DE69728263T2

DE69728263T2 - H2-M modifizierte transgene Tiere

Info

Publication number: DE69728263T2
Application number: DE69728263T
Authority: DE
Inventors: Wai-Ping Leung; Lars Karlsson; Lubing Zhou; A. Per PETERSON
Original assignee: Ortho McNeil Pharmaceutical Inc
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-01-16
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2017-01-11
Also published as: DK0900002T3; WO1997025861A1; JP2000503209A; DE69728263D1; AU1697797A; EP0900002A4; CA2242400A1; AU724240B2; EP0900002A1; ATE262585T1; EP0900002B1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene nicht menschliche Tiere, in denen das H2-Ma-Gen verändert ist, was ein Tier ergibt, dem funktionelles H2-M fehlt.
Hintergrund der Erfindung
Die genauen Rollen von H2-M im Immunsystem, bei der normalen Gewebeentwicklung und -aufrechterhaltung sowie in der embryonalen und fötalen Entwicklung sind zu diesem Zeitpunkt nicht gut verstanden. Aufgrund der bekannten Beteiligung von H2-M bei der Präsentation von exogenen antigenen Peptiden auf Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II-Molekülen sind H2-M Proteine wichtige Wirkstoffziele für die Modulation von Immunantworten.
Die Erzeugung von H2-M modifizierten transgenen Tieren würde bei der Definition der biologischen Rolle(n) von H2-M helfen und ein Tiermodell der H2-M Defizienz produzieren, das bei dem Aufbau und Vermittlung von chemischen und biologischen Ansätzen verwendet werden kann, um die H2-M Aktivität zu modulieren. Solche H2-M modifizierten transgenen Tiere können auch als eine Quelle von Zellen für die Zellkultur verwendet werden.
Die Funktion von MHC Klasse II-Molekülen ist es, fremde Antigene gegenüber T-Lymphozyten zu präsentieren. MHC Klasse II-Moleküle sind auf der Zelloberfläche trimere Komplexe der α und β-Ketten, die mit Peptiden assoziiert sind, die von abgebauten Proteinen abgeleitet sind. Während der Infektion werden die Peptide von dem eindringenden Organismus abgeleitet, was zur Antigen-spezifischen Aktivierung von T-Lymphozyten führt. T-Lymphozyten werden auch durch nicht-selbst MHC Klasse II-Moleküle aktiviert, was die Basis der Graft-Abstoßung ist.
MHC Klasse II-Moleküle werden hauptsächlich auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, die von Knochenmark abgeleitet sind. Es gibt drei verschiedene MHC Klasse II-Moleküle, HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR, während die Maus zwei MHC Klasse II-Moleküle aufweist, H2-A und H2-E. Das Verfahren des Antigenabbaus und der Peptidassoziierung mit MHC Klasse II findet im endosomalen System der Antigen-präsentierenden Zelle statt. Intrazelluläre MHC Klasse II-Moleküle werden mit einer dritten Kette assoziiert, der invarianten Kette. Die invariante Kette weist verschiedene Funktionen auf; sie blockiert die Bindung von Peptiden und Proteinen an MHC Klasse II im endoplasmatischen Reticulum (ER); sie erleichtert den MHC Klasse II-Transport aus dem ER hinaus und sie leitet die MHC Klasse II zu den Endosomen, wo die Peptidbeladung stattfindet. Bevor die Peptidbeladung von MHC Klasse II stattfinden kann, muß die invariante Kette entfernt werden. Proteolyse und saurer pH führen zum Abbau und dem Entfernen des meisten der invarianten Kette, jedoch kann ein finales Fragment, CLIP (Klasse II-assoziierte invariante Kettenpeptid) genannt, nicht durch Proteolyse entfernt werden, und ein Austausch dieses Fragments durch antigene Peptide wird durch HLA-DM (in Menschen, in der Maus H2-M) katalysiert, das in MHC Klasse II exprimierenden Zellen endosomal oder lysosomal vorhanden ist. Zellinien, denen funktionelles HLA-DM fehlt, können Antigene nur schwer prozessieren und präsentieren und anstelle der MHC Klasse II-Moleküle auf der Zelloberfläche dieser Zellinien enthalten sie das CLIP-Peptid (Fling et al., 1994, HLA-DMA and -DMB genes are both required for MHC class II/peptide complex formation in antigen-presenting cells. Nature 368, 554–8; Morris et al., 1994, An essential role for HLA-DM in antigen presentation by class II major histocompatibility molecules. Nature 368, 551–4). Die Rück-Einführung von HLA-DM in diese Zellen stellt die Fähigkeit wieder her, Antigene zu prozessieren, was zeigt, daß HLA-DM wichtig ist für die Modulation des Peptidgehalts von MHC Klasse II-Molekülen. In vitro-Experimente haben gezeigt, daß gereinigtes HLA-DM direkt den Peptidaustausch in den gereinigten MHC Klasse II-Molekülen vermitteln kann, was zu einem Austausch von CLIP oder anderen schlecht passenden Peptiden mit gut passenden Peptiden führt (Denzin and Cresswell, 1995, HLA-DM induces CLIP dissociation from MHC class II αβ dimers and facilitates peptide loading. Cell 82, 155–165; Sloan et al., 1995, Mediation by HLA-DM of dissociation of peptides from HLA-DR. Nature 375, 802–806). Das Mausmolekül, H2-M, kann in menschlichen Zellinien und in vitro für HLA-DM substituieren, jedoch wurden bis jetzt keinen in H2-M defekten Mauszellinien publiziert (Karlsson et al., 1994, Reconstitution of an operational MHC class II compartment in nonantigen-presenting cells. Science 266, 1569–1573; Morris et al., 1994, supra).
MHC Klasse I- und Klasse II-Moleküle sind für die Funktion des Immunsystems wesentlich, da die Aktivierung von T-Zellen jedes der zwei Klassen von MHC-Molekülen erfordert. In einer normalen Situation stellt das Immunsystem einen guten Schutz gegen infektiöse Mittel und möglicherweise gegen die Tumorentwicklung zur Verfügung. Jedoch können viele pathologische Zustände aus nicht wünschenswerten Immunantworten resultieren. Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel Rheumatoide Arthritis und systemischer Lupus Erythematosus sind typische Beispiele der Selbstangriffe durch das deregulierte Immunsystem, die zu chronischer Entzündung und gegebenenfalls dem Verlust der Funktion der Zielorgane führen. Die Abstoßung von Grafts ist ein weiteres Beispiel von unerwünschter Reaktivität des Immunsystems bei der Transplantation.
Die vorhandenen Behandlungsoptionen für chronische Entzündungserkrankung sind auf die Minimierung der Effekte der entzündlichen Reaktion gerichtet. Für schwere Fälle, wie zum Beispiel Organtransplantationen, werden die Patienten mit immunsuppressiven Wirkstoffen behandelt. Diese Wirkstoffe sind jedoch nicht spezifisch, da die meiste Reaktivität des Immunsystems verringert wird und die behandelten Patienten gegenüber allen Arten von Infektionen empfindlich werden. Viele Autoimmunerkrankungen sind mit bestimmten MHC Klasse II-Allelen assoziiert, obwohl es unklar ist, wie diese Assoziierung mit MHC Klasse II-vermittelter Antigenpräsentation assoziiert ist. Es ist möglich, daß die Fähigkeit, nur MHC Klasse II-vermittelte T-Zell-Aktivierung zu modulieren, die meisten der unerwünschten Immunreaktivität kontrollieren könnte, während immer noch ein Schutz gegen Infektionen durch MHC Klasse I-restringierte T-Lmyphozyten verbleibt.
Zusammenfassung der Erfindung
Mäuse, die kein funktionelles H2-M aufweisen, wurden erzeugt und sind hier beschrieben. Diese Mäuse stellen ein wertvolles Tiermodell zur Verfügung, um die Funktion von H2-M zu verstehen und die therapeutischen Effekte von Wirkstoffen zu ermitteln, die die Funktion oder die Expression von HLA-DM in menschlichen Zellen modulieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1, Tafeln A, B, C, D und E. Unterbrechung des Maus-H2-Ma-Gens. (A) Karte, die die Organisation des H2-Ma-Gens vor (oben) und nach (unten) der homologen Rekombination mit dem abzielenden Konstrukt (Mitte) zeigen. Ein 6,7 kb DNA-Fragment eines 129/Sv Maus-genomischen Klons, das das meiste des H2-Ma-Gens aus der Exon 1 und einen Teil von Intron 1 abdeckte, wurde in dem abzielenden Konstrukt als eine homologe Region für die Rekombination verwendet. Eine Kassette, die ein Neomycin-Resistenzgen (neo) enthielt, wurde in die zweite HindIII-Stelle in Exon 2 des H2-Ma-Gens kloniert. Eine Deletion von 61 bp 5' zu der neo-Kassetten-Insertionsstelle in Exon 2 wurde ebenfalls in dem Konstrukt hergestellt. Ein Herpes Simplex-Thymidinkinase (tk)-Gen wurde in dem 3'-Ende des Konstrukts plaziert. Die Restriktionsstellen sind Apa I (A), HindIII (H), Not I (N), Stu I (S), und Sfi I (Sf). Die numerierten gefüllten Kästchen sind Exons. Die Position der in Southern-Hybridisierung verwendeten Sonde ist gezeigt. (B) Genomische Southern-Analyse von Apa I-verdauter Schwanz-DNA aus Wild-Typ (+/+)-, heterozygoten (+/–)- und homozygoten (–/–)-Mäusen für das unterbrochene H2-Ma-Gen. Die DNA-Größe ist 2,8 kb für das endogene Allel und 1,8 kb für das unterbrochene Allel. (C und D) Konfokale Bilder von H2-M^+/+ (C)- oder H2-M^–/– (D)-Splenozyten, die mit K553 (anti H2-M) (rot) gefärbt wurden (Karlsson et al., 1994, Reconstitution of an operational MHC class II compartment in nonantigen-presenting cells. Science 266, 1569–1573; Morris et al., 1994, supra) und M5/114 (anti-H-2A^d) (grün) (Bhattacharya et al., 1981, J. Immunol. 127, 2488). K553-Färbung ist in C in vesikulären Strukturen vorhanden, fehlt jedoch in D. Die M5/114-Färbung ist sowohl an der Zelloberfläche und intrazellulär in beiden Fällen lokalisiert. (E) Immunpräzipitation von ³⁵S-markierten Milzzellen. H2-M^+/+- (oben) oder M2-M^–/–- (unten) Splenozyten wurden mit ³⁵-S-Cystein wie beschrieben für 3 Stunden vor der Lyse in 1% Triton X-100, PBS, und vollständigem Proteinase-Inhibitor-Cocktail (Boehringer Mannheim) markiert (Karlsson et al., 1994, Science 266, 1569–1573). H2-M wurde mit mAb 2E5A immunpräzipitiert, der mit H2-M αβ-Dimeren reaktiv ist. Die Immunpräzipitate wurden mit Protein G-Sepharose geerntet, gewaschen und in isoelektrischem Fokusierungs-Probenpuffer resuspendiert. Die Proben wurden durch zweidimensionale Gelektrophorese analysiert, die Proben wurden auf 7,5 bis 12,5% Polyacrylamidgelen nach IEF (pH 5 bis 7) aufgetrennt. Die Gele wurden dann fixiert, getrocknet und autoradiographiert. Die Autoradiographien wurden mit einem Agfa Arcus II-Scanner gescannt. Die zusammengesetzten Bilder wurden auf einem Kodak XLS 8600-Drucker ausgedruckt. Die Abkürzungen sind wie folgt: a, Actin; α, H2-Ma; β, H2-Mb. Saure Proteine sind auf der rechten Seite lokalisiert.
2, Tafeln A, B, C und D. Expression von H2-A in Lymphoidgewebe von H2-M^–/–- und H2-M^+/+-Littermates. (A) Lymphknotenzellen wurden mit Antikörpern, die entweder mit H2-A^b (M5/114, BP107, KH74) oder einem Antikörper gegenüber CLIP-beladenem H2-A^b (30-2) reaktiv waren gefärbt und durch Flußzytometrie analysiert. Die Bindung von KH74 an H2-M^–/–-Zellen wurden durch vorherige Inkubation mit 30-2 blockiert, jedoch nicht mit irrelevanten Maus-IgG (MuIgG). (B) Thymusschnitte wurden mit entweder K553, reaktiv mit H2-M, mit anti-H2-A^b reaktiven mAbs (M5/114, BP107) oder mit anti-CLIP mAb (30-2) gefärbt. (C und D) H2-M^+/+- und H2-M^–/–-Splenozyten wurden für 30 Minuten markiert und sofort (0) oder nach verschiedenen Perioden der Inkubation mit nicht-markiertem Medium (Stunden) wie angegeben analysiert. Die H2-A^b-Moleküle wurden mit M5/114 immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Protein G-Sepharose geerntet, gewaschen und in SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert, der 2% SDS ist ohne (2C) oder mit 10 mM Dithiothreitol (2D) enthielt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 20 Minuten belassen (2C) oder für 5 Minuten gekocht (2D). Die Proben wurden auf 7,5 bis 12,5% Polyacrylamidgelen direkt aufgetrennt. Die Abkürzungen sind wie folgt: α, H2-A^bα; β, H2-A^bβ, αβ und αβ*, H2-A^b-Dimere. Die Größenmarker sind in Kilodalton; lip31, invariante Kette p31.
3, Tafeln A und B. Analyse von T-Zell-Markern in H2-M^–/–- und H2-M^+/+-Mäusen. (A) Lymphknotenzellen oder Thymozyten wurden mit Antikörpern gefärbt, die mit CD4 und CD8 reaktiv waren und durch Flußzytometrie analysiert. (B) Analyse von Lymphknoten CD4⁺-T-Zellen auf Aktivierungsmarker unter der Verwendung von CD45RB (links) und L-Selectin (rechts) zeigten einen naiven Phänotyp an. CD4⁺-T-Zellen von H2-M^–/– snf H2-M^+/+-Mäusen waren L-Selectin^hi, CD44^lo und CD45RB^hi und wenigen exprimierten Markern, die mit der Aktivierung assoziiert waren. Zum Beispiel, CD69 oder Interleukin 2-Rezeptor.
4, Tafeln A und B. CD4⁺-T-Zellfunktion und Antigen-präsentierende Kapazität. (A) Reaktivität von CD4⁺-Zellen von H2-M^–/– (links) oder H2-M^+/+ (rechts)-Mäusen gegenüber APCs aus verschiedenen Mausstämmen. (B) Fähigkeit von H2-M^–/– und H2-M^+/+ APCs, um allogene CD4⁺-T-Zellen zu stimulieren. Die Antworten wurden nach 3, 4 und 5 Tagen Kultur analysiert. Responder-Zellpopulationen waren vereinigte Lymphknotenzellen, die auf CD4⁺-Zellen durch Behandlung mit einem Cocktail von Antikörpern, die spezifisch für B-Zellen, MHC Klasse II-exprimiertenden Zellen und CD8⁺-Zellen angereichert waren wie beschrieben (Webb and Sprent, 1990. Science 248, 1643), zusammen mit Komplement. Milzzellen, die durch Behandlung mit Antikörper gegenüber CD4 (RL172), anti-CD8 (3.16.8), anti-Thy-1 (J1J) und Komplement depletiert waren, wurden mit Mitomycin C behandelt und als eine Quelle von APCs verwendet. Responderzellen (1,5 × 10⁵) wurden mit 5 × 10⁵ APCs in einem Gesamtvolumen von 200 μl von ³H-Thymidin für ungefähr 18 Stunden vor der Ernte und dem Auszählen kultiviert.
Genaue Beschreibung der Erfindung
In Mäusen exprimiertes H2-M ist aus den Alpha (H2-Ma)- und Beta (H2-Mb)-Ketten zusammengesetzt. Die Alpha-Kette wird durch ein Einzel-Kopie-Gen mit dem Namen H2-Ma-Gen kodiert, wohingegen die Beta-Kette ein Produkt von entweder dem H2-Mb1- oder H2-Mb2-Gen sein kann, die hoch homolog sind und auf dem Chromosom nebeneinander lokalisiert sind (Cho et al., 1991, A cluster of transcribed sequences between the Pb and Ob genes of the murine major histocompatibility complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5197–5201). Um die Funktion von H2-M in der Maus auszuschalten, kann das H2-Ma-Gen das bessere Ziel zur Unterbrechung sein, da es als ein einzelnes Gen existiert. Die H2-M modifizierten transgenen Mäuse, die wir erzeugt haben, stellen ein Modell zur Verfügung, in dem das H2-Ma-Gen durch homologe Rekombination (HR) unterbrochen wurde. Das Verfahren der Erzeugung der Knockout-Mäuse kann in vier Grundphasen eingeteilt werden:

1. Klonieren des H2-Ma-Gens und Präparation eines DNA-Konstrukts zur Transfektion von embryonalen Stamm (ES)-Zellen;
2. Isolieren von transfizierten ES-Zellen, in denen das H2-Ma-Gen durch HR ausgeschaltet wurde;
3. Generieren von chimären Mäusen aus Mausembryonen, die mit den Knockout-ES-Zellen injiziert wurden; und
4. Anzüchten von chimären Mäusen um Knockout-Mäuse durch Keimbahntransmission zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung verwendet einen Maus-H2-Ma-Genklon, um transgene Tiere zu erzeugen, in denen das H2-Ma-Gen in nicht funktionell verändert wurde. Die Veränderungen gegenüber dem natürlich auftretenden Gen können Modifikationen, Deletionen und Substitu tionen sein. Modifikationen und Deletionen verändern das natürlich auftretende Gen in nicht-funktionell, wodurch ein "Knockout"-Tier erzeugt wird. Die Substitution des natürlich auftretenden Gens mit einem Gen von einer zweiten Spezies führt zu einem Tier, das das Genprodukt der zweiten Spezies herstellt. Die Substitution des natürlich auftretenden Gens mit einem Gen, das eine Mutation aufweist, führt zu einem Tier, das das mutierte Genprodukt herstellt. Diese transgenen Tiere sind wichtig für Wirkstoff-Antagonisten oder Argonistenuntersuchungen, die Erzeugung von Tiermodellen von menschlichen Erkrankungen und für die eventuelle Behandlung von Abweichungen oder Erkrankungen, die mit menschlichem HLA-DM-vermittelten Immunantworten assoziiert sind. Ein transgenes Tier, das ein "Knockout" des H2-Ma-Gens trägt, ist für die Etablierung eines nicht-menschlichen Modells für Erkrankungen brauchbar, die H2-M-Äquivalente, wie zum Beispiel HLA-DM im Menschen, einschließen.
Die Sequenz des Maus-H2-Ma-Gens ist bekannt (Peleraux et al., 1996, Genomic organization of a mouse MHC class II region including the H2-M and lmp2 loci. Immunogenetics, 42 204–214). Die H2-Ma-genomische DNA wird aus einer Mausgenombibliothek kloniert und weist die erwarteten Charakteristika einer DNA, die für das H2-Ma-Protein kodiert, auf. Eine transgene Maus, die das unterbrochene H2-Ma-Gen trägt, wird durch homologe Rekombination von einem Ziel-DNA-Konstrukt mit dem endogenen Gen auf dem Chromosom erzeugt. Die transgene Maus, die das unterbrochene H2-Ma-Gen trägt, exprimiert keine funktionellen H2-M-Moleküle und ist bei der Etablierung eines in vivo-Modells von menschlichen HLA-DM-vermittelten Erkrankungen brauchbar.
Der Ausdruck "Tier" wird hier verwendet, um alle Wirbeltiere mit der Ausnahme von Menschen einzuschließen. Er schließt auch ein einzelnes Tier in allen Phasen der Entwicklung ein, einschließlich den embryonalen und fötalen Phasen. Ein "transgenes Tier" ist jedes Tier, das eine oder mehrere Zellen enthält, die eine veränderte oder erhaltene, direkt oder indirekt, durch bewußte genetische Manipulation auf einem subzellulären Niveau, wie zum Beispiel durch gezielte Rekombination oder Mikroinjektion oder Infektion mit rekombinanten Virus genetische Information trägt. Der Ausdruck "transgenes Tier" ist nicht dazu gedacht, eine klassische Züchtung mittels Kreuzen oder eine in vitro-Befruchtung zu umfassen, sondern ist so gedacht, um Tiere zu umfassen, in denen eine oder mehrere Zellen durch ein rekombinantes DNA-Molekül verändert sind oder dieses erhalten. Dieses rekombinante DNA-Molekül kann spezifisch auf einem definierten genetischen Lokus abgerichtet sein, kann zufällig in nerhalb eines Chromosoms integriert sein oder es kann extrachromosomal replizierende DNA sein. Der Ausdruck "Keimbahn-transgenes Tier" betrifft ein transgenes Tier, in dem die genetische Veränderung oder die genetische Information in die Keimbahnzellen eingeführt wurde, wodurch die Fähigkeit übertragen wird, die genetische Information an Nachkommen zu übertragen. Falls solche Nachkommen in der Tat einige oder alle dieser Veränderungen oder genetischen Information besitzt, sind sie ebenfalls transgene Tiere.
Die Veränderung oder genetische Information kann fremd für die Spezies des Tieres sein, zu der der Empfänger gehört oder fremd nur für den bestimmten individuellen Empfänger oder kann eine genetische Information sein, die bereits durch den Empfänger besessen wurde. Im letzten Fall kann das veränderte oder eingeführte Gen unterschiedlich zu dem nativen Gen exprimiert werden oder überhaupt nicht exprimiert werden.
Das nicht-funktionelle H2-Ma-Gen sollte im allgemeinen nicht vollständig das selbe H2-Ma wie nativ zu dem Wirtstier kodieren, und sein Expressionsprodukt sollte zu einem geringen oder großen Ausmaß verändert sein oder insgesamt fehlen. Jedoch ist es vorsehbar, daß ein moderater modifiziertes H2-Ma in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen wird.
Die zur Veränderung eines Zielgens verwendeten Gene können durch eine große Vielzahl von Techniken erhalten werden, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf, die Isolierung aus genomischen Quellen, die Präparation von cDNAs aus isolierten mRNA-Templaten, direkte Synthese oder einer Kombination davon.
Ein Typ von Zielzellen für die transgene Einführung sind ES-Zellen. ES-Zellen können aus prä-Implantationsembryonen erhalten werden, die in vitro kultiviert werden und mit Embryonen fusioniert werden (M. J. Evans et al., Nature 292: 154–156 (1981); M. O. Bradley et al., Nature 309: 255–258 (1984); Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065–9069 (1986); Robertson et al., Nature 322, 445–448 (1986); S. A. Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4582–4584 (1993)). Transgene können durch Standardtechniken, wie zum Beispiel DNA-Transfektion oder durch Retrovirus-vermittelte Transduktion effizient in die ES-Zellen eingeführt werden. Die erhaltenen transformierten ES-Zellen können danach mit Blastozysten aus einem nicht-menschlichen Tier kombiniert werden. Die eingeführten ES-Zellen besiedeln danach den Embryo und tragen zur Keimbahn des erhaltenen chimären Tieres bei (R. Jaenisch, Science 240: 1468–1474 (1988)).
Da H2-M eine unabhängige Komponente eines komplexen Mechanismus ist, müssen die Proteine, einschließlich der durch die H2-Ma-DNA kodierten, sowohl einzeln und als eine Gruppe untersucht werden, wenn deren Beitrag zu den Mechanismen der Immunantworten verstanden werden soll. Ein Ansatz für das Problem der Bestimmung der Beiträge von individuellen Genen und deren Expressionsprodukten ist es, isolierte Gene zu verwenden, um selektiv das native Wild-Typ-Gen in totipotenten ES-Zellen (sowie diejenigen die hier beschrieben werden) zu inaktivieren und dann transgene Mäuse zu erzeugen. Die Verwendung von Gen-abgezielten ES-Zellen bei der Erzeugung von Gen-abgezielten transgenen Mäusen wurde 1987 beschrieben (Thomas et al., Cell 51: 503–512, (1987) und wird anderswo zusammenfassend beschrieben (Frohman et al., Cell 56: 145–147 (1989); Capecchi, Trends in Genet. 5: 70–76 (1989); Baribault et al., Mol. Biol. Med. 6: 481–492, (1989); Wagner, EMBO J. 9: 3025–3032 (1990); Bradley et al., Bio/Technology 10: 534–539 (1992)).
Techniken sind erhältlich, um jede genetische Region zu inaktivieren oder zu jeder gewünschten Mutation zu verändern durch die Verwendung von abgezielter homologer Rekombination, um spezifische Veränderungen in chromosomale Allele einzuführen. Jedoch wurde die homologe Plasmid-Chromosomen-Rekombination in Säugetierzellen nur mit Frequenzen zwischen 10^–6 und 10^–3 nachgewiesen (Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1391–1395 (1985); Smithies et al., Nature 317: 230–234 (1985); Thomas et al., Cell 44: 419–428, (1986); Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820–6824 (1987)). Nicht homologe Plasmid-Chromosom-Interaktionen sind häufiger und treten in Spiegeln von 10⁵-fach (Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1391–1395 (1985)) bis 10²-fach (Thomas et al., Cell 44: 419–428 (1986); Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820–6824 (1987)) höher als die vergleichbare homologe Insertion auf.
Um diese niedrige Frequenz von homologer Rekombination in Maus-ES-Zellen zu überwinden, wurden verschiedene Strategien entwickelt, um seltene homologe Rekombinanten nachzuweisen oder zu selektieren. Ein Ansatz zum Nachweis von homologen Veränderungsereignissen verwendet die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) um Pools von Transformantenzellen auf homologe Insertion zu screenen, gefolgt vom Screening von einzelnen Klonen (Kim et al., Nucleic Acids Res. 16: 8887–8903 (1988); Kim et al., Gene 103: 227–233 (1991)). Alternativ wurde ein positiver genetischer Selektionsansatz entwickelt, in dem ein Markergen konstruiert wird, das nur aktiv sein wird, wenn eine homologe Insertion auftritt, was es ermög licht, diese Rekombinanten direkt zu selektieren (Sedivy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 227–231 (1989)). Einer der wirksamsten Ansätze, die zur Selektion von homologen Rekombinanten entwickelt wurde, ist das Positiv-Negativ-Selektions (PNS)-Verfahren, das für Gene entwickelt wurde (wie zum Beispiel H2-Ma), für die keine direkte Selektion der Veränderung existiert (Monsour et al., Nature 336: 348–352: (1988); Capecchi, Science 244: 1288–1292, (1989); Capecchi, Trends in Genet. 5: 70–76 (1989)). Das PNS-Verfahren ist für das Abzielen von Genen effizienter, die nicht in hohen Spiegeln exprimiert werden, da das Markergen seinen eigenen Promotor aufweist. Es wird auf nicht-homologe Rekombinanten selektiert durch die Verwendung des Herpes Simplex-Virus Thymidinkinase (HSV-TK) und ein Selektieren gegen seine nicht homologe Insertion mit den Herpeswirkstoffen, wie zum Beispiel Gancyclovir (GANC) oder FIAU (1-(2-Desoxy-2-fluor-B-D-arabinofuranosyl)-5-joduracil). Durch diese Gegenselektion kann die Zahl von homologen Rekombinanten in den überlebenden Transformanten erhöht werden.
Wie hier verwendet ist ein "abgezieltes Gen" oder "Knockout" (KO) eine DNA-Sequenz, die in die Keimbahn eines nicht-menschlichen Tieres mittels menschlicher Intervention eingeführt wurde, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, den hier beschriebenen Verfahren. Die abgezielten Gene der Erfindung schließen DNA-Sequenzen ein, die so aufgebaut sind, um spezifisch kognate endogene Allele zu verändern.
MHC Klasse II-Moleküle binden Peptide, die von exogenen Proteinen abgeleitet sind und präsentieren diese Peptide an der Zelloberfläche, wo sie durch T-Zellen erkannt werden können. Zwei Wege können vorhergesehen werden, um die Präsentationsfunktion der MHC Klasse II-Moleküle zu modifizieren. Entweder kann die Expression der MHC Klasse II-Moleküle selber blockiert werden oder das Verfahren der Peptidbeladung auf neu synthetisierte MHC Klasse II-Moleküle kann blockiert werden. Mäusen, denen MHC Klasse II-Moleküle fehlen, wurden erzeugt (Cosgrove et al., 1991, Mice lacking MHC class II molecules. Cell 66, 1051–66). Sie weisen eine verringerte Funktion des Immunsystems auf, mit nur geringen Zahlen von MHC Klasse II reaktiven T-Zellen, und während die Zahlen von B-Zellen normal sind, ist deren Fähigkeit bestimmte Antikörper herzustellen, beeinträchtigt. Ihre Fähigkeit, einer viralen Infektion zu widerstehen, scheint normal zu sein (Bodmer et al., 1993, Environmental modulation of the autonomy of cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 23, 1649–54; Laufer et al., 1993, Autoimmune diabetes can be induced in transgenic major histocompatibility complex class II-deficient mice. J. Exp. Med. 178, 589–96). Die Regulation der MHC Klasse II-Expression ist so komplex, daß es nicht vollständig klar ist, auf welchen Transkriptionsfaktor ein potentieller Wirkstoff abgerichtet werden sollte. Die Kontrolle der Peptidbeladung ist möglicherweise leichter zu erreichen, da kürzliche Daten zeigen, daß HLA-DM als ein Enzym wirkt, das den Austausch von Peptiden mit geringer Affinität durch Peptide mit höherer Affinität auf den MHC Klasse II-Molekülen katalysiert. Jedoch werden nicht alle Antigene gleichmäßig durch das Fehlen von HLA-DM beeinträchtigt, und es ist möglich, daß das Fehlen von HLA-DM einen weniger deutlichen Effekt aufweisen wird, als das gesamte Fehlen der MHC II-Moleküle. Der Expressionsspiegel von HLA-DM ist mindestens 10-fach geringer als die MHC Klasse II-Moleküle und die invariante Kette. Die relativ kleine Menge von HLA-DM relativ zu anderen MHC Klasse II-Elementen stimmt mit seiner katalytischen Funktion überein. Anders als MHC Klasse II oder die invariante Kette ist HLA-DM hauptsächlich im endosomalen Kompartiment lokalisiert, das für kleine Molekül-Wirkstoffe leicht zugänglich ist. Die kleine Menge und die intrazelluläre Lokalisierung von H2-M macht es zu einem attraktiven Wirkstoffziel. Es erscheint möglich, daß ein Wirkstoff, der die Funktion von HLA-DM blockieren könnte ein brauchbares therapeutisches Mittel wäre und daher H2-M Knockout-Mäuse brauchbar sein werden, um die in vivo-Funktion von H2-M und die Effekte von MHC Klasse II-Funktion zu zeigen. Basierend auf den zellulären Daten kann erwartet werden, daß viele (jedoch nicht alle) Antigene durch MHC Klasse II Moleküle in den H2-M Knockout-Mäusen schlecht präsentiert werden (Brooks et al., 1994, Antigen presentation and assembly by mouse I-Ak class II molecules in human APC containing deleted or mutated HLA DM genes. J. Immunol. 153, 5382-92; Mellins et al., 1990, Defective processing and presentation of exogenous antigens in mutants with normal HLA class II genes. Nature 343, 71–4). Die verringerte Antigenpräsentation wird höchstwahrscheinlich zu einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Infektionen führen und das Ausmaß dieses Effekts kann in den H2-M Knockout-Mäusen untersucht werden.
Die H2-M Knockout-Mäuse werden dabei helfen, die Rolle von MHC Klasse II und Peptiden für die Thymusentwicklung von T-Zellen zu definieren. Die Entwicklung von MHC Klasse II-restringierten T-Zellen erfordert die Expression von MHC Klasse II-Molekülen im Thymus. Es ist jedoch nicht klar, wie die sich entwickelten T-Zellen MHC Klasse II-Moleküle erkennen und ob die MHC Klasse II-Moleküle im Thymus mit den Peptiden beladen sind. In den H2-M Knockout-Mäusen sind die Spiegel von MHC Klasse II auf der Zelloberfläche normal, jedoch sind die meisten der MHC Klasse II-Moleküle mit invarianten Kettenpeptiden beladen. H2-M Knockout-Mäuse entwickeln geringere als normale Zahlen von MHC Klasse II-restringierten T-Zellen, was vermuten läßt, daß die Entwicklung dieser Zellen die Diversifikation der Peptide erfordert, die mit MHC II im Thymus assoziiert sind. Da gezeigt wurde, daß die Entwicklung von T-Zellen die Anwesenheit von H2-M erfordert, können Wirkstoffe, die die Expression oder die Funktion von HLA-DM in menschlichen Zellen blockieren, die Nebenwirkung einer Kompromittierung des T-Zell-Repertoires in jungen Individuen aufweisen. Um das Thymozyten-Selektionsverfahren in H2-M Knockout-Mäusen weiter zu analysieren, werden diese Mäuse mit T-Zell-Rezeptor transgenen Mäusen gekreuzt. Die T-Zell-Rezeptoren dieser Mäuse weisen alle dieselbe Spezifität auf, was daher die Untersuchung des Effekts von H2-M auf die Entwicklung von spezifischen T-Zell-Rezeptoren mit bekannter Reaktivität ermöglicht.
Der Effekt von H2-M auf das Fortschreiten von chronischer entzündlicher Erkrankung und Graftabstoßung wird ebenfalls in H2-M Knockout-Mäusen untersucht. Der mögliche niedrige Spiegel und die schlechte Antigenpräsentation der MHC Klasse II-Moleküle in der Abwesenheit von H2-M sagt voraus, daß die Aktivierung und Effektorfunktion von MHC Klasse II-restringierten T-Zellen beeinträchtigt werden wird. Wirkstoffe, die auf die Funktion von HLA-DM abzielen, können den therapeutischen Effekt von Verlangsamung des Fortschreitens von Autoimmunerkrankung und der Vorbeugung der Graftabstoßung aufweisen. Die Effekte des Fehlens von MHC Klasse II-Molekülen wurden in verschiedenen Mausmodellen von Autoimmunerkrankungen analysiert und zeigten, daß in den meisten Fällen die Schwere der Erkrankung abnahm (zusammenfassend beschrieben in Grusby und Glimcher, 1995, Immune responses in MHC class II-deficient mice. Annu. Rev. Immunol. 13, 417–35). Die H2-M Knockout-Mäuse, die hier beschrieben werden, werden mit den verschiedenen Autoimmunerkrankungs-Mausmodellen gekreuzt, um den Effekt von H2-M bei Fortschreiten von Autoimmunerkrankungen zu untersuchen. Ähnlich wird die Beteiligung von H2-M bei der Transplantation in den H2-M Knockout-Mäusen untersucht.
Zellen aus den H2-M Knockout-Mäusen werden dazu verwendet, um spezifische antigene Peptide zu präsentieren. Von normalen Mäusen abgeleitete Antigen-präsentierende Zellen weisen MHC Klasse II-Moleküle mit stabil gebundenen Peptiden auf. MHC Klasse II-Moleküle auf normalen Zellen können mit exogenen Peptiden beladen werden, jedoch bindet nur ein kleiner Teil der MHC Klasse II-Moleküle das hinzugefügte Peptid. Im Gegensatz dazu weisen die Antigen-präsentierenden Zellen von Mäusen, denen H2-M fehlt, MHC Klasse II-Moleküle auf, die in einem großen Ausmaß invariante Kettenpeptide enthalten. Diese Peptide können durch exogene hinzugefügte Peptide durch eine Verringerung des pHs und durch Hinzufügung durch rekombinantem H2-M zur Außenseite der Zellen ausgetauscht werden. Dieser Effekt wird in einer Situation verwendet, wo Antigen-präsentierende Zellen aus den H2-M Knockout-Mäusen gesammelt werden und mit ausgewählten Peptiden in vitro beladen werden. So mit antigenen Peptiden beladene Zellen werden dann als Antigen-präsentierende Zellen verwendet, die das hinzugefügte Peptid effizient präsentieren, entweder für die Stimulierung von T-Zellen in vitro oder für die Injektion in Tiere für die in vivo-Stimulierung. Ähnlich wird ein HLA-DM blockierender Wirkstoff auf ähnliche Weise zur Behandlung von Erkrankungen verwendet, wo die Reaktivität des Immunsystems gegen ein bestimmtes Antigen nicht ausreichend ist, z. B. in Krebspatienten. In diesem Falle werden Antigen-präsentierende Zellen von den Patienten gesammelt und mit dem Wirkstoff behandelt, wobei HLA-DM blockiert wird, während die Zellen lang genug in Kultur gehalten werden, um es Peptid-enthaltenden MHC Klasse II-Molekülen zu ermöglichen, auf der Zelloberfläche durch invariante Kette Peptid-enthaltende MHC Klasse II-Moleküle ersetzt zu werden. Diese Zellen können dann wie oben beschrieben effizient mit Tumor-abgeleiteten Peptiden beladen werden und dann in den Patienten zurück verabreicht werden, wodurch eine effiziente Antigenpräsentation zu den eigenen T-Zellen des Patienten zur Verfügung gestellt wird. Antigen-spezifische T-Zell-Toleranz kann durch präsentieren von T-Zellen gegenüber Antigen-präsentierenden Zellen, die mit einer hohen Dosis eines spezifischen antigenen Peptids beladen sind, induziert werden. Die Induktion von T-Zell-Toleranz ist eine ideale klinische Situation, da dies bedeutet, daß eine Langzeit-Wirkstoffbehandlung nicht erforderlich ist. Im Fall von Autoimmunerkrankungen, in denen die Antigen-Spezifität der reagierenden T-Zellen bekannt ist, wird eine effiziente Beladung von Antigen-präsentierenden Zellen mit einem bestimmten antigenen Peptid dazu verwendet, um T-Zell-Toleranz zu induzieren.
Die folgenden Beispiele werden zum Zweck der Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung präsentiert und sollen nicht als eine Begrenzung des Bereichs dieser Erfindung ausgelegt werden.
Beispiel 1
Isolierung der Maus-H2-Ma genomischen Klone
Um ein spezifisches Gen durch homologe Rekombination zu unterbrechen, werden DNA-Konstrukte, die das unterbrochene Gen enthalten, zur Transfektion von ES-Zellen benötigt.
Zuerst wird das Maus-H2-Ma-Gen zur Herstellung des DNA-Konstrukts benötigt. Von dem Maus-H2-Ma-Gen war bekannt, das es in der 5'-proximalen Region des H2-Mb2-Gens lokalisiert war (Cho et al., 1991, A cluster of transcribed sequences between the Pb and Ob genes of the murine major histocompatibility complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5197–5201). Um die Maus-genomische DNA zu klonieren, die das H2-Ma-Gen enthält, wurde eine Maus H2-Mb2-cDNA (Peleraux et al., 1995, Genomic organization of a mouse MHC class II region including the H2-M and lmp2 loci., Immunogenetics, in press) mit 32-P Radioisotop markiert und als eine Sonde verwendet, um 4 × 10⁵ Phagenplaques zu screenen, die aus einer 129 SV Maus-genomischen Bibliothek hergestellt wurden. Sieben Phagenklone hybridisierten mit der Sonde und wurden zur Charakterisierung isoliert. Von zwei Klonen wurde gefunden, daß sie das komplette H2-Ma-Gen enthalten und einer von diesen (Klon 2) wurde für die weiteren Analysen ausgewählt. 1 zeigt die Region des H2-Ma-Gen, die durch Klon 2 abgedeckt wird. Die Restriktionskarte des H2-Ma-Gens wurde aus der Analyse von Klon 2 erhalten.
Beispiel 2
Präparation von Gen-abzielenden Konstrukten
Das DNA-Konstrukt wurde in einem pUC-Plasmidvektor hergestellt. Ein 6,7 kb genomisches Fragment, das den Hauptteil des H2-Ma-Gens mit der Ausnahme von Exon 1 und einem Teil von Intron 1 abdeckt, wurde aus dem Klon 2 erhalten und in dem Konstrukt als eine homologe Region für die Rekombination verwendet (1). Die Neo-Kassette, die das Neomycin-Resistenzgen enthielt, wurde in dem zweiten Exon des H2-Ma-Gens plaziert. Zwei Typen von Konstrukten wurden hergestellt, in denen die Neokassette entweder in derselben oder in der entgegengesetzten Orientierung des H2-Ma-Gens vorlag. Eine Deletion von 61 bp in Exon 2 wurde auch an der Stelle hergestellt, wo die Neo-Kassette plaziert wurde. Das Herpes Simplex-Virus Typ-I-Thymidinkinase (HSV tk)-Gen wurde an dem 3'-Ende der homologen Region angeordnet.
Beispiel 3
Isolierung von Gen-abgezielten ES-Zellinien
Transfektion von ES-Zellen
Das DNA-Konstrukt wurde durch vollständigen Verdau mit NotI, SfiI oder einer Kombination dieser zwei Restriktionsenzyme verdaut. Die DNA wurde dann durch 2 Volumen von eiskaltem Ethanol bei –20°C für 1 Stunde gefällt. Die gefällte DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit 0,5 ml 70% Ethanol gespült, luftgetrocknet und dann bei 1 mg/ml in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (Gibco) gelöst.
ES-Zellen E14 (Hooper et al., 1987, HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature 326, 292–295) wurden in einem undifferenzierten Stadium durch Co-Kultivieren mit Embryonenfibroblasten (EF) und in Kulturmedium (15% FCS, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM b-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 U Penizillin und 100 U Streptomycin) gehalten, das 1000 U/ml Leukämie-inhibierenden Faktor (LIF) (Gibco) enthielt. Die EF-Zellen waren primäre Fibroblastenkulturen, die aus Tag 15–17 Mausföten gemäß dem von Robertson beschriebenen Verfahren präpariert wurden (Robertson, 1987, Embryo-derived stem cell lines. Chaptor 4. from "Teratocarcinomas and embryonic stem cells. A practical approach" Editor: Robertson, E. J. IRL Press, Oxford-Washington DC). Die EF wurden mit 10 μg/ml Mitomycin C (Sigma) in Kulturmedium für 2 Stunden behandelt, um die Zellteilung vor ihrer Verwendung als Feederzellen zu stoppen. Für die DNA-Transfektion wurden die ES-Zellen durch Trypsinbehandlung geerntet und bei 6,25 × 10⁶ Zellen/ml in Kulturmedium resuspendiert. 20 μg DNA-Konstrukt wurden in 0,8 ml ES-Zellsuspension für die Elektroporation bei 250 μF und 340 Volt unter der Verwendung des Genpulsers (BioRad) hinzugefügt.
Transfizierte ES-Zellen wurden auf EF-beschichteten 90 mm-Platten bei 2,5 × 10⁶/90 mm-Platte in Kulturmedium plattiert. Zwei Tage später wurden die Zellen einer Wirkstoffselektion in Medium, das 400 μg/ml G418 (Geneticin, Gibco) und 2 μM GANC (Cytosin, Syntex) enthielt, unterzogen. Das Kulturmedium wurde täglich gewechselt. Ein massiver Zelltod war beginnend an Tag 4 ersichtlich und die meisten der toten Zellen wurden durch den täglichen Mediumwechsel an ungefähr Tag 8 entfernt. Die überlebenden Zellkolonien waren unter dem Mikroskop bei ungefähr Tag 7 beobachtbar.
PCR-Screen auf homologer Rekombination in ES-Zellen
Die Größe von ES-Kolonien an Tag 11 nach der Transfektion war für das PCR-Screening groß genug. Um Zellkolonien zu ernten, wurde das Kulturmedium in den 90 mm-Platten aus geblasen und 10 ml PBS wurden hinzugefügt. Einzelne Zellkolonien wurden mit Hilfe eines Stereomikroskops lokalisiert, in einem 20 μl-Volumen geerntet und in 96 Well-Platten transferiert. Um einzelne Zellsuspensionen der ES-Kolonien zu präparieren, wurden 25 μl an 0,25% Trypsin (Gibco) pro Well in 96 Well-Platten hinzugefügt.
Nach 8 Minuten der Trypsinbehandlung bei 37°C wurden 25 μl an Kulturmedium hinzugefügt. Alle ES-Kolonien wurden immer noch in Kulturmedium als Masterplatten gehalten, während sie durch PCR auf homologe Rekombinationsereignisse gescreent wurden. Um Masterplatten zu präparieren, wurden 60 ml jeder Probe in 96 Well-Platten transferiert, die mit EF-Zellen beschichtet wurden und 180 μl/Well des G418 und GANC enthaltenden Kulturmediums enthielten.
Für den PCR-Screen der ersten Runde wurde jede Zellysatprobe aus 12 Zellkolonien präpariert, die als eine Reihe von in den 96 Well-Platten angeordnet waren. Nach der Präparation von Masterplatten wurden die verbleibenden Zellproben von ungefähr 90 μl/Well auf jeder Reihe der Platten vereinigt und die Zellen wurden pelletiert. Nach Abgießen des gesamten Mediums wurden die Zellen durch Hinzufügung von 30 μl destilliertem Wasser und kurzem Vortexen lysiert. Die Zelllysate wurden durch ein erstes Erhitzen bei 95°C für 10 Minuten präpariert, gefolgt durch eine Zugabe von 1 μl Proteinase K (10 mg/ml in Wasser) mit kurzem Vortexen, einer 90 minütigen Inkubation bei 50°C zum Proteinase K-Verdau und dann 10 Minuten bei 95°C für die Hitzeinaktivierung von Proteinase K.
Die PCR wurde unter der Verwendung des 9600 GeneAmp-Systems (Perkin Elmer) durchgeführt. Die Reaktionsgemische enthielten 5 μl Zellysat, 4 μM jedes der zwei Olignukleotid-Primer, 200 μM jedes von dATP, dTTP, dCTP und dGTP und 5 U AmpliTaq DNA-Polymerase in PCR-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,3, 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂). Die Reaktionsbedingungen waren 3 Zyklen von 2 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 60°C und 2 Minuten bei 72°C, dann 40 Zyklen von 15 Sekunden bei 94°C, 15 Sekunden bei 60°C und 1 Minute bei 72°C, gefolgt von 7 Minuten bei 72°C. Für das DNA-Konstrukt, in dem das Neogen und das H2-Ma-Gen in derselben Orientierung vorliegen, waren die PCR-Primer, die dazu verwendet wurden, um die homologe Rekombination zu amplifizieren: MA3S (5'-GGATTCCTGTCAGGAGTTTCAAAG-3') [SEQ ID NO: 1], Neo-134R (5'-AAGCGCATGCTCCAGACTGCCTT-3') [SEQ ID NO: 2] und von der Größe der amplifizierten DNA wird erwartet, das sie ungefähr 1 kb ist.
Für das DNA-Konstrukt in dem das Neo-Gen und das H2-Ma-Gen in der gegenüberliegenden Orientierung vorliegen, waren die PCR-Primer: MA3S und neo-1858 (5'-GCCAAGTTCTAATTCCATCAG-3') [SEQ ID NO: 3] und von der Größe der amplifizierten DNA wird erwartet, das sie ungefähr 0,98 kb ist.
Um das durch die PCR amplifizierte spezifische DNA-Fragment nachzuweisen, wurden 20 μl der PCR-Proben nach ihrer Größe durch 1% Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, auf Nylonmembranen (Hybond, Amersham) geblottet und an die P³²-markierte Oligonukleotidsonde A (5'-CCAGTTCTGTCAGCACAAGGTCTGGAGTGTTTAGGT-3') [SEQ ID NO: 4] hybridisiert. Die PCR-Proben mit der erwarteten Größe an DNA-Banden, die durch die Oligosonde nachgewiesen wurden, wurden als mögliche positive Gruppen für ein weiteres Screening betrachtet.
Die ES-Zellen in den Masterplatten waren nach ungefähr 3–4 Tagen Kultur zum Aufteilen bereit. Die Zellkolonien in den positiven Gruppen wurden einzeln durch eine zweite Runde an PCR gescreent, um die positiven Kolonien zu identifizieren. Um die positiven Gruppen in Kultur zu halten, wurden die Zellen in den Wells durch zuerst entfernen des Kulturmediums, einmal spülen mit 50 μl PBS, behandeln mit 40 μl 0,25% Trypsin für 5 Minuten bei 37°C, gefolgt von hinzufügen von 90 μl Kulturmedium trypsinisiert. Die Zellen wurden dann resuspendiert und 20 μl von diesen wurden auf Masterplatten transferiert, die mit EF beschichtet wurden und mit 200 μl Kulturmedium befüllt waren, das G418 und GANC enthielt. Die verbleibenden Zellen (110 μl/Well) wurden einzeln in Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Die Zellysate wurden präpariert und homologe Rekombinationssignale wurden durch PCR amplifiziert und durch Hybridisierung unter der Verwendung der oben erwähnten Oligonukleotidsonden nachgewiesen.
Bestätigung von Gen-abgezielten ES-Zellen durch genomische Southern-Hybridisierung
Von im PCR-Screening positiven Kolonien abgeleitete ES-Zellen wurden in Kultur expandiert und die DNA wurde aus den Zellen gereinigt. Die genomische DNA wurde mit ApaI verdaut, auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, auf Hybond-N+ Membran (Amersham) geblottet und mit einem ³²P-markiertem DNA-Fragment wie in 1 gezeigt hybridisiert. Die Sonde war ein 0,6 Kb EcoRI/BamHI-Fragment (die EcoRI-Stelle war von dem Lambda- Vektor abgeleitet und die Vektorsequenz betrug weniger als 8 Basenpaare in der gesamten Probe), die mit einem 2,8 Kb ApaI-Fragment in dem normalen H2-Ma-Gen und an ein 1,8 Kb ApaI-Fragment in dem H2-Ma-Gen, das einer homologen Rekombination mit dem abzielenden Konstrukt unterzogen wurde, hybridisierte. Die Unterbrechung des H2-Ma-Gen durch homologe Rekombination ist in 1 gezeigt. Die Restriktionskarte des Wild-Typ H2-Ma-Gens (A – ApaI, H – HindIII, N – NotI, S – StuI, Sf – SfiI), wobei die numerisch gefüllten Kästen Exons sind, ist gezeigt. Das Gen-abzielende Konstrukt des H2-Ma-Gens ist mit der in dem zweiten Exon des H2-Ma-Gens plazierten Neomycin-Kassette (neo) gezeigt und eine 61-Basenpaar-Deletion wurde auch in Exon 2 erzeugt, wo neo plaziert wurde. Das Herpes Simplex-Virus Typ I-Thymidinkinase (HSV-TK)-Gen wurde an dem 3'-Ende des Konstrukts plaziert. Die Struktur des unterbrochenen H2-Ma-Gens nach homologer Rekombination zwischen dem abzielenden Konstrukt und dem endogenen H2-Ma-Gen ist ebenfalls gezeigt.
Beispiel 4
Infektion des Gen-abzielenden ES-Klons in Donor-Blastozysten
Die Gen-abgezielte ES-Zellinie mit dem unterbrochenen H2-Ma-Gen wurde durch PCR charakterisiert und durch die Southern-Hybridierungsanalyse bestätigt. Die ES-Zellen wurden dann von den Feederzellen durch Behandeln der Zellkulturen mit Trypsin, einem Ermöglichen der Feederzellen sich für 30–45 Minuten anzulagern und Entfernen der nicht angebrachten ES-Zellen abgetrennt. Die ES-Zellen wurden in C57BL/6J Empfänger-Blastozysten unter der Verwendung von vorher beschriebenen Techniken injiziert (Bradley, A. "Production and analysis of chimeric mice. In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E. J. Robertson, ed. Oxford: IRL Press, (1987), pp 113–151).
Mausembryonen bei ungefähr 3,5 Tagen Gestationsphase wurden aus den Uteri von superovulierten C57BL/6J-Mäusen gesammelt. Ungefähr 10–15 ES-Zellen wurden in die Blastocoel-Höhle des Embryos injiziert. Die injizierten Embryonen wurden in die Uteri von ungefähr 2,5 Tagen pseudo-schwangeren CD1-Mäusen transferiert und die aus diesen Embryonen entwickelten Mäuse wurden 17 Tage später geboren. Eine Gesamtzahl von 16 chimären Mäusen wurde von der Embryoinjektion mit den H2-Ma Knockout-Zellinien erhalten. Da ES-Zellen E14 die wir verwendeten, aus dem 129 Ola-Mausstamm abgeleitet waren, der für die dominanten Agouti (A) Fellfarbgene homozygot ist, sowie die ES-Zellinie E14 für die Agouti (A) Fellfarbgene homozygot ist, ergibt ein Eindringen der ES-Zellen in die injizierten (schwarze Fellfarbe) C57BL/6J-Blastozysten die Erzeugung von chimären Fellfarbmäusen.
Beispiel 5
Züchten von chimären Mäusen
Die chimären männlichen Mäuse werden mit Wild-Typ C57BL/6 (schwarze Fellfarbe) weiblichen Mäusen gekreuzt. Einige der Nachkommen aus der Chimäre X C57BL/6-Kreuzung werden als Agouti erwartet, wenn die chimären männlichen ES-Zell-genetisches Material in ihre Keimbahn inkorporiert hatten (Agouti ist dominant gegenüber schwarzer Fellfarbe). Diese Kreuzungen werden durchgeführt, um auf den Transfer von ES-Zell-genetischer Information an ihre Nachkommen zu testen, einschließlich dem unterbrochenen H2-Ma-Gen.
Um die H2-Ma-Genotypen zu bestimmen, wurde genomische DNA von ungefähr 1 cm Schwanz von jeder Maus nach Entwöhnung gereinigt. Die genomische DNA wurde wie beschrieben isoliert (Laird et al., supra), gefolgt von Phenol und Phenol : Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Die Southern-Hybridisierungsanalyse (wie hier beschrieben) wurde verwendet, um Nachkommen zu identifizieren, die das unterbrochene H2-Ma-Gen enthielten. Die transgenen Nachkommen sind für die H2-Ma-Genunterbrechung heterozygot. Sowohl genomische (Schwanz) DNAs transgener heterozygoter und nicht transgener Mäuse wurde mit ApaI verdaut, auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, auf Hybond-N+ Membran geblottet und mit 3'-flankierenden DNA-Sonden hybridisiert, um die transgene H2-Ma-Genstruktur zu bestätigen. Die Southern-Hybridisierungsanalyse bestätigte, daß die Struktur des veränderten H2-Ma-Gens identisch zu der vorhergesagten war und der früher charakterisierten in den H2-Ma-gezielten ES-Klonen. 2 zeigt die Analyse von Mausschwanz-DNA durch Southern-Blot, wobei Hybridisierungsprofile von Wild-Typ (+/+), heterozygoten (+/–) und homozygoten (–/–) Mäusen gezeigt werden.
Beispiel 6
Züchten von heterozygoten Mäusen und Erzeugung von homozygoten H2-Ma-defizienten Mäusen
Männliche und weibliche transgene Mäuse, von denen jede eine Kopie des veränderten H2-Ma-Gens enthielt (heterozygote Mäuse) wurden miteinander gepaart, um Mäuse zu erzeugen, in denen beide Kopien des H2-Ma-Gens das abgezielte, veränderte transgene H2-Ma-Gen sind. Es wurde vorhergesagt, daß ein Viertel dieser Mausembryos für das veränderte H2-Ma-Gen homozygot wären. Überlebende Nachkommen werden durch Southern-Hybridisierung wie oben beschrieben genotypisiert. Homozygote Mutantenmäuse werden in einem Verhältnis von 1 in 4 Nachkommen geboren, falls das defekte Gen nicht die Embryoentwickelung beeinträchtigt. Homozygote Mutantenmäuse werden durch Analyse von Schwanz-DNA-Proben identifiziert, in denen nur die 1,8 kb ApaI geschnittene DNA-Bande, die von dem unterbrochenen Gen abgeleitet ist, jedoch nicht die 2,8 kb der DNA-Bande von dem intakten H2-Ma-Gen mit der 0,6 kb flankierenden Sonde hybridisiert wird (1B). Es wird bestimmt, daß 33% (15 Mäuse) einer Gesamtzahl von 45 Nachkommen-Mäusen homozygot (–/–) für das unterbrochene H2-Ma-Gen waren, 35,5% (16 Mäuse) heterozygot waren und 31,1% (14 Mäuse) für das H2-Ma-Gen Wild-Typ (+/+) waren.
Beispiel 7
Charakterisierung von homozygoten H2-Ma defizienten Mäusen
Splenozyten aus den H2-M^+/+ (Wild-Typ) und H2-M^–/– (defizienten) Mäusen wurden auf die H2-M-Expression unter der Verwendung von indirekter Immunfluoreszenz hin analysiert. Milzzellen wurden auf mit Cell-Tak (Collaborative Biomedical Research) beschichteten Objektträgern kultiviert, vor einer Fixierung in 4% Formaldehyd-PBS. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit 50 mM NH₄Cl und PBS gewaschen. Die Antikörperinkubation wurden PBS mit 0,6% Fischhautgelatine und 0,2% Saponin für die Permeabilisierung durchgeführt. Texas-Rot-markierte Kaninchen-Antikörper gegen Immunglobulin G (IgG) (Molecular Probes) und Fluoreszin-Isothiocyanat (FITC)-markierte Ratten-Antikörper gegen IgG (Cappel) wurden als sekundäre Reagenzien verwendet. Die fluoreszenten Zellen wurden unter der Verwendung eines Bio-Rad konfokalen Mikroskops aufgezeichnet. In den H2-M^+/+-Mäusen war die H2-M-Färbung in den vesikulären Strukturen lokalisiert (1C, rot), während keine H2-M-Färbung in Zellen von H2-M^–/–-Mäusen nachgewiesen wurde (1C, rot). Co-Färbung mit anti-H2-A^b monoklonalen Antikörper (mAB) M5/114 zeigte keine distinkten Färbungsunterschiede zwischen den zwei Zelltypen (vergleiche 1C und 1D, grün). Das Fehlen von normalem H2-M-Protein in den Mutanten-Mäusen wurde durch zweidimensionale Elektrophorese von immunpräzipitiertem H2-M aus metobolisch markierten Splenozyten bes tätigt. Während die Präzipitate aus Wild-Typ-Zellen sowohl H2-Ma und H2-Mb enthielten, wurde kein H2-M in dem Präzipitat von den H2-M^–/–-Zellen nachgewiesen (1E).
Um den Effekt von H2-M auf die Zelloberflächenexpression von MHC Klasse II zu bestimme, wurden Lymphknotenzellen von Wild-Typ und H2-M defizienten Mäusen mit einem Panel von H2-A^b-reaktiven mAbs inkubiert und durch Flußcytometrie (FACS) analysiert. Mehrere dieser mAbs (M5/114, 2A, Y3P und AF6-120.1) färbten Wild-Typ- und Mutantenzellen mit gleicher Intensität, was darauf hinwies, daß die Zelloberflächen Spiegel von H2-A^b vergleichbar waren (2A). Im Gegensatz zu diesen mAbs wurde eine unterschiedliche Färbung mit zwei anderen anti-H2-A^b mAbs beobachtet: BP107 färbte Mutantenzellen überhaupt nicht, während KH74 Mutantenzellen mit verringerten Intensität färbte (2A). Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die H2-A^b-Konformation auf den H2-M^–/–-Zellen unterschiedlich von den Wild-Typ-Kontrollzellen sein kann. Im Hinblick auf diese gut dokumentierten Ergebnisse wird DM in der Entfernung von CLIP von Klasse II-Molekülen impliziert (Sloan et al., 1995, Nature 375, 802. Denzin and Cresswell. 1995. Cell 82, 155. Sherman et al., 1995. Immunity 3, 197). Die verringerte Bindung von einigen anti-H2-A^b mAb an H2-M^–/–-Zellen könnte ein Versagen widerspiegeln, CLIP gegen andere Peptide auszutauschen. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden Mutantenzellen mit mAb 30-2 gefärbt, der mit CLIP-assoziiertem H2-A^b reagiert (Morkowski et al., 1995, J. Exp. Med. 182, 1403). Im Gegensatz zu der schwachen Reaktivität mit Wild-Typ-Zellen färbten H2-M^–/–-Zellen stark mit mAb 30-2 (2A). Darüber hinaus blockierte die Prä-Inkubation mit mAb 30-2 vollständig die Reaktivität von anti-H2-A^b mAb KH74 mit Mutantenzellen, während dieselbe Behandlung keinen Effekt auf die KH74-Färbung auf H2-M^+/+-Kontrollzellen hatte (2A). Daher scheinen im wesentlichen alle Klasse II-Moleküle CLIP zu enthalten.
Die immunhistochemische Analyse von Gewebeschnitten aus H2-M^–/–-Mäusen bestätigte die FACS-Analyseergebnisse. Thymus-Cryostatschnitte wurden unter der Verwendung von Kaninchen-Antiserum K553, gefolgt von biotinyliertem Kaninchen-Antikörper gegen IgG (Jackson ImmunoResearch) auf H2-M gefärbt; für H2-Ab unter der Verwendung von biotinyliertem 30-2 mAbs. Gebundene Antikörper wurden mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Streptavidin (Jackson ImmunoResearch) nachgewiesen, gefolgt von kolorimetrischen Substrat. So war die H-2M-Expression in den Lymphoidgeweben von Mutantenmäusen nicht nachweisbar, wohingegen in Wild-Typ-Mäusen eine H2-M-Expression in B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen in der Milz und den Lymphknoten beobachtet wurde.
Im normalen Thymus wird H-2M in kortikalen Epithelzellen und in der Medulla exprimiert, war jedoch vollständig nicht nachweisbar im H2-M^–/–-Thymus (2B). Die Klasse II-Expression im Thymus der Mutantenmäuse war mit der Wild-Typ-Kontrolle vergleichbar, wenn durch mAb M5/114 analysiert, während keine Färbung mit mAb BP107 im Mutantenthymus beobachtet wurde (2B). Ähnlich zu dem Klasse II-Molekülen in Lymphknoten-B-Zellen schienen die Klasse II-Moleküle im H2-M^–/–-Thymus hauptsächlich CLIP zu enthalten, da beide Epithelzellen und Knochenmarks-abgeleitete APCs stark mit mAb 30-2 färbten. Im Unterschied dazu färbte dieser Antikörper nur wenige verstreute Zellen in der Medulla des Wild-Typ-Thymus (2B).
Unter mild denaturierenden Bedingungen wandern Klasse II-Moleküle, die gut-passenden Peptide enthalten, in SDS-PAGE-Gelen oft als Dimere (Stern and Wiley. 1992, Cell 68, 465. Sadegh-Nasseriand Germian, 1991, Nature 353, 167. Nelson et al., 1994, Nature 371, 250), wohingegen Klasse II-Moleküle mit schlecht passenden Peptiden dissoziieren und als einzelne α- und β-Ketten laufen. Die SDS-Stabilität von H2-A^b-Molekülen aus Wild-Typ oder Mutantenmäusen wurde in einem Puls-Chase-Experiment analysiert. Nach der Immunpräzipitation mit M5/114 wurden die Proben durch SDS-PAGE ohne Kochen analysiert, was daher die stabilen Klasse II Dimere intakt ließ. 2C zeigt, daß in Splenozyten aus H2-M^+/+-Mäusen SDS-stabile Dimere (αβ) innerhalb einer Stunde Verfolgung gebildet wurden und auch nach 24 Stunden der Verfolgung prominent waren. Nur kleine Mengen von SDS-instabilen Klasse II-Monomeren wurden gesehen. Überraschenderweise wanderten die H2-A^b-Moleküle, die aus den H2-M^–/–-Splenozyten ausgefällt wurden, auch als SDS-stabile Dimer, obwohl ihre Wanderung leicht langsamer war als die Wanderung von Dimeren, die aus Wild-Typ-Zellen abgeleitet waren (1C, αβ*). Einige Klasse II-Monomere wurden auch gefunden und zusätzlich war eine Bande mit geringem Molekulargewicht deutlich, die CLIP repräsentierte. H2-H^–/–-abgeleitete H2-A^b-Moleküle schienen kompakt zu sein, anders als Lose in der Natur (Viville et al., 1993, Cell 72, 635. Bikoff et al., 1993, J. Exp. Med. 177, 1699. Dommair et al., 1989, Cold spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54, 409), und wanderten als distinkte Banden im Gegensatz zu der defusen Dimerbande, die in dem Wild-Typ-Präzipitat gesehen wurde. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß eine begrenzte Zahl von Peptiden, am wahrscheinlichsten CLIP für die Dimerbanden verantwortlich war. SDS-stabile DR1-CLIP-Komplexe wurden berichtet (Bijlmakers et al., 1994, EMBO J. 13, 2699) und da CLIP stark an H2-A^b bindet (Sette et al., 1995, J. Exp. Med. 181, 677) ist die Bildung von SDS-stabilen Dimeren denkbar, obwohl nicht unerwartet. Die Intensität der Klasse II-Banden nahm nicht signifikant während der 24 Stunden Verfolgungsperiode ab, was anzeigte, daß die Halbwertszeit von H2-A^b in den Mutantenmäusen ähnlich zu der Halbwertszeit in Wild-Typ-Mäusen ist. In gekochten (und reduzierten) Proben (2D) wanderte die Klasse II als Monomere und der einzige distinkte Unterschied zwischen den Wild-Typ- und Mutantenpräzipitaten war die große Menge von CLIP, die in der Mutantenprobe vorhanden war. Die Immunpräzipitation mit mAb In-1, der mit der invarianten Kette reaktiv ist (jedoch nicht mit CLIP), ergab keine Unterschiede zwischen Mutanten- und Wild-Typ-Zellen in entweder gekochten oder nicht-gekochten Proben.
Es war von Interesse, zu bestimmen, ob CLIP-assoziierte Klasse II-Moleküle in der Lage waren eine normale Selektion von CD4⁺-Zellen zu vermitteln. Wie in 3A dargestellt, war der Anteil von Lymphknoten (und Milz) CD4⁺-Zellen in H2-M^–/–-Mäusen auf ungefähr 30–50% von Normal verringert. Diese Verringerung in CD4⁺-Zellen wurde auch im Thymus gefunden, jedoch in einem geringerem Ausmaß. Nichtsdestotrotz sahen die Lymphoidgewebe normal aus und das Ergebnis, daß signifikante Zahlen von CD4⁺-Zellen sich entwickelten, zeigte an, daß eine positive Selektion über H2-A^b-Moleküle in den H2-M^–/–-Mäusen auftrat. Der Phänotyp der in diesen Mäusen erzeugten CD4⁺-Zellen war ähnlich zu denjenigen von H2-M^+/+-Mäusen. Daher zeigte die Hauptzahl von extrathymischen CD4⁺-Zellen einen naiven Phänotyp (3B) und die Analyse von Vβ-Verwendung ließ vermuten, daß die Zellen polyklonal waren.
Um zu bestimmen, ob die H2-M^–/– CD4⁺-Zellen funktionell waren, wurde ihre Fähigkeit, sich in Antwort auf Alloantigene zu teilen, analysiert. CD4⁺-Zellen von den Mutantenmäusen versagten auf ihre eigenen Milz-APCs zu antworten, übereinstimmend mit normaler Selbsttoleranzinduktion. Im Unterschied dazu reagierten diese Zellen stark auf APCs von MHC-passenden Wild-Typ-Littermates (und normalen C57BL/6). Diese Hyperreaktivität war so früh wie 2 Tage in Kultur ersichtlich und war bei Tag 3–4 maximal. Die Titration von Responder-CD4⁺-Zellen zeigte, daß die H2-M^–/–-Zellen 10–100-fach mehr auf H2-A^b responsiv waren, als CD4⁺-Zellen von normalen Wild-Typ-Mäusen. Eine abnormal starke proliferative Antwort wurde auch nach Aussetzen von H2-M^–/– CD4⁺-Zellen gegenüber APCs aus einer Vielzahl von MHC-allogenen Stämmen, einschließlich B10.D2 (H2-A^d), B10.BR (H2-A^k) und B6.bm12 (H2-A^bm12) gesehen. Nicht überraschend im Hinblick auf das begrenzte Peptid-Repertoire der H2-M^–/– Klasse II-Moleküle versagten die APCs von H2-M^–/–-Mäusen dabei, MHC-allogene T-Zellen zu stimulieren (4B). Die Unfähigkeit, proliferative T- Zellantworten hervorzurufen, spiegelte nicht die schlechte Co-Stimulation wieder, da H2-M^–/– APCs eine normale Co-Stimulation für die CD4⁺-Zellantworten auf anti-CD3-Antikörper sowie auf Concanavalin A zur Verfügung stellen konnten. Weiterhin waren H2-M^–/– APCs nicht spezifisch suppressiv, da die Hinzugabe von diesen Zellen zu Kulturen mit normalen APCs die Antwort nicht signifikant veränderte.
Diese Ergebnisse sind mit der Beobachtung konsistent, daß ein begrenztes Peptid-Repertoire (das hauptsächlich aus CLIP besteht) die positive Selektion von signifikanten Zahlen von funktionellen CD4⁺-T-Zellen unterstützen kann. Nichtsdestotrotz argumentiert die verringerte Zahl von CD4⁺-Zellen in diesen Mäusen auch dafür, daß eine normale Dichte von Klasse II-Molekülen auf Thymus-Epithelzellen nicht ausreichend ist, um maximale Spiegel von positiver Selektion zu erreichen, sondern das die Peptiddiversifikation zu der Effizienz dieses Prozesses beiträgt.
Die H2-M^–/–-Mäuse zeigen keine offene Autoimmunität, was anzeigt, daß die Toleranz gegenüber CLIP-assoziierten Klasse II-Molekülen normal ist. Die Hyperreaktivität von H2-M^–/–-CD4⁺-Zellen auf H2-A^b APCs aus normalen Mäusen läßt jedoch vermuten, daß die Diversifikation der Klasse II-assoziierten Peptide in H2-M^–/–-Mäusen zu begrenzt ist, um eine negative Selektion gegenüber Selbstpeptiden anders als CLIP zu induzieren.
Die dreidimensionale Struktur von HLA-DR3-CLIP (Ghosh et al., 1995, Nature 378, 457) läßt vermuten, daß Klasse II-CLIP-Komplexe nicht qualitativ unterschiedlich von anderen Klasse II-Peptidkomplexen sein können. Daher spiegelt das Versagen von allogenen CD4⁺-T-Zellen, auf H2-M^–/– APCs zu Antworten nur unwahrscheinlicher weise eine Konformationsänderung in den Klasse II-Molekülen wider, die eine T-Zell-Rezeptorbindung beseitigen würde. Das Fehlen von Antwort ist wahrscheinlicher eine Widerspiegelung der Tatsache, daß die meisten Klasse II-Moleküle auf H2-M^–/– APCs CLIP enthalten. Trotz dieser hohen Dichte dieses Komplexes auf den H2-M^–/– APCs ist die Vorläufer-Sequenz von T-Zellen, die in der Lage sind, einen einzelnen Klasse II-Peptidkomplex zu erkennen (d. h. allogenes MHC-CLIP) vermutlich niedrig und die Reaktivität von diesen Zellen in Tests von Zellteilungsantwort nicht nachweisbar.
Die hier präsentierten Daten zeigen, daß H2-M klar für die Erzeugung eines normalen Repertoires von CD4⁺-T-Zellen sowie für die Präsentation eines normalen Arrays von Peptid-Antigenen ist.

Claims

Transgene Maus, deren somatische- und Stammzellen ein Gen enthalten, das für eine nicht-funktionelle Form eines H2-Ma-Gens kodiert, wobei auf das nicht-funktionelle H2-Ma-Gen so abgezielt wurde, daß das Wildtyp H2-Ma-Gen in der Maus oder einem Vorfahren der Maus in einem embryonalen Stadium unter Verwendung von embryonalen Stammzellen ersetzt wurde.
Maus gemäß Anspruch 1, worin besagte Maus fruchtbar und fähig ist, das nicht-funktionelle H2-Ma-Gen auf ihren Nachwuchs zu übertragen.
Maus gemäß Anspruch 2, worin das nicht-funktionelle H2-Ma-Gen in einen Vorfahren der Maus in einem embryonalen Stadium durch Mikroinjektion von veränderten embryonalen Stammzellen in den Mausblastozyten eingeführt worden ist.
Maus gemäß Anspruch 2, worin das nicht-funktionelle H2-Ma-Gen in die Maus in einem embryonalen Stadium eingebracht worden ist, entweder durch Mikroinjektion von veränderten embryonalen Stammzellen in den Mausblastozyten oder durch eine Koinkubation von veränderten embryonalen Stammzellen mit befruchteten Eiern oder Morulae.
Transgene Maus von Anspruch 1 worin die nicht-funktionelle Form des H2-Ma von einer Spezies, anders als der Maus, abstammt.
Maus gemäß Anspruch 5, worin die nicht-funktionelle Form von H2-Ma humanes HLA-DM ist.
Zellinie, die von der transgenen Maus gemäß Anspruch 1 abgeleitet ist.