CN1520459A - 突变体的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供目的外源基因的高频随机突变体的制造方法，在这种方法中，将真核启动子，外源DNA序列，内含子增强子和3’HS3/4增强子连在一起，构建成一个重组表达载体，导入并在动物细胞中表达。

Description

突变体的制造方法
技术领域
本发明涉及一种新的制造突变体方法，所述方法包括将改进的DNA构建体导入动物细胞中，以及涉及用于制造基因突变体或表达突变基因的DNA构建体和试剂盒。
技术背景
现存的生物是通过诱变和环境对突变体的选择长期进化而来的。普通进化速度很慢，而且是经过许多代才向前发展。另一方面，在免疫系统的制造抗体的细胞中，抗原诱变和选择是在一代中完成的，下一代不会遗传获得的功能。免疫系统中这种快速的进化可以解释成对环境依赖的病原微生物突变的对抗。
本发明者以前获得了转基因小鼠，其中转入了细菌来源的氯霉素乙酰转移酶的基因，并证明抗体基因的突变是受它的启动子和增强子控制的，而且任何基因的突变都可以通过抗体基因的启动子和增强子的控制来诱导(Azuma，T.等，Int.Immunology，5(2)121-130(1992))。
现在使用的制造突变体的方法是一种突变体制造方法，在这个方法中，将缺失，插入和/或添加突变适当地引入所需的DNA序列中，即位点特异性地取代一定长度DNA序列的位点特异性突变(位点特异突变(Site-specific mutagesis)，Zoller等，Nucleic Acid Res，10，6487-6500(1982)；Zooler等，Methods in Enzymol.，100，468-500(1983))。在利用人工合成的寡核苷酸做引物的一般错配突变中，合成的由大约20个碱基组成的互补寡核苷酸在碱基序列中准备诱导突变的位点附近会产生一个任选突变，寡核苷酸和靶DNA杂交，然后，用DNA聚合酶可产生和靶DNA剩余序列互补的DNA。这样就可能把所需的突变导入所需的位点。但这种方法不能一次诱导许多突变体。
在其他诱变系统中，有人检测了在损伤基因的化合物存在的情况下，某种特定功能的消失或显示(Myers等，科学，232，613-618(1986))，而另外的人则是利用细菌等。但是这些方法基本上和上述本发明者诱导突变的方法不同。
小鼠和人Ig V区的变异(多样性)的产生方法如下：将胚系中分隔存在的V，D和J基因区段组合连接，在连接过程中，这些区段的连接处有核苷酸的缺失和和添加，以及连接的V-(D)-J基因发生体细胞高变。体细胞高变和抗体的亲和力成熟相关，而且在T细胞依赖的抗原(TD)刺激后可以经常观察到(Bothwell，A.L.M.等，细胞，24，625(1981)：Gearhart，P.J.等，自然，291，29(1981)：Griffiths，G.M.等，自然，312，271(1984)：Maizels，N.等，细胞，43，715(1985)：Wysocki，L.T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，1847(1986)：Cumano，A.等，EMBO.J.，5，2459(1986)：Berek，C.等，细胞，67，1121(1991)：Taketani，M.等，Mol.Immunol.，32，983(1995)：Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999)：2-10)。利用κ链(O’Brien，R.L.等，自然，326，405(1987)：Sharpe，M.J.等，Eur.J.Immunol.，20，1379(1990)：Sharpe，M.J.等，EMBO.J.，10，2139(1991)：Betz，A.G.等，细胞，77，239(1994)：Yelamos，J.等，自然，376，225(1995)：Peter，A.等，Immunity，4，57(1996)：11-16)，λ链(Klotz，E.等，J.Immunol.，157，4458(1996)：17)和H链转基因小鼠(Durdik，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2346(1989)：Sohn，J.等，J.Exp.Med.，177，493(1993)：Tumas-Brundage，K.M.和Manser，T.，J.Exp.Med.，1985，239(1997)：18-20)已经鉴定出负责诱导体细胞高变的顺式作用元件。
如上所述，本发明者制备了携带氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的转基因小鼠，而氯霉素乙酰转移酶基因通过VH17.2.25(Loh，D.Y.等，细胞，33，85(1983)：Grosschedl，R.和Baltimore，D.，细胞，41，885(1985)：22，23)和J-C内含子增强子(以后简写成Eμ)(Gillies，S.D.等，细胞，33，715(1983)：Banerji，J.等，细胞，33，729(1983)：24，25)/基质结合区(以后简写成MAR)(Forrester，W.C.等，科学，265，1221(1994)：26)驱动的。结果，在CAT中检测到了体细胞高变，而在VH启动子或Eμ/MAR侧翼序列却检测不到。但是，在内源性VH-D-JH中观察到的突变频率是约1/10，这表明这些顺式作用元件对于高变而言是关键或重要的，而其他成分如3’端的Cλ，Cα或Cα的增强子侧翼序列(3’增强子)(Pettersson，S.等，自然，344，165(1990)：Dariavach，P.等，Eur.J.Immunol.，21，1499(1991)：Lieberson，R.等，EMBO.J.，14，6229(1995)：27-29)可能是造成高频率的体细胞高变的原因(Sohn，J.等，J.Exp.Med.，177，493(1993)：Tumas-Brundage，K.M.和Manser，T.，J.Exp.Med.，185，239(1997)：Giusti，A.M.和Manser，T.J.Exp.Med.，177，793(1997)：19，20，30)
发明内容
为了鉴定对提高IgH基因高变频率至关重要的成分，本发明者采用了由Chen等人开发的一个RAG-2缺陷(重组激活基因：基因重排蛋白-2基因)胚泡补体系统(Chen，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，4528(1993)：31)。将一系列仅在3’侧翼区存在差异的转基因构建体微注射入RAG-2缺陷胚泡以转染胚胎干细胞(以后简称ES细胞)。从这个系统中得到的嵌合小鼠然后用T细胞依赖的抗原免疫。
结果，转基因的VH-D-JH中体细胞高变频率揭示出插入DNase I敏感区3b(以后简称HS3b)和/或HS4(Madisen，L.和Groudine，M.，GenesDev.8，2212(1994)：Michaelson，J.S.等，Nucleic Acids Res.，23，975(1995)：Arulampalam，V等，Immunol.Today，18，549(1997)：32-34)会诱导随机的体细胞高变。
本发明的目的是提供随机突变体的制造方法，在这种方法中，将其中修饰的真核启动子，外部DNA序列，内含子增强子和3’HS3/4增强子连在一起的DNA构建体导入动物细胞。本发明的另一个目的是通过在动物细胞中表达DNA构建体而获得一个突变基因的方法。本发明者找到了一种能产生这种突变体的DNA构建体以及一种制造基因突变体或表达突变基因的试剂盒，从而完成了本发明。此外，从动物细胞表达系统中获得的突变基因表达产物意味着它已进行了针对动物细胞的毒性筛选。
本发明提供了下列第1到第20项。
第1项.一种外源基因随机突变体的制造方法，其中将至少含有下列(a)-(d)DNA序列的DNA构建体导入动物细胞，这样，在动物细胞中就获得了外源基因的突变体：
(a)启动子；
(b)外源基因；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子。
第2项.根据第1项所述的制造方法，其中(d)增强子进一步包括HS1和HS2。
第3项.根据第1或第2项所述的制造方法，其中(d)增强子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO：1或2中的一段DNA序列。
第4项.根据第1到第3项中任一项所述的制造方法，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列来自免疫球蛋白DNA序列。
第5项.根据第2项所述的制造方法，其中(d)增强子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
第6项.根据第1到第5项中任一项所述的制造方法，其中
(a)启动子是VH启动子；和
(d)增强子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO：1和2中的DNA序列。
第7项.根据第5或第6项所述的制造方法，其中所述的DNA构建体是pvehc3’EHS3b/4。
第8项.根据第1到第7项中任一项所述的制造方法，其中动物细胞是B细胞系动物细胞。
第9项.根据第8项所述的制造方法，其中B细胞系动物细胞源自前B淋巴细胞系细胞。
第10项.一种在动物细胞中通过表达外源基因突变体而获得突变基因表达产物的方法，所述外源基因突变体是根据第1到第9项中任一项所述的制造方法获得的。
第11项.一种制造外源基因突变体的DNA构建体，其至少包括：
(a)启动子；
(b)外源基因；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子。
第12项.根据第11项所述的DNA构建体，其中(d)增强子进一步包括HS1和HS2。
第13项.根据第11项或第12项所述的DNA构建体，其中(d)增强子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO：1或2中的一段DNA序列。
第14项.根据第11到第13项中任一项所述的DNA构建体，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列来自免疫球蛋白DNA序列。
第15项.根据第11到第14项中任一项所述的DNA构建体，其中(d)增强子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
第16项.根据第11到第15项中任一项所述的DNA构建体，其中
(a)启动子是VH启动子，和
(d)增强子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO：1和2中的DNA序列。
第17项.根据第11或第12项所述的DNA构建体，其中所述DNA构建体是pvehc3’EHS3b/4。
第18项.一种用于外源基因突变体的制造方法或产生突变基因的表达产物的试剂盒，为了实现对制造外源基因突变体的突变DNA序列的表达，所述试剂盒包括一种载体，所述载体具有：
(a)启动子；
(b)外源基因插入位点；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子。
第19项.根据第18项所述的试剂盒，其中(d)增强子进一步包括HS1和HS2。
第20项.含有SEQ ID NO：14序列的VH17.2.25启动子。
根据本发明，将外源基因导入受抗体基因的启动子和增强子控制的系统，因此能获得具有频繁和随机突变的基因簇，同时提供一种用于动物细胞系突变体的制造方法，其中突变被广泛引入肽或蛋白，这样就可能去改进和改变自然发生的蛋白的功能。例如，有可能开发新型的针对抗生素抗性细菌具有改进功能的抗生素，农业化学药品或一些功能更好的改进的肽类药物，如干扰素和生长激素。此外，利用动物细胞，可以同时进行毒性筛选，因此，能检查初步的毒力，并快速创造出功能改进的各种不同的肽类产物。
在本说明书后文中，氨基酸，肽，碱基序列，核酸等的简写表示应遵循IUPAC-IUB的规定(IUPAC-IUB对生物命名的通讯(IUPAC-IUBcommunication on Biological Nomenclature)，Eur.J.Biochem，138：9(1984))“说明书的准备和其他含碱基序列或氨基酸序列的材料指南”(Guideline for the preparation of specification and others containing abase sequence or an ammo acid sequence)(日本专利局编辑)及本领域的常规符号。
根据通用基因工程技术(分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；Continuation of Biochemical Experiment Course，GeneticResearch Method I，II和III，Japanese Biochemical Society(1986))或基因重组技术(例如参考，科学，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，80，5990(1983))能轻易地合成DNA，构建含有外源基因的DNA构建体(例如表达载体)，DNA构建体转化宿主细胞以及由宿主细胞分泌表达蛋白等。
在本发明中，突变体指的是含有外源基因的随机突变DNA序列的基因或含有由随机突变基因编码的突变氨基酸序列的表达产物。
根据本发明，可在动物细胞中获得突变体产物的方法如下：制备DNA构建体，其由本发明提供，用于诱导突变体(重组DNA)，它能在含有编码所需蛋白的基因的宿主细胞中表达，然后把构建体导入宿主细胞。
在说明书中“把DNA构建体导入动物细胞”意思是指把外源基因整合到动物细胞的基因组中。
获得突变基因表达产物的方法如下：培养含有上述外源基因突变体的转化子，然后从所得的培养物中收集表达产物。
由本发明提供的用于诱导突变体的DNA构建体在其结构中至少包括(a)启动子，(b)外源基因，(c)内含子增强子，以及(d)在Dnase I敏感区含HS1，HS2和HS3b和/或HS4的增强子，并且通过通用基因工程技术可轻易地制备或获得。
为了制备本发明中的各个基因(DNA)，这个基因可以来源于合适的起源或通过化学合成。
具体来说，DNA合成可以通过亚磷酰胺法或三酯法进行化学合成，或者也可用商业上的全自动寡核苷酸合成仪进行合成。从化学合成的单链产物也可制备双链DNA片段，其方法如下：合成互补链，在合适的条件下使这些链一起退火，然后用DNA聚合酶和合适的引物序列合成互补链。
此外，每个基因也可用下述方法获得：用上述的方法进行DNA合成，或从含有该基因的载体或从其中基因得以表达的合适起源中，用一般方法构建一个cDNA文库，然后用合适的探针或对基因特异的抗体去筛选所需的克隆(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，6613(1981)；科学，222，778(1983)等)。
上面列举为cDNA起源的有各种不同的细胞和组织，其中每个基因都可以表达，以及衍生自这些细胞和组织的培养细胞等。此外，用常规的方法可以从这些起源中分离总RNA，分离和纯化mRNA，制备和克隆cDNA等。商业上买到cDNA文库，如来自Clontech Lab.Inc的cDNA文库也能用于本发明。从cDNA文库中筛选基因的方法不受限制，它也可以采用常规方法进行。
具体而言，使用针对蛋白的特异抗体，对通过cDNA所产生的蛋白进行免疫筛选的方法，选择对应cDNA克隆的方法，用选择性结合靶DNA的探针进行噬菌斑杂交和集落杂交的方法，以及这些方法的组合等均可使用。
作为这里使用的探针，一般采用根据每个基因的碱基序列信息而化学合成的DNA序列，但根据本发明获得的基因或基因片段使用起来也能获得满意的效果。根据外源基因碱基序列设计的有义引物或反义引物也能作为筛选用探针。
对应于每个基因DNA序列的部分核苷酸序列均可用作上述的探针。核苷酸序列可至少含15个连续的碱基，优选的是20个连续碱基，更优选的是30个连续碱基，而最优选的则是50个连续的碱基。此外，含有所述序列的阳性克隆本身也可用作探针。
用PCR法扩增DNA/RNA是获得基因的优选方法(科学，230，1350(1985))。尤其是当很难从文库中获得全长cDNA时，RACE法(cDNA末端快速扩增法，Journal of Experimental Medicine，12(6)，35(1994))，尤其是5’RACE法(M.A.Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，8，8998(1998))等可以优选采用。
当采用PCR方法时，所用引物可根据基因序列信息加以设计，并用常规方法合成。扩增的DNA/RNA片段可以用如上所述的常规方法分离和纯化，如凝胶电泳。
上面获得的基因序列或各种不同的DNA片段序列可以用双脱氧测序法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463(1977)和Maxam-Gilber化学测序法(Methods in Enzymology，65，499(1980)等常规方法确定，或者，更容易地可以使用商用测序试剂盒等来测序。
(b)所需的外源基因
在上述DNA构建体的组成中，用作(b)外源基因的DNA既可以是衍生自所需基因的外源基因，也可是诱导突变体的表达蛋白。或者，用作外源基因的DNA可以是合成的。用于本发明制造突变体的方法的外源基因长度一般是4kb或更小，优选的是3kb或更小，更优选的是大约2kb，但也可使用长度大于4kb的外源DNA序列。
就从外源基因表达时展示生物活性来看，对它没有特别限制，如生长激素(GH)，胰岛素，干扰素，促红细胞生成素等。
为了更容易地检测插入到宿主细胞基因组的外源基因，用作所谓的标记基因的DNA序列可以和上述(b)外源基因的DNA序列连接在一起。
使用这样获得的外源基因的部分或全部序列，可以特异性地检测外源基因及其突变体在个体或各种不同组织中的表达。
可以用常规的方法进行这种检测，如通过RT-PCR扩增RNA(反转录聚合酶链式反应，E.S.Kawasaki等，RNA的扩增(Amplification ofRNA)，In PCR Protocol，方法和应用指南(A Guide to methods andapplications)，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991))，RNA印迹分析(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989))，利用原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))和原位杂交在细胞水平上的检测，NASBA方法(基于核酸序列的扩增，自然，350，91-92(1991)以及其他各种方法。RT-PCR是优选的检测方法。
外源基因用合适的限制酶剪切，得到限制性DNA片段，即DNA构建体的(b)外源基因。
(c)启动子
用作上述DNA构建体的组成的(a)启动子包括免疫球蛋白重链可变区启动子(VH启动子)，来自SV40的启动子，反转录病毒启动子，腺病毒启动子，巨细胞病毒启动子，来自诸如多瘤病毒或乙型肝炎病毒的启动子，金属硫蛋白启动子，热激启动子，SRα启动子，以及其它对哺乳动物细胞有效的启动子等。VH启动子，尤其是VH17.2.25启动子(Gillies，S.D.等，细胞，33，715(1983)：Banerji，J.等，细胞，33，729(1983))在本发明中是优选使用的。
例如，上述启动子可包括诱导新霉素抗性基因或四霉素抗性基因的启动子。
上述启动子可以两个或多个连在一起。
上述启动子的各种DNA序列是已知的，而且其背景信息也是可得到的。
(c)内含子增强子
内含子增强子是一段DNA序列，它能调节转录，含有插在重链JH基因和Cμ基因的外显子之间的未表达区序列。免疫球蛋白的重链增强子(Cμ增强子)和κ-链增强子(κ增强子)便是(c)中内含子增强子的例子。
(d)脱氧核糖核酸酶I(DNase I)敏感区
DNase I敏感区是用低浓度DNase I处理分离的细胞核时遭受片段化的区域。在免疫球蛋白重链基因中，HS1，HS2，HS3b和HS4都是已知的。HS3b/4指的是HS3b和HS4两者或其中一个。本发明的特征是含有HS3b区和/或HS4区。在一个优选的实施方案中，除了HS3b和/或HS4，还包含HS1和HS2(它们在这里称作3’E)。没有内含子的序列表示为3’EHS3b/4，它包含Lieberson，R等人公开的3’增强子的Xba I片段(4.0kb)(EMBO，J.，14，6229(1995)和Madisen，L等人公开的MP11的HS3(1182bp)和HS4(1381bp)(Genes Dev.，8，2212(1994)。
连接每段基因(DNA构建体的制备用)
本发明的DNA构建体的制备方法为，例如，通过常规方法把上述每个基因插入合适的表达载体，例如，把每个元件插入到有合适抗生素抗性基因的载体。具体而言，DNA构建体的的构建是将启动子，外源基因，内含子增强子，DNase I敏感区(包括HS3b和/或HS4的DNA序列，如果有必要，进一步还包括含3’E的增强子)插入到动物细胞系中所用的带任选抗生素抗性基因的载体，这些元件用任选的限制性酶从载体克隆，基因组DNA或质粒中切割而来或人工合成的。
具体而言，用限制性酶，连接酶等根据常规方法，便可将基因插入到载体。
在所需的重组表达载体中，内含子增强子和3’EHS3b/4增强子可以从5’到3’端同向构建，也可从3’到5’端同向构建或从5’到3’端反向构建，也可从3’到5’端反向构建。
在上述DNA构建体中，插入外源基因的启动子和3’EHS3b/4增强子之间的间隔可以是0.1kb-100kb，优选的是1-10kb，更优选的是2-5kb。
优选的表达载体的例子是反转录病毒载体。更具体而言，如pIND(Invitrogen)，pcDNA3.1/His(Invitrogen)，Pegfp-N，pEGFP-C(Clontech)等。
根据本发明者和其它人(Azuma，T等，Int，Immunology，5(2)121-130(1993)，含有(a)启动子和(c)内含子增强子的DNA构建体的例子是一种含VH启动子和内含子增强子的表达载体。它可被优选用来制备DNA构建体。
在上述含启动子和内含子增强子的表达载体中，启动子位于外源基因的上游5’端，从而可诱导外源基因表达。然后依次是外源基因，内含子增强子。
上述载体用于制备含有外源基因的本发明DNA构建体，当对其进行修饰，使其含有一个启动子，所需外源基因的插入位点，对诱导突变所必需的一个/或多个增强子(尤其是免疫球蛋白增强子和内含子增强子)和DNase I敏感区时，它都可以有效作为DNA构建体用于外源基因突变体的制造方法或获得突变基因表达产物的试剂盒中。
本发明的DNA构建体可以是环形DNA或线形DNA。
可以用常规方法来检测是否获得了本发明的DNA构建体，例如用限制性酶去切割构建体，然后进行电泳，或结合PCR，Southern杂交和测序等。
突变体的制造方法
在外源基因的制造方法中，首先，把用上述方法产生的DNA构建体导入合适的宿主细胞，从而获得同源性重组体。
宿主细胞的例子包括真核生物，包括哺乳动物，酵母，植物等的细胞，但哺乳动物细胞是优选的。和可使突变更有效的决定子一起转化的确立的细胞系优选用作这样的细胞，猴COS细胞(细胞，23，175(1981))，中国仓鼠卵母细胞，Hela细胞，大鼠II成纤维细胞，消化道上皮细胞和它的二氢叶酸还原酶缺陷株(Proc.Nalt.Acad.Sci.USA.77：4126(1980))。就已经建立起来的细胞系而言，优选使用，但不限于，例如T细胞或B细胞系动物细胞，尤其是前B细胞系动物细胞，更优选的是J558细胞和J558L细胞。就酵母细胞而言，用的是酵母属等的酵母细胞。此外，来自动物活体的细胞也能用作宿主细胞。
把外源基因导入宿主细胞基因组的结果是能获得转化了本发明DNA构建体的转化子。
把本发明DNA构建体导入宿主细胞可以用本领域已知的把DNA导入细胞的各种方法来进行，例如电穿孔法，磷酸钙共沉淀法，脂质体法，DEAE葡聚糖法，显微注射法，病毒转导等。电穿孔法是优选采用的。
能导入本发明DNA构建体的细胞的例子包括受精卵，胚胎，生殖细胞等。导入细胞可以用常规的方法来进行。
突变体是否获得可以用已知的方法来检查，例如通过随机测序方法或通过确定外源基因表达产物的活性以及选择其活性区别于外源基因表达产物的突变体。此外，也可以根据标准活性和活性的程度，或根据活性高低来选择突变体。
转化有目的外源DNA的分离形式的细胞本身，含有随机突变基因，可改进成和人外源基因相关的肽，肽的功能更好。因此，它能用作药物来改善疾病，也能作为一种模式系统用于治疗研究。
得到的转化子可以用常规的方法培养。结果，由外源基因的突变体所编码的本发明的目的蛋白在胞内，胞外或转化子的细胞膜上表达和产生(积累，分泌)。
根据所用的宿主细胞，各种普通培养基可以适当地加以选择并用于培养，而培养可在适合宿主细胞生长的状态下进行。
如果有必要，可以根据重组蛋白的物理或化学特性，采用各种不同的分离方法来分离和纯化本发明获得的重组蛋白(例如，参考Biochemistry Data Book II，1175-1259，Editionl，Issue 1，由TokyoKagaku Dojin出版(1980年6月23日)；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等)。
普通重建方法，即能使蛋白沉淀的方法(盐析法)，离心分离，渗透冲击法，超声破碎，超滤，分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析，离子交换层析，亲和层析，各种液相层析如高效液相色谱(HPLC)，透析及这些方法的组合都可以作为上述方法的具体例子。例如，用一个结合有本发明蛋白特异抗体的柱子进行亲和层析是特别优选的。
这样，将本发明的重组表达载体导入一动物细胞中以生成外源DNA，导致由所述DNA编码的随机突变体。本发明的重组表达载体表达随机突变体的频率至少是在约1×10-4到约1×10-3/bp/代。
本发明提供了一种突变体的制造方法，这个突变体含有真核细胞，尤其是动物细胞，所述动物细胞中含有上述的重组载体，而重组载体中则含有外源DNA或外源基因的插入位点，从而可以完成导入的DNA序列或基因突变体的表达。
根据本发明制造突变体的方法，可以对具抗微生物活性、但由于其对动物细胞的毒性而不可用的肽进行改进，使这种肽变成低毒性和高抗微生物活性的肽。同样，试图改进或改变一些蛋白的功能也是有可能的，如自然存在的干扰素，生长激素等。因此，可以提供一种开发农业化学物质或改进药物功能等的有用方法。
而且，本发明还提供用来制造外源基因突变体或制造突变基因的表达产物的试剂盒，其含有DNA构建体，这个DNA构建体中有外源DNA或外源基因的插入位点。具体来说，DNA构建体包括：
(a)启动子；
(b)外源基因；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子，如果有必要，还进一步包括HS1和HS2。
根据本发明制造突变体的试剂盒，对动物细胞具低毒性和高抗微生物活性的改进肽以及功能改善的蛋白药物如天然存在的干扰素，生长激素等本发明也提供。
附图简述
图1A所示的是IgH突变转基因构建体用来制造嵌合小鼠的示意图。
在图1B中，用来扩增cDNA的引物的位置和方向用箭头表示。
图2所示的是从转染有图1所示的IgH突变基因的J558L细胞中制造产抗-NP抗体的人Cμ。使用包被有NP9-BSA的平板，对培养了12小时的J558L细胞(1×106细胞/ml)的上清进行ELISA，从而估计抗体的产量。
图3A所示的是在嵌合小鼠A4-3，2-1和2-3中，用ES细胞对RAG-2-/-小鼠的免疫系统进行重建的过程。使用包被有大鼠抗小鼠IgM单克隆抗体的平板和POD标记的山羊抗小鼠的IgM抗体，通过ELISA检测免疫前小鼠中的小鼠IgM的水平。
图3B所示的是使用包被有小鼠抗人IgM抗体和POD标记的山羊IgM抗体检测免疫前或免疫血清中人IgM的水平。免疫血清被称作TD。
来自Balb/c小鼠和RAG-2-/--小鼠的抗血清在A中用作对照，除了这些血清以外的J558L的培养物上清在B中用作对照。
图3C所示的是抗NP抗体与包被抗NP9-BSA抗体的平板结合的分析。用POD标记的抗小鼠IgG来检测结合的抗体。
图3D所示的是来自嵌合小鼠的抗血清和用NP1-BSA或NP12-BSA包被的平板的结合比率。
图4所示的是用RT-PCR特异性扩增转基因。用NP34-CGG免疫嵌合小鼠，从中提取嵌合小鼠IgM-B220+脾细胞的mRNA，然后以此制备cDNA，并通过PCR扩增。只有嵌合小鼠会产生对应于转基因的条带(泳道1-6)，而C57BL/6小鼠却不会产生这样的条带(泳道7)。J558L细胞转染子(泳道8)和非转染子(泳道9)也如图所示被用作阳性或阴性对照。
图5所示为来自脾脏IgM-B220+细胞(A)和腹膜B1细胞(B)的转基因构建体中体细胞高变的分布和发生频率的比较。
来自两种嵌合小鼠的转基因构建体中体细胞高变的分布和频率分别如图A所示。底部数值表示的是根据Kabat等人的方法所编号的氨基酸位置。
实施本发明的最佳模式
下面给出的一些实施例可以更详细说明本发明，但这些实施例并不是为了限制本发明的范围。
实施例1
1)IgH转基因的构建
构建了携带不同3’侧翼区的人Cμ的IgH链(IgH)。含有VH启动子和含Eμ/MAR的片段的获得
将含有VH17.2.25启动子(0.55kb：SEQ ID No.14)、带有Kpn I和Apa I限制酶切位点的片段，以及另一个含有Eμ/MAR(1kb)、带有XhoI和Sal I位点的片段，通过PCR从构建体[具氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的质粒，CAT基因由位于pBluescript SK(+)限制酶Xba I和XhoI位点之间、来源于VH17.2.25的VH启动子和内含子增强子(J-C内含子增强子/基质结合区(简写成Eμ/MAR))所控制]中克隆出来，这个质粒是本发明者以前制备用来制造CAT转基因小鼠的(Azuma，T.等，Int.Immunology，5(2)121-130(1993))。
VH-D-JH基因片段的获得
含有限制酶Apa I和Xho I位点的重排VH-D-JH基因片段(2.0kb)也可利用来自A6的基因组DNA，通过PCR克隆，A6是一个能制造抗4-羟基-3-硝基苯基因乙酰单克隆抗体(下文称作抗-NP单克隆抗体)的杂交瘤，它是从C57BL/6小鼠(Tokyo Animal Center)中获得的(Taketani，M.等，Mol.Immunity，32，983(1995)：Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999))。
依次将VH启动子，VH-D-JH基因和Eμ/MAR克隆进Bluescript IISK(购自Stratagene)。
人Cμ基因的获得
从一个噬菌体克隆CH.H.Igμ-24(Takahashi，N.等，Nucleic AcidRes.，8，5983(1980)；Health Science Resources Bank)获得人Cμ基因的6.9kb Xba I片段。
3’增强子的获得
从J.Manis和F.Alt博士(Harvard Medical School)获得含3’增强子(后文简写成3’E)的Xba I片段(4.0kb)的质粒(Lieberson，R.等，EMBO.J，14，6229(1995))。用如SEQ ID No.3-6所示的引物和来自B细胞淋巴瘤MPC11(Madisen，L.和Groudine，M.，Genes Dev.8，2212(1994))的基因组DNA，通过PCR克隆片段，该片段含有如SEQ ID No.1所示的HS3b(1.2kb)和如SEQ ID No.2所示的HS4(1.4kb)。在每个引物序列中，限制酶Spe I或Xba I的识别位点用下划线表示。
SEQ ID NO.3：HS3-S：5’-TCTAGAACCACATGCGATCTAAGGGATATTGGGG-3’
SEQ ID NO.4：反义HS3 Spe I：5’-CAGG ACTAGTGATCATTGAGCTCCGGCTCTAAC-3’
SEQ ID NO.5：HS4-S XbaI：5’-CTAG TCTAGACTGCAGACTCACTGTTCACCATG-3’
SEQ ID NO.6：反义HS4 Spe I：5’-GTGG ACTAGTAAGCTTGGAGTTAGGTGGGTAGG-3’
将这些片段按HS3b和HS4的顺序连接到3’E的3’端。3’E，HS3b和HS4串联，中间没插入任何Ig内含子序列。
通过基因重组技术，利用上述的各个片段，可以获得如下三种构建体：pvehc△3’E(12kb)，pvehc3’E(16kb)和pvehc3’EHS3b/4(19kb)。
2)转基因的结构特征
本发明获得的转基因构建体包含由小鼠VH186.2编码的V区，它是参与对4-羟基-3-硝基苯乙酰半抗原应答的显性VH(Bothwell，A.L.M.等，细胞，24，625(1981))。
将从A6重排的小鼠VH186.2-DFL16.1-JH2基因连接到人Cμ，这样便于区别编码的转基因和内源性小鼠H，A6是能制造针对4-羟基-3-硝基苯乙酰的单克隆抗体的杂交瘤(Taketani，M.等，Mol.Immunity，32，983(1995)：Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999))。
此外，因为转基因在B细胞表面的表达会改变B细胞的发育，所以从Cμ去除跨膜外显子能防止转基因在细胞表面的表达。转基因仅包含Cμ，而没有编码其它H链同种型的基因区。
所有这三种转基因构建体都包含来自小鼠J-Cμ内含子的VH启动子和Eμ/MAR，它们作为顺式作用元件，已用于CAT转基因的构建(Azuma，T.等，Int.Immunol.，5，121(1993))。因此，转基因结构的差异主要限制在3’侧翼区(图1)。
构建体之一pvehc△3’E，缺乏3’增强子区，受VH启动子和Eμ/MAR控制。另一个构建体pvehc3’E除了VH启动子和Eμ/MAR外，还包含3’增强子(Lieberson，R.等，EMBO.J.，14，6229(1995))。将含有3’增强子(3’E)的限制酶BamH I片段(4.0kb)用于基因构建。在pvehc3’E上添加HS3b和HS4产生一个称作pvehc3’EHS3b/4的构建体。
内源性IgH基因含有一个附加的顺式作用元件，叫HS3a(Matthias，P.和Baltimore，D.，Mol.Cell Biol.，13，1547(1993))，它和HS3b的核苷酸序列完全一样，但方向相反(Arulampalam，V.等，Immunol.Today，18，549(1997))。本发明的转基因构建体不含这个顺式作用元件。
实施例2
1)将IgH突变基因(Lundblad，A.等，Immunochemistry 9，535-544(1972))转染进J558L细胞以及制备抗体
为了评估这三个构建体的转录活性，将这些载体转染进小鼠浆细胞瘤细胞系J558L细胞中。将含有限制酶Not I识别位点的线形IgH基因构建体(10μg)进行电穿孔(Sahagaw，B.G.等，1986，J.Immunol.，137：1066-1074)，和质粒pSV2-gpt(1.6μg)(Mulligan，R.C.&Berg P.科学，209；1422-1427(1980))共转染进J558L细胞。特异的电穿孔条件如下所示。
设备：基因脉冲发生器(BIO-RAD laboratories)
条件：
缓冲液：PBS
细胞：0.5mL PBS中的J558L，浓度是2×107细胞/ml
线形DNA：IgH转基因(10μg)和pSV2-gpt(1.6μg)
反应条件：电容(960μF)，电压(350V)
将转染细胞在37℃下培养在存在CO2以及次黄嘌呤，黄嘌呤和霉酚酸(Sigma)的混合物中。对药物抗性IgH基因的转化子进行有限稀释，根据抗体的产量来选择克隆。具体而言，用ELISA来检测抗-NP嵌合抗体的产量(图2)。
为了定量分析抗体产量，将从每个转基因构建体中诱导而来的一些转化子克隆，用含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基(总体积：200μL；Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)在平底96孔的平板中培养12小时，细胞浓度为2×106细胞/mL。用含1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)将培养物上清稀释成不同浓度，利用包被有NP9-BSA的聚乙烯平板，通过ELISA进行分析。过氧化物酶(POD)标记的抗小鼠λ1链抗体(Southern Biotech)或抗人μ链抗体(ZYMED)可以用来检测结合的抗体。
结果如图2所示。
转基因构建体被设计来表达嵌合H链，嵌合H链含有小鼠抗-NP单克隆抗体的VH区和人Ig的C区，它们被期望用来和小鼠λ1链装配从而产生抗-NP的嵌合抗体。
所有构建体被有效地转染在J558L细胞中，并通过和内源性λ1链配对从而制造抗-NP的抗体。在这些构建体中，pvehc△3’E和其他构建体相比表现出很弱的产量。3’E的添加(pvehc3’E)导致抗体产量的显著增长，然而，进一步添加HS3b和HS4看起来对抗体产量没有影响。尽管涉及转录对各个转染DNA的拷贝数的依赖知之甚少，本发明者还是认为，抗体产量数反应了构建体的转录活性，这种转录活性在pvehc3’E和pvehc3’EHS3b/4之间没有显著差异。
实施例3
1)嵌合小鼠的制造
为了制造嵌合小鼠，本发明者采用至少两种独立的转染ES克隆用于对RAG-2-/-小鼠成纤维细胞进行显微注射。本发明者也使用至少两种嵌合小鼠/转基因构建体用于分析体细胞高变。用于本实验的转染的ES细胞系和嵌合小鼠如表1所示。
用Bio-Rad基因脉冲发生器将PGKneo的EcoR I片段(1.5kb，1μg)和三种线形IgH转基因构建体(30μg)以实施例2中同样的方式电穿孔进1×107的E14-1细胞(Kuhn，R等，科学，254，707(1991))。
然后用G418(150μg/mL，Gibco)选择转染细胞。选择的克隆通过如下方法筛选：用如SEQ ID No.7和8所示的两个引物进行PCR，这两个引物可以和位于VH17.2.25启动子和JH2中的DNA序列杂交；然后分别使用人Cμ基因作为探针进行Southern印迹。
SEQ ID NO.7：5’-GACTCAGGAGGACTCTAGTT-3’
SEQ ID NO.8：5’-GGTGTCCCTAGTCCTTCATG-3’
用95℃30sec，65℃30sec，和72℃1min，30个循环进行PCR扩增。整合的pvehc3’E的拷贝数通过Southern印迹计算为2-3。用来自pvehc3’E转染的ES细胞的DNA作为标准通过PCR分析，对pvehc△3’E和pvehc3’EHS3b/4的拷贝数进行估计。
2)用嵌合小鼠制备抗体
将含有IgH转基因的ES细胞克隆注射入RAG-2-/-的成纤维细胞(Takahashi，N.等，Nucleic Acids Res.，8，5983(1980))，并移植到ICR代养母鼠(8-12周大，CLEA Japan Inc.)的子宫中。用PE抗-CD3抗体或生物素抗-B220/SA-FITC将细胞染色后，含有源自嵌合小鼠ES细胞的B细胞和T细胞的免疫系统的互补性通过流式细胞仪检测。
将POD标记的绵羊抗小鼠μ链抗体用来检测结合的抗体。为了分析具人Cμ的抗体，用绵羊抗人IgM抗体(Southern Biotech)包被平板，并将POD标记的抗人IgM单克隆抗体(ZYMED)用作检测结合抗体。J558L转化子的培养物上清，人Waldenstrom IgM，和抗-NP IgM单克隆抗体B4-3用作对照抗体。
图1.使用的ES细胞和嵌合小鼠
    构建体 细胞克隆   拷贝数     嵌合小鼠
 Pvehc△3’E     3-89     ＜3     3-2
    3-88     ＜3     3-4
 Pvehc3’E     No.6     ＜3     1-1，2/3
    A-4     ＜3     A4-3
 Pvehc3’EHS3b/4     25-2-5     ＜3     2-1
    25-2-2     ＜3     2-3
和C57BL/6小鼠进行回交来检查转基因的生殖传递，从产生的小鼠尾巴中提取DNA，根据小鼠中是否含有转基因，从而分析嵌合小鼠的产生。
3)免疫和抗体产量
为了检查免疫系统是否和源自ES细胞的淋巴细胞发生重建，用ELISA检测嵌合小鼠A4-3，2-1和2-3的免疫前血清中的IgM数量。
结果如图3A所示。不管是何种转基因，来自这些小鼠的所有血清中的小鼠IgM检测数量是相似的，但比正常的BALB/c小鼠中的数量要小。
下一步，具不同NP值的NP34-鸡γ球蛋白(NP34-CGG)和NP-BSA用Azuma等人相同的方法(Azuma，T等，Molec.Immunol.，24，287(1987))制备。
将包括4-羟基-3-硝基苯乙酰鸡γ球蛋白(后文中简写成NP34-CGG)的CFA(弗氏完全佐剂：Difco，100μg/小鼠)施用给嵌合小鼠中，也可施用等量的IFA(弗氏不完全佐剂)进行再次免疫。在最终给药含NP34-CGG的PBS后三天，收集免疫小鼠的抗血清。然后把小鼠杀死，获得组织样品。
用包被有NP1-BSA或NP16-BSA的平板来检测抗-NP的抗体产量以及这些抗体的亲和力成熟。POD标记的绵羊抗-小鼠IgG(ZYMED)被用作检测这些抗体。
抗-NP的单克隆抗体F8用作不成熟抗体的对照，而C6则用作成熟单克隆抗体的对照(Takatani，M.等，Mol.Immunol.，32，983(1995)；Furukawa，K.等，Immunty，11，329(1999))。
结果如图3B所示。表达人Cμ的由转基因编码的抗体在用NP34-CGG免疫的小鼠的免疫前或免疫后抗血清中没有检测到。
生成抗-NP单克隆抗体(γ1λ1)的杂交瘤制备自用NP34-CGG免疫的pvehc3’EHS3b/4小鼠。没有一种分泌型抗体能表达人Cμ，然而，它们中的一些能在胞内合成具人Cμ的H链。
结果表明转基因能在嵌合小鼠的B细胞中转录和翻译。然而，分泌的H链产物水平比可检测的水平要低。
下一步，用ELISA检测嵌合小鼠中针对TD抗原NP34-CGG的抗体反应。结果如图3C所示。抗体值改变了，但所有小鼠会产生抗IgG抗体，这表明免疫系统对抗NP抗体生成有应答。
此外，这些抗体对NP1-BSA的结合比率涉及到对NP16-BSA的结合，其可以如检测亲和力成熟来加以检测。结果如图3D所示。
如图3D所示，对照的单克隆抗体F8没有表示出体细胞高变，它和NP-Cap的缔合常数(Ka)是2×105/M，比率是0.29。另一方面，Ka是2×107的成熟单克隆抗体C6的比率在1左右(Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999))。所有来自嵌合小鼠的血清表示出和C6相似的比率，因此，用NP34-CGG免疫后，所有嵌合小鼠中的抗-NP抗体的亲和力成熟向前发展的程度相似。
实施例4.VH基因的克隆和测序
尽管免疫系统在嵌合小鼠中得以重建，但获得足够的PNAhiIgG+B细胞还是十分困难的，它们作为源自单个嵌合小鼠的核心生发细胞是很流行。因此，用NP34-CGG免疫后，用FACS Vantage对预计可选择同种型转换记忆B细胞的脾脏IgM-B220+细胞，，以及XX通过流式细胞仪加以分选。
来自用NP34-CGG免疫的嵌合小鼠脾脏的单细胞悬浮液用0.83％的氯化铵处理诱导溶血。在一些实验中，T细胞也用抗-Thy1抗体(T24/40和HO13.4)处理诱导溶血，然后用兔补体处理。这些细胞用藻红素(PE)-标记的抗-CD45R/B220(细胞表面分子，pherMingen)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠IgM(ZYMED)进行染色。
腹膜细胞用生物素标记的抗-CD5/FITC标记的链霉抗生物素蛋白(pherMingen)和PE标记的抗-CD45R(B220)染色。
CD45R(B220)+IgM-，CD45R(B220)+IgM-，或CD5+CD45R(B220)+在荧光激活细胞分选仪Vantage上通过流式细胞术进行分级(Becton，Dickinson公司)。
此外，作为一个对照实验，染色和分选后，从胸腺中获得CD4+细胞和/或CD8+细胞。
根据制造商的说明书，利用TRIzol(RNA制备试剂，GIBCO BRL)从用上述流式细胞术分级的脾脏或腹膜细胞中制备总RNA。
用寡(dT)作为引物和Superscript II反转录酶(GIBCO BRL)从总RNA中制备cDNA。这些cDNA样品每个都用PCR进行扩增，分别利用SEQ ID No.9的VH186.2引物和SEQ ID No.10的人Cμ引物用于扩增转基因，而用SEQ ID No.9的VH186.2引物和SEQ ID No.11的小鼠Cγ1引物扩增内源性小鼠Ig基因。
SEQ ID NO.9：5’-CATGCTCTTCTTGGCAGCAAC-3’
SEQ ID NO.10：5’-GCAGCCAACGGCCACGCTGC-3’
SEQ ID NO.11：5’-GGCCGAATTCCATGGAGTTAGTTTGGG-3’
PCR反应在下列条件下进行：95℃1min，62℃1min，和72℃1min，30个循环。转基因和内源性小鼠IgH基因的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析，或使用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司)连接到pCR-2.1(Invitrogen公司)，以及用如SEQ.NO.12(-20，Takara Bio公司)所示的M13引物，如SEQ ID NO.13(Takara Bio公司)所示的M13反式引物和Hitachi DNA测序仪model 5500(Hitachi，Ltd.)进行测序。
如图4所示，包括转基因的抗体片段的表达得以鉴定。
2)在脾脏和腹膜B细胞中转基因的体细胞高变
将突变总数除序列确定的碱基总数便能计算出突变频率。结果如表2所示。
表2.嵌合小鼠脾脏IgM-B细胞V区序列的突变
  构建体     pvehc△3’E       pvehc3’E       pvehc3’EHS3b/4
  ES克隆     3-89     3-88     No.6     A4     25-2-5     25-2-2
  分析的序列数     30     18     51c     30     21     21
  观察到的突变数     16     11     42     25     161     132
  CDRa中的突变百分比(％)     56     36     38     75     57     55
  突变频率b(％)     0.15     0.17     0.23     0.23     2.14     1.76
aCDR中的突变百分比＝100×(CDR中点突变的总数)/(点突变的总数)
b突变频率＝100×(点突变的总数)/(碱基对的总数)
c分析了两个嵌合小鼠
为了分析转基因中的体细胞高变，使用了能和VH186.2或人Cμ杂交的引物。对通过RT-PCR制备的cDNA进行克隆和测序。结果如表3所示。在脾脏B细胞的转基因构建体中的体细胞高变的分布和频率如图5所示。
因为组合使用引物，因此转基因的特异性扩增只在嵌合小鼠的脾细胞中观察到，但在用NP34-CGG免疫的C57BL/6小鼠中观察不到。此外，还观察到所有序列Z在CDR3中都有相同的连接多样性，这是用于构建转基因的A6DNA的特征。
关于基因构建体pveh△3’E，由于体细胞高变导致的核苷酸改变在VH186.2-DFL16.1-JH2中观察到了，但频率比较低。突变频率估计是0.17％(表2)。
尽管和pvehc△3’E相比，基因构建体pvehc3’E的高变频率有轻微上升，但仍表现出和pvehc△3’E基本相似的高变分布(表2)。
就pvehc3’EHS3b/4而言，它是把HS3b/4进一步加到本发明基因构建体pvehc3’E上，如在VH186.2-DFL16.1-JH2基因中的结果所示，体细胞高变的频率显著增长(图5)。尽管所有测序了的PCR克隆是随机挑选的，但它们含有的核苷酸是变化的。这些核苷酸变化在CDR2(高可变区2)和CDR3区附近发现的频率是很高的(图5和表2)。
这些数据从两种嵌合小鼠中获得，这两种嵌合小鼠对应图5所示的每种转基因构建体，并且这些数据相互之间一致性良好。pvehc3’EHS3b/4中高的高变频率是很明显的。然而，来自同样嵌合小鼠的腹膜B1细胞中突变明显缺乏(图5)。
下面表3所示的是转基因中鉴定的碱基取代特征。
表3.IgH基因中的突变
  碱基取代                   构建体
pvehc△3’E     Pvehc3’E  pvehc3’EHS3b/4
    转换
    A→G     5     12     25
    G→A     3     13     47
    C→T     1     5     8
    T→C     3     5     34
    总数     12     35     114
    碱基易位
    C→A     2     0     8
    G→T     1     2     20
    A→C     2     2     32
    A→T     0     5     12
    G→C     4     7     43
    C→G     1     4     11
    T→A     4     7     26
    T→G     1     3     27
    总数     15     32     179
从IgH转基因之间的比较来看，很明显碱基转换和碱基易位频率几乎相同。
此外，在称作RGYW基元(A/G，G，C/T，A/T)的基因座序列中(Kabat，E.A.等，US National Institutes of Health，Bethesda，M.D.，USA，p1394(1991)：Rogozin，I.B.等，Biochim.Biophys.Acta.，1171，11(1992))，分析了在VH186.2转基因中出现的体细胞高变。种系基因VH186.2(294bp)含有RGYW/WRCY基元(93bp)，对应于总碱基的32％，而这个基元中出现的体细胞高变的频率是34％，不显著高于其他VH区。
工业实用性
在上述的实施例中，本发明者采用了一个RAG-2-/-成纤维细胞系统制备嵌合小鼠，它携带不同顺式元件的IgH转基因。
本发明的制造方法优于传统的转基因技术，当ES细胞用低拷贝数的转基因转化时，它的优点更甚。事实上，转化子ES细胞中转基因的拷贝数通过Southern印迹和PCR计算，绝大部分情况下是3或更少(表1)。
在pvehc△3’E中只发现了少数的高变，而该发现得以证实，因为顺式作用元件，VH启动子和Eμ/MAR不足以诱导高频率的高变。在pvehc△3’E(pvehc3’E)添加3’增强子片段(4kb)导致高变的频率上升约30％。
在本发明中，通过将HS3b和HS4导入pvehc3’E的3’增强子的3’端，发现诱导的高变的表达频率大大增强，这表明构建体pvehc3’EHS3b/4含有体细胞高变必需的所有元件。本发明者进行的实验阐明，造成高频率高变的基元位于长度为2.6kb的HS3b/4区域。
因此有可能提供一个重组表达载体用于诱导所需转基因的随机突变。此外，也可能提供一种制造高频随机突变体的方法，它通过在动物细胞中表达重组表达载体来获得。另外，也可能提供一种方法用于表达随机突变体，或提供一种用于制造随机突变体的试剂盒，所述试剂盒含有重组表达载体和动物细胞。
                        序列表
<110>大塚制药株式会社等(OTSUKA PHARMACEUTICAL CO.，LTD.et al)
<120>突变体的制造方法(PRODUCTION PROCESS FOR MUTANT)
<130>SCT033859-47
<140>
<141>
<150>2001-191884
<151>2001-06-25
<160>14
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1182
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
tctagaacca catgcgatct aagggatatt ggggcaatac atgtgtagtg agatacctgc 60
ctttctgatg agccctgtct ggcagggata aactctcctt tctgcatctc cagggcctcg 120
atgagctgac tatctagtcc tctgccagaa tagctgtgtg gccttgggtg atgctggctg 180
acctcaggct ggtctgggtt gtctctggct gacacccctt gactctggat gaccctggga 240
agaccatact taatcttaat tggacttgtt ctcattggga gagaacatgg cctcactaag 300
gcacgagtgt ggatggcctt gggtgatggg ggttggggcc tcctcagccc ctggcaggct 360
tccctggctg ccacccctca tccaggtccc aggcccacct ggcctggtcc agtgtggtgt 420
gattctcaga acagtagctg tggtttgggg cacctgtgct gagaaaggct caggatgact 480
cagctgccct cagctcagag ctgctttgaa tgtttcagca ggtgatagac aacagagact 540
tcagaagaga gaaaaacaag ttgctaatgt gaacatccct gccctacccc cacacctgta 600
ctgcaaatct ccccacactg ttgaccccag atagagatcc caggacagca ggtgatagac 660
aaaggaggct ccagaggaga gaaaaatagt atctacaagc atgactacct ctgccctgcc 720
ccacacctgc cctgcaaagc tccccaggat gctgacccca catctgtaga ccccaggcca 780
gaggctccat ctcccagggc ctgggcttgc tttgtctcca ttctgcgcct ctgagcctgg 840
gcaaggccaa tgagcgaaag gggtcactgt cccagttgca gcccagtgtg tgacagtgtt 900
gtggggattc tggaatcttc tgcaggaatc ccctgtaggg atcctcctaa tgtgaatgag 960
gcttggaata gcaaagggac gtcttgtaaa ataccactga ttccttgggc ctcagacaat 1020
ggatgtgaga tgaggaccaa ggtccagggc cagtgttggt aagcagaatt tggggctaga 1080
gttcaggctt agaagtcaat gatgagggcc agggcccaat gactaggtca gggcccattg 1140
atcagtacag gacccagttg ttagagccgg agctcaatga tc                    1182
<210>2
<211>1381
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
ctgcagactc actgttcacc atgaacccag ctagtcagat tcatatgtga aactcatatc 60
agcctctgca cacacataca cacacataca cacatattac acccatgcac acacatgtac 120
acatacatac acatgtacac atacatgtgt acacacacat atagagaagg cattggtggg 180
gaaaacatta ggccatggct acagtacagg gcacaaggat ggtggtacag aatgaggtca 240
ggctgggtca gcataacaag aacacttgga caaagtgagg gtagtgtgtg tgtgtgtgtg 300
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cacgttgaaa gtcttcagta gactggtatc actagccctg 360
atatgggcaa cacagcaagc ctgggtcaca ctcaagctga gtatcagggt agccagggcc 420
ttctaaccaa gggtagatgc agcctgtgtt ccgtttactg accagtgaga agccatgagc 480
tgaaceagac cagaagaccc ttactgttcc caccccaccc ccacccagtt tagtctcagc 540
aagaccctgt actgtgggcc acagctctcc tctacactcc acctgtagca caaacactat 600
ttgcaaacat ttctaaaaag tagtagaaca ggaaccacag agcagagggg gggactggcg 660
tggaaagccc cattcaccca tgggactgaa actcagggaa ccagaaccgt aaggagattt 720
gcatggtgct gggggaggtt ggccctggat cagtgagccc agagagttac tggtttctca 780
cttccatcat gtcaacctcc tcaaccccca aaaatggcca ggcctaggct atggatgagt 840
ttcaatgacc aggccctaag gacgagtcac agaggacttc ctggtgggct caggcagcag 900
acctgctcag atggattgca gagccagagg gagccatggc caggaaggcc agacgcctta 960
ggggtgtgct gtctctgcat cctttgccct ctctgctcct cacagtccat ctgccatctc 1020
acaatccctg ctgtcgctct ggggcccaga cctggccagt ctgggtacct gtggaataca 1080
cccaaagaag caatccccag cctcaggatc cacaactact tcccctacag acatgagtga 1140
tctcagccca catgtctggg ggccacagaa gcccctaaga ccctactctg ctaataggcc 1200
ctcctcccac cacgcaagac aatacacagg caaggtgatg tggatgagag gaccaaccca 1260
ggtacctgtg tgtgagatac accctgtggg tatcctggcc agaatctggt gaccaaccca 1320
acctgtgtcc ctagaggagt actccgtgcc tgcactcacc tacccaccta actccaagct 1380
t                                                                 1381
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>3
 tctagaacca catgcgatct aagggatatt gggg                            34
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>4
caggactagt gatcattgag ctccggctct aac                          33
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>5
ctagtctaga ctgcagactc actgttcacc atg                          33
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>6
gtggactagt aagcttggag ttaggtgggt agg                          33
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>7
gactcaggag gactctagtt                                     20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>8
ggtgtcccta gtccttcatg                                     20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>9
catgctcttc ttggcagcaa c                                   21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>10
gcagccaacg gccacgctgc                                     20
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：引物
<400>11
ggccgaattc catggagtta gtttggg                                     27
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：M13正向引物
<400>12
ctctacagac acgggcc                                                17
<210>13
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：M13反向引物
<400>13
aaaaagcttg gtgtccctag tccttcatg                                   29
<210>14
<211>546
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：启动子
<400>14
ttcttaaata aaatgctgaa tgaacatttg aatacacata ttgctgagac atgttctctt 60
gctgtcattt gtgtaatatt ttagtatgca accttttgga aaggccatta ttatttaaat 120
atatatgaga gaagattgct aactctcata aatgtattgg tttttttttt aaatttccag 180
taagcgttat cctcattgct actaccacca atcaattttt tcactaagac aagtgagtgt 240
ctcaggttag gattctattt taagattgag atattaggct ttgatactac atctaaatgg 300
tctgtacatg tctcgaagaa agttcttcag acagagttag gacttggatc caggagttag 360
gacttggact gactcaggag gactctagtt tcttcttctc cagctggaat gtccttatgt 420
aagaaaagcc ttgcctcatg agtatgcaaa tcatgtgcga ctgtgatgat taatataggg 480
atatccacac caaacatcat atgagcccta tcttctctac agacactgaa tctcaaggtc 540
cttaca                                                            546

Claims (20)

1.一种外源基因随机突变体的制造方法，其中将至少含有下列(a)-(d)DNA序列的DNA构建体导入动物细胞，以及在所述动物细胞中制造外源基因突变体：
(a)启动子；
(b)外源基因；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中(d)增强子进一步包括HS1和HS2。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中(d)增强子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO：1或2中的一段DNA序列。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的制造方法，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列来自免疫球蛋白DNA序列。
5.根据权利要求2所述的制造方法，其中(d)增强子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的制造方法，其中
(a)启动子是VH启动子；和
(d)增强子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO：1和2中的DNA序列。
7.根据权利要求5或6所述的制造方法，其中所述的DNA构建体是pvehc3’EHS3b/4。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的制造方法，其中动物细胞是B细胞系动物细胞。
9.根据权利要求8所述的制造方法，其中B细胞系动物细胞源自前B淋巴细胞系细胞。
10.一种通过表达外源基因突变体而获得突变基因表达产物的方法，所述外源基因突变体是由权利要求1到9中任一项所述的制造方法获得的。
11.一种用于制造外源基因突变体的DNA构建体，其至少包括：
(a)启动子；
(b)外源基因；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子。
12.根据权利要求11所述的DNA构建体，其中(d)增强子进一步包括HS1和HS2。
13.根据权利要求11或12所述的DNA构建体，其中(d)增强子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO：1或2中的一段DNA序列。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的DNA构建体，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列来自免疫球蛋白DNA序列。
15.根据权利要求11到14中任一项所述的DNA构建体，其中(d)增强子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
16.根据权利要求11到15中任一项所述的DNA构建体，其中
(a)启动子是VH启动子；和
(d)增强子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO：1和2中的DNA序列。
17.根据权利要求11或12所述的DNA构建体，其中所述的DNA构建体是pvehc3’EHS3b/4。
18.一种用于外源基因突变体的制造方法或产生突变基因的表达产物的试剂盒，为了实现对制造外源基因突变体的突变DNA序列的表达，其包括一种载体，所述载体含有：
(a)启动子；
(b)外源基因插入位点；
(c)内含子增强子；以及
(d)在DNase I敏感区含HS3b和/或HS4的增强子。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中(d)增强子进一步包括HS1和HS2。
20.含有SEQ ID NO：14序列的VH17.2.25启动子。
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