DE69434622T2 - Varianten der gallensäure-stimulierten lipase, dna die dafür kodiert, und transgene nicht-humane säugetiere - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide, welche Varianten von Gallensalzstimulierter Lipase bzw. "Bile Salt-Stimulated Lipase" (BSSL; EC 3.1.1.1) sind. Sie betrifft ebenfalls Nukleinsäuremoleküle, welche die Polypeptide codieren, und Unterprodukte, welche die DNA-Moleküle umfassen. Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung der BSSL-Varianten und zur Herstellung von transgenen nicht-menschlichen Säugetieren, die zur Expression der BSSL-Varianten in der Lage sind. Darüber hinaus betrifft die Erfindung derartige transgene Tiere sowie Kleinkind-Formulierungen, umfassend Milch, welche die Polypeptide aus solchen transgenen Tieren umfasst. Die Erfindung betrifft des Weiteren pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Polypeptide umfassen; sowie die Verwendung der Polypeptide und DNA-Moleküle für die Herstellung von Medikamenten.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Hydrolyse von Lipiden in der Nahrung
  • Lipide in der Nahrung sind eine wichtige Energiequelle. Die energiereichen Triacylglycerole machen mehr als 95 % dieser Lipide aus. Einige der Lipide, z.B. bestimmte Fettsäuren und die fettlöslichen Vitamine, sind essentielle Nahrungsbestandteile. Vor der gastrointestinalen Absorption erfordern die Triacylglycerole wie auch die Nebenkompanenten, d. h. veresterte fettlösliche Vitamine und Cholesterol, sowie Diacylphosphatidylglycerole, eine Hydrolyse der Esterbindungen, um weniger hydrophobe absorbierbare Produkte entstehen zu lassen. Diese Reaktionen werden von einer spezifischen Gruppe von Enzymen katalysiert, welche Lipasen genannt werden.
  • Im Menschen wird angenommen, dass die wesentlichen beteiligten Lipasen Magen-Lipase, Pankreatische Colipase-abhängige Lipase (Hydrolyse von Tri- und Diacylglycerolen), Pankreatische Phospholipase A2 (Hydrolyse von Diacylphosphatidylglycerolen) und Carbonsäureester-Hydrolase (CEH) (Hydrolyse von Cholesteryl- und fettlöslichen Vitamin-Estern, aber auch Tri-, Di- und Monoacylglycerolen) sind. Im an der Brust gestillten Neugeborenen spielt Gallensalz-stimulierte Lipase (BSSL) eine wesentliche Rolle in der Hydrolyse von mehreren der obenstehend erwähnten Lipiden. Zusammen mit Gallensalzen bilden die Produkte aus dem Lipidverdau gemischte Mizellen oder unilamellare Vesikel (Hernell et al., 1990), aus welchen die Absorption stattfindet.
  • Gallensalz-stimulierte Lipase
  • Gallensalz-stimulierte Lipase (BSSL) ist ein Bestandteil von Milch in einer begrenzten Anzahl von Spezies, z.B. Menschen, Gorillas, Katzen und Hunde (Hernell et al., 1989, Hamosh et al., 1986). Bei Vermischung mit Gallen im Inhalt des oberen Dünndarms wird BSSL spezifisch durch primäre Gallensalze aktiviert (Hernell, 1975). BSSL, welche ungefähr 1 % des Gesamtmilchproteins ausmacht (Bläckberg & Hernell, 1981), wird nicht während der Passage mit der Milch durch den Magen abgebaut, und sie wird im Duodenum-Inhalt durch Gallensalze vor einer Inaktivierung durch pankreatische Proteasen, wie Trypsin und Chymotrypsin, geschützt.
  • Eine Wärmebehandlung von menschlicher Milch (Pasteurisierung bei 62,5 °C, 30 Minuten), welche BSSL vollständig inaktiviert (Björksten et al., 1980), verringert den Koeffizienten der Fettabsorption um ungefähr ein Drittel in zu früh geborenen Kleinkindern (Williamson et al., 1978, Atkinson et al., 1981). Somit ist die überlegene Verwertung von frischem Menschenmilch-Triacylglycerol, im Vergleich zu derjenigen von Formulierungen bzw. Zubereitungen für Kleinkinder mit ähnlicher Fettzusammensetzung, auf BSSL zurückzuführen (Hernell et al., 1991, Chapell et al., 1986).
  • BSSL ist eine nicht-spezifische Lipase (EC 3.1.1.1) dahingehend, dass sie nicht nur Triacylglycerol sondern auch Di- und Monoacylglycerol, Cholesterylester und fettlösliche Vitaminester hydrolysiert (Bläckberg & Hernell, 1983). Nach der Aktivierung besitzt BSSL somit das Potenzial, die meisten menschlichen Milchlipide von sich aus zu hydrolysieren, obwohl die wirkungsvollste Verwertung von Triacylglycerol aus menschlicher Milch die synergistische Wirkung von Magen-Lipase (EC 3.1.1.3), Colipase-abhängiger pankreatischer Lipase (EC 3.1.1.3) und BSSL erfordert (Bernbäck et al., 1990).
  • Jüngere Untersuchungen legten nahe, dass das Milchenzym von besonderer Bedeutung für die Verwertung langkettiger mehrfach-ungesättigter Fettsäuren durch das neugeborene Kleinkind ist (Hernell et al., 1993). Diese Fettsäuren sind wichtige Vorläufer van Eicosanoiden und für die Neuronen-Entwicklung. Neugeborene Kleinkinder, insbesondere im Falle von Früh geburten, besitzen eine beschränkte Kapazität für eine Synthese dieser Fettsäuren aus ihren Vorläufern. Somit werden sie für eine noch nicht definierte Zeitdauer nach der Geburt als essentiell angesehen.
  • In jüngeren Untersuchungen aus mehreren Laboratorien sind die cDNA-Strukturen sowohl der Milchlipase als auch der Pankreas-Carbonsäureester-Hydrolase (CEH) (E.C. 3.1.1.1) charakterisiert worden (Baba et al., 1991; Hui et al., 1991; Nilsson et al., 1990; Reue et al., 1991), und die Schlussfolgerung besteht darin, dass das Milchenzym und das Pankreasenzym Produkte desselben Gens sind. Die cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des BSSL/CEH-Gens (SEQ ID Nr.: 1) werden ebenfalls offenbart in WO 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) und in WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra).
  • BSSL ist ein einzelkettiges Glycoprotein. Das abgeleitete Protein (SEQ ID Nr.: 3) enthält 722 Aminosäurereste und ist in hohem Maße glycosyliert (Abouakil et al., 1989). Die N-terminale Hälfte des Proteins zeigt eine erstaunliche Homologie zu Acetylcholinesterase und einigen anderen Esterasen (Nilsson et al., 1990).
  • Ein vermeintlicher Aktive-Stelle-Serinrest liegt am Serin-194; die Sequenz um dieses Serin herum stimmt mit der Konsensussequenz der aktiven Stelle von Serin-Hydrolasen überein. Die einzelne vermeintliche N-Glycosylierungs-Stelle ist nur sieben Reste N-terminal zum Aktive-Stelle-Serin positioniert (Nilsson et al., 1990).
  • Die BSSL-Sequenz enthält in ihrem C-terminalen Teil 16 prolinreiche Wiederholungen bzw. Repeats von jeweils 11 Aminosäureresten. Eine Variation in der Anzahl an Wiederholungen scheint eine Haupterklärung für die Unterschiede in der molekularen Größe und Aminosäurezusammensetzung zwischen entsprechenden Enzymen aus unterschiedlichen Spezies zu sein (Han et al., 1987, Fontaine et al., 1991, Kyger et al., 1989). Diese Wiederholungen tragen den Großteil der 15-20 % an Kohlenhydrat des Proteins (Baba et al., 1991, Abouakil et al., 1989).
  • Die einzigartige Strukturdifferenz zwischen BSSL und typischen Esterasen liegt im C-terminalen Teil der Polypeptidkette, d. h. den 16 prolinreichen Wiederholungen von 11 Aminosäureresten. Die entsprechenden pankreatischen Enzyme aus der Kuh und der Ratte besitzen nur 3 bzw. 4 Wiederholungen (Han et al., 1987, Kyger et al., 1989). Eine wahrscheinliche Hypothese bestand deshalb darin, dass der C-terminale Teil, oder wenigstens ein Bereich davon, für die Lipaseaktivität, d. h. Aktivität gegenüber emulgiertem langkettigen Triacylglycerol, unverzichtbar ist.
  • Mangelhafte Lipid-Absorption
  • Übliche Ursachen von Lipid-Mangelabsorption und folglich Unterernährung, sind verringerte intraluminale Spiegel an Pankreatischer Colipase-abhängiger Lipase und/oder Gallensalzen. Typische Beispiele eines solchen Lipasemangels sind Patienten, welche unter cystischer Fibrose, einer häufigen genetischen Erkrankung, welche zu einem lebenslangen Mangel in 80 % der Patienten führt, und chronischer Pankreatitis, oftmals wegen chronischem Alkoholismus, leiden.
  • Die derzeitige Behandlung von Patienten, welche unter einem Mangel an pankreatischer Lipase leiden, ist die orale Verabreichung von sehr hohen Dosierungen einer rohen Präparation von Schweine-Pankreasenzymen. Allerdings wird Colipase-abhängige Pankreatische Lipase durch den niedrigen pH-Wert inaktiviert, der im Magen vorherrscht. Dieser Effekt kann durch die Verwendung von großen Dosen an Enzym nicht vollständig überwunden werden. Somit sind die verabreichten großen Dosierungen für die meisten Patienten unangemessen, und darüber hinaus sind die Präparationen unrein und übel schmeckend.
  • Es sind bestimmte Tabletten formuliert worden, welche durch die sauren Regionen des Magens hindurchwandern und das Enzym nur in der verhältnismäßig alkalischen Umgebung des Jejunums abgeben. Allerdings besitzen viele Patienten, welche unter pankreatischen Erkrankungen leiden, ein abnormal saures Jejunum, und in diesen Fällen können die Tabletten darin versagen, das Enzym abzugeben.
  • Darüber hinaus besteht, da die derzeit auf dem Markt befindlichen Präparationen von einer nicht-menschlichen Herkunft sind, eine Gefahr für Immunreaktionen, welche schädliche Auswirkungen auf die Patienten auslösen oder zu einer verringerten Therapieeffizienz führen können. Ein weiterer Nachteil bei den derzeitigen Präparationen ist, dass ihr Gehalt an von Colipase-abhängiger Lipase verschiedenen lipolytischen Aktivitäten nicht angegeben wird. Tatsächlich enthalten die meisten von ihnen sehr niedrige Spiegel an BSSL/CEH-Aktivität. Dies kann ein Grund sein, warum viele Patienten, welche unter cystischer Fibrose leiden, trotz einer Ergänzungstherapie unter Mangelerscheinungen an fettlöslichen Vitaminen und essentiellen Fettsäuren leiden.
  • Somit besteht ein großer Bedarf nach Produkten mit Eigenschaften und einer Struktur, welche aus humanen Lipasen abgeleitet sind, und mit einer breiten Substratspezifität, wobei die Produkte oral an Patienten verabreicht werden können, welche unter einem Mangel an einem oder mehreren der pankreatischen lipolytischen Enzyme leiden. Produkte, welche aus der Anwendung der vorliegenden Erfindung abgeleitet werden können, erfüllen diese Notwendigkeit von sich selbst aus oder in Kombination mit Präparationen, die andere Lipasen enthalten.
  • KURZE BESCHREIBUNG DES ERFINDUNGSKONZEPTES
  • Rekombinante BSSL-Varianten gemäß der Erfindung behielten katalytische Aktivität, aber enthalten weniger Glycosylierungsstellen als Volllängen-BSSL und werden daher mit einem potenziell verringerten Grad an Kohlenhydrat-Heterogenität hergestellt. Diese verminderte Komplexität erleichtert die Reinigung und Charakterisierung des rekombinanten Proteins, was zu einer kostengünstigeren Herstellung von Polypeptiden mit BSSL-Aktivität führen wird.
  • In einem anderen Aspekt ist der verringerte Glycosylierungsgrad für den Wirt weniger beanspruchend und gestattet eine höhere Produktion in mehreren Wirtszellen. In noch einem anderen Aspekt gestattet die reduzierte Anzahl an Glycosylierungsstellen in einer BSSL-Variante eine effiziente Produktion in niederen Eukaryoten und begrenzt das potenzielle Risiko einer abweichenden Glycosylierung, welche immunologische Reaktionen hervorrufen kann. Die verringerte Größe und weniger komplexe Glycosylierung bringen ebenfalls mit sich, dass das Wirtsspektrum breiter ist als für ein Protein mit sehr kamplexen und schweren Kohlehydratresten.
  • Die therapeutische Verwendung einer BSSL-Variante, welche von geringerer Größe ist, aber gleich aktiv ist, bedeutet, dass das Gewicht der Substanz, welches zur Supplementierung benötigt wird, vermindert wird. Ein weiterer möglicher Vorteil mit einer rekombinanten BSSL-Variante, der die meisten oder alle der O-glycosylierten Wiederholungen fehlen, ist eine verringerte Gefahr für eine immunologische Antwort in dem Empfängerindividuum. Dies beruht auf der Tatsache, dass der O-verknüpfte Zucker, abhängig von der Zelle, in der er hergestellt wird, sehr heterogen sein kann.
  • Es gibt Angaben in der wissenschaftlichen Literatur, dass natives BSSL an die Darmschleimhaut bindet und von ihr aufgenommen wird. Eine BSSL-Variante, welche hinsichtlich des Aufweisens einer verringerten Aufnahme selektiert wurde, wird während einer längeren Zeitdauer auf die Nahrungs-Lipidsubstrate einwirken, was zu einer effizienteren intraluminalen Verdauung führt. Beispiele derartiger Varianten sind Moleküle mit verringerter Glycosylierung.
  • Wie oben stehend erwähnt, ist vorgeschlagen worden, dass BSSL eine besondere Bedeutung für die Verwertung von langkettigen mehrfach-ungesättigten Fettsäuren (Hernell et al., 1993), die von großer Bedeutung für die Neuronenentwicklung des neugeborenen Kleinkindes sind, und von Vitamin A besitzt. Eine BSSL-Variante gemäß der Erfindung, welche in diesen Hinsichten wirksamer ist, kann durch bekannte Verfahren ausgewählt werden. Es ist wahrscheinlich, dass ein trunkiertes oder verkürztes Enzym in Hinsicht auf die Konformation unterschiedlich ist, was die Spezifität gegenüber verschiedenen Lipidsubstraten beeinflussen kann.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, codierend ein Polypeptid mit einer Gallensalz-aktivierten hydrolytischen Aktivität gegenüber langkettigem Triacylglycerol, wobei das Polypeptid eine BSSL-Variante ist, die dahingehend kürzer als das native, 722 Aminosäuren große Volllängen-BSSL-Polypeptid ist, dass sie nur einen Teil der Aminosäuresequenz, gezeigt als Reste 536-722 in SEQ ID Nr.: 3, umfasst, und wobei die BSSL-Variante weniger als 16 Wiederholungseinheiten umfasst, wobei der Begriff "Wiederholungseinheit" eine der wiederkehrenden Einheiten von je 33 Nukleotiden bezeichnet, welche in SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzauflistung angegeben sind.
  • Der Begriff "Teil der Aminosäuresequenz" soll so verstanden werden, dass er eine einzelne Aminosäure sowie eine Sequenz von mehreren Aminosäuren oder mehrere derartige Sequenzen in Kombination umfasst.
  • Der Begriff "BSSL-Variante" soll als ein Polypeptid verstanden werden, welches BSSL-Aktivität aufweist und einen Teil der Aminosäuresequenz von humaner BSSL, gezeigt als SEQ ID Nr.: 3 in der Sequenzauflistung, umfasst.
  • Der Begriff "Polypeptid, aufweisend BSSL-Aktivität" versteht sich als ein Polypeptid, das wenigstens die folgenden Eigenschaften umfasst:
    • (a) geeignet für orale Verabreichung;
    • (b) aktiviert durch spezifische Gallensalze;
    • (c) wirkend als eine nicht-spezifische Lipase im Inhalt des Dünndarms, d. h. Fähigkeit, Lipide verhältnismäßig unabhängig von ihrer chemischen Struktur und ihres physikalischen Zustands (emulgiert, mizellar, löslich) zu hydrolysieren; und gegebenenfalls eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften
    • (d) Fähigkeit zum Hydrolysieren von Triacylglycerolen mit Fettsäuren von verschiedener Kettenlänge und verschiedenem Ungesättigtheits-Grad;
    • (e) Fähigkeit zum Hydrolysieren auch von Diacylglycerol, Monoacylglycerol, Cholesterylestern, Lysophosphatidylacylglycerol und Retinyl- und anderen fettlöslichen Vitamin-Estern;
    • (f) Fähigkeit zum Hydrolysieren nicht nur der sn-1(3)-Esterbindungen in einem Triacylglycerol, sondern ebenfalls der sn-2-Esterbindung;
    • (g) Fähigkeit zum Wechselwirken mit nicht nur primären sondern auch sekundären Gallensalzen;
    • (h) abhängig von Gallensalzen für optimale Aktivität;
    • (i) stabil, in dem Sinn, dass der Mageninhalt die katalytische Effizienz nicht in irgendeinem wesentlichen Ausmaß beeinflussen wird;
    • (j) stabil gegenüber Inaktivierung durch pankreatische Proteasen, z.B. Trypsin, vorausgesetzt, dass Gallensalze vorhanden sind;
    • (k) Fähigkeit zur Bindung an Heparin und Heparinderivate, z.B. Heparansulfat;
    • (l) Fähigkeit zum Binden an Lipid-Wasser-Interphasen;
    • (m) stabil genug, um eine Lyophilisierung zu gestatten;
    • (n) stabil bei Vermischung mit Nahrungsbestandteilen, wie in menschlicher Milch oder Milch-Formulierung.
  • In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül gemäß dem oben Genannten, wobei die BSSL-Variante einen Phenylalaninrest in ihrer C-terminalen Position aufweist oder die Sequenz Gln-Met-Pro in ihrem C-terminalen Teil umfasst, wobei sie alternativ dazu die Aminosäuresquenz, gezeigt als Reste 712 – 722 in SEQ ID Nr.: 3, in ihrem C-terminalen Teil umfasst.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Begriff "C-terminale Position" die Position des letzten C-terminalen Rests, wohingegen der Begriff "C-terminaler Teil" verstanden werden soll als die ungefähr 50 Aminosäurereste, welche das C-terminale Ende der BSSL-Variante bilden.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül gemäß dem oben stehenden, worin die BSSL-Variante weniger als 16 Wiederholungseinheiten umfasst, wobei der Begriff "Wiederholungseinheit" eine der wiederkehrenden Einheiten von je 33 Nukleotiden bezeichnet, welche in SEQ ID Nr.: 1 in der Sequenzauflistung angegeben sind.
  • In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül gemäß des oben stehenden, welches ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 90 % homolog mit der Aminosäuresequenz ist, die als SEQ ID Nr.: 5, 6 oder 9 in der Sequenzauflistung gezeigt ist.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Polypeptid, gezeigt als SEQ ID Nr.: 5, 6, 7 oder 9 in der Sequenzauflistung, sowie ein Polypeptid, codiert von einer Nukleinsäuresequenz gemäß des Obenstehenden.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Hybridgen, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß des oben Genannten, einen replizierbaren Expressionsvektor, umfassend ein solches Hybridgen, und eine Zelle, welche ein solches Hybridgen beherbergt. Diese Zelle kann eine prokaryotische Zelle, ein einzelliger eukaryotischer Organismus oder eine Zelle sein, welche aus einem vielzelligen Organismus, z.B. einem Säuger, abgeleitet ist.
  • Im vorliegenden Kontext bezeichnet der Ausdruck "Hybridgen" eine Nukleinsäuresequenz, einerseits umfassend eine Nukleinsäuresequenz, codierend eine BSSL-Variante, wie oben stehend definiert, und andererseits eine Nukleinsäuresequenz des Gens, welche zur Vermittlung der Expression des Hybridgenprodukts in der Lage ist. Der Begriff "Gen" bezeichnet ein gesamtes Gen sowie eine Teilsequenz davon, fähig zur Vermittlung und Lenkung der Expression des Hybridgens auf das Gewebe von Interesse. Normalerweise ist die Teilsequenz eine solche, welche mindestens eines oder mehrere aus einer Promotorregion, einer Transkriptionsstartstelle, nicht-codierenden 3'- und 5'-Regionen und Struktursequenzen beinhaltet.
  • Das Hybridgen wird vorzugsweise durch in-vitro-Inserieren der die BSSL-Variante codierenden Nukleinsäuresequenz in das Gen, welches zur Vermittlung der Expression in der Lage ist, durch Anwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken gebildet. Alternativ dazu kann die Nukleinsäuresequenz, welche die BSSL-Variante codiert, in vivo mittels homologer Rekombination inseriert werden.
  • Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "replizierbar", dass der Vektor fähig ist, in einem gegebenen Typ von Wirtszelle zu replizieren, in welche er eingebracht worden ist. Unmittelbar stromaufwärts der Nukleinsäuresequenz kann eine Sequenz vorgesehen sein, die ein Signalpeptid codiert, dessen Gegenwart die Sekretion der BSSL-Variante gewährleistet, welche von Wirtszellen, die den Vektor beinhalten, exprimiert wird. Die Signalsequenz kann diejenige sein, welche natürlicherweise mit der Nukleinsäuresequenz assoziiert ist, oder von anderer Herkunft sein.
  • Der Vektor kann ein beliebiger Vektor sein, welcher zweckmäßig rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterzogen werden kann, und die Auswahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle abhängen, in welche er eingebracht werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation unabhängig von der Chromosomenreplikation ist; Beispiele eines derartigen Vektors sind ein Plasmid, Phage, Cosmid, Mini-Chromosom oder Virus. Alternativ dazu kann der Vektor ein solcher sein, der bei Einbringung in eine Wirtszelle in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit den Chromosom(en) repliziert wird, in welche(s) er integriert worden ist. Beispiele für geeignete Vektoren sind ein bakterieller Expressionsvektor und ein Hefeexpressionsvektor. Der Vektor der Erfindung kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung, wie oben definiert, tragen.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (i) Wachsenlassen einer Wirtszelle in oder auf einem Kulturmedium, in welche ein Nukleinsäuremolekül gemäß des Obenstehenden in einem Hybridgen eingebracht worden ist, welches zum Replizieren in einer spezifischen Wirtszelle in der Lage ist, oder Identifizieren und Reproduzieren eines Organismus, in welchen ein Nukleinsäuremolekül gemäß des oben Genannten in einem Hybridgen, welches fähig zum Replizieren in dem spezifischen Organismus ist, eingebracht worden ist, (ii) Exprimieren des Polypeptids; und (iii) Rückgewinnen des Polypeptids.
  • Das zur Aufzucht der Zellen verwendete Medium kann ein beliebiges herkömmliches Medium sein, das für den Zweck geeignet ist. Ein geeigneter Vektor kann ein beliebiger der obenstehend beschriebenen Vektoren sein, und eine passende Wirtszelle kann von einem beliebigen der obenstehend aufgelisteten Zelltypen sein. Die Verfahren, welche zum Konstruieren des Vektors und zur Bewirkung von dessen Einbringung in die Wirtszelle angewandt werden, können jedwede für derartige Zwecke bekannte Verfahren innerhalb des Gebiets der rekombinanten DNA sein. Die von den Zellen exprimierte, rekombinante humane BSSL-Variante kann sezerniert, d. h. über die Zellmembran exportiert werden, abhängig vom Typ der Zelle und der Zusammensetzung des Vektors.
  • Wenn die BSSL-Variante von dem rekombinanten Wirt intrazellulär produziert wird, d. h. nicht von der Zelle sezerniert wird, kann sie durch Standardvorgehen, umfassend das Zellaufbrechen durch mechanische Mittel, z.B. Schallbehandlung oder Homogenisierung, oder durch enzymatische oder chemische Mittel, gefolgt von der Aufreinigung, gewonnen werden.
  • Um sezerniert zu werden, sollte der DNA-Sequenz, welche die BSSL-Variante codiert, eine Sequenz vorangehen, die ein Signalpeptid codiert, dessen Gegenwart die Sekretion der BSSL-Variante aus den Zellen gewährleistet, so dass wenigstens ein signifikanter Anteil der exprimierten BSSL-Variante in das Kulturmedium sezerniert und gewonnen wird.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Expressionssystem, umfassend ein Hybridgen, welches in einer Wirtszelle oder einem Organismus exprimierbar ist, die/der das Hybridgen beinhaltet, so dass ein rekombinantes Polypeptid hergestellt wird, wenn das Hybridgen exprmiert wird, wobei das Hybridgen durch Inserieren einer Nukleinsäuresequenz gemäß dem oben Genannten in ein Gen, welches zur Vermittlung der Expression des Hybridgens in der Lage ist, hergestellt wird.
  • Ein mögliches Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten BSSL-Variante der Erfindung erfolgt durch die Verwendung von transgenen nicht-menschlichen Säugetieren, die zum Absondern der BSSL-Variante in ihre Milch in der Lage sind. Die Verwendung von transgenen nicht-menschlichen Säugetieren besitzt den Vorteil, dass große Ausbeuten an der rekombinanten BSSL-Variante bei vernünftigen Kosten erhältlich sind und dass, speziell wenn das nicht-menschliche Säugetier eine Kuh ist, die rekombinante BSSL-Variante in Milch hergestellt wird, welche der normale Bestandteil z.B. von Kleinkind-Formulierungen ist, so dass keine umfangreiche Aufreinigung benötigt wird, wenn die rekombinante BSSL-Variante als eine Nährstoff-Ergänzung in Produkten auf Milchbasis verwendet werden soll.
  • Weiterhin führt die Produktion in einem höheren Organismus, wie einem nicht-menschlichen Säugetier, normalerweise zur korrekten Prozessierung des Säuger-Proteins, z.B. bezüglich der post-translationalen Prozessierung, wie oben stehend erörtert, und zu einer korrekten Faltung. Auch können große Mengen einer im Wesentlichen reinen BSSL-Variante erhalten werden.
  • Folglich kann es sich bei dem Expressionssystem, auf das oben Bezug genommen wurde, um ein Säugetier-Expressionssystem handeln, umfassend eine für eine BSSL-Variante codierende DNA-Sequenz, welche in ein Gen inseriert ist, das ein Milchprotein eines nicht-menschlichen Säugetiers codiert, so dass ein Hybridgen gebildet wird, welches in der Brustdrüse eines erwachsenen Weibchens eines Säugetiers, welches das Hybridgen beherbergt, exprimierbar ist.
  • Die Brustdrüse als ein Gewebe zur Expression und Milchproteine codierende Gene werden im Allgemeinen als besonders geeignet zur Verwendung in der Herstellung von heterologen Proteinen in transgenen nicht-menschlichen Säugetieren angesehen, weil Milchproteine natürlicherweise bei hohen Expressionsspiegeln in der Brustdrüse produziert werden. Des Weiteren wird Milch leicht aufgefangen und ist in großen Mengen verfügbar. Im vorliegenden Zusammenhang besitzt die Verwendung von Milchprotein-Genen bei der Herstellung einer rekombinanten-BSSL-Variante den weiteren Vorteil, dass sie unter zu ihren natürlichen Herstellungsbedingungen ähnlichen Bedingungen bezüglich der Regulierung von Expression und der Produktionslokalisierung (der Brustdrüse) hergestellt wird.
  • Bei Verwendung in einem transgenen Säugetier umfasst das Hybridgen, auf welches oben stehend Bezug genommen wurde, vorzugsweise eine Sequenz, codierend ein Signalpeptid, so dass es ermöglicht wird, dass das Hybridgenprodukt korrekt in die Brustdrüse sezerniert wird. Das Signalpeptid wird typischerweise dasjenige sein, welches normalerweise in dem betreffenden Milchprotein-Gen gefunden wird, oder ein solches, welches mit der DNA-Sequenz assoziiert ist, welche die BSSL-Variante codiert. Allerdings sind auch andere Signalsequenzen relevant, welche zur Vermittlung der Sekretion des Hybridgenprodukts zu der Brustdrüse in der Lage sind. Selbstverständlich sollten die verschiedenen Elemente des Hybridgens auf eine solche Weise fusioniert werden, dass die korrekte Expression und Prozessierung des Genprodukts ermöglicht wird. Daher sollte normalerweise die DNA-Sequenz, welche das Signalpeptid der Wahl codiert, präzise an den N-terminalen Teil der DNA-Sequenz fusioniert werden, welche die BSSL-Variante codiert. In dem Hybridgen wird die DNA-Sequenz, welche die BSSL-Variante codiert, normalerweise ihr Stopp-Codon, jedoch nicht ihre eigene Message-Spaltungs- und Polyadenylierungs-Stelle umfassen. Stromabwärts der DNA-Sequenz, welche die BSSL-Variante codiert, werden normalerweise die mRNA-Prozessierungssequenzen des Milchprotein-Gens beibehalten werden.
  • Eine Reihe von Faktoren werden als für den tatsächlichen Expressionsspiegel eines jeweiligen Hybridgens verantwortlich in Erwägung gezogen. Das Vermögen des Promotors sowie anderer regulatorischer Sequenzen, wie oben stehend erwähnt, die Integrationsstelle des Expressionssystems im Genom des Säugetiers, die Integrationsstelle der DNA-Sequenz, welche die BSSL-Variante codiert, in dem Milchprotein-codierenden Gen, Elemente, die posttranskriptionale Regulation vermitteln, und andere ähnliche Faktoren können von entscheidender Bedeutung für den erhaltenen Expressionsspiegel sein. Auf der Basis der Kenntnis der verschiedenen Faktoren, welche den Expressionsspiegel des Hybridgens beeinflussen, wird der Fachmann auf dem Gebiet wissen, wie ein Expressionssystem zu entwerfen ist, das für die vorliegende Absicht brauchbar ist.
  • Das zu verwendende Milchprotein-Gen kann aus der gleichen Spezies abgeleitet sein, wie derjenigen, in welche das Expressionssystem eingebracht werden soll, oder es kann aus einer anderen Spezies abgeleitet werden. In diesem Zusammenhang ist es gezeigt worden, dass die regulatorischen Elemente, welche Genexpression zielgerichtet auf die Brustdrüse lenken, über Speziesgrenzen hinweg funktionell sind, was man auf einen möglichen gemeinsamen Vorfahren zurückführen kann (Hennighausen et al., 1990).
  • Beispiele für geeignete Gene, codierend ein Milchprotein oder effektive Teilsequenzen davon, welche in der Konstruktion eines Expressionssystems der Erfindung verwendet werden sollen, werden normalerweise unter Molke-Proteinen von unterschiedlicher Säugetier-Herkunft, z.B. einem Gen für saures Molke-Protein (WAP, whey acidic protein), vorzugsweise von Maus-Herkunft, und einem β-Lactoglobulin-Gen, vorzugsweise von Schaf-Herkunft, gefunden. Auch Casein-Gene von verschiedenerlei Herkunft können als für die transgene Herstellung einer BSSL-Variante geeignet befunden werden, z.B. Rinder-αS1-Casein und Kaninchen-β-Casein. Das gegenwärtig bevorzugte Gen ist ein Maus-WAP-Gen, da von diesem gefunden wurde, dass es zur Bereitstellung eines hohen Expressionsspiegels einer Reihe von menschlichen Fremdproteinen in Milch aus verschiedenen transgenen Tieren in der Lage ist (Hennighausen et al., 1990).
  • Eine andere Sequenz, welche vorzugsweise mit dem Expressionssystem der Erfindung assoziiert ist, ist eine so genannte expressionsstabilisierende Sequenz, welche fähig zur Vermittlung einer Expression von hohem Niveau ist. Es existieren starke Anzeichen, dass derartige stabilisierende Sequenzen in der Nachbarschaft von und stromaufwärts von Milchprotein-Genen gefunden werden.
  • Ebenfalls eingeschlossen in der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, fähig zum Exprimieren einer BSSL-Variante, umfassend (a) Einbringen eines Expressionssystems gemäß des oben Stehenden in ein befruchtetes Ei oder eine Zelle eines Embryos eines nicht-menschlichen Säugetiers, so dass das Expressionssystem in die Keimbahn des Säugetiers eingebunden wird, und (b) Entwickeln des resultierenden eingebrachten befruchteten Eies oder Embryos zu einem adulten weiblichen nicht-menschlichen Säugetier.
  • Die Einbindung des Expressionssystems in die Keimbahn des Säugetiers kann unter Anwendung einer beliebigen geeigneten Technik durchgeführt werden, z.B. wie beschrieben in "Manipulating the Mouse Embryo"; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Zum Beispiel können einige hundert Moleküle des Expressionssystems direkt in ein befruchtetes Ei, z.B. ein befruchtetes Ein-Zell-Ei oder einen Pro-Nukleus davon, oder ein Embryo des Säugetiers der Wahl injiziert werden, und die mikroinjizierten Eier können dann in die Eileiter von pseudoschwangeren Leihmüttern transferiert und sich entwickeln gelassen werden.
  • Das Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, fähig zum Exprimieren einer BSSL-Variante, kann auch ein Verfahren umfassen, worin das Säugetier im Wesentlichen unfähig zum Exprimieren von BSSL aus dem Säugetier selbst ist. Ein solches Verfahren umfasst (a) Zerstören des BSSL-Expressions-Vermögens des Säugetiers, so dass im Wesentlichen keine Säugetier-BSSL exprimiert wird, und Einbringen eines Expressionssystems gemäß des oben Genannten in die Keimbahn des Säugetiers auf eine solche Weise, dass eine BSSL-Variante in dem Säugetier exprimiert wird; und/oder (b) Ersetzen des Säugetier-BSSL-Gens oder eines Teils davon mit einem Expressionssystem, wie es obenstehend definiert ist.
  • Das Säugetier-BSSL-Expressions-Vermögen kann bequem durch Einführung von Mutationen in die DNA-Sequenz, welche für die Expression von BSSL verantwortlich ist, zerstört werden. Derartige Mutationen können Mutationen, welche die DNA-Sequenz aus dem Leseraster bringen, die Einführung eines Stopp-Codons oder eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden der DNA-Sequenz umfassen.
  • Das Säugetier-BSSL-Gen oder ein Teil davon kann mit einem Expressionssystem, wie oben definiert, oder mit einer DNA-Sequenz, welche die BSSL-Variante codiert, durch Anwendung der gut bekannten Prinzipien der homologen Rekombination ersetzt werden.
  • In einem weiteren wichtigen Aspekt betrifft die Erfindung ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, welches in seinem Genom eine DNA-Sequenz gemäß des oben Genannten beherbergt. Die DNA-Sequenz kann vorzugsweise in der Keimbahn des Säugers, und in einem Milchprotein-Gen des Säugers, vorhanden sein. Das transgene nicht-menschliche Säugetier kann vorzugsweise aus der Gruppe gewählt werden, welche aus Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen, Schweinen und Rindern besteht.
  • Ebenfalls eingeschlossen in der Erfindung sind Nachkommen eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers gemäß des oben Genannten sowie Milch, welche aus einem solchen transgenen nicht-menschlichem Säugetier erhalten wird.
  • Die Erfindung betrifft ferner eine Kleinkind-Formulierung, umfassend Milch gemäß des oben Genannten, und eine Kleinkind-Formulierung, umfassend eine BSSL-Variante, wie oben definiert. Die Kleinkind-Formulierung kann unter Anwendung herkömmlicher Vorgehensweisen hergestellt werden und jedwede notwendigen Additive, wie Mineralien, Vitamine etc. enthalten.
  • In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine BSSL-Variante, wie oben definiert, sowie eine derartige BSSL-Variante zum Einsatz in der Therapie.
  • In noch weiteren Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung einer BSSL-Variante, wie oben definiert, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von einem pathologischen Zustand, zusammenhängend mit exokriner Pankreas-Insuffizienz; cystischer Fibrose; chronischer Pankreatitis; mangelhafter Fettabsorption; mangelhafter Absorption von fettlöslichen Vitaminen; mangelhafter Fettabsorption wegen physialogischer Gründe. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer BSSL-Variante für die Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Verwertung von in der Nahrung befindlichen Lipiden, insbesondere bei zu früh geborenen Kleinkindern.
  • BEISPIELE
  • 1. EXPRESSION VON REKOMBINANTEM BSSL IN EUKARYOTISCHEN UND PROKARYOTISCHEN ZELLEN
  • 1.1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN
  • 1.1.1. Rekombinante Plasmide
  • Das Plasmid pS146, welches die 2,3 kb große humane BSSL-cDNA (Nilsson et al., 1990), kloniert in pUC19, enthält, wurde mit HindIII und SalI verdaut, und die BSSL-cDNA wurde in einen Rinder-Papillomavirus(BPV)-Expressionsvektor, pS147 (1), eingeführt. Dieser Vektor enthält die humane BSSL-cDNA unter der Steuerung des murinen Metallothionein 1 (mMT-1)-Enhancer- und Promotorelements (Pavlakis & Hamer, 1983). Die mRNA-Prozessierungssignale werden von einem genomischen Fragment vorgesehen, enthaltend einen Teil von Exon II, Intron II, Exon III und stromabwärts gelegene Elemente des Kaninchen-β-Globin-Gens. Diese Transkriptionseinheit wurde in einen Vektor kloniert, der das gesamte BPV-Genom enthielt. Die Transkription war unidirektional für BPV und die BSSL-Transkriptionseinheit. Zur Vermehrung des Vektors in E. coli enthält der Vektor ebenfalls pML2d, ein pBR322-Derivat (Sarver et al., 1982).
  • Der Expressionsvektor pS147 wurde mit einem Vektor, der das Neomycin-Resistenzgen codiert, gesteuert von dem Harvey-Sarcom-Virus-5'-"Long terminal repeat" und Affen-Virus-40-Polyadenylierungssignalen (Lusky & Botchan, 1984), cotransfiziert.
  • Für die Expression von BSSL in E. coli wurde die BSSL-cDNA als ein NdeI-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pT7-7 (Ausubel et al., 1992) in das Plasmid pGEMEX-1 (Promega, Madison, WI, USA) (Studier & Moffat, 1986) subkloniert. Durch dieses Klonierungsverfahren wurde die für das T7-Gen 10 codierende Sequenz durch das BSSL-Gen, codierend für das reife Protein, welchem ein Start-Codon voranging, ersetzt. Der letztliche Expressionsvektor pGEMEX/BSSL, wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung von spezifischen internen BSSL-Primern bestätigt.
  • 1.1.2. Mutagenese
  • Die Nukleotid-Nummer 1 wurde dem A in dem Initiationscodon ATG zugewiesen. Für die Aminosäurenummerierung ist das erste Methionin in dem Signalpeptid –23, und dem ersten Aminosäurerest des reifen Proteins, einem Alanin, wird die Nummer 1 zugewiesen.
  • Für die Konstruktion der Deletionsvariante A (SEQ ID Nr.: 4) wurden zwei PCR-Primer, PCR-1 und PCR-2 (Tabelle 1), synthetisiert. Die HindIII-, SalI- und BamHI-Stellen wurden für eine Klonierung in unterschiedliche Plasmide erzeugt. Die BclI-Stelle wurde in der BSSL-Sequenz erzeugt, ohne die Aminosäuresequenz zu verändern. Dies wurde vorgenommen, um die Addition von synthetischer DNA zum Erhalten der anderen Varianten zu erleichtern. Der Primer PCR-2 enthält zwei synthetische Stop-Codons. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden mit BamHI und HindIII verdaut und zur Sequenzanalyse in pUC18 kloniert. Dieses Plasmid wurde pS157 genannt. Das korrekte PCR-Fragment wurde in den BPV-Expressionsvektor durch Fusion an die BSSL-Sequenz an der einmaligen Asp700-Stelle (Position 1405 in der BSSL-cDNA) und der SalI-Stelle vor dem β-Globin-Gen-Fragment inseriert, was zu pS257 führte.
  • Die B-Varianten-Konstruktion (SEQ ID Nr.: 5) wurde unter Verwendung der Oligonukleotide Nummer 3, 4, 7 und 8 (Tabelle 1) durchgeführt. Die annealten Oligonukleotide codieren die äußerste C-terminale Aminosäuresequenz, welche Lysin 712 bis Phenylalanin 722 im Volllängenprotein repräsentiert. Dieses Fragment wurde an Glutamin 535 fusioniert. Ein Translations-Stop wurde direkt nach dem letzten Phenylalanin inseriert. Dieses Fragment enthält eine BclI-Stelle im 5'-Ende und eine SalI-Stelle im 3'-Ende, was die Einführung in pS157 gestattet. Das resultierende Plasmid wurde mit Asp700 und SalI verdaut, und das 313 bp große Fragment wurde in den Expressionsvektor eingeführt, wie oben stehend beschrieben. Das resultierende Plasmid wurde pS258 genannt.
  • TABELLE 1.
  • Synthetische Oligonukleotide, welche verwendet wurden für die Konstruktion der BSSL-Varianten. Nukleotide von Restriktionsstellen sind unterstrichen. Translations-Stoppsignale sind durch fett gedruckte Buchstaben angegeben. Das veränderte Codon in Variante N ist in PCR-3 durch Fettdruckbuchstaben und einen Asterisken angegeben.
  • Figure 00160001
  • Um das Gen, welches die C-Variante (SEQ ID Nr.: 6) codiert, zu konstruieren, wurden die Oligonukleotide 1 bis 6 (Tabelle 1) verwendet. Das angelagerte bzw. annealte DNA-Fragment enthält zwei Repetitionen, die elf Aminosäuren codieren, identisch zum Konsensus (Nilsson et al., 1990), inseriert zwischen Glutamin 535 und der Lysin 712- bis Phenylalanin-722-Sequenz. Dieses Fragment enthält auch eine BclI-Stelle im 5'-Ende und eine SalI-Stelle im 3'-Ende, was dieselbe Klonierungsstrategie wie oben ermöglicht. Das resultierende Plasmid wurde als pS259 bezeichnet.
  • Für die Konstruktion von Variante N (nicht-N-glycosylierte Variante SEQ ID Nr.: 7) wurden zwei PCR-Primer (PCR-3 und PCR-4 in Tabelle 1) synthetisiert. Die EcoRI- und BamHI-Stellen wurden für die Klonierung des 360-bp-PCR-Produkts in pUC19 für eine Sequenzanalyse erzeugt. Die potenzielle N-verknüpfte Glycosylierungsstelle bei Asparagin 187 wurde zu einem Glutamin geändert. Die modifizierte Sequenz wurde als ein BalI-HindIII-Fragment isoliert und in mit SacI und HindIII verdauten pUC19 gemeinsam mit einem SacI- und BalI-Fragment kloniert, welches den mMT-1-Promotor und das 5'-Ende von BSSL-cDNA enthielt. Ein ungefähr 1,2 kb großes SacI-DraIII-Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert und in das mMT-1-Element bzw. die BSSL-cDNA-Sequenz, innerhalb des Expressionsvektors, inseriert. Das resultierende Plasmid wurde pS299 genannt.
  • 1.1.3. Säugerzellkultur und Transfektionen
  • Die Vektoren wurden in die Maus-Zelllinie C127 (ATCC CRL 1616) nach dem Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren (Graham & Van der Eb, 1973) co-transfiziert.
  • Die C127-Zellen wurden in Ham's F 12 -Dulbecco's modiziertem Eagle-Medium (DMEM) (1:1), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, kultiviert. Neomycin-resistente Zellklone wurden mit 1,5 mg × ml–1 G418 selektiert, und nach 10 – 15 Tagen wurden resistente Zellklone von den Stammplatten isoliert und für eine Analyse passagiert.
  • 1.1.4. Bakterienstämme und Kulturbedingungen
  • Für Expressionsexperimente wurde der Vektor pGEMEX/BSSL in E. coli-Stämme JM109(DE3) und BL21(DE3)pLysS transformiert. Die Expressionsexperimente wurden ausgeführt, wie beschrieben von Studier et al. (1986). Nach Ernten von Bakterien wurden die Zellen mittels Zentrifugation (5000 × g während 10 Minuten bei 4 °C) pellettiert. Für die Herstellung von Periplasma- und Cytoplasma-Fraktionen wurde das Pellet in 4 ml 20 mM Tris-Cl/20 % Saccharose, pH 8,0, 200 μl 0,1 M EDTA und 40 μl Lysozym (15 mg/ml in Wasser) pro Gramm Pellet resuspendiert. Die Suspension wurde 40 Minuten lang auf Eis inkubiert. 160 μl 0,5 M MgCl2 pro Gramm Pellet wurden zugesetzt, wonach die Suspension 20 Minuten lang bei 12000 × g zentrifugiert wurde. Der resultierende Überstand enthält periplasmatische Proteine und das Pellet repräsentiert die cytoplasmatische Fraktion. Alternativ dazu wurden, für die Herstellung löslicher Proteine, die Zellen in 40 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, pH 8,2, suspendiert, gefriergetaut und mehrere Male schallbehandelt, um eine Lyse vorzunehmen. Das Zell-Lysat wurde zentrifugiert (30000 × g während 30 Minuten bei 25 °C).
  • 1.1.5. Nukleinsäureanalyse
  • RNA und DNA wurden aus isolierten Säugetierzelllinien oder E.coli-Zellen hergestellt (Ausubel et al., 1992). Die RNA oder DNA wurden auf Agarosegelen fraktioniert und auf "GeneScreen Plus" (New England Nuclear) geblottet und gemäß den Anweisungen des Herstellers hybridisiert.
  • 1.1.6. Herstellung von nativem Enzym
  • Gallensalz-stimulierte Lipase wurde aus menschlicher Milch gereinigt, wie es früher beschrieben wurde (Bläckberg & Hernell, 1981). Die gereinigte Präparation war homogen, wie mittels SDS-PAGE beurteilt, und wies eine spezifische Aktivität von 100 μmol freigesetzter Fettsäure × min–1 und mg–1 auf, wenn ein Assay mit langkettigem Triacylglycerol als Substrat ausgeführt wurde.
  • 1.1.7. Enzym-Assay
  • Der Enzym-Assay erfolgte wie beschrieben (Bläckberg & Hernell, 1981) unter Verwendung von Triolein, emulgiert mit Gummi Arabicum, als Substrat. Die Inkubationen wurden mit 10 mM Natriumcholat als aktivierendes Gallensalz durchgeführt. Als die Gallensalz-Abhängigkeit getestet wurde, wurden Gallensalze (Natriumcholat oder Natriumdesoxycholat, Sigma Chem. Co.) zu den in 3 angegebenen Konzentrationen zugesetzt.
  • 1.1.8. Western-Blotting
  • Um signifikante Reaktionen in den Blotting-Experimenten zu erhalten, wurden die konditionierten Medien mittels Chromatographie auf Blue-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology) konzentriert. Die jeweiligen Medien wurden mit Blue-Sepharose vermischt (ungefähr 10 ml Medium pro ml Gel). Das Gel wurde (10 ml pro ml Gel) mit 0,5 M Tris-Cl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 0,1 M KCl, gewaschen. Die Enzym-Aktivität wurde mit 1,5 M KCl im selben Puffer eluiert. Durch dieses Vorgehen wurde eine 25-30-fache Konzentrierung sowie eine 3-5-fache Aufreinigung erhalten. Eine SDS-PAGE wurde auf 10%igen Polyacrylamidgelen im Wesentlichen gemäß Laemmli (1970) durchgeführt. Nach Transfer auf Nitrozellulosemembranen und Inkubation mit einem polyklonalen Kaninchenantiserum gegen gereinigtes BSSL erfolgte eine Detektion unter Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, welches mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, und eines Entwicklungs-Kits von Bio-Rad.
  • 1.1.9. Behandlung mit N-Glycosidase F
  • Zu 10 μl von Variante B, enthaltend eine BSSL-Aktivität von 2,5 μmol freigesetzter Fettsäure × min–1, wurden 1 μl 1 M β-Mercaptoethanol und 0,5 μl 10 % (w/v) SDS zugesetzt. Nach 5 Minuten langem Kochen wurden 10 μl 0,1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 8,0, 6 μl 0,1 M EDTA, 4 μl 7,5 % (w/v) Nonidet P 40 und 5 μl (1U) N-Glycosidase F (Boehringer Mannheim) zugegeben. Als eine Kontrolle wurde die gleiche Menge an Variante B identisch behandelt, außer dass keine Glycosidase zugesetzt wurde. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die Proben auf SDS-PAGE laufen gelassen und unter Verwendung des polyklonalen Kaninchen-BSSL-Antiserums geblottet.
  • 1.2. ERGEBNISSE
  • 1.2.1. Konstruktion der BSSL-Varianten
  • Die Modifikationen der BSSL-Varianten in Bezug auf das Volllängen-BSSL sind in der Tabelle 2 und der 1 zusammengefasst. Die zur Erzeugung dieser Varianten verwendeten Strategien sind im Abschnitt 1.1 beschrieben. Für die Variante A (SEQ ID Nr.: 4) wurde ein Stop-Codon nach dem Glutamin an Position 535 eingeführt, wodurch die letzten 187 Aminosäuren des Volllängenproteins entfernt wurden. Für die Variante B (SEQ ID Nr.: 5) wurde die Domäne, welche die äußersten 11 C-terminalen Aminosäuren und das originale Translations-Stopp codierte, an Glutamin-535 fusioniert. Somit fehlten dieser Variante alle Wiederholungseinheiten. Für die Variante C (SEQ ID Nr.: 6) wurde ein Fragment, enthaltend zwei Wiederholungseinheiten mit einer zum Konsensus (Nilsson et al., 1990) identischen Sequenz, zwischen Glutamin-535 und die Lysin-712- an die Phenylalanin-722-Sequenz inseriert.
  • Um die Bedeutung der einzigen vermeintlichen N-verknüpften Kohlenhydrat-Struktur, welche nahe zum Aktiven-Stellen-Serin-194 positioniert ist, zu analysieren, wurde eine Variante konstruiert. Die Variante N (SEQ ID Nr.: 7) wurde durch Verändern der potenziellen N-Glycosylierungsstelle am Asparagin-187 zu einem Glutamin erhalten.
  • TABELLE 2 Die Aminosäuresequenz der BSSL-Varianten in Bezug auf diejenige von menschlicher BSSL.
    Figure 00200001
  • 1.2.2. Charakterisierung von rekombinanter DNA in den Säugetierzelllinien
  • DNA-Proben wurden aus den Zelllinien hergestellt, die mit den Expressionsvektoren transfiziert waren, welche die verschiedenen BSSL-Varianten codierten. Die präparierte DNA wurde mit BamHI verdaut, auf Agarosegelen fraktioniert und auf Membranen für die Hybridisierung überführt. Die verwendete Sonde war 32P-markierte BSSL-cDNA. Die Hybridisierungsergebnisse bestätigten das Vorliegen der rekombinanten Gene und auch, dass die Vektor-Kopienzahl in den verschiedenen Zelllinien ungefähr gleich war (2). Die Positionen der hybridisierenden Fragmente spiegelten die unterschiedlichen Längen der verschiedenen BSSL-Sequenzen wider und standen in Übereinstimmung mit den erwarteten Größen. Die Positionen waren ebenfalls ähnlich zu der Bakterien-abgeleiteten DNA, welche im Transfektionsexperiment eingesetzt wurde, was zeigt, dass kein größeres Rearrangement der Vektor-DNA in den Zelllinien stattgefunden hatte (2). Die oberen Hybridisierungssignale in der DNA-Probe, welche die Variante A repräsentiert, beruhten wahrscheinlich auf einem partiellen Verdau.
  • 1.2.3. Expression von mRNA für Volllängen- und mutierte BSSL in Säugetierzellen
  • Um die Expression der verschiedenen rekombinanten BSSL-Gene zu analysieren, wurde RNA aus den isolierten Zelllinien hergestellt. Northern-Blot-Experimente und Hybridisierung mit 32P-markierter BSSL-cDNA zeigten, dass rekombinante mRNA in allen Zelllinien nachweisbar war, welche einen BSSL-Vektor beinhalteten (3). Keine Hybridisierung wurde in der Kontrollprobe gefunden, welche aus einer Zelllinie abgeleitet wurde, die einen identischen Vektor, mit Ausnahme der BSSL-cDNA, enthielt (3).
  • Die unterschiedlichen Längen der hybridisierenden mRNAs standen in Übereinstimmung mit den Modifikationen der cDNAs. Die Steady-State-Level der rekombinanten BSSL-mRNA-Varianten in den verschiedenen Proben waren ungefähr die gleichen, außer für die Variante A (3). Der Grund für die verringerte Akkumulation von Variante-A-mRNA ist nicht bekannt, aber sie wurde bei zwei Populationen von Zelllinien sowie bei isolierten Klonen beobachtet. Das Vorliegen gleicher Mengen von RNA in den verschiedenen Proben wurde durch Hybridisierung an eine Maus-β-Actin-Sonde bestätigt (3, untere Tafel).
  • 1.2.4. Herstellung von Volllängen- und Varianten von BSSL in Säugetierzellen
  • Medien aus individuellen Klonen der C127-Zellen, transfiziert mit Volllängen-BSSL und den verschiedenen mutierten Formen, wurden abgesammelt und hinsichtlich BSSL-Aktivität getestet (4). Für das Volllängenmolekül und die Varianten N, B und C lagen die Aktivitäten in den Klonen mit der höchsten Expression im Bereich von 0,7 bis 2,3 μmol freigesetzte Fettsäure × min–1 × ml Medium–1. Bei einer spezifischen Aktivität, vergleichbar zu derjenigen der nativen Milch-BSSL, würde dies Expressionsspiegeln von 7-23 μg × ml Medium–1 entsprechen. Für die Variante A besaßen alle analysierten Klone Aktivitäten unter 0,05 μmol freigesetzte Fettsäure × min–1 und ml Medium–1. Die Konzentrierung auf Blue-Sepharose und das Lyophilisieren des Klons, welcher die höchste Aktivität zeigte, enthüllten, dass tatsächlich ein aktives Enzym exprimiert wurde, wenngleich bei sehr niedrigen Spiegeln. Die Möglichkeit, dass die mit der Variante A erhaltene geringe Aktivität zum Teil durch eine beträchtlich geringere spezifische Aktivität erklärt werden könnte, konnte nicht ausgeschlossen werden.
  • Western-Blots von Klonen der verschiedenen Transfektionsexperimente sind in der 5A gezeigt. Das scheinbare Mr der BSSL-Varianten war wie erwartet. Es sollte jedoch bemerkt werden, dass für Volllängen-BSSL sowie für die Varianten B und C ein Doppelbande beobachtet wurde. Weil bei allen Dreien die einzige N-Glykosylierungsstelle unversehrt war, wohingegen der Variante N, welche keine Doppelbande zeigte, diese Stelle fehlte, bestand eine wahrscheinliche Erklärung darin, dass die Doppelbande aus Unterschieden in der N-Glykosylierung resultierte. Deshalb wurde die Variante B einem Verdau mit N-Glykosidase F unterzogen. Wie in der 5B gezeigt, verblieben lediglich Spurenmengen der oberen Bande, wohingegen die untere Bande an Stärke zunahm, was anzeigt, dass nur ein Teil der exprimierten Variante N-glykosyliert war.
  • Eines der Merkmale von BSSL ist ihre spezifische Aktivierung durch primäre Gallensalze, z.B. Cholat (Hernell, 1975). All die unterschiedlichen rekombinanten Formen von BSSL zeigten die gleiche Konzentrationsabhängigkeit für Cholat-Aktivierung (6). Eine maximale Aktivität wurde in dem verwendeten Assaysystem bei etwa 10 mM erhalten. Als Cholat durch Desoxycholat ausgetauscht wurde (ein sekundäres Gallensalz), fand keine derartige Aktivierung statt. Somit zeigten die rekombinante Volllängen-Form wie auch die verschiedenen Varianten dieselbe Spezifität in Bezug auf Gallensalz-Aktivierung.
  • 1.2.5. Expression und biochemische Charakterisierung von Volllängen-BSSL in E. coli
  • Zwei E.coli-Stämme, JM109(DE3) und BL21(DE3)pLysS (Studier et al., 1986), wurden mit dem Expressionsvektor pGEMEX/BSSL transformiert, welcher die humane BSSL-cDNA unter der Steuerung des T7-Promotors enthielt. Transformanten aus beiden Stämmen wurden identifiziert, kultiviert und etwa 90 Minuten lang mit IPTG induziert (Studier et al., 1986). Eine Analyse der Gesamt-mRNA durch Northern-Blot unter Verwendung der BSSL-cDNA als eine 32P-markierte Sonde demonstrierte, dass die Expression in beiden Stämmen effizient induziert wurde und dass die Transkription strikt reguliert war (7A). Die scheinbare Größe der rekombinanten BSSL-mRNA, ungefähr 2,4 kb, steht in Übereinstimmung mit der erwarteten Länge. Eine SDS-PAGE-Trennung der Proteinproben und Immunodetektion mit Anti-BSSL-Antikörpern zeigten, dass Volllängen-BSSL effizient in E. coli produziert wurde (7B). In dem BL21(DE3)pLysS-Stamm wurde mehr Protein in das Periplasma sezerniert als in JM109(DE3) (7B).
  • IPTG-induzierte E.coli-Kulturen enthielten aktives lösliches BSSL, entsprechend 0,5 – 4 μg BSSL-Protein/ml Kultur. Ein Western-Blotting zeigte, dass zwischen 20 und 60 % des reaktiven Materials in dem unlöslichen Pellet vorlagen. Nicht-induzierte Bakterien enthielten keine signifikante BSSL-Aktivität.
  • Die Lipaseaktivität aus kultivierten Bakterien zeigte die gleiche Gallensalz-Abhängigkeit wie native Milch-BSSL.
  • 2. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON REKOMBINANTEN VOLLLÄNGEN- UND MUTIERTEN FORMEN VON GALLENSALZ-STIMULIERTER LIPASE
  • 2.1. EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN
  • 2.1.1. Enzyme und Enzymvarianten
  • Rekombinantes Volllängen-BSSL und BSSL-Varianten B, C und N wurden konstruiert und exprimiert, wie vorangehend beschrieben. Im Vergleich zu dem nativen Enzym fehlten der Variante B (SEQ ID Nr.: 5) alle 16 einmaligen, O-glykosylierten, prolinreichen C-terminalen Wiederholungseinheiten (aa 536-711), wobei jedoch das äußerste C-terminale Fragment (aa 712-722) an Glutamin-535 fusioniert war. Die Variante C (SEQ ID Nr.: 6) enthält das gleiche C-terminale Fragment und zwei Wiederholungseinheiten von 11 Resten zwischen Glutamin-535 und Lysine-712. In der Variante N (nicht-N-glykosylierte Variante, SEQ ID Nr.: 7) wurde das für den einzigen N-verknüpften Zucker verantwortliche Asparagin-187 durch einen Glutamin-Rest ausgetauscht. Native BSSL wurde aus menschlicher Milch gereinigt, wie beschrieben (Bläckberg & Hernell, 1981).
  • 2.1.2. Enzym-Assay
  • Lipaseaktivität wurde geassayt, wie beschrieben (Bläckberg & Hernell, 1981), wobei in Gummi Arabicum emulgiertes Triolein als Substrat verwendet wurde. Natriumcholat (10 mM) wurde als aktivierendes Gallensalz verwendet. Verschiedene Modifikationen des Assays sind in den Legenden zu den Figuren angegeben.
  • 2.1.3. Herstellung von Immunosorbens
  • Gereinigte Milch-BSSL (5 mg) wurde unter Verwendung von CNBr, wie beschrieben vom Hersteller, an Sepharose gekoppelt. 40 ml eines polyklonalen Antiserums, welches in Kaninchen gegen gereinigte Milch-BSSL gewonnen worden war, wurden durch die Säule laufen gelassen. Spezifische Antikörper wurden mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,5, eluiert. Der pH-Wert wurde unverzüglich mit festem Tris auf ungefähr 8 eingestellt. Nach dem Entsalzen und Lyophilisieren wurden 6 mg der affinitätsgereinigten Antikörper an Sepharose gekoppelt, wie oben stehend beschrieben.
  • 2.1.4. Reinigungsvorgehen
  • Konditionierte Kulturmedien, enthaltend 5 – 25 μg rekombinant exprimierte BSSL oder BSSL-Variante, wurden mit Blue-Sepharose (Pharmacia, Schweden) bei 10 ml Medium pro ml abgesetztem Gel gemischt. Nach 30 Minuten langem Kopfüber-Mischen wurde das Gel mit 0,05 M Tris-Cl, pH 7,0, 0,05 M KCl gespült, und die Lipase-Aktivität wurde mit 0,05 M Tris-Cl, pH, 7,0, 1,5 M KCl eluiert. Der Aktivitäts-Peak wurde vereinigt und gegen 5 mM Natrium-Veronal, pH 7,4, 0,05 M NaCl dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 0,05 bis 1,0 M NaCl in 5 mM Natrium-Veronal-Puffer, pH 7,4, eluiert. Fraktionen, welche Lipase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und auf eine Immunosorbens-Säule aufgetragen. Nach Spülen mit 0,05 M Tris-Cl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, wurde gebundene Lipase mit 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,5, eluiert. Der pH-Wert der Fraktionen wurde unverzüglich mit festem Tris auf ungefähr 8 eingestellt.
  • 2.1.5. Elektrophorese
  • Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde im Wesentlichen gemäß Laemmli (1970) durchgeführt. Die Proteine wurden mit Commassie-Brilliant-Blue gefärbt.
  • 2.1.6. N-terminale Sequenzanalyse
  • Die Aminosäure-Sequenzanalyse wurde auf einer Applied Biosystems Inc. 477A-Puls-Flüssigkeitsphasen-Sequenziervorrichtung und einem "on-line" Phenylthiohydantoin-120A-Analysegerät mit regulären Zyklusprogrammen und Chemikalien vom Hersteller durchgeführt. Aus einem sequenzierten Standardprotein (β-Lactoglobulin) berechnete Anfangs- und Wiederholungs-Ausbeuten beliefen sich auf 47 % bzw. 97 %.
  • 2.2. ERGEBNISSE
  • 2.2.1. Reinigung rekombinanter BSSL und BSSL-Varianten
  • Die Chromatographie von konditionierten Medien auf Blue-Sepharose wurde hauptsächlich als ein Konzentrierungsschritt eingesetzt. Die nachfolgende Chromatographie auf Heparin-Sepharose ergab eine anfängliche Aufreinigung hauptsächlich durch Entfernung des Großteils des im Kulturmedium vorhandenen Albumins. Dieser Schritt zeigte auch, dass die rekombinanten BSSL-Moleküle alle die Heparinbindung beibehielten. Nach dem Immunosorbens erschienen alle BSSL-Varianten zu mehr als 90 % rein, wie mittels SDS-PAGE beurteilt wurde (8). Das Volllängenenzym wie auch die Varianten B und C wanderten als eine Doppelbande. Das scheinbare Mr der verschiedenen Varianten wird in der Tabelle 3 gezeigt.
  • Eine N-terminale Sequenzanalyse ergab eine einzelne Sequenz für alle Varianten bei 8 Zyklen: Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-.
  • 2.2.2. Lipase-Aktivität
  • In der Tabelle 3 ist das scheinbare Molekulargewicht der verschiedenen Präparationen gezeigt. Die spezifischen Aktivitäten der Präparationen lagen im Bereich von 75 bis 120 μmol freigesetzte freie Fettsäure pro Minute und mg Protein. Folglich konnte kein signifikanter Unterschied in der Aktivität zwischen Volllängen-BSSL und den BSSL-Varianten beobachtet werden.
  • Die Präparationen zeigten alle ein absolutes Erfordernis nach primärem Gallensalz (Natriumcholat) für eine Aktivität gegenüber emulgiertem langkettigen Triacylglycerol (9A). Natriumdesoxocholat machte jede der Varianten aktiv (Daten nicht gezeigt). Allerdings hatte Desoxycholat, bei Kombinieren der verschiedenen Gallensalze, zwei Effekte (9B und C). Zum Ersten verringerte es die zur Aktivierung benötigte Konzentration an Cholat und, zum Zweiten, inhibierte es die Enzymaktivität bei höherer Gallensalzkonzentration.
  • TABELLE 3. Scheinbares Mr von rekombinanter Volllängen-BSSL und BSSL-Varianten.
    Figure 00250001
  • 2.2.3. Stabilität der rekombinanten BSSL und BSSL-Varianten
  • Rekombinante BSSL sowie die BSSL-Varianten zeigten die gleiche pH-Stabilität wie native Milch-BSSL (10). Eine Inaktivierung fand in allen Fällen bei einem pH-Wert um 2,5 – 3 statt. Über einem pH-Wert von 3 waren alle Varianten vollständig stabil, vorausgesetzt die Proteinkonzentration war hoch genug. Dies wurde mittels Hinzusetzen von Rinderserumalbumin oder Ovalbumin bewirkt (Daten nicht gezeigt). Verdünnte Proben waren bei allen getesteten pH-Werten weniger stabil, aber die Schwelle blieb die gleiche (Daten nicht gezeigt). Die 11 zeigt die Wärmestabilität der rekombinanten Enzyme im Vergleich zu dem nativen Milchenzym. Bei einer Temperatur von 37 – 40 °C beginnt die Aktivität zu sinken. Die Varianten (B, C, N) erschienen etwas weniger stabil als das rekombinante Volllängenenzym und das Milchenzym zu sein. Wenn jedoch die Prateinkonzentration durch Hinzufügen von Rinderserumalbumin erhöht wurde, waren alle Varianten auch bei 40 °C stabil (11).
  • Native Milch-BSSL und alle rekombinanten Varianten waren sämtlich gegenüber Trypsin empfindlich. Es wurde eine zeitabhängige Inaktivierung erhalten (12). Wenn jedoch Gallensalze, d. h. Cholat, in den Puffer eingeschlossen wurden, waren die Lipasevarianten geschützt, und die Lipaseaktivität blieb bestehen (12).
  • In Hinsicht auf eine Reihe von in vitro-Merkmalen, d. h. Gallensalz-Aktivierung, Heparinbindung, pH- und Temperaturstabilität und Gallensalz-Schutz gegen Inaktivierung durch Proteasen, wurden somit keine signifikanten Unterschiede beobachtet, als die verschiedenen BSSL-Varianten mit nativer Milch-BSSL verglichen wurden.
  • 3. EXPRESSION IN TRANSGENEN TIEREN
  • 3.1. KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN
  • Um einen Expressionsvektor für die Herstellung von rekombinanter humaner BSSL-Variante in Milch aus transgenen Tieren zu konstruieren, wurde die folgende Strategie angewandt (13).
  • Drei Plasmide, enthaltend verschiedene Teile des humanen BSSL-Gens (pS309, pS310 und pS311) wurden unter Anwendung der Verfahren erhalten, welche in Lidberg et al. (1992) beschrieben wurden. Das Plasmid pS309 enthält ein SphI-Fragment, welches das BSSL-Gen von der 5' gelegenen nicht-transkribierten Region bis zu einem Teil des vierten Introns abdeckt. Das Plasmid pS310 enthält ein SacI-Fragment, welches eine BSSL-Varianten-Gensequenz von einem Teil des ersten Introns bis zu einem Teil des sechsten Introns abdeckt. Das Plasmid pS311 enthält schließlich ein BamHI-Fragment, welches das BSSL-Gen von einem Hauptteil des fünften Introns ab sowie den Rest der Intron/Exon-Struktur mit Deletionen im Exon 11 abdeckt. Bei den deletierten Sequenzen handelt es sich um 231 bp, was zu einer Sequenz führt, die eine BSSL-Variante codiert, welche exakt 77 Aminosäuren oder sieben Wiederholungseinheiten weniger als die Volllängen-BSSL aufweist. Die Nukleotidsequenz der resultierenden BSSL-Variante ("Variante T") ist in der Sequenz uflistung als SEQ ID Nr.: 8 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von Variante T ist in der Sequenzauflistung als SEQ ID Nr.: 9 gezeigt.
  • Aufgrund der hochrepetitiven Sequenz im Exon 11 des humanen BSSL-Gens können ver hältnismäßig hohe Häufigkeiten für Rearrangements vorhergesehen werden, wenn diese Sequenz in ein Plasmid kloniert und in Bakterien vermehrt wird. Basierend auf dieser Annahme wurde eine gewünschte BSSL-Variante, welche ein trunkiertes Exon 11 enthält, identifiziert, isoliert und einer Sequenzanalyse unterzogen.
  • Ein weiteres Plasmid, pS283, enthaltend einen Teil der menschlichen BSSL-cDNA, kloniert in das Plasmid pUC19 an den HindIII und SacI-Stellen, wurde für die Fusion von den genomischen Sequenzen verwendet. Das Plasmid pS283 wurde ebenfalls verwendet, um eine geeignete Restriktionsenzymstelle, KpnI, lokalisiert in der 5' gelegenen nicht-translatierten Leader-Sequenz von BSSL, zu erlangen.
  • Das Plasmid pS283 wurde mit NcoI und SacI verdaut und ein Fragment von etwa 2,7 kb wurde durch Elektrophorese isoliert. Das Plasmid pS309 wurde mit NcoI und BspEI verdaut, und ein Fragment von etwa 2,3 kb, welches den 5'-Teil des BSSL-Gens enthält, wurde isoliert. Das Plasmid pS310 wurde mit BspEI und SacI verdaut, und ein Fragment von etwa 2,7 kb, enthaltend einen Teil der mittleren Region des BSSL-Gens, wurde isoliert. Diese drei Fragmente wurden ligiert und in kompetente E. coli, Stamm TG2, transformiert, und Transformanten wurden mittels Ampicillinselektion isoliert.
  • Plasmide wurden aus einer Anzahl von Transformanten hergestellt, und ein als pS312 (14) bezeichnetes Plasmid, welches das gewünschte Konstrukt enthält, wurde für weitere Experimente verwendet.
  • Um eine Modifikation von pS311 zu erhalten, in welchem die stromabwärts des Stop-Codons gelegene BamHI-Stelle in eine SalI-Stelle umgewandelt war, um eine weitere Klonierung zu erleichtern, wurde das folgende Verfahren angewandt: Das Plasmid pS311 wurde durch partiellen BamHI-Verdau linearisiert. Das linearisierte Fragment wurde isoliert, und ein synthetischer DNA-Linker, welcher BamHI zu einer SalI-Stelle umwandelt (5'-GATCGTCGAC-3'), wodurch die BamHI-Stelle zerstört wird, wurde inseriert. Da es zwei potentielle Positionen für die Integration des synthetischen Linkers gab, wurden die resultierenden Plasmide durch Restriktionsenzym-Spaltung analysiert. Ein Plasmid, bei welchem der Linker an der gewünschten Position stromabwärts von Exon 11 inseriert worden war, wurde isoliert und als pS313 bezeichnet.
  • Um das letztendliche Expressionsvektorkonstrukt, beinhaltend die genomischen humanen BSSL-Varianten-Sequenzen, zu erhalten, wurde ein existierender Expressionsvektor pS314 verwendet, der entworfen war, um eine stadium- und gewebespezifische Expression in den Brustdrüsenzellen während Lactations-Perioden zu vermitteln. Das Plasmid pS314 enthält ein genomisches Fragment aus dem Gen für Saures Maus-Molkeprotein (WAP) (Campbell et al., 1984), welches als ein NotI-Fragment kloniert ist. Das genomische Fragment besitzt ungefähr 4,5 kb an stromaufwärts gelegenen regulatorischen Sequenzen (URS, upstream regulatory sequences), alle vier Maus-WAP-Exons und alle Intronsequenzen sowie etwa 3 kb an Sequenz, stromabwärts zum letzten Exon. Eine einmalige KpnI-Stelle ist im ersten Exon 24 bp stromaufwärts des natürlichen WAP-Translations-Initiationscodons lokalisiert. Eine andere einmalige Restriktionsenzymstelle ist die SalI-Stelle, welche in Exon 3 lokalisiert ist.
  • Die genomische menschliche BSSL-Varianten-Sequenz wurde zwischen diese Stellen, KpnI und SalI, durch die folgende Strategie inseriert: Zuerst wurde pS314 mit KpnI und SalI verdaut, und ein Fragment, repräsentierend das gespaltene Plasmid, wurde elektrophoretisch isoliert. Als Zweites wurde pS312 mit KpnI und BamHI verdaut, und ein ungefähr 4,7 kb großes Fragment, repräsentierend den 5'-Teil des menschlichen BSSL-Gens, wurde isoliert. Drittens, wurde pS313 mit BamHI und SalI verdaut, und der 3'-Teil des menschlichen BSSL-Gens wurde isoliert. Diese drei Fragmente wurden ligiert, in kompetente E. coli-Bakterien transformiert, und Transformanten wurden nach Ampicillin-Selektion isoliert.
  • Plasmide wurden aus mehreren Transformanten hergestellt und sorgfältig mittels Restriktionsenzym-Kartierung und Sequenzanalyse analysiert. Ein Plasmid, welches den gewünschten Expressionsvektor repräsentiert, wurde definiert und als pS317 bezeichnet (15).
  • Um die prokaryotischen Plasmidsequenzen zu entfernen, wurde pS317 mit NotI verdaut. Das rekombinante Vektorelement, bestehend aus Maus-WAP-Sequenz, flankierend das genomische humane BSSL-Varianten-Fragment, wurde dann durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wurde weiter unter Anwendung von Elektroelution gereinigt, bevor es in Maus-Embryonen injiziert wurde.
  • Das rekombinante Gen für die Expression der humanen BSSL-Variante in Milch aus transgenen Mäusen ist in der 16 gezeigt.
  • 3.2. ERZEUGUNG VON TRANSGENEN TIEREN
  • Ein NotI-Fragment wurde aus dem Plasmid pS317 gemäß Abschnitt 3.1 isoliert. Dieses DNA-Fragment enthielt den Maus-WAP-Promotor, verknüpft an eine genomische Sequenz, welche die humane BSSL-Variante codiert. Das isolierte Fragment wurde bei einer Konzentration von 3 ng/μl in den Pronukleus von 350 C57B1/6JxCBA/2J-f2-Embryonen injiziert, welche aus Spendermäusen erhalten wurden, die für eine Superovulation mit 5 IU an Serum-Gonadotropin aus schwangeren Stuten geprimt worden waren. Die C57B1/6JxCBA/2J-f1-Tiere wurden vom "Bomholtgård Breeding and Research Centre" LTD, Ry, Dänemark, erhalten. Nach Auffangen der Embryonen aus den Eileitern, wurden sie von den Cumuluszellen durch Behandlung mit Hyaluronidase im Medium M2 (Hogan et al., 1986) getrennt. Nach Waschen wurden die Embryonen in das Medium M16 (Hogan et al., 1986) überführt und in einem Inkubator mit 5 % CO2-Atmosphäre gehalten. Die Injektionen wurden in einem Mikrotröpfchen von M2 unter Leicht-Paraffinöl durch Verwendung von hydraulischen Narishigi-Mikromanipulatoren und eines inversen Nikon-Mikroskops, welches mit einer Optik von Nomarski ausgestattet war, durchgeführt. Nach der Injektion wurden 267 gesund aussehende Embryonen in 12 pseudoschwangere C57B1/6JxCBA/2J-f1-Empfänger implantiert, denen man 0,37 ml 2,5 % Avertin intraperitoneal verabreichte. Mäuse, welche das Transgen integriert hatten, wurden mittels PCR-Analyse von DNA aus Schwanzbiopsieproben identifiziert, welche drei Wochen nach der Geburt der Tiere erhalten wurden. Positive Ergebnisse wurden mittels Southern-Blot-Analyse bestätigt.
  • Für das Absammeln der Milch erhielten weibliche Taktierende Tiere intraperitoneal eine Injektion mit 2 IU Oxytocin und wurden 10 Minuten später mit 0,40 ml 2,5 % Avertin intraperitoneal betäubt. Eine Milchsammelvorrichtung wurde über einen silikonisierten Schlauch an der Zitze angebracht, und Milch wurde durch sanftes Massieren der Brustdrüse in ein 1,5 ml großes Eppendorf-Röhrchen abgesammelt. Die Menge an Milch schwankte abhängig vom Tag der Laktation zwischen 0,1 und 0,5 ml pro Maus und Absammlung.
  • 3.3. EXPRESSION VON BSSL-VARIANTE IN TRANSGENEN MÄUSEN
  • Transgene Mäuse wurden durch Analyse von DNA identifiziert, welche aus herausgeschnittenen Schwanzproben präpariert worden war. Die Gewebeproben wurden mit Proteinase K inkubiert und mittels Phenol/Chloroform extrahiert. Die isolierte DNA wurde in Polymerasekettenreaktionen mit Primern verwendet, welche spezifische Fragmente amplifizieren, wenn die heterologe, eingeführte DNA vorhanden ist, welche das Expressionsvektor-Fragment repräsentiert. Die Tiere wurden auch mittels DNA-Hybridisierungs- Experimenten analysiert, um die PCR-Daten zu bestätigen und hinsichtlich möglicher Rearrangements, der Struktur der integrierten Vektorelemente zu testen und Informationen über die Kopienzahl an integrierten Vektorelementen zu erhalten.
  • In einem Satz von Experimenten wurden 31 Mäuse mit den zwei Verfahren analysiert, und die Ergebnisse zeigten, dass 1 Maus das aus pS317 abgeleitete heterologe DNA-Vektorelement trug. Das Ergebnis aus der PCR-Analyse und den Hybridisierungsergebnissen war identisch (17). Insgesamt wurde von 10 aus 65 getesteten Tieren gefunden, dass sie hinsichtlich pS317 transgenisch waren.
  • Die Maus, von welcher identifiziert wurde, das Vektor-DNA-Element zu tragen (Gründertier), wurde dann gekreuzt, und der F1-Wurf wurde hinsichtlich des Transgens mittels der gleichen Verfahrensweisen analysiert.
  • Aus verschiedenen Geweben von pS317-transgenen Weibchen während der Laktation isolierte RNA ist durch Agarose-Formaldehyd-Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Membranen geblottet und mit 32P-markierter BSSL-cDNA als einer Sonde hybridisiert worden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass während der Laktation die Expression auf die Brustdrüse begrenzt ist (18).
  • Milchproben wurden aus dem betäubten Gründertier, welches zur Induktion der Laktation mit Oxytocin behandelt worden war, gesammelt und hinsichtlich des Vorliegens von rekombinanter menschlicher BSSL-Variante analysiert. Dies wurde durch SDS-PAGE, Transfer auf Nitrozellulosemembranen und Inkubation mit polyklonalen Antikörpern bewerkstelligt, welche gegen native humane BSSL erzeugt worden waren. Die erhaltenen Ergebnisse demonstrierten die Expression von rekombinanter humaner BSSL-Variante in Milch aus transgenen Mäusen. Die 19 verdeutlicht das Vorliegen von rekombinanter humaner BSSL-Variante in Milch aus transgenen Mäusen. SDS-PAGE-Trennung und Immunoblotting von Milchproben, welche aus verschiedenen pS317-transgenen Mäusen abgeleitet wurden, zeigen eine effiziente Produktion einer rekombinanten BSSL-Variante mit reduziertem scheinbaren Molekulargewicht im Vergleich zu rekombinanter Volllängen-BSSL, die aus der Milch einer Maus abgeleitet worden war, die hinsichtlich pS314 transgenisch war. Das Plasmid pS314 ist ähnlich zu pS317 mit der Ausnahme, dass pS314 menschliche Volllängen-BSSL-cDNA anstatt der genomischen Variante enthält. Die Doppelbande, welche in allen Mäusemilchproben offensichtlich ist, repräsentiert Maus-BSSL und zeigt daher die Kreuzreaktivität des Antiserums. Diese Folgerung wird ferner durch die Beobachtung unterstützt, dass diese Doppelbande in der Spur 9 von 19 offensichtlich ist, welche gereinigtes Maus-BSSL enthält.
  • Stabile Linien von transgenen Tieren werden erzeugt.
  • In einer ähnlichen Weise können andere transgene Tiere, wie Kaninchen, Kühe oder Schafe, welche zur Expression von menschlichen BSSL-Varianten in der Lage sind, hergestellt werden.
  • HINTERLEGUNGEN
  • Die folgenden Plasmide sind gemäß des Budapester Vertrags bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) hinterlegt worden:
    Figure 00310001
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1
    • A. Karte des BPV-basierenden Vektors, welcher für die Expression der verschiedenen BSSL-Varianten verwendet wurde.
    • B. Schematische Wiedergabe der verschiedenen analysierten BSSL-Varianten. FL bezeichnet die Volllängen-BSSL. Die aktive Stelle ist durch einen Kreis angegeben, und die Stelle für das potentielle N-verknüpfte Kohlenhydrat ist durch ein Dreieck gezeigt. Die Region, welche die Wiederholungseinheiten enthält, ist als eine gestreifte Fläche und der konservierte C-Terminus als eine ausgefüllte Fläche gezeigt.
  • 2 Southern-Blot-Analyse von DNA aus Zelllinien, welche BSSL-Varianten exprimieren. DNA, hergestellt aus Zelllinien, exprimierend Volllängen-BSSL (FL), Variante A (A), Variante B (B), Variante C (C) und Variante N (N), wurde analysiert. 5 μg der jeweiligen präparierten zellabgeleiteten DNA (links) und 1 ng gereinigte aus Bakterien abgeleitete Vektor-DNA (rechts) wurde mit BamHI verdaut. Die DNA-Proben wurden auf einem Agarosegel getrennt, auf 'GeneScreen Plus'-Membran überführt und mit 32P-markierter menschlicher BSSL-cDNA hybridisiert.
  • 3 Nohern-Blot-Analyse von RNA aus isolierten Zelllinien, welche rekombinante BSSL-Varianten exprimieren. 10 μg Gesamt-RNA, hergestellt aus Zelllinien, welche Volllängen-BSSL (FL), Variante A (A), Variante B (B), Variante C (C), Variante N (N) herstellen, wurden analysiert. RNA aus einer C127-Zelllinie, welche einen BPV-Vektor beinhaltet, identisch zu dem Vektor in 1 mit der Ausnahme, dass er ein zu BSSL nicht-verwandtes Protein codiert, wurde als Negativkontrolle (–) (obere Tafel) verwendet. Die Filter wurden mit 32P-markierter hybridisiert. Der Filter wurde dann mit einer Maus-β-ActincDNA-Sonde nochmals hybridisiert. Die β-Actin-mRNA-Signale (untere Tafeln) wurden als eine interne Kontrolle für die Mengen an RNA, welche auf jede Spur aufgetragen wurden, verwendet.
  • 4 Expression von BSSL-Aktivität in C127-Zellen, welche mit Volllängen- und mutierten Formen von humanem BSSL transfiziert worden waren. C127-Zellen wurden mit verschiedenen BSSL-Konstrukten transfiziert: Volllängen-BSSL (FL), Variante N (N), Variante C (C), Variante B (B), Variante A (A). Nach der anfänglichen Wachstumsperiode wurden individuelle Klone selektiert und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Anzahl an selektierten Klonen (n) ist in der Figur angegeben. Lipaseaktivität wurde auf den konditionierten Medien bestimmt. Die Werte sind als μmol freigesetzte freie Fettsäure × min–1 × ml konditioniertes Medium–1 ausgedrückt.
  • 5
    • A. Western-Blotting von Volllängen- und mutierier rekombinanter BSSL. Die Mengen an Lipaseaktivität, ausgedrückt als μmol freigesetzte Fettsäure × min–1, welche auf das Gel aufgetragen wurden, beliefen sich auf: Volllänge 0,2 (Spur 1), Variante N 0,16 (Spur 2), Variante C 0,6 (Spur 3), Variante B 0,8 (Spur 4) und native BSSL 0,1 (Spur 5). Das verwendete Antiserum wurde in Kaninchen gegen BSSL, welche aus menschlicher Milch gereinigt worden war, herangezogen. Die Position von Größen-Markern (vorgefärbte SDS-PAGE-Standards, 'Low Range', BioRad) sind auf der linken Seite angezeigt.
    • B. Western-Blot von mit N-Glycosidase F behandelter Variante B. Die Variante B wurde mit N-Glycosidase F verdaut, wie beschrieben in "Experimentelle Vorgehensweisen". Die Spur 1 zeigt unbehandelte und die Spur 2 behandelte Variante B.
  • 6 Gallensalzabhängigkeit von Volllängen- und mutierter BSSL. Die Lipase-Aktivität wurde in Gegenwart von variierenden Konzentrationen an Natriumcholat (durchgezogene Linien) oder Natriumdesoxycholat (unterbrochene Linien) auf konditionierten Medien von rekombinanter Volllängen-BSSL (*), Variante A (☐), Variante B
    Figure 00330001
    Variante C (∎), Variante N (•) und gereinigter menschlicher Milch-BSSL (o) bestimmt. Für die A-Variante wurde konditioniertes Medium auf Blue-Sepharose konzentriert, wie beschrieben unter "Experimentelle Vorgehensweisen". Die Menge der jeweiligen Enzymquelle wurde gewählt, um den gleichen Spiegel an Maximalaktivität zu erhalten, außer für Variante A, welche eine Maximalaktivität von lediglich einem Zehntel der anderen aufwies. Kontrollexperimente zeigten, dass die Wachstumsmedien den Spiegel an Aktivität oder die Gallensalz-Abhängigkeit von nativer BSSL nicht beeinflussten (Daten nicht gezeigt).
  • 7
    • A. Northern-Blot von BSSL, hergestellt durch verschiedene Stämme von E. coli unter Verwendung von pGEMEX. Die Bakterien wurden mittels IPTG induziert, wie beschrieben in "Experimentelle Vorgehensweisen". Die Experimentbedingungen waren, wie in der Legende zu 2 beschrieben, beschaffen. Spur 1: Stamm BL21(DE3)pLysS, nicht induziert; Spur 2: Stamm BL21(DE3)pLysS, induziert; Spur 3: Stamm JM109(DE3), nicht induziert; Spur 4: Stamm JM109(DE3), induziert.
    • B. Western-Blot, unter Verwendung von Antikörpern gegen gereinigte Milch-BSSL, von einer 8-18 % SDS-PAGE, welche die Expression von rekombinanter BSSL in verschiedenen Stämmen von E. coli unter Verwendung von pGEMEX zeigt. Die Bakterien wurden mit IPTG induziert, und zytoplasmatische und periplasmatische Proteine wurden aus dem Lysat präpariert, wie beschrieben in den experimentellen Vorgehensweisen. Die Mengen an Bakterienproteinen, aufgetragen in Spur 2-5 (periplasmatische Präparationen) und 7 – 10 (zytoplasmatische Präparationen), repräsentieren das gleiche Kulturvolumen, was die Färbung proportional zum Produktionsniveau sein lässt. Spur 1: Pharmacia-Molekular-Größenmarker: Spuren 2 und 8: Stamm JM109(DE3), induziert; Spuren 3 und 7: Stamm JM109(DE3), nicht induziert; Spuren 4 und 10: Stamm BL21(DE3)pLysS, induziert; Spuren 5 und 9: Stamm BL21(DE3)pLysS, nicht induziert; Spur 6: 25 ng gereinigte native Milch-BSSL.
  • 8 SDS-PAGE gereinigter rekombinanter BSSL und BSSL-Varianten. Rekombinante Volllängen-BSSL (FL) und BSSL-Varianten N, B und C wurden wie beschrieben gereinigt. Jeweils 3 μg, außer für Variante B, von welcher 1,5 μg verwendet wurden, wurden aufgetragen. 5 μg gereinigte native Milch-BSSL (NAT) wurde aufgetragen. Die Position der Größenmarker ist auf der linken Seite angezeigt.
  • 9 Effekt von Natriumdesoxycholat auf die Aktivierung von rekombinanter BSSL und BSSL-Varianten durch Natriumcholat. Gereinigte Präparationen von rekombinanter Volllängen-BSSL (•), rekombinanten BSSL-Varianten B (o), C (∎) und N
    Figure 00340001
    sowie gereinigter nativer Milch-BSSL (☐) wurden hinsichtlich Lipase-Aktivität bei verschiedenen Konzentrationen an Natriumcholat in Abwesenheit (linke Tafel) und in Gegenwart von 5 mM (mittlere Tafel) oder 10 mM (rechte Tafel) Desoxycholat geassayt.
  • 10 Stabilität rekombinanter BSSL und BSSL-Varianten bei unterschiedlichem pH-Wert. Native BSSL, rekombinante Volllängen-BSSL und BSSL-Varianten wurden bei 37 °C in unterschiedlichen Puffern mit pH 2 – 8 inkubiert. Alle Puffer enthielten 1 mg/ml Rinderserumalbumin. Nach 30 Minuten wurden Aliquots entnommen und hinsichtlich Lipase-Aktivität geassayt. Für die Erklärung der Symbole siehe die Legende zu 9.
  • 11 Wärmestabilität rekombinanter BSSL und BSSL-Varianten. Gereinigte rekombinante Volllängen-BSSL, BSSL-Varianten und native Milch-BSSL wurden bei den angegebenen Temperaturen in 50 mM Tris-Cl-Puffer, pH 7,5 inkuziert. Zu einem Satz von Proben wurde Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 mg/ml zugegeben. Nach 30 Minuten wurden Proben entnommen und hinsichtlich Lipase-Aktivität geassayt. Die Aktivitäten sind als Prozentsatz der Aktivität für jede Probe bei 0 Minuten ausgedrückt. Für die Erklärung von Symbolen siehe die Legende zu 9.
  • 12 Effekt von Gallensalzen auf die Inaktivierung rekombinanter BSSL- und BSSL-Varianten durch Trypsin. Gereinigte rekombinante Volllängen-BSSL, BSSL-Varianten und native Milch-BSSL (15 μl, enthaltend 1 – 4 μg) wurden zu 60 μl 1,0 M Tris-Cl, pH 7,4, mit 10 μg Trypsin (TPCK-Trypsin, Boehringer-Mannheim) bei 25 °C in Abwesenheit (unterbrochene Linien) und in Gegenwart (durchgezogene Linien) von 10 mM Natriumcholat zugegeben. An den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und hinsichtlich Lipase-Aktivität geassayt. Die Werte sind als Prozentsatz von Werten ausgedrückt, welche in Kontroll-Inkubationen in Abwesenheit von Trypsin erhalten wurden. Für eine Erklärung der Symbole siehe die Legende zu 9.
  • 13 Verfahren zur Herstellung des Plasmids pS317. Für weitere Details, siehe Abschnitt 3.1.
  • 14 Schematische Struktur des Plasmids pS312.
  • 15 Schematische Struktur des Plasmids pS317.
  • 16 Physikalische Karte, welche die physikalische Einführung einer humanen genomischen BSSL-Varianten-Struktur in das erste Exon des WAP-Gens, wie beschrieben in Abschnitt 3.1, repräsentiert.
  • 17
    • A. Schematische Wiedergabe der Lokalisierung von PCR-Primern, welche für die Identifizierung von transgenen Tieren verwendet wurden. Der 5'-Primer ist innerhalb der WAP-Sequenz positioniert, beginnend an der Position –148 bp stromaufwärts der Fusion zwischen dem WAP und der BSSL-Variante. Der 3'-Primer ist im ersten BSSL-Variante-Intron, endend 400 bp stromabwärts vom Fusionspunkt, lokalisiert.
    • B. Die Sequenzen der verwendeten PCR-Primer.
    • C. Agarosegel, welches eine typische Analyse der PCR-Analyse der potentiellen Gründertiere zeigt. M: Molekulargewichtsmarker. Spur 1: Kontroll-PCR-Produkt, erzeugt von dem Plasmid pS317. Spuren 2-13: PCR-Reaktionen, durchgeführt mit DNA-Präparationen aus potentiellen Gründertieren.
  • 18 Northern-Blot-Analyse von RNA, hergestellt aus verschiedenen Geweben, welche aus einer weiblichen Maus isoliert wurden, die hinsichtlich pS317 transgenisch ist. Die Gewebe wurden am Tag 4 der Laktation isoliert. 10 μg Gesamt-RNA aus jedem Gewebe wurden mittels Agarose-Formaldehyd-Trennung analysiert, auf Membranen überführt und mit 32P-markierter menschlicher BSSL-cDNA hybridisiert. Die Spuren enthalten Mg: Brustdrüse; Li: Leber; Ki: Niere; Sp: Milz; He: Herz; Lu: Lunge; Sg: Speicheldrüse; Br: Gehirn. RNA-Größen in Nukleotiden sind auf der linken Seite angegeben.
  • 19 Western-Blotting von Milch, welche aus pS317-transgenen Mäusen und Mäusen, welche hinsichtlich eines Volllängen-cDNA-Vektors pS314 transgenisch sind, und aus Kontrolltieren erhalten wurde. Die Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Immobilon-Filter überführt und mit Antiserum immunogeblottet, welches gegen native humane BSSL erzeugt worden war. Spur 1: Molekulargewichtmarker; Spuren 2, 3 und 4: 2 μl Milch aus drei F1-Töchtern (F1 30, 31 und 33) von pS317-Gründer F0 #91; Spur 5: 2 μl Milch aus pS314-Gründer #90. Spuren 6, 7 und 8: 2 μl Milch aus drei nicht-BSSL-transgenen Tieren; Spur 9: gereinigte Maus-BSSL; Spur 10: gereinigte humane native BSSL.
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  • SEQUENZAUFLISTUNG
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Claims (39)

  1. Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert mit gallensalzaktivierter, langkettiger triacylglycerolhydrolytischer Aktivität kodiert, welches Polypeptid eine BSSL-Variante ist, die kürzer ist als das native 722 Aminosäure-BSSL-Polypeptid in voller Länge, indem sie nur einen Teil der Aminosäuresequenz umfasst, die als Reste 536-722 in SEQ ID NO:3 gezeigt ist, und welche BSSL-Variante weniger als 16 Wiederholungseinheiten umfasst, wo der Ausdruck "Wiederholungseinheit" eine der Wiederholungseinheiten von 33 Nukleotiden bezeichnet, die einzeln in SEQ ID NO:1 in der Sequenzliste angegeben sind.
  2. Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert mit gallensalzaktivierter, langkettiger triacylglycerolhydrolytischer Aktivität kodiert, welches Polypeptid eine BSSL-Variante ist, welche alle der Aminosäuren 1-535 und einen Teil der Aminosäuresequenz, die als Reste 538-722 in SEQ ID NO:3 gezeigt ist, umfasst.
  3. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die betreffende BSSL-Variante einen Phenylalaninrest in dessen C-terminalen Position besitzt.
  4. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-3, worin die betreffende BSSL-Variante die Gln-Met-Pro-Sequenz in dessen C-terminalen Teil umfasst.
  5. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-4, worin die betreffende BSSL-Variante die Aminosäuresequenz, die als Reste 712-722 in SEQ ID NO:3 gezeigt ist, in dessen C-terminalen Teil, umfasst.
  6. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2, welches Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz mindestens 90% homolog ist mit der Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO:5, 6 oder 9 in der Sequenzliste gezeigt ist.
  7. Ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 6, welches Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:5, 6 oder 9 in der Sequenzliste gezeigt ist, umfasst.
  8. Ein Polypeptid, das als SEQ ID NO:5, 6, 7 oder 9 in der Sequenzliste gezeigt ist.
  9. Ein Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 kodiert wird.
  10. Ein Polypeptid gemäß Anspruch 8 oder 9, welches Polypeptid mindestens 90% rein ist.
  11. Ein Hybridgen, das ein Nukleinsäuremolekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 umfasst.
  12. Ein replizierbarer Expressionsvektor, der ein Hybridgen gemäß Anspruch 11 umfasst.
  13. Ein Vektor gemäß Anspruch 12, welcher Vektor der Rinderpapillomvirusvektor mit der DSM-Hinterlegungsnummer: 7501, 7502 oder 7497 ist.
  14. Eine Zelle, die ein Hybridgen gemäß Anspruch 11 enthält.
  15. Eine Zelle gemäß Anspruch 14, welche Zelle aus der murinen Zelllinie C127 oder aus E. coli stammt.
  16. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids, welches Verfahren folgendes umfasst: (i) Kultivieren einer Wirtszelle in oder auf einem Kulturmedium, in welche Wirtszelle ein Nukleinsäuremolekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 in ein Hybridgen eingeführt worden ist, welches Hybridgen imstande ist, in der spezifischen Wirtszelle zu replizieren, oder Identifizierung und Reproduktion eines Organismus, worin ein Nukleinsäuremolekül gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 in ein Hybridgen eingeführt worden ist, welches Hybridgen imstande ist, in dem spezifischen Organismus zu replizieren; (ii) Expression des Polypeptids; und (iii) Gewinnen des Polypeptids.
  17. Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, wo das Hybridgen den Rinderpapillomvirusvektor mit der DSM-Hinterlegungsnummer: 7501, 7502 oder 7497 umfasst.
  18. Ein Expressionssystem umfassend ein Hybridgen, das sich in einer Wirtszelle ausdrücken lässt oder ein Organismus, das das betreffende Hybridgen enthält, ausdrücken lässt, so dass ein rekombinantes Polypeptid bei der Expression des Hybridgens hergestellt wird, wobei das betreffende Hybridgen hergestellt wird durch Einführung einer Nukleinsäuresequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 in ein Gen, das imstande ist, die Expression des betreffenden Hybridgens zu vermitteln, wobei Menschen von dem betreffenden Expressionssystem ausgeschlossen sind.
  19. Ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers, das imstande ist, eine BSSL-Variante auszudrücken, umfassend (a) die Einführung eines Expressionssystems gemäß Anspruch 18 in ein fertilisiertes Ei oder eine Embryonzelle eines nicht-humanen Säugetiers, so dass das Expressionssystem in die Keimbahn des Säugetiers eingefügt werden kann, und (b) Entwicklung des resultierenden eingeführten fertilisierten Eies oder Embryons in ein erwachsenes weibliches nicht-humanes Säugetier.
  20. Ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-humanen Säugetiers, das imstande ist, eine BSSL-Variante auszudrücken, umfassend (a) Zerstörung der BSSL-ausdrückenden Fähigkeit des Säugetiers und Einführung eines Expressionssystems gemäß Anspruch 18 in die Keimbahn des Säugetiers in solch eine Weise, dass eine BSSL-Variante in dem Säugetier ausgedrückt wird; und/oder (b) Ersetzung des BSSL-Gens des Säugetiers oder eines Teils hiervon durch ein Expressionssystem gemäß Anspruch 18.
  21. Ein transgenes nicht-humanes Säugetier, das in seinem Genom eine DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 enthält.
  22. Ein transgenes nicht-humanes Säugetier gemäß Anspruch 21, in welchem die DNA-Sequenz in der Keimbahn des Säugetiers vorhanden ist,
  23. Ein transgenes nicht-humanes Säugetier gemäß Anspruch 21 oder 22, in welchem die DNA-Sequenz in dem Milchproteingen des Säugetiers vorhanden ist.
  24. Ein transgenes nicht-humanes Säugetier gemäß irgendeinem der Ansprüche 21-23, welches Säugetier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen, Schweinen und Rindern.
  25. Nachkommen eines transgenen nicht-humanen Säugetiers gemäß irgendeinem der Ansprüche 21-24, welches Nachkommen in seinem Genom eine DNA-Sequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 enthält.
  26. Milch gewonnen von einem transgenen nicht-humanen Säugetier gemäß irgendeinem der Ansprüche 21-25 umfassend ein Polypeptid, das von einer Nukleinsäuresequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 kodiert wird.
  27. Eine Zubereitung für Säuglinge umfassend Milch gemäß Anspruch 26.
  28. Eine Zubereitung für Säuglinge umfassend ein Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10.
  29. Ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung für Säuglinge durch Ergänzen einer Nahrungszubereitung für Säuglinge mit einem Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10.
  30. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 als eine Ergänzung für Nahrungszubereitung für Säuglinge.
  31. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10.
  32. Ein Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Verwendung in der Therapie.
  33. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von zystischer Fibrose.
  34. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von chronischer Pankreatitis.
  35. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Fett-Malabsorption.
  36. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Malabsorption von fettlöslichen Vitaminen.
  37. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Fett-Malabsorption aufgrund physiologischer Ursachen.
  38. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verbesserung der Ausnutzung von Nahrungslipiden.
  39. Anwendung eines Polypeptids gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verbesserung der Ausnutzung von Nahrungslipiden in Frühgeborenen.
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