DE3751863T2

DE3751863T2 - Bestimmung der Insulin Expression

Info

Publication number: DE3751863T2
Application number: DE3751863T
Authority: DE
Inventors: Howard M Prof Goodman; Richard F Selden
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1986-05-20
Filing date: 1987-05-19
Publication date: 1996-12-12
Anticipated expiration: 2007-05-20
Also published as: ATE140846T1; JPH01502716A; ATE212662T1; ES2171401T3; GR3021288T3; EP0247494B1; DE3752347T2; EP0561140B1; ES2090006T3; US6018097A; EP0561140A1; WO1987007298A1; DE3751863D1; DE3752347D1; JPH10108587A; EP0247494A2; EP0247494A3

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung des Effekts eines heterologen Agens auf ein Tier.
Die Möglichkeit, spezifische Gene in das Genom von Säugetierembryos einzugliedern, hat ein zweckdienliches in vivo System zur Analyse der Genkontrolle und -expression geschaffen. Die hocheffiziente Transformation kultivierter Säugetierzellen wurde durch direkte Mikroinjektion spezifischer DNA-Sequenzen in den Zellkern ausgeführt (Capecchi, M., Cell 22:479-488 (1980)). Gordon J.W. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 7380-7384 (1978)) zeigten, daß DNA in Mäuseembryos mikroinjiziert werden und in dem daraus entstehenden Nachkommen festgestellt werden kann. Somit ist gegenwärtige die Möglichkeit, bestimmte transgene Mäuse zu erzeugen, gut beschrieben und in der Wissenschaft gut bekannt.
Das grundlegende Verfahren, das zur Erzeugung transgener Mäuse verwendet wird, erfordert die Gewinnung befruchteter Eier von den Eileitern soeben gepaarter weiblicher Mäuse. DNA, die das Gen enthält, welches in die Maus übertragen werden soll, wird in den männlichen Pronucleus jedes befruchteten Eis mikroinjiziert. Mikroinjizierte Eier werden dann in die Eileiter von einen Tag scheinträchtigen Ammen implantiert und bis zur termingerechten Geburt ausgetragen (Wagner, T.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376-6380 (1981)). Die neugeborenen Mäuse werden dann auf die Gegenwart der mikroinjizierten DNA durch Mittel getestet, die in der Wissenschaft bekannt und geeignet sind, die Gegenwart mikroinjizierter DNA nachzuweisen.
Unter Anwendung von im wesentlichen diesem Verfahren erzeugten Wagner, T.E. et al., erfolgreich eine erwachsene Maus, die zur Expression von Kaninchen-B-Globin imstande war. Die Maus war ferner imstande, Nachkommen zu produzieren, die ebenso das Kaninchen B-Globingen exprimierten. Es wurden zusätzliche geklonte Immunglobulingene in Maus-Keimlinien eingefügt, um transgene Mäuse zu erzeugen, die das geklonte Immunglobulin erzeugen. (Grosschedl, R. et al., Cell 38: 647-658 (1984)), Brinster, R.L. et al., (Nature, 306: 332-336 (1983)). Palmiter, R.D. et al., (Nature, 300: 611-615 (1982) erzeugten transgene Mäuse, welche den Maus-Metallothionein I-Promotor trugen, der an das Strukturgen für das Rattenwachstumshormon geschmolzen war. Es zeigte sich, daß diese Mäuse erhöhte Werte des Rattenwachstumshormons produzierten und ein deutlich verstärktes Wachstum zeigten. Brinster, R.L. et al., Cell 37: 367-379 (1984), injizierten die SV40-Gene der frühen Region und ein Metallothionein-Fusionsgen in befruchtete Mäuseeier, wobei im wesentlichen die zuvor beschriebene Methode anwendet wurde. Ein hoher Prozentsatz der transgenen Mäuse, die sich aus diesen Eiern entwickelten, entwickelten Tumore innerhalb des Plexus choroideus. SV40 T-Antigen-mRNA und Protein wurden sofort in diesem beeinträchtigten Gewebe nachgewiesen. Die SV40 T-Antigen Genexpression war jedoch in nicht beeinträchtigten Geweben oder in anfälligen Geweben vor der offenen Pathologie kaum nachweisbar, was darauf schließen läßt, daß die Tumorbildung von der Aktivierung der SV40-Gene abhing. Diese Arbeit weist darauf hin, daß es möglich ist, die Gene, die für ein Tumorvirus kodieren, in einen Mausembryo zu injizieren und somit eine Maus mit einer Prädisposition für eine Geschwulstentstehung zu erzeugen. Swift, G.M. et al., (Cell 38: 639-646 (1984)) erzeugten eine transgene Maus, die selektiv das Gen für die pankreatische Elastase I der Ratte in hohen Werten in der Maus-Bauchspeicheldrüse exprimierten.
Geklonte Gene können in die Maus-Keimlinie durch Mikroinjektion in die Pronuclei von Maus-Zygoten übertragen werden. Solche mikroinjizierten Gene integrieren sich häufig in die Chromosome, werden während der Entwicklung beibehalten und als Mendel'sche Eigenschaften an die Nachkommen übertragen. (Grosschedl, R. et al.; Wagner, T.E. et al.). Forscher haben berichtet, daß bei Anwendung dieses Verfahrens transgene Mäuse mit einer Effizienz zwischen 10 und 30 Prozent erzeugt werden können. Mikroinjizierte Fremdgene haben eine Tendenz gezeigt, in transgenen Mäusen exprimiert zu werden (Brinster, R.L. et al., Swift, G.M. et al.). Eine derartige Expression kann jedoch nicht vorausgesetzt werden. Lacy, E. et al., Cell 34: 343-358 (1983) offenbaren eine transgene Maus, die das menschliche B-Globin-Gen enthält und im allgemeinen dieses Gen nicht exprimiert. Ebenso hat sich gezeigt, daß die Wachstumshormongene von Ratte und Mensch nicht unter der Kontrolle ihrer eigenen Promotoren in transgenen Mäusen, welche diese Gene tragen, exprimiert werden (Wagner, T.E. et al.; Hammer, O. et al.). Es zeigte sich, daß die Expression des Kücken-Transferringens nur mäßig in der Leber (wo es für gewöhnlich vorzugsweise exprimiert wird) in bezug auf andere Gewebe in einer transgenen Maus, welche das Kücken-Transferringen enthält, verstärkt wird (McKnight, G.S. et al., Cell 34: 335-341 (1983)). Obwohl das Verfahren zur Herstellung transgener Mäuse in der Wissenschaft beschrieben wurde, bleibt jedoch die Fähigkeit, spezifische transgene Mäuse zu erzeugen, die das geklonte Gen richtig exprimieren, ungenau definiert. Es wurde angenommen, daß diese aberranten Ergebnisse die Möglichkeit reflektieren, daß die geklonte DNA in eine essentielle Region des Maus-Chromosoms integriert wurde, die deren Expression modifiziert, oder eine Mutation oder Neuordnung bei der Integration in das Maus-Chromosom erfahren hat.
Es wird angenommen, daß die geklonten Genfragmente beim Eintritt in den Nucleus des einzelligen befruchteten Eis an zufälligen Stellen auf den Maus-Chromosomen eingebaut werden. Sobald die geklonte DNA in diese Stellen eingegliedert ist, ist sie im allgemeinen stabil und führt zu der vererbbaren Übertragung dieser Gene an Mäuse-Nachkommen. Daher wird angenommen, daß die äußerst variable Expression der Thymidinkinase in transgenen Mäusen, welche das Herpes Simplex Virus (Typ 1) Gen tragen, aus einer genetischen Neuordnung resultieren, die eintritt, wenn das Thymidinkinase-Fusionsgen in das Mauschromosom integriert wird (Palmiter, R.D. et al., Cell, 36: 869-877, (1984)).
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung transgener Mäuse ist in Wagner, T. E. et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 81.570 (entsprechend U.S. Patentanmeldung Nr.273.239) beschrieben, das insbesondere eine Maus offenbart, die in ihren Erythrozyten das Kaninchen Beta-Globingen exprimiert.
Es gibt bereits Berichte über Versuche zur Eingliederung des Gens für Human-Insulin in Mäuse (Illmensee, K. et al., "Nuclear and Gene Transplantation in the Mouse". In: Brown B.D., Fox C.F., Hrsg. Developmental Biology Using Purified Genes, Academic Press, New York, S. 607-629 (1981); Burki, K. et al., Embo J. 1:127-131 (1982); Van der Putten, H. et al., Mol. Gen. Genetic 198: 128-138 (1984)). Diese Bemühungen führten zur Herstellung einer Maus, welche die menschlichen Insulinhormon-Gensequenzen enthielt. Die transgene Maus, die von diesen Laboratorien erzeugt wurde, war jedoch nicht imstande, die menschlichen Insulin-Gensequenzen an ihre Nachkommen zu übertragen. Van der Putten, H. et al., zeigten, daß obwohl Maus-Nachkommen, die von einer transgenen (die Insulinsequenz tragenden) Maus abgeleitet wurden, DNA-Sequenzen enthielten, welche die Insulin-Gensequenzregion flankierten, den Maus-Nachkommen alle menschlichen Insulinsequenzen fehlten. Um zu erklären, wie die insulintragenden Sequenzen aus den transgenen Mäusen deletiert werden konnten, während die flankierenden Regionen bei diesen Mäusen erhalten blieben, nahmen Van der Putten, H. et al., eine Keimlinien-spezifische Exzision an, welche die menschlichen Insulinsequenzen spezifisch entfernte. Van der Putten, H. et al. schlossen, daß die Exzision der menschlichen Insulin-Gensequenzen ein allgemeines Phänomen sein könnte, das in einer Anfangsstufe in der Bildung der Keimlinie beim transgenen Weibchen auftritt. In dem von Van der Putten, H. et al., angewandten Verfahren wurde für die Mikroinjektionen eine hohe Anzahl ringförmiger DNA-Moleküle verwendet, die das menschliche Insulingen enthielten.
Schließlich lehrt der Stand der Technik die Möglichkeit, bestimmte transgene Mäuse zu erzeugen, die zu einer gewebespezifischen Expression eines geklonten Gens imstande sind. Der Stand der Technik lehrt jedoch auch die Schwierigkeit der spezifischen Herstellung einer transgenen Maus, die das menschliche Insulingen exprimiert. Obwohl es möglich war, transgene Mäuse zu erzeugen, welche die DNA-Sequenzen des Gens für humanes Insulin tragen, ist von diesen Mäusen nicht bekannt, daß sie humanes Insulin produzieren, und sie sind nicht imstande, Nachkommen hervorzubringen, die das humane Insulingen entweder exprimieren oder tragen (Van der Putten H. et al., Mol. Gen. Genetic 198:128-138 (1984)).
Es ist daher von großem Interesse, ein Verfahren zur Erzeugung einer Maus zu entwickeln, die ein menschliches Hormon oder ein Analog eines menschlichen Hormons exprimiert und welche die Fähigkeit zur Expression dieses Hormons an ihre Maus-Nachkommen durch Vererbung übertragen kann.
Hierin wird ein Verfahren zur Isolierung einer Maus beschrieben, die humanes Insulin exprimiert. Ein cDNA-Fragment, das für einen Teil des humanen Präproinsulins kodiert, wurde zur Sondierung einer menschlichen Genbank in Bakteriophage Lambda Charon 4a verwendet (beschrieben von R.M. Lawn et al., Cell 15: 1157-1174 (1978)). Durch das Screenen der rekombinanten Phagen durch Hybridisierung nach jenen, welche humane Insulin-Gensequenzen enthalten, wurde ein 12,5 Kilobasen EcoRI-Fragment erhalten. Dieses Fragment wurde sequenziert, und es zeigte sich, daß es die vollständige Nucleotidsequenz des geklonten humanen Insulingens enthielt, (Bell, G.I. et al., Nature 284: 26-32 (1980)). Das 12,5 kb EcoRI-Fragment wurde in den männlichen Pronucleus eines einzelligen Mausembryos mikroinjiziert. Der Embryo wurde dann in eine scheinträchtige Amme zur Gestation übertragen. Dieses Verfahren führte zu der Geburt von drei lebensfähigen Mäusen, welche die humanen Insulin-Gensequenzen enthielten, wie durch die Southern-Hybridisierungsanalyse nachgewiesen wurde. Eine dieser drei Mäuse, ein Männchen, wurde zur Erzeugung einer Kolonie von mehreren hundert Nachkommen aufgezogen. Das humane Insulingen wurde in Mendel'scher Weise übertragen, wobei etwa 50% sowohl der F1- als auch F2-Nachkommen das injizierte DNA-Fragment enthielten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Bestimmung des Effekts eines heterologen Agens geschaffen, das eine Droge, ein pharmakologisches oder therapeutisches Mittel ist, auf die Expression oder den Gehalt eines heterologen Proteins, das durch ein Transgen kodiert wird, welches humanes Präproinsulin, Proinsulin oder Insulin ist, wobei die Methode folgendes umfaßt:
(a) Bereitstellen des Agens einem nicht humanen, transgenen Säugetier, dessen Zellen das Transgen enthalten, welches für das heterologe Protein kodiert; und
(b) Untersuchen des Effekts des Agens auf die Expression oder den Gehalt des heterologen Proteins durch Aufzeichnen der Expression oder des Gehalts beim Tier.
Das nicht humane transgene Säugetier kann eine Maus sein.
Eine Targetmaus, deren Zellen eine genetische Sequenz für alle oder einen Teil der humanen Präproinsulin-, Proinsulin- oder Insulingene enthält und die zur Erzeugung von Maus-Nachkommen aufgezogen werden kann, deren Zellen die genetischen Sequenzen enthalten, kann durch eine Methode erhalten werden, welche folgendes umfaßt:
a) Isolieren eines befruchteten Eis von einer ersten weiblichen Maus;
b) Übertragen einer genetischen Sequenz, die das gesamte oder einen Teil des humanen Präproinsulin-, Proinsulin- oder Insulingens enthält, in das befruchtete Ei;
c) Übertragen des befruchteten Eis, das die genetische Sequenz enthält, zu 5 dem Uterus einer zweiten scheinträchtigen weiblichen Maus;
d) Behandeln der zweiten weiblichen Maus, so daß:
i) die zweite weibliche Maus mit einem Embryo trächtig wird, der von dem befruchtete Ei abgeleitet wird, welches die genetische Sequenz enthält;
ii) sich der Embryo zu der Targetmaus entwickelt; und
iii) die Targetmaus lebensfähig von der zweiten weiblichen Maus geboren wird;
wobei die Targetmaus eine genetische Sequenz für humanes Präproinsulin, Proinsulin oder Insulin enthält und zur Erzeugung von Maus-Nachkommen aufgezogen werden kann, deren Zellen die genetischen Sequenzen stabil enthalten.
Die Erfindung kann eine transgene Maus vom Stamm B6C3F1 verwenden, wobei die transgene Maus imstande ist, humanes Insulin in einer auf natürliche Weise regulierten Art stabil zu exprimieren. Ein Human-C-Peptid-Radioimmuntestsatz (Behringwerke AG, Deutschland) wurde für den Nachweis der Expression des humanen Insulingens bei dieser Maus und ihren Nachkommen verwendet. Der Test ist für Human-C-Peptid spezifisch und zeigt eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit dem Maus-C-Peptid. Unter Verwendung dieses Tests wurden mehrere hundert transgene Mäuse unter einer Vielzahl physiologischer Umstände analysiert, und es zeigte sich, daß sie Human-C-Peptid produzieren, wodurch die Expression von humanem Insulinhormon in diesen Mäusen angezeigt wird.
Es zeigte sich, daß die normale Glucose-Homöostase bei diesen Mäusen erhalten blieb, was darauf hinweist, daß die Expression des humanen Insulingens richtig reguliert war. Der Spiegel von humanem Insulin in den transgenen Mäusen zeigte, daß die Insulinexpression sich unter derselben Regulierung und Kontrolle wie entweder humanes Insulin beim Menschen oder Maus-Insulin bei der Maus befand.
Die Erfindung ist signifikant und zweckdienlich, da sie ein Tiermodell für den Test auf Effektoren des humanen Insulinhormons zum Beispiel in einem nicht menschlichen Tier liefert.
Figur 1A zeigt die Gegenwart der humanen Insulin-Gensequenz innerhalb der chromosomalen DNA der transgenen Maus. Figur 1B zeigt die Gegenwart von mRNA des Menschen und der Maus in Geweben von transgenen und Kontrollmäusen.
Figur 2 zeigt die Serumglucosespiegel in transgenen und Kontrollmäusen nach einer intraperitonealen Glucose-Injektion.
Figur 3 zeigt Human-C-Peptidspiegel während eines intravenösen Aminosäuretoleranztests bei transgenen und Kontrollmäusen.
Figur 4 zeigt Human-C-Peptidspiegel während eines intraperitonealen Glucosetoleranztests bei transgenen und Kontrollmäusen.
Figur 5 zeigt Human-C-Peptidspiegel während eines intravenösen Tolbutamidinfusionstests bei transgenen und Kontrollmäusen.
Insulin ist ein Polypeptidhormon, das die vorherrschende physiologische Rolle bei der Regulierung der Nährstoffhomöostase in einem Organismus spielt. Es wird durch die Beta-Zellen der Langerhans-Inseln (in der Folge als "Inselzellen" beschrieben) der Bauchspeicheldrüse synthetisiert. Zirkulierende Insulinspiegel werden durch mehrere kleine Moleküle, vor allem Glucose, Aminosäuren, Fettsäuren und einige pharmakologische Mittel reguliert. Insulin besteht aus zwei Polypeptidketten (A und B, die durch Disulfidbindungen verbunden sind), die von der proteolytischen Spaltung von Proinsulin abgeleitet werden, wodurch äquimolare Mengen des reifen Insulins und eines Verbindungspeptids (C-Peptid) entstehen. Proinsulin wird als Vorläufer produziert, der als Präproinsulin bekannt ist. Präproinsulin wird von der Zelle zu Proinsulin verarbeitet, das dann von der Zelle als das reife Hormon Insulin ausgeschieden wird. Daher kann die Insulinhormonexpression oder der Spiegel durch Messung der Expression oder des Spiegels von Präproinsulin, Proinsulin, Insulin, A-Peptid, B-Peptid oder vorzugsweise C-Peptid getestet werden.
Der Begriff "F1", wie hierin verwendet, bezeichnet die Nachkommen der ersten Generation einer Maus (d.h. deren "Söhne und Töchter"). Der Begriff "F2", wie hierin verwendet, bezeichnet die Nachkommen der zweiten Generation einer Maus (d.h. deren "Enkel").
Der Begriff "humanes Insulin" bezeichnet nicht nur natürliches Insulin, sondern auch alle seine Analoge. Beispiele für solche Analoge sind: das Produkt eines humanen Insulingens, das eine Mutation enthält, welche das dabei entstehende Insulin in seiner Funktion beeinträchtigt, oder ein natürlich vorkommendes Humanprotein, das in seiner Struktur oder Funktion normalem humanen Insulin gleich ist, oder ein neuartiges Insulinhormon, das durch in vitro oder in vivo Mutagenisierung oder Modifizierung des humanen Insulingens entsteht. Der Begriff "humanes Insulin" bezeichnet ferner variante Formen von humanem Insulin. Eine variante Form von humanem Insulin ist ein Molekül, das in seiner Struktur oder Funktion dem humanen Insulin gleich ist, das auf natürliche Weise oder durch eine Erkrankung entsteht und in einer Subpopulation der Gesamtpopulation vorhanden ist.
Der Begriff "heterologes Protein" bezeichnet ein Protein, das normalerweise nicht von einer bestimmten Art produziert wird. Humanes Insulin, Kaninchen-B-Globin sind Beispiele für heterologe Proteine, die in einer Maus erzeugt werden können. Das charakteristische Merkmal transgener Säugetiere ist, daß sie die Gene für heterologe Proteine enthalten und daher die Fähigkeit besitzen, heterologe Proteine zu erzeugen.
Der Begriff "geklontes Gen" bezeichnet eine DNA-Sequenz von Interesse, die isoliert wurde und in das befruchtete Ei einer Maus injiziert werden soll, so daß eine transgene Maus entsteht, welche die geklonten Gensequenzen enthält.
Wie hierin verwendet, sind die Begriffe "Gen", "DNA-Sequenz" oder "genetische Sequenzen" synonym und bezeichnen DNA, die alle Introne oder Exone enthält, die von Natur aus mit dieser DNA verbunden sind. Ein Beispiel eines Gens ist die DNA, die für humanes Präproinsulin und die nicht translatierten und dazwischenliegenden Sequenzen kodiert, die mit dieser DNA-Sequenz assoziiert sind (Bell, G. et al., Nature 284: 26-31 (1980)). Von einer genetischen Sequenz wird behauptet, daß sie von einer zweiten genetischen Sequenz abgeleitet wird, wenn sie entweder eine exakte Kopie der zweiten genetischen Sequenz ist oder wenn sie aus einer Veränderung (d.h. Mutation, Insertion oder Deletion) der zweiten Sequenz resultiert. Eine genetische Sequenz wird als "exprimiert" bezeichnet, wenn das Gen in RNA transcribiert wird und die RNA in Protein translatiert wird.
Das geklonte Gen oder ein Fragment des geklonten Gens wird nach einem von mehreren, in der Wissenschaft allgemein bekannten Verfahren erzeugt und gereinigt. So kann das geklonte Gen synthetisch erzeugt werden oder durch Behandlung von mRNA, die von der Transcription des Gens mit einer reversen Transcriptase abgeleitet wird, so daß eine cDNA-Version des Gens erzeugt wird, oder durch die direkte Isolierung des Gens von einer genomischen Bank oder von anderen Quellen.
Unabhängig davon, wie das geklonte Gen isoliert wird, wird es amplifiziert und von anderen möglichen verunreinigenden Molekülen gereinigt. Es kann jede DNA-Sequenz wie das humane Proinsulingen, eine DNA-Sequenz, die für humanes Insulin kodiert oder das Gen für humanes Präproinsulin, vorzugsweise DNA von Plasmid pgHI 12,5, welches das humane Präproinsulingen enthält (Bell, G. et al.), verwendet werden. Die Sequenz von Insulin, Präproinsulin und Proinsulin ist von Bell, G. et al., offenbart.
Befruchtete Mauseier zur Mikroinjektion werden in cumulus von den Eileitern weiblicher Mäuse gewonnen, die einige Stunden zuvor gepaart worden waren. Obwohl befruchtete Mauseier von Weibchen von Mausstämmen C57BL/6J, SJL/Wt, C3H oder C57/SJL verwendet werden können, wird bevorzugt, befruchtete Mauseier von Eileitern von C57/C3H F1 Weibchen zu verwenden, die mit F1-Männchen gepaart worden waren. Befruchtete Eier in der pronuclearen Stufe (d.h. in jener Stufe, in der die männlichen und weiblichen Pronuclei innerhalb des Zytoplasmas getrennt und voneinander unterscheidbar sind) werden von den Eileitern der trächtigen (C57/C3H) F1 Weibchen gesammelt. Die isolierten befruchteten Eier werden bei 37ºC in M16 Kulturmedium (Whittingham, D.G., J. Reprod. Fertil. Suppl., 14: 7-21 (1971)) inkubiert und 2-4 Stunden bis zur Mikromanipulation gelagert. Die Manipulation der Pipetten, die zum Halten des befruchteten Eis verwendet werden, so daß die Injektion geklonter DNA möglich ist, wird unter Verwendung von Leitz Mikromanipulatoren und mit Paraffinöl gefüllten Hamilton-Spritzen durchgeführt. Die Insulin DNA-Quelle, die diesen Embryos injiziert werden soll, sollte in 0,5 mM Tris (pH=8) 0,5 mM EDTA sein. Ein kleiner Tropfen Kulturmedium mit fünf oder sechs befruchteten Eiern wird auf einen Objektträger gebracht und mit Paraffinöl bedeckt. Zwischen 2 und 20 pl, aber vorzugsweise 5 pl von entweder gereinigtem Insulin-Genfragment oder einem kovalent geschlossenen Plasmid, welches die Insulin-Gensequenz enthält, wird in die Injektionspipette gezogen, die dann neben den Tropfen bewegt wird, der die befruchteten Eier enthält. Ein befruchtetes Ei wird auf der Haltepipette plaziert, so daß der männliche Pronucleus sich neben der Injektionspipette für die anschließende Injektion der Insulin-Genlösung in den Pronucleus befindet. Eine effektive Kopienzahl der Insulin-Gensequenz, zwischen 600 und 20000, aber vorzugsweise 1000 Kopien der Insulin-Gensequenz, wird in jedes befruchtete Ei injiziert. Pro Stunde werden 60-100 Eier injiziert.
Nach der Mikroinjektion in alle Pronuclei werden die befruchteten Eier aus dem Mediumtropfen auf dem Objektträger entfernt und in Kulturröhrchen zur Präimplantationsentwicklung nach dem Verfahren von Wagner, T.E. et al., gebracht. Nach 4 Stunden Kultur bei 37º in M16 Puffer werden 1 oder 2 befruchtete Eier in den Uterus von einen Tag scheinträchtigen ICR-Ammen transplantiert und bis zur zeitgerechten Geburt ausgetragen. Scheinträchtige Mäuse werden durch Paaren von weiblichen Mäusen mit vasektomisierten Männchen erhalten, wie von Hoppe, P. et al., Biol. Reprod. 8: 420-426 (1973) beschrieben ist. Zwischen 10 und 30 Prozent der neugeborenen Säugetiere, die diese Ammen zur Welt bringen, sind transgen (d.h., enthalten in ihre Chromosomen eingebaute Sequenzen des geklonten Gens).
Die Gegenwart dieser eingebauten Sequenzen wird durch Mittel nachgewiesen, die in der Wissenschaft bekannt sind und für den Nachweis des spezifischen geklonten Gens geeignet sind. So wird für den Nachweis eines Gens, das ein Polypeptidprodukt exprimiert oder nicht, eine Southern-Hybridisierungsanalyse ausgeführt. Solche Techniken, wie auch jene, die für rekombinante DNA-Manipulationen erforderlich sind, sind in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, beschrieben, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Geklonte Gene, deren Gegenwart durch die Produktion eines Polypeptids wie Insulin als nachweisbar vorausgesetzt wird, können durch Mittel nachgewiesen werden, die imstande sind, das Produkt des geklonten Gens von jedem endogenen Genprodukt zu unterscheiden (wie zum Beispiel imstande sind, humanes Insulin von Maus-Insulin zu unterscheiden), wie durch den Radioimmuntest, Enzymtest oder durch jedes andere Mittel, das in der Wissenschaft gut bekannt ist.
Obwohl jedes geeignete Mittel für den Nachweis der Expression des geklonten Gens in der transgenen Maus verwendet werden kann, wird die Verwendung eines Radioimmuntests wie dem Human-C-Peptid-Radioimmuntestsatz (im Handel von Behringwerke AG, Deutschland, erhältlich) bevorzugt, der für Human-C-Peptid spezifisch ist und eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit Maus-C-Peptid zeigt und daher zur Unterscheidung der Expression von humanem Insulin von endogenem Maus-Insulin geeignet ist.
Sobald eine transgene Maus identifiziert wurde, wird dann die stabile Beibehaltung und Übertragung des integrierten geklonten Gens durch klassische Mendel'sche Experimente bestätigt, die in der Wissenschaft der Genetik gut bekannt sind. Von einer Maus wird behauptet, daß sie von einer anderen Maus abgeleitet ist, wenn die Mäuse genetisch nicht zu unterscheiden sind oder wenn eine der Mäuse ein Nachkomme der anderen ist. Von einer transgenen Maus wird behauptet, daß sie eine geklonte Gensequenz stabil enthält oder ein Genprodukt eines geklonten Gens stabil exprimiert, wenn einige der F1 oder F2 Nachkommen der transgenen Maus die geklonte Gensequenz enthalten bzw. das geklonte Genprodukt exprimieren und zwar in einer Weise, die entweder im wesentlichen gleich jener der transgenen Maus ist oder die sich im wesentlichen nicht von jener eines nicht transgenen Säugetiers unterscheidet.
Für gewöhnlich ist es wünschenswert, daß das geklonte humane Insulingen nur in bestimmten Geweben exprimiert wird, die jenen Geweben entsprechen, in welchen das geklonte humane Insulingen von Natur aus in seinem natürlichen Wirtorganismus exprimiert wird. Um die Gewebespezifität zu zeigen, ist es ausreichend, Teile verschiedener Gewebe von der transgenen Maus zu analysieren um zu bestimmen, ob diese Gewebe das geklonte Genprodukt exprimieren. So kann ein Protein, das von verschiedenen Geweben abgeleitet wurde, durch Radioimmuntest oder durch ein anderes Mittel auf die Gegenwart des geklonten Genprodukts getestet werden. Als Alternative kann RNA von mehreren Geweben bereitet und an eine ³²P- oder anders radiomarkierte (oder biotinylierte), nicktranslatierte humane Insulin-cDNA-Sonde durch in der Wissenschaft bekannte Mittel hybridisiert werden (Maniatis, T. et al.).
Die Expression der geklonten humanen Insulin-Gensequenzen wird vorzugsweise in einer transgenen Maus durch denselben Mechanismus "natürlich reguliert", wie dies beim natürlichen menschlichen Wirt der Fall ist.
Der Begriff "natürlich reguliert" bedeutet, daß das Gen in einer physiologisch passenden Weise reguliert wird. Somit kann die Expression des Gens nicht konstitutiv sein, sondern als Reaktion auf die Anforderungen, Aktivitäten und Effektoren der transgenen Maus schwanken. "Natürliche Regulierung" erfordert, daß das geklonte humane Insulingen nicht in allen Geweben und Organen der Maus exprimiert wird, sondern nur in jenen Geweben und Organen, in welchen das geklonte Insulingen in seinem natürlichen Wirt exprimiert wurde. Ferner erfordert eine solche "natürliche Regulierung", daß die Insulin-Gensequenzen, ihre entsprechenden mRNA-Transcripte und die Proteine, die aus diesen Transcripten erzeugt werden, "natürlich verarbeitet" werden. Der Begriff "natürlich verarbeitet" umfaßt Schritte wie die mRNA-Transcription, das Spleißen und die proteolytische Spaltung von Protein-Vorläufermolekülen (wie Präproinsulin oder Proinsulin). Zusätzlich bewirkt die "natürliche Regulierung" einen Insulingen-Expressionswert, der innerhalb eines für gewöhnlich vorgefundenen physiologischen Bereichs und nicht in einem anomalen Bereich liegt. Der physiologisch normale Bereich der Insulinkonzentration bei einer Maus ist 0-100 uE/ml. Daher wäre zum Beispiel die Expression des humanen Präproinsulingens in einer transgenen Maus "natürlich reguliert", wenn (1) die Expression nur in den Inselzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus eintritt, (2) das produzierte Präproinsulin auf natürliche Weise zu Proinsulin verarbeitet wird und das auf natürliche Weise produzierte Proinsulin ferner auf natürliche Weise zu Insulin verarbeitet wird, das auf natürliche Weise in das Kreislaufsystem der Maus sezerniert wird, (3) die Menge an produziertem Präproinsulin, Proinsulin und Insulin innerhalb eines normalen physiologischen Bereichs liegt, (4) die Gegenwart von Affektoren der Insulinexpression (wie Glucose oder Aminosäuren) eine Veränderung in der Menge und Konzentration von humanem Präproinsulin, Proinsulin und Insulin in einer Weise herbeiführt, die im wesentlichen mit jener identisch ist, in der Maus-Präproinsulin, Proinsulin und Insulin bei der Maus schwanken oder humanes Präproinsulin, Proinsulin und Insulin beim Menschen schwanken.
Transgene Mäuse, welche das humane Insulinhormon produzieren, sind für die pharmazeutische Industrie besonders zweckdienlich. Solche Mäuse liefern zum ersten Mal ein in vivo nicht humanes Tiermodell zur Bestimmung des Effektes eines Wirkstoffes oder eines anderen Agens auf die menschlichen Insulinwerte. Gegenwärtig sind für jeden Versuch, eine derartige Bestimmung vorzunehmen, Freiwillige oder Patienten erforderlich. Die ethischen Beschränkungen, die bei der Forschung mit menschlichen Probanden vorgefunden werden, begrenzen die Art und den Umfang der Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen humanem Insulin und therapeutischem Mittel.
In einer exakt analogen Weise könnten die pharmakologischen Effekte, der therapeutische Wert und die medizinische Bedeutung eines Agens bestimmt werden, indem das Agens einem transgenen Säugetier verabreicht und der mögliche Effekt des Agens auf die Expression und den Spiegel des heterologen Proteins, das von dem transgenen Säugetier produziert wird, bestimmt wird. Wenn daher ein transgenes Tier hergestellt wird, das heterologes Protein vorwiegend in seinem Plexus choroideus erzeugt (wie dies Swift, G.M. et al., taten), könnten die Effekte von Mitteln auf den Plexus choroideus oder die Fähigkeit der Mittel, in den Plexus choroideus einzudringen, durch Untersuchung der Expression von heterologem Protein bestimmt werden. Daher lehrt die vorliegende Erfindung mehr als die Verwendung transgener Säugetiere zur Untersuchung der Insulinexpression; die vorliegende Erfindung offenbart die Nützlichkeit transgener Säugetiere und insbesondere transgener Mäuse in der allgemeinen Untersuchung der Pharmakologie und Medizin.
Die Möglichkeit, eine transgene Maus herzustellen, die ein Analog des humanen Insulins exprimiert, ermöglicht Untersuchungen der Struktur und Funktion des Insulinhormons. Früher war es schwierig, derartige Studien durchzuführen, da Individuen, welche solche Analoge exprimieren, selten sind und da die von solchen Probanden oder Patienten erzeugten Hormonmengen stark begrenzt sind. Im Gegensatz dazu erlaubt die Möglichkeit, transgene Mäuse zu erzeugen, welche Analoge von humanem Insulin exprimieren, die Reinigung und Charakterisierung solcher Analoge. Die Menge der verfügbaren natürlichen Analoge wäre nur durch die Größe der in der Untersuchung verwendeten Mauskolonie begrenzt. Ferner liefert die Möglichkeit, Insulin-Gensequenzen in vitro zu manipulieren und diese Sequenzen wieder in eine Maus einzugliedern, wodurch eine transgene Maus entsteht, die ein neuartiges Insulinhormon exprimiert, ein außerordentliches Werkzeug zur Untersuchung des Verhältnisses zwischen der Struktur und Funktion von Hormonen.
Von Bell, G.I. et al., wird der E. coli Stamm beschrieben, der das Plasmid pgHI 12,5 enthält.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird diese mit Bezugnahme auf einige spezifische Beispiele näher erklärt, die hierin nur dem Zweck der Veranschaulichung dienen und, falls nicht anders angegeben, nicht als Einschränkung der Erfindung gedacht sind.

Beispiel I

Herstellung des geklonten Insulinfragments

Insulin-mRNA wurde aus pankreatischen Zellen isoliert und zur Herstellung einer cDNA-Sonde verwendet (Lawn, R.M. et al.; Bell, G.I. et al.). Eine menschliche Genbank in Bakteriophage Lambda Charon 4A wurde in Gegenwart der cDNA-Sonde inkubiert. Zwei von etwa 10&sup6; Phagen hybridisierten mit der Sonde. Einer dieser Klone enthielt ein 12,5 kb EcoRI-Fragment, welches die vollständige Nucleotidsequenz des geklonten humanen Präproinsulingens enthielt. Dieses 12,5 kb Fragment wurde in das Plasmid pBR322 subgeklont und als pgHI 12,5 bezeichnet, in das Bakterium E. coli, Stamm DK1, eingefügt und dadurch amplifiziert. Nach der Amplifizierung wurde das 12,5 kb Fragment aus dem Plasmid geschnitten und gereinigt. Etwa 1000 Kopien dieses Fragments wurden in den männlichen Pronucleus von einzelligen Mausembryos mikroinjiziert, die dann scheinträchtigen Ammen zur Gestation übertragen wurden. Von 46 Mäusen, die nach einer Injektionsreihe geboren wurden, enthielten drei (etwa 7%) humane Insulin-Gensequenzen wie durch Southern-Hybridisierungsanalyse nachgewiesen wurde. Es zeigte sich, daß eine Maus, ein Männchen, 5 bis 10 Kopien des humanen Insulin-Genfragments pro haploidem Genom enthielt, und diese wurde weiter charakterisiert. Diese Maus wurde zur Erzeugung einer Kolonie von mehreren hundert Nachkommen aufgezogen, und es zeigte sich, daß die humanen Insulin-Gensequenzen auf Mendel'sche Weise übertragen wurden, wobei etwa 50% sowohl der F1 als auch F2 Nachkommen das injizierte DNA-Fragment erbten. Maus Nr. 16, die sich als eine transgene, das humane Insulingen produzierende Maus erwies, wurde mit einer weiblichen Maus vom Stamm B6C3F1 zur Erzeugung von Maus-Nachkommen aufgezogen. Durch die Testung auf die Human-Insulinproduktion bei diesen Mäusen und die selektive Paarung von Human-Insulin-produzierenden Geschwistern wurde eine Kolonie homozygoter, Human-Insulin-produzierender Mäuse erhalten. Diese homozygoten, Human-Insulin-produzierenden Mäuse wurden als B6C3F1/Huming bezeichnet.
Die Charakterisierung der transgenen Mäuse ist in Figur 1A dargestellt. Die chromosomale DNA von mehreren Mäusen wurde untersucht, um zu bestimmen, ob die Mäuse humane Insulin-DNA-Sequenzen trugen. DNA-Proben wurden mit Pvu II aufgeschlossen und durch eine Southern-Hybridisierungsanalyse (Maniatis, T. et al.) unter Verwendung eines radiomarkierten 1594 bp Pvu II-Fragments (das in dem humanen 12,5 kb Insulin-DNA-Fragment enthalten ist) als Sonde analysiert. Die Bahnen 1, 2 und 5 zeigten eine Hybridisierung zwischen der Sonde und den genomischen Sequenzen der transgenen Mäuse. Bahn 3 zeigt das Fehlen einer Hybridisierung zwischen der Sonde und den genomischen Sequenzen einer nicht transgenen Geschwistermaus. Bahn 4 zeigt die Hybridisierung zwischen der Sonde und genomischer DNA einer menschlichen Kontrolle. Bei der Southern-Blot-Analyse wurden 8 ug der gesamten genomischen DNA bei jeder Maus mit Pvu II aufgeschlossen, einer Elektrophorese auf einem 0,9% Agarosegel unterzogen und dann auf Nitrozellulose übertragen. Der Filter wurde dann über Nacht vorhybridisiert, auf eine ³²P-markierte genomische Human-Insulinsonde hybridisiert, gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die genomische Insulinsonde war ein Fragment, das sich von einer Bgl II-Stelle bei -169 in bezug auf die Transcriptionsanfangsstelle des humanen Insulingens zu einer Ava I-Stelle bei + 644 erstreckt. Zusätzlich zu den Promotorsequenzen enthielt dieses Fragment das erste Intron, das erste Exon (einschließlich der Sequenzen, die für das Signalpeptid, B-Peptid und einen Teil des C-Peptids kodieren) und einen Teil des zweiten Introns. Die genomische humane Insulinsonde zeigte eine begrenzte Kreuzhybridisierung mit den endogenen Maus-Insulingenen.

Beispiel II

Bestätigung der Expression des geklonten humanen Insulinhormongens in der Maus

Die Gegenwart von DNA, welche humane Insulin-Gensequenzen enthält, wurde bei der Maus B6C3F1/Huming unter Verwendung der Southern-Hybridisierungsanalyse nachgewiesen. Zur Bestimmung der Gewebespezifität der humanen Insulingenexpresssion bei der transgenen Maus wurden sowohl RNA-Analysen als auch Untersuchungen der Funktion der Langerhans-Inseln durchgeführt. Die gesamte RNA von mehreren Geweben wurde von transgenen Mäusen und nicht-transgenen Geschwistern zubereitet. Diese RNA wurde durch Elektrophorese auf 1,2% Agarose-Formaldehydgelen getrennt, auf Nitrozellulose übertragen und an eine ³²P-markierte, nicktranslatierte humane Insulin-cDNA-Sonde hybridisiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 1B dargestellt (Bahn 1, RNA von der Leber einer nicht transgenen Maus; Bahn 2, RNA von der Bauchspeicheldrüse einer nicht transgenen Maus; Bahn 3, RNA von der Leber einer transgenen Maus; Bahn 4, RNA von der Bauchspeicheldrüse einer transgenen Maus), obwohl die pankreatische RNA sowohl von den transgenen als auch den Kontrollmäusen an die humane Insulin-cDNA-Sonde hybridisierte, zeigten die RNAs von transgener und Kontroll-Leber, Milz, Gehirn, Niere, Herz, Darm, Lunge und Muskel keine Hybridisierung. Weder die Maus-Insulin-cDNA noch Gensequenzen wurden bestimmt, aber da die kodierenden Regionen der Insulin-RNA von Ratte und Mensch eine Sequenzhomologie von 81% aufweisen (Bell, G.I. et al.), wurde erwartet, daß sowohl die transgene als auch die Kontroll- pankreatische RNA an die Humansonde hybridisiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß das humane Insulingen nur in der Bauchspeicheldrüse der transgenen Maus vom Stamm B6C3F1/Huming exprimiert wurde und in keinem der anderen getesteten Geweben. Da keine transgenen Gewebe mit Ausnahme der Bauchspeicheldrüse gefunden wurden, die nachweisbare Werte von Insulin-RNA exprimieren, wurde die Insulinexpression sowohl in der transgenen als auch in der Kontrollbauchspeicheldrüse untersucht, um zu bestimmen, ob die transgene Bauchspeicheldrüse eine Stelle der Human-Insulinexpression ist. Pancreatische Langerhans-Inseln von sechs transgenen und sechs Kontrollmäusen wurden durch Kollagenaseaufschluß isoliert (Lacy et al., Diabetes 16:35-39 (1967)) und in Gruppen von etwa 80-100 Inselzellen/Gewebekulturvertiefung kultiviert. Am folgenden Tag wurden Teilmengen der Medien entnommen und die Human-C-Peptidwerte gemessen. Die Proben von den Gewebekulturvertiefungen, die Inselzellen von der Bauchspeicheldrüse transgener Mäuse enthielten, enthielten 250-650 ng/ml Human-C-Peptid, aber die Gewebekulturvertiefungen, die Inselzellen von der Bauchspeicheldrüse von Kontrollmäusen enthielten, enthielten kein nachweisbares Human-C-Peptid. Die kultivierten transgenen Inselzellen exprimierten noch mehrere Tage Human-C-Peptid. Aus diesen Experimenten wurde die Hauptstelle der Human-Insulinexpression bei transgenen Mäusen vom Stamm B6C3F1/Huming als die endocrine Bauchspeicheldrüse bestimmt.
Transgene und Kontrollbauchspeicheldrüsen wurden unter Verwendung eines Anti-Schwein-Insulin-Antikörpers vom Meerschweinchen und eines Anti-Human-C-Peptid-Antikörpers von der Ziege mit Immunoperoxidase gefärbt. Der Anti-Schwein-Insulin-Antikörper kreuzreagiert sowohl mit humanem als auch Maus-Insulin, und die Inselzellen sowohl der transgenen als auch Kontrollmäuse werden gefärbt. Die Größe, Verteilung und Anzahl von Inseln waren sowohl bei den transgenen als auch Kontrollmäusen im wesentlichen gleich. Es ist von Bedeutung, daß nur die Inselzellen transgener Mäuse, aber nicht die Inselzellen von Kontrollmäusen unter Verwendung eines Anti-Human-C-Peptid-Antikörpers gefärbt wurden. Dies widerspiegelt die Tatsache, daß der Anti-Human-C-Peptid-Antikörper eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit dem Maus-C-Peptid zeigte. Die immunhistochemischen Daten stimmten mit der Northern-Analyse und den zuvor angeführten Studien zur Inselfunktion überein und zeigten, daß die Inselzellen transgener Mäuse vom Stamm B6C3F1/Huming spezifisch Human-Insulin exprimierten.

Beispiel III

Studien der physiologischen Regulierung von Glucose- und Human-Insulinspiegel bei den transgenen Mäusen

Glucose- und Human-C-Peptid-Werte in transgenen Mäusen vom Stamm B6C3F1/Huming wurden unter einer Reihe von physiologischen Bedingungen untersucht, um zu bestimmen, ob normale Glucose-Homöostase erhalten bleibt und ob die Expression des Human-Insulingens bei diesen Mäusen richtig reguliert wird. Zur Untersuchung der Blutglucoseregulierung wurden Glucosetoleranztests durchgeführt. Transgene Nachkommen der Maus #16 und nicht transgene Geschwister wurden über Nacht fasten gelassen, erhielten eine intraperitoneale Glucose-Injektion (1 mg/g Körpergewicht), und nach der Injektion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten zur Bestimmung der Serumglucosespiegel Blut abgenommen. Die Glucosetoleranzkurve von den transgenen Mäusen ist ähnlich jener von den Kontrollmäusen (Fig. 2). (Jede Maus wurde willkürlich zur Serumprobennahme zu einem der folgenden Zeitpunkte nach der Infektion gewählt: 5, 10, 20, 30, 45, 60 oder 90 Minuten, wie durch die Vollinie dargestellt ist. Vier Mäuse erhielten keine Glucose, und ihnen wurde Blut abgenommen, um die Nüchtern-Serumglucosespiegel zu bestimmen (gestrichelte Linie). Die Human-C-Peptid-Werte in den Seren dieser Mäuse wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Gerätesatzes (Behringwerke AG, Deutschland) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen gemessen. Serum-Human-C-Peptid-Werte dieser transgenen Mäuse sind in Figur 3 durch eine Vollinie dargestellt; jene der Kontrollmäuse sind durch eine gestrichelte Linie dargestellt. Von besonderer Bedeutung ist, daß die nüchternen und maximal stimulierten Glucosespiegel wie auch die Kinetik der Rückkehr zu basalen Glucosespiegel bei den transgenen und Kontrolltieren gleich sind. Zusätzlich erhöhte die intravenöse Verabreichung von Glucagon sowohl bei den transgenen als auch bei den Kontrollmäusen die Serumglucosespiegel innerhalb von 15 Minuten um etwa 50%. Insgesamt lassen diese Ergebnisse stark darauf schließen, daß Serumglucosespiegel bei den transgenen Mäusen richtig moduliert werden. Das Gewicht der transgenen Mäuse, die Wachstumsraten, das Freßverhalten, die Fortpflanzungsfähigkeit und die Lebensdauer erscheinen normal.
Die Rolle von humanem Insulin bei der Regulierung der Blutglucosespiegel bei transgenen Mäusen wurde untersucht, indem ein Glucosetoleranztest bei transgenen und Kontrollmäusen durchgeführt wurde (Fig. 4). In den Seren von nüchternen transgenen Mäusen war kein Human-C-Peptid nachweisbar. Innerhalb von 10 Minuten nach der intraperitonealen Verabreichung von Glucose jedoch erscheint Human-C-Peptid in dem Serum und Höchstwerte werden in etwa 20 Minuten erreicht. 45 Minuten nach der Glucoseinjektion fielen die Human-C-Peptid-Werte auf Werte, die nahe jenen vor der Stimulation oder den Basalwerten waren. Dieses Muster der Human-C-Peptidexpression stimmte annähernd mit den zuvor beschriebenen Glucosetoleranzkurven überein und wies darauf hin, daß bei transgenen Mäusen vom Stamm B6C3F1/Huming die Serum-Human-Insulinspiegel durch Glucose richtig reguliert wurden. Zusätzlich waren diese Daten den zuvor sowohl für transgene Mäuse als auch Menschen berichteten Glucosetoleranzergebnissen gleich (Larkins, Diabetes 22: 251-255 (1973); Rubenstein, in Endocrinology, Bd. II (Hrsg. De Groot et al.) 951-957 (Grune and Stratton, Veröff. 1979)). Die Kontrollmäuse exprimierten kein nachweisbares Human-C-Peptid, was darauf hinweist, daß das menschliche Gen die Quelle für das Human-C-Peptid in den transgenen Mäusen sein muß.
Insulin wird durch mehrere andere Faktoren, einschließlich der Aminosäuren und bestimmten pharmakologischen Mitteln, reguliert. Es wurde ein intravenöser Aminosäure-Infusionstest bei nüchternen transgenen und Kontrollmäusen durchgeführt und die Human-C-Peptidwerte im Serum bestimmt. Human-C-Peptid-Höchstwerte wurden innerhalb von 5 Minuten nach der Aminosäureinfusion beobachtet und nahmen allmählich in den folgenden 40 Minuten ab. Transgene Mäuse vom Stamm B6C3F1/Huming und Kontrollmäuse wurden über Nacht fasten gelassen, erhielten 0,5 mg Arginin und 0,5 mg Leucin infundiert und es wurde zu den bei der Human-C-Peptidbestimmung angegebenen Zeitpunkten Blut abgenommen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 4 dargestellt. Jeder Zeitpunkt stellt den Durchschnitt der Werte von vier Tieren dar. Die Vollinien geben Daten von transgenen Mäusen wieder; die gestrichelten Linien geben Daten von Kontrollmäusen wieder. Ebenso reagieren die Human-C-Peptidwerte auf Tolbutamid, einem Sulfonylharnstoffderivat, von dem bekannt ist, daß es die Insulinfreisetzung fördert (Ganda, O.P et al., Diabetes 24: 354-361 (1975)). Transgene und Kontrollmäuse wurden über Nacht fasten gelassen, erhielten 0,5 mg Tolbutamid (The Upjohn Company Michigan) infundiert und es wurde zu den bei der Human-C-Peptidbestimmung angegebenen Zeitpunkten Blut abgenommen Figur 5). Jeder Zeitpunkt stellt den Durchschnitt der Werte von zwei Tieren dar. Die Daten von transgenen Mäusen sind in Vollinien dargestellt; die Daten von Kontrollmäusen sind in gestrichelten Linien dargestellt.
Tolbutamid wurde in der Klinik zur Diagnose von Insulinoma verwendet, da bei normalen Subjekten Seruminsulin- (oder C-Peptid-) Werte rasch auf den Normalwert von ihrer durch Tolbutamid induzierten Spitze zurückkehren, aber bei Patienten mit Insulinoma erhöhte Insulinwerte bestehen bleiben (Fajans, S.S. et al., J. Lab. Clin. Med. 54: 811 (1959)). Innerhalb von 20 Minuten nach der intravenösen Tolbutamidverabreichung erreichten die Serum-Human-C-Peptidwerte ein Maximum, wonach in den folgenden 10 Minuten eine rasche Abnahme erfolgte.
Die Tatsache, daß transgene Mäuse vom Stamm B6C3F1/Huming rasch wieder die basalen Human-C-Peptidserumwerte erreichten, bekräftigt den Schluß, daß ihre Insulinexpression knapp reguliert war. Die zuvor angeführten Tolbutamidergebnisse haben eine signifikante Bedeutung für Insulin-Pharmakologisten. Wirkstoffe, von welchen angenommen wird, daß sie die Human-Insulinsynthese, -sekretion, -wirkung oder -clearance beeinflussen, können nun in einem in vivo-Tiersystem getestet werden. Die in vivo-Effekte verschiedener pharmakologischer Mittel auf die humane Genexpression und Proteinfunktion können nun in einer anderen Umgebung als jener des Menschen getestet werden.
Die Erfindung wurde zwar in Verbindung mit besonderen Ausführungsbeispielen beschrieben, aber es versteht sich, daß weitere Modifikationen möglich sind.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Effekts eines heterologen Agens, das eine Droge, ein pharmakologisches oder eines therapeutisches Mittel ist, auf die Expression oder den Gehalt eines heterologen Proteins, das durch ein Transgen kodiert wird, welches humanes Präproinsulin, Proinsulin oder Insulin ist, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

(a) Bereitstellen des Agens einem nicht humanen, transgenen Säugetier, dessen Zellen das Transgen enthalten, welches für das heterologe Protein kodiert;

(b) Untersuchen des Effekts des Agens auf die Expression oder den Gehalt des heterologen Proteins durch Aufzeichnen der Expression oder des Gehalts beim Tier.

2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei das Agens die Insulinsynthese, -sekretion, -wirkung oder -clearance beeinflußt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Agens ein Sulphonylharnstoff-Insulinfreisetzungspromotor wie Tolbutamid ist.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Transgen nur in den Inselzellen der Bauchspeicheldrüse des Säugetiers exprimiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Transgen Präproinsulin kodiert, das zu Proinsulin und dann Insulin verarbeitet werden kann, wobei das Insulin auf natürliche Weise in das Gefäßsystem des Tiers ausgeschüttet wird.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das heterologe Protein, das durch das Transgen kodiert wird, natürlich verarbeitet wird, so daß der Wert der Insulinexpression innerhalb des für gewöhnlich auftretenden physiologischen Bereichs liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der C-Peptid-Gehalt in den Zellen der Bauchspeicheldrüse 250 bis 650 ng/ml beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gegenwart von Affektoren der Insulinexpression bewirkt, daß die Menge und Konzentration von Präproinsulin, Proinsulin und Insulin in einer Weise schwankt, die im wesentlichen mit jener bei Menschen identisch ist.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das nicht humane, transgene Tier eine Maus ist.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das transgene Säugetier eine Maus ist, die vom Stamm B6C3DF1/Huming abgeleitet ist.