CN1071790C - 胆盐刺激的脂酶变异体、其制法、用途及编码它的核酸 - Google Patents

胆盐刺激的脂酶变异体、其制法、用途及编码它的核酸 Download PDF

Info

Publication number
CN1071790C
CN1071790C CN94191848A CN94191848A CN1071790C CN 1071790 C CN1071790 C CN 1071790C CN 94191848 A CN94191848 A CN 94191848A CN 94191848 A CN94191848 A CN 94191848A CN 1071790 C CN1071790 C CN 1071790C
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
pro
gly
thr
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN94191848A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1121355A (zh
Inventor
L·布拉克堡
M·艾龙
L·汉森
O·赫奈尔
L·隆德堡
M·施特龙维斯特
J·特奈尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AstraZeneca AB
Original Assignee
Astra AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from SE9300686A external-priority patent/SE9300686D0/xx
Priority claimed from SE9300722A external-priority patent/SE9300722D0/xx
Application filed by Astra AB filed Critical Astra AB
Publication of CN1121355A publication Critical patent/CN1121355A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1071790C publication Critical patent/CN1071790C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/20—Dietetic milk products not covered by groups A23C9/12 - A23C9/18
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/19—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

本发明涉及作为胆盐刺激的脂酶(RSSL；EC3.1.1.1)变异体的新多肽。还涉及编码所述多肽的DNA分子，及含所述DNA分子的亚产物。本发明还涉及生产所述BSSL变异体以及生产能表达BSSL变异体的转基因非人类哺乳动物的方法。此外，本发明涉及所述的转基因动物以及含有来自所述转基因动物的乳的婴儿配方。本发明还涉及含所述多肽的药物组合物，以及所述多肽和DNA分子对于药物制造的用途。

Description

胆盐刺激的脂酶变异体、其制法、用途及编码它的核酸
技术领域
本发明涉及作为胆盐刺激的脂酶(BSSL；EC3.1.1.1.)变异体的新的多肽。也涉及编码所述多肽的DNA分子，涉及含所述DNA分子的亚产品。此外本发明涉及生产所述BSSL变异体和生产能表达BSSL变异体的转基因非人类哺乳动物的方法。而且本发明涉及所述的转基因动物及含此转基因动物乳的婴儿膳食配方。本发明还涉及含所述多肽的药物组合物，所述多肽及制造药物的DNA分子的用途。
背景技术
膳食脂类的水解
膳食脂类是一种重要的能量来源。富含能量的三脂酰甘油占这些脂类的95％以上。一些脂类，如某些脂肪酸和脂溶性维生素，是必需的膳食成分。在胃肠吸收之前，三脂酰甘油和微量成分，如酯化的脂溶性维生素、胆固醇及二脂酰磷脂酰甘油，需要酯键水解以得到疏水性弱、可吸收的产物。通过称为脂酶的特异性酶类催化这些反应。
在人类中，相关的必需脂酶有，胃脂酶、共脂酶依赖的胰脂酶(水解三-和二脂酰甘油)、胰磷脂酶A2(水解二脂酰磷脂酰甘油)和羧基酯水解酶(CEH)(水解固醇酯和脂溶性维生素酯及三、二和单脂酰甘油)。对哺乳的新生儿，胆盐刺激的脂酶(BSSL)在水解上述提到的几种脂类过程中发挥着重要的作用。脂类消化产物和胆盐一起形成混合的吸收微团或单层吸收囊泡(Hernell et al.,1990)。胆盐刺激的脂酶
胆盐刺激的脂酶(BSSL)在有限几个种类，如人类、大猩猩、猫和狗中是乳中成分(Hernell et al.,1989,Hamosh et al.,1986)。在上部小肠内容物中与胆汁混合后，BSSL被初级胆盐(Hernell,1975)特异地激活。约占总乳蛋白1％的BSSL，和乳一起经过胃时不降解，在十二指肠内容物中胆盐保护其不被如胰蛋白酶和糜蛋白酶的胰蛋白酶类失活。
加热处理人乳(巴斯德消毒法62.5℃,30分钟)，使BSSL完全失活(Bjrksten et al.,1980)，使早产儿的脂肪吸收系数降低约1/3(Williamson et al.,1978,Atkinson et al.,1981)，因此由于BSSL和同样脂肪成分的婴儿膳食配方比，新鲜人乳中三脂酰甘油较好利用(Hernell et al.,1991,Chapell et al.,1986)。
BSSL是一种非特异性脂酶(EC3.1.1.1)，它不但大量水解三脂酰甘油，而且水解二和单脂酰甘油，胆固醇酯类及脂溶性维生素酯类(Blckberg&Hernell,1983)。因此，活化后，BSSL本身有能力水解人乳中的大部分脂类，纵使人乳三脂酰甘油的最有效利用需要胃脂酶(EC3.1.1.3)，共脂酶依赖的胰脂酶(EC3.1.1.3)和BSSL(Bernbck et al.,1990)的协同作用。
最近研究表明，乳酶对于新生儿利用长链多不饱和脂肪酸是特别重要的(Hernell et al.,1993)。这些脂肪酸是eicosanoids的重要前体并有助于神经系统的发育。新生儿，尤其早产儿，从前体合成这些脂肪酸的能力有限。因此，认为出生后在一段还未确定的时期内仍然需要它们。
最近从几个实验室研究中已描述了乳脂酶和胰羧基酯水解酶(CEH)(E.C.3.1.1.1)两者cDNA结构的特征(Baba et al.,1991；Hui et al.,1991；Nilsson et al.,1990；Reue etal.,1991)，结论为，乳酶和胰酶是同一基因的产物。BSSL或CEH基因的cDNA序列及推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)也公开在WO91/15234(Oklahoma Medical Research Foundation)和WO91/18923(Aktiebolaget Astra)中。
BSSL是一种单链糖蛋白。推导出的蛋白质(SEQ ID NO:3)含722个氨基酸残基，而且高度糖基化(Abouakilet al.,1989)。这种蛋白质N-端部分的一半同乙酰胆碱脂酶及其它一些脂酶有显著同源性(Nilsson et al.,1990)。
一个暂定的丝氨基残基活性位点定位在第194位丝氨酸；这个丝氨酸两侧的序列同丝氨酸水解酶的共有活性位点序列是一致的。一个暂定的N-糖基化位点、在活性位点丝氨酸N-端的仅7个残基处(Nilsson et al.,1990)。
BSSL在其C-端含16个脯氨酸丰富的重复序列，每个重复序列由11个氨基酸残基组成。重复序列数量的不同似乎主要解释了源于不同种之相应酶之间分子大小和氨基酸构成上的差异(Han et al.,1987；Fontaine et al.,1991；Kyger et al.,1989)。这些重复序列带有占此蛋白15-20％的糖类的大部分(Baba et al.,1991；Abouakil et al.,1989)。
在BSSL和典型的脂酶之间独一无二的结构差别在多肽链的C-端，即由11个氨基酸残基组成的16个富含脯氨酸的重复序列。牛和大鼠相应的胰酶分别只有3和4个重复序列(Han et al.,1987；Kyger et al.,1989)。因此，可以假设即，C-端，或至少部分C-端对于脂酶活性抗乳化的长链三脂酰甘油的活性是必不可少的。脂类吸收异常
脂类吸收异常及由此引起的营养不良，一般原因是管腔内共脂酶依赖的胰脂酶和/或胆盐的水平降低。这种脂酶缺乏的典型例子是囊性纤维性变患者，其中80％的人由于普遍的遗传性紊乱导致终生缺陷，再就是慢性胰腺炎，通常由慢性酒精中毒引起。
目前，治疗胰脂酶缺乏的患者，是口服很大剂量的猪胰酶粗制品。然而，共脂酶依赖的胰脂酶通常由于胃内pH低而失活。使用大剂量的酶不能完全克服此影响。因此大剂量口服胰酶对多数患者是不够的，而且该制品不纯且口味差。
已制定配方的某种药片，能通过胃的酸性区，只在空肠的相对碱性环境中释放出酶。但是，许多胰病患者空肠呈不正常的酸性，在那些情况下药片不能释放酶。
而且，由于目前市场上的制品为非人类来源，有产生免疫反应的危险性，对患者产生有害作用或降低疗效。
此制品进一步的弊端是，和共脂酶依赖的脂酶比，其它脂解活性的内容物尚未陈述。实际上，它们多半含很低水平的BSSL/CEH活性。这可能是许多患囊性纤维性变的患者尽管用补充疗法，但仍患有脂溶性维生素和必需脂肪酸缺乏的一个原因。
因此，强烈需要具有人类脂酶特性和结构并具有广泛底物特异性的产品。此产品能给患一或几种胰脂解酶缺乏的患者口服。使用本发明的产品本身或同含其它脂酶的制品结合满足了这种需要。
本发明构思简述
按照本发明，重组BSSL变异体有稳定的催化活性，但比全长BSSL含较少糖基化位点，由此其生产可能降低糖类的异质性程度。这种复杂性的降低使此重组蛋白易于纯化及描述特征，将导致更有效地生产具有BSSL活性的多肽。
另一方面，糖基化程度的降低减少了对宿主的要求，并允许几种宿主细胞有较高水平的生产。但在另一方面，BSSL变异体糖基化位点数的降低，允许较低等真核生物进行高效生产并限制可引起免疫反应的异常糖基化的潜在危险。这种大小的降低，糖基化复杂性较低也表明与具有很复杂及含大量糖类部分的蛋白质相比较，宿主范围比较广阔。
治疗用BSSL变异体的大小较小，但是活性相等，这意谓着补充所需的物质重量减少了。进一步，重组BSSL变异体缺乏大多数或全部O-糖基化重复单位，可能的优点是降低接受个体中产生免疫反应的危险性。这是因为依赖于产生它的细胞，O-连接的糖可能是很有异源性的。
科学文献指出，天然BSSL粘着在小肠粘液中并通过其吸收。筛选的降低了吸收率的BSSL变异体在较长时期内对膳食脂类底物是有活性的，进而产生高效的腔内消化。这种变异体的例子是具有降低的糖基化的分子。
如上所述，已证实BSSL对新生儿神经系统发育上发挥重要作用的长链多不饱和脂肪酸(Hernellet al.,1993)和维生素的利用是特别重要的。
按照本发明，在此方面更有效的BSSL变异体可经已知方法筛选。截短的酶可能有不同的构象，所述构象影响对不同的脂类底物的特异性。
本发明公开
一方面，本发明涉及编码短于722个氨基酸的BSSL变异体的核酸分子，所说的BSSL变异体含SEQ ID NO:3中所示536-722残基部分氨基酸序列。
术语“部分氨基酸序列”理解为含一个氨基酸及几个氨基酸的序列或几个结合的所述序列。
术语“BSSL变异体”理解为多肽，具有BSSL活性，并且含序列表SEQ ID NO:3所示的人BSSL之部分氨基酸序列。
术语“具有BSSL活性的多肽”理解为至少含有下列特性的多肽
(a)适于口服；
(b)能被特异性胆盐活化；
(c)在小肠内容物中起非特异性脂酶的作用，即能水解脂类，
   相对地与其化学结构和物理状态(乳化的、微团的、可溶
   的)无关；
并且可选择地有一或更多下述特性：
(d)水解有不同链长度及不同不饱和程度之脂肪酸的三脂酰甘
   油的能力；
(e)也有水解二脂酰甘油、单脂酰甘油胆甾烯基酯、溶血磷脂
   酰甘油、视黄基和其它脂溶性维生素酯的能力；
(f)不但有水解三脂酰甘油的sn-1(3)酯键的能力，而且
   有水解sn-2酯键的能力；
(g)不但具有和初级胆盐相互作用的能力，而且有和次级胆盐
   相互作用的能力；
(h)最佳活性依赖胆盐；
(i)在胃内容物中稳定，对其催化效率的影响不会达到任何实
   质程度；
(j)若胆盐存在，稳定地抗胰酶，如胰蛋白酶失活；
(k)结合肝素和肝素衍生物，如硫酸肝素的能力；
(l)和脂-水界面结合的能力；
(m)对低压冻干法足够稳定；
(n)当和食物成分，如人乳或乳膳食成分混合时稳定。
另一些方面，本发明涉及如上所述的核酸分子，其中所说BSSL变异体在其C-端位置有一个苯丙氨酸残基，或在其C-端部分含一个谷氨酰胺-蛋氨酸-脯氨酸(Gln-Met-Pro)序列，另一方面在其C-端部分可替换含有SEQ ID NO:3中第712-722残基所示的氨基酸序列。
在本发明中，术语“C-端位置”命名为最后的C-端残基位置，而术语“C-端部分”可理解为组成BSSL变异体C-端的约50个氨基酸残基。
如上所述本发明进一步涉及核酸分子，其中所说的BSSL变异体含不到16个的重复单位。本发明中术语“重复单位”命名为33个核苷酸的重复单位之一，所述每一核苷酸均在序列表SEQ ID NO:1中有说明。
另一些方面，本发明涉及上述编码一种多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列与序列表中的SEQ ID NO:5、6或9所示的氨基酸序列有至少90％的同源，并涉及编码一种多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列与序列表SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少有90％的同源，但编码187位置上有一个天冬酰胺的多肽的那些核酸分子除外。
本发明也涉及序列表中SEQ ID NO:5、6、7、或9所示的多肽以及如上所说的核酸序列编码的多肽。
本发明还涉及一种含上述核酸分子的杂种基因，一种含所述杂种基因的可复制的表达载体以及含有所述杂种基因的细胞。所述细胞可以是原核细胞、单细胞真核有机体或源于多细胞有机体如哺乳动物的细胞。
在本发明中，“杂种基因”意思是核酸序列，它一方面包含编码如上定义的BSSL变异体的核酸序列，另一方面含有能调控所述杂种基因产物表达的基因之核酸序列。术语“基因”意思是在所需组织能调控和定位杂种基因表达的一个完整的基因和其亚序列。通常，所说的亚序列至少有一或多个启动子区、一个转录起始位点、3′和5′非编码区和结构序列。
优选地，杂种基因通过在体外将编码BSSL变异体的核酸序列插入到用现有技术能调控表达的基因中而形成的。另外，编码BSSL变异体的核酸序列在体内可通过同源重组插入。
在本发明中，术语“可复制的”意思是指载体能在给定类型的它被导入的宿主细胞中复制。紧接核酸的序列上游可提供一个编码信号肽的序列，信号肽的存在保证了由含载体的宿主细胞表达的BSSL变异体的分泌。信号序列可以是天然和核酸序列有关的，或是其它来源的。
载体可以是适于重组DNA方法的任何载体，载体的选择通常依赖于它被导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外单位存在的载体，其复制不依赖染色体复制；此类载体的例子有质粒、噬菌体、粘粒、微小染色体或病毒。另外，载体可以是这样的载体，当其引入宿主细胞时，整合进宿主细胞基因组中，与其整合的染色体一起复制。适宜的载体例子是细菌表达载体和酵母表达载体。本发明的载体可携带上述定义的本发明的任何核酸序列。
另一方面，本发明涉及重组多肽的生产方法，所说方法包括(ⅰ)在能于特异性宿主细胞或有机体中复制的杂种基因中插入上述核酸分子；(ⅱ)将所得的重组杂种基因导入宿主细胞或有机体；(ⅲ)在培养基内或上使所得的细胞生长，或鉴定并繁殖有机体，以表达多肽；和(ⅳ)回收多肽。
用于生长细胞的培养基可以是适于此目的的任何常规培养基。合适的载体可以是上述任何载体，而合适的宿主细胞可以是上述列出的任何类型细胞。用于构建载体和使其引入宿主细胞的方法可以是重组DNA领域中用于此目的的任何已知方法。可以分泌细胞表达的人重组BSSL变异体，即通过细胞膜输出，这依赖于细胞的类型和载体的构成。
如果BSSL变异体由重组宿主细胞内产生，即，细胞不分泌出BSSL变异体，则可通过标准方法，包括通过机械方法，如声处理或匀浆化，或通过酶学或化学方法使细胞裂解，接着进行纯化而回收。
为了分泌，编码BSSL变异体的DNA序列之前应有一编码信号肽的序列，其存在保证了BSSL变异体从细胞中分泌，以致将至少相当比例的表达的BSSL变异体分泌到培养基中并回收。
本发明也涉及到一种表达系统，包括在含有所说的杂种基因的宿主细胞或有机体中可以表达的杂种基因，当杂种基因表达时产生重组多肽，通过将上述核酸序列插入能调节所说杂种基因表达的基因中产生所述的杂种基因。
生产本发明的重组BSSL变异体可能的方法是使用能将BSSL变异体分泌到其乳中的转基因非人类哺乳动物。转基因非人类哺乳动物的使用，其优点是可以以合理的成本获得高产率的重组BSSL变异体，尤其若非人类哺乳动物是母牛时，在乳中生产作为例如婴儿膳食配方的正常组分的重组BSSL变异体以便当使用重组BSSL变异体作为以乳为基本的产品中的营养添加剂时不必过度纯化。
而且在较高等有机体如非人类哺乳动物中生产通常会对哺乳动物蛋白进行正确的加工，如有关上述的翻译后加工过程和适当折叠，也可以得到大量基本上纯的BSSL变异体。
因此，上述表达系统可以是哺乳动物表达系统，其包括编码BSSL变异体的DNA序列，此序列插入到编码非人类哺乳动物乳蛋白的基因中，以便形成在成年哺乳动物雌性乳腺内可表达的杂种基因，所述哺乳动物含有所说杂种基因。
通常认为，作为表达组织的乳腺和编码乳蛋白的基因特别适合于在转基因非人类哺乳动物中生产异源蛋白质，由于乳蛋白在乳腺中通常以高表达水平生产。而且易于大量收集和使用乳。在本发明中，在重组BSSL变异体的生产中使用乳蛋白基因的进一步的益处是，利用表达调节及生产位置(乳腺)在类似其自然生产条件的条件下进行生产。
当在转基因哺乳动物中使用时，上述杂种基因优选地含有编码信号肽的序列，以便能将杂种基因产物正确地分泌到乳腺内。信号肽典型地通常是在所述研究的乳蛋白基因中发现的或是与编码BSSL变异体的DNA序列相关的。但是，能调节杂种基因产物使其分泌到乳腺内的其它信号序列，也是相关的。当然，杂种基因的各种元件应以如此方式融合，以便使基因产物进行正确表达及加工。因此，应将编码所需信号肽的DNA序列与编码BSSL变异体的DNA序列的N-末端部分精确融合。在杂种基因中，编码BSSL变异体的DNA序列，通常含有其终止密码子，但不是其自身的信息裂解和聚腺苷酸位点。通常保留编码BSSL变异体的DNA序列的下游，乳蛋白基因的mRNA加工序列。
许多因素被认为对某个特别杂种基因的实际表达水平有影响。启动子及上述其它调节序列的能力、哺乳动物基因组中表达系统的整合位点、编码BSSL变异体的DNA序列在乳蛋白编码基因中的整合位点、赋予转录后调节元件及其它类似因子对获得的表达水平是相当重要的。根据对影响杂种基因表达水平的各种因子的认识，本领域技术人员知道怎样设计用于本发明目的的表达体系。
所用的乳蛋白基因可源于与表达体系所插入的乳蛋白基因之种相同，或源于别的种。就此而论已表明，乳腺靶基因表达的调节元件在功能上跨跃了种的界限，这也许是由于可能的共同祖先(Hennighausenet al.1990)。
在构建本发明表达体系中所用的编码乳蛋白适宜的基因或其有效的亚序列通常发现于不同哺乳类源的乳清蛋白之中，如乳清酸蛋白(WAP)基因，优选的是鼠源的；和β-乳球蛋白基因，优选的是羊源的。而且可能发现不同来源的酪蛋白基因也适于BSSL变异体的转基因生产，如牛αS1-酪蛋白和兔β-酪蛋白。目前优选的基因是鼠WAP基因，因发现其可在不同转基因动物乳中使许多外源人类蛋白质的高水平表达(Hennighausen et al.1990)。
另一个和本发明表达系统相关的优选序列是能调节高水平表达的所谓表达稳定序列。强有力证据表明，此稳定序列发现于乳蛋白基因附近和上游。
本发明也包括生产能表达BSSL变异体的转基因非人类哺乳动物的方法，包括(a)将上述表达系统进入受精卵或非人类哺乳动物胚胎细胞以便使表达系统掺入哺乳动物种系；和(b)使所得的受精卵或胚胎发育成为成年雌性非人类哺乳动物。
可使用任何合适的技术，如在“Manipulating the MouseEmbryo”,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press 1986中描述的将表达系统掺入哺乳动物种系。例如，几百个分子的表达系统可直接注射进受精卵，如受精的一个细胞卵或其卵原核，或所用哺乳动物的胚胎，此后将微注射的卵转入假孕代育母亲的输卵管，使其发育。
生产能表达BSSL变异体的转基因非人类哺乳动物的方法也包括其中所说的哺乳动物基本上不能表达来自哺乳动物本身的BSSL的方法。所述方法包括(a)损害哺乳动物的BSSL表达能力以便基本上不表达哺乳动物BSSL，并按上述将一个表达系统以使在哺乳动物中表达BSSL变异体的方式插入哺乳动物种系，和/或(b)用如上限定的表达系统取代哺乳动物BSSL基因或其部分。
通过在导致BSSL表达的DNA序列中引入突变可以方便地破坏哺乳动物的BSSL表达能力。所述突变可以包括使DNA序列脱离框架、引入终止密码、缺乏DNA序列的一或多个核苷酸。
可用上述的表达系统或通过熟知的同源重组原理用编码BSSL变异体的DNA序列取代哺乳动物BSSL基因或其部分。
在更重要的方面，本发明涉及在其基因组中有如上DNA序列的转基因非人类哺乳动物。所说DNA序列可优选地存在于哺乳动物的胚系及哺乳动物的乳蛋白基因中。优选地可从包括小鼠、大鼠、兔、羊、猪和牛筛选转基因非人类哺乳动物。
本发明也包括如上转基因非人类哺乳动物的后代及从所述转基因非人类哺乳动物获得的乳。
本发明进一步涉及含如上乳的婴儿配方及上述含BSSL变异体的婴儿配方。婴儿配方可使用常规方法制备，而且可含任何必需的添加剂矿物质、维生素等。
进一步，本发明涉及含如上BSSL变异体的药物组合物及所述BSSL变异体在治疗中的应用。
更进一步，本发明涉及用上述BSSL变异体制造用于治疗与外分泌胰腺功能不全：胆囊纤维化、慢性胰腺炎、脂肪吸收障碍、脂溶性维生素吸收不良、由于病理原因造成的脂肪吸收不良相关的病理状态之药物。本发明也涉及用于药物制造的BSSL变异体对于改善膳食脂类利用的用途，尤其在早产儿中。
实施例1．重组BSSL在真核及原核细胞中的表达1.1实验方法1.1.1重组质粒
被克隆进pUC19中的含2.3kb人BSSL cDNA(Nilsson et al.1990)的质粒pS146经HindⅢ和SalⅠ酶解，将BSSL cDNA导入牛乳头瘤病毒(BPV)表达载体，pS147(图1)。此载体含有位于鼠金属硫因1(mMT-1)控制增强子及启动元件之下(Pavlakis&Hamer,1983)的人BSSL cDNA。mRNA加工信号通过含部分外显子Ⅱ、内含子Ⅱ、外显子Ⅲ及兔β-球蛋白基因下游元件的基因组片段提供。将该转录单位克隆进含整个BPV基因组的载体中。对BPV和BSSL转录单位来说，转录是单方向的。为了使此载体在大肠杆菌中繁殖，该载体还包含pML2d，它是pBR322的衍生物(Sarver et al.1982)。
表达载体pS147和在Harrey肉瘤病毒5′-长末端重复序列及SV40多腺苷酸化信号(Lusd&Botchan,1984)驱动下的编码新霉素抗性基因的载体共转染。
为了在大肠杆菌中表达BSSL，从质粒pT7-7(Ausubel et al,1992)中将BSSL cDNA作为NdeⅠ-BamHⅠ片段亚克隆到pGEMEX-1(Promega,Madison,WI,USA)(Studier & Moffat,1986)中。用这种克隆方法，T7基因10编码序列被前面加起始密码子的编码成熟蛋白质的BSSL基因置换。最终表达载体pGEMEX/BSSL通过使用特异的BSSL内引物，经DNA测序证实。1.1.1.2诱变
指定起始密码ATG中的A为核苷酸1号。对于氨基酸序号，信号肽中的第一个蛋氨酸号为-23，将成熟蛋白质中第一个氨基酸残基，丙氨酸，指定为1号。
为构建缺失变异体A(SEQ ID NO:4)，合成了两个PCR引物，PCR-1和PCR-2(表1)。为了克隆进不同的质粒，产生了HindⅢ、SalⅠ和BamHⅠ位点。没有改变氨基酸序列，在BSSL序列中产生了BclⅠ位点。这样做为了便于加入合成的DNA，以获得其它变异体。引物PCR-2含两个合成的终止密码子。所得的PCR片段经BamHⅠ和HindⅢ酶解并克隆进pUC18以便序列分析。该质粒命名为pS157。正确的PCR片段通过在独一无二的Asp700位点(BSSL cDNA中1405位置)和β-球蛋白基因片段前部的SalⅠ位点与BSSL序列融合而插入到BPV表达载体，结果产生pS257。
通过使用3、4、7和8号寡核苷酸(表1)获得了B-变异体构建体(SEQ ID NO:5)。退火的寡核苷酸正好编码C-未端氨基酸序列相当于全长蛋白质中的赖氨酸712至苯丙氨酸722。此片段和谷氨酰胺535融合。一个翻译终止子直接插入到最后一个苯丙氨酸后。此片段在5′端含一个BclⅠ位点并在3′端含一个SalⅠ位点，使其能够导入pS157。所得的质粒用Asp700和SalⅠ酶解，将313bp片段导入上述的表达载体。产生的质粒命名为pS258。表1.
用于构建BSSL变异体的合成的寡核苷酸在限制性位点的核苷酸下面划了线。翻译终止信号由黑体字标出。变异体N中可变密码在PCR-3中用黑体字和星号标出。
 寡核苷酸                         序列(5′-3′)
 PCR-1  CGGGATCCGAAGCCCTTCGCCACCCCCACG
 PCR-2  CGAAGCTTGTCGACTTACTACTGATCAGTCACTGTGGGCAGCGCCAG
 PCR-3  GGGAATTCTGGCCATTGCTTGGGTGAAGAGGAATATCGCGGCCTTCGGGGGGGACCCCAACCAGATCACGCTCTTCGGGGAGTCT
 PCR-4  CGGGATCCCACATAGTGCAGCATGGGGTACTCCAGGCC
 1  GATCAGGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGG
 2  GCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCAAGGAAGCTCAGA
 3  TGCCTGCAGTCATTAGGTTTTAGTAAGTCGACA
 4  AGCTTGTCGACTTACTAAAACCTAATGACTG
 5  CAGGCATCTGAGCTTCCTTGGAGTCACCCGTGGGCGGCACGGGGGGGGCCCCGGA
 6  GTCACCCGTGGGCGGCACGGGGGGGGCCCCCT
 7  GATCAGAAGGAAGCTCAGA
 8  CAGGCATCTGAGCTTCCTTCT
为了构建编码C-变异体(SEQ ID NO:6)的基因，使用1至6号寡核苷酸(表1)。退火的DNA片段含两个重复序列，编码11个氨基酸与共有序列(Nilsson et al.1990)一致，在谷氨酰胺535和赖氨酸712-苯丙氨酸722序列之间插入。此片段也含一个5′端的BclⅠ位点及一个3′端SalⅠ位点，以允许与上述相同的克隆策略。所得的质粒命名为pS259 。
为构建变异体N(非-N-糖基化的变异体，SEQ ID NO:7)，合成了两个PCR引物(PCR-3和PCR-4，表1)。产生EcoRⅠ和BamHⅠ位点，以使360bp的PCR产物克隆进pUC19中进行序列分析。将潜在N-连接的糖基化位点，在天冬酰胺187，变成谷氨酰胺。分离作为BalⅠ-HindⅢ片段的修饰的序列然后与含mNT-1启动子和5′端BSSL cDNA的SacⅠ和BalⅠ片段一起克隆进SacⅠ和HindⅢ消化过的pUC19，一个约1.2kb的SacⅠ-DraⅢ片段由此质粒分离到，然后分别插入到在表达载体之内的mMT-1元件和BSSL cDNA序列中。所得的质粒命名为pS299。1.1.3.哺乳动物细胞培养和转染
根据磷酸钙沉淀法(Graham&Van der Eb,1973)将载体共转染进鼠细胞系C127(ATCC CRL 1616)。
在补充10％胎牛血清的Ham′s F12-Dulbecco′s ModifiedEagle′s培养基(DMEM)(1∶1)中培养C127细胞。用1.5mg×ml-1的G418筛选新霉素抗性细胞克隆，10-15天后，抗性细胞克隆从主平皿中分离，传代，用于分析。1.1.4细菌菌株和培养条件
为了表达实验将载体pGEMEX/BSSL转化到大肠杆菌菌株JM109(DE3)和BL21(DE3)pLysS中。表达实验按Studier等人(1986)的描述进行。收集细菌后，通过离心(4℃,5,000xg 10分钟，)沉淀细胞。为制备周质和胞质部分，将沉淀重悬于每克沉淀4ml20mM Tris-C1/20％蔗糖，pH8.0,200μl 0.1MEDTA及40μl的溶菌酶(15mg/每ml水)中。重悬液置冰上40分钟。每克沉淀物加160μl 0.5M MgCl2，此后在12000xg，离心悬液20分钟，产生的上清液含周质蛋白质，沉淀物代表细胞质部分。另外，为制备可溶性蛋白质，将细胞悬于40mM Tris-Cl,0.1mMEDTA,0.5mM(苯基甲基磺酰氟化物pH8.2)，冻融和声处理几次使其溶解。离心细胞溶解液(25℃,30,000xg 30分钟)。1.1.5.核酸分析
从分离的哺乳动物细胞系或大肠杆菌细胞(Ausubel et al,1992)制备RNA和DNA。在琼脂糖凝胶中使RNA或DNA分离，转印到GeneScreen Plus(New England Nuclear)上，按供应商的说明杂交。1.1.6.天然酶的制备
按前述的方法(Blckberg&Hernell,1981)从人乳中纯化胆盐刺激的脂酶。纯化的制品经SDS-PAGE判断同源性，当用长链三脂酰甘油为底物检测时，比活性为每分钟，每mg释放100μmol脂肪酸。1.1.7酶分析
使用阿拉伯树胶乳化的三油酸甘油酯为底物，按所述的方法(Blckberg&Hernell,1981)进行酶检测。用10mM胆酸钠为激活的胆盐，进行培养。当检测胆盐依赖性时，加入胆盐(胆酸钠或脱氧胆酸钠，Sigma Chem.Co)达到表3中所给的浓度。1.1.8 Western印迹
为了在印迹实验中获得有意义的反应，通过Blue Sepharose(Pharmaci LKB Biotechnology)层析浓缩条件培养基。将各个培养基和Blue Sepharose(每ml凝胶约10ml培养基)混合。用含0.1MKCl的0.5M Tris-Cl缓冲液，pH7.4洗涤凝胶(每ml胶10ml)。酶活性用同一缓冲液的1.5M KCl洗脱。用此方法浓缩了25-30倍，纯化了3-5倍。按Laemmli(1970)方法，必要地在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE。转移至硝酸纤维素膜上，与抗纯化的BSSL的多克隆兔抗血清一起孵育后，用和碱性磷酸酶结合的山羊抗兔IgG及来自Bio-Rad的发育试剂盒进行测定结果。1.1.9用N-糖苷酶F处理
加1μl 1M的β-巯基乙醇和0.5μl 10％(w/v)的SDS到含BSSL活性为每分钟释放2.5μmol脂肪酸的10μl变异体B中。煮沸5分钟后，加入10μl 0.1M磷酸钠缓冲液pH8.0,6μl0.1M EDTA,4μl 7.5％(w/v)Nonidet P40和5μl(IU)N-糖苷酶F(Boechringer Mannheim)。作为对照，处理了同等量的变异体B，除无糖苷酶加入外。在37℃温育过夜后样品经SDS-PAGE电泳，并使用多克隆兔BSSL抗血清进行印迹。1.2.结果1.2.1构建BSSL变异体
在表2和图1中概括了关于全长BSSL,BSSL变异体的修饰。用于产生这些变异体的策略在1.1.部分描述了。对变异体A(SEQ IDNO:4)而言，终止密码引入到谷氨酰胺535位置后，去除了全长蛋白质的最后187个氨基酸。对变异体B(SEQ ID NO:5)而言，编码正巧11个氨基酸的区域和原始翻译终止子与谷氨酰胺-535融合，因此，这种变异体缺乏所有的重复序列。对变异体C(SEQ IDNO:6)而言，含两个重复序列的片段，插入到谷氨酰胺-535和赖氨酸-712至苯丙氢酸722序列之间。所述重复序列含有与共有序列(Nilsson et al,1990)相同的序列。
为了分析唯一不明确的N-连接的碳水化合物结构(其位置接近活性位点丝氨酸-194)的重要性构建变异体。通过将天冬酰胺-187变成谷氨酰胺而改变潜在的N-糖基化位点获得变异体N(SEQ IDNO:7)。表2
和人类BSSL相关的BSSL变异体的氨基酸序列
    变异体     缺失的残基     变化的残基
A(SEQ ID NO:4)     536-722
B(SEQ ID NO:5)     536-711
C(SEQ ID NO:6)  536-568,591-711
N(SEQ ID NO:7)   Asn 187→Gln
1.2.2哺乳动物细胞系重组DNA的特征描述
重组DNA样品从用编码不同BSSL变异体的表达载体转染的细胞系中制备。制备的DNA用BamHⅠ消化，在琼脂糖凝胶上分开，并转移至杂交膜上。使用的探针是32P标记的BSSL cDNA。杂交结果证实了重组基因的存在，而且载体拷贝数在不同的细胞系大约相等(图2)。杂交片段的位置反映了各种BSSL序列的长度并与期望大小一致。位置也类似于起源于细菌的用于转染实验的DNA，表明在细胞系中没有主要的载体DNA的重排(图2)。代表变异体A的DNA一样品中上边的杂交信号可能归因于部分消化。1.2.3在哺乳动物细胞中全长和突变BSSL mRNA的表达
为分析不同重组BSSL基因的表达，从分离的细胞系中制备了mRNA 。Northern印迹实验和用32P-标记的BSSL cDNA杂交实验表明，在含有BSSL载体(图3)的所有细胞系中都可检测到重组mRNA。在对照样品中没有杂交，所述对照样品得自含除BSSL cDNA外的相同载体的细胞系(图3)。
杂交mRNA的不同长度与cDNAs的修饰一致。在不同样品中重组BSSLmRNA变异体的稳定状态水平除了变异体A(图3)外，几乎是相同的。变异体A mRNA积累降低的原因尚未知晓，但观察到两个细胞系群及分离的克隆。在不同样品中等量RNA的存在，通过用鼠β-actin探针(图3，较低组)杂交证实1.2.4生产哺乳动物全长和BSSL变异体
收集了源于单个克隆的用全长BSSL及其不同突变形式转染的C127-细胞培养基并分析BSSL的活性(图4)。对于全长分子和变异体N、B和C，最高表达克隆的活性范围是每分钟每毫升培养基释放0.7-2.3μmol脂肪酸。和天然人乳中BSSL的比活性比较，此表达水平为每毫升培养基7-23μg。对变异体A而言，所有分析的克隆其活性低于每分钟每毫升培养基释放0.05μmol脂肪酸。在Blue-Sepharose柱上浓缩和冷冻干燥显示最高活性的克隆，表明的确表达了有活性的酶，尽管表达水平较低不能排除。通过相当低比活性解释以变异体A部分获得的低活性可能性。
源于不同转染实验克隆的Western印迹显示于图5A。BSSL变异体明显的Mr正如所望。但是应注意到，对全长BSSL及变异体B和C而言，出现了双条带。因为所有这三个都有单一完整的N-糖基化位点，而没出现双条带的变异体N缺少N-糖基化位点，所以可能解释为，双条带产生于N-糖基化的差别。因此变异体B应该用N-糖苷酶F消化。如图5B所示，上面的带只保留痕量，而下面的带强度增加，表明只有部分表达的变异体N-糖基化了。
BSSL的特性之一是其可通过初级胆盐，如胆酸盐(Hernell,1975)将异性活化。所有不同重组形式的BSSL证明了胆酸盐活化的相同浓度依赖性(图6)。在使用的实验体系中约10mM获得了最大活性。当将胆酸盐换成脱氧胆酸盐(次级胆盐)，无此活化产生。因此，重组全长及不同的变异体证明了胆盐活化的同一特异性。1.2.5.大肠杆菌中全长BSSL的表达及生化特性
用含位于T7启动子控制下的人BSSL cDNA的表达载体pGEMEX/BSSL转化两个大肠杆菌菌株JM109(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Studier et al.,1986)。鉴别来自于两个菌株的转化体，将其培养并用IPTG诱导约90分钟(Studier et al.,1986)。通过使用BSSL cDNA为32P标记的探针，经Northern印迹分析总mRNA表明，两个菌株中均有效地诱导了表达而且转录受到密切调节(图7A)。明显的重组BSSL mRNA的大小约2.4kb，和期望长度一致。蛋白质样品的SDS-PAGE分离及用抗BSSL抗体的免疫测定表明在大肠杆菌中有效地产生了全长BSSL(图7B)。BL21(DE3)pLysS菌株比JM109(DE)(图7B)菌株有更多的蛋白质被分泌到周质。
IPTG诱导的大肠杆菌培养基含相当于0.5-4μg蛋白质/ml培养基的活性可溶的BSSL。Western印迹证明20-60％的反应物在不溶的沉淀物中。未诱导的细菌不包含任何明显的BSSL活性。
来自培养细菌的脂酶活性表明和天然乳中BSSL有同样的胆盐依赖性。2.重组全长和突变的胆盐刺激脂酶的纯化及特征描述2.1．实验方法2.1.1．酶和酶变异体
如上所述构建和表达了重组全长BSSL和BSSL变异体B、C和N。和天然的酶比较，变异体B(SEQ ID NO:5)缺少所有16个独一无二的，O-糖基化的，富含脯氨酸、C-未端重复序列(aa 536-711)，但含有大部分的融合于谷氨酰胺-535的C-未端片段(aa712-722)。变异体C(SEQ ID NO:6)含同样的C-未端片段和在谷氨酰胺-535与赖氨酸-712之间的两个11个残基的重复单位。在变异体N(非-N-糖基化变异体，SEQ ID NO:7)，负责唯一连接糖的天冬酰胺-187换成了谷氨酰胺残基。天然BSSL从人乳中按所述方法纯化(Blckberg&Hernell,1981)。2.1.2．酶分析
用阿拉伯乳化的三油酸甘油酯为底物，如所述(Blckberg&Hernell,1981)测定了脂酶活性，用胆酸钠(10mM)为活化胆盐。此测定的不同变化在附图说明中给出。2.1.3. 制备免疫吸附剂
按制造者的描述用CMBr，使纯化的乳BSSL(5mg)结合到Sepharose上。抗纯化的乳BSSL兔产生的多克隆抗血清40ml通过此柱。用0.1M甘氨酸-HCl pH2.5洗脱特异抗体。用固态Tris使pH立即调至8左右。脱盐和冻干后，将6mg亲和纯化抗体与上述Sepharose结合。2.1.4．纯化方法
含5-25μg重组表达BSSL或BSSL变异体的条件培养基，以每ml配好凝胶10ml培养基与Blue Sepharose混合(Pharmacia,Swedan)。彻底混合30分钟后，用0.05M Tris-Cl pH7.0,0.05MKCl流洗凝胶；脂酶活性用0.05M Tris-Cl,pH7.0,1.5MKCl洗脱。收集活性峰，对5mM佛多那钠，pH7.4,0.05M NaCl透析。透析液用于肝素-Sepharose柱。此柱用在5mM佛多那钠缓冲液，pH7.4中的梯度0.05-1.0M NaCl洗脱。收集含脂酶活性的组分，用于免疫吸附柱，用0.05M Tris-Cl pH7.5,0.15M NaCl流洗后，0.1M甘氨酸-HCl、pH2.5洗脱结合的脂酶。用固态Tris使组分的pH立即调到8左右。2.1.5．电泳
基本根据Laemmli(1970)方法，进行了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白质用考马斯亮蓝染色。2.1.6．N-未端序列分析
在Applied Biosystems公司的477A脉冲液相测序仪及带有来于制造商的规范循环程序和化学品的连网苯硫乙内酰脲120A分析仪上进行氨基酸序列分析。从测得的标准蛋白质序列(β-乳球蛋白)计算，最初及重复产量分别为47％和97％。2.2．结果2.2.1．重组BSSL和BSSL变异体的纯化
主要用在Blue Sepharose柱上层析条件培养基作为浓缩步骤。接着在肝素-Sepharose柱上层析主要是去除培养基中存在的大部分白蛋白得到初步纯化。此步骤也说明，重组BSSL分子都具有肝素结合能力。免疫吸附后，所有BSSL变异体，象经SDS-PAGE(图8)制定的那样，纯度超过90％。全长酶及变异体B和C作为成对物迁移。不同变异体的表观Mr列于表3。N-未端序列分析对所有8个循环的变异体测出了一个单一顺序：Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-。2.2.2．脂酶活性
表3显示了不同制品的表观分子量。制品的比活性范围是每分钟每毫克蛋白质释放游离脂肪酸75-120μmol。因此没有观察到全长BSSL和BSSL变异体间活性的显著差别。
所有制品说明绝对需要对抗长链三脂酰甘油的初级胆汁盐(胆酸钠)活性(图9A)。脱氧胆酸钠不能提供任何变异体活性(资料未列出)。但是，一旦结合不同的胆盐，脱氧胆酸盐就有双重作用(图9B和C)。首先它降低活化必需的胆酸盐浓度，其次在较高胆盐浓度下抑制酶的活性。表3
重组全长BSSL和BSSL变异体的表观Mr
酶      Mr(KDa)通过SDS-PAGE测定
全长        105,107
变异体B        63,65
变异体C        60,62
变异体N        95
2.2.3．重组BSSL和BSSL变异体的稳定性
重组BSSL和BSSL变异体与天然乳BSSL显示了同样的pH稳定性(图10)。pH在2.5-3左右所有情况下都有失活发生。pH在3以上，所有变异体是完全稳定的，提供的蛋白质浓度足够高。这通过加入小牛血清白蛋白或卵清蛋白达到(资料未列出)在所有测试的pH，稀释的样品都是不太稳定的，但阈值是一样的(资料未列出)。图11显示和天然乳酶比较，重组酶的热稳定性。在37-40℃此活性开始降低。变异体(B、C、N)稳定性比全长重组酶和乳酶略低。但是，如果蛋白质浓度通过加入小牛血清白蛋白得到提高，所有变异体在40℃也是稳定的(图11)。
天然乳BSSL和所有重组变异体对胰蛋白酶都敏感。一种依赖时间的失活获得了(图12)。但是，如果胆盐，即胆酸盐存在于缓冲液中，脂酶变异体就得到了保护，脂酶活性保留下来(图12)。
因此，鉴于许多体外特征，即胆盐活化、肝素结合、pH和温度稳定性及对蛋白酶失活的胆盐保护将不同的BSSL变异体与天然乳BSSL比较，没有发现显著差异。3．在转基因动物中表达3.1．表达载体的构建
为了构建在转基因动物乳中生产重组人BSSL变异体的表达载体，使用了下列策略(图13)。
应用Lidberg等人(1992)叙述的方法，获得了含人BSSL基因不同部分的质粒(pS309、pS310、pS311)。质粒pS309含一个SphⅠ片段，此片段包含5′-非转录区至第四内含子的部分序列。质粒pS310含一个SacⅠ片段，此片段含有一从第一内含子的部分序列至第六内含子的部分序列的BSSL变异体基因序列。最后质粒pS311含一个BamHⅠ片段，此片段含BSSL基因的第五内含子的主要部分及缺失第十一外显子的内含子/外显子结构的其余部分。缺失的序列是231bp，它能产生一个编码BSSL变异体的序列，此变异体实际上含77个氨基酸或比全长BSSL少七个重复单位。产生BSSL变异体(变异体T)的核苷酸序列列于序列表SEQ ID NO:8中。变异体T的氨基酸序列列于序列表SEQ ID NO:9中。
由于在人BSSL基因第十一外显子有高度的重复序列，在这种序列克隆进质粒或在细菌中繁殖时，可设想有相当高的重排频度。根据这种假设，含有截短第十一外显子的所需BSSL变异体基因得到了鉴定、分离、进行了序列分析。另一个质粒pS283，含部分在HindⅢ和SacⅠ位点克隆进pUC19的部分人BSSL cDNA，用于基因组序列的融合。质粒pS283也用于获得合适的限制酶酶切位点，KpnⅠ位于BSSL 5′非翻译前导序列中。
用NcoⅠ和SacⅠ消化质粒pS283，通过电泳分离到一约2.7kb的片段。用NcoⅠ和BspEⅠ消化质粒pS309，分离到一包含BSSL基因5′一部分约2.3kb的片段。用BspEⅠ和SacⅠ消化质粒pS310，分离到一含BSSL基因中间段部分约2.7kb的片段。这三个片段连接在一起，转化感受态大肠杆菌菌株TG2，经氨基苄青霉素筛选分离转化体。
从许多转化体制备了质粒，一个含所要构建物的质粒，叫pS312(图14)，用于进一步研究。
为了获得pS311的修饰形式，位于终止密码下游的BamHⅠ位点换成SalⅠ位点，便于进一步克隆，使用了下列方法：通过BamHⅠ部分消化，使质粒pS311线性化。分离到线性化的片段，将BamHⅠ换成SalⅠ位点的合成DNA接头(5′-GATCGTCGAC-3′)插入，破坏了BamHⅠ位点。由于有两个潜在的用于整合合成接头的位置，所以通过限制酶切割分折所得的质粒。在11外显子下游理想位置插入接头的质粒得到分离，命名为pS313。
为了获得含有人BSSL变异体基因组序列的最终表达载体构建体，使用现有的表达载体pS314，设计它来调节泌乳期乳腺细胞的阶段和组织特异性表达。质粒pS314含一个克隆为NotⅠ片段的鼠乳清酸性蛋白(WAP)基因(Campbell et al.1984)的基因组片段。
基因组片段含约4.5kb的上游调节序列(URS)，所有四个鼠WAP外显子及所有内含子序列、约3kb的最后外显子的下游序列。独一无二的KpnⅠ位点位于天然WAP翻译起始密码上游第一个外显子24bp内。另一个独一无二的限制酶位点位于第三外显子内SalⅠ位点。
人BSSL变异体基因组序列用下列方法插入到KpnⅠ和SalⅠ位点间，第一，用KpnⅠ和SalⅠ消化pS314，电泳分离代表裂解质粒的片段，第二，用KpnⅠ和BamHⅠ消化pS312一个约4.7kb，代表BSSL基因5′部分的片段得到分离。第三，用BamHⅠ和SalⅠ消化pS313，分离到人BSSL基因的3′一部分。这三个片段连接起来，转化感受态大肠杆菌，经氨基苄青霉素选择后分离转化体。
质粒从几个转化体中得到制备，通过限制酶图谱和序列分析仔细分析。确定了代表所需的表达载体的一个质粒，命名为pS317(图15)。
为了移去原核质粒序列，用NotⅠ消化pS317。此后，含人BSSL变异体基因组片段和侧翼的鼠WAP序列的重组载体因子经琼脂糖电泳分离。分离的片段在注进鼠胚胎之前进一步经电洗脱纯化。
在转基因鼠乳中表达人BSSL变异体的重组基因显示于图16。3.2．转基因动物的产生
按照3.1.部分从质粒pS317分离一个NotⅠ片段。此DNA片段含连接到编码人BSSL变异体基因组序列的鼠WAP启动子。这种分离片段以3ng/μl的浓度，将其注射进从供体小鼠获取的350C5781/6J×CBA/2J-f2胚胎的原核中，供体小鼠预先用5IU怀孕母马牛清用于排卵过速的促性腺激素处理。C57B1/6J×CBA/2J-f1动物从Bomholtgard Breeding和Research Center LTD,Ry,Denmark获得。从输卵管采集胚胎后，用M2培养基(Hogan etal.1986)中的透明质酸酶处理，从丘细胞分离胚胎。清洗后，将胚胎转至M15培养基(Hogan et al,1986)，保存在5％CO2孵箱中。使用液压微操作器和带有Nomarski镜片的Nikon倒置显微镜，在轻石蜡油下的M2微粒中进行注射。注射后，267个看上去健康的胚胎埋植进12个假孕的，经腹膜内注射0.3个ml,2.5％AvertinC57B1/6J×CBA/2J-f1受体中。从动物生后三周获得的尾尸检标本DNA，经PCR分析，识别整合转基因的小鼠。用Southern Blot分析证实了阳性结果。
为收集乳，雌性泌乳期动物用2IU催产素经腹膜内注射，十分钟后用0.40ml,2.5％的Avertin腹膜内麻醉。集乳器通过一个硅化过的管附在乳头上，通过轻轻按摩哺乳动物腺体，将乳收集到一个1.5ml的Eppendorf管中。乳量随泌乳天数改变，每个小鼠及每次收集在0.1和0.5ml之间。3.3．转基因小鼠中BSSL变异体的表达
通过剪尾样本制备的DNA分析鉴别转基因鼠。组织样品与蛋白酶K温育，经酚/氯仿抽提。如存在代表表达载体片段的异源引入的DNA扩增特异的片段的带引物的聚合酶链反应中使用分离的DNA。用DNA杂交实验分析动物以证实PCR数据并检测可能的重排，整合载体元件的结构并得到有关整合载体元件拷贝数的资料。
在一套实验中，用两种方法分析了31只小鼠，结果表明，一只鼠带有pS317的异源DNA载体元件。PCR分析和杂交实验的结果一致(图17)。
总共65个测试动物，有10个是pS317转基因的。
将鉴定带有载体DNA元件(建立者动物)的小鼠配对，F1动物用同样的方法进行转基因分析。
通过琼脂糖福尔马林凝胶电泳分离在泌乳期从pS317转基因雌性动物不同组织中分离的RNA，然后转至滤纸上，以32P-标记的BSSLcDNA为探针杂交。获得的结果证明，在泌乳期表达在乳腺表达受限制(图18)。
从麻醉的用催产素处理诱导泌乳的建立者动物收集乳样品，分析重组BSSL变异体的存在。此是通过SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜，及与产生的抗天然人BSSL的多克隆抗体孵育实现。
获得的结果证实了转基因小鼠乳中重组人BSSL变异体的表达。图19证实了转基因小鼠乳中重组BSSL变异体的存在。SDS-PAGE分离及源于不同pS317转基因小鼠的乳样品免疫印迹分析显示，和全长源于转基因pS314的小鼠乳中重组BSSL比较，带有还原性表观分子量的重组BSSL产量高。质粒pS314类似pS317，不同的是，pS314含全长人BSSL cDNA，不含基因组变异体。出现在所有鼠乳样品中的双带代表鼠BSSL，并因此显出抗血清的交叉反应。出现在图19的第9泳道明显的双带(包含纯化的鼠BSSL)的观察进一步支持这个结论。
稳定的转基因动物系产生了。
用相似的方法，也可制备能表达人BSSL变异体的其它转基因动物，如兔、奶牛或绵羊。保藏
根据布达佩斯条约在DSM(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)保藏了下列质粒
 质粒     保藏号      保藏日
 pS309pS310pS311pS317     DSM 7101DSM 7102DSM 7103DSM 7104 1992.6.12
 pS147pS257pS299     DSM 7495DSM 7496DSM 7497 1993.2.26
 pS258pS259     DSM 7501DSM 7502     1993.3.3
附图概述图1A．用于表达不同BSSL变异体的BPV为基本载体的图谱。B．分析不同BSSL变异体的图例说明。FL表示全长BSSL。活性位点用圆圈表示，潜在的N-连接的碳水化合物位点用三角形表示。含重复序列的区域用条线区表示，保守的C-未端用涂满黑色区表示。图2
源于表达BSSL变异体细胞系的DNA的Southern印迹分析。分析了从表达全长BSSL(FL)、变异体A(A)、变异体B(B)、变异体C(C)和变异体N(N)制备的DNA。用BamHⅠ消化5μg各自制备的细胞DNA(左)及1ng纯化的细菌载体DNA(右)。 DNA样品在琼脂糖凝胶上分离，转移至GeneScreen Plus膜上，与32P-标记的人BSSL cDNA杂交。图3
从表达BSSL变异体的细胞系分离的RNA的Northern印迹分析。分析了从生产全长BSSL(FL)、变异体A(A)、变异体B(B)、变异体C(C)、变异体N(N)的细胞系制备的10μg总RNA。用来自C127细胞系的RNA作负对照(-)(上边组)所述细胞系含有与图1中载体相同的BPV-载体，除了编码一个与BSSL不相干的蛋白质外，用32P-标记的BSSL cDNA与滤膜杂交。用鼠β-肌动蛋白cDNA为探针，与滤膜再次杂交。B-肌动蛋白mRNA信号(下边组)用作上样到每一泳道mRNA量的内标对照。图4
在用全长和突变形式的人BSSL转染的C127细胞中BSSL的表达活性。C127细胞用不同的BSSL构建体转染：全长BSSL(FL)、变异体N(N)、变异体C(C)、变异体B(B)、变异体A(A)。起始生长期后，筛选个别克隆，使之成长至汇合。筛选的克隆(n)数表示在图中。在条件培养基上确定脂酶活性。其数值用每ml条件培养基每分钟释放的游离脂肪酸的μmol表示。图5A．全长和突变的重组BSSL的Western印迹分析。脂酶活性的量表示为，每分钟释放脂肪酸的μmol，用于凝胶是，全长0.2(泳道1)、变异体N0.16(泳道2)、变异体C0.6(泳道3)、变异体B0.8(泳道4)及天然BSSL0.1(泳道5)。所用的抗血清是在抗从人乳纯化的BSSL的兔中产生的。分子大小标记(Prestained SDS-PAGEStandard,Low Range,BioRad)标在左边。B.N-糖苷酶F处理的变异体B的Western印迹。用实验方法所述的N-糖苷酶F消化变异体B。泳道1是未处理的，泳道2是处理的变异体B。图6
全长及突变BSSL的胆盐依赖性。在改变浓度的胆酸钠(实线)或脱氧胆酸钠(断线)存在的情况下，在来自全长重组BSSL(*)、变异体A(□)、变异体B(▲)变异体C(■)、变异体N(●)及纯化的人乳BSSL(○)的条件培养基上确定脂酶活性。对A变异体而言，按实验方法所述，在Blue Sepharose上浓缩条件培养基。除了最大活性只有其它酶的1/10变异体A外，选择各来源的酶量以获得同样的最大活性水平。对照实验表明生长培养基不影响活性水平或天然BSSL的胆盐依赖性(数据未列出)。图7A．使用pGEMEX通过不同的大肠杆菌菌株产生的BSSL Northern印迹。细菌用实验方法中所述的IPTG进行诱导。
实验条件见图2所示。泳道1，菌株BL21(DE3)pLysS，未诱导的；泳道2，菌株BL21(DE3)pLysS，诱导的；泳道3，菌株JM109(DE3)，未诱导的；泳道4，菌株JM109(DE3)，诱导的。B．使用抗纯化的乳BSSL的抗体8-18％SDS-PAGE Western印迹表明，使用pGEMEX在不同大肠杆菌菌株中重组BSSL的表达。用IPTG诱导细菌，按实验方法所述从裂解液制备细胞质和周质蛋白质。上样至泳道2-5(周质制品)和7-10(胞质制品)的细菌蛋白质量代表了使菌株和生产水平成比例的相同培养量。泳道1,Pharmacia分子大小标记；泳道2和8，菌株JM109(DE3)，诱导的：泳道3和7，菌株JM109(DE3)，未诱导的；泳道4和10，菌株BL21(DE3)pLysS，诱导的；泳道5和9，菌株BL21(DE3)pLysS，未诱导的；泳道6,25ng纯化的天然BSSL。图8
纯化的重组BSSL及BSSL变异体的SDS-PAGE。全长重组BSSL(FL)和BSSL变异体N、B及C按所述纯化。除了B用1.5μg外，每种用3μg纯化的天然乳BSSL(NAT)用5μg。分子大小标记的位置在左边。图9
通过胆酸钠，脱氧胆酸钠对重组BSSL及BSSL活化的作用。在无(左边组)或存在5mM(中间组)或10mM(右边组)脱氧胆酸盐的条件下，用不同浓度的胆酸钠分析了纯化的重组全长BSSL(●)、重组BSSL变异体B(○)、C(■)和N(▲)、及纯化的天然乳BSSL(□)制品的脂酶活性。图10
重组BSSL和BSSL变异体在不同pH的稳定性。在37℃,pH2-8的不同缓冲液中温育天然BSSL、重组全长BSSL及BSSL变异体。所有缓冲液均含1mg/ml牛血清白蛋白，30分钟后，撤去分装品，分析脂酶活性，符号的解释见图9的说明。图11
重组BSSL和BSSL变异体的热稳定性。在50mM Tris-Cl缓冲液pH7.5，指定的温度下温育纯化的重组全长BSSL,BSSL变异体及天然乳BSSL。一组牛血清白蛋白(BSA)样品加至1mg/ml。30分钟后撤出样品并分析脂酶活性。活性表示为在0分钟每份样品的活性百分比，符号的解释见图9的说明。图12
胆盐对通过胰蛋白酶使重组BSSL及BSSL变异体失活的影响。在25℃，有(实线)无(断线)10mM胆酸钠存在条件下，将纯化重组全长BSSL、BSSL变异体及天然乳BSSL(15μl含14μg)加到含10μg胰蛋白酶(TPCK-胰蛋白酶、Boehringer-Mannheim)60μl，1.0M Tris-Cl pH7.4的溶液中。在指定时间，撤除测定样品，分析脂酶活性。数值表示为无胰蛋白酶条件下对照温育中获得值的百分比。符号解释见图9的说明。图13
生产质粒pS317的方法，更详细资料见3.1部分图14
质粒pS312的图示结构。图15
质粒pS317的图示结构。图16
表示3.1部分所述WAP第一外显子内人BSSL变异体基因组结构物理上引入的物理图谱。图17A．用于转基因动物鉴定的PCR引物的定位图示。5′-引物位于在融合上游位置-148bp开始的WAP序列内，所述融合在WAP和BSSL变异体之间。3′-引物位于编码融合点下游400bp的第一BSSL变异体内含子中。B．使用的PCR引物序列C．琼脂糖凝胶显示潜在建立者动物典型的PCR分析。M：分子量标记。泳道1：产生于质粒pS317的对照PCR产物。泳道2-13：从潜在建立者动物制备的DNA进行PCR反应。图18
从pS317转基因雌性小鼠分离的不同组织制备的RNA Northern印迹分析。在泌乳第四天分离组织。通过琼脂糖-甲醛分离分析源于每一组织的10μg总RNA，转移其至滤膜上，与32P-标记的人BSSLcDNA进行杂交。泳道含Mg：乳腺；Li：肝；Ki：肾；Sp：脾；He：心；Lu：肺；Sg：唾液腺；Br：脑。RNA的核苷酸大小在右边标出。图19
从pS317转基因小鼠、全长cDNA载体pS314转基因小鼠及对照动物乳的Western印迹。样品经SDS-PAGE分离，转移至Immobilon滤膜上，用抗天然人BSSL产生的抗血清进行免疫印迹分析。泳道1：分子量标记；泳道2、3和4:2μl来自3个pS317建立者FO#91F1雌仔的乳(F1 30、31和33)。泳道5:2μl来自建立者#90pS317的乳。泳道6、7和8:2μl源于非BSSL转基因动物乳；泳道9：纯化的鼠BSSL；泳道10：纯化的人天然BSSL。
参考文献Abouakil,N.,Rogalska,E.,and Lombardo,D.(1989): Biochim.Biophys.Acta 1002,225-230Atkinson,S.A.,Bryan,M.H.,and Andiersson,G.H.(1981):J.Pediatr.99,617-624Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.,Struhl,K.(eds.)in:Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley & Sons,New York;edition of 1992)Baba,T.,Downs,D.,Jackson,K.W.,Tang,J.and Wang,C.S.(1991):Biochemistry 30,500-510.Bernbck,S.,Blckberg,L.,and Hernell,O.(1990):J.Clin.Invest.85,1221-1226Bjrksten,B.,Burman,L.G.,deChateau,P.,Fredrikzon,B.,Gothefors,L.&Hernell,O.(1980):Br.Med.J.201,267-272.Blckberg,L.&Hernell,O.(1981):Eur.J.Biochem 116,221-225.Blckberg,L.and Hernell,O.(1983):FEBS Lett.157,337-341Campbell,S.M.,Rosen,J.M.,Hennighausen,L.G.,Strech-Jurk,U.andSippel,A.E.(1984):Nucleic Acid Res.12,8685-8697.Chappell,J.E.,Clandinin,M.T.,Kearney-Volpe,C.,Reichman,B.,andSwyer,P.W.(1986):J.Pediatr.108,439-447Fontaine,R.,Carter,C.,and Hui,D.(1991): Biochernistry30,7008-1014Graham,F.L.,and Van der Eb,A.J.(1973):Virology52,456-467Hamosh,M.,Freed,L.M.,York,CM.,Sturman,J.A.,and Hamosh,P.(1986):Fed.Proc.45,1452Han,J.H.,Stratowa,C.,and Rutter,W.J.(1987): Biochemistry26,1617-1625Hennighausen,L.,Ruiz,L.& Wall,R(1990):Current Opinion inBiotechnology1,74-78.Hernell,O.(1975):Eur.J.Clin.Invest.5,267-272Hernell,O.,Blckberg,L.,and Lindberg,T.in:Textbook ofgastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal,E.ed)pp.209-217(Raven Press,New York 1989)Hernell,O.,Staggers,J.E.and Carey,M.C.(1990):Biochernistry29.2041-2056Hernell,O.and Blckberg,L.in:Encyclopedia of human biology(Dulbecco,R.ed.)Vol.3,pp.47-56(Academic Press,San Diego 1991)Hernell,O.,Blckberg,L.,Chen,Q.,Sternby,B.and Nilsson,.(1993):J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.(In press)Hogan,B.,Constantini,F.and Lacy,E.(1986):Manipulating the mouseembryo.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Hui,D.and Kissel,J.A.(1990):Febs Lett.276,131-134.Kyger,E.M.,Wiegand,R.C.,and Lange,L.G.(1989): Biochem.Biophys.Res.Commun.164,1302-1309Laemmli,U.K.(1970):Nature(London)227,680-685Lidberg,U.,Nilsson,J.,Strmberg,K.,Stenman,G.,Sahlin,P.,Enerbck,S.G.and Bjursell,G.(1992):Genomics13,630-640Lusky,M.,and Botchan,M.R.(1984):Cell36,391-401Nilsson,J.,Blckberg,L.,Carlsson,P.,Enerbck,S.,Hernell,O.andBjursell,G.(1990):Eur.J.Biochem.192,543-550.Pavlakis,G.N.,and Hamer,D.H.(1983):Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,397-401Reue,K.,Zambaux,J.,Wong,H.,Lee,G.,Leete,TH.,Ronk,M.,Shively,J.E.,Sternby,B.,Borgstrm,B.,Ameis,D.and Schotz,M.C.(1991):J.Lipid.Res.32,267-276.Sarver,N.,Byrne,J.C.,and Howell,P.M.(1982):Proc.Natl.Acad.Sci.USA79,7147-7151Studier,F.W.and Moffat,B.A.(1986):J.Mol.Biol.189,113-130Williamson,S.,Finucane,E.,Ellis,H.,and Gamsu,H.R.(1978):Arch.Dis.Childhood53,555-563
序列表(1)一般资料：
(ⅰ)申请人：
  (A)名字：AB ASTRA
  (B)街道：Kvarnbergagatan 16
  (C)市：  Sodertalje
  (E)国家：Sweden
  (F)邮编(ZIP):S-151 85
  (G)电话：+46-8-553 260 00
  (H)电传：+46-8-553 288 20
  (I)电挂：19237 astra s
(ⅱ)发明题目：新多肽
(ⅲ)序列数：9
(ⅳ)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC可容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.25(EPO)
(ⅵ)在先申请资料：
  (A)申请号：SE 9300686-4
  (B)申请日：1993.3.1
(ⅵ)在先申请资料：
  (A)申请号：SE9300722-7
  (B)申请日：1993.3.4(2)SEQ ID NO:1的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2428bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA到mRNA
(ⅲ)假设：无
(ⅲ)反义：无
(ⅵ)来源：
  (A)有机体：Homo sapiens
  (F)组织类型：乳腺
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：82..2319
  (D)其它资料：/产物=“胆盐刺激的脂酶”
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：外显子
  (B)位置：985..1173
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：外显子
  (B)位置：1174..1377
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：外显子
  (B)位置：1378..1575
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：外显子
  (B)位置：1576..2415
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：mat_肽
  (B)位置：151..2316
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：polyA_信号
  (B)位置：2397..2402
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_区域
  (B)位置：1756..2283
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：5′UTR
  (B)位置：1..81
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1756..1788
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1789..1821
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1822..1854
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1855..1887
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1888..1920
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1921..1953
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1954..1986
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1987..2019
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2020..2052
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2053..2085
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键调：重复_单位
  (B)位置：2086..2118
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2119..2151
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2152..2184
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2185..2217
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2218..2250
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位量：2251..2283
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG    60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT     111
                    Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val
                    -23         -20                 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG     159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu
        -10                  -5               1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG     207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys
  5                  10                  15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC      255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20                  25                  30                  35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG      303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp
             40                  45                  50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC      351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala
         55                  60                  65ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC      399Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu
     70                  75                  80AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC     447Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro
 85                  90                  95GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT     495Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His100                 105                 110                 115GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC     543Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala
            120                 125                 130ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC     591Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro
        135                 140                 145CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC     639Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
    150                 155                 160CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG     687Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala
165                 170                 175GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT     735Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala180                 185                 190                 195GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC     783Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
            200                 205                 210CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG     831Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp
        215                 220                 225GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG     879Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys
    230                 235                 240GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG     927Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys
245                 250                 255GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA     975Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala260                 265                 270                 275GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT    1023Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile
            280                 285                 290GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC    1071Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala
        295                 300                 305GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC    1119Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
    310                 315                 320TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC    1167Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val
325                 330                 335ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG    1215Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys340                 345                 350                 355GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG    1263Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp
            360                 365                 370GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT    1311Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe
        375                 380                 385GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG    1359Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln
    390                 395                 400CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC    1407His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser
405                 410                 415CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT    1455His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His420                 425                 430                 435GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG    1503Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr
            440                 445                 450GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC    1551Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr
        455                 460                 465TGG ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT    1599Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala
    470                 475                 480GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG    1647Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu
485                 490                 495GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA    1695Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg500                 505                 510                 515ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA    1743Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr
            520                 525                 530GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG    1791Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
        535                 540                 545GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG    1839Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro
    550                 555                 560CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC    1887Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
565                 570                 575GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG    1935Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val580                 585                 590                 595CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC       1983Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
            600                 605                 610TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC        2031Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro
        615                 620                 625GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT        2079Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
    630                 635                 640GAC GCC GGG CCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGC GCC CCC        2127Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro
645                 650                 655CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG ACC CCC ACG        2175Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr660                 665                 670                 675GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC        2223Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
            680                 685                 690CCC CCT GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCT GAG GCT GCC CCT GTG CCC CCC        2271Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro
        695                 700                 705ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT AGG TTT TAGCGTCCCA 2326Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
    710                 715                 720TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG GGGCTCCCCT CCCATCTTGA      2386GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA                         2428(2)SEQ ID NO:2的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：745个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys-23         -20                 -15                 -10Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu
    -5                    1               5Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp10                  15                  20                  25Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala
             30                  35                  40Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala
         45                  50                  55Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser
     60                  65                  70Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln
 75                  80                  85Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr90                  95                 100                 105Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn
            110                 115                 120Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile
        125                 130                 135Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr
    140                 145                 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met
155                 160                 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170                 175                 180                 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser
            190                 195                 200Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile
        205                 210                 215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro
    220                 225                 230Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly
235                 240                 245Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250                 255                 260                 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met
            270                 275                 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro
        285                 290                 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile
    300                 305                 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met
315                 320                 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330                 335                 340                 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys
            350                 355                 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln
        365                 370                 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe
    380                 385                 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys
395                 400                 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410                 415                 420                 425Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr
            430                 435                 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp
        445                 450                 455Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys
    460                 465                 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu
475                 480                 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490                 495                 500                 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr
            510                 515                 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala
        525                 530                 535Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro
    540                 545                 550Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
555                 560                 565Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro570                 575                 580                 585Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            590                 595                 600Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        605                 610                 615Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
    620                 625                 630Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro
635                 640                 645Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly650                 655                 660                 665Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala
            670                 675                 680Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
        685                 690                 695Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu
    700                 705                 710Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
715                 720(2)SEQ ID NO:3的资料：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：722个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：无
(ⅵ)来源
(A)有机体：Homo sapiens
(F)组织类型：乳腺
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Cly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly
530                 535                 540Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala545                 550                 555                 560Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
            565                 570                 575Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
        580                 585                 590Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro
    595                 600                 605Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
610                 615                 620Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro625                 630                 635                 640Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            645                 650                 655Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        660                 665                 670Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
    675                 680                 685Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro
690                 695                 700Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile705                 710                 715                 720Arg Phe(2)SEQ ID NO:4的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：535个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：无
(ⅵ)来源
  (A)有机体：Homo sapiens
  (F)组织类型：乳腺
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：肽
  (B)位置：1..535
  (D)其它资料：/标记=变异体_A
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255CyS Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln
530                 535(2)SEQ ID NO:5的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：546个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：无
(ⅵ)来源
  (A)有机体：Homo sapiens
  (F)组织类型：乳腺
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：肽
  (B)位置：1..546
  (D)其它资料：/标记=变异体_B
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile
530                 535                 540Arg Phe545(2)SEQ ID NO:6的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：568个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：无
(ⅵ)来源
  (A)有机体：Homo sapiens
  (F)组织类型：乳腺
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：肽
  (B)位置：1..568
  (D)其它资料：/标记=变异体_C
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly
530                 535                 540Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Lys Glu Ala545                 550                 555                 560Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
            565(2)SEQ ID NO:7的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：722个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅲ)假设：无
(ⅵ)来源
  (A)有机体：Homo sapiens
  (F)组织类型：乳腺
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：肽
  (B)位置：1..722
  (D)其它资料：/标记=变异体_N
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7：Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val1               5                   10                  15Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly
        20                  25                  30Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His
    35                  40                  45Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys
50                  55                  60Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys65                  70                  75                  80Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg
            85                  90                  95Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly
        100                 105                 110Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu
    115                 120                 125Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg
130                 135                 140Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly145                 150                 155                 160Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg
            165                 170                 175Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Gln Ile Thr Leu Phe Gly
        180                 185                 190Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr
    195                 200                 205Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu
210                 215                 220Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val225                 230                 235                 240Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln
            245                 250                 255Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val
        260                 265                 270Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val
    275                 280                 285Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr
290                 295                 300Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp305                 310                 315                 320Gly His Ile Phe Ala Set Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn
            325                 330                 335Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr
        340                 345                 350Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr
    355                 360                 365Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val
370                 375                 380Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala385                 390                 395                 400Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
            405                 410                 415Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly
        420                 425                 430Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala
    435                 440                 445Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met
450                 455                 460Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly465                 470                 475                 480Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser
            485                 490                 495Cly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg
        500                 505                 510Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala
    515                 520                 525Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly
530                 535                 540Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala545                 550                 555                 560Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr
            565                 570                 575Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala
        580                 585                 590Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro
    595                 600                 605Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
610                 615                 620Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro625                 630                 635                 640Pro Thr Gly Asp Ala Gly Pro Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            645                 650                 655Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        660                 665                 670Thr Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
    675                 680                 685Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Ala Pro
690                 695                 700Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile705                 710                 715                 720Arg Phe(2)SEQ ID NO:8的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：2184bp
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组的)
(ⅲ)假设：无
(ⅲ)反义：无
(ⅵ)来源
  (A)有机体：Homo sapiens
  (F)组织类型：乳腺
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：82..2088
  (D)其它资料：/标记=变异体_T
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：mat_肽
  (B)位置：151..2085
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_区域
  (B)位置：1756..2052
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1756..1788
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1789..1821
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1822..1854
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1855..1887
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1888..1920
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1921..1953
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1954..1986
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：1987..2019
(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：重复_单位
  (B)位置：2020..2052
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8：ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TAATGCAAAG      60AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG CTC ACC ATG GGG CGC CTG CAA CTG GTT       111
                    Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val
                    -23         -20                 -15GTG TTG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GTG GCG AGT GCC GCG AAG CTG       159Val Leu Gly Leu Thr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu
        -10                  -5                   1GGC GCC GTG TAC ACA GAA GGT GGG TTC GTG GAA GGC GTC AAT AAG AAG       207Gly Ala Val Tyr Thr Glu Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys
  5                  10                  15CTC GGC CTC CTG GGT GAC TCT GTG GAC ATC TTC AAG GGC ATC CCC TTC       255Leu Gly Leu Leu Gly Asp Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe20                  25                  30                  35GCA GCT CCC ACC AAG GCC CTG GAA AAT CCT CAG CCA CAT CCT GGC TGG       303Ala Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp
             40                  45                  50CAA GGG ACC CTG AAG GCC AAG AAC TTC AAG AAG AGA TGC CTG CAG GCC       351Gln Gly Thr Leu Lys Ala Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala
         55                  60                  65ACC ATC ACC CAG GAC AGC ACC TAC GGG GAT GAA GAC TGC CTG TAC CTC       399Thr Ile Thr Gln Asp Ser Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu
     70                  75                  80AAC ATT TGG GTG CCC CAG GGC AGG AAG CAA GTC TCC CGG GAC CTG CCC       447Asn Ile Trp Val Pro Gln Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro
 85                  90                  95GTT ATG ATC TGG ATC TAT GGA GGC GCC TTC CTC ATG GGG TCC GGC CAT       495Val Met Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His100                 105                 110                 115GGG GCC AAC TTC CTC AAC AAC TAC CTG TAT GAC GGC GAG GAG ATC GCC       543Gly Ala Asn Phe Leu Asn Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala
            120                 125                 130ACA CGC GGA AAC GTC ATC GTG GTC ACC TTC AAC TAC CGT GTC GGC CCC       591Thr Arg Gly Asn Val Ile Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro
        135                 140                 145CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC       639Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
    150                 155                 160CTT CGG GAT CAG CAC ATG GCC ATT GCT TGG GTG AAG AGG AAT ATC GCG       687Leu Arg Asp Gln His Met Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala
165                 170                 175GCC TTC GGG GGG GAC CCC AAC AAC ATC ACG CTC TTC GGG GAG TCT GCT       735Ala Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala180                 185                 190                 195GGA GGT GCC AGC GTC TCT CTG CAG ACC CTC TCC CCC TAC AAC AAG GGC       783Gly Gly Ala Ser Val Ser Leu Gln Thr Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly
            200                 205                 210CTC ATC CGG CGA GCC ATC AGC CAG AGC GGC GTG GCC CTG AGT CCC TGG       831Leu Ile Arg Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp
        215                 220                 225GTC ATC CAG AAA AAC CCA CTC TTC TGG GCC AAA AAG GTG GCT GAG AAG       879Val Ile Gln Lys Asn Pro Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys
    230                 235                 240GTG GGT TGC CCT GTG GGT GAT GCC GCC AGG ATG GCC CAG TGT CTG AAG       927Val Gly Cys Pro Val Gly Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys
245                 250                 255GTT ACT GAT CCC CGA GCC CTG ACG CTG GCC TAT AAG GTG CCG CTG GCA       975Val Thr Asp Pro Arg Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala260                 265                 270                 275GGC CTG GAG TAC CCC ATG CTG CAC TAT GTG GGC TTC GTC CCT GTC ATT      1023Gly Leu Glu Tyr Pro Met Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile
            280                 285                 290GAT GGA GAC TTC ATC CCC GCT GAC CCG ATC AAC CTG TAC GCC AAC GCC      1071Asp Gly Asp Phe Ile Pro Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala
        295                 300                 305GCC GAC ATC GAC TAT ATA GCA GGC ACC AAC AAC ATG GAC GGC CAC ATC      1119Ala Asp Ile Asp Tyr Ile Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile
    310                 315                 320TTC GCC AGC ATC GAC ATG CCT GCC ATC AAC AAG GGC AAC AAG AAA GTC      1167Phe Ala Ser Ile Asp Met Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val
325                 330                 335ACG GAG GAG GAC TTC TAC AAG CTG GTC AGT GAG TTC ACA ATC ACC AAG      1215Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys340                 345                 350                 355GGG CTC AGA GGC GCC AAG ACG ACC TTT GAT GTC TAC ACC GAG TCC TGG      1263Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp
            360                 365                 370GCC CAG GAC CCA TCC CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GTG GTG GAC TTT     1311Ala Gln Asp Pro Ser Gln Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe
        375                 380                 385GAG ACC GAT GTC CTC TTC CTG GTG CCC ACC GAG ATT GCC CTA GCC CAG     1359Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln
    390                 395                 400CAC AGA GCC AAT GCC AAG AGT GCC AAG ACC TAC GCC TAC CTG TTT TCC     1407His Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser
405                 410                 415CAT CCC TCT CGG ATG CCC GTC TAC CCC AAA TGG GTG GGG GCC GAC CAT     1455His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His420                 425                 430                 435GCA GAT GAC ATT CAG TAC GTT TTC GGG AAG CCC TTC GCC ACC CCC ACG     1503Ala Asp Asp Ile Gln Tyr Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr
            440                 445                 450GGC TAC CGG CCC CAA GAC AGG ACA GTC TCT AAG GCC ATG ATC GCC TAC     1551Gly Tyr Arg Pro Gln Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr
        455                 460                 465TGC ACC AAC TTT GCC AAA ACA GGG GAC CCC AAC ATG GGC GAC TCG GCT     1599Trp Thr Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala
    470                 475                 480GTG CCC ACA CAC TGG GAA CCC TAC ACT ACG GAA AAC AGC GGC TAC CTG     1647Val Pro Thr His Trp Glu Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu
485                 490                 495GAG ATC ACC AAG AAG ATG GGC AGC AGC TCC ATG AAG CGG AGC CTG AGA     1695Glu Ile Thr Lys Lys Met Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg500                 505                 510                 515ACC AAC TTC CTG CGC TAC TGG ACC CTC ACC TAT CTG GCG CTG CCC ACA     1743Thr Asn Phe Leu Arg Tyr Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr
            520                 525                 530GTG ACC GAC CAG GAG GCC ACC CCT GTG CCC CCC ACA GGG GAC TCC GAG     1791Val Thr Asp Gln Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu
        535                 540                 545GCC ACT CCC GTG CCC CCC ACG GGT GAC TCC GAG ACC GCC CCC GTG CCG     1839Ala Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro
    550                 555                 560CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC     1887Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
565                 570                 575GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG     1935Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val580                 585                 590                 595CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC     1983Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp
            600                 605                 610TCC GGG GCC CCC CCC GTG CCG CCC ACG GGT GAC TCC GGG GCC CCC CCT      2031Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro
        615                 620                 625GTG CCC CCC ACA GAT GAC TCC AAG GAA GCT CAG ATG CCT GCA GTC ATT      2079Val Pro Pro Thr Asp Asp Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile
    630                 635                 640AGG TTT TAGCGTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGAGT GGGACCCCAG       2135Arg Phe
645GGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCT                2184(2)SEQ ID NO:9的资料：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：668个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (D)拓扑结构：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9：Met Leu Thr Met Gly Arg Leu Gln Leu Val Val Leu Gly Leu Thr Cys-23         -20                 -15                 -10Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu Gly Ala Val Tyr Thr Glu
    -5                    1               5Gly Gly Phe Val Glu Gly Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu Leu Gly Asp10                  15                  20                  25Ser Val Asp Ile Phe Lys Gly Ile Pro Phe Ala Ala Pro Thr Lys Ala
             30                  35                  40Leu Glu Asn Pro Gln Pro His Pro Gly Trp Gln Gly Thr Leu Lys Ala
         45                  50                  55Lys Asn Phe Lys Lys Arg Cys Leu Gln Ala Thr Ile Thr Gln Asp Ser
     60                  65                  70Thr Tyr Gly Asp Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Gln
 75                  80                  85Gly Arg Lys Gln Val Ser Arg Asp Leu Pro Val Met Ile Trp Ile Tyr90                  95                 100                 105Gly Gly Ala Phe Leu Met Gly Ser Gly His Gly Ala Asn Phe Leu Asn
            110                 115                 120Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu Glu Ile Ala Thr Arg Gly Asn Val Ile
        125                 130                 135Val Val Thr Phe Asn Tyr Arg Val Gly Pro Leu Gly Phe Leu Set Thr
    140                 145                 150Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Asp Gln His Met
155                 160                 165Ala Ile Ala Trp Val Lys Arg Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro170                 175                 180                 185Asn Asn Ile Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Ser
            190                 195                 200Leu Gln Thr Leu Set Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg Arg Ala Ile
        205                 210                 215Ser Gln Ser Gly Val Ala Leu Ser Pro Trp Val Ile Gln Lys Asn Pro
    220                 225                 230Leu Phe Trp Ala Lys Lys Val Ala Glu Lys Val Gly Cys Pro Val Gly
235                 240                 245Asp Ala Ala Arg Met Ala Gln Cys Leu Lys Val Thr Asp Pro Arg Ala250                 255                 260                 265Leu Thr Leu Ala Tyr Lys Val Pro Leu Ala Gly Leu Glu Tyr Pro Met
            270                 275                 280Leu His Tyr Val Gly Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Asp Phe Ile Pro
        285                 290                 295Ala Asp Pro Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Ile Asp Tyr Ile
    300                 305                 310Ala Gly Thr Asn Asn Met Asp Gly His Ile Phe Ala Ser Ile Asp Met
315                 320                 325Pro Ala Ile Asn Lys Gly Asn Lys Lys Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr330                 335                 340                 345Lys Leu Val Ser Glu Phe Thr Ile Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys
            350                 355                 360Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr Glu Ser Trp Ala Gln Asp Pro Ser Gln
        365                 370                 375Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe
    380                 385                 390Leu Val Pro Thr Glu Ile Ala Leu Ala Gln His Arg Ala Asn Ala Lys
395                 400                 405Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro410                 415                 420                 425Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly Ala Asp His Ala Asp Asp Ile Gln Tyr
            430                 435                 440Val Phe Gly Lys Pro Phe Ala Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gln Asp
        445                 450                 455Arg Thr Val Ser Lys Ala Met Ile Ala Tyr Trp Thr Asn Phe Ala Lys
    460                 465                 470Thr Gly Asp Pro Asn Met Gly Asp Ser Ala Val Pro Thr His Trp Glu
475                 480                 485Pro Tyr Thr Thr Glu Asn Ser Gly Tyr Leu Glu Ile Thr Lys Lys Met490                 495                 500                 505Gly Ser Ser Ser Met Lys Arg Ser Leu Arg Thr Asn Phe Leu Arg Tyr
            510                 515                 520Trp Thr Leu Thr Tyr Leu Ala Leu Pro Thr Val Thr Asp Gln Glu Ala
        525                 530                 535Thr Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Glu Ala Thr Pro Val Pro Pro
    540                 545                 550Thr Gly Asp Ser Glu Thr Ala Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly
555                 560                 565Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro570                 575                 580                 585Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser
            590                 595                 600Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val
        605                 610                 615Pro Pro Thr Gly Asp Ser Gly Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Asp Asp
    620                 625                 630Ser Lys Glu Ala Gln Met Pro Ala Val Ile Arg Phe
635                 640                 645
Figure C9419184800721
INDICATIONS RELATTING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
                (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800722
Figure C9419184800731
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800732
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800742
Figure C9419184800751
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITE D MICROORGANISM
               (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800752
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800762
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800772
Figure C9419184800781
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rulc 13bis)
Figure C9419184800782
Figure C9419184800791
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rule 13bis)
Figure C9419184800792
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
               (PCT Rule 13bis)
Figure C9419184800802

Claims (33)

1．一种编码不到722个氨基酸的多肽的核酸分子，所述多肽是一种BSSL变异体，所说BSSL变异体含SEQ ID No:3所示第536-722个残基的部分氨基酸序列。
2．根据权利要求1的核酸分子，其中所说的BSSL变异体在其C-末端有一个苯丙氨酸残基。
3．根据权利要求1或2的核酸分子，其中所说BSSL变异体在其C-末端部分含有序列Gln-Met-Pro。
4．根据权利要求1或2的核酸分子，其中所说BSSL变异体在其C-末端部分含SEQ ID No:3中残基第712-722所示的氨基酸序列。
5．根据权利要求1或2的核酸分子，其中所述BSSL含不到16个重复单位。
6．根据权利要求1的编码多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列与序列表SEQID No:5、6或9所示的氨基酸序列至少90％同源。
7．根据权利要求6的编码多肽的核酸分子，所述多肽含序列表SEQ ID No:5、6或9所示的氨基酸序列。
8．一种编码多肽的核酸分子，所述多肽的氨基酸序列与序列表SEQ ID No:7所示的氨基酸序列至少90％同源，但编码在187位置为天冬酰胺的多肽的那些核酸分子除外。
9．根据权利要求8的编码多肽的核酸分子，所述多肽含序列表SEQ ID No:7所示的氨基酸序列。
10．序列表SEQ ID No:5、6、7或9所示的多肽。
11．由根据权利要求1-9的任一权利要求的核酸序列编码的多肽。
12．根据权利要求10或11的多肽，所述多肽的纯度超过90％。
13．含根据权利要求1-9的任一权利要求的核酸分子的杂种基因。
14．一种含权利要求13的杂种基因的可复制的表达载体。
15．根据权利要求14的载体，所述载体为牛乳头状瘤病毒载体pS258、pS259或pS299。
16．含有权利要求13杂种基因的细胞。
17．根据权利要求16的细胞，此细胞来自鼠细胞系C127或大肠杆菌。
18．一种生产权利要求11或12的重组多肽的方法，所说方法包括(ⅰ)将按照权利要求1-9的任一权利要求的核酸分子插入能在特异的宿主细胞或有机体中复制的杂种基因，(ⅱ)将所得的重组杂种基因引入宿主细胞或有机体；(ⅲ)在培养基内或上鉴定和生长产生的细胞，或鉴定和繁殖有机体，以便表达多肽；(ⅳ)回收多肽。
19．根据权利要求18的方法，其中杂种基因含于牛乳头状瘤病毒载体pS258、pS259或pS299。
20．一种表达系统，包含能在含所述杂种基因的宿主细胞或有机体中表达的杂种基因，以致于当杂种基因表达时生产重组多肽，所说杂种基因是通过将权利要求1-9的任一权利要求的核酸序列插入能调节所述杂种基因表达的基因中而产生。
21．含有根据权利要求10-12的任一权利要求多肽的婴儿食品组合物。
22．用权利要求10-12的任一权利要求的多肽补充婴儿食品组合物的婴儿食品组合物生产方法。
23．权利要求10-12的任一权利要求的多肽作为婴儿食物补充剂的用途。
24．含权利要求10-12的任一权利要求的多肽的药物组合物。
25．在治疗中应用的权利要求10-12的任一权利要求的多肽。
26．按权利要求10-12的任一权利要求的多肽在制备用于治疗与外分泌胰腺功能生理障碍相关的药物中的应用。
27．根据权利要求26的应用，用于制造治疗胆囊纤维化药物。
28．根据权利要求26的应用，用于制造治疗慢性胰腺炎的药物。
29．根据权利要求26的应用，用于制造治疗脂肪吸收不良的药物。
30．根据权利要求26的应用，用于制造治疗脂溶性维生素吸收不良的药物。
31．根据权利要求26的应用，用于制造治疗由生理原因所致脂肪吸收不良的药物。
32．根据权利要求26的应用，用于制造改进膳食脂类的利用的药物。
33．改进权利要求26的应用，用于制造提高早产儿膳食脂类的利用率的药物。
CN94191848A 1993-03-01 1994-02-25 胆盐刺激的脂酶变异体、其制法、用途及编码它的核酸 Expired - Lifetime CN1071790C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9300686A SE9300686D0 (sv) 1993-03-01 1993-03-01 Novel polypeptides
SE9300686-4 1993-03-01
SE9300722A SE9300722D0 (sv) 1993-03-04 1993-03-04 Novel polypeptides ii
SE9300722-7 1993-03-04

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001377388A Division CN1187450C (zh) 1993-03-01 1994-02-25 生产转基因非人类哺乳动物的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1121355A CN1121355A (zh) 1996-04-24
CN1071790C true CN1071790C (zh) 2001-09-26

Family

ID=26661673

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94191848A Expired - Lifetime CN1071790C (zh) 1993-03-01 1994-02-25 胆盐刺激的脂酶变异体、其制法、用途及编码它的核酸
CNB001377388A Expired - Lifetime CN1187450C (zh) 1993-03-01 1994-02-25 生产转基因非人类哺乳动物的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001377388A Expired - Lifetime CN1187450C (zh) 1993-03-01 1994-02-25 生产转基因非人类哺乳动物的方法

Country Status (28)

Country Link
US (2) US5827683A (zh)
EP (1) EP0687296B1 (zh)
JP (1) JP3837444B2 (zh)
KR (2) KR100312825B1 (zh)
CN (2) CN1071790C (zh)
AT (1) ATE317429T1 (zh)
AU (1) AU675701B2 (zh)
BR (1) BR9406376A (zh)
CA (1) CA2156083C (zh)
CZ (1) CZ290927B6 (zh)
DE (1) DE69434622T2 (zh)
DK (1) DK0687296T3 (zh)
EE (1) EE9400458A (zh)
ES (1) ES2258262T3 (zh)
FI (1) FI954082A (zh)
HU (1) HU221119B1 (zh)
IL (2) IL144015A (zh)
IS (1) IS4130A (zh)
NO (1) NO953426L (zh)
NZ (1) NZ262529A (zh)
PL (1) PL184960B1 (zh)
PT (1) PT687296E (zh)
RU (1) RU2219239C2 (zh)
SG (1) SG52597A1 (zh)
SK (1) SK285420B6 (zh)
TW (1) TW387013B (zh)
UA (1) UA48109C2 (zh)
WO (1) WO1994020610A1 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5696087A (en) * 1994-12-01 1997-12-09 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for reducing cholesterol absorption
US5821226A (en) * 1994-12-01 1998-10-13 Oklahoma Medical Research Foundation BAL C-tail drug delivery molecules
CA2206526A1 (en) * 1994-12-01 1996-06-06 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for reducing cholesterol absorption
US5681819A (en) * 1994-12-01 1997-10-28 Oklahoma Medical Research Foundation Method and compositions for reducing cholesterol absorption
FR2733249B1 (fr) * 1995-04-20 1997-06-06 Biocem Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
SE9501939D0 (sv) * 1995-05-24 1995-05-24 Astra Ab DNA molecules for expression of polypeptides
US6342218B1 (en) 1997-02-14 2002-01-29 Oklahoma Medical Research Foundation Method for treatment of SLE
SE9801424D0 (sv) * 1998-04-22 1998-04-22 Astra Ab Expression methods
AU2001255469A1 (en) * 2000-04-21 2001-11-07 Monsanto Technology Llc Purification of ace inhibiting polypeptides containing vpp from milk
CA2558754C (fr) 2004-03-31 2015-09-22 Universite De La Mediterranee Glycopeptides derives de structures pancreatiques, anticorps et leurs applications en diagnostic et therapeutique
FR2868424B1 (fr) * 2004-03-31 2008-04-11 Univ Aix Marseille Ii Glycopeptides derives de structures pancreatiques, anticorps et leurs applications en diagnostic et therapeutique
CN100343391C (zh) * 2004-12-31 2007-10-17 中国农业大学 卵巢注射法制备转基因动物
EP2039764A1 (en) * 2007-09-19 2009-03-25 Pevion Biotech AG Truncated secretory aspartyl proteinase 2
EP2629789A1 (en) 2010-10-21 2013-08-28 Swedish Orphan Biovitrum AB (Publ) Method to increase the absorption of unsaturated fatty acids by human infants
JP5850940B2 (ja) * 2010-10-21 2016-02-03 スウェディッシュ オーファン バイオビトラム パブリーク アクチエボラグ ヒト乳児の発育速度を増大させる方法
FR2966734B1 (fr) 2010-10-29 2014-07-18 Max Rombi Composition comprenant au moins une enzyme proteolytique pour son utilisation pour empecher la synthese des triglycerides
WO2012158109A1 (en) * 2011-05-18 2012-11-22 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Low ph protein purification process
CN103088000A (zh) * 2012-03-23 2013-05-08 北京济福霖生物技术有限公司 在哺乳动物乳腺中过表达胆盐激活脂酶的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015234A1 (en) * 1990-04-04 1991-10-17 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
WO1991018923A1 (en) * 1990-06-01 1991-12-12 Aktiebolaget Astra Derivatives of human bile-salt stimulated lipase, and pharmaceutical compositions containing them

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4944944A (en) * 1987-11-19 1990-07-31 Oklahoma Medical Research Foundation Dietary compositions and methods using bile salt-activated lipase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991015234A1 (en) * 1990-04-04 1991-10-17 Oklahoma Medical Research Foundation Recombinant bile salt activated lipases
WO1991018923A1 (en) * 1990-06-01 1991-12-12 Aktiebolaget Astra Derivatives of human bile-salt stimulated lipase, and pharmaceutical compositions containing them

Also Published As

Publication number Publication date
EP0687296A1 (en) 1995-12-20
IL108698A0 (en) 1994-05-30
SG52597A1 (en) 1998-09-28
CZ216995A3 (en) 1997-05-14
PL310413A1 (en) 1995-12-11
CA2156083C (en) 2008-07-15
IL144015A (en) 2006-08-20
US5763739A (en) 1998-06-09
HU9502561D0 (en) 1995-10-30
DE69434622T2 (de) 2006-08-24
FI954082A0 (fi) 1995-08-31
NO953426D0 (no) 1995-08-31
ES2258262T3 (es) 2006-08-16
EP0687296B1 (en) 2006-02-08
US5827683A (en) 1998-10-27
SK108595A3 (en) 1997-01-08
CN1346888A (zh) 2002-05-01
HU221119B1 (en) 2002-08-28
IS4130A (is) 1994-09-02
HUT73398A (en) 1996-07-29
JPH08507439A (ja) 1996-08-13
RU2219239C2 (ru) 2003-12-20
NZ262529A (en) 1997-07-27
ATE317429T1 (de) 2006-02-15
CZ290927B6 (cs) 2002-11-13
AU6223794A (en) 1994-09-26
CA2156083A1 (en) 1994-09-15
PT687296E (pt) 2006-05-31
EE9400458A (et) 1996-06-17
CN1187450C (zh) 2005-02-02
DE69434622D1 (de) 2006-04-20
WO1994020610A1 (en) 1994-09-15
BR9406376A (pt) 1996-01-16
AU675701B2 (en) 1997-02-13
NO953426L (no) 1995-08-31
KR100357016B1 (ko) 2002-10-19
JP3837444B2 (ja) 2006-10-25
FI954082A (fi) 1995-08-31
CN1121355A (zh) 1996-04-24
PL184960B1 (pl) 2003-01-31
UA48109C2 (uk) 2002-08-15
TW387013B (en) 2000-04-11
SK285420B6 (sk) 2007-01-04
KR100312825B1 (ko) 2001-12-28
DK0687296T3 (da) 2006-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1071790C (zh) 胆盐刺激的脂酶变异体、其制法、用途及编码它的核酸
CN1086262A (zh) 新的dna序列
CN1079433C (zh) 在转基因动物中生产纤维蛋白原
CN1230537C (zh) 来自曲霉属融合产物中经加工的重组乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断的表达
CN1230541C (zh) 产生三酰甘油的生物合成途径中的新型酶类及编码该酶类的重组dna分子
CN1304581C (zh) 用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法
CN1491280A (zh) 滑膜细胞蛋白质
CN1215432A (zh) 调节外源性基因在哺乳动物系统中表达的激素介导的方法及其相关产物
CN1612746A (zh) Hepcidin作为铁稳态调节剂的用途
CN1826414A (zh) 突变型腺伴随病毒的病毒颗粒及其使用方法
CN1035527A (zh) 直接表达活化人c蛋白的载体和化合物
CN1201013C (zh) 用于减少同源重组现象的腺病毒载体及方法
CN1916167A (zh) 过氧化物酶体增殖物激活受体的调节
CN1639333A (zh) 利用基因重组蚕生产生理活性蛋白质的方法
CN1189188A (zh) 超耐热蛋白酶基因
CN1167793C (zh) 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法
CN1516734A (zh) 生产人胶原的转化蚕
CN1944645A (zh) 利用乳腺生物反应器制备重组人的抗凝血酶ⅲ蛋白的方法
CN1035526A (zh) 表达人c蛋白酶原的载体和化合物
CN1306568A (zh) 可得自转基因羊的胆汁盐活化的人脂肪酶(bssl)
CN1648135A (zh) 转导肽－人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白及其应用
CN1157635A (zh) α-乳清蛋白基因构建物
CN1520459A (zh) 突变体的制造方法
CN1283785C (zh) 利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素的方法
CN1200735C (zh) 肾小球膜细胞增生性肾炎动物模型

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1031370

Country of ref document: HK

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: ALEX CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: ASTRAZENCA AB

Effective date: 20041217

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: ASTRAZENCA AB

Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: AKTIEBOLAGET ASTRA

CP03 Change of name, title or address

Address after: Swedish Sodertalje

Patentee after: ASTRAZENECA AB

Address before: Swedish Sodertalje

Patentee before: ASTRA AB

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20041217

Address after: Sweden Getebao

Patentee after: Astra AB

Address before: Swedish Sodertalje

Patentee before: ASTRAZENECA AB

C17 Cessation of patent right
CX01 Expiry of patent term

Expiration termination date: 20140225

Granted publication date: 20010926