Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Beurteilung möglicher therapeutischer Mittel in
einer transgenen, ein menschliches Hormon produzierenden Maus, welches das Einführen
eines möglicherweise therapeutischen Mittels in die transgene Maus und das Beobachten der
Expression oder des Spiegels der Produktion des menschlichen Hormons, beinhaltet.
Stand der Technik
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Die Möglichkeit, spezifische Gene in das Genom von Säugetierembryos zu
integrieren, stellt ein nützliches in vivo System für die Analyse der Genkontrolle und -expression dar.
Die hochwirksame Transformation kultivierter Säugetierzellen wird durch direkte
Mikroinjektion spezifischer DNA-Sequenzen in den Zellkern erreicht (Capecchi, M., Cell 22: 479-
488 (1980)). (Gordon, J. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7.380-7.384 (1978))
zeigten, daß DNA in Mäuseembryos mikroinjiziert werden kann und dann bei den Nachkommen
vorgefunden wird. Somit ist gegenwärtig die Möglichkeit, gewisse transgene Mäuse zu
erzeugen, nach dem Stand der Technik gut beschrieben und allgemein bekannt.
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Das grundlegende Verfahren, das zur Erzeugung transgener Mäuse verwendet wird,
benötigt die Gewinnung befruchteter Eier aus den Eileitern frisch begatteter weiblicher
Mäuse. DNA, die das gewünschte Gen enthält, das in die Maus transferiert werden soll, wird
in den männlichen Vorkern jedes befruchteten Eis mikroinjiziert. Mikroinjizierte Eier werden
dann in die Eileiter von einen Tag pseudoschwangeren Ammen implantiert und ausgetragen
(Wagner, T. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 6.376-6.380 (1981)). Die neugeborenen
Mäuse werden dann auf die Gegenwart der mikroinjizierten DNA durch Mittel getestet, die in
der Wissenschaft bekannt und geeignet sind, um die Gegenwart der mikroinjizierten DNA
nachzuweisen.
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Wagner, T. E. et al. erzeugten, im wesentlichen unter Anwendung dieses Verfahrens,
erfolgreich eine erwachsene Maus, die zur Expression von Kaninchen B-Globin imstande
war. Diese Maus war des weiteren imstande, Nachkommen zu erzeugen, die ebenso das
Kaninchen B-Globin-Gen exprimierten. Zusätzliche geklonte Immunglobulingene wurden in
Mauskeimbahnen eingeführt, um transgene Mäuse zu erzeugen, die das geklonte
Immunglobulin erzeugen (Grosschedl, R. et al., Cell 38: 647-658 (1984), Brinser, R. L. et al.,
Nature 306: 332-336 (1983)). Palmiter, R. D. et al., (Nature, 300: 611-615 (1982))
erzeugten transgene Mäuse, die den Maus-Metallothionein I-Promoter trugen, der an das Strukturgen
für das Ratten-Wachstumshormon geschmolzen war. Es zeigte sich, daß diese Mäuse
erhöhte Werte des Ratten-Wachstumshormons erzeugten, und ein dramatisch verstärktes
Wachstum zeigten. Brinster, R. L. et al. (Cell, 37: 367-379 (1984)) injizierten die SV40 Gene
der frühen Region und ein Metallothionein-Fusionsgen in befruchtete Mauseier, im
wesentlichen unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens. Ein hoher Prozentsatz der
transgenen Mäuse, die sich aus diesen Eiern entwickelten, entwickelten Tumore im Plexus
choroideus. SV40 T-Antigen-mRNA und Protein wurden in diesem befallenen Gewebe leicht
nachgewiesen. Die SV40 T-Antigen-Genexpression war jedoch in nicht befallenen Geweben
oder in anfälligen Geweben vor der offenkundigen Pathologie kaum nachweisbar, was darauf
schließen läßt, daß die Tumorgenese von der Aktivierung der SV40 Gene abhängig ist. Diese
Arbeit zeigte, daß es möglich ist, die Gene, die für ein Tumorvirus codieren, in einen
Mausembryo zu injizieren, und dadurch eine Maus mit einer Prädisposition für eine Onkogenese zu
erzeugen. Swift, G. M. et al., (Cell 3: 639-646 (1984)) erzeugten eine transgene Maus, die
das Gen für Ratten-Pankreaselastase I in hohen Werten in dem Maus-Pankreas exprimierten.
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Geklonte Gene können in die Maus-Keimbahn durch Mikroinjektion in die Vorkerne
der Maus-Zygoten transferiert werden. Solche mikroinjizierten Gene werden häufig in
Chromosome integriert, während der Entwicklung beibehalten und auf den Nachkommen als
nach den Mendelschen Regeln vererbte Merkmale übertragen (Grosschedl, R. et al., Wagner,
T. E. et al.). Forscher haben berichtet, daß transgene Mäuse mit einer Effizienz zwischen 10
und 30 Prozent unter Verwendung dieses Verfahrens erzeugt werden können. Mikroinjizierte
Fremdgene haben eine Neigung zur Expression in transgenen Mäusen gezeigt (Brinster, R. L.
et al., Swift, G. M. et al.). Eine solche Expression kann jedoch nicht vermutet werden. Lacy,
E. et al., Cell 34: 343-358 (1983) offenbarten eine transgene Maus, die das menschliche B-
Globin-Gen enthält, die im allgemeinen dieses Gen nicht exprimiert. Ebenso hat sich gezeigt,
daß die Wachstumshormongene von Ratten und Menschen nicht unter der Steuerung ihrer
eigenen Promotoren in transgenen Mäusen exprimiert werden, die diese Gene tragen
(Wagner, T. E., et al.; Hammer O. et al.). Es hat sich gezeigt, daß die Expression des Hühner-
Transferringens in der Leber (wo es normalerweise vorzugsweise exprimiert wird) im
Vergleich zu anderen Geweben in einer transgenen Maus, die das Hühner-Transferringen enthält,
nur mäßig verstärkt wird (McKnight, G. S. et al., Cell 34: 335-341 (1983)).
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Obwohl demgemäß das Verfahren zur Erzeugung transgener Mäuse in der
Wissenschaft beschrieben wurde, bleibt die Fähigkeit, spezifische transgene Mäuse zu erzeugen, die
das geklonte Gen richtig exprimieren, ungenau definiert. Es wurde die Theorie entwickelt,
daß diese von der Regel abweichenden Ergebnisse die Möglichkeit wiederspiegeln, daß die
geklonte DNA in eine essentielle Region des Maus-Chromosoms integriert wurde, die ihre
Expression modifiziert, oder eine Mutation oder Neuordnung in dem Integrationsprozeß in
das Maus-Chromosom erfahren hat.
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Es wird angenommen, daß die geklonten Genfragmente bei Eintritt in den Kern des
einzelligen befruchteten Eis an zufälligen Stellen auf dem Maus-Chromosom integriert
werden. Sobald die geklonte DNA in diesen Stellen integriert ist, ist sie im allgemeinen stabil und
führt zu der vererbbaren Übertragung dieser Gene in die nachkommenden Mäuse. Daher wird
angenommen, daß die äußerst variable Expression der Thymidinkinase in transgenen Mäusen,
die das Herpes-Simplex-Virus (Typ 1) Gen tragen, aus einer genetischen Neuordnung
resultiert, die auftritt, wenn das Thymidinkinase-Fusionsgen in das Mauschromosom integriert
wird (Palmiter, R. D. et al., Cell 36: 869-877 (1984)).
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Das allgemeine Verfahren zur Erzeugung transgener Mäuse ist in Wagner, T. et al.,
Europäische Patentanmeldung Nr. 81.570 (entsprechend der U.S. Patentanmeldung Nr.
273.239) beschrieben, das insbesondere eine Maus offenbart, die in ihren Erythrozyten ein
Kaninchen-Beta-Globin Gen exprimiert.
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Es wurde bereits von Bemühungen berichtet, das Gen für menschliches Insulin in
Mäuse einzuführen (Illmensee, K. et al., "Nuclear and Gene Transplantation in the Mouse".
In: Brown B. D., Fox C. F., Hrsg. Developmental Biology Using Purified Genes, Academic
Press, New York, S. 607-629 (1981); Burki, K. et al., Embo J. 1: 127-131 (1982); Van der
Putten, H. et al., Mol. Gen. Genetic 198: 128-138 (1984)). Diese Bemühungen führten zu der
Erzeugung einer Maus, welche die menschlichen Insulinhormon-Gensequenzen enthielt. Die
transgene Maus, die von diesen Laboratorien erzeugt wurde, war jedoch nicht imstande, die
menschlichen Insulin-Gensequenzen auf ihre Nachkommen zu übertragen. Van der Putten H.
et al. zeigten, daß die Mäusenachkommen, die von einer transgenen (Insulinsequenz
tragenden) Maus abgeleitet waren, zwar DNA-Sequenzen aufwiesen, welche die
Insulingensequenzregion flankiert hatten, den Mäusenachkommen aber alle menschlichen Insulinsequenzen
fehlten. Zur Erklärung, wie die insulintragenden Sequenzen aus den transgenen Mäusen
entfernt werden konnten, während die flankierenden Regionen in diesen Mäusen erhalten
blieben, sprachen Van der Putten, H. et al., von einem keimbahnspezifischen
Exzisionsereignis, das spezifisch die menschlichen Insulinsequenzen entfernte. Van der Putten H. et al.
schlossen, daß die Exzision der menschlichen Insulin-Gensequenzen ein allgemeines
Phänomen sein könnte, das in einer anfänglichen Phase in der Bildung der Keimbahn in dem
transgenen Weibchen auftritt. In dem von Van der Putten, H. et al. angewandten Verfahren
wurde für die Mikroinjektionen eine hohe Anzahl kreisförmiger DNA-Moleküle verwendet,
die das menschliche Insulingen enthielten.
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Der Stand der Technik lehrt schließlich die Möglichkeit, gewisse transgene Mäuse zu
erzeugen, die zu einer gewebespezifischen Expression eines geklonten Gens imstande sind.
Der Stand der Technik lehrt jedoch auch die Schwierigkeit der spezifischen Erzeugung einer
transgenen Maus, die das menschliche Insulingen exprimiert. Obwohl es möglich ist,
transgene Mäuse zu erzeugen, die DNA-Sequenzen des Gens für menschliches Insulin tragen, ist
von diesen Mäusen nicht bekannt, daß sie menschliches Insulin produzieren, und sie waren
nicht imstande, Nachkommen zu erzeugen, die das menschliche Insulingen entweder
exprimieren oder tragen (Van der Putten H. et al., Mol. Gen. Genetic 198: 128-138 (1984)).
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Es ist daher von großem Interesse, ein Verfahren zur Erzeugung einer Maus zu
entwickeln, die imstande ist, ein menschliches Hormon oder ein Analogon eines menschlichen
Hormons zu exprimieren, und welche die Fähigkeit, dieses Hormon zu exprimieren, auf ihre
Mäusenachkommen vererben kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es wird ein Verfahren zur Isolierung einer Maus beschrieben, die ein menschliches
Hormon oder ein Analogon davon exprimiert. Ein cDNA-Fragment, das für einen Teil von
menschlichem Preproinsulin codiert, wurde zum Sondieren einer menschlichen Genbank im
Bakteriophagen Lambda Charon 4a (beschrieben von R. M. Lawn, et al., Cell 15: 1.157-
1.174 (1978)) verwendet. Durch die Durchmusterung der rekombinanten Phagen durch
Hybridisierung nach jenen, die menschliche Insulin-Gensequenzen enthielten, wurde ein 12,5
Kilobasen EcoRI Fragment erhalten. Dieses Fragment wurde sequenziert und es wurde
gezeigt, daß es die vollständige Nucleotidsequenz des geklonten menschlichen Insulingens
enthielt (Bell, G. I. et al., Nature 284: 26-32 (1980)). Das 12,5 kb EcoRI Fragment wurde in
den männlichen Vorkern eines einzelligen Mausembryos mikroinjiziert. Der Embryo wurde
dann in eine pseudoschwangere Amme für eine Schwangerschaft übertragen. Dieses
Verfahren führt zu der Geburt von drei lebensfähigen Mäusen, die menschliche
Insulin-Gensequenzen enthielten, wie durch Southern Hybridisierungsanalyse nachgewiesen wurde. Eine
dieser drei Mäuse, ein Männchen, wurde zur Erzeugung einer Kolonie von mehreren hundert
Nachkommen gezüchtet. Das menschliche Insulingen wurde nach den Mendelschen Regeln
übertragen, wobei etwa 50% sowohl der F1 als auch F2 Nachkommen das injizierte DNA-
Fragment erbten.
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Im Detail umfaßt die Erfindung:
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ein Verfahren zur Beurteilung der Wirkung eines Mittels auf die Expression oder den
Spiegel eines menschlichen Hormons oder eines Analogons davon, welches durch ein
natürlich reguliertes Transgen codiert ist, welches Verfahren beinhaltet:
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a) Verabreichung des Mittels an ein nicht-menschliches transgenes Säugetier,
dessen Zellen das natürlich regulierte Transgen enthalten, das für das menschliche Hormon
oder ein Analogon davon codiert; und
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b) Untersuchung der Wirkung des Mittels auf die Expression oder den Spiegel
eines menschlichen Hormons oder eines Analogons davon durch Beobachtung der Expression
oder des Spiegels im Tier;
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wobei das menschliche Hormon oder Analogon davon nicht Preproinsulin, Proinsulin
oder Insulin ist.
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Vorzugsweise ist das Mittel ein Heilmittel und/oder das nicht-menschliche transgene
Säugetier ist ein Nagetier.
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Die Erfindung ist dahingehend signifikant und nützlich, daß sie ein Tiermodell zur
Testung auf Effektoren menschlicher Hormone oder Analoga davon in einem
nichtmenschlichen Tier bereitstellt.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1A zeigt die Gegenwart von menschlichen Insulin-Gensequenzen innerhalb der
chromosomalen DNA der transgenen Maus. Fig. 1B zeigt die Gegenwart von menschlicher
und Maus-Insulin-mRNA in Geweben von transgenen und Kontrollmäusen.
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Fig. 2 zeigt die Serumglucosespiegel in transgenen und Kontrollmäusen nach einer
intraperitonealen Glucoseinjektion.
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Fig. 3 zeigt menschliche C-Peptidspiegel während eines intravenösen Aminosäure-
Toleranztestes an transgenen und Kontrollmäusen.
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Fig. 4 zeigt menschliche C-Peptidspiegel während eines intraperitonealen Glucose-
Toleranztestes an transgenen und Kontrollmäusen.
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Fig. 5 zeigt menschliche C-Peptidspiegel während eines intravenösen Tolbutamid-
Infusionstestes an transgenen und Kontrollmäusen.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Insulin ist ein Polypeptidhormon, das die vorherrschende physiologische Rolle in der
Regulierung der Kraftstoff-Homöostase in einem Organismus spielt. Es wird durch die
Betazellen der Langerhansschen Inseln (in der Folge als "Inselzellen" bezeichnet) des Pankreas
synthetisiert. Zirkulierende Insulinspiegel werden durch mehrere kleine Moleküle reguliert,
nämlich Glucose, Aminosäuren, Fettsäuren und gewisse pharmakologische Mitteln. Insulin
besteht aus zwei Polypeptidketten (A und B, die durch Disulfidbindungen verbunden sind),
die von der proteolytischen Spaltung von Proinsulin abgeleitet werden, die äquimolare
Mengen des reifen Insulins und eines Verbindungspeptids (C-Peptid) erzeugt. Proinsulin wird als
Vorläufer erzeugt, der als Preproinsulin bekannt ist. Preproinsulin wird von der Zelle zu
Proinsulin verarbeitet, das dann aus der Zelle als reifes Hormon, Insulin, ausgeschieden wird.
Somit kann die Insulinhormonexpression oder der Spiegel durch Messen entweder der
Expression oder des Spiegels von Preproinsulin-, Proinsulin-, Insulin-, A-Peptid-, B-Peptid- oder
vorzugsweise C-Peptid bewertet werden.
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Der Begriff "F1", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die erste Generation von
Nachkommen einer Maus (d. h., deren "Söhne und Töchter"). Der Begriff "F2", wie hierin
verwendet, bezieht sich auf die zweite Generation von Nachkommen einer Maus (d. h., deren
"Enkelkinder").
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Der Begriff "menschliches Insulin" bezieht sich nicht nur auf natürliches Insulin,
sondern auch auf jedes Analogon davon. Beispiele für solche Analoga sind: das Produkt eines
menschlichen Insulingens, das eine Mutation enthält, welche das dadurch erzeugte Insulin
funktionell beeinträchtigt, oder ein natürlich vorkommendes menschliches Protein, das
strukturell oder funktionell normalem menschlichen Insulin ähnlich ist, oder ein neuartiges
Insulinhormon, das sich aus der in vitro oder in vivo Mutagenisierung oder Modifizierung des
menschlichen Insulingens ergibt. Der Begriff "menschliches Insulin" bezeichnet ferner
variante Formen von menschlichem Insulin. Eine variante Form von menschlichem Insulin ist
ein Molekül, das dem menschlichen Insulin, das natürlich oder durch Erkrankung entsteht,
strukturell oder funktionell ähnlich ist, und in einer Subpopulation der Gesamtpopulation
vorhanden ist.
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Der Begriff "heterologes Protein" bezeichnet ein Protein, das normalerweise nicht von
einer bestimmten Spezies produziert wird. Menschliches Insulin, Kaninchen B-Globin sind
Beispiele für heterologe Proteine, die in einer Maus erzeugt werden können. Die Eigenschaft
transgener Säugetiere ist, daß sie die Gene für heterologe Proteine besitzen und somit die
Fähigkeit haben, heterologe Proteine zu erzeugen.
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Der Begriff "geklontes Gen" bezeichnet eine DNA-Sequenz von Interesse, die isoliert
wurde und in das befruchtete Ei einer Maus injiziert werden soll, um eine transgene Maus zu
erzeugen, welche die geklonten Gensequenzen enthält.
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Wie hierin verwendet, sind die Begriffe "Gen", "DNA-Sequenz" oder "genetische
Sequenzen" Synonyme und bezeichnen DNA, die alle Introne oder Exone enthält, die von
Natur aus mit dieser DNA verbunden sind. Ein Beispiel für ein Gen ist die DNA, die für
menschliches Preproinsulin und die nicht-translatierten und dazwischenliegenden Sequenzen
codiert, die mit dieser DNA-Sequenz verbunden sind (Beil, G. et al., Nature, 284: 26-31
(1980)). Von einer genetischen Sequenz wird behauptet, daß sie von einer zweiten
genetischen Sequenz abgeleitet ist, wenn sie entweder eine exakte Kopie der zweiten genetischen
Sequenz ist, oder wenn sie das Ergebnis einer Änderung (d. h., Mutation, Insertion oder
Deletion) der zweiten Sequenz ist. Von einer genetischen Sequenz wird behauptet, daß sie
"exprimiert" ist, wenn das Gen in RNA transkribiert ist und die RNA in das Protein
translatiert ist.
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Das geklonte Gen, oder ein Fragment des geklonten Gens, wird durch eines von
mehreren Verfahren, die in der Wissenschaft allgemein bekannt sind, erzeugt und gereinigt.
So kann das geklonte Gen synthetisch oder durch Behandlung von mRNA, die aus der
Transkription des Gens mit einer reversen Transkriptase abgeleitet ist, um eine cDNA-
Version des Gens zu erzeugen, oder durch die direkte Isolierung des Gens von einer
genomischen Bank oder anderen Quellen erzeugt werden.
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Unabhängig davon, wie das geklonte Gen isoliert wird, wird es amplifiziert und von
anderen möglicherweise verunreinigenden Molekülen gereinigt. Es kann jede DNA-Sequenz
verwendet werden, wie das menschliche Proinsulingen, eine DNA-Sequenz, die für
menschliches Insulin codiert, oder das Gen für menschliches Preproinsulin, vorzugsweise DNA von
Plasmid pgHI 12,5, welches das menschliche Preproinsulingen enthält (Beil, G. et al.). Die
Sequenz von Insulin, Preproinsulin und Proinuslin ist von Bell, G. et al. offenbart.
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Befruchtete Mauseier zur Mikroinjektion werden in cumulus von den Eileitern
weiblicher Mäuse gewonnen, die einige Stunden davor begattet wurden. Obwohl befruchtete
Mauseier von Weibchen von den Mausstämmen C57BL/6J, SJL/Wt, C3H oder C57/SJL
verwendet werden können, ist die Verwendung von befruchteten Eiern von den Eileitern von
C57/C3H F1 Weibchen, die mit F1 Männchen gepaart wurden, bevorzugt. Befruchtete Eier in
der pronuklearen Phase (d. h., in der Phase, in welcher die Vorkerne des Männchens und des
Weibchens im Zytoplasma getrennt und voneinander unterscheidbar sind) werden von den
Eileitern der schwangeren (C57/C3H) F1 Weibchen gesammelt. Die isolierten befruchteten
Eier werden bei 37ºC in M16 Kulturmedium inkubiert (Whittingham, D. G., J. Reprod. Fertil.
Suppl., 14: 7-21 (1971) und 2-4 Stunden bis zur Mikromanipulation gelagert. Die
Manipulation der Pipetten zur Aufnahme des befruchteten Eis, so daß die Injektion geklonter DNA
möglich ist, erfolgt unter Verwendung von Leitz Mikromanipulatoren und von mit Paraffinöl
gefüllten Hamilton-Spritzen. Die Insulin-DNA-Quelle, die in diese Embryos injiziert werden
soll, sollte sich in 0,5 mM Tris (pH = 8) 0,5 mM EDTA befinden. Ein kleiner Tropfen des
Kulturmediums mit fünf oder sechs befruchteten Eiern wird auf einen Objektträger
aufgebracht und mit Paraffinöl bedeckt. Zwischen 2 und 20 pl, aber vorzugsweise 5 pl entweder
eines gereinigten Insulin-Genfragments oder eines kovalent geschlossenen Plasmids, welches
die Insulin-Gensequenz enthält, werden in die Injektionspipette aufgezogen, die dann
angrenzend zum Tropfen hin bewegt wird, der die befruchteten Eier enthält. Ein befruchtetes Ei
wird auf der Haltepipette positioniert, so daß der männliche Vorkern neben der
Injektionspipette liegt, für eine anschließende Injektion der Insulin-Genlösung in den Vorkern. Eine
effektive Anzahl von Kopien der Insulin-Gensequenz, zwischen 600 und 20.000, aber
vorzugsweise 1.000 Kopien der Insulin-Gensequenz werden in jedes befruchtete Ei injiziert. 60-
100 Eier werden pro Stunde injiziert.
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Nach der Mikroinjektion in alle Vorkerne werden die befruchteten Eier von dem
Mediumtropfen auf dem Objektträger entfernt und in Kulturröhrchen zur
Präimplantationsentwicklung nach dem Verfahren von Wagner, T. E. et al. eingebracht. Nach 4 Stunden
Kultur bei 37º in M16 Puffer werden 1 oder 2 befruchtete Eier in die Uteri von einen Tag
pseudoschwangeren ICR-Ammen eingebracht und ausgetragen. Pseudoschwangere Mäuse
werden durch Paarung von weiblichen Mäusen mit vasektomierten Männchen erhalten, wie
von Hoppe, R. et al., Biol. Reprod. 8: 420-426 (1973) beschrieben ist. 10-30 Prozent der
neugeborenen Säugetiere, die von diesen Ammen zur Welt gebracht werden, sind transgen
(d. h., enthalten in ihren Chromosomen integrierte Sequenzen des geklonten Gens).
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Das Vorhandensein dieser integrierten Sequenzen wird durch Mittel erfaßt, die in der
Wissenschaft bekannt und für den Nachweis des spezifischen geklonten Gens geeignet sind.
So wird für den Nachweis eines Gens, das ein Polypeptidprodukt exprimiert oder nicht
exprimiert, eine Southern Hybridisierungsanalyse durchgeführt. Solche Techniken, wie auch
jene, die für rekombinante DNA Manipulationen erforderlich sind, sind in Maniatis, T. et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982,
beschrieben, das in der Folge zum Zwecke der Bezugnahme zitiert wird. Geklonte Gene,
deren Gegenwart durch die Erzeugung eines Polypeptids nachweisbar sein soll, wie Insulin,
können durch Mittel nachgewiesen werden, die zur Unterscheidung des Produktes des
geklonten Gens von jedem anderen endogenen Genprodukt imstande sind (die zum Beispiel
imstande sind, menschliches Insulin vom Insulin der Maus zu unterscheiden), wie durch
Radioimmunoassay, Enzymassay, oder durch andere Mittel, die in der Wissenschaft allgemein
bekannt sind.
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Obwohl jedes geeignete Mittel für den Nachweis der Expression des geklonten Gens
in der transgenen Maus verwendet werden kann, ist die Verwendung eines
Radioimmunoassays bevorzugt, wie des Human-C-Peptid-Radioimmunoassay-Testsatzes (im Handel von
Behringwerke AG, Deutschland erhältlich), der für menschliches C-Peptid spezifisch ist, eine
geringe oder keine Kreuzreaktivität mit Maus-C-Peptid zeigt, und daher zur Unterscheidung
der Expression von menschlichem Insulin von endogenem Maus-Insulin geeignet ist.
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Sobald eine transgene Maus identifiziert ist, wird die stabile Erhaltung und
Übertragung des integrierten geklonten Gens dann durch klassische Mendelsche Experimente
bestätigt, die in der Wissenschaft der Genetik allgemein bekannt sind. Von einer Maus wird
behauptet, daß sie von einer anderen Maus abgeleitet ist, wenn die Mäuse genetisch nicht
unterscheidbar sind, oder wenn eine der Mäuse ein Abkömmling der anderen ist. Von einer
transgenen Maus wird behauptet, daß sie stabil eine geklonte Gensequenz enthält, oder stabil
ein Genprodukt eines geklonten Gens exprimiert, wenn einige der F1 oder F2 Nachkommen
der transgenen Maus die geklonte Gensequenz enthalten bzw. das Genprodukt eines
geklonten Gens exprimieren, in einer Weise, die entweder im wesentlichen gleich jener der
transgenen Maus ist, oder die im wesentlichen von jener eines nicht transgenen Säugetiers
unterscheidbar ist.
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Für gewöhnlich ist es wünschenswert, daß das geklonte menschliche Insulingen nur in
bestimmten Geweben exprimiert wird, die jenen Geweben entsprechen, in welchen das
geklonte menschliche Insulingen in seinem natürlichen Wirtsorganismus von Natur aus
exprimiert wird. Für den Nachweis der Gewebespezifität ist es ausreichend, Teile verschiedener
Gewebe der transgenen Maus zu analysieren, um zu bestimmen, ob diese Gewebe das
geklonte Genprodukt exprimieren. Somit kann Protein, das von verschiedenen Geweben
abgeleitet wird, durch den Radioimmunoassay oder durch andere Mittel auf die Gegenwart des
geklonten Genprodukts untersucht werden. Als Alternative kann RNA aus mehreren
Geweben hergestellt und durch Mittel, die in der Wissenschaft bekannt sind (Maniatis, T. et al.) an
eine ³²P oder andersartig radiomarkierte (oder biotinylierte) nick-translatierte menschliche
Insulin cDNA-Sonde hybridisiert werden.
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Die Expression der geklonten menschlichen Insulin-Gensequenzen ist vorzugsweise in
einer transgenen Maus durch dieselben Mechanismen "natürlich reguliert", wie bei deren
natürlichem menschlichen Wirt.
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Der Begriff "natürlich reguliert" bedeutet, daß das Gen in einer physiologisch
geeigneten Weise reguliert ist. Somit kann die Expression des Gens nicht konstitutiv sein,
sondern abhängig von den Anforderungen, Aktivitäten und Effektoren der transgenen Maus
unterschiedlich sein. Die "natürliche Regulierung" erfordert, daß das geklonte menschliche
Insulingen nicht in allen Geweben und Organen der Maus exprimiert wird, sondern nur in
jenen Geweben und Organen, in welchen das geklonte Insulingen in seinem natürlichen Wirt
exprimiert wurde. Ferner erfordert eine solche "natürliche Regulierung", daß die Insulin-
Gensequenzen, ihre entsprechenden mRNA Transkripte und die aus diesen Transkripten
erzeugten Proteine "natürlich verarbeitet" werden. Der Begriff "natürlich verarbeitet"
beinhaltet Schritte wie die mRNA Transkription, das Spleißen und die proteolytische Spaltung
von Proteinvorläufermolekülen (wie Preproinsulin oder Proinsulin). Zusätzlich verursacht die
"natürliche Regulierung" einen Spiegel der Insulin-Genexpression, der innerhalb eines
normalerweise vorgefundenen physiologischen Bereichs und nicht in einem anormalen
Bereich liegt. Der physiologisch normale Bereich einer Insulinkonzentration in einer Maus ist 0-
100 uU/ml. Somit wäre die Expression des menschlichen Preproinsulingens in einer
transgenen Maus "natürlich reguliert", wenn (1) die Expression nur in den Inselzellen der Pankreas
der Maus aufträte, (2) das erzeugte Preproinsulin auf natürliche Weise zu Proinsulin
verarbeitet würde und das natürlich erzeugte Proinsulin auf natürliche Weise zu Insulin
weiterverarbeitet würde, dieses auf natürliche Weise in das Kreislaufsystem der Maus sezerniert
würde, (3) die Menge an erzeugtem Preproinsulin, Proinsulin und Insulin innerhalb eines
normalen physiologischen Bereichs läge, (4) die Gegenwart von Affektoren der
Insulinexpression (wie Glucose oder Aminosäuren) eine Veränderung in der Menge und Konzentration
von menschlichem Preproinsulin, Proinsulin und Insulin bewirkte, die im wesentlichen mit
jener identisch ist, in welcher sich Preproinsulin, Proinsulin und Insulin der Maus in der Maus
verändern, oder menschliches Preproinsulin, Proinsulin und Insulin sich in Menschen
verändern würden.
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Transgene Mäuse, die menschliches Insulinhormon erzeugen, sind insbesondere für
die pharmazeutische Industrie nützlich. Solche Mäuse stellen erstmals ein in vivo,
nichtmenschliches Tiermodell zur Bewertung der Wirkung eines Heilmittels oder anderen Mittels
auf menschliche Insulinwerte bereit. Gegenwärtig verlangt jede Bemühung, eine solche
Bewertung durchzuführen, Freiwillige oder Patienten. Die ethischen Einschränkungen, die bei
der Forschung mit menschlichen Probanden gelten, grenzen die Art und den Umfang der
Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen menschlichem Insulin und therapeutischem
Mittel deutlich ein.
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In exakt analoger Weise könnten die pharmakologischen Wirkungen, der
therapeutische Wert und die medizinische Bedeutung eines Mittels durch Verabreichung des Mittels
an irgendein transgenes Säugetier und Auswertung der möglichen Wirkung des Mittels auf
die Expression und den Spiegel irgendeines menschlichen Hormons oder Analogons davon,
das von dem transgenen Säugetier erzeugt wird, bestimmt werden. Wenn somit zum Beispiel
ein transgenes Säugetier erzeugt wird, das heterologes Protein vorwiegend in seinem Plexus
choroideus erzeugt (wie bei Swift, G. M. et al.), könnten die Wirkungen der Mittel auf den
Plexus choroideus oder die Fähigkeit der Mittel, in den Plexus choroideus einzudringen,
durch Untersuchung der Expression des heterologen Proteins bewertet werden. Somit
offenbart die vorliegende Erfindung die Nützlichkeit transgener Säugetiere und insbesondere
transgener Mäuse in der allgemeinen Untersuchung der Pharmakologie menschlicher Hormone.
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Die Möglichkeit, eine transgene Maus zu erzeugen, die ein Analogon eines
menschlichen Hormons exprimiert, ermöglicht Untersuchungen der Struktur und Funktion des
Hormons. Früher war die Durchführung solcher Studien schwierig wegen der Seltenheit von
Individuen, die solche Analoga produzieren und weil die Hormonmenge, die in solchen
Subjekten oder Patienten erzeugt wird, äußerst begrenzt ist. Im Gegensatz dazu wird durch die
Möglichkeit, transgene Mäuse zu erzeugen, die Analoga des menschlichen Insulins
exprimieren, die Reinigung und Charakterisierung solcher Analoga möglich. Die verfügbare
Menge der natürlichen Analoga wäre nur durch die Größe der Mauskolonie begrenzt, die in
der Untersuchung verwendet wird. Ferner stellt die Möglichkeit, Insulin-Gensequenzen in
vitro zu manipulieren und diese Sequenzen wieder in eine Maus zu überführen, wodurch eine
transgene Maus erzeugt wird, die ein neuartiges Insulinhormon erzeugt, ein
außergewöhnliches Werkzeug zur Untersuchung des Verhältnisses zwischen Hormonstruktur und
-funktion dar.
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Ein E. coli-Stamm, der Plasmid pgHI 12,5 enthält, ist von Bell, G. I. et al. beschrieben.
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Nachdem diese Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird diese mit
Bezugnahme auf gewisse spezifische Beispiele verständlicher, die hierin nur zum Zwecke der
Veranschaulichung enthalten sind und die Erfindung nicht einschränken sollen, wenn nicht
anderes angegeben ist.
REFERENZBEISPIEL I
Herstellung des geklonten Insulinfragments
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Insulin mRNA wurde aus pankreatischen Zellen isoliert und zur Erzeugung einer
cDNA Sonde verwendet (Lawn, R. M. et al.; Bell, G. I. et al.). Eine menschliche Genbank in
Bakteriophage Lambda Charon 4A wurde in Gegenwart der cDNA Sonde inkubiert. Zwei von
etwa 10&sup6; Phagen hybridisierten mit der Sonde. Einer dieser Klone enthielt ein 12,5 kb EcoRI
Fragment, das die vollständige Nucleotidsequenz des geklonten menschlichen Preproinsulin-
Gens enthielt. Dieses 12,5 kb-Fragment wurde in Plasmid pBR322 subgeklont und als pgHI
12,5 bezeichnet, das in das Bakterium E. coli, Stamm DKI, eingeführt und dadurch
amplifiziert wurde. Nach der Amplifizierung wurde das 12,5 kb Fragment aus dem Plasmid
ausgeschnitten und gereinigt. Etwa 1.000 Kopien dieses Fragments wurden in den männlichen
Vorkern von einzelligen Mausembryos mikroinjiziert, die dann in pseudoschwangere Ammen
für eine Schwangerschaft übertragen wurden. Von 46 Mäusen, die nach einer Serie von
Injektionen geboren wurden, enthielten 3 (etwa 7%) menschliche Insulin-Gensequenzen, die
durch Southern Hybridisierungsanalyse nachgewiesen wurde. Es zeigte sich, daß eine Maus,
ein Männchen, 5 bis 10 Kopien des menschlichen Insulin-Genfragments pro haploidem
Genom enthielt, und diese wurde näher charakterisiert. Diese Maus wurde zur Erzeugung
einer Kolonie von mehreren hundert Nachkommen gezüchtet, und es zeigte sich, daß die
menschlichen Insulin-Gensequenzen nach den Mendelschen Regeln übertragen wurden,
wobei etwa 50% sowohl der F1 als auch F2 Nachkommen das injizierte DNA-Fragment
erbten. Maus Nr. 16, die sich als transgene, menschliches Insulin produzierende Maus erwies,
wurde mit einer weiblichen Maus von Stamm B6C3F1 gezüchtet, um Mausnachkommen zu
erzeugen. Durch Testung dieser Mäuse auf die Erzeugung von menschlichem Insulin und
selektive Paarung von menschliches Insulin produzierenden Geschwistern wurde eine
Kolonie homozygoter, menschliches Insulin produzierender Mäuse erhalten. Die homozygoten,
menschliches Insulin produzierenden Mäuse wurden als B6C3F1/Huming bezeichnet.
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Die Charakterisierung der transgenen Mäuse ist in Fig. 1A dargestellt.
Chromosomale DNA von mehreren Mäusen wurde getestet um festzustellen, ob die Mäuse
menschliche Insulin-DNA-Sequenzen trugen. DNA-Proben wurden mit PvuII aufgeschlossen und
durch eine Southern-Hybridisierungsanalyse (Maniatis, T. et al.) unter Verwendung eines
radiomarkierten 1.594 bp PvuII-Fragments (das in dem 12,5 kb menschlichem Insulin-DNA-
Fragment enthalten war) als Sonde analysiert. Die Bahnen 1, 2 und 5 zeigen eine
Hybridisierung zwischen der Sonde und genomischen Sequenzen transgener Mäuse. Bahn 3 zeigt das
Fehlen einer Hybridisierung zwischen der Sonde und genomischen Sequenzen einer
nichttransgenen Geschwistermaus. Bahn 4 zeigt die Hybridisierung zwischen der Sonde und
genomischer DNA einer menschlichen Kontrolle. Für die Southern-Blot-Analyse wurden 8 ug
der gesamten genomischen DNA für jede Maus mit PvuII aufgeschlossen, einer
Elektrophorese auf einem 0,9% Agarosegel unterzogen und auf Nitrozellulose übertragen. Das Filter
wurde dann über Nacht vorhybridisiert, an eine 32P-markierte genomische menschliche
Insulinsonde hybridisiert, gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die genomische
Insulinsonde war ein Fragment, das sich von einer BgIII-Stelle bei -169 in bezug auf die
transkriptionale Anfangsstelle des menschlichen Insulingens zu einer Aval-Stelle bei +644
erstreckte. Zusätzlich zu Promotorsequenzen enthielt dieses Fragment die erste
dazwischenliegende Sequenz, das erste Exon (einschließlich Sequenzen, die für das Signalpeptid,
B-Peptid und einen Teil des C-Peptids codierten), und einen Teil der zweiten
dazwischenliegenden Sequenz. Die genomische menschliche Insulinsonde zeigte eine beschränkte
Kreuzhybridisierung mit den endogenen Maus-Insulingenen.
REFERENZBEISPIEL II
Bestätigung der Expression des geklonten menschlichen Insulinhormongens in der
Maus
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Die Gegenwart von DNA, die menschliche Insulin-Gensequenzen enthält, wurde in
der Maus B6C3F1/Huming durch die Verwendung der Southern-Hybridisierungsanalyse
nachgewiesen. Zur Bestimmung der Gewebsspezifität der menschlichen Insulingenexpression
in transgenen Mäusen wurden sowohl RNA Analysen als auch Funktionsstudien der
pankreatischen Inseln durchgeführt. Die vollständige RNA von mehreren Geweben wurde von
transgenen Mäusen und nicht transgenen Geschwistern hergestellt. Diese RNA wurde durch
Elektrophorese auf 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gelen getrennt, auf Nitrozellulose
übertragen, und an eine ³²p-markierte, nick-translatierte, menschliche Insulin-cDNA-Sonde
hybridisiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 1B dargestellt (Bahn 1, RNA von der
Leber einer nicht transgenen Maus; Bahn 2, RNA von der Pankreas einer nicht-transgenen
Maus; Bahn 3 RNA von der Leber einer transgenen Maus; Bahn 4, RNA von der Pankreas
einer transgenen Maus). Obwohl pankreatische RNA sowohl von transgenen als auch von
Kontrollmäusen an die menschliche Insulin-cDNA-Sonde hybridisierten, zeigten die RNAs
von transgenen und Kontroll-Leber, Milz, Gehirn, Niere, Herz, Darm, Lunge und Muskel
keine Hybridisierung. Weder die Maus-Insulin-cDNA noch die Gensequenzen wurden
bestimmt, aber da die Kodierungsregionen der Ratten- und menschlichen Insulin-mRNAs eine
Sequenzhomologie von 81% haben (Bell, G. I. et al.), wurde erwartet, daß pankreatische
RNAs sowohl der transgenen als auch Kontrolltiere an die menschliche Sonde hybridisieren.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das menschliche Insulingen nur in der Pankreas der transgenen
Maus vom Stamm B6C3F1/Huming exprimiert wurde, und in keinem der anderen
untersuchten Gewebe. Da keine transgenen Gewebe außer der Pankreas eine Expression nachweisbarer
Werte der Insulin-RNA zeigten, wurde die Insulinexpression sowohl in der transgenen als
auch Kontroll-Pankreas untersucht, um festzustellen, ob die transgene Pankreas ein
Expressionsort von menschlichem Insulin ist. Pankreatische Inseln von sechs transgenen und sechs
Kontrollmäusen wurden durch Collagenase-Auschluß isoliert (Lacy et al., Diabetes 16: 35-
39 (1967)) und in Gruppen von etwa 80-100 Inselzellen/Gewebekulturvertiefung gezüchtet.
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Am folgenden Tag wurden Teilmengen der Medien entnommen und menschliche C-
Peptidspiegel gemessen. Die Proben von den Gewebekulturvertiefungen, die Inselzellen der
Pankreas transgener Mäuse enthielten, enthielten 250-650 ng/ml menschliches C-Peptid,
aber die Gewebekulturvertiefungen, die Inselzellen der Pankreas von Kontrollmäusen
enthielten, enthielten kein nachweisbares menschliches C-Peptid. Die kultivierten transgenen
Inselzellen exprimierten noch einige Tage menschliches C-Peptid. Nach diesen Experimenten
wurde die endokrine Pankreas als der Hauptort der menschlichen Insulinexpression in
transgenen Mäusen des Stammes B6C3F1/Huming bestimmt.
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Transgene und Kontroll-Pankreaten wurden unter Verwendung eines
Meerschweinchen-Anti-Schwein Insulinantikörpers und eines Ziegen-Anti-Mensch C-Peptid-Antikörpers
mit Immunoperoxidase gefärbt. Der Anti-Schwein Insulinantikörper kreuzreagiert sowohl mit
menschlichem als auch mit Maus-Insulin, und Inselzellen von sowohl transgenen als auch von
Kontrollmäusen werden gefärbt. Die Größe, Verteilung und Anzahl von Inseln war im
wesentlichen bei den transgenen und Kontrollmäusen dieselbe. Von Bedeutung ist, daß nur die
Inselzellen transgener Mäuse und nicht die Inselzellen von Kontrollmäusen unter
Verwendung eines Anti-Mensch-C-Peptid-Antikörpers gefärbt wurden. Dies wiederspiegelt die
Tatsache, daß der Anti-Mensch-C-Peptid-Antikörper geringe oder keine Kreuzreaktivität mit
dem Maus C-Peptid zeigt. Die immunhistochemischen Daten stimmten mit der Northern
Analyse und den zuvor angeführten Studien der Inselfunktion überein, und zeigten, daß die
Inselzellen transgener Mäuse vom Stamm B6C3F1/Huming menschliches Insulin spezifisch
exprimierten.
REFERENZBEISPIEL III
Studien der physiologischen Regulierung von Glucose- und menschlichen
Insulinspiegeln in transgenen Mäusen
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Glucose- und menschliche C-Peptid-Spiegel in transgenen Mäusen vom Stamm
B6C3F1/Huming wurden unter verschiedenen physiologischen Bedingungen untersucht um
festzustellen, ob die normale Glucose-Homöostase erhalten bleibt, und ob die Expression des
menschlichen Insulingens in diesen Mäusen richtig reguliert ist. Zur Untersuchung der
Blutglucoseregulierung wurden Glucose-Toleranztests durchgeführt. Transgene Nachkommen der
Maus #16 und nicht-transgene Geschwister wurden über Nacht fasten gelassen, erhielten eine
intraperitoneale Injektion von Glucose (1 mg/gm Körpergewicht), und es wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion Blutproben zur Bestimmung der
SerumOglucosespiegel genommen. Die Glucose - Toleranzkurve von den transgenen Mäusen ist ähnlich jener
von den Kontrollmäusen (Fig. 2). (Jede Maus wurde willkürlich zur Serumprobennahme zu
einem der folgenden Zeitpunkte nach der Infektion ausgewählt: 5, 10, 20, 30, 45, 60 oder 90
Minuten, dargestellt durch eine Vollinie. Vier Mäuse erhielten keine Glucose und es wurden
Blutproben zur Bestimmung der Serumglucosewerte während des Fastens (gestrichelte Linie)
genommen. Die menschlichen C-Peptidspiegel in den Seren dieser Mäuse wurden unter
Verwendung eines im Handel erhältlichen Testsatzes (Behringwerke AG, Deutschland) unter
den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gemessen. Menschliche
Serum-C-Peptidspiegel dieser transgenen Mäuse sind in Fig. 3 durch eine Vollinie dargestellt, jene der
Kontrollmäuse sind durch eine gestrichelte Linie dargestellt). Von besonderer Bedeutung ist, daß die
Glucosespiegel während des Fastens und bei Maximalsimulation wie auch die Kinetik der
Rückkehr zu basalen Glucosespiegeln bei den transgenen und den Kontrolltieren ähnlich sind.
Zusätzlich erhöhte die intravenöse Verabreichung von Glucagon die Serumglucosespiegel um
etwa 50% innerhalb von 15 Minuten sowohl bei den transgenen als auch bei den
Kontrollmäusen. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, daß die Serumglucosespiegel in
transgenen Mäusen passend moduliert sind. Das Gewicht der transgenen Mäuse, die
Wachstumsraten, das Freßverhalten, die Fortpflanzungsfähigkeit, und die Langlebigkeit erschienen
normal.
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Die Rolle des menschlichen Insulins in der Regulierung von Blutglucosespiegeln in
transgenen Mäusen wurde durch Durchführung eines Glucose-Toleranztests an transgenen
und an Kontrollmäusen untersucht (Fig. 4). In den Seren von hungernden transgenen Mäusen
war kein menschliches C-Peptid nachweisbar. Innerhalb von 10 Minuten nach der
intraperitonealen Verabreichung von Glucose erscheint jedoch menschliches C-Peptid im Serum,
und Höchstwerte werden noch etwa 20 Minuten erhalten. 45 Minuten nach der
Glucoseinjektion fielen die menschlichen C-Peptidspiegel auf Werte, die sich dem Vorstimulations- oder
Basalspiegel näherten. Dieses Muster der menschlichen C-Peptidexpression korrelierte eng
mit den zuvor beschriebenen Glucose-Toleranzkurven und zeigte, daß in transgenen Mäusen
des Stammes B6C3F1/Huming die menschlichen Seruminsulinspiegel durch Glucose passend
reguliert wurden. Zusätzlich glichen diese Daten den Glucose-Toleranzergebnissen, die zuvor
sowohl für Mäuse als auch Menschen berichtet wurden (Larkins, Diabetes 22: 251-255
(1973); Rubenstein in Endocrinology, Band II (Hrsg. DeGroot et al.) 951-957 (Grune und
Stratton, erschienen 1979)). Die Kontrollmäuse exprimierten kein nachweisbares
menschliches C-Peptid, was darauf hinweist, daß das menschliche Gen die Quelle des menschlichen C-
Peptids in den transgenen Mäusen sein muß.
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Insulin wird durch mehrere andere Faktoren reguliert, einschließlich Aminosäuren und
gewisse pharmakologische Mittel. Ein intravenöser Aminosäure-Infusionstest wurde bei
hungernden transgenen und Kontrollmäusen durchgeführt und menschliche C-Peptidspiegel
wurden im Serum bestimmt. Höchstwerte des menschlichen C-Peptids wurden innerhalb von
5 Minuten nach der Aminosäureinfusion beobachtet und nahmen in den folgenden 40
Minuten allmählich ab. Transgene Mäuse vom Stamm B6C3F1/Huming und Kontrollmäuse
wurden über Nacht fasten gelassen, erhielten eine Infusion mit 0,5 mg Arginin und 0,5 mg Leucin
und zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Blutproben zur Bestimmung des menschlichen
C-Peptids genommen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 4 dargestellt. Jeder
Zeitpunkt stellt den Durchschnitt von Werten von vier Tieren dar. Die Vollinien zeigen Daten
von transgenen Mäusen; die gestrichelten Linien zeigen Daten von Kontrollmäusen. Ebenso
sprachen die menschlichen C-Peptid Serumspiegel auf Tolbutamid an, ein
Sulfonylharnstoffderivat, von dem bekannt ist, daß es die Insulinfreisetzung fördert (Ganda, O. P. et alt,
Diabetes 24: 354-361 (1975)). Transgene und Kontrollmäuse wurden über Nacht fasten
gelassen, erhielten eine Infusion mit 0,5 mg Tolbutamid (The Upjohn Company, Michigan), und
zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Blutproben zur Bestimmung des menschlichen C-
Peptids genommen (Fig. 5). Jeder Zeitpunkt stellt den Durchschnitt der Werte von zwei
Tieren dar. Daten von transgenen Mäusen sind durch Vollinien dargestellt; Daten von
Kontrollmäusen sind durch gestrichelte Linien dargestellt.
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Tolbutamid wurde klinisch zur Diagnose von Insulinomen verwendet, da in normalen
Subjekten Seruminsulin- (oder C-Peptid-) Spiegel rasch von ihrem durch Tolbutamid
induzierten Höchstwert auf den Normalwert zurückkehren, aber bei Insulinom-Patienten erhöhte
Insulinspiegel bestehen bleiben (Fajans, S. S. et al., J. Lab. Clin. Med. 54: 811 (1959)).
Innerhalb von 20 Minuten nach der intravenösen Tolbutamid-Verabreichung erreichten die
Serumspiegel von menschlichem C-Peptid ihren Höchstwert, worauf eine rasche Abnahme in
den nächsten 10 Minuten folgte.
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Die Tatsache, daß transgene Mäuse vom Stamm B6C3F1/Huming rasch wieder die
Basalserumspiegel von menschlichem C-Peptid erreichten, bekräftigt die Schlußfolgerung,
daß ihre Insulinexpression streng reguliert ist. Die Tolbutamid-Ergebnisse, die oben angeführt
sind, haben signifikante Auswirkungen für Insulin-Pharmakologen. Heilmittel, von welchen
vermutet wird, daß sie die menschliche Insulinsynthese, Sekretion, Wirkung oder Clearance
beeinflussen, können nun in einem in vivo Tiersystem getestet werden. Die in vivo
Wirkungen verschiedener pharmakologischer Mittel auf die menschliche Genexpression und
Proteinfunktion können nun in einer nicht menschlichen Umgebung bewertet werden.