DE69233173T2

DE69233173T2 - Herstellung eines Interesse-Proteins in der Milch eines Transgen-Säugetieres

Info

Publication number: DE69233173T2
Application number: DE69233173T
Authority: DE
Inventors: Louis-Marie Houdebine; Eve Devinoy; Dominique Thepot
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1991-06-12
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2012-06-13
Also published as: EP0527063B1; DE69233173D1; EP0527063A1; ES2206444T3; WO1992022644A1; JPH06508515A; FR2677652A1; PT527063E; CA2111238A1; FR2677652B1; ATE248221T1; CA2111238C; DK0527063T3; JP3824632B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines interessierenden Proteins in der Milch eines Säugetierleibchens, außer dem Menschen. Sie betrifft gleichfalls die Konstrukte, die es erlauben, diese Tiere zu erhalten, die so erhaltenen Tiere wie auch die Zellen, die die Konstrukte, die die Expression eines heterologen Proteins erlauben, enthalten.
Es wurden mehrere Wege verfolgt, um Proteine zu erhalten, welche ein biologisches, therapeutisches oder industrielles Interesse aufweisen und natürlicherweise in geringen Mengen oder in einer schwierig zu reinigenden Form produziert werden.
Proteine konnten beispielsweise dank Techniken der genetischen Rekombination durch Mikroorganismen, wie Bakterien oder Hefen, produziert werden. Indessen benötigt der größte Teil der Proteine nach ihrer Synthese ein Reifungsstadium, welches in chemischen Modifizierungen von bestimmten reaktionsfähigen Gruppen, einer Glykosylierung u.s.w. besteht. Die prokaryotischen Zellen verfügen nicht über die enzymatische Ausstattung, welche adäquat ist, um diese Reifung auszuführen, woraus die Gewinnung von inaktiven Proteinen und/oder von Proteinen mit hoher Antigenität resultiert.
Es ist dementsprechend vorzuziehen, diese Proteine in eukaryotischen Zellen, die die geeigneten enzymatischen Umwandlungen vornehmen, zu synthetisieren. Indessen wirft die Kultur von Gewebezellen in großem Maßstab eine bestimmte Anzahl von technischen und wirtschaftlichen Schwierigkeiten auf.
Ein anderer Ansatz besteht dementsprechend darin, diese Proteine durch Zellen in vivo durch das Zwischenglied von transgenen Tieren produzieren zu lassen. Es ist wünschenswert, dass das eingesetzte System die Produktion von Proteinen in großer Menge, und welche leicht gewinnbar ist, erlaubt. Es ist folglich interessant, dass das rekombinante Protein auf der Ebene der Milchdrüse von transgenen Tieren produziert wird und in die Milch ausgeschieden wird. Es handelt sich tatsächlich um eine leicht sammelbare biologische Flüssigkeit, welche eine relativ begrenzte Komplexität und eine geringe proteolytische Aktivität aufweist; außerdem werden die Reifungsprozesse der rekombinanten Proteine (Glycosylierung, Phosphorylierung, Spaltung u.s.w.) wahrscheinlich sichergestellt sein.
Es ist so gelungen, durch die Milchdrüse von Mäusen oder Schafen Proteine der Milch einer anderen Spezies oder Proteine, die in der Milch normalerweise nicht vorhanden sind, produzieren zu lassen (Ref. 1 bis 15).
Bühler et al., (Februar 1990) Biotechnology, Band 8: 140–143 betrifft die Verwendung des Casein-Promotors für die Expression von IL-2 in der Milch von Kaninchen. EP 264 166 , WO 91/03551 und Andres et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84: 1299–1303, beziehen sich auf die Verwendung des WAP-Promotors aus der Maus.
Gleichwohl variiert der Gehalt von so produzierten Proteinen extrem. Er unterscheidet sich von einem transgenen Tier zum anderen insoweit, wie dieser von dem Prozess der Integration des Transgens, welcher seinerseits von einem Tier zum anderen variiert, abhängt. Die Natur der Genkonstrukte ist gleichfalls essentiell, wobei die die Expression der Gene der Proteine der Milch regulierenden Elemente in Mehrzahl vorliegen und sich an verschiedenen Stellen der Promotorregion und des transkribierten Teils des Gens befinden können. So sind der Promotor von β-Lactoglobulin aus dem Schaf, der WAP-Promotor aus der Ratte und der β-Caseinpromotor aus der Ratte in der Lage, diese Proteine in transgenen Mäusen synthetisieren zu lassen. Die Gehalte sind gleichwohl lediglich im Falle von β-Lactoglobulin systematisch hoch. So dirigiert der β-Lactoglobulin-Promotor die Synthese von humanem α₁-Antitrypsin, welches den Wert von 7 mg/ml Milch erreicht, in der Milch einer transgenen Maus. Der Promotor von α_S1-Casein erlaubt die Synthese von humaner Urokinase, aber die Promotoren der Gene des β-Caseins aus der Ratte und des β-Caseins aus dem Kaninchen, die bis heute eingesetzt werden, haben eine begrenzte Aktivität. Der Promotor des WAP-Gens aus der Maus dirigiert die Synthese von mehreren fremden Proteinen (Plasminogenaktivator, CD4), die in die Milch von transgenen Mäusen sekretiert werden. Die mit diesem Promotor erhaltenen Mengen von Proteinen sind gleichwohl relativ mäßig.
Außerdem erweist sich, dass die Spezifität des Promotors durch seine Kombination mit einem fremden Gen modifiziert wird. Beispielsweise erzielen Günzburg et al. (Molecular Endocrinology 1991) die Sekretion von Wachstumshormon mit Hilfe einer rekombinanten DNA unter der Abhängigkeit von dem WAP-Promotor aus der Maus bei transgenen Tieren; das Wachstumshormon wird aber gleichfalls im Kleinhirn, in Bergmann-Gliazellen produziert. Solche Phänomene können zu Toxizität und zum frühzeitigen Tod des Tiers führen.
Die Erfindung beruht auf dem Nachweis des besonderen Vorteils des Promotors des WAP-Gens des Kaninchens. Tatsächlich ist das WAP des Kaninchens ("whey acidic protein") ein Protein, das in der Milch von Kaninchen relativ reichlich vorkommt (15 mg/ml Milch), und das Kaninchen ist potentiell ein transgenes Tier, das in großem Maßstab einsetzbar ist.
Die Sequenz der cDNA, welche das WAP-Protein aus dem Kaninchen kodiert, wird in Deviney et al., (1988), Nucleic Acids Research, Band 16, Seite 8180, beschrieben.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines interessierenden heterologen Proteins in reifer Form oder in fusionierter Form in der Milch eines Säugetierweibchens, außer dem Menschen, wobei man in dem Verfahren:

– das Weibchen aufzieht und
– die Milch gewinnt, aus der man das Protein gewinnt, welches man abtrennt, falls erforderlich,

Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein Verfahren, in welchem die die Expression des interessierenden Proteins kontrollierende Sequenz außerdem Expressionselemente umfasst, welche auf dem Fragment zwischen 3 kb und 6,3 kb einschließlich stromaufwärts vom 3'-Ende des WAP-Promotors liegen.
Die Gewinnung von transgenen Tieren ist bekannt und wurde mit nahe verwandten Konstrukten in den zuvor zitierten Dokumenten, aber gleichfalls in Günzburg et al., Hennighausen et al., Burdon et al., Reddy et al. sowie in dem Patent WO 90 05188 ausgiebig beschrieben.
Die detaillierte Beschreibung der Transgenesemethoden wird hier im Detail nicht wiederholt werden, die obigen Dokumente werden in der vorliegenden Beschreibung unter ausdrücklicher Bezugnahme zitiert.
Mit "interessierendes heterologes Protein" soll im wesentlichen ein Protein bezeichnet werden, das natürlichezweise nicht unter der Kontrolle des WAP-Promotors des Kaninchens steht.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das eingesetzte Säugetierweibchen, außer dem Menschen, vorzugsweise ein Kaninchen, aber diese Konstrukte sind gleichfalls in anderen Säugetieren, beispielsweise den Mäusen, wirksam.
Die erhaltene Milch enthält das Protein von Interesse, das dann isoliert werden kann oder nicht; je nachdem, ob es in reifer oder fusionierter Form vorliegt, kann dieses eine chemische oder enzymatische Spaltung durchlaufen, falls erforderlich.
Die eingesetzten DNA-Konstrukte werden vorzugsweise durch Mikroinjektion auf der Ebene des befruchteten Eis im Stadium von einer Zelle bis 8 Zellen eingeführt, dann selektiert man die Tiere, die den zuvor beschriebenen Kriterien entsprechen, d.h. transgen sind und das Protein in der Milch exprimieren.
Die Promotorregion dieses WAP-Gens, aufgepfropft auf das Reportergen der bakteriellen Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), enthält die Elemente, die auf die beiden wichtigsten lactogenen Hormone, Prolactin und die Glucocorticoide, ansprechen. Diese Hormone stimulieren die Expression des CAT-Gens intensiv, wenn mit dem hybriden Gen pri märe Mammaepithelzellen eines Kaninchens transfiziert werden. Die Reaktion auf die Hormone hängt von der Länge des eingesetzten Promotors ab. Der Promotor des WAP-Gens des Kaninchens ist dementsprechend viel wirkungsvoller als die Promotoren der WAP-Gene aus der Maus und der Ratte, welche bis zum heutigen Tage eingesetzt werden.
Insbesondere kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren der das interessierende Protein kodierenden Sequenz in Richtung ihres 5'-Endes eine Sequenz, welche dem vollständigen Promotor des WAP-Gens des Kaninchens entspricht, oder eine äquivalente Sequenz, welche die Promotorfunktion sicherstellt, vorangehen. Es ist in diesem Falle ebenso möglich, die Gesamtheit des WAP-Gens und einen WAP-Promotor dieses Gens oder eine äquivalente Sequenz einzusetzen. Die der Anmeldung beigefügte 5 gibt das WAP-Gen des Kaninchens an.
Mit "äquivalente Sequenz" soll vorzugsweise eine Sequenz bezeichnet werden, die eine Länge von mindestens 3 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des WAP-Promotors aufweist und insbesondere die Expressionselemente umfasst, die sich auf dem Fragment mit einer Länge von mindestens 6,3 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors des Kaninchens befinden, sich insbesondere zwischen den HindIII- und BamHI-Stellen befinden (1).
Der Promotor kann eine Sequenz von 17 kb, welche zwischen den HindIII- und EcoRI-Stellen eingeschlossen ist, oder eine Sequenz, die die auf diesem Fragment befindlichen Expressionselemente umfasst, umfassen. Die essentiellen Elemente der erfindungsgemäßen Konstrukte befinden sich auf dem Fragment mit einer Länge von 17,6 kb ausgehend vom 3'-Ende des Promotors.
Dieser lange Promotor ist in der Lage, Elemente mitzubringen, die die Expression des fremden Gens, welches mit diesem verknüpft ist, noch weiter begünstigen, oder dessen Expression in noch regelmäßigerer Weise zu erhöhen, indem diese unabhängiger vom Insertionsort des Transgens in das Genom gemacht wird.
Der kurze Promotor von 6,3 kb wird eine Reaktion auf die lactogenen Hormone ergeben, die praktisch identisch ist mit jener, die mit dem langen Promotor von 17 kb erhalten wird, und kann die Synthese von Proteinen, deren Gene mit diesem in einem Vektor kombiniert werden, bis zu sehr hohen Gehalten dirigieren.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Konstrukte, wie sie vorstehend definiert wurden, aber bei denen in der dem Gen des WAP-Proteins des Kaninchens entsprechenden Sequenz das AUG-Start- oder -Initiatorcodon deletiert ist.
Diese Modifizierung kann insbesondere durch gesteuerte Mutagenese erzielt werden.
Wenn die das interessierende Protein kodierende Sequenz in einer fusionierten Form mit der Sequenz der Gesamtheit oder eines Teils des WAP-Gens vorliegt, ist es möglich, die ATG-Sequenz dieses Proteins zu entfernen.
Das WAP-Protein des Kaninchens könnte z.B. mit diesem Konstrukttyp beispielsweise in transgenen Mäusen exprimiert werden.
In diesem Konstrukttyp, welcher das Gen des WAP-Proteins des Kaninchens umfasst, wobei dieses gegebenenfalls das AUG-Start- oder -Initiatorcodon verloren hat, kann das Gen oder die cDNA des interessierenden Proteins an unterschiedlichen Stellen angeordnet werden, die zu unterschiedlichen Niveaus und Konstrukttypen führen werden, wie sich dies aus den Beispielen ergeben wird.
Gemäß einem anderen von deren Aspekten stellt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung der Milch, welche durch ein Säugetierweibchen, außer dem Menschen, produziert wird, und des interessierenden Proteins, das diese enthält, bereit, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man, um das interessierende Protein in der Milch des Säugetierweibchens, außer dem Menschen, zu gewinnen,

a) die Milchdrüsen erntet,
b) die Milchdrüsen bei einer Temperatur von ungefähr 0°C über eine Dauer, die zwi schen 2 Stunden und 18 Stunden variiert, inkubieren lässt,
c) die Milch gewinnt, welche spontan aus den Drüsen ausgeschwitzt wird,
d) das interessierende Protein ausgehend von der Milch isoliert und das gereinigte Protein erhält.

Dieses Verfahren wurde im Rahmen der Produktion von heterologem Protein durch ein transgenes Tier, in dessen Genom Fragmente des Gens des WAP-Proteins integriert worden sind, entwickelt, aber es kann auf die Reinigung eines jeglichen Proteins, welches man aus der Milch zu isolieren wünscht, angewandt werden.
Es weist bezogen auf die klassischen Melkverfahren von nicht wiederkäuenden Säugetieren beträchtliche Vorteile auf der Ebene der erhaltenen Mengen auf, vor allem bei kleinen Tieren, wie der Maus (24). Die Zusammensetzung der gesammelten Milch ist identisch zu jener der natürlicherweise produzierten Milch. Dieses Verfahren erlaubt außerdem einen leichteren Transfer der erhaltenen Produkte vom Produktionsort zum Reinigungs- und Behandlungsort durch Transport der Milchdrüsen in Eis.
Das Verfahren zur Herstellung von heterologem Protein der Erfindung erlaubt gemäß einer jeglichen seiner Varianten, eine große Anzahl von Proteinen zu erhalten. Unter diesen Proteinen kann man aufführen:

– die Wachstumsfaktoren,
– die Interleukine,
– die Stimulationsfaktoren,
– die Kinasen,
– die Koagulations- oder Gerinnungsfaktoren,
– alpha-Antitrypsin,
– Hirudin;

– Erythropoietin,
– G-CSF,
– alpha-Antitrypsin,
– Urokinase,
– den Faktor VIII.

Man kann die folgenden Konstrukte aufführen:

– Konstrukt: WAP-humanes α₁-Antitrypsin (Analog Arg 358): das vollständige Gen des humanen α₁-Antitxypsins, welches Arg 358 anstelle von Meth 358 aufweist (Courtney, Bull. Inst. Pasteur (1988) 86, 85–94), wurde mit dem langen Promotor (17,6 kb) des WAP-Gens des Kaninchens an der HindIII-Stelle der nicht translatierten 5'P-Sequenz nach dem Modell der WAP-GH-Konstrukte fusioniert. Mehrere Maus-Linien exprimieren das humane Gen in einer Konzentration von 2 und 5 mg/ml Milch.
– Konstrukt WAP-humanes Erythropoietin: das vollständige Gen des humanen Erythropoietins (Semenza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 2301–2305) ist mit dem Promotor (6,3 kb und 17,6 kb) des WAP-Gens des Kaninchens fusioniert.
– Konstrukt WAP-humaner Faktor VIII-delta II: die cDNA des humanen Faktors VIII-deltaII (mit einer Deletion der Region B [Meulien et al., Prot. Engin (1988) 2, 301–306]), welcher das erste Intron des Faktor VIII-Gens vorangeht und der dessen Polyadenylierungssequenz fehlt, wurde in das Innere des vollständigen WAP-Gens des Kaninchens an der HindIII-Stelle, welche durch gesteuerte Mutagenese eingeführt wurde und welche dem natürlichen AUG vorangeht, eingeführt.

Die erfindungsgemäßen Konstrukte erlauben, ganz und gar unerwartete Ergebnisse zu erhalten; insbesondere ist der 6,3 kb-Promotor von WAP, welcher mit den Genen des Wachstumshormons vom Menschen und vom Rind kombiniert ist, in der Lage, die Synthese dieser Proteine in der Milch von transgenen Mäusen in sehr hohen Gehalten (1–21 mg/ml) zu dirigieren.
Das hGH, welches in der Milch der transgenen Mäuse enthalten ist, ist strukturell intakt. Das hGH hat gleichfalls seine biologische Aktivität beibehalten (ausgewertet nicht durch dessen Wachstumshormonaktivität, sondern durch seine Prolactin-Aktivität). Der biologische Test gibt an, dass die Konzentration des Hormons 10 mg/ml beträgt, ein Wert, welcher mit den durch den radioimmunologischen Test und durch Elektrophorese gefundenen Werten übereinstimmt.
Der Promotor des WAP-Gens des Kaninchens ist dementsprechend viel wirksamer als die Promotoren der WAP-Gene aus der Maus und der Ratte, welche bis zum heutigen Tage eingesetzt werden.
Die folgende Tabelle 1 gibt eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Veröffentlichungen 2 bis 15 und bringt dementsprechend die mit den erfindungsgemäßen Konstrukten erhaltenen Ergebnisse bezogen auf jene, die im Stand der Technik veröffentlicht worden sind, zur Geltung.
Einer der essentiellen Gründe kann in der Tatsache bestehen, dass das DNA-Fragment des Kaninchens (6,3 kb) viel länger ist als sein Homolog aus der Maus und der Ratte (2,6 kb und 0,9 kb). Es können essentielle regulatorische Elemente in den eingesetzten DNA-Fragmenten aus der Maus und der Ratte fehlen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Konstrukte, die es erlauben, Säugetierweibchen, außer dem Menschen, gemäß der Erfindung zu erhalten.
Die Erfindung betrifft insbesondere die DNA-Sequenzen und die Vektoren, die das Ausführen des Verfahrens erlauben; insbesondere die DNA-Sequenzen, die mindestens ein heterologes Gen, welches ein interessierendes Protein kodiert, unter der Kontrolle von mindestens einer Sequenz, welches sich unter den Expressionselementen des WAP-Proteins des Kaninchens befindet und sich auf dem Fragment mit einer Länge von mindestens 3 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors befindet, umfassen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Säugetierweibchen, außer dem Menschen, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar sind, sowie transformierte Zellen, mit Ausnahme der Zellen, die sich in situ im menschlichen Körper befinden, welche die erfindungsgemäßen Konstrukte enthalten.
Obgleich die in Frage kommenden Tiere sehr unterschiedlich sein können, ist das Kaninchen ein Tier, welches potentiell eingesetzt werden kann, um rekombinante Proteine in reichlicher Ausbeute zu erhalten. Bis zu 100 ml Milch können jeden Tag gesammelt werden. Diese Milch ist sehr reich an Proteinen (viel reicher als die Milch der Wiederkäuer). Sie ist außerdem einfacher und weniger beschwerlich von Kaninchen als von großen transgenen Tieren zu erhalten. Der Promotor des WAP-Gens des Kaninchens hat außerdem alle Chancen, die Synthese von rekombinanten Proteinen beim Kaninchen am besten zu dirigieren.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden Beispiele, in denen auf die folgenden Figuren Bezug genommen werden wird, ersichtlich werden:
1: Kartierung des WAP-Gens des Kaninchens.
2a: Schema der Konstruktion des Plasmids pW₃.
2b: Polylinker des Plasmids p-polyIII-I.
3: Schema der Konstruktion des Plasmids pJ₄.
4: Produktion von Wachstumshormon vom Menschen und vom Rind in transgenen Mäuse-Linien, welche die Konstrukte pW₃ und pJ₄ beherbergen.
5: Sequenz des WAP-Gens des Kaninchens.
6: Schemata der verschiedenen in vivo eingesetzten Konstrukte.
7: Schemata der Konstrukte, welche das CAT-Reportergen und variable Längen des WAP-Promotors enthalten.
8: Wirksamkeit der in 7 beschriebenen Konstrukte.
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION DES PLASMIDS pW3
Man stellt zuallererst das Plasmid p26C her.
Das Plasmid p26C wurde erhalten, indem die BamH₁-HindIII-Sequenz des WAP-Gens (6,3 kb-Fragment der 1) in den Polylinker des Vektors p-poly III-I (zwischen den Stellen BamH₁ und HindIII) eingeführt wurde.
Im Zuge dieser Klonierung wurde die BamH₁-Stelle beseitigt und durch die ClaI-Stelle ersetzt, die in dem Vektor p26C zu sehen ist (2). Der Vektor p26C ist folglich ein Plasmid, welches in der Lage ist, ein fremdes Gen aufzunehmen, welches unter die Abhängigkeit des 6,3 kb-WAP-Promotors gestellt wird. Die Einführung des fremden Gens kann beispielsweise in die SalI-Stelle des Polylinkers erfolgen (2). Die Inserts, die die Gesamtheit des Promotors und der fremden Gene enthalten, können aus dem Plasmid nach Schneiden an den beiden Not1-Stellen, die sich an den Enden des Polylinkers des Plasmids p-poly III-I befinden, isoliert werden.
Das Plasmid pW₃, erhalten ausgehend von dem Plasmid p26C (gemäß 2), enthält den Promotor des WAP-Gens des Kaninchens (6,3 kb) und das Gen des humanen Wachstumshormons (hGH). Das für die Herstellung der transgenen Mäuse eingesetzte Fragment befindet sich zwischen den beiden Not1-Stellen.
Eine HindIIi-Stelle wurde in die Leadersequenz des Gens (Leader) durch gesteuerte Mutagenese eingeführt, um als Klonierungsstelle zu dienen.
BEISPIEL 2: KONSTRUKTION DES PLASMIDS pJ74
Das Plasmid pJ₄, erhalten ausgehend von dem Plasmid p26 (gemäß 3), enthält den Promotor des WAP-Gens des Kaninchens (6,3 kb) und das Gen von Rinder-Wachstumshormon (bGH). Das für die Herstellung der transgenen Mäuse eingesetzte Fragment befindet sich zwischen den beiden Not1-Stellen.
Der E. coli-Stamm, welcher das Plasmid p26 enthält, wurde am 12. Juni 1991 unter der Nr. I-1116 bei der Collection Nationale de Nature de Microorganismes des Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, hinterlegt.
BEISPIEL 3: HERSTELLUNG VON TRANSGENEN MÄUSEN
Die pW₃- und pJ₄-Fragmente wurden eingesetzt, um transgene Tiere zu erhalten. Die transgenen Mäuse wurden durch die klassische Mikroinjektionstechnik (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438–4442) erhalten. 1–2 pl, welche 500 Kopien des Gens enthalten, wurden in den männlichen Pronukleus von Mäuseembryonen injiziert. Die Konstrukte wurden in dem Vektor p-poly III-I (Lathe et al., Gene (1987) 57, 193–201) hergestellt. Es wurden die Not1-Not1-Fragmente dieses Vektors, welche die rekom binierten Gene enthalten, mikroinjiziert. Die Embryonen werden dann in den Eileiter von weiblichen Adoptivtieren, welche hormonal vorbereitet worden waren, transferiert. Ungefähr 10% der manipulierten Embryonen führten zur Geburt von kleinen Mäusen und 2–5% der manipulierten Embryonen zu transgenen kleinen Mäusen. Die Anwesenheit der Transgene wurde durch die Southern-Transfer-Technik ausgehend von der aus den Schwänzen der Mäuse extrahierten DNA nachgewiesen. Die Konzentrationen von Wachstumshormon im Blut und in der Milch der Tiere wurden mit Hilfe von spezifischen radioimmunologischen Tests bestimmt.
Die biologische Aktivität von hGH wurde bestimmt, indem Milch zu Kulturmedium von Zellen oder von Mammaexplantaten von Kaninchen zugesetzt wurde. Das in der Milch enthaltene hGH hat die Expression des β-Casein-Gens, bestimmt durch die Messung der mRNAs und des Proteins, induziert.
BEISPIEL 4: PRODURTION VON WACHSTUMSHORMON VOM MENSCHEN ODER VOM RIND IN DER MILCH VON TRANSGENEN MÄUSEN, WELCHE DIE KONSTRUKTE pW3 UND pJ4 INKORPORIERT HABEN
Die Konzentrationen von Hormonen wurden durch spezifische radioimmunologische Tests bestimmt.
Die Identifizierung des hGH in der Milch einer transgenen Maus erfolgt auf die folgende Weise. Die Mäusemilch wird bei 150000 g eine Stunde zentrifugiert, um die Casein-Mizellen zu sedimentieren. Der Überstand (1 μl pro Vertiefung) wurde gewonnen und durch eine Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von Wachstumshormon vom Menschen als Vergleich und einer Kontrollmilch untersucht. Die Ergebnisse sind in der 4 angegeben.
Die Tiere, welche das Konstrukt pW₃ integriert haben, liefern hGH-Konzentrationen in der Größenordnung von 10 mg/ml Milch und können 21 mg/ml erreichen.
Die Tiere, welche das Konstrukt pJ₄ integriert haben, produzieren in der Größenordnung von 5 mg/ml Milch bGH und bis zu 17 mg/ml.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt, 1,5 ml Milch/Milchdrüse der Maus zu sammeln (indem man die Milchdrüse in Eis legt). 200 laktierende Mäuse, welche ein fremdes Protein in einer Konzentration von 3 bis 5 mg/ml exprimieren, liefern folglich 1 g rohes Protein.
BEISPIEL 5: GENKONSTRUKTE
Die Konstrukte von Genen, die eingesetzt werden, um rekombinante Proteine in der Milch von transgenen Tieren zu exprimieren, enthalten in allen Fällen die regulatorische Region des WAP-Gens des Kaninchens: das BamHI-HindIII-Fragment (6,3 kb) oder EcoRI- HindIII-Fragment (17,6 kb). Die Plasmide WAP-hGH, WAP bGH, WAP α-AT und WAP-EPO enthalten jeweils die fremden Gene (Leadersequenz, Exons, Introns und Transkriptionsterminationssequenz) von Wachstumshormon vom Menschen (hGH), von Wachstumshormon vom Rind (bGH), von zu Arg 358 mutiertem humanem α₁-Antitrypsin bzw. von humanem Erythropoietin. In diesen Konstrukten wurden die Gene mit der regulatorischen Region des WAP-Gens an der HindIII-Stelle kombiniert. Das Konstrukt WAP-FVIII-ΔII enthält die cDNA des humanen Faktors VIII in seiner ΔII-Form, welcher ein Intron des Gens des humanen Faktors VIII vorangeht. Diese Gesamtheit aus Intron und CDNA wurde in die HindIII-Stelle des vollständigen WAP-Gens des Kaninchens eingeführt (6).
BEISPIEL 6: IDENTIFIZIERUNG DER AKTIVITÄT DER REGULATORISCHEN REGION DES WAP-GENS DES KANINCHENS IN VITRO
Variable Längen der stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle des WAP-Gens befindlichen Region wurden mit einem Reportergen (dem Gen CAT: Chloramphenicolacetyltransferase) kombiniert (7). Diese Konstrukte wurden in auf einem Gel mit Collagen I aus Rattenschwanz kultivierte Mammaepithelzellen durch eine Transfektion mit Hilfe von Lipofectin eingeführt. Die Zellen wurden dann drei Tage in Gegenwart von Hormonen (Insulin, Cortisol, Prolactin) kultiviert. Dann wurde das Enzym in den Zellextrakten gemessen. Die Konstrukte, die lediglich 1806 bp oder weniger der regulatorischen Region enthalten, exprimieren das CAT-Gen nicht. Das 3000 bp enthaltende Konstrukt ist schwach aktiv, wohingegen die Konstrukte, die 6300 und 17600 bp enthalten, in Gegenwart der Hormone ohne Weiteres exprimiert werden. Das Prolactin spielt allein eine schwache, aber signifikante Induktorrolle hinsichtlich des CAT-Gens. Das Insulin und vor allem das Cortisol, welche allein inaktiv sind, verstärken die Wirkung des Prolactins. Die Empfindlichkeit des Gens gegenüber den Hormonen ist exakt identisch zu jener des endogenen WAP-Gens der Zellen. Die Regionen –3000–1806 bp und –6300–3000 bp enthalten dementsprechend regulatorische Elemente, die essentiell sind, damit das WAP-Gen auf intensive Weise exprimiert wird (8). Das 17600–6300 bp-Fragment trägt in vitro keine zusätzliche Stimulation bei, was nicht ausschließt, dass es eine solche Wirkung in vitro bei den transgenen Tieren haben könnte. Diese Experimente enthüllen erstmals die Aktivität der regulatorischen Regionen des WAP-Gens in vitro durch Transfektionen von Zellen.
REFERENZEN

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LEGENDE ZU DEN FIGUREN
6:
Die Konstrukte, die eingesetzt wurden, um die Expression von rekombinanten Proteinen in der Milch von transgenen Tieren zu erhalten.
7:
Schema der verschiedenen Konstrukte, welche das CAT-Gen, unter die Abhängigkeit von variablen Längen des WAP-Gens des Kaninchens gestellt, umfassen.
8:
Darstellung der Variation der CAT-Aktivität in Extrakten von primären Mammaepithelzellen vom Kaninchen, welche durch verschiedene Plasmide transfiziert worden sind.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines interessierenden heterologen Proteins in reifer Form oder in fusionierter Form in der Milch eines Säugetierweibchens, außer dem Menschen, wobei man in dem Verfahren: – das Weibchen aufzieht und – die Milch gewinnt, aus der man das Protein gewinnt, welches man abtrennt, falls erforderlich, dadurch gekennzeichnet, dass das Weibchen ein transgenes Tier ist, in dessen Genom eine Sequenz, die für das interessierende Gen kodiert, unter der Kontrolle mindestens einer Sequenz, die sich unter den Expressionselementen des WAP-Proteins des Kaninchens befindet und sich auf dem Fragment mit einer Länge von mindestens 3 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors befindet, integriert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das interessierende heterologe Protein kodiert, unter der Kontrolle einer Sequenz ist, welche darüber hinaus mindestens ein Expressionselement umfasst, das auf dem Fragment zwischen 3 kb und 6,3 kb einschließlich stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors des Kaninchens liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das interessierende heterologe Protein kodiert, unter der Kontrolle einer Sequenz ist, die alle Expressionselemente umfasst, die auf dem Fragment mit einer Länge von 6,3 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors des Kaninchens liegen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des WAP-Promotors die Expressionselemente umfasst, die auf der Sequenz mit 6,3 kb liegen, welche zwischen den HindIII- und BamHI-Stellen eingeschlossen ist, die in 1 dargestellt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das interessierende heterologe Protein kodiert, unter der Kontrolle einer Sequenz ist, die alle Expressionselemente umfasst, die auf dem Fragment mit einer Länge von 17 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors des Kaninchens liegen.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz des WAP-Promotors die Expressionselemente umfasst, die auf der Sequenz mit 17 kb liegen, welche zwischen den HindIII- und EcoRI-Stellen eingeschlossen ist, die in 1 dargestellt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Sequenz, die für das interessierende Protein kodiert, gegen ihr 5'-Ende eine Sequenz, die dem Promotor des vollständigen WAP-Gens des Kaninchens entspricht, oder eine äquivalente Sequenz vorangeht, welche für die Funktion des Promotors sorgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass dem interessierenden Protein das gesamte WAP-Gen und der gesamte WAP-Promotor des Gens oder eine äquivalente Sequenz vorangeht.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Sequenz, welche dem Gen des WAP-Proteins des Kaninchens entspricht, das Initiatorcodon AUG deletiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in der Sequenz, die der Sequenz entspricht, welche für das heterologe Protein kodiert, das Initiatorcodon AUG deletiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man, um das interessierende Protein in der Milch des Säugetierweibchens zu gewinnen, a) die Milchdrüsen erntet, b) die Milchdrüsen bei einer Temperatur von etwa 0°C über eine Dauer, die zwischen 2 Stunden und 18 Stunden variiert, inkubieren lässt, c) die Milch gewinnt, welche spontan aus den Drüsen ausgeschwitzt wird, d) das interessierende Protein ausgehend von der Milch isoliert und das gereinigte Protein erhält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das heterologe Protein kodiert, die Sequenz ist, die für das menschliche Wachstumshormon kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Protein ausgewählt ist aus: – Wachstumsfaktoren, – Interleukinen, – Stimulationsfaktoren, – Kinasen, – Koagulationsfaktoren, – alpha-Antitrypsin, – Hirudin.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ausgewählt ist aus: – Erythropoietin, – G-CSF, – alpha-Antitrypsin, – Urokinase, – dem Faktor VIII.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das interessierende Protein kodiert, aus der cDNA des menschlichen Faktors VIII-delta II zusammengesetzt ist, der das erste Intron des Gens des Faktors VIII vorangeht.
Eukaryontische Zelle, mit Ausnahme von Zellen, die sich in situ im menschlichen Körper finden, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrem Genom eine Sequenz, die für das interessierende heterologe Protein kodiert, unter der Kontrolle des WAP-Promotors des Kaninchens oder einer äquivalenten Sequenz, welche die Funktion des Promotors sicherstellt, enthält.
Eukaryontische Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine primäre Brustepithelzelle eines weiblichen Säugetiers handelt.
Transgenes Säugetierweibchen, außer dem Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass es Zellen nach einem der Ansprüche 16 und 17 einschließt.
DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein heterologes Gen umfasst, das für ein interessierendes Protein unter der Kontrolle mindestens einer Sequenz kodiert, die sich unter den Expressionselementen des WAP-Proteins des Kaninchens befindet und sich auf dem Fragment mit einer Länge von mindestens 3 kb stromaufwärts vom 3'-Ende des vollständigen WAP-Promotors befindet.