HU221119B1 - Variants of bile salt-stimulated lipase, dna molecules encoding them, and transgenic nonhuman mammals - Google Patents

Variants of bile salt-stimulated lipase, dna molecules encoding them, and transgenic nonhuman mammals Download PDF

Info

Publication number
HU221119B1
HU221119B1 HU9502561A HU9502561A HU221119B1 HU 221119 B1 HU221119 B1 HU 221119B1 HU 9502561 A HU9502561 A HU 9502561A HU 9502561 A HU9502561 A HU 9502561A HU 221119 B1 HU221119 B1 HU 221119B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
bssl
pro
gly
thr
leu
Prior art date
Application number
HU9502561A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9502561D0 (en
HUT73398A (en
Inventor
Lars Blaeckberg
Michael Edlund
Lennart Hansson
Olle Hernell
Lennart Lundberg
Mats Stroemqvist
Jan Toernell
Original Assignee
Astra Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9300686A external-priority patent/SE9300686D0/xx
Priority claimed from SE9300722A external-priority patent/SE9300722D0/xx
Application filed by Astra Ab filed Critical Astra Ab
Publication of HU9502561D0 publication Critical patent/HU9502561D0/hu
Publication of HUT73398A publication Critical patent/HUT73398A/hu
Publication of HU221119B1 publication Critical patent/HU221119B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/20—Dietetic milk products not covered by groups A23C9/12 - A23C9/18
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/19—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

A találmány olyan, új polipeptidekre vonatkozik, amelyek az epesóáltal stimulált lipázok (BSSL; EC 3.1.1.1.) va- riánsai. A találmánykiterjed a polipeptideket kódoló DNS-molekulákra, valamint a DNS-molekulákat tartalmazó altermékekre is. A találmány tárgyát képeziktovábbá a BSSL-variánsok előállítási eljárásai és a BSSL-variánsokexpresszálására alkalmas transzgenikus nem humán emlősök előállításieljárásai. Ezenkívül a találmány magában foglalja az ilyentranszgenikus állatokat, valamint az ezekből az állatokból nyert tejettartalmazó tejkészítményeket (csecsemőtápszereket). A találmánykiterjed a polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítményekre is. ŕ

Description

A találmány olyan, új polipeptidekre vonatkozik, amelyek az epesó által stimulált lipázok (BSSL; EC 3.1.1.1.) variánsai. A találmány kiterjed a polipeptideket kódoló DNS-molekulákra, valamint a DNS-molekulákat tartalmazó altermékekre is. A találmány tárgyát képezik továbbá a BSSL-variánsok előállítási eljárásai és a BSSL-variánsok expresszálására alkalmas transzgenikus nem humán emlősök előállítási eljárásai. Ezenkívül a találmány magában foglalja az ilyen transzgenikus állatokat, valamint az ezekből az állatokból nyert tejet tartalmazó tej készítményeket (csecsemőtápszereket). A találmány kiterjed a polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítményekre is.
HU 221 119 B1
A leírás terjedelme 64 oldal (ezen belül 14 lap ábra)
HU 221 119 Β1
A találmány olyan, új polipeptidekre vonatkozik, amelyek az epesó által stimulált lipázok (Bile SaltStimulated Lipase, BSSL; EC 3.1.1.1.) variánsai. A találmány kiterjed a polipeptideket kódoló DNSmolekulákra, valamint a DNS-molekulákat tartalmazó altermékekre (szubproduktumokra) is. A találmány tárgyát képezik továbbá a BSSL-variánsok előállítási eljárásai és a BSSL-variánsok kifejezésére (expresszálására) alkalmas transzgenikus nem humán emlősök előállítási eljárásai. Ezenkívül a találmány magában foglalja az ilyen transzgenikus állatokat, valamint az ezekből az állatokból nyert tejből álló tej készítményeket (csecsemőtápszereket). A találmány kiterjed a polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítményekre, valamint a polipeptideknek és a DNS-molekuláknak gyógyszerek előállításában történő felhasználására is.
A tápláléklipidek hidrolízise
A tápláléklipidek igen jelentős energiaforrások. A magas energiatartalmú triacil-glicerinek több mint 95%-át ezek a lipidek alkotják. Néhány lipid, például bizonyos zsírsavak és a zsíroldékony vitaminok esszenciális tápanyagkomponensek. A gasztrointesztinális abszorpció előtt a triacil-glicerinekben, valamint a kisebb részarányú komponensekben, azaz az észteresített zsíroldékony vitaminokban és koleszterinben, illetve a diacil-foszfatidil-glicerínekben az észterkötéseket hidrolizálni kell annak érdekében, hogy kevésbé hidrofób, abszorbeálható termékek képződjenek. Ezeket a hidrolízisreakciókat egy specifikus enzimcsoport tagjai, az úgynevezett lipázok katalizálják.
A humán szervezet esszenciális lipázai a következő enzimeket foglalják magukban: gyomorlipáz, hasnyálmirigy kolipázfüggő lipáz (tri- és diacil-glicerinek hidrolízise), hasnyálmirigy-foszfolipáz A2(diacil-foszfatidil-glicerinek hidrolízise), valamint karboxil-észter-hidroláz (Carboxylic Ester Hydrolase, CÉH), (koleszterilés zsíroldékony vitaminészterek, továbbá tri-, di- és monoacil-glicerinek hidrolízise). Az anyatejjel táplált újszülöttekben a fentiekben említett lipidek közül többnek a hidrolízisében az epesóstimulált lipáznak (BSSL) esszenciális szerepe van. A lipidemésztés termékei az epesókkal együttesen vegyes micellákat vagy egylemezes vesiculákat alkotnak [Hernell, O. et al., Biochemistry, 29, 2041-2056 (1990)], és az abszorpció ezekből történik meg.
Az epesóstimulált lipáz
Az epesóstimulált lipáz (BSSL) korlátozott számú fajban, például emberekben, gorillákban, macskákban és kutyákban a tej egyik alkotórésze [Hernell, O. et al., Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E. ed.), Raven Press, New York, pp. 209-217 (1989); és Hamosh, M. et al., Fed. Proc., 45, 1452 (1986)]. Amikor a felső vékonybél tartalma összekeveredik az epével, a primer epesók specifikusan aktiválják a BSSL-t [Hernell, O., Eur. J. Clin. Invest., 5, 267-272 (1975)]. A tej teljes proteintartalmának hozzávetőleg 1%-át kitevő BSSL [Blackberg, L. and Hernell, 0., Eur. J. Biochem., 116, 221-225 (1981)] nem degradálódik akkor, amikor a tej keresztülhalad a gyomron, és a nyombéltartalomban az epesók védik meg a BSSL-t attól, hogy a hasnyálmirigy-proteázok, például a tripszin és a kimotripszin inaktiválják.
Az emberi tej hőkezelése (62,5 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül végzett pasztörizálása), ami a BSSL-t teljes mértékben inaktiválja [Björksten, B. et al, Br. Med. J., 201, 267-272 (1980)], koraszülöttekben hozzávetőleg 1/3-dal csökkenti a zsírabszorpciós koefficiens értékét [Williamson, S. et al, Arch. Dis. Childhood, 53, 555-563 (1978); és Atkinson, S. A. et al., J. Pediatr., 99, 617-624 (1981)]. A BSSL-lel függ össze, hogy a friss, humán anyatejben lévő triacilglicerin lényegesen jobban hasznosítható a szervezetben, mint a hasonló zsírösszetételű csecsemőtápszerekben lévő triacil-glicerin [Hernell, O. and Blackberg, L., Encyclopedia of humán biology (Dulbecco, R. ed.), Academic Press, San Diego, Vol. 3, pp. 47-56 (1991); és Chappell, J. E. et al., J. Pediatr., 108, 439-447 (1986)].
A BSSL egy nem specifikus lipáz (EC 3.1.1.1.), amely nemcsak a triacil-glicerint, hanem a di- és monoacil-glicerint, a koleszterilésztereket, valamint a zsíroldékony vitaminésztereket is hidrolizálja [Blackberg, L. and Hernell, O., FEBS Lett., 157, 337-341 (1983)]. Aktiválás után a BSSL önmagában is képes a humán tej legtöbb lipidjének hidrolízisére, bár az emberi anyatej triacil-glicerinjének leghatékonyabb felhasználásához szükség van a gyomorlipáz (EC 3.1.1.3.), a kolipázfüggő hasnyálmirigylipáz (EC 3.1.1.3.) és a BSSL szinergetikus kölcsönhatására [Bembáck, S. et al, J. Clin. Invest., 85, 1221-1226(1990)].
Az utóbbi időben végzett vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy az újszülött csecsemők esetén a tej enzimnek különösen nagy jelentősége van a hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavak hasznosításában [Hernell, O. et al, Pediatr. Gastroenterol. Nutr., megjelenés alatt (1993)]. Ezek a zsírsavak az ejkozanoidok fontos prekurzorai, és jelentősek az idegfejlődés szempontjából is. Az újszülött csecsemők, különösen a koraszülöttek, csak korlátozott mértékben képesek ezeknek a zsírsavaknak a prekurzoraikból történő szintézisére. Ugyanakkor ezek a zsírsavak a születés után bizonyos (ma még pontosan nem meghatározott) ideig esszenciálisak.
A közelmúltban több, egymástól független laboratóriumban vizsgálták a tejlipázból és a hasnyálmirigy karboxil-észter-hidrolázból (CÉH) (EC 3.1.1.1.) származó cDNS-szerkezeteket [Baba, T. et al., Biochemistry, 30, 500-510 (1991); Hűi, D. and Kissel, J. A., FEBS Lett., 276, 131-134 (1990); Nilsson, J. et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990); és Reue, K. et al., J. Lipid Rés., 32 267-276 (1991)]. Ezeknek a vizsgálatoknak az egybehangzó következtetése az, hogy a tejenzim és a hasnyálmirigyenzim ugyanannak a génnek a terméke. A BSSL/CEH gén cDNS-szekvenciáját és származtatott aminosavszekvenciáját (1. számú szekvencia) a WO 91/15234 és a WO 91/18923 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben is leírják.
A BSSL egyláncú glikoprotein. A származtatott protein (3. számú szekvencia) 722 aminosavcsoportot tartalmaz és nagymértékben glikozilezett [Abouakil, N. et
HU 221 119 Β1 al., Biochim. Biophys. Acta, 1002, 225-230 (1989)]. A protein iV-terminális fele szembetűnő homológiát mutat az acetil-kolin-észterázzal és néhány további észterázzal [Nilsson, J. et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990)]·
Egy kísérleti aktívhely-szerincsoport a szerin-194nél helyezkedik el. Ezt a szerint körülvevő szekvencia megegyezik a szerin-hidrolázok aktív helyének szekvenciájával. Az egyetlen kísérleti TV-glikozilezési hely a szerin-aktívhely A-terminálisától csak hét csoportnyi távolságban helyezkedik el [Nilsson, J. et al, Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990)].
A BSSL-szekvencia a C-terminális részében 11 aminosavcsoport prolinban gazdag 16 ismétlődését tartalmazza. Feltehetően az ismétlődések számának variációja adja a különböző fajokból származó megfelelő enzimek közötti eltérő molekulaméretek és aminosavösszetételek elsődleges magyarázatát [Han, J. H. et al., Biochemistry, 26, 1617-1625 (1987); Fontain, R. et al., Biochemistry, 30, 7008-1014 (1991); és Kyger, E. M. et al, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 164, 1302-1309 (1989)]. Ezek az ismétlődések hordozzák a protein 15-20%-át kitevő szénhidrát legnagyobb részét [Baba, T. et al, Biochemistry, 30, 500-510 (1991); és Abouakil, N. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1002, 225-230 (1989)].
A BSSL és a tipikus észterázok közötti egyetlen eltérés a polipeptidlánc C-terminális részében, azaz a 11 aminosavcsoport 16 prolinban gazdag ismétlődésében található. A szarvasmarhából és a patkányból származó megfelelő hasnyálmirigyenzimek - az előbbi sorrendnek megfelelően - csak 3, illetve 4 ismétlődéssel rendelkeznek [Han, J. H. et al., Biochemistry, 26, 1617-1625 (1987); és Kyger, E. M. et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 164, 1302-1309 (1989)]. Az egyik valószínűsíthető hipotézis értelmében a Cterminális rész vagy ennek legalább egy része nélkülözhetetlen a lipázaktivitáshoz, azaz az emulgeált hosszú láncú triacil-glicerinnel szembeni aktivitáshoz.
Lipidfelszívódási zavar
A lipidfelszívódás zavarának és így az alultápláltságnak az egyik leggyakoribb okát a hasnyálmirigy kolipázfuggő lipáz és/vagy az epesók csökkent intraluminális mennyisége jelenti. Az ilyen lipázhiány jellegzetes példái közé tartoznak a cysticus fibrosisban és a krónikus pancreatitisben szenvedő betegek; a cysticus fibrosis gyakori genetikus rendellenesség, ami egész életen át tartó hiányt okoz a betegek 80%-ának esetében, míg a krónikus pancreatitis gyakran a krónikus alkoholizmus következménye.
A hasnyálmirigylipáz-hiányos betegek jelenlegi kezelése sertés-hasnyálmirigyenzimek nyerspreparátumának igen nagy dózisokban történő orális beadásából áll. Ugyanakkor azonban a kolipázfüggő hasnyálmirigylipáz a gyomorban uralkodó alacsony pH hatására inaktiválódik. Ez a hatás nem küzdhető le teljes mértékben az enzim rendkívül nagy dózisainak alkalmazásával. Emiatt a beadott nagy dózisok a legtöbb beteg esetén nem nyújtanak megfelelő eredményt, ráadásul a preparátumok szennyezettek és kellemetlen ízűek.
A korábbiakban megfelelő formálási módszerek alkalmazásával már előállítottak olyan tablettákat, amelyek átjutnak a gyomor savas régióin, és az enzimet csak az éhbél (jejunum) viszonylag lúgos környezetében szabadítják fel. Ugyanakkor azonban a hasnyálmirigy-rendellenességekben szenvedő betegek közül sok abnormálisán savas éhbéllel rendelkezik, és az ilyen esetekben a tabletták nem tudják szabaddá tenni az enzimet.
Ezen túlmenően, mivel a jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő preparátumok nem humán forrásból származnak, jelentős az olyan immunreakciók kockázata, amelyek káros hatásokat fejthetnek ki a betegekre, illetve amelyek a terápiás hatékonyság csökkenését eredményezik. A jelenleg alkalmazott preparátumoknak egy további hátránya az, hogy a preparátumoknak a kolipázfüggő lipázétól eltérő egyéb lipolitikus aktivitásai nincsenek megállapítva. Ténylegesen a legtöbb ilyen preparátum csak igen csekély BSSL/CEH aktivitással rendelkezik. Ez lehet az egyik oka annak, hogy sok, cysticus fibrosisban szenvedő beteg a kiegészítő terápia ellenére a zsíroldékony vitaminok és az esszenciális zsírsavak hiányában szenved.
A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy igen nagy igény van olyan termékekre, amelyek a humán lipázokból származó tulajdonságokkal és szerkezettel, valamint széles szubsztrátspecifitással rendelkeznek, valamint amely termékek orálisan beadhatók a hasnyálmirigyenzimek egy vagy több tagjának hiányában szenvedő betegeknek. A jelen találmány alkalmazásával előállítható termékek önmagukban vagy más lipázokat tartalmazó preparátumokkal kombinálva teljes mértékben kielégítik a fenti igényt.
A találmány szerinti rekombináns BSSL-variánsoknak megmaradt a katalitikus aktivitásuk, de kevesebb glikozilezési helyet tartalmaznak, mint a teljes hosszúságú BSSL, és így lényegesen kisebb fokú szénhidrát-heterogenitással állíthatók elő. A kevésbé bonyolult molekulaszerkezet könnyebbé teszi a tisztítást és a rekombináns protein jellemzését, ami a BSSLaktivitással rendelkező polipeptidek gazdaságosabb előállítását eredményezi.
Más szempontból a csökkent mértékű glikozilezés kisebb megterhelést jelent a befogadószervezet számára, és számos gazdasejtben nagyobb termelékenységet tesz lehetővé. Ezenkívül a BSSL-variánsban lévő glikozilezési helyek kisebb száma hatékony termelést tesz lehetővé az alacsonyabb rendű eukariótákban, és csökkenti az esetleg immunreakciókat okozó abnormális glikozilezés tényleges veszélyét. A kisebb méret és a kevésbé bonyolult glikozilezés maga után vonja azt is, hogy a gazdaszervezet szélesebb tartományból választható ki, mint egy nagyon komplex és nagy tömegű szénhidrátcsoportokkal rendelkező protein esetén.
Egy kisebb méretű, de azonos aktivitású BSSL-variáns gyógyászati alkalmazása során a kiegészítéséhez szükséges anyag tömege is kisebb. Egy rekombináns BSSL-variánssal elérhető további lehetséges előnyt jelent az, hogy az O-glikozilezett ismétlődések legnagyobb részének vagy egészének hiánya csökkenti a be3
HU 221 119 Β1 fogadó egyedben kialakuló immunválasz kockázatát. Ez annak tulajdonítható, hogy az O-kötésű cukor, attól a sejttől függően, amelyben termelődik, rendkívül heterogén lehet.
A szakirodalomban utalás történik arra, hogy a natív BSSL az intesztinális mukózához kötődik, illetve a natív BSSL-t az intesztinális mukóza veszi fel. Egy olyan BSSL-variáns, amely a redukált felvétel szempontjából kerül kiválasztásra, a táplálék lipidszubsztrátokon hosszabb időtartamban lesz aktív, és így hatékonyabb intraluminális emésztést tesz lehetővé. Az ilyen variánsok példái közé azok a molekulák tartoznak, amelyek kevésbé glikozilezettek.
Amint azt a fentiekben már említettük, Hemell szerint a BSSL-nek különösen nagy jelentősége van az Avitaminnak, valamint azoknak a hosszú láncú, többszörösen telítetlen zsírsavaknak a hasznosításában [Hemell, O. et al., Pediatr. Gastroenterol. Nutr., megjelenés alatt (1993)], amelyek igen fontosak az újszülöttek idegfejlődésének szempontjából. Az ilyen értelemben hatékonyabb, találmány szerinti BSSL-variánsokat ismert módszerekkel választhatjuk ki. Egy megcsonkított vagy megrövidített enzim feltehetően eltérő konformációval rendelkezik; az eltérő konformáció befolyásolhatja a különböző lipidszubsztrátokkal szembeni specifitást.
A találmány egyrészt egy olyan polipeptidet kódoló nukleinsavmolekulára vonatkozik, amely polipeptid egy 722 aminosavnál rövidebb BSSL-variáns, és a BSSL-variáns a 3. számú szekvenciában 536-722 csoportokként látható aminosavszekvencia egy részéből áll.
Az „aminosavszekvencia egy része” kifejezés magában foglalja a különféle aminosavból álló szekvenciákat, illetve az ilyen szekvenciák kombinációit.
A „BSSL-variáns” kifejezés egy olyan polipeptidet jelent, amelynek BSSL-aktivitása van, és amely a Szekvenciák jegyzékében található 3. számú szekvenciának megfelelő humán BSSL aminosavszekvenciájának egy részét tartalmazza.
A „BSSL-aktivitással rendelkező polipeptid” kifejezés egy olyan polipeptidet jelent, amely legalább a következő jellemzőkkel rendelkezik:
(a) alkalmas orális beadásra;
(b) specifikus epesók által aktivált;
(c) a vékonybelek tartalmában nem specifikus lipázként működik, azaz képes a lipideket azok kémiai szerkezetétől és fizikai (emulgeált, micelláris, oldott) állapotától viszonylag függetlenül hidrolizálni;
és amely adott esetben egy vagy több alábbi tulajdonsággal is bír:
(d) képes a különféle lánchosszúságú és eltérő mértékben telítetlen zsírsavakkal alkotott triacil-glicerineket hidrolizálni;
(e) képes a diacil-glicerint, monoacil-glicerint, koleszteril-észtereket, lizofoszfatidil-acil-glicerint, valamint a retinil- és egyéb zsíroldékony vitaminésztereket is hidrolizálni;
(f) egy triacil-glicerinben nemcsak az sn-l(3) észterkötéseket, hanem az sn-2 észterkötéseket is képes hidrolizálni;
(g) nemcsak a primer, hanem a szekunder epesókkal is képes kölcsönhatásba lépni;
(h) optimális aktivitása az epesóktól függő;
(i) stabil olyan értelemben, hogy a gyomortartalom nem befolyásolja jelentős mértékben a katalitikus aktivitását;
(j) epesavak jelenlétében stabil a hasnyálmirigy-proteázok, például a tripszin által okozott inaktiválódással szemben;
(k) képes heparinhoz és heparinszármazékokhoz, például heparán-szulfáthoz kötődni;
(l) képes lipid-víz fázishatárokhoz kötődni;
(m) elég stabil ahhoz, hogy liofilizálni lehessen;
(n) élelmiszer-összetevőkkel, például a humán tejben vagy a mesterséges tejkészítményekben előforduló komponensekkel történő összekeveréskor stabil.
A találmány kiterjed továbbá egy olyan, a fentiek szerinti nukleinsavmolekulára is, amelyben az említett BSSL-variáns a C-terminális helyzetében egy fenil-alanin-csoporttal rendelkezik, vagy a C-terminális részében Gln-Met-Pro szekvenciát tartalmaz, illetve alternatív módon a C-terminális részében a 3. számú szekvencia 712-722 csoportjaiként feltüntetett aminosavszekvenciát tartalmazza.
Ebben az összefüggésben a „C-terminális helyzet” kifejezés az utolsó C-terminális csoport helyzetére utal, míg a „ C-terminális rész” kifejezés a BSSL-variáns Cterminális végét alkotó mintegy 50 aminosavcsoportra vonatkozik.
A találmány kiterjed ezenkívül egy olyan, a fentiek szerinti nukleinsavmolekulára is, amelyben az említett BSSL-variáns 16-nál kevesebb ismétlődő egységből áll. Ebben az összefüggésben az „ismétlődő egység” kifejezés a Szekvenciák jegyzékében található 1. számú szekvenciában feltüntetett 33 nukleotid ismétlődő egységeinek egyikét jelenti.
A találmány magában foglal továbbá egy olyan polipeptidet kódoló, a fentiek szerinti nukleinsavmolekulát is, amely polipeptid aminosavszekvenciája legalább 90%-ban homológ a Szekvenciák jegyzékében lévő 5., 6. vagy 9. számú szekvenciával, valamint egy olyan polipeptidet kódoló, a fentiek szerinti nukleinsavmolekulát is, amely polipeptid aminosavszekvenciája legalább 90%-ban homológ a Szekvenciák jegyzékében található 7. számú szekvenciával, kivéve azokat a nukleinsavmolekulákat, amelyek a 187 helyzetben aszparagincsoporttal rendelkező polipeptideket kódolnak.
A találmány kiterjed továbbá a Szekvenciák jegyzékében 5., 6., 7. vagy 9. szekvenciaként feltüntetett polipeptidre, valamint egy, a fentiek szerinti nukleinsavszekvencia által kódolt polipeptidre is.
A találmány kiteljed még egy fentiek szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó hibrid génre, egy ilyen hibrid gént tartalmazó replikálható expressziós vektorra, valamint egy ilyen hibrid gént magában foglaló sejtre is. Ez a sejt például egy prokarióta sejt, egy egysejtű eukarióta organizmus vagy egy többsejtű nem humán organizmusból, például egy nem humán emlősből származó sejt lehet.
HU 221 119B1
Ebben az összefüggésben a „hibrid gén” kifejezés egy olyan nukleinsavszekvenciára vonatkozik, amely egyrészt egy, a fentiekben meghatározott BSSL-variánst kódoló nukleinsavszekvenciát, másrészt egy olyan nukleinsavszekvenciát tartalmaz, amely a hibrid gén termékének expresszióját közvetíteni (mediálni) képes gén nukleinsavszekvenciája. A „gén” megfogalmazás egyaránt magában foglalja az egész gént, illetve ennek egy olyan szekvenciáját, amely alkalmas a hibrid gén expressziójának mediálására és a kérdéses szövetbe történő irányítására (targetálására). Szokásosan ez a szekvencia legalább egy vagy több promoterrégiót, transzkripciós starthelyet, 3’ és 5’ nemkódoló régiót és szerkezeti szekvenciákat foglal magában.
A hibrid gént előnyösen a BSSL-variánst kódoló nukleinsavszekvenciának az expressziót mediálni képes génbe in vivő, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával végzett inszerciójával alakíthatjuk ki. Alternatív módon a BSSL-variánst kódoló nukleinsavszekvenciát in vivő homológ rekombináció útján is inszertálhatjuk.
Ebben az összefüggésben a „replikálható” kifejezés azt jelenti, hogy a vektor egy adott típusú gazdasejtben (amelybe a vektor előzetesen bevezetésre került) képes a replikációra. Közvetlenül a nukleinsavszekvencia felső részénél elhelyezkedhet egy szignálpeptidet kódoló szekvencia, amelynek jelenléte biztosítja a vektort magában foglaló gazdasejtek által expresszált BSSL-variáns szekréciója. A szignálszekvencia a nukleinsavszekvenciával természetes módon kapcsolódó, illetve más eredetű is lehet.
A vektor bármely olyan vektor lehet, amely rekombináns DNS-eljárásokkal egyszerűen kezelhető; a vektor kiválasztása leggyakrabban attól a gazdasejttől függ, amelybe a vektort be kívánjuk vezetni. Ennek megfelelően a vektor lehet például egy autonóm módon replikáló vektor, azaz egy olyan vektor, amely egy extrakromoszomális egységként létezik és amelynek replikációja független a kromoszomális replikációtól; ilyen vektor lehet például egy plazmid, fág, kozmid, minikromoszóma vagy vírus. Alternatív módon a vektor olyan is lehet, amely a gazdasejtbe történő bevezetéskor a gazdasejtgenomba integrálódik és azzal a kromoszómával, illetve azokkal a kromoszómákkal együtt replikálódik, amelybe vagy amelyekbe előzetesen beépült. Alkalmas vektor lehet például egy bakteriális expressziós vektor vagy egy élesztőexpressziós vektor. A találmány szerinti vektor a fentiekben meghatározott találmány szerinti nukleinsavszekvenciák bármelyikét hordozhatja.
A találmány további tárgyát képezi egy eljárás rekombináns polipeptid előállítására, amelynek során (i) egy fentiek szerinti nukleinsavmolekulát inszertálunk egy olyan hibrid génbe, amely egy specifikus gazdasejtben vagy nem humán organizmusban replikációra képes; (ii) a kapott rekombináns hibrid gént bevezetjük egy gazdasejtbe vagy nem humán organizmusba; (iii) a polipeptid expressziója érdekében a kapott sejtet tenyésztőközegben vagy tenyésztőközegen növesztjük, vagy egy nem humán organizmust azonosítunk és reprodukálunk; és (iv) az expresszálódott polipeptidet kinyerjük.
A sejttenyésztéshez alkalmazott közeg bármely szokásos, ilyen célra alkalmas médium lehet. Alkalmas vektor lehet a fentiekben ismertetett vektorok bármelyike, és megfelelő gazdasejt lehet a fentiekben felsorolt sejttípusok bármelyike. A vektor összeállításához és a vektornak a gazdasejtbe történő bevezetéséhez alkalmazott eljárásokat a rekombináns DNS-ek esetén ismert, ilyen célra szokásosan használt módszerek közül tetszés szerint választhatjuk meg. A sejtek által expresszált rekombináns humán BSSL-variáns a sejt típusától és a vektor összetételétől függően kiválasztódhat (szekretálódhat), azaz keresztüljuthat a sejtmembránon.
Amennyiben a BSSL-variánst a rekombináns gazda intracelluláris módon termeli, a BSSL-variánst a sejt nem választja ki; ebben az esetben a BSSL-variáns kinyerését valamely standard eljárás alkalmazásával nyerjük ki, amelynek során a sejteket mechanikus eszközökkel, például nagyfrekvenciás hanghullámokkal végzett kezeléssel (szonikálással) vagy homogenizálással, illetve enzimatikus úton kémiai úton elroncsoljuk, majd a kívánt terméket tisztítjuk.
A kiválasztás (szekréció) érdekében a BSSL-variánst kódoló DNS-szekvenciát meg kell előznie egy szignálpeptidet kódoló szekvenciának, amelynek jelenléte biztosítja a BSSL-variánsnak a sejtből oly módon történő kiválasztódását, amelynek eredményeként az expresszált BSSL-variáns legalább egy jelentős része a tenyésztőközegbe szekretálódik, ahonnan a BSSL-variáns már kinyerhető.
A találmány magában foglal egy olyan hibrid gént tartalmazó expressziós rendszert is, amely hibrid gén egy, a hibrid gént magában foglaló gazdasejtben vagy nem humán organizmusban oly módon expresszálható, hogy a hibrid gén expresszálódásakor egy rekombináns polipeptid termelődik, és amely hibrid gént úgy állítjuk elő, hogy egy fentiek szerinti nukleinsavszekvenciát egy olyan génbe inszertáljuk, amely gén alkalmas a hibrid gén expressziójának közvetítésére.
A találmány szerinti rekombináns BSSL-variánsok egyik lehetséges előállítási eljárása során olyan, transzgenikus nem humán emlősöket alkalmazunk, amelyek képesek a BSSL-variánst a tejükbe kiválasztani. A transzgenikus nem humán emlősök alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy ezeknek az állatoknak a felhasználásával a rekombináns BSSL-variánst elfogadható költségek mellett nagy mennyiségekben tudjuk előállítani, különösen, ha a nem humán emlős tehén; további előnyt jelent, hogy a rekombináns BSSL-variáns olyan tejben képződik, ami például a gyermektápszerek szokásos összetevője, és így nincs szükség igen alapos tisztításra abban az esetben, amikor a rekombináns BSSLvariánst tejalapú termékekben tápanyag-kiegészítőként kívánjuk felhasználni.
Ezen túlmenően a magasabb rendű szervezetekben, például egy nem humán emlősben történő termelés az emlősprotein korrekt kialakulását eredményezi, különös tekintettel a fentiekben tárgyalt transzláció utáni folyamatra, illetve biztosítja a folyamat megfelelő lezárását.
HU 221 119 Β1
Az előbbieken kívül ily módon lényegében tiszta BSSLvariánst lehet nagy mennyiségekben előállítani.
A fentiekben tárgyalt expressziós rendszer egy olyan emlős expressziós rendszer lehet, amely egy nem humán emlős tejproteinjét kódoló génbe inszertált BSSL-variánst kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és így egy olyan hibrid gént képez, amely a hibrid gént magában foglaló emlős kifejlett nőstényének emlőjében expresszálódhat.
Az emlő mint expressziós szövet és a tejproteineket kódoló gének különösen alkalmasak transzgenikus nem humán emlősökben heterológ proteinek termelésére történő felhasználásra, mivel az emlőben a tejproteinek nagy expressziós mennyiségekben természetes úton képződnek. A tej emellett könnyen összegyűjthető és nagy mennyiségekben hozzáférhető. Ebben az összefüggésben a tejproteingéneknek egy rekombináns BSSL-variáns előállításában történő felhasználása azzal a további előnnyel is együtt jár, hogy a BSSLvariáns az expressziós szabályozásnak és a termelés helyének (az emlő) a szempontjából a természetes termelés körülményeihez hasonló körülmények között képződik.
Amennyiben egy transzgenikus emlőst alkalmazunk, a fentiekben hivatkozott hibrid gén előnyösen egy szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz, és így alkalmas a hibrid gén termékének az emlőbe történő kiválasztására (szekretálására). A szignálpeptid jellegzetesen egy olyan szignálpeptid, ami szokásosan megtalálható a kérdéses tejproteingénben, illetve egy olyan szignálpeptid, ami a BSSL-variánst kódoló DNSszekvenciához kapcsolódik. Ugyanakkor azonban más olyan szignálszekvenciák is alkalmasak, amelyek képesek a hibrid gén termékének az emlőbe történő szekrécióját közvetíteni (mediálni). Természetesen a hibrid gén különféle elemeit úgy kell összeállítani, hogy a hibrid gén alkalmas legyen a korrekt expresszióra és a géntermék megfelelő felépítésére. Általában a kiválasztott szignálpeptidet kódoló DNS-szekvenciának pontosan össze kell épülnie a BSSL-variánst kódoló DNS-szekvencia A-terminális részével. A hibrid génben a BSSLvariánst kódoló DNS-szekvencia szokásosan tartalmazza a stopkodonját, viszont nem tartalmazza a saját tisztázó üzenetét (message cleavance) és poliadenilezési helyét. A BSSL-variánst kódoló DNS-szekvencia mögött a tejproteingén mRNS érési (processing) szekvenciája normálisan visszamarad.
Egy egyedi hibrid gén aktuális expressziós szintjét számos tényező befolyásolja. Az elért expressziós szintért felelős létfontosságú tényezők közé tartoznak egyebek mellett - például a következők: a promoternek, valamint más, a fentiekben említett szabályozószekvenciáknak a teljesítőképessége, a BSSL-variánst kódoló DNS-szekvenciának a tejproteint kódoló génben lévő integrációs helye, a transzkripció utáni szabályozást biztosító elemek és más hasonló faktorok. A hibrid gén expressziós szintjét befolyásoló különféle tényezők ismeretében az ezen a területen jártas szakember tudja, hogy hogyan kell a jelen célokra felhasználható expressziós rendszereket megtervezni.
Az alkalmazandó tejproteingén származhat ugyanazokból a fajokból, mint amelyekbe az expressziós rendszert inszertálni kívánjuk, illetve más fajokból is származhat. Ezzel összefüggésben a korábbiakban már bemutatták, hogy azok a szabályozóelemek, amelyek a génexpressziót az emlőbe irányítják, fünkcionálisan átlépik a fajok közötti határokat; ez a jellemző egy lehetséges közös ősnek tulajdonítható [Hennighausen, L. et al., Current Opinion in Biotechnology, 1, 74-78 (1990)].
A találmány szerinti expressziós rendszerek összeállításában felhasználandó, tejproteint kódoló géneknek vagy ezek hatékony alszekvenciáinak az alkalmas példái általában a különféle emlősökből származó tej savóproteinek között találhatók; ilyen lehet egy tejsavó savas protein (whey acidic protein, WAP) gén, előnyösen egy rágcsálóeredetű WAP gén, illetve egy (előnyösen juheredetű) β-laktoglobulin gén. A BSSL-variánsok transzgenikus termelésére alkalmas gének a különféle eredetű kazeingének között is megtalálhatók, ilyen például a borjú-aSl-kazein és a nyúl^-kazein. A jelenleg előnyben részesített gén egy rágcsáló-WAPgén, mivel ez a gén számos idegen humán protein nagy mennyiségben történő expresszióját képes biztosítani különféle transzgenikus állatok tejében [Hennighausen, L. et al., Current Opinion in Biotechnology, 1, 74-78 (1990)].
Egy másik, előnyösen a találmány szerinti expressziós rendszerrel társult szekvencia egy olyan, úgynevezett expresszióstabilizáló szekvencia, amely nagy mennyiségű expresszió közvetítésére képes. Erőteljes utalások vannak arra, hogy az ilyen stabilizálószekvenciák a tejproteingének szomszédságában és felső részénél találhatók.
A találmány részét képezi egy BSSL-variáns expressziójára alkalmas transzgenikus nem humán emlős előállítási eljárása, amelynek során (i) egy fentiek szerinti expressziós rendszert bevezetünk egy nem humán emlős megtermékenyített petéjébe vagy embriósejtjébe, és így az expressziós rendszert beépítjük az emlős csíravonalába, és (ii) az így kapott, beillesztett, megtermékenyített petéből vagy embrióból kifejlett nőstény nem humán emlőst fejlesztünk ki.
Az expressziós rendszernek az emlős csíravonalába történő beépítését bármely ilyen célra alkalmas technika felhasználásával végrehajthatjuk; ilyen eljárást ismertetnek például a következő helyen: „Manipulating the Mouse Embryo”; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Például az expressziós rendszer néhány száz molekuláját közvetlenül befecskendezhetjük egy megtermékenyített petébe, például egy megtermékenyített egysejtű petébe vagy ennek pronukleuszába, illetve a kiválasztott emlős embriójába, majd a mikroinjektált petéket ezt követően álterhes nevelőanyák petevezetékébe juttatjuk és hagyjuk a petéket kifejlődni.
A BSSL-variánsok expresszálására képes transzgenikus nem humán emlősök előállítási eljárása olyan eljárás is lehet, amelyben az emlős lényegében alkalmatlan az ugyanazon emlősből származó BSSL expresszálására. Az ilyen eljárás során (i) megszüntetjük az
HU 221 119 Β1 emlős-BSSL-expresszáló képességét, és így lényegében semmilyen emlős-BSSL nem expresszálódik, majd egy fentiek szerinti expressziós rendszert inszertálunk oly módon az emlős csíravonalába, hogy az emlősben egy BSSL-variáns expresszálódik; és/vagy (ii) az emlős-BSSL-gént vagy az emlős-BSSL-génnek egy részét egy fentiek szerinti expressziós rendszerrel helyettesítjük.
Az emlős-BSSL-t expresszáló képességet egyszerűen megszüntethetjük úgy, hogy a BSSL expresszálásáért felelős DNS-szekvenciába mutációkat vezetünk be. Ilyen mutáció lehet például egy olyan mutáció, amely megváltoztatja a DNS-szekvencia szerkezetét, vagy egy stopkodon bevezetése, illetve a DNS-szekvencia egy vagy több nukleotidjának kiiktatása.
Az emlős-BSSL-génnek vagy egy részének egy fentiek szerinti expressziós rendszerrel vagy egy, a BSSLvariánst kódoló DNS-szekvenciával történő helyettesítését a homológ rekombináció jól ismert elveinek gyakorlati alkalmazásával hajthatjuk végre.
A találmány egy további, igen lényeges részét képezi egy olyan, transzgenikus nem humán emlős, amely a genomjában egy fentiek szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz. A DNS-szekvencia előnyösen az emlős csíravonalában és az emlős tejproteingénjében van jelen.
A transzgenikus nem humán emlőst előnyösen a következő állatok közül választhatjuk ki: egér, patkány, nyúl, juh, sertés és szarvasmarha.
A találmány magában foglalja a fentiek szerinti transzgenikus nem humán emlősutódot, valamint az ilyen transzgenikus nem humán emlősből nyert tejet is.
A találmány kiterjed a fentiek szerinti tejet tartalmazó csecsemő-tejkészítményekre, és egy fentiek szerinti BSSL-variánst tartalmazó csecsemő-tejkészítményekre is. A csecsemő-tejkészítményeket hagyományos eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő, és a készítmények szükséges adalékokat, például ásványi anyagokat, vitaminokat stb. is tartalmazhatnak.
A találmány magában foglalja az olyan gyógyszerkészítményeket, amelyek egy, a fentiekben meghatározott BSSL-variánst tartalmaznak, illetve az ilyen BSSL-variánsok gyógyászati felhasználását is.
A találmány kiterjed egy, a fentiekben meghatározott BSSL-variánsnak az alábbiakban felsorolt betegségekkel összefüggő patológiás állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállításában történő felhasználására : exokrin hasnyálmirigy-elégtelenség; cysticus fibrosis; krónikus pancreatitis; zsír-malabszorpció; a zsíroldékony vitaminok maiabszorpciója; fiziológiás okoknak tulajdonítható zsír-malabszorpció.
A találmány magában foglalja egy BSSL-variánsnak egy, a táplálék lipidek (különösen koraszülöttekben történő) hasznosításának javítására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására történő felhasználását is.
Példák
1. Rekombináns BSSL expresszálása eukarióta és prokariőta sejtekben
1.1. Kísérleti eljárások
1.1.1. Rekombináns plazmidok
A pUC19-be klónozott, 2,3 kb humán BSSLcDNS-t [Nilsson, J. et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990)] tartalmazó pS146 plazmidot Hindlllmal és Sa/I-gyel emésztettük, majd a BSSL-cDNS-t egy pS147 bovin-papillomavírus (BPV) expressziós vektorba vezettük be (1. ábra). Ez a vektor a humán BSSL-cDNS-t a rágcsáló-metallotionein 1 (mMT-1) fokozó- és promoterelem kontrollja alatt tartalmazza [Pavlakis, G. N. and Hamer, D. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 397-401 (1983)]. A mRNS termelőszignáljait egy olyan genomfragmentummal biztosítjuk, amely exon II, intron II, exon III részt tartalmaz, valamint a nyúl-P-globin-gén alsó elemeit tartalmazza. Ezt a transzkripciós egységet egy olyan vektorba klónoztuk, amely az egész BPV-genomot tartalmazta. A transzkripció a BPV-re és a BSSL transzkripciós egységre nézve egyirányú volt. A vektor E. coli-bm történő szaporításához a vektor pML2d-t, egy pBR322 származékot [Sarver, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7145-7151 (1982)] is tartalmaz.
A pS147 expressziós vektort a Harvey-szarkómavírus 5’ hosszú terminális ismétlődés és simian vírus 40 poliadenilezési szignál vezetése mellett egy, a neomicinrezisztens gént kódoló vektorral kotranszfektáltuk [Lusky, M. and Botchan, M. R., Cell, 36, 391-401 (1984)].
A BSSL E. coli-bm történő expressziójához a BSSL-cDNS-t pT7-7 plazmidból [Ausubel, F. M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1992)] származó Nde\őa/nHI fragmentumként pGEMEX-1 (Promega, Madison, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) plazmidba szubklónoztuk [Studier, F. W. and Moffat, B.
A., J. Mól. Bioi., 189, 113-130 (1986)]. Ennek a klónozási eljárásnak az útján egy startkodonnal bevezetve az érett proteint kódoló BSSL-génnel a T7 gén 10 kódolószekvenciáját helyettesítettük. A végső expressziós vektort, a pGEMEX/BSSL-t specifikus BSSL belső primerek alkalmazásával végzett DNS-szekventálás útján ellenőriztük.
1.1.2. Mutagenezis
Az ATG iniciációs kodonban lévő A-t jelöltük 1. számú nukleotidként. Az aminosavszámozásban a szignálpeptid első metioninja a -23-as és az érett protein első aminosavcsoportjához, egy alaninhoz rendeljük az 1-es sorszámot.
Az A. deléciós variáns (4. számú szekvencia) felépítéséhez két PCR-primert szintetizáltunk (PCR-1 és PCR-2; 1. táblázat). A különféle plazmidokba történő klónozáshoz ///«dili, SaR és θα«ιΗΙ helyeket alakítottunk ki. A BSSL-szekvenciában az aminosavszekvencia megváltoztatása nélkül hoztuk létre a BcR helyet. Ezt az egyéb variánsok előállítása érdekében végzett szintetikus DNS hozzáadás elősegítése érdekében hajtottuk végre. A PCR-2 primer két szintetikus stopkodont tartalmaz. Az így nyert PCR-fragmentumokat őűz«HI-gyel és ///ndlll-mal emésztettük, majd a szekvenciaanalízishez pCU 18-ba klónoztuk. A plazmidot pS157 jelzéssel láttuk el. A korrekt PCR-fragmentumot az egyetlen AsplOO helynél (a BSSL-cDNS-ben lévő
HU 221 119B1
1405 pozíciónál) és a β-globin-gén fragmentum előtti Sáli helynél a BSSL-szekvenciához kapcsolva a BPV expressziós vektorba inszertáltuk, és így a pS257 plazmidot nyertük.
A B. variáns (5. számú szekvencia) összeállítását a
3., 4., 7. és 8. számú oligonukleotidok (1. táblázat) alkalmazásával végeztük. A megerősített oligonukleotidok kódolják a teljes hosszúságú proteinben a 712 lizintől a 722 fenil-alaninig terjedő teljes C-terminális szekvenciát. Ezt a fragmentumot az 535 glutaminhoz kapcsoltuk. Az utolsó fenil-alanin után közvetlenül egy transzlációs stopot inszertáltunk. A fragmentum az 5’végben egy Beli helyet és a 3’-végben egy Sáli helyet tartalmaz, lehetővé téve ezáltal a pS157-be történő bevezetést. Az így nyert plazmidot 4.sp700-zal és Sallgyel emésztettük, majd a 313 bp fragmentumot bevezettük a fentiekben ismertetett expressziós vektorba. Az így előállított plazmidot pS258 jelöléssel láttuk el.
1. táblázat
A BSSL-variánsok kialakításához alkalmazott szintetikus oligonukleotidok. A restrikciós helyek nukleotidjait aláhúztuk. A transzlációs stopszignálokat félkövér betűkkel jelöljük. Az N. variánsban lévő megváltozott kodonokat a PCR-3-ban félkövér betűkkel és egy csillaggal különböztetjük meg.
Oligo- nuklcotid Szekvencia (5’- 3’)
PCR-1 CGGGATCCGAAGCCCTTCGCCACCC CCACG
PCR-2 CGAAGCTTGTCACTTACTACTGATG CAGTCACTGTGGGCAGCGCCAG
PCR-3 GGGAATTCTGGCCATTGCTTGGGTG AAGAGGAATATCGCGGCCTTCGGGG GGGACCCCAACCAGATCACGCTCTT CGGGGAGTCT *
PCR-4 CGGGATCCCACATAGTGCAGCATGG GGTACTCCAGGCC
1 GATCAGGGGGCCCCCCCCGTGCCGC CCACGGGTGACTCCGGG
2 GVWVVVWGTGWGVVVAVGGGT GAVTVVAAGGAAGCTCAGA
3 TGCCTGCAGTCATTAGGTTTTAGTA AGTCGACA
3 AGCTTGTCGACTTACTAAAACCTAA TGACTG
5 CAGGCATCTGAGCTTCCTTGGAGTC ACCCGTGGGCGGCACGGGGGGGGCC CCGGA
6 GTCACCCGTGGGCGGCACGGGGGGG GCCCCCT
7 GATCAGAAGGAAGCTCAGA
8 CAGGCATCTGAGCTTCCTTCT
A C. variánst (6. számú szekvencia) kódoló gén felépítéséhez az 1-6. számú oligonukleotidokat (1. táblázat) alkalmaztuk. A megerősített DNS-fragmentum két, aminosavat kódoló, az elfogadottal [Nilsson, J. et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990)] azonos, az 535 glutamin és 712 lizintől a 722 fenil-alaninig terjedő szekvencia közé inszertált ismétlődést tartalmaz. Ez a fragmentum az 5’-végben egy Beli helyet és a 3’végben egy Sal\ helyet is tartalmaz, lehetővé téve ezáltal a fenti stratégiával azonos klónozás végrehajtását. Az így nyert plazmidot pS259 jelzéssel láttuk el.
Az N. variáns (nem TV-glikozilezett variáns, 7. számú szekvencia) előállításához két PCR-primert (1. táblázat: PCR-3 és PCR-4) szintetizáltunk. Az £coRI és 5aznHI helyeket a szekvenciaanalízis céljára, a 360 bp PCR-terméknek a pUC 19-be történő klónozásához alakítottuk ki. A 187 aszparaginnál lévő tényleges Nkötésű glikozilezési helyet glutaminra cseréltük. A módosított szekvenciát Bali-Hináiii fragmentumként izoláltuk, majd a fragmentumot egy, az mMT-1 promotert és a BSSL-cDNS 5’-véget tartalmazó Saci és Báli fragmentummal együtt SacI-gyel és /frndlll-mal emésztett pUC19-be klónoztuk. Ebből a plazmidból egy hozzávetőleg 1,2 kb nagyságú AacI-DralII fragmentumot izoláltunk, amit az expressziós vektorban lévő mMT-1 elembe, illetve a BSSL-cDNS-szekvenciába inszertáltunk. Az így nyert plazmidot pS299 jelöléssel láttuk el.
1.1.3. Emlőssejttenyésztés és transzfekció
A vektorokat a kalcium-foszfátos precipitációs eljárásnak [Graham, F. L. and Van dér Eb, A. J., Virology, 52, 456-467 (1973)] megfelelően C127 rágcsálósejtvonalba (ATCC CRL 1616) kotranszfektáltuk. A C127 sejteket 10% magzati bovinszérummal kiegészített 1:1 arányú Ham-féle F12/DMEM (Dulbecco’s Modifíed Eagle’s médium) közegben tenyésztettük. A neomicinrezisztens sejtklónokat 1,5 mg/ml G418-cal szelektáltuk, majd 10-15 nap elteltével az alaplemezekről a rezisztens sejtklónokat izoláltuk és analizáltuk.
1.1.4. Bakteriális törzsek és tenyésztési körülmények
Az expressziós kísérletekhez a pGEMEX/BSSL vektort JM109-(DE3) és BL21(DE3)pLysS E. coli törzsekbe transzformáltuk. Az expressziós kísérleteket a Studier által ismertetetteknek megfelelően hajtottuk végre [Studier, F. W. and Moffat, B. A., J. Mól. Bioi., 189, 113-130 (1986)]. A baktériumok leszüretelése után a sejteket 5000 g mellett 10 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással pelletáltuk. A periplazma- és a citoplazmafrakciók előállításához a pelletet a pellett egy grammjára vonatkoztatva 4 ml 20 mM Tris-Cl/20% szacharóz (pH 8,0), 200 μΐ 0,1 M EDTA és 40 μΐ lizozim (15 mg/ml víz) keverékben szuszpendáltuk. A szuszpenziót 40 percen keresztül jégen inkubáltuk. A pellet egy grammjára vonatkoztatva 160 μΐ 0,5 M magnézium-kloridot adtunk a szuszpenzióhoz, majd a keveréket 12 000 g mellett 20 percen keresztül centrifugáltuk. Az így nyert felülúszó tartalmazza a periplazmatikus proteineket, míg a pellet képviseli a citoplazmatikus frakciót. Az oldható proteinek előállítását alternatív módon elvégezhettük úgy is, hogy a sejteket 40 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM benzil-szulfonil-fluorid (pH 8,2) keverékben szuszpendáltuk, majd a szuszpenziót a lizáláshoz több
HU 221 119 Β1 alkalommal lefagyasztottuk-felolvasztottuk és nagyfrekvenciás hanghullámokkal kezeltük (szonikáltuk). A sejtlizátumot 30 000 g mellett 30 percen keresztül 25 °C hőmérsékleten centrifugáltuk.
1.1.5. Nukleinsavanalízis
Izolált emlőssejtvonalakból vagy E. coli sejtekből RNS-t és DNS-t preparáltunk [Ausubel, F. M. et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1992)]. Az RNS-t vagy DNS-t agarózgélen frakcionáltuk, majd GeneScreen Plusra (New England Nuclear) vittük és a gyártó által adott utasításoknak megfelelően hibridizáltuk.
1.1.6. A natív enzim előállítása
Az epesóstimulált lipázt a korábbiakban ismertetetteknek [Bláckberg, L. and Hemell, O., Eur. J. Biochem., 116, 221-225 (1981)] megfelelően humán tejből izoláltuk és tisztítottuk. A tisztított preparátumot SDS-PAGE alkalmazásával homogenizáltuk. Szubsztrátként hosszú láncú triacil-glicerint alkalmazva vizsgáltuk az enzimet, amelynek fajlagos aktivitása ebben a vizsgálatban percenként és milligrammonként 100 pmol felszabadított zsírsavnak felelt meg.
1.1.7. Enzimvizsgálat
Az enzimvizsgálatot a korábbiakban ismertetetteknek [Bláckberg, L. and Hemell, O., Eur. J. Biochem., 116,221-225 (1981)] megfelelően végeztük. Ennek során szubsztrátként gumiarábikummal emulgeált trioleint használtunk. Az inkubálásokat 10 mM nátriumkólát aktiváló epesó jelenlétében hajtottuk végre. Amikor az epesófüggést teszteltük, a 3. ábránál megadott koncentrációkhoz adtunk epesókat [nátrium-kolátot vagy nátrium-dezoxi-kolátot (Sigma Chem. Co.)].
1.1.8. Fehérjekimutatás (Western blotting)
Annak érdekében, hogy a kimutatási kísérletekben szignifikáns reakciókat kapjunk, az adott közegeket Blue Sepharose (kékdextrán; Pharmacia LKB Biotechnology) alkalmazásával végzett gélkromatográfiával betöményítettük. A megfelelő médiumokat összekevertük a Blue Sepharose géllel (körülbelül 10 ml médium/1 ml gél). A gélt 0,1 M kálium-kloridot tartalmazó 0,5 M Tris-Clpufferrel (pH 7,4) mostuk (10 ml/1 ml gél). Az enzimaktivitást 1,5 M kálium-kloridot tartalmazó ugyanilyen pufferrel eluáltuk. Ezzel az eljárással 25-30-szoros koncentrációt és 3-5-szörös tisztaságot értünk el. Lényegében a Laemmli által ismertetett eljárásnak [Laemmli, U. K., Natúré (London), 227, 680-685 (1970)] megfelelően SDS-PAGE-t végeztünk 10% poliakrilamidgéleken. A nitro-cellulóz-membránokra történő átvitel és egy poliklonális nyúlantiszérummal végzett inkubálás után a tisztított BSSL detektálását alkálikus foszfatázzal konjugált kecske-antinyúl IgG, valamint egy Bio-Rad kifejlesztőkészlet (kit) alkalmazásával végeztük.
1.1.9. A-glikozidáz F-fel végzett reakció
A B. variáns 10 pl-éhez (BSSL-aktivitás: 2,5 pmol szabaddá tett zsírsav/perc) 1 pl 1 M β-merkapto-etanolt és 0,5 pl 10 vegyes% SDS-t adtunk. Ötperces forralás után 10 pl 0,1 M nátrium-foszfát-puffért (pH 8,0), 6 pl 0,1 M EDTA-t, 4 pl 7,5 vegyes% Nonidet P 40-et és 5 ml (1U) A-glikozidáz F-et (Boehringer Mannheim) adtunk az előbbi keverékhez. Kontrollként a B. variáns ugyanilyen mennyiségét ugyanezekkel a reagensekkel reagáltattuk, kivéve azt, hogy ebben az esetben nem használtunk glikozidázt. Egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a mintákat SDS-PAGE-n futtattuk, majd poliklonális nyúl-BSSL-antiszérum alkalmazásával mutattuk ki.
1.2. Eredmények
1.2.1. A BSSL-variánsok felépítése
A BSSL-variánsoknak a teljes hosszúságú BSSLhez viszonyított módosításait a 2. táblázatban és az 1. ábrán foglaljuk össze. Az ezeknek a variánsoknak az előállításához alkalmazott stratégiát az 1.1. szekcióban ismertettük. Az A. variáns (4. számú szekvencia) esetén az 535 pozícióban lévő glutamin után egy stopkodont vezettünk be, és így eltávolítottuk a teljes hosszúságú proteinből az utolsó 187 aminosavat. A B. variánsnál (5. számú szekvencia) a 11 legutolsó C-terminális aminosavat kódoló domént és az eredeti transzlációs stopot az 535-glutaminhoz kapcsoltuk. Ennélfogva ebből a variánsból hiányzik az összes ismétlődés. A C. variáns (6. számú szekvencia) esetén a 722-fenilalanin-szekvenciához az 535-glutamin és a 712-lizin közé egy olyan fragmentumot inszertáltunk, amely fragmentum két, az elfogadottal [Nilsson, J. et al., Eur. J. Biochem., 192, 543-550 (1990)] azonos szekvenciájú ismétlődést tartalmazott.
A 194-szerin-aktívhelyhez közel elhelyezkedő egyetlen, kísérleti A-kötéses szénhidrátszerkezet szerepének vizsgálata érdekében előállítottunk egy variánst. Az N. variánst (7. számú szekvencia) úgy állítottuk elő, hogy a 187-aszparaginnál lévő tényleges A-glikozilezési helyet glutaminra változtattuk.
2. táblázat
A BSSL-variánsok aminosavszekvenciáinak a humán BSSL-hez viszonyított eltérései
Variáns Kiiktatott csoportok Kicserélt csoportok
A. (4. számú szekvencia) 536-722
B. (5. számú szekvencia) 536-711
C. (6. számú szekvencia) 536-568, 591-711
N. (7. számú szekvencia) Asn 187 —» Gin
1.2.2. Az emlőssejtvonalakban lévő rekombináns DNS jellemzése
A különféle BSSL-variánsokat kódoló expressziós vektorokkal transzfektált sejtvonalakból DNS-mintákat preparáltunk. Az előállított DNS-t Tta/wHI-gyel emésztettük, agarózgélen frakcionáltuk, majd a hibridizációhoz membránokra vittük. Az alkalmazott minta 32P-jelzett BSSL-cDNS volt. A hibridizációs eredmények egyrészt megerősítették a rekombináns gének jelenlétét, másrészt azt, hogy a különféle sejtvonalakban hozzávetőleg azonos volt a vektor másolatainak a száma (2. ábra). A hibri9
HU 221 119 Β1 dizációs fragmentumok pozíciói megfelelően visszatükrözték a különféle BSSL-szekvenciák eltérő hosszúságait, illetve összhangban voltak a várt méretekkel. A pozíciók hasonlítottak a transzfekciós kísérletekben alkalmazott, bakteriális eredetű DNS-hez is, ami azt jelezte, hogy a sejtvonalakban nem történt semmilyen lényeges vektor-DNS-átrendeződés. Az A. variánst reprezentáló DNS-minta felső hibridizációs szignáljai feltehetően a részleges emésztéssel hozhatók összefüggésbe.
1.2.3. Az mRNS expressziója teljes hosszúságú és mutáns BSSL esetén emlőssejtekben
A különféle rekombináns BSSL-gének expressziójának elemzéséhez izolált sejtvonalakból RNS-t preparáltunk. Az RNS-kimutatási („Northem-blot”-) kísérlet és a 32P-jelzett BSSL-cDNS-sel végzett hibridizáció azt mutatta, hogy valamennyi, BSSL-vektort magában foglaló sejtvonalban rekombináns mRNS volt kimutatható (3. ábra). A kontrollmintában, amely egy, a BSSL-cDNS kivételével azonos vektort tartalmazó sejtvonalból származott, nem történt hibridizáció (3. ábra).
A hibridizáló mRNS-ek eltérő hosszúságai megfeleltek a cDNS-ek módosításainak. A különböző mintákban a rekombináns BSSL-mRNS-variánsok egyensúlyi koncentrációi körülbelül azonosak voltak, kivéve az A. variánst (3. ábra). Az A. variáns mRNS csökkent akkumulációjának oka nem ismert, de ugyanezt a jelenséget figyeltük meg két sejtvonal-populációban, valamint izolált kiónokban is. A különböző mintákban lévő RNS egyenlő mennyiségeit egy rágcsáló-p-aktin-próbához végzett hibridizációval igazoltuk (3. ábra, alsó panel).
1.2.4. A teljes hosszúságú BSSL és a BSSL-variánsok előállítása emlőssejtekben
A teljes hosszúságú BSSL-lel és a különböző mutánsformákkal transzfektált C127-sejtek egyedi klónjaiból származó közegeket összegyűjtöttük, majd a BSSLaktivitásra nézve vizsgáltuk (4. ábra). A teljes hosszúságú molekula, valamint az N., B. és C. variáns esetén a legnagyobb expressziójú kiónokban lévő aktivitások 0,7-2,3 pmol szabaddá tett zsírsav/perc/(ml médium) értékűek voltak. A natív tej-BSSL fajlagos aktivitásával összehasonlítva ez az érték 7-23 pg/(ml médium) értékű expressziós szinteknek felelne meg. Az A. variáns esetén valamennyi analizált klón 0,05 pmol szabaddá tett zsírsav/perc/(ml médium) alatti aktivitásokkal rendelkezett. A legnagyobb aktivitást mutató klón Blue-Sepharose-on végzett betöményítése és liofilizálása kimutatta, hogy valóban expresszálódott egy aktív enzim, de csak igen csekély mennyiségben. Nem zárható ki annak a lehetősége, hogy az A. variánssal nyert alacsony aktivitást részben egy jelentősen kisebb fajlagos aktivitás magyarázza.
Az 5A. ábrán láthatók a különböző transzfekciós kísérletek kiónjaiból nyert fehérjekimutatások (Western blots). A BSSL-variánsok látszólagos Mr értékei a várakozásoknak megfelelőek voltak. Meg kell azonban jegyeznünk, hogy a teljes hosszúságú BSSL, valamint a
B. és C. variáns esetén egy kettős sávot nyertünk. Tekintettel arra, hogy mindháromnak megvan az egyetlen, intakt A-glikozilezési helye, míg a kettős sávot nem mutató N. variáns esetén ez a hely hiányzik, valószínűnek tűnik az a magyarázat, hogy a kettős sáv az Nglikozilezési eltérésekből adódik. A B. variánst Nglikozidáz F-fel emésztettük. Amint az az 5B. ábrán látható, a felső sáv csak nyomokban maradt vissza, miközben az alsó sáv erőssége megnőtt, ami azt jelzi, hogy az expresszált variáns csak részben volt A-glikozilezett.
A BSSL egyik jellemző tulajdonsága az, hogy primer epesók, például kólátok specifikusan aktiválják [Hemell, O., Eur. J. Clin. Invest., 5, 267-272 (1975)]. A BSSL különféle rekombináns formáinak mindegyike ugyanolyan koncentrációfüggést mutatott a kolátaktiválásnál (6. ábra). Az alkalmazott vizsgálati rendszerben körülbelül 10 mM koncentrációnál lehetett maximális aktivitást elérni. Amennyiben a kolátot dezoxi-kolátra (egy szekunder epesóra) cseréltük, nem történt aktiválás. A rekombináns teljes hosszúságú egység, valamint a különféle variánsok az epesó-aktiválás vonatkozásában ugyanolyan specifitást mutattak.
1.2.5. A teljes hosszúságú BSSL expressziója és biokémiai tulajdonságai E. coli-ban
A humán BSSL-cDNS-t tartalmazó pGEMEX/BSSL expressziós vektorral a T7 promoter kontrollja alatt két, JM109(DE3) és BL21(DE3)pLysS E. coli törzset [Studier, F. W. and Moffat, B. A., J. Mól. Bioi., 189, 113-130 (1986)] transzformáltunk. A két törzsből származó transzformánsokat azonosítottuk, tenyésztettük és körülbelül 90 percen keresztül IPTG-vel indukáltuk [Studier, F. W. and Moffat, B. A., J. Mól. Bioi., 189, 113-130 (1986)]. 32P-jelzett próbaként a BSSL-cDNS-t alkalmazva RNS-kimutatással (Northem-blot) teljes mRNS-analízist végeztünk, ami azt igazolta, hogy mindkét törzsben hatékony expresszió-indukció történt, valamint hogy a transzkripció szigorúan szabályozott volt (7A. ábra). A rekombináns BSSL-mRNS látszólagos mérete hozzávetőleg 2,4 kb, ami jó egyezést mutat a várt hosszúsággal. A proteinminták SDS-PAGE-elválasztása és anti-BSSL-antitestekkel végzett immundetektálása azt mutatta, hogy a teljes hosszúságú BSSL hatékonyan termelődött az E. coli-ban (7B. ábra). A BL21(DE3)pLysS törzsben a protein nagyobb része szekretálódott a periplazmába, mint a JM109(DE3) törzsben (7B. ábra).
Az IPTG által indukált E. coli tenyészetek 0,5-4 pg BSSL-protein/(ml tenyészet) értéknek megfelelő mennyiségben tartalmaztak aktív oldható BSSL-t. A fehérjekimutatás (Western blotting) azt mutatta, hogy a reaktív anyag 20% és 60% közötti mennyisége volt az oldhatatlan pelletben. Az indukálatlan baktériumok nem tartalmaztak szignifikáns BSSL-aktivitást.
A tenyésztett baktériumokból nyert lipázaktivitás ugyanolyan epesófüggést mutatott, mint a natív tejBSSL.
2. Az epesóstimulált lipázrekombináns teljes hosszúságú és mutáns formáinak tisztítása és jellemzése
2.1. Kísérleti eljárások
2.1.1. Enzimek és enzim variánsok
A rekombináns teljes hosszúságú BSSL-t, valamint a B., C. és N. variánsokat a fentiekben ismertetetteknek megfelelően konstruáltuk és expresszáltuk. A natív enzimhez viszonyítva a B. variáns (5. számú szekvencia) esetén hiányzik mind a 16 egyedi, O-glikozilezett, pro10
HU 221 119 Β1 linban gazdag, C-terminális-ismétlődés (536-711), viszont a legszélső C-terminális-fragmentum (712-722) az 535-glutaminhoz kapcsolódik. A C. variáns (6. számú szekvencia) ugyanezzel a C-terminális-fragmentummal rendelkezik, valamint az 535-glutamin és a 712-lizin között két, 11 csoportból álló ismétlődést tartalmaz. Az N. variánsban (nem A-glikozilezett variáns, 7. számú szekvencia) a kizárólag az A-kötésű cukorért felelős 187-aszparagin glutamincsoportra lett cserélve.
A natív BSSL humán tejből végzett tisztítását a korábbiakban ismertetetteknek [Bláckberg, L. and Hemell, O., Eur. J. Biochem., 116, 221-225 (1981)] megfelelően hajtottuk végre.
2.1.2. Enzimvizsgálat
Az enzimvizsgálatot a korábbiakban ismertetetteknek [Bláckberg, L. and Hemell, O., Eur. J. Biochem., 116, 221-225 (1981)] megfelelően végeztük. Ennek során szubsztrátként gumiarábikummal emulgeált trioleint használtunk. Aktiváló epesóként 10 mM nátrium-kolátot alkalmaztunk. A vizsgálat különféle módosításait az ábrák magyarázatánál ismertetjük.
2.1.3. Az immunszorbens előállítása mg tisztított tej-BSSL-t bróm-cián (CNBr) alkalmazásával, a gyártó előírásainak megfelelően Sepharose-hoz kapcsoltunk. Egy nyúlban létrehozott tisztított tej-BSSL-lel szembeni poliklonális antiszérum 40 ml-ét keresztüljuttattuk az oszlopon. A specifikus antitesteket 0,1 M glicin-hidroklorid-oldattal (pH 2,5) eluáltuk. A pH-t szilárd Tris-sel azonnal, körülbelül 8-as értékre állítottuk be. Sómentesítés és liofilizálás után az affinitáskromatográfiával tisztított antitestek 6 mg-ját a fentieknek megfelelően Sepharose-hoz kapcsoltuk.
2.1.4. Tisztítási eljárás
Az 5-25 pg rekombináns expresszált BSSL-t vagy BSSL-variánst tartalmazó kondicionált tenyésztőközeget 10 ml médium/1 ml ülepített gél arányban összekevertük Blue Sepharose-zal (Pharmacia, Svédország). A keveréket 30 percen keresztül rázattuk, majd a gélt 0,05 M Tris-Cl (pH 7,0), 0,05 M kálium-klorid eleggyel mostuk, ezt követően pedig a lipázaktivitást 0,05 M Tris-Cl (pH 7,0), 1,5 M kálium-klorid keverékkel eluáltuk. Az aktív frakciókat egyesítettük, majd 5 mM nátrium-veronai (pH 7,4), 0,05 M nátrium-klorid eleggyel szemben dializáltuk. A dializátumot felvittük egy heparin-Sepharose oszlopra. Az oszlopot 5 mM nátrium-veronal-pufferben (pH 7,4) lévő 0,05 M -> 1,0 M nátrium-klorid-gradienssel eluáltuk. A lipázaktivitással rendelkező frakciókat összeöntöttük és egy immunszorbens oszlopra vittük. Egy 0,05 M Tris-Cl (pH 7,5), 0,15 M nátrium-klorid eleggyel végzett mosás után a kötött lipázt 0,1 M glicin-hidrokloriddal (pH 2,5) eluáltuk. A frakciók pH-ját szilárd Trisszel azonnal körülbelül 8-as értékre állítottuk be.
2.1.5. Elektroforézis
Nátrium-dodecil-szulfát/poli(akril-amid) gélelektroforézist (SDS-PAGE) hajtottunk végre, lényegében annak megfelelően, ahogyan azt Laemmli ismertette [Laemmli, U. K., Natúré (London), 227, 680-685 (1970)]. A proteineket Commasie Brilliant Blue segítségével festettük meg.
2.1.6. Az A-terminális szekvencia analízise
Az aminosavszekvenciák elemzését egy Applied Biosystems Inc. 477A impulzusrendszerű folyadékfázisú szekventorral és egy on-line (fenil-tio)-hidantoin 120A analizátorral, szabályos ciklusú programok és a gyártótól származó vegyszerek alkalmazásával végeztük el. Egy szekventált standardproteinből (β-laktoglobulin) kiszámítottuk a kezdeti és az ismétlődő hozamokat, amelyeknek értéke az előbbi sorrendnek megfelelően 47% és 97% volt.
2.2. Eredmények
2.2.1. A rekombináns BSSL és BSSL-variánsok tisztítása
Koncentrálólépésként elsődlegesen a kondicionált tenyésztőközeg Blue Sepharose-on végzett kromatográfiáját alkalmaztuk. Az ezt követő, heparin-Sepharoseon végzett kromatográfia a tenyésztőközegben lévő albumin legnagyobb részének eltávolítása útján egy kezdeti tisztítást eredményezett. Ez a lépés is azt mutatta, hogy a rekombináns BSSL-molekulák mindegyike megtartotta a heparinkötést. Az immunszorbens kromatográfia után az SDS-PAGE szerint valamennyi variáns több mint 90%-os tisztasággal rendelkezett (8. ábra). A teljes hosszúságú enzim, valamint a B. és C. variáns dublettként vándorolt. A különféle variánsok látszólagos Mr értékei a 3. táblázatban láthatók. Az A-terminális szekvencia analízise valamennyi variáns esetén egyetlen, 8 tagból álló szekvenciát eredményezett: Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-.
2.2.2. Lipázaktivitás
A 3. táblázatban a különféle preparátumok látszólagos molekulatömegei láthatók. A preparátumok fajlagos aktivitásai 75 és 120 μιηοΐ szabaddá tett zsírsav/perc/mg protein közötti értékűek voltak. Megállapítható, hogy a teljes hosszúságú BSSL és a BSSL-variánsok aktivitásai között nem figyelhető meg szignifikáns eltérés.
Az emulgeált hosszú láncú triacil-glicerinnel szembeni aktivitáshoz valamennyi preparátum esetén elengedhetetlenül szükséges egy primer epesó (nátrium-kólát) alkalmazása (9A. ábra). A nátrium-dezoxi-kolát nem tette a variánsokat aktívvá (az adatok nem láthatók). Ugyanakkor azonban ha a különféle epesókat kombináltuk, a dezoxi-kolátnak két effektusa volt (9B. és 9C. ábra). Először, a dezoxi-kolát csökkentette az aktiváláshoz szükséges kólát mennyiségét, másodszor pedig nagyobb epesókoncentrációnál gátolta az enzimaktivitást.
3. táblázat
A rekombináns teljes hosszúságú BSSL és a BSSL-variánsok látszólagos Mr értékei
Enzim Mr (kDa) (SDS-PAGE útján meghatározva)
Teljes hosszúságú 105, 107
B. variáns 63,65
C. variáns 60, 62
N. variáns 95
HU 221 119 Β1
2.2.3. A rekombináns BSSL és a BSSL-variánsok stabilitása
A rekombináns BSSL és a BSSL-variánsok ugyanolyan pH-stabilitást mutattak, mint a natív tej-BSSL (10. ábra). Körülbelül 2,5-3 közötti pH-értéknél valamennyi esetben inaktiválódás történt. Amennyiben a proteinkoncentráció elég nagy volt, pH 3 felett valamennyi variáns tökéletesen stabil volt. A megfelelően nagy proteinkoncentrációt bovin-szérumalbumin vagy ovalbumin hozzáadásával biztosítottuk (az adatok nem láthatók). A meghígított minták minden vizsgált pHértéknél kevésbé stabilak voltak, azonban a küszöbérték ugyanaz maradt (az adatok nem láthatók). All. ábra a rekombináns enzimek és a natív tejenzim hőstabilitásainak az összehasonlítását mutatja be. Az aktivitás 37-40 °C közötti hőmérséklet-tartományban csökkenni kezd. A variánsok (azaz a B., a C. és az N. variáns) valamivel kevésbé stabilnak tűnik, mint a teljes hosszúságú rekombináns enzim és a tejenzim. Ugyanakkor azonban ha bovin-szérumalbumin hozzáadásával megemeltük a proteinkoncentrációt, valamennyi variáns stabil volt 40 °C hőmérsékletnél is (11. ábra).
A natív tej-BSSL és valamennyi rekombináns variáns igen érzékeny volt tripszinre. Időfüggő inaktiválódást figyeltünk meg (12. ábra). Ugyanakkor azonban ha puffer epesókat, például kolátot tartalmazott, a lipázvariánsok védettek voltak, és a lipázaktivitás megmaradt (12. ábra).
A számos in vitro jellemző alapján, azaz az epesav általi aktiválás, a heparinkötés, a pH- és hőstabilitás, valamint a proteázok által okozott inaktiválódással szembeni epesóvédelem vonatkozásában semmiféle szignifikáns különbséget nem találtunk a különböző BSSL-variánsok és a natív tej-BSSL közötti összehasonlítás során.
3. Expresszió transzgenikus állatokban 3.1. Az expressziós vektorok összeállítása
Egy, rekombináns humán BSSL-variáns transzgenikus állatokból származó tejben történő előállítására szolgáló expressziós vektor felépítéséhez az alábbi stratégiát alkalmaztuk (13. ábra).
A Lidberg által ismertetett eljárások [Lidberg, U. et al., Genomics, 13, 630-640 (1992)] alkalmazásával három, a humán BSSL-gén különböző részeit (pS309, pS310 és pS311) tartalmazó plazmidot nyertünk. A pS309 plazmid egy olyan Sphl fragmentumot tartalmaz, amely a BSSL-gént az 5’ át nem írt régiótól a negyedik intronrészéig fedi. A pS310 plazmid egy olyan Sacl fragmentumot tartalmaz, amely egy, az első intronrésztől a hatodik intronrészig terjedő BSSL variáns génszekvenciát takar. Végül a pS311 plazmid egy olyan őa/wHI fragmentumot tartalmaz, amely a BSSL-gént az ötödik intron egy fő részétől takarja és a 11-es exonban lévő deléciók figyelembevételével az intron/exon szerkezetnek a maradékát fedi. A kiiktatott szekvenciák 231 bp értékűek, ami egy olyan, BSSL-variánst kódoló szekvenciát eredményez, amely pontosan 77 aminosavval vagy hét ismétlődéssel kevesebbel rendelkezik, mint a teljes hosszúságú BSSL. Az így nyert BSSL-variáns („T. variáns”) nukleotidszekvenciáját a Szekvenciák jegyzékében lévő 8. számú szekvencia mutatja be. A T. variáns aminosavszekvenciája a Szekvenciák jegyzékében 9. számú szekvenciaként szerepel.
A humán BSSL-gén 11-es exonjában lévő nagymértékben ismétlődő szekvencia következményeként viszonylag nagy gyakoriságú átrendeződés valószínűsíthető akkor, ha a szekvenciát egy plazmidba klónozzuk és baktériumokban szaporítjuk. Ennek a feltételezésnek az alapján azonosítottunk, izoláltunk és szekvenciaanalízisnek vetettünk alá egy olyan, kívánt BSSL-variánst, amely egy megcsonkított 11-es exont tartalmazott.
Egy, a tfzwdlll és Sacl helyeknél a pUC19 plazmidba klónozott humán BSSL-cDNS egy részét tartalmazó másik, pS283 plazmidot alkalmaztunk a genomos szekvenciák egyesítéséhez. A pS283 plazmidot felhasználtuk arra is, hogy egy a BSSL 5’ nemtranszlált vezetőszekvenciájában lévő Kpnl valódi restrikciós enzimhelyet nyerjünk.
A pS283 plazmidot Arai-gyei és Sacl-gyel emésztettük, majd elektroforézissel egy körülbelül 2,7 kb nagyságú fragmentumot izoláltunk. A pS309 plazmidot Arai-gyei és őspEI-gyel emésztettük, és ezt követően egy, körülbelül 2,3 kb nagyságú, a BSSL-gén 5’-részét tartalmazó fragmentumot izoláltunk. A pS310 plazmidot ZLpEI-gyel és Sacl-gyel emésztettük, majd egy körülbelül 2,7 kb nagyságú, a BSSL-gén középső régióját tartalmazó fragmentumot izoláltunk. Ezt a három fragmentumot ligáltuk, megfelelő TG2 E. coli törzsbe transzformáltuk, majd a transzformánsokat ampicillinszelekció útján izoláltuk.
Számos transzformánsból preparáltunk plazmidokat, amelyek közül egyet, a kívánt konstrukciót tartalmazó, pS312 jelzéssel ellátott (14. ábra) plazmidot használtuk fel a további kísérletekben.
A pS311 egy olyan módosulatának az előállításához, amelyben a stopkodon mögött elhelyezkedő SaznHI helyet a további klónozás elősegítése érdekében egy Sáli hellyé alakítottuk át, a következő eljárást alkalmaztuk. A pS311 plazmidot részleges Őa/wHI emésztéssel linearizáltunk. A linearizált fragmentumot izoláltuk, majd egy olyan, szintetikus DNS-linkert inszertáltunk a fragmentumba, amely a BamHl helyet egy Sáli hellyé (5’-GATCGTCGAC-3’) konvertálja, miáltal megszünteti a 5aznHI helyet. Mivel a szintetikus linker integrációjához két potenciális pozíció volt jelen, a kapott plazmidokat restrikciós enzimmel végzett hasítással analizáltuk. Azt a plazmidot, amelyben a linker a kívánt, a 11-es exon mögötti helyzetben inszertálódott, izoláltuk. A plazmidot pS313 jelöléssel láttuk el.
A humán BSSL-variáns genomszekvenciákat magában foglaló, végső expressziósvektor-konstrukció előállításához egy olyan, pS314 létező expressziós vektort alkalmaztunk, amelyet az emlősejtekben a szoptatási idő alatt történő állapot- és szövetspecifikus expresszió közvetítéséhez terveztek. A pS314 plazmid egy Notl fragmentumként klónozott, rágcsáló tejsavó savas protein (WAP)-génből [Campbell, S. M. et al., Nucleic Acid Rés., 12, 8685 8697 (1984)] származó genomfragmentumot tartalmaz. A genomfragmentum mind a négy rágcsáló-WAP-exon- és az összes intronszekven12
HU 221 119 Bl cia előtt körülbelül 4,5 kb nagyságú regulátorszekvenciával (upstream regulatory sequences, URS), illetve az utolsó exon mögött egy, körülbelül 3 kb nagyságú szekvenciával rendelkezik.
A humán BSSL-variáns genomszekvenciát a következő stratégia alkalmazásával inszertáltuk az említett helyek, azaz a KpnX és a SalX hely közé. Először a pS314 plazmidot A/wI-gyel és So/I-gyel emésztettük, majd elektroforetikus úton egy, a hasított plazmidot reprezentáló fragmentumot izoláltunk. Másodszor a pS312 plazmidot Xjwl-gyel és TfaniHI-gyel emésztettük és egy hozzávetőleg 4,7 kb nagyságú, a humán BSSLgén 5’-részét reprezentáló fragmentumot izoláltunk. Harmadszor a pS313 plazmidot 2tamHI-gyel és Sa/I-gyel emésztettük, majd a humán BSSL-gén 3’-részét izoláltuk. Ezt a három fragmentumot ligáltuk, megfelelő E. coli baktériumokba transzformáltuk, majd ampicillinszelekció után izoláltuk a transzformánsokat.
Számos transzformánsból plazmidot preparáltunk, majd az így nyert plazmidokat restrikciósenzim-térképezéssel és szekvenciaanalízissel gondosan elemeztük. Meghatároztuk a kívánt expressziós vektort reprezentáló plazmidot, amit pS317 jelzéssel láttunk el (15. ábra).
A prokariotikus plazmidszekvenciák eltávolítása érdekében a pS317 plazmidot Ao/I-gyel emésztettük. A humán BSSL-variáns genomfragmentum melletti rágcsáló-WAP-szekvenciából álló rekombináns vektorelemet ezt követően agarózelektroforézissel izoláltuk. Az izolált fragmentumot elektroelúcióval tovább tisztítottuk, majd egérembriókba injekcióztuk.
A humán BSSL-variáns transzgenikus egerekből származó tejben történő expresszálására szolgáló rekombináns gént a 16. ábrán mutatjuk be.
3.2. Transzgenikus állatok létrehozása
A pS317 plazmidból a 3.1. szekció szerint egy NotX fragmentumot izoláltunk. Ez a DNS-fragmentum tartalmazta azt a rágcsáló-WAP-promotert, amely egy humán BSSL-variánst kódoló genomszekvenciához kapcsolódott. Az izolált fragmentumot 3 ng/μΐ koncentrációban 350 C57Bl/6JxCBA/2J-f2 embrió pronucleusába injektáltuk; az embriókat olyan donor egerekből nyertük, amelyeket a szuperovulációhoz vemheslószérum gonadotropin 5 IU mennyiségével kezeltünk. A C57Bl/6JxCBA/2J-fi embriókat a következő helyről kaptuk: Bomholtgárd Breeding and Research Centre LTD, Ry, Dánia. A petevezetékekből kigyűjtött embriókat az M2 médiumban [Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986)] hialuronidázzal végzett kezelés útján elválasztottuk a cumulus sejtektől. Mosás után az embriókat az M16 médiumba [Hogan, B. et al., Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986)] helyeztük át és egy 5%-os szén-dioxidatmoszférájú inkubátorban tartottuk. Az injektálásokat könnyű paraffinolaj alatt M2 mikrocseppben végeztük, amelynek során Narishigi hidraulikus mikromanipulátorokat és egy Nomarski-optikával ellátott Nikon inverz mikroszkópot alkalmaztunk. Az injektálás után 267 egészségesnek látszó embriót beültettünk 12 olyan, álvemhes C57Bl/6JxCBA/2J-f1 állatba, amelyek intraperitonealis úton 0,37 ml 2,5% Avertint kaptak. Azokat az egereket, amelyek a transzgént integrálták, az állatok születése után három héttel nyert farokbiopsziaminták DNS-ének PCR-analízisével azonosítottuk. A pozitív eredményeket DNS-kimutatással (Southemblot) ellenőriztük.
A tej lefejéséhez nőstény, szoptatós állatoknak intraperitonealis úton 2 IU oxitocininjekciót adtunk, majd 10 perccel később az állatokat 0,40 ml 2,5% Avertin intraperitonealis beadásával anesztetizáltuk. Az emlőbimbóhoz szilikoncsövön keresztül egy fejőberendezést kapcsoltunk, majd az emlő enyhe masszírozásával a tejet 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe gyűjtöttük. A tej mennyisége a szoptatási időszak napjától függően változott; egerenként és fejésenként általában 0,1-0,5 ml közötti mennyiségű tejet nyertünk.
3.3. BSSL-variáns expresszálása transzgenikus egerekben
A transzgenikus egereket a kimetszett farokmintákból készített DNS-analízissel azonosítottuk. A szövetmintákat K-proteinázzal inkubáltuk és fenol/kloroform rendszerrel extraháltuk. Az izolált DNS-t olyan primerekkel alkalmaztuk polimeráz-láncreakciókban, amely primerek, ha jelen van az expressziós vektorfragmentumot reprezentáló heterológ bevezetett DNS, amplifikálják a specifikus fragmentumokat. A PCR-adatok ellenőrzése, valamint a lehetséges átrendeződések, az integrált vektorelemek szerkezetének vizsgálata, továbbá annak érdekében, hogy információt nyerjünk az integrált vektorelemek másolatszámáról, az állatokat DNShibridizációs kísérletekkel is analizáltuk.
Az egyik kísérletsorozatban kétféle eljárás szerint 31 egeret analizáltunk, és az eredmények azt mutatták, hogy egyetlen egér hordozta a pS317 plazmidból származó heterológ DNS-vektorelemet. A PCR-analízis és a hibridizációs kísérletek eredménye ugyanez volt (17. ábra). Összességében 65 tesztelt állatból tizet találtunk a pS317 vonatkozásában transzgenikusnak.
A DNS-vektorelemet hordozóként azonosított egeret (alapító állatot) ezt követően pároztattuk, és az FI almot ugyanezekkel az eljárásokkal analizáltuk a transzgénre.
A pS317 transzgenikus nőstények különféle szöveteiből a szoptatási időszak alatt izolált RNS-t agarózformaldehid-gélelektroforézissel elkülönítettük, membránokra vittük próbaként 32P-jelzett BSSL-cDNS-sel hibridizáltuk. Az így nyert eredmények azt mutatják, hogy a laktációs időszakban az expresszió az emlőre korlátozódik (18. ábra).
A tejelválasztás megindítása érdekében oxitocinnal kezelt, anesztetizált alapító állatból tejmintákat gyűjtöttünk, majd az így nyert tejmintákat rekombináns humán BSSL-variáns jelenlétében analizáltuk. Az analízist SDS-PAGE-val, nitro-cellulóz-membránokra történő átvitellel és natív humán BSSL-lel szemben kialakult poliklonális antitestekkel végzett inkubálás útján hajtottuk végre. Az így nyert eredmények bizonyították a rekombináns humán BSSL-variáns transzgenikus egerekből nyert tejben történő expresszióját. A 19. ábra iga13
HU 221 119 Β1 zolja, hogy a rekombináns BSSL-variáns jelen van a transzgenikus egerekből nyert tejben. A különféle pS317 transzgenikus egerekből származó tejminták SDS-PAGE elválasztása és immunkimutatása egy olyan rekombináns BSSL-variáns hatékony termelését mutatja, amely a pS314 transzgenikus egér tejéből származó teljes hosszúságú rekombináns BSSL-hez viszonyítva kisebb látszólagos molekulatömeggel rendelkezik. A pS314 plazmid hasonlít a pS317 plazmidhoz, kivéve azt, hogy a pS314 a genomvariáns helyett teljes hosszúságú humán BSSL-cDNS-t tartalmaz. A kettős sáv, ami minden rágcsáló tejmintájában megjelenik, rágcsáló-BSSL-t reprezentál, és így az antiszérum keresztreaktivitását mutatja. Ezt a következtetést támasztja alá az a további megfigyelés is, hogy ez a kettős sáv megjelenik a 19. ábrának abban a 9. oszlopában, amely tisztított rágcsáló-BSSL-t tartalmaz.
Transzgenikus állatok stabil vonalai alakulnak ki.
Hasonló módon más, humán BSSL-variánsok expresszálására képes transzgenikus állatokat, például nyulakat, szarvasmarhákat vagy juhokat is előállíthatunk.
Deponálás
A Budapesti Szerződés értelmében a következő plazmidokat helyeztük letétbe a DSM-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen):
Plazmid Deponálási szám A letétbe helyezés időpontja
pS309 DSM7101 1992. június 12.
pS310 DSM 7102
pS311 DSM 7103
pS317 DSM 7104
pS147 DSM 7495 1993. február 26.
pS257 DSM 7496
pS299 DSM 9497
pS258 DSM 7501 1993. március 03.
pS259 DSM 7502
Az ábrák rövid ismertetése
1. ábra
A. A különféle BSSL-variánsok expressziójához alkalmazott bovin-papillomavírus (BPV)-alapú vektor térképe.
B. A különféle analizált BSSL-variánsok vázlatos bemutatása. FL jelenti a teljes hosszúságú BSSL-t. Az aktív helyet egy körrel jelezzük, míg a tényleges Nkötésű szénhidrát helyét egy háromszög jelöli. Az ismétlődéseket tartalmazó régiót a vonalkázott terület, a konzervált C-terminálist pedig a fekete sáv jelzi.
2. ábra
BSSL-variánsokat expresszáló sejtvonalakból készített DNS-ek analízise (Southem-blot). A teljes hosszúságú BSSL-t (FL), az A. variánst (A), a B. variánst (B), a
C. variánst (C) és az N. variánst (N) expresszáló sejtvonalakból előállított DNS-eket analizáltuk. A megfelelően preparált, sejteredetű DNS (bal) 5 pg-ját és a tisztított, bakteriális eredetű vektor-DNS (jobb) 1 ng-ját őa/nHI-gyel emésztettük. A DNS-mintákat agarózgélen elválasztottuk, GeneScreen Plus membránra vittük, majd 32P-jelzett humán BSSL-cDNS-sel hibridizáltuk.
3. ábra
Rekombináns BSSL-variánsokat expresszáló izolált sejtvonalakból származó RNS-ek analízise (Northemblot). A teljes hosszúságú BSSL-t (FL), az A. variánst (A), a B. variánst (B), a C. variánst (C) és az N. variánst (N) expresszáló sejtvonalakból előállított teljes RNS 10 pg-ját analizáltuk. Negatív kontrollként (-) egy olyan C127 sejtvonalból származó RNS-t alkalmaztunk, amely egy, az 1. ábra szerinti vektorral azonos, azonban egy BSSL-től független proteint kódoló BPVvektort foglal magában (felső panel). A szűrőket 32Pjelzett BSSL-cDNS-sel hibridizáltuk. A szűrőt ezt követően rágcsáló-p-aktin cDNS-próbával rehibridizáltuk. A β-aktin mRNS-szignálokat (alsó panel) alkalmaztuk belső kontrollként az egyes oszlopokra felvitt RNSmennyiségekhez.
4. ábra
BSSL-aktivitás expressziója a humán BSSL teljes hosszúságú és mutáns formáival transzfektált C127 sejtekben. Cl27 sejteket különféle szerkezetű BSSL-ekkel transzfektáltunk: teljes hosszúságú BSSL (FL), N. variáns (N), C. variáns (C), B. variáns (B) és A. variáns (A). A kezdeti növekedési periódus után kiónokat szelektáltunk, majd a kiónokat konfluenssé válásig hagytuk növekedni. A szelektált kiónok számát (n) feltüntetjük az ábrán. A lipázaktivitást a kondicionált médiumokon határoztuk meg. A lipázaktivitás értékeit pmol szabaddá tett zsírsav/perc/ml kondicionált médiumegységekben fejezzük ki.
5. ábra
A. Teljes hosszúságú és mutáns rekombináns BSSL fehérjekimutatása (Western blotting). A gélre felvitt lipázaktivitás pmol szabaddá tett zsírsav/perc egységekben kifejezett mennyiségei a következők voltak: teljes hosszúságú 0,2 (1. oszlop), N. variáns 0,16 (2. oszlop), C. variáns 0,6 (3. oszlop), B. variáns 0,8 (4. oszlop), valamint natív BSSL 0,1 (5. oszlop). Az alkalmazott antiszérumot nyúlban, humán tejből tisztított BSSL-lel szemben fejlesztettük ki. A méretjelzések (Prestained SDS-PAGE Standards, Low Rangé, BioRad) helyzetét a bal oldalon tüntetjük fel.
B. jV-glikozidáz F-fel kezelt B. variáns fehérjekimutatása (Westem-blot). A B. variánst a Kísérleti eljárások című fejezetben ismertetettek szerint A-glikozidáz F-fel emésztettük. Az 1. oszlop a kezeletlen, míg a 2. oszlop a kezelt B. variánst mutatja.
6. ábra
Teljes hosszúságú és mutáns BSSL epesófüggése. Változó koncentrációjú nátrium-kólát (folytonos vonal) vagy nátrium-dezoxi-kolát (szaggatott vonal) jelenlétében, kondicionált médiumokon meghatároztuk a következők lipázaktivitását: teljes hosszúságú, rekombináns BSSL (*), A. variáns (_), B. variáns (A), C. variáns (), N. variáns (·) és tisztított humán tej-BSSL (O). Az A. variáns esetén a kondicionált médiumot Blue Sepharose-on a Kísérleti eljárások című fejezetben ismertetet14
HU 221 119B1 teknek megfelelően betöményítettük. A megfelelő enzimforrások mennyiségét úgy választottuk meg, hogy azonos maximális aktivitási értékeket nyeljünk, kivéve az A. variánst, amelynek maximális aktivitása a többiének csak egytized része volt. A kontrollkísérletek azt mutatták, hogy a tenyésztőközegek nem befolyásolják a natív BSSL aktivitásának nagyságát vagy epesófüggését (az adatok nem láthatók).
7. ábra
A. Különböző E. coli törzsekkel pGEMEX alkalmazása mellett termelt BSSL RNS-kimutatása (Northemblot). A baktériumokat IPTG-vel indukáltuk, a Kísérleti eljárások című fejezetben ismertetetteknek megfelelően.
A kísérleti körülmények a 2. ábra magyarázatánál megadottak voltak. 1. oszlop: BL21(DE3)pLysS törzs, nem indukált; 2. oszlop: BL21(DE3)pLysS törzs, indukált; 3. oszlop: JM109(DE3) törzs, nem indukált; 4. oszlop: JM109(DE3) törzs, indukált.
B. A rekombináns BSSL különböző E. coli törzsekben pGEMEX alkalmazása melletti expresszióját bemutató, tisztított tej-BSSL-antitestekkel végzett 8-18% SDS-PAGE fehérjekimutatás (Westem-blot). A Kísérleti eljárások című fejezetben leírtak szerint indukáltuk a baktériumokat IPTG-vel, illetve preparáltuk a lizátumból a citoplazma- és periplazmaproteineket. A 2-5. oszlopban (periplazmapreparátumok) és a 7-10. oszlopban (citoplazmapreparátumok) felvitt bakteriális proteinek mennyiségei azonos tenyésztőmennyiséget képviselnek, így a foltok méretei arányosak a termelt mennyiségekkel. 1. oszlop: Pharmacia molekulaméretmarkerek; 2. és 8. oszlop: JM109(DE3) törzs, indukált;
3. és 7. oszlop: JM109(DE3) törzs, nem indukált; 4. és 10. oszlop: BL21(DE3)pLysS törzs, indukált; 5. és 9. oszlop: BL21(DE3)pLysS törzs, nem indukált; 6. oszlop : 25 ng tisztított natív tej-BSSL.
8. ábra
Tisztított rekombináns BSSL és BSSL-variánsok SDS-PAGE-vizsgálata. A teljes hosszúságú rekombináns BSSL-t (FL), valamint az N., B. és C. variánst a korábbiakban ismertetetteknek megfelelően tisztítottuk. Mindegyikből 3 pg-ot használtunk, kivéve a B. variánst, amelyből 1,5 pg-ot alkalmaztunk. A tisztított natív tej-BSSL (NAT) mennyisége 5 pg volt. A méretmarkerek helyzetét a bal oldalon tüntetjük fel.
9. ábra
A nátrium-dezoxi-kolát hatása a rekombináns BSSL és a BSSL-variánsok nátrium-koláttal végzett aktiválására. Változó koncentrációjú nátrium-kólát alkalmazása mellett rekombináns teljes hosszúságú BSSL (·), rekombináns BSSL B. variáns (O), rekombináns BSSL C. variáns () és rekombináns BSSL N. variáns (▲) tisztított preparátumokat, valamint tisztított natív tej-BSSL-t (_.) vizsgáltunk a lipázaktivitásra nézve, dezoxi-kolát nélkül (bal panel), 5 mM dezoxi-kolát jelenlétében (középső panel), illetve 10 mM dezoxi-kolát jelenlétében (jobb panel).
10. ábra
A rekombináns BSSL és a BSSL-variánsok stabilitása különböző pH-értékeken. Natív BSSL-t, rekombináns teljes hosszúságú BSSL-t és BSSL-variánsokat különböző, 2-8 közötti pH-értékű pufferekben 37 °C hőmérsékleten inkubáltunk. Valamennyi puffer 1 mg/ml bovin-szérumalbumint tartalmazott. Harminc perc elteltével egyenlő mintákat vettünk, majd a mintákat a lipázaktivitásra nézve vizsgáltuk. A jelölések jelentései azonosak a 9. ábránál megadottakkal.
11. ábra
A rekombináns BSSL és a BSSL-variánsok hőstabilitása. Tisztított rekombináns teljes hosszúságú BSSL-t, BSSL-variánsokat és natív tej-BSSL-t 50 mM Tris-Cl-pufferben (pH 7,5), a jelzett hőmérsékleteken inkubáltunk. Az egyik mintasorozathoz 1 mg/ml mennyiségű bovin-szérumalbumint (BSA) adtunk. Harminc perc elteltével mintákat vettünk, majd a mintákat a lipázaktivitásra nézve vizsgáltuk. Az aktivitási értékeket valamennyi minta esetén a 0. percnél mért aktivitás százalékaként tüntettük fel. A jelölések jelentései azonosak a 9. ábránál megadottakkal.
12. ábra
Epesók hatása a rekombináns BSSL és BSSL-variánsok tripszin által okozott inaktivációjára. 10 pg tripszint (TPCK-trypsin, Boehringer-Mannheim) tartalmazó 60 pl 1,0 M Tris-Cl (pH 7,4) pufferhez nátriumkólát nélkül (szaggatott vonal) vagy 10 mM nátriumkólát jelenlétében (folytonos vonal) 25 °C hőmérsékleten 15 pl térfogatban lévő 1-4 pg tisztított rekombináns teljes hosszúságú BSSL-t, BSSL-variánsokat és natív tej-BSSL-t adtunk. A jelzett időpontokban mintákat vettünk, majd a mintákat a lipázaktivitásra nézve vizsgáltuk. Az aktivitási értékeket a tripszin nélkül végzett kontrollinkubációk során nyert értékek százalékaként fejezzük ki. A jelölések jelentései azonosak a 9. ábránál megadottakkal.
13. ábra
Eljárás a pS317 plazmid előállítására. A további részleteket a 3.1. szekcióban ismertetjük.
14. ábra
A pS312 plazmid vázlatos szerkezete.
15. ábra
A pS317 plazmid vázlatos szerkezete.
16. ábra
Az ábra a humán BSSL-variáns genomszerkezetnek a WAP-gén első exonjába történő bevezetését mutatja be.
17. ábra
A. A transzgenikus állatok azonosításához alkalmazott PCR-primerek elhelyezkedésének vázlatos bemutatása. Az 5’-primer a WAP és a BSSL-variáns közötti fúzió előtti -148 bp helyzetnél kezdődő WAP-szekvenciában helyezkedik el. A 3’-primer a fúziós pont mögött 400 bp-vel végződő első BSSL-variáns intronban foglal helyet.
B. Az alkalmazott PCR-primerek szekvenciái.
C. A potenciális alapító állatok PCR-analízisének egyik jellegzetes elemzését bemutató agarózgél-elektroforézis. M: molekulatömeg-markerek; 1. oszlop: a pS317 plazmidból létrehozott kontroll-PCR-termék; 2-13. oszlop: a potenciális alapító állatokból származó DNS-preparátumokkal végzett PCR-reakciók.
HU 221 119 Β1
18. ábra pS317 transzgenikus nőstény egérből izolált különféle szövetekből preparált RNS elemzése (RNS-kimutatás; Northem-blot). A szöveteket a laktációs periódus negyedik napján izoláltuk. Az egyes szövetekből származó teljes RNS 10 pg-ját agaróz-formaldehid-elválasztással analizáltuk, membránokra vittük, majd 32Pjelzett humán BSSL-cDNS-sel hibridizáltuk. Az oszlopok jelzéseinek jelentései: Mg: emlő; Li: máj; Ki: vese; Sp: lép; He: szív; Lu: tüdő; Sg: nyálmirigy; Br: agy. A jobb oldalon a nukleotidokben lévő RNS-méreteket tüntetjük fel.
19. ábra pS317 transzgenikus egerekből, teljes hosszúságú cDNS-vektor pS314 transzgenikus egerekből és kontroliállatokból nyert tej fehérjekimutatása (Westem-blot).
A mintákat SDS-PAGE alkalmazásával szeparáltuk, Immobilon szűrőkre vittük, majd natív humán BSSL-lel szemben létrehozott antiszérummal immunkimutatást végeztünk. 1. oszlop: molekulatömeg-markerek; 2., 3. és
4. oszlop: a 91. számú FO pS317 alapító három FI nős10 tényivadékától (FI 30., 31. és 33.) nyert 2 pl tej; 5. oszlop: a 90. számú pS314 alapítótól nyert 2 pl tej; 6., 7. és 8. oszlop: három nem BSSL transzgenikus állattól nyert 2 pl tej; 10. oszlop: tisztított humán natív BSSL.
Szekvenciák jegyzéke
1.számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2428 bázispár
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁLTÍPUS: kettős
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS mRNS-hez
iii) FELTÉTELEZETT: NEM
(iii) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: emlőmirigy (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 82..2319 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: (termék= epesó-stimulált lipáz)
HU 221 119B1 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: exon (B) ELHELYEZKEDÉS: 985..1173 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: exon (B) ELHELYEZKEDÉS: 1174..1377 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: exon (B) ELHELYEZKEDÉS: 1378..1575 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: exon (B) ELHELYEZKEDÉS: 1576..2415 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: mat_peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 151..2316 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: poliA_szignál (B) ELHELYEZKEDÉS: 2397..2402 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő szakasz (B) ELHELYEZKEDÉS: 1756..2283 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: 5’UTR (B) ELHELYEZKEDÉS: 1..81
HU 221 119 Β1 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1756..1788 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1789..1821 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1822..1854 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1855..1887 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1888..1920 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1921..1953 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1954..1986 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1987..2019
HU 221 119 Β1 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2020..2052 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2053..2085 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2086..2118 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2119..2151 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2152..2184 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2185..2217 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2218..2250 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2251..2283
HU 221 119 Β1 (xi) A szekvencia leírása: l.sz. szekvencia:
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG 60
AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT 111
Met -23 Leu Thr Met -20 Gly Arg Leu Gin Leu -15 Val
GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG 159
Val Leu Gly Leu -10 Thr Cys Cys Trp Alá -5 Val Alá Ser Alá Alá 1 Lys Leu
GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 207
Gly Alá 5 Val Tyr Thr Glu Gly Gly 10 Phe Val Glu Gly 15 Val Asn Lys Lys
CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255
Leu 20 Gly Leu Leu Gly Asp 25 Ser Val Asp Ile Phe 30 Lys Gly Ile Pro Phe 35
GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG 303
Alá Alá Pro Thr Lys 40 Alá Leu Glu Asn Pro 45 Gin Pro His Pro Gly Trp 50
CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC 351
Gin Gly Thr Leu 55 Lys Alá Lys Asn Phe 60 Lys Lys Arg Cys Leu 65 Gin Alá
ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC 399
Thr Ile Thr 70 Gin Asp Ser Thr Tyr 75 Gly Asp Glu Asp Cys 80 Leu Tyr Leu
AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC 447
Asn Ile 85 Trp Val Pro Gin Gly Arg 90 Lys Gin Val Ser 95 Arg Asp Leu Pro
GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495
Val 100 Met Ile Trp Ile Tyr Gly 105 Gly Alá Phe Leu 110 Met Gly Ser Gly His 115
GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543
Gly Alá Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu Glu Ile 130 Alá
ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591
Thr Arg Gly Asn 135 Val Ile Val Val Thr 140 Phe Asn Tyr Arg Val 145 Gly Pro
CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639
Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Alá Asn Leu Pro Gly 160 Asn Tyr Gly
HU 221 119 Β1
CTT Leu CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG 687
Arg 165 Asp Gin His Met Alá Ile Alá Trp Val Lys Arg Asn Ile Alá
170 175
GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT 735
Alá 180 Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn 185 Ile Thr Leu Phe 190 Gly Glu Ser Alá 195
GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC 783
Gly Gly Alá Ser Val 200 Ser Leu Gin Thr Leu Ser Pro 205 Tyr Asn Lys Gly 210
CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG 831
Leu Ile Arg Arg 215 Alá Ile Ser Gin Ser Gly Val Alá 220 Leu Ser 225 Pro Trp
GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG 879
Val Ile Gin Lys 230 Asn Pro Leu Phe 235 Trp Alá Lys Lys Val 240 Alá Glu Lys
GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG 927
Val Gly Cys Pro 245 Val Gly Asp Alá 250 Alá Arg Met Alá 255 Gin Cys Leu Lys
GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA 975
Val 260 Thr Asp Pro Arg Alá Leu Thr 265 Leu Alá Tyr Lys 270 Val Pro Leu Alá 275
GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT 1023
Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Val Gly Phe 285 Val Pro Val Ile 290
GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC 1071
Asp Gly Asp Phe 295 Ile Pro Alá Asp Pro Ile Asn Leu 300 Tyr Alá 305 Asn Alá
GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC 1119
Alá Asp Ile Asp 310 Tyr Ile Alá Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320 Gly His Ile
TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC 1167
Phe Alá Ser 325 Ile Asp Met Pro 330 Alá Ile Asn Lys Gly Asn 335 Lys Lys Val
ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG 1215
Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys
340 345 350 355
GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG 1263
Gly Leu Arg Gly Alá Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp
360 365 370
HU 221 119 Β1
GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT Glu Asn AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT 1311
Alá Gin Asp Pro Ser Gin 375 Lys 380 Lys Lys Thr Val Val Asp 385 Phe
GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG 1359
Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu lle Alá Leu Alá Gin
390 395 400
CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC 1407
His Arg Alá Asn Alá Lys Ser Alá Lys Thr Tyr Alá Tyr Leu Phe Ser
405 410 415
CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT 1455
His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Alá Asp His
420 425 430 435
GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG 1503
Alá Asp Asp He Gin Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Alá Thr Pro Thr
440 445 450
GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC 1551
Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Alá Met He Alá Tyr
455 460 465
TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT 1599
Trp Thr Asn Phe Alá Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Alá
470 475 480
GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG 1647
Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu
485 490 495
GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA 1695
Glu lle Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg
500 505 510 515
ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA 1743
Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Alá Leu Pro Thr
520 525 530
GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG 1791
Val Thr Asp Gin Glu Alá Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
535 540 545
GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG 1839
Alá Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Alá Pro Val Pro
550 555 560
CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC 1887
Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
565 570 575
HU 221 119B1
GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG 1935
Gly 580 Alá Pro Pro Val Pro 585 Pro Thr Gly Asp Ser 590 Gly Alá Pro Pro Val 595
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC 1983
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
600 605 610
TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC 2031
Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro
615 620 625
GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT 2079
Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
630 635 640
GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC 2127
Asp Alá Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro
645 650 655
CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG 2175
Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Thr Pro Thr
660 665 670 675
GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC 2223
Gly Asp Ser Glu Thr Alá Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá
680 685 690
CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT GTG CCC CCC 2271
Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Alá Alá Pro Val Pro Pro
695 700 705
ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA 2326
Thr Asp Asp Ser Lys Glu Alá Gin Met Pro Alá Val Ile Arg Phe 710 715 720
TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA 2386
GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA 2428
2.számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 745 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein
HU 221 119 Β1 (xi) A szekvencia leírása: 2.sz. szekvencia:
Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gin Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys
-23 -20 -15 -10
Cys Trp Alá Val Alá Ser Alá Alá Lys Leu Gly Alá Val Tyr Thr Glu
-5 1 5
Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp
10 15 20 25
Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá
30 35 40
Leu Glu Asn Pro Gin Pro His Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá
45 50 55
Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gin Alá Thr Ile Thr Gin Asp Ser
60 65 70
Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gin
75 80 85
Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr
90 95 100 105
Gly Gly Alá Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Alá Asn Phe Leu Asn
110 115 120
Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Alá Thr Arg Gly Asn Val Ile
125 130 135
Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr
140 145 150
Gly Asp Alá Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met
155 160 165
Alá Ile Alá Trp Val Lys Arg Asn Ile Alá Alá Phe Gly Gly Asp Pro
170 175 180 185
Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Alá Gly Gly Alá Ser Val Ser
190 195 200
Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Alá Ile
205 210 215
HU 221 119 Β1
Ser Gin Ser 220 Gly Val Alá Leu Ser 225
Leu Phe 235 Trp Alá Lys Lys Val 240 Alá
Asp 250 Alá Alá Arg Met Alá 255 Gin Cys
Leu Thr Leu Alá Tyr 270 Lys Val Pro
Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val Pro
Alá Asp Pro 300 Ile Asn Leu Tyr Alá 305
Alá Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320 Gly
Pro 330 Alá Ile Asn Lys Gly 335 Asn Lys
Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr Ile
Thr Thr Phe Asp 365 Val Tyr Thr Glu
Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val Val 385
Leu Val 395 Pro Thr Glu Ile Alá 400 Leu
Ser 410 Alá Lys Thr Tyr Alá 415 Tyr Leu
Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly Alá
Val Phe Gly Lys Pro Phe Alá Thr
445
Trp Val Ile Gin Lys Asn Pro 230
Lys Val Gly Cys Pro Val Gly 245
Lys Val Thr Asp Pro Arg Alá 260 265
Alá Gly Leu Glu Tyr Pro Met 275 280
Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro 295
Alá Alá Asp Ile Asp Tyr Ile 310
Ile Phe Alá Ser Ile Asp Met 325
Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr 340 345
Lys Gly Leu Arg Gly Alá Lys 355 360
Trp Alá Gin Asp Pro Ser Gin 375
Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe 390
Gin His Arg Alá Asn Alá Lys 405
Ser His Pro Ser Arg Met Pro 420 425
His Alá Asp Asp Ile Gin Tyr 435 440
Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp 455
HU 221 119 Β1
Arg Thr Val Ser Lys Alá Met lle Alá Tyr Trp Thr Asn Phe Alá Lys 460 465 470
Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Alá Val Pro Thr His Trp Glu 475 480 485
Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu lle Thr Lys Lys Met
490 495 500 505
Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr
510 515 520
Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Alá Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin Glu Alá 525 530 535
Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Alá Thr Pro Val Pro Pro 540 545 550
Thr Gly Asp Ser Glu Thr Alá Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly 555 560 565
Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro
570 575 580 585
Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
590 595 600
Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val 605 610 615
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp 620 625 630
Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Alá Gly Pro Pro Pro 635 640 645
Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
650 655 660 665
Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Alá
670 675 680
Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr 685 690 695
Gly Asp Ser Glu Alá Alá Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu 700 705 710
Alá Gin Met Pro Alá Val lle Arg Phe 715 720
HU 221 119 Β1
3. számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 722 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) MOLEKULATÍPUS: protein (íii) FELTÉTELEZETT: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: Emlőmirigy (xi) A szekvencia leírása: 3.sz. szekvencia:
Alá Lys 1 Leu Gly Alá Val 5 Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp He Phe Lys Gly
20 25 30
He Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá Leu Glu Asn Pro Gin Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gin Alá Thr He Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn He Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Val Met He Trp He Tyr Gly Gly Alá Phe Leu Met Gly
100 105 110
Ser Gly His Gly Alá Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
115 120 125
Glu He Alá Thr Arg Gly Asn Val He Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130 135 140
Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Alá Asn Leu Pro Gly
145 150 155 160
HU 221 119B1
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gin His Met Alá 170 lle Alá Trp Val Lys 175 Arg
Asn He Alá Alá 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn lle Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Alá 195 Gly Gly Alá Ser Val 200 Ser Leu Gin Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu lle Arg Arg 215 Alá lle Ser Gin Ser 220 Gly Val Alá Leu
Ser 225 Pro Trp Val lle Gin 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Alá Lys Lys Val 240
Alá Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val Gly Asp 250 Alá Alá Arg Met Alá 255 Gin
Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg Alá 265 Leu Thr Leu Alá Tyr 270 Lys Val
Pro Leu Alá 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val
Pro Val 290 lle Asp Gly Asp Phe 295 lle Pro Alá Asp Pro 300 lle Asn Leu Tyr
Alá 305 Asn Alá Alá Asp lle 310 Asp Tyr lle Alá Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His lle Phe Alá 325 Ser lle Asp Met Pro 330 Alá lle Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Val Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr
He Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Alá 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Val Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Alá Gin Asp Pro 375 Ser Gin Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val
Val 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Val Leu Phe Leu Val 395 Pro Thr Glu lle Alá 400
Leu Alá Gin His Arg 405 Alá Asn Alá Lys Ser 410 Alá Lys Thr Tyr Alá 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly
HU 221 119 Β1
Alá Asp His Alá Asp Asp 435
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg 450 lle Alá Tyr Trp Thr Asn 465 470
Asp Ser Alá Val Pro Thr 485
Gly Tyr Leu Glu He Thr 500
Ser Leu Arg Thr Asn Phe 515
Leu Pro Thr Val Thr Asp 530
Asp Ser Glu Alá Thr Pro 545 550
Pro Val Pro Pro Thr Gly 565
Gly Asp Ser Gly Alá Pro 580
Pro Pro Val Pro Pro Thr 595
Thr Gly Asp Ser Gly Alá 610
Alá Pro Pro Val Pro Pro 625 630
Pro Thr Gly Asp Alá Gly 645
Gly Alá Pro Pro Val Pro 660
Thr Pro Thr Gly Asp Ser 675
Ser Gly Alá Pro Pro Val 690 lle Gin Tyr Val Phe 440
Pro Gin Asp Arg Thr 455
Phe Alá Lys Thr Gly 475
His Trp Glu Pro Tyr 490
Lys Lys Met Gly Ser 505
Leu Arg Tyr Trp Thr 520
Gin Glu Alá Thr Pro 535
Val Pro Pro Thr Gly 555
Asp Ser Gly Alá Pro 570
Pro Val Pro Pro Thr 585
Gly Asp Ser Gly Alá 600
Pro Pro Val Pro Pro 615
Thr Gly Asp Ser Gly 635
Pro Pro Pro Val Pro 650
Pro Thr Gly Asp Ser 665
Glu Thr Alá Pro Val 680
Pro Pro Thr Gly Asp 695
Gly Lys Pro Phe Alá 445
Val Ser Lys Alá Met 460
Asp Pro Asn Met Gly 480
Thr Thr Glu Asn Ser 495
Ser Ser Met Lys Arg 510
Leu Thr Tyr Leu Alá 525
Val Pro Pro Thr Gly 540
Asp Ser Glu Thr Alá 560
Pro Val Pro Pro Thr 575
Gly Asp Ser Gly Alá 590
Pro Pro Val Pro Pro 605
Thr Gly Asp Ser Gly 620
Alá Pro Pro Val Pro 640
Pro Thr Gly Asp Ser 655
Gly Alá Pro Pro Val 670
Pro Pro Thr Gly Asp 685
Ser Glu Alá Alá Pro 700
HU 221 119 Β1
Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Alá Gin Met Pro Alá Val Ile 705 710 715 720
Arg Phe
4.számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 535 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) MOLEKULATÍPUS: protein (iii) FELTÉTELEZETT: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: Emlőmirigy (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: Peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 1..535 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: (jelzés = A változat) (xi) A szekvencia leírása: 4.sz. szekvencia:
Alá Lys Leu Gly Alá Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
20 25 30
Ile Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá Leu Glu Asn Pro Gin Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gin Alá Thr Ile Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg
90 95
HU 221 119 Β1
Asp Leu Pro Val 100 Met Ile Trp Ile Tyr 105 Gly Gly Alá Phe Leu 110 Met Gly
Ser Gly His 115 Gly Alá Asn Phe Leu 120 Asn Asn Tyr Leu Tyr 125 Asp Gly Glu
Glu Ile 130 Alá Thr Arg Gly Asn 135 Val He Val Val Thr 140 Phe Asn Tyr Arg
Val 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp 155 Alá Asn Leu Pro Gly 160
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gin His Met Alá 170 Ile Alá Trp Val Lys 175 Arg
Asn Ile Alá Alá 180 Phe Gly Gly Asp Pro 185 Asn Asn He Thr Leu 190 Phe Gly
Glu Ser Alá 195 Gly Gly Alá Ser Val 200 Ser Leu Gin Thr Leu 205 Ser Pro Tyr
Asn Lys 210 Gly Leu He Arg Arg 215 Alá He Ser Gin Ser 220 Gly Val Alá Leu
Ser 225 Pro Trp Val Ile Gin 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Alá Lys Lys Val 240
Alá Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val Gly Asp 250 Alá Alá Arg Met Alá 255 Gin
Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg Alá 265 Leu Thr Leu Alá Tyr 270 Lys Val
Pro Leu Alá 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val
Pro Val 290 Ile Asp Gly Asp Phe 295 He Pro Alá Asp Pro 300 He Asn Leu Tyr
Alá 305 Asn Alá Alá Asp Ile 310 Asp Tyr Ile Alá Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His Ile Phe Alá 325 Ser Ile Asp Met Pro 330 Alá Ile Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Val Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr
He Thr Lys Gly Leu Arg Gly Alá Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
355 360 365
HU 221 119B1
Glu Ser Trp Alá Gin Asp Pro Ser Gin Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val
370 375
Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Alá
385 390 395 400
Leu Alá Gin His Arg Alá Asn Alá Lys Ser Alá Lys Thr Tyr Alá Tyr
405 410 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
420 425 430
Alá Asp His Alá Asp Asp Ile Gin Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Alá
435 440 445
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Alá Met
450 455 460
Ile Alá Tyr Trp Thr Asn Phe Alá Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asp Ser Alá Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
500 505 510
Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Alá
515 520 525
Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin
530 535
5.számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 546 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (iii) FELTÉTELEZETT: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens
HU 221 119 Β1 (F) SZÖVETTÍPUS: Emlőmirigy (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: Peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 1..546 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: (jelzés = B változat) (xi) A szekvencia leírása: 5.sz. szekvencia:
Alá 1 Lys Leu Gly Alá 5 Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
20 25 30
Ile Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá Leu Glu Asn Pro Gin Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gin Alá Thr Ile Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Alá Phe Leu Met Gly
100 105 110
Ser Gly His Gly Alá Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
115 120 125
Glu Ile Alá Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130 135 140
Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Alá Asn Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Alá Ile Alá Trp Val Lys Arg
165 170 175
Asn Ile Alá Alá Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
180 185 190
Glu Ser Alá Gly Gly Alá Ser Val Ser Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr
195 200 205
HU 221 119 Β1
Asn Lys 210 Gly Leu He Arg Arg 215 Alá He Ser Gin Ser 220 Gly Val Alá Leu
Ser 225 Pro Trp Val He Gin 230 Lys Asn Pro Leu Phe 235 Trp Alá Lys Lys Val 240
Alá Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val Gly Asp 250 Alá Alá Arg Met Alá 255 Gin
Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg Alá 265 Leu Thr Leu Alá Tyr 270 Lys Val
Pro Leu Alá 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280 Met Leu His Tyr Val 285 Gly Phe Val
Pro Val 290 lle Asp Gly Asp Phe 295 lle Pro Alá Asp Pro 300 He Asn Leu Tyr
Alá 305 Asn Alá Alá Asp lle 310 Asp Tyr He Alá Gly 315 Thr Asn Asn Met Asp 320
Gly His He Phe Alá 325 Ser He Asp Met Pro 330 Alá He Asn Lys Gly 335 Asn
Lys Lys Val Thr 340 Glu Glu Asp Phe Tyr 345 Lys Leu Val Ser Glu 350 Phe Thr
lle Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Alá 360 Lys Thr Thr Phe Asp 365 Val Tyr Thr
Glu Ser 370 Trp Alá Gin Asp Pro 375 Ser Gin Glu Asn Lys 380 Lys Lys Thr Val
Val 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Val Leu Phe Leu Val 395 Pro Thr Glu He Alá 400
Leu Alá Gin His Arg 405 Alá Asn Alá Lys Ser 410 Alá Lys Thr Tyr Alá 415 Tyr
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met Pro 425 Val Tyr Pro Lys Trp 430 Val Gly
Alá Asp His 435 Alá Asp Asp He Gin 440 Tyr Val Phe Gly Lys 445 Pro Phe Alá
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gin Asp Arg Thr Val 460 Ser Lys Alá Met
He Alá Tyr Trp Thr Asn Phe Alá Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465
470
475
480
HU 221 119 Β1
Asp Ser Alá Val Pro 485 Thr His Trp Glu Pro 490 Tyr Thr Thr Glu Asn 495 Ser
Gly Tyr Leu Glu 500 He Thr Lys Lys Met 505 Gly Ser Ser Ser Met 510 Lys Arg
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520 Tyr Trp Thr Leu Thr 525 Tyr Leu Alá
Len Pro 530 Thr Val Thr Asp Gin 535 Lys Glu Alá Gin Met 540 Pro Alá Val He
Arg Phe
545
6. számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 568 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) MOLEKULATÍPUS: protein (iii) FELTÉTELEZETT: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: Emlőmirigy (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: Peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 1..568 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: (jelzés = C változat) (xi) A szekvencia leírása: 6.sz. szekvencia:
Alá Lys Leu Gly Alá Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp He Phe Lys Gly
25 30
HU 221 119 Β1
He Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá Leu Glu Asn Pro Gin Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gin Alá Thr Ile Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn He Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Val Met Ile Trp He Tyr Gly Gly Alá Phe Leu Met Gly
100 105 110
Ser Gly His Gly Alá Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
115 120 125
Glu Ile Alá Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130 135 140
Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Alá Asn Leu Pro Gly
145 150 155 160
Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met Alá Ile Alá Trp Val Lys Arg
165 170 175
Asn Ile Alá Alá Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn He Thr Leu Phe Gly
180 185 190
Glu Ser Alá Gly Gly Alá Ser Val Ser Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr
195 200 205
Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Alá Ile Ser Gin Ser Gly Val Alá Leu
210 215 220
Ser Pro Trp Val Ile Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Alá Lys Lys Val
225 230 235 240
Alá Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Alá Alá Arg Met Alá Gin
245 250 255
Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Alá Leu Thr Leu Alá Tyr Lys Val
260 265 270
Pro Leu Alá Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
275 280 285
Pro Val He Asp Gly Asp Phe Ile Pro Alá Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290 295 300
HU 221 119 Β1
Alá Asn Alá Alá Asp Ile Asp Tyr Ile Alá Gly Thr Asn Asn Met Asp
305 310 315 320
Gly His Ile Phe Alá Ser Ile Asp Met Pro Alá Ile Asn Lys Gly Asn
325 330 335
Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr 340 345 350
Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Alá Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 365
Glu Ser Trp Alá Gin Asp Pro Ser Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 375 380
Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Alá
385 390 395 400
Leu Alá Gin His Arg Alá Asn Alá Lys Ser Alá Lys Thr Tyr Alá Tyr
405 410 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430
Alá Asp His Alá Asp Asp Ile Gin Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Alá 435 440 445
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Alá Met 450 455 460
Ile Alá Tyr Trp Thr Asn Phe Alá Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly
465 470 475 480
Asp Ser Alá Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
485 490 495
Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg 500 505 510
Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Alá 515 520 525
Leu Pro Thr Val Thr Asp Gin Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly 530 535 540
Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Lys Glu Alá 545 550 555 560
Gin Met Pro Alá Val Ile Arg Phe 565
HU 221 119 Β1
7. számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 722 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) MOLEKULATÍPUS: protein (iii) FELTÉTELEZETT: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: Emlőmirigy (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: Peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 1..722 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: (jelzés = N változat) (xi) A szekvencia leírása: 7. sz. szekvencia:
Alá Lys 1 Leu Gly Alá 5 Val Tyr Thr Glu Gly 10 Gly Phe Val Glu Gly 15 Val
Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp lle Phe Lys Gly
20 25 30
lle Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá Leu Glu Asn Pro Gin Pro His
35 40 45
Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50 55 60
Leu Gin Alá Thr lle Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Asn lle Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Val Met lle Trp lle Tyr Gly Gly Alá Phe Leu Met Gly
100 105 110
HU 221 119 Β1
Ser Gly His 115 Gly Alá Asn Phe Leu 120
Glu lle 130 Alá Thr Arg Gly Asn 135 Val
Val 145 Gly Pro Leu Gly Phe 150 Leu Ser
Asn Tyr Gly Leu Arg 165 Asp Gin His
Asn lle Alá Alá 180 Phe Gly Gly Asp
Glu Ser Alá 195 Gly Gly Alá Ser Val 200
Asn Lys 210 Gly Leu lle Arg Arg 215 Alá
Ser 225 Pro Trp Val lle Gin 230 Lys Asn
Alá Glu Lys Val Gly 245 Cys Pro Val
Cys Leu Lys Val 260 Thr Asp Pro Arg
Pro Leu Alá 275 Gly Leu Glu Tyr Pro 280
Pro Val 290 lle Asp Gly Asp Phe 295 lle
Alá 305 Asn Alá Alá Asp lle 310 Asp Tyr
Gly His lle Phe Alá 325 Ser lle Asp
Lys Lys Val Thr 340 Glu Glu Asp Phe
lle Thr Lys 355 Gly Leu Arg Gly Alá 360
Glu Ser 370 Trp Alá Gin Asp Pro 375 Ser
Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu 125
Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg 140
Gly Asp Alá Asn Leu Pro Gly 155 160
Alá lle Alá Trp Val Lys Arg 170 175
Asn Gin He Thr Leu Phe Gly 190
Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr 205
Ser Gin Ser Gly Val Alá Leu 220
Leu Phe Trp Alá Lys Lys Val 235 240
Asp Alá Alá Arg Met Alá Gin 250 255
Leu Thr Leu Alá Tyr Lys Val 270
Leu His Tyr Val Gly Phe Val 285
Alá Asp Pro lle Asn Leu Tyr 300
Alá Gly Thr Asn Asn Met Asp 315 320
Pro Alá lle Asn Lys Gly Asn 330 335
Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr 350
Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 365
Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 380
HU 221 119 Β1
Val 385 Asp Phe Glu Thr Asp 390 Val Leu
Leu Alá Gin His Arg 405 Alá Asn Alá
Leu Phe Ser His 420 Pro Ser Arg Met
Alá Asp His 435 Alá Asp Asp Ile Gin 440
Thr Pro 450 Thr Gly Tyr Arg Pro 455 Gin
Ile 465 Alá Tyr Trp Thr Asn 470 Phe Alá
Asp Ser Alá Val Pro 485 Thr His Trp
Gly Tyr Leu Glu 500 Ile Thr Lys Lys
Ser Leu Arg 515 Thr Asn Phe Leu Arg 520
Leu Pro 530 Thr Val Thr Asp Gin 535 Glu
Asp 545 Ser Glu Alá Thr Pro 550 Val Pro
Pro Val Pro Pro Thr 565 Gly Asp Ser
Gly Asp Ser Gly 580 Alá Pro Pro Val
Pro Pro Val 595 Pro Pro Thr Gly Asp 600
Thr Gly 610 Asp Ser Gly Alá Pro 615 Pro
Alá 625 Pro Pro Val Pro Pro 630 Thr Gly
Pro Thr Gly Asp Alá Gly Pro Pro
645
Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Alá 395 400
Lys Ser Alá Lys Thr Tyr Alá Tyr 410 415
Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 425 430
Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Alá 445
Asp Arg Thr Val Ser Lys Alá Met 460
Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly 475 480
Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser 490 495
Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg 505 510
Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Alá 525
Alá Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly 540
Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Alá 555 560
Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr 570 575
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá 585 590
Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro 605
Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly 620
Asp Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro 635 640
Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser 650 655
HU 221 119 Β1
Gly Alá Pro Pro 660 Val Pro Pro Thr Gly Asp 665 Ser Gly Alá Pro 670 Pro Val
Thr Pro Thr 675 Gly Asp Ser Glu Thr 680 Alá Pro Val Pro Pro 685 Thr Gly Asp
Ser Gly 690 Alá Pro Pro Val Pro 695 Pro Thr Gly Asp Ser 700 Glu Alá Alá Pro
Val 705 Pro Pro Thr Asp Asp 710 Ser Lys Glu Alá Gin 715 Met Pro Alá Val Ile 720
Arg Phe
8. számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2184 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) (iii) FELTÉTELEZETT: NEM (iii) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: emlőmirigy (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 82..2088 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: (jelzés = T változat) (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: mat_peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 151..2085
HU 221 119B1 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő szakasz (B) ELHELYEZKEDÉS: 1756..2052 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1756..1788 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1789..1821 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1822..1854 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1855..1887 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1888..1920 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1921..1953 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1954..1986 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 1987..2019
HU 221 119 Β1 (ix) JELLEGZETESSÉG:
(A) NÉV/KULCSSZÓ: ismétlődő egység (B) ELHELYEZKEDÉS: 2020..2052 (xi) A szekvencia leírása: 8. sz. szekvencia:
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG 60
AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC Met Leu Thr ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT Met Gly Arg Leu Gin Leu Val 111
-23 -20 -15
GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG 159
Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Alá -10 -5 Val Alá Ser Alá Alá Lys Leu 1
GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG 207
Gly Alá 5 Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe 10 Val Glu Gly Val Asn Lys Lys 15
CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC 255
Leu Gly 20 Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp 25 Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe 30 35
GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG 303
Alá Alá Pro Thr Lys Alá Leu Glu Asn 40 Pro 45 Gin Pro His Pro Gly Trp 50
CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC 351
Gin Gly Thr Leu Lys Alá Lys Asn Phe 55 60 Lys Lys Arg Cys Leu Gin Alá 65
ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC 399
Thr Ile Thr Gin Asp Ser Thr Tyr Gly Asp 70 75 Glu Asp Cys Leu Tyr Leu 80
AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC 447
Asn Ile 85 Trp Val Pro Gin Gly Arg Lys 90 Gin Val Ser Arg Asp Leu Pro 95
GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT 495
Val Met 100 Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Alá 105 Phe Leu Met Gly Ser Gly His 110 115
GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC 543
Gly Alá Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu 120 Tyr 125 Asp Gly Glu Glu Ile Alá 130
ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC 591
Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr 135 140 Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro 145
HU 221 119 Β1
CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC
Leu Gly Phe 150 Leu Ser Thr Gly Asp Alá Asn 155 Leu Pro Gly 160 Asn Tyr Gly
CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG
Leu Arg Asp Gin His Met Alá Ile Alá Trp Val Lys Arg Asn Ile Alá
165 170 175
GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT
Alá Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Alá
180 185 190 195
GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC
Gly Gly Alá Ser Val Ser Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
200 205 210
CTC ATC CGG OGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC CTG GCC CTG AGT CCC TGG
Leu Ile Arg Arg Alá Ile Ser Gin Ser Gly Val Alá Leu Ser Pro Trp
215 220 225
GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG CTG GCT GAG AAG
Val Ile Gin Lys Asn Pro Leu Phe Trp Alá Lys Lys Val Alá Glu Lys
230 235 240
GTG GGT TGC CCT GTG GCT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TCT CTG AAG
Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Alá Alá Arg Met Alá Gin Cys Leu Lys
245 250 255
GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA
Val Thr Asp Pro Arg Alá Leu Thr Leu Alá Tyr Lys Val Pro Leu Alá
260 265 270 275
GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT CTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT
Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile
280 285 290
GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC
Asp Gly Asp Phe Ile Pro Alá Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Alá Asn Alá
295 300 305
GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC
Alá Asp Ile Asp Tyr Ile Alá Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
310 315 320
TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC
Phe Alá Ser Ile Asp Met Pro Alá Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val
325 330 335
ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG
Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys
340 345 350 355
GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT CTC TAC ACC GAG TCC TGG
Gly Leu Arg Gly Alá Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr GlU Ser Trp
360 365 370
639
687
735
783
831
879
927
975
1023
1071
1119
1167
1215
1263
HU 221 119B1
GCC CAG Alá Gin GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT
Asp Pro Ser Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val 385 Asp Phe
375 380
GAG ACC GAT CTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG
Glu Thr Asp 390 Val Leu Phe Leu Val Pro 395 Thr Glu Ile Alá 400 Leu Alá Gin
CAC AGA GCC AAT GCC AAG ACT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC
His Arg 405 Alá Asn Alá Lys Ser Alá Lys 410 Thr Tyr Alá 415 Tyr Leu Phe Ser
CAT CCC TCT CGG ATG CCC CTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT
His Pro 420 Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro 425 Lys Trp 430 Val Gly Alá Asp His 435
GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG
Alá Asp Asp Ile Gin 440 Tyr Val Phe Gly Lys 445 Pro Phe Alá Thr Pro 450 Thr
GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC
Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val 455 460 Ser Lys Alá Met Ile 465 Alá Tyr
TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT
Trp Thr Asn 470 Phe Alá Lys Thr Gly Asp 475 Pro Asn Met Gly Asp 480 Ser Alá
GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG
Val Pro 485 Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr 490 Thr Glu Asn 495 Ser Gly Tyr Leu
GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA
Glu Ile 500 Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser 505 Ser Met 510 Lys Arg Ser Leu Arg 515
ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA
Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu 520 Thr 525 Tyr Leu Alá Leu Pro 530 Thr
GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG
Val Thr Asp Gin Glu 535 Alá Thr Pro Val 540 Pro Pro Thr Gly Asp 545 Ser Glu
GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG
Alá Thr Pro 550 Val Pro Pro Thr Gly Asp 555 Ser Glu Thr Alá 560 Pro Val Pro
CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC
Pro Thr 565 Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro 570 Val Pro Pro 575 Thr Gly Asp Ser
GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG
Gly Alá 580 Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly 585 Asp Ser 590 Gly Alá Pro Pro Val 595
1311
1359
1407
1455
1503
1551
1599
1647
1695
1743
1791
1839
1887
1935
HU 221 119 Β1
CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC CTG CCG CCC ACG GGT GAC 1983
Pro Pro Thr Gly Asp 600 Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
605 610
TCC GGG GCC CCC CCC CTG CCG CCC ACG GCT GAC TCC GGG GCC CCC CCT 2031
Ser Gly Alá Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá Pro Pro
615 620 625
GTG CCC CCC AGA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA CTC ATT 2079
Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Alá Gin Met Pro Alá Val Ile
630 635 640
AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG 2135
Arg Phe
645
GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCT 2184
9. számú szekvencia adatai:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 668 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) A szekvencia leírása: 9. sz. szekvencia:
Met -23 Leu Thr Met -20 Gly Arg Leu Gin Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys
-15 -10
Cys Trp Alá Val Alá Ser Alá Alá Lys Leu Gly Alá Val Tyr Thr Glu
-5 1 5
Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp
10 15 20 25
Ser Val Asp He Phe Lys Gly Ile Pro Phe Alá Alá Pro Thr Lys Alá
30 35 40
Leu Glu Asn Pro Gin Pro His Pro Gly Trp Gin Gly Thr Leu Lys Alá
45 50 55
Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gin Alá Thr Ile Thr Gin Asp Ser
60 65 70
HU 221 119B1
Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn He Trp Val Pro Gin 75 80 85
Gly Arg Lys Gin Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met He Trp He Tyr
95 100 105
Gly Gly Alá Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Alá Asn Phe Leu Asn
110 115 120
Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Alá Thr Arg Gly Asn Val He 125 130 135
Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr 140 145 150
Gly Asp Alá Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gin His Met 155 160 165
Alá He Alá Trp Val Lys Arg Asn He Alá Alá Phe Gly Gly Asp Pro
170 175 180 185
Asn Asn He Thr Leu Phe Gly Glu Ser Alá Gly Gly Alá Ser Val Ser
190 195 200
Leu Gin Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu He Arg Arg Alá He 205 210 215
Ser Gin Ser Gly Val Alá Leu Ser Pro Trp Val He Gin Lys Asn Pro 220 225 230
Leu Phe Trp Alá Lys Lys Val Alá Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly 235 240 245
Asp Alá Alá Arg Met Alá Gin Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Alá
250 255 260 265
Leu Thr Leu Alá Tyr Lys Val Pro Leu Alá Gly Leu Glu Tyr Pro Met
270 275 280
Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe He Pro 285 290 295
Alá Asp Pro He Asn Leu Tyr Alá Asn Alá Alá Asp He Asp Tyr He 300 305 310
Alá Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His He Phe Alá Ser He Asp Met 315 320 325
Pro Alá He Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr 330 335 340 ' 345
HU 221 119 Β1
Lys Leu
Thr Thr
Glu Asn
Leu Val 395
Ser Alá 410
Val Tyr
Val Phe
Arg Thr
Thr Gly 475
Pro Tyr 490
Gly Ser
Trp Thr
Thr Pro
Thr Gly 555
Alá Pro 570
Pro Thr
Gly Alá
Val Ser
Phe Asp 365
Lys Lys 380
Pro Thr
Lys Thr
Pro Lys
Gly Lys 445
Val Ser 460
Asp Pro
Thr Thr
Ser Ser
Leu Thr 525
Val Pro 540
Asp Ser
Pro Val
Gly Asp
Pro Pro 605
Glu Phe 350
Val Tyr
Lys Thr
Glu Ile
Tyr Alá 415
Trp Val 430
Pro Phe
Lys Alá
Asn Met
Glu Asn 495
Met Lys 510
Tyr Leu
Pro Thr
Glu Thr
Pro Pro 575
Ser Gly 590
Val Pro
Thr Ile
Thr Glu
Val Val 385
Alá Leu 400
Tyr Leu
Gly Alá
Alá Thr
Met Ile 465
Gly Asp 480
Ser Gly
Arg Ser
Alá Leu
Gly Asp 545
Alá Pro 560
Thr Gly
Alá Pro
Pro Thr
Thr Lys 355
Ser Trp 370
Asp Phe
Alá Gin
Phe Ser
Asp His 435
Pro Thr 450
Alá Tyr
Ser Alá
Tyr Leu
Leu Arg 515
Pro Thr 530
Ser Glu
Val Pro
Asp Ser
Pro Val 595
Gly Asp 610
Gly Leu
Alá Gin
Glu Thr
His Arg 405
His Pro 420
Alá Asp
Gly Tyr
Trp Thr
Val Pro 485
Glu Ile 500
Thr Asn
Val Thr
Alá Thr
Pro Thr 565
Gly Alá 580
Pro Pro
Ser Gly
Arg Gly
Asp Pro 375
Asp Val 390
Alá Asn
Ser Arg
Asp Ile
Arg Pro 455
Asn Phe 470
Thr His
Thr Lys
Phe Leu
Asp Gin 535
Pro Val 550
Gly Asp
Pro Pro
Thr Gly
Alá Pro 615
Alá Lys 360
Ser Gin
Leu Phe
Alá Lys
Met Pro 425
Gin Tyr 440
Gin Asp
Alá Lys
Trp Glu
Lys Met 505
Arg Tyr 520
Glu Alá
Pro Pro
Ser Gly
Val Pro 585
Asp Ser 600
Pro Val
HU 221 119 Β1
Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Alá
620 625
Ser Lys Glu Alá Gin Met Pro Alá
635 640
Pro Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp 630
Val Ile Arg Phe 645

Claims (41)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. BSSL-aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula, amely polipeptid egy, a teljes hosszúságú natív BSSL 722 aminosavánál rövidebb és 535 aminosavánál hosszabb BSSL-variáns, amely a 3. számú szekvencia 536-722. csoportjaiként bemutatott aminosavszekvenciának csak egy részét tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a BSSL-variáns a C-terminális helyzetben egy fenil-alanin-csoportot tartalmaz.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a BSSL-variáns a Cterminális részében Gln-Met-Pro szekvenciát tartalmaz.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a BSSL-variáns a C-terminális részében a 3. számú szekvencia 712-722. csoportjaiként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a BSSL-variáns 16-nál kevesebb ismétlődő egységből áll.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy egy olyan polipeptidet kódol, amely polipeptid aminosavszekvenciája legalább 90%-ban homológ a Szekvenciák jegyzékében 5., 6. vagy 9. számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciával.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy egy olyan polipeptidet kódol, amely polipeptid a Szekvenciák jegyzékében 5., 6. vagy 9. számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.
  8. 8. Nukleinsavmolekula, amely egy BSSL-aktivitással rendelkező polipeptidet kódol, amelynek aminosavszekvenciája legalább 90%-ban homológ a Szekvenciák jegyzékében a 7. számú szekvenciaként megadott aminosavszekvenciával, kivéve azokat a nukleinsavmolekulákat, amelyek a 187. helyzetben aszparagincsoportot tartalmazó polipeptideket kódolnak.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy egy olyan polipeptidet kódol, amely a Szekvenciák jegyzékében 7. számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.
  10. 10. A Szekvenciák jegyzékében 5., 6. vagy 9. számú szekvenciával rendelkező polipeptid.
  11. 11. Egy, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula által kódolt polipeptid.
  12. 12. Egy 10. vagy 11. igénypont szerinti polipeptid lényegében tiszta formában.
  13. 13. Hibrid gén, amely egy 1-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát és a hibrid gén expressziójának közvetítésére képes nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
  14. 14. Replikációs expressziós vektor, amely egy 13. igénypont szerinti hibrid gént tartalmaz.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti vektor, amely pS258, pS259 vagy pS299 bovin-papillomavírus vektor.
  16. 16. Egy 13. igénypont szerinti hibrid gént tartalmazó sejt.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy C127 rágcsálósejtvonalból vagy E. co/z-ból származik.
  18. 18. Eljárás rekombináns polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy 1-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát olyan hibrid génbe inszertálunk, amely egy specifikus gazdasejtben vagy nem humán organizmusban replikációra képes;
    (ii) a kapott hibrid gént bevezetjük egy gazdasejtbe vagy nem humán organizmusba;
    (iii) a kapott sejtet azonosítjuk és tenyésztőközegben vagy tenyésztőközegen növesztjük, vagy a nem humán organizmust azonosítjuk és reprodukáljuk, a polipeptid expresszálásához; és (iv) az expresszált polipeptidet kinyeijük.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibrid gént pS258, pS259 vagy pS299 bovin-papillomavírus vektor tartalmazza.
  20. 20. Expressziós rendszer, amely egy olyan hibrid gént tartalmaz, amely egy gazdasejtben vagy organizmusban oly módon expresszálható, hogy rekombináns polipeptid termelődik a hibrid gén expresszálásakor, és amely hibrid gént úgy állítjuk elő, hogy egy, az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvenciát a hibrid gén expressziójának közvetítésére képes génbe inszertálunk, azzal a megkötéssel, hogy az expressziós rendszer teljes humán egyedtől (embertől) eltérő.
  21. 21. Eljárás egy BSSL-variáns expressziójára alkalmas transzgenikus nem humán emlős előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy 20. igénypont szerinti expressziós rendszert bevezetünk egy nem humán emlős megtermékenyített petéjébe vagy embriósejtjébe, így az expressziós rendszert beépítjük az emlős csíravonalába, és (ii) az így kapott, beillesztett, megtermékenyített petéből vagy embrióból kifejlett nem humán nőstény emlőst fejlesztünk ki.
  22. 22. Eljárás transzgenikus nem humán emlős előállítására, amely egy BSSL-variáns expressziójára alkal49
    HU 221 119 Β1 más és magából az emlősből származó BSSL expresszálására lényegében képtelen, azzal jellemezve, hogy (i) megszüntetjük az emlős BSSL-expresszáló képességét és így lényegében semmilyen emlős-BSSL nem expresszálódik, majd egy 20. igénypont szerinti expressziós rendszert inszertálunk az emlős csíravonalába úgy, hogy az emlősben egy BSSL-variáns expresszálódik; és/vagy (ii) az emlős-BSSL-gént vagy az emlős-BSSL-génnek egy részét egy 20. igénypont szerinti expressziós rendszerrel helyettesítjük.
  23. 23. Transzgenikus nem humán emlős, amely a genomjában egy 1-9. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti transzgenikus nem humán emlős, amelyben a DNS-szekvencia az emlős csíravonalában van jelen.
  25. 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti transzgenikus nem humán emlős, amelyben a DNS-szekvencia az emlős tejproteingénjében egy hibrid gén formájában van jelen, amely a transzgenikus nem humán emlős tejmirigyében expres szálható.
  26. 26. A 23-25. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus nem humán emlős, amely egér, patkány, nyúl, juh, sertés vagy szarvasmarha.
  27. 27. Egy 22-25. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus nem humán emlős utóda, amely a genomjában hordoz egy 1-9. igénypont szerinti DNS-szekvenciát.
  28. 28. Tej, amely a 25. igénypont szerinti transzgenikus nem humán emlősből származik.
  29. 29. Csecsemőtápszer-készítmény, amely 28. igénypont szerinti tejet tartalmaz.
  30. 30. Csecsemőtápszer-készítmény, amely egy 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmaz.
  31. 31. Eljárás csecsemőtápszer-készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy hagyományos csecsemőtápszer-készítményt egy 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptiddel kiegészítünk.
  32. 32. Gyógyszerkészítmény, amely egy 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmaz.
  33. 33. Egy, a 10-12. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid gyógyászati felhasználásra.
  34. 34. A 32. igénypont szerinti, exokrin hasnyálmirigy-elégtelenséggel összefüggő patológiás állapotok kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti, cysticus fibrosis kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  36. 36. A 34. igénypont szerinti, krónikus pancreatitis kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  37. 37. A 34. igénypont szerinti, zsír-malabszorpció kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  38. 38. A 34. igénypont szerinti, zsíroldékony vitaminok maiabszorpciójának kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  39. 39. A 34. igénypont szerinti, fiziológiás okoknak tulajdonítható zsír-malabszorpció kezelésére alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  40. 40. A 34. igénypont szerinti, tápláléklipidek hasznosításának javítására alkalmazható gyógyszerkészítmény.
  41. 41. A 34. igénypont szerinti, tápláléklipidek koraszülöttekben történő hasznosításának javítására alkalmazható gyógyszerkészítmény.
HU9502561A 1993-03-01 1994-02-25 Variants of bile salt-stimulated lipase, dna molecules encoding them, and transgenic nonhuman mammals HU221119B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9300686A SE9300686D0 (sv) 1993-03-01 1993-03-01 Novel polypeptides
SE9300722A SE9300722D0 (sv) 1993-03-04 1993-03-04 Novel polypeptides ii
PCT/SE1994/000160 WO1994020610A1 (en) 1993-03-01 1994-02-25 Variants of bile salt-stimulated lipase, dna molecules encoding them, and transgenic non-human mammals

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9502561D0 HU9502561D0 (en) 1995-10-30
HUT73398A HUT73398A (en) 1996-07-29
HU221119B1 true HU221119B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=26661673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502561A HU221119B1 (en) 1993-03-01 1994-02-25 Variants of bile salt-stimulated lipase, dna molecules encoding them, and transgenic nonhuman mammals

Country Status (28)

Country Link
US (2) US5827683A (hu)
EP (1) EP0687296B1 (hu)
JP (1) JP3837444B2 (hu)
KR (2) KR100312825B1 (hu)
CN (2) CN1071790C (hu)
AT (1) ATE317429T1 (hu)
AU (1) AU675701B2 (hu)
BR (1) BR9406376A (hu)
CA (1) CA2156083C (hu)
CZ (1) CZ290927B6 (hu)
DE (1) DE69434622T2 (hu)
DK (1) DK0687296T3 (hu)
EE (1) EE9400458A (hu)
ES (1) ES2258262T3 (hu)
FI (1) FI954082A (hu)
HU (1) HU221119B1 (hu)
IL (2) IL144015A (hu)
IS (1) IS4130A (hu)
NO (1) NO953426L (hu)
NZ (1) NZ262529A (hu)
PL (1) PL184960B1 (hu)
PT (1) PT687296E (hu)
RU (1) RU2219239C2 (hu)
SG (1) SG52597A1 (hu)
SK (1) SK285420B6 (hu)
TW (1) TW387013B (hu)
UA (1) UA48109C2 (hu)
WO (1) WO1994020610A1 (hu)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5696087A (en) * 1994-12-01 1997-12-09 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for reducing cholesterol absorption
US5821226A (en) * 1994-12-01 1998-10-13 Oklahoma Medical Research Foundation BAL C-tail drug delivery molecules
CA2206526A1 (en) * 1994-12-01 1996-06-06 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for reducing cholesterol absorption
US5681819A (en) * 1994-12-01 1997-10-28 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for reducing cholesterol absorption
FR2733249B1 (fr) * 1995-04-20 1997-06-06 Biocem Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
SE9501939D0 (sv) * 1995-05-24 1995-05-24 Astra Ab DNA molecules for expression of polypeptides
US6342218B1 (en) 1997-02-14 2002-01-29 Oklahoma Medical Research Foundation Method for treatment of SLE
SE9801424D0 (sv) * 1998-04-22 1998-04-22 Astra Ab Expression methods
AU2001255469A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Monsanto Technology Llc Purification of ace inhibiting polypeptides containing vpp from milk
CA2558754C (fr) 2004-03-31 2015-09-22 Universite De La Mediterranee Glycopeptides derives de structures pancreatiques, anticorps et leurs applications en diagnostic et therapeutique
FR2868424B1 (fr) * 2004-03-31 2008-04-11 Univ Aix Marseille Ii Glycopeptides derives de structures pancreatiques, anticorps et leurs applications en diagnostic et therapeutique
CN100343391C (zh) * 2004-12-31 2007-10-17 中国农业大学 卵巢注射法制备转基因动物
EP2039764A1 (en) * 2007-09-19 2009-03-25 Pevion Biotech AG Truncated secretory aspartyl proteinase 2
EP2629789A1 (en) 2010-10-21 2013-08-28 Swedish Orphan Biovitrum AB (Publ) Method to increase the absorption of unsaturated fatty acids by human infants
JP5850940B2 (ja) * 2010-10-21 2016-02-03 スウェディッシュ オーファン バイオビトラム パブリーク アクチエボラグ ヒト乳児の発育速度を増大させる方法
FR2966734B1 (fr) 2010-10-29 2014-07-18 Max Rombi Composition comprenant au moins une enzyme proteolytique pour son utilisation pour empecher la synthese des triglycerides
WO2012158109A1 (en) * 2011-05-18 2012-11-22 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Low ph protein purification process
CN103088000A (zh) * 2012-03-23 2013-05-08 北京济福霖生物技术有限公司 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4944944A (en) * 1987-11-19 1990-07-31 Oklahoma Medical Research Foundation Dietary compositions and methods using bile salt-activated lipase
US5200183A (en) * 1987-11-19 1993-04-06 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
SE9001985D0 (sv) * 1990-06-01 1990-06-01 Astra Ab New chemical products

Also Published As

Publication number Publication date
EP0687296A1 (en) 1995-12-20
CN1071790C (zh) 2001-09-26
IL108698A0 (en) 1994-05-30
SG52597A1 (en) 1998-09-28
CZ216995A3 (en) 1997-05-14
PL310413A1 (en) 1995-12-11
CA2156083C (en) 2008-07-15
IL144015A (en) 2006-08-20
US5763739A (en) 1998-06-09
HU9502561D0 (en) 1995-10-30
DE69434622T2 (de) 2006-08-24
FI954082A0 (fi) 1995-08-31
NO953426D0 (no) 1995-08-31
ES2258262T3 (es) 2006-08-16
EP0687296B1 (en) 2006-02-08
US5827683A (en) 1998-10-27
SK108595A3 (en) 1997-01-08
CN1346888A (zh) 2002-05-01
IS4130A (is) 1994-09-02
HUT73398A (en) 1996-07-29
JPH08507439A (ja) 1996-08-13
RU2219239C2 (ru) 2003-12-20
NZ262529A (en) 1997-07-27
ATE317429T1 (de) 2006-02-15
CZ290927B6 (cs) 2002-11-13
AU6223794A (en) 1994-09-26
CA2156083A1 (en) 1994-09-15
PT687296E (pt) 2006-05-31
EE9400458A (et) 1996-06-17
CN1187450C (zh) 2005-02-02
DE69434622D1 (de) 2006-04-20
WO1994020610A1 (en) 1994-09-15
BR9406376A (pt) 1996-01-16
AU675701B2 (en) 1997-02-13
NO953426L (no) 1995-08-31
KR100357016B1 (ko) 2002-10-19
JP3837444B2 (ja) 2006-10-25
FI954082A (fi) 1995-08-31
CN1121355A (zh) 1996-04-24
PL184960B1 (pl) 2003-01-31
UA48109C2 (uk) 2002-08-15
TW387013B (en) 2000-04-11
SK285420B6 (sk) 2007-01-04
KR100312825B1 (ko) 2001-12-28
DK0687296T3 (da) 2006-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5616483A (en) Genomic DNA sequences encoding human BSSL/CEL
US20070011754A1 (en) Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
HU221119B1 (en) Variants of bile salt-stimulated lipase, dna molecules encoding them, and transgenic nonhuman mammals
LT4008B (en) Novel polypeptides
PL175404B1 (pl) Wyizolowana cząsteczka DNA i sposób wytwarzania ludzkiego białka BSSL/CEL

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: AREXIS AB, SE

Free format text: FORMER OWNER(S): ASTRA AKTIEBOLAG, SE; ASTRAZENECAAB, SE

HC9A Change of name, address

Owner name: AREXIS AB, SE

Free format text: FORMER OWNER(S): ASTRA AKTIEBOLAG, SE; ASTRAZENECAAB, SE