CN1778918A - 抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法。抑制Stat3基因表达的siRNA，该siRNA表达质粒包括：pBS/U6载体；编码特异性抑制Stat3基因表达的siRNA的DNA片段。本发明利用DNA介导的RNA干扰技术构建Stat3基因特异性的RNAi，用于观察细胞内Stat3被特异性抑制的情况下信号通路的变化，从而为在细胞系中研究Stat3的功能提供了有效的工具，在治疗与研究与Stat3相关的肿瘤领域中有广阔的应用前景。

Description

抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种抑制Stat3(signal transducer andantivator of transcription信号转导及转录活化因子)基因表达的siRNA和及其制备方法。

背景技术

RNAi(RNA interference)技术是近几年发展起来的一种抑制基因表达的新方法，该方法是将功能未知基因编码区(外显子)或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达，这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干扰，使目的基因沉默。这一现象已在植物、真菌(fungi)、锥虫(trypanosome)、涡虫(planaria)、囊虫(hydra)、果蝇(drosoph ila)、线虫(canenorhabdit is elegans)、斑马鱼(zeb rafish)、老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中得以发现。

RNAi的外源性或内源性的dsRNA在细胞内与一种RNA酶III(RNAase III核酸内切酶)--Dicer结合，随即被切割成21～23nt的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA(double-stranded RNA)，是RNAi的起始诱导物，即siRNA(small interference RNA)。siRNA与Dicer形成RNA诱导沉默复合物(RNAinduces silencing comple，RISC)。siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RICS结合mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，特异性地抑制靶基因的表达。新产生的dsRNA片段可再次形成RISC，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。因此，每个细胞只需要几个siRNA分子就能够引起强烈的RNAi效应。此外，siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRp)的作用下进行大量扩增，并转运出细胞，使RNAi扩散到整个机体并可以传代。

目前RNAi技术已经广泛用于基因功能、信号转导通路方法以及肿瘤基因治疗的研究领域。

RNAi识别可以精确到一个核苷酸，对由野生型点突变形成的癌基因如ras、p53等，能够产生准确有效的封闭效果，野生型基因则不受影响，可以用于阻断某些突变基因的表达，或者由蛋白过量表达引起的恶变。RNAi在肿瘤基因治疗上与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统的基因治疗方法相比，具有特异、高效、毒性小的特点，因此可用来对一些肿瘤进行治疗。RNAi技术用于抑制肿瘤生长因子的表达，可以抑制动物模型的肿瘤生长，并已经应用于快速鉴别新的肿瘤靶目标。由于肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果，RNAi技术能够同时抑制多个不同基因，而且抑制效果互不干扰。

RNAi对人类宫颈癌细胞Hela、非小细胞肺H1299、头颈部鳞状细胞癌C33、骨肉瘤U22OS、乳腺癌MCF27等细胞系实验中肿瘤相关基因的抑制作用也很明显。

siRNA的序列专一性非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

Stat(signal transducer and antivators of transcription)信号转导及转录活化因子)是存在于细胞质中的一类潜在的信号转导和转录激活因子。其蛋白家族有7个成员，Stat1，2，3，4，5a，5b，和6。其中的Stat3在细胞的增殖、分化、存活以及胚胎发育中都有非常重要的作用。Stat3信号通道的过度激活破坏了正常细胞的增殖、生存活动，能够诱导出某些转化细胞的特性；过表达的Stat3调节了细胞周期的控制和凋亡活动，表明Stat3的激活可能与致癌作用有关，阻断Stat3信号通路有望能够预防和治疗人类肿瘤。因此利用上述的RNAi技术来阻断Stat3信号通路可以预防和治疗人类肿瘤。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制Stat3基因表达的siRNA。它利用DNA介导的RNA干扰技术构建Stat3基因特异性的RNAi，用于观察细胞内Stat3被特异性抑制的情况下表达及信号通路的变化，为从细胞系研究Stat3的功能提供了有效的工具，在研究和治疗与Stat3相关的肿瘤领域有广阔的应用前景。

本发明的另一目的是提供一种抑制Stat3基因表达的siRNA的制备方法。

本发明的上述目的可以通过如下措施实现：

设计抑制Stat3基因表达的双链siRNA片段。Stat3 RNAi设计序列及其靶向NCBI网站Genbank数据库小鼠Stat3基因(序列号为AY299489)位置分别为：

第一条(作用部位157-174)：

CTTTTTT＜3’

第二条(作用部位1226-1243)：

CTTTTTT＜3’

第三条(作用部位1936-1953)：

TTTTTT＜3’

第四条(作用部位2334-2351)：

CTTTTTT＜3’

本发明所述siRNA可以通过体外化学合成并在体内表达。

其中U6启动子用于启动下游DNA的转录，其转录起始位点是一个G(鸟嘌呤)，转录中止子为连续5-6个T(胸腺嘧啶)。编码区DNA可以转录出具有特异序列的mRNA，该mRNA并不编码可以翻译的氨基酸，而是在细胞内自动形成一个带有环的发卡式RNA，该发卡式RNA可以介导与其具有相同序列的mRNA的降解。

本发明含III型RNA聚合酶真核启动子的载体为pBS/U6载体，编码特异性抑制Stat3基因表达的siRNA的DNA片段。

本发明所述siRNA表达质粒的分子类型为环状DNA，大小为3303bp。

本发明人致力与于抗肿瘤和基因工程研究，用多年积累的知识和经验开展RNAi抗病毒治疗研究。通过大量的研究和实验证明，利用DNA介导的RNA干扰技术构建Stat3基因特异性的RNAi，可以用于观察细胞内Stat3被特异性抑制的情况下表达及信号通路的变化，为本发明为从细胞系研究Stat3的功能提供了有效的工具，因此本发明被列为国家自然基金项目和重庆市人口与计划生育委员会2004年第三批科研基金项目。

本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)阻抑Stat3基因的表达。通过外源导入与内源基因同源的dsRNA(double-stranded RNA-即双链RNA)来介导目标mRNA的降解，从而导致生物体内特异基因的沉默。RNA干扰通过关闭特异基因的表达在基因表达调控、缺陷识别及疾病基因的治疗等方面显出极为重要的应用价值。

本发明针对胚胎时期Stat3对细胞生长、存活和分化神经发育情况，针对小鼠Stat3的RNA干扰质粒可用于小鼠胚胎，设计出抑制Stat3基因表达的重组质粒pBS/U6-Stat3-RNAi。用siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RICS结合mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，特异性地抑制靶基因的表达。新产生的dsRNA片段可再次形成RISC，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应，使Stat3的RNA干扰的效果明显，几乎可以完全抑制掉外源性的Stat3。

本发明使用最新发展起来的RNA干扰技术，直接从转录水平上降低Stat3基因mRNA的积累，并直接导致Stat3蛋白量积累的减少进而抑制Stat3信号通路。本发明相对用Stat3反义寡核苷酸，Stat3显性负性蛋白Stat3β，Stat3上游特异性受体的拮抗剂以及受体中和抗体，或者天然存在的诸如SOCS和PIAS等蛋白抑制Stat3信号传导通路治疗肿瘤的技术和方法，操作更加方便，效果更加突出。

附图说明

图1为Stat3基因干扰质粒酶切鉴定电泳图(阳性结果与阴性对照)；

图2为小干扰RNA抑制Stat3蛋白在293T细胞中的表达；

图3为RT-PCR检测4种Stat3干扰质粒抑制Stat3在293T细胞中mRNA的表达；

图4为免疫染色实验小干扰RNA抑制Stat3蛋白在293T细胞中表达的剂量效应；

图5为免疫印迹实验检测Stat3干扰质粒抑制Stat3在293T细胞中蛋白表达的剂量效应；

图6为RT-PCR检测Stat3干扰质粒抑制Stat3在293T细胞中mRNA表达的剂量效应；

图7为siRNA茎环结构简单示意图；

图8为pBS/U6-Stat3-RNAi(2334)质粒图谱；

具体实施方式

首先合成siRNA干扰序列，再进行RNAi载体的处理，将处理好的载体与处理好的dsRNA连接，然后转化，挑选阳性克隆，提质粒，最后鉴定Stat3基因干扰质粒。

在构建的干扰质粒的阳性克隆的筛选上我们采用方便可行的双酶切的阴性鉴定法。而对此质粒有效性的鉴定我们分别采用蛋白检测水平的免疫印记实验、mRNA检测水平的半定量RT-PCR、镜下结果直观的免疫染色方法，并且加入了剂量效应的比较。从而清楚地看出构建质粒对Stat3基因的抑制效果。

其具体方法如下：

一.合成siRNA干扰序列：

合成基本原则为：

1.从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AGN18TT”(其中N是任意碱基)结构的长度为22bp的序列；

A)避免在起始密码子或无义区域选择目的序列；

B)序列的GC含量为30％-60％；

C)由于5’和3’端的非编码区(UTRs)有丰富的调控蛋白结构区域，这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNA核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果，因此设计时不针对5’和3’端的非编码区(UTRs)；

D)将挑选的序列和相应的基因组数据库如人，小鼠，大鼠等进行比较，排除与其它编码序列/EST同源的序列，例如使用BLAST；

F)选出合适的目标序列进行合成以找到最有效的siRNA序列；

G)在正义链和反义链序列上不能连续出现3个或以上的T或A，否则可能导致siRNA转录的提前终止。

H)干扰序列末端核苷酸最好是C或T。

I)干扰序列尽量避免在目的基因的首末端。

2.克隆到siRNA表达载体中的DNA包括两个短的反向重复序列，中间由环序列分隔，组成发夹结构，由polIII启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。

3.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点(本实验选的是ApaI和EcoRI)。

4.在启动子下游的酶切位点下方紧连着一个C，使插入片断和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。siRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果不以G开头，必须在紧连正义链的上游加上一个G。

5.siRNA插入片段中的环结构应当靠近寡核苷酸的中央。环的大小和核苷酸序列可以不同，但在其内包含一个独特的限制性酶切位点则利于检测带有siRNA插入片段的克隆。在比较了众多不同长度和序列的环后发现5’TTCAAGAGA3’序列最为有效，因此我们采用这一序列作为环结构序列。

干扰序列确定后将得到的连接干扰序列正序片段和反序片断的连接子，并且为了及时中止干扰序列的转录，在干扰序列末端加上polyT作为中止子，利用pBS/U6多克隆位点中可以使用的内切酶，选择了ApaI和EcoRI作为插入位点，在寡核苷酸序列末端分别加上适当的与这两种内切酶匹配的碱基。

根据以上原则，按GenBank中小鼠的Stat3全长序列，选择了四条干扰序列。

针对Stat3设计的四对体内表达siRNA(短发卡RNA)的寡核苷酸序列为：157位点：

正义链

TTTTG＜3’；

反义链

GGCATGTGA＜3’；

1226位点：

正义链

TTTTG＜3’；

反义链

GCTTGAACT＜3’；

1936位点：

正义链

TTTG＜3’；

反义链

TTCAGCTG＜3’；

2334位点：

正义链

TTTTG＜3’；

反义链

CTGCAGCTT＜3’；

方框中序列为环结构序列。

干扰序列的处理：

4条干扰序列由上海生工合成，均为2OD量(2管，1OD/管，1OD＝33μg)，将合成好的每条寡核苷酸sense和antisense均配成终浓度为250umol/L的溶液，然后将正义链和反义链各取100μl按1∶1比例两两混合均匀，置于盛有水的烧杯中煮沸10分钟，然后于室温自然冷却，使寡核苷酸链退火，便可形成相应的双链DNA。即得到pBS/U6载体中的插入片断siRNA。

操作时可直接将siRNA片段加入酶联反应体系中。这种结构可以在细胞中产生siRNA，其体内表达的siRNA如图7所示。

二.RNAi载体的处理

因为U6启动子驱动的目的基因必须以鸟嘌呤开头，而ApaI内切酶消化后产物3’末端恰好剩余一个鸟嘌呤，只需将互补链的5’粘末端切除，然后通过平端连接插入目标基因的干扰序列即可构建目标基因的干扰质粒，因此所用的pBS/U6载体是以pBlueScript为基础插入U6启动子和适当的多克隆位点构建而成的。所使用的pBS/U6载体为Sui G et al. A DNA vector-based RNAi technology tosuppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：5515-5520.中记载的载体。

RNAi载体的处理过程如下：

1、取pBS/U6载体2μg，用ApaI内切酶室温消化过夜，确定酶切完全后，再切Klenow酶。酶切体系如下：

$\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{pBS}/U6& 2\mathrm{ug}\\ \mathrm{ApaI}& 1\mathrm{\μl}\\ \mathrm{ApaI\; buffer}(10\×)& 2\mathrm{\μl}\\ \mathrm{ddH}2O& 15\mathrm{\μl}\end{array}\right.$

                                合20μl

2、经DNA回收后，取适量ApaI酶切处理后pBS/U6，组建下面Klenow酶切体系：

$\left\{\begin{array}{cc}\mathrm{Digested\; pBS}/U6& 17\mathrm{\μl}\\ \mathrm{Klenow}\left(L\arg \mathrm{e\; fragment}\right)& 0.5\mathrm{\μl}\\ \mathrm{Klenow\; buffer}(10\×)& 2\mathrm{\μl}\\ \mathrm{dNTP}\left(10\mathrm{mmol}\right)& 0.066\mathrm{\μl}\end{array}\right.$

                                          合20μl

室温消化30分钟，确定酶切完全即可，将反应体系置于75摄氏度水浴中终止反应，然后将热激后的反应体系放在冰上退火。

3、直接进行溶液体系DNA回收或胶回收

溶液回收用的是NucleoTrap Gel Extraction Kit(从BD Biosciences购买)，按照厂家提供的实验方法回收DNA。

4、将回收后DNA片段直接进行下游选取的内切酶进行酶切，本实验选择EcoRI酶，确定酶切完全即可，酶切体系为：

37摄氏度水浴，2小时以上

5、酶切产物再经过DNA电泳回收纯化

酶切完后，先取少量(如2μl)稀释后跑DNA电泳，以判断酶切是否完全。如还不完全则可延长酶切时间或增加酶量，如完全即可行下步。将酶切体系全部跑1％DNA胶，110V，20-30分钟即可。紫外灯下看条带。凝胶成像仪中观察条带大小是否正确，酶切完全与否。然后用刀切下DNA集中那块。预先称量一干净EP管，再称量加入切下的凝胶后重量，得到DNA胶的重量。

接着按照通常的实验方法回收凝胶中的DNA。

至此pBS/U6载体处理完毕。

三.将处理好的pBS/U6载体与处理好的dsDNA连接

处理后的pBS/U6载体与dsDNA连接的原则∶载体与dsDNA质量比为1∶20到1∶40。

使用Takara Biotech DNA Ligation Kit Ver.2试剂盒(从Takara公司购买).进行快速连接30分钟以上，使连接充分。

可16摄氏度过夜放置。

四.转化，挑选阳性克隆，提质粒：

将放置过夜连接的反应液10μl用通常的方法进行全部转化。完成后将涂好的平板置于37摄氏度孵箱内16-20小时。平板应先正置，待菌液干后再倒置平板。16-20小时后观察平板，见有菌落生长，由于是连接产物转化，所以菌落不如质粒转化生产的多。

挑单克隆，摇菌，37摄氏度，振摇，9-12小时，取出LB管，抽提质粒：使用北京博大泰克生物基因技术公司的质粒小样快速提取试剂盒，按照厂家提供的实验方法提取质粒，其质粒的质粒图谱见图8。(以第四个序列构建而成的质粒为例)

五.Stat3基因干扰质粒的鉴定

在构建的干扰质粒的阳性克隆的筛选上我们采用的是双酶切的阴性鉴定法。在干扰序列插入时选取的内切酶是ApaI和EcoRI，序列插入后将取代多克隆位点中ApaI和EcoRI之间的内切酶识别位点，分别是XhoI，SalI，HindIII和EcoRV。根据pBS/U6质粒图谱可知，在U6启动子前面有三个内切酶识别位点，分别是KpnI，XbaI和BamHI。所以任意选取一个U6启动子前面的内切酶和其后可以被插入序列取代的内切酶进行双酶切，干扰载体都将被单酶切，得到线性化干扰载体，而如果选用干扰序列不能取代的内切酶和启动子前面的内切酶进行双酶切，则应能切出连同U6启动子和干扰序列一起的一个片断，大小应比U6启动子略大。若没有干扰序列插入，则酶切结果应分别出现约300bp的U6启动子和约3kb左右的pBlueScript骨架。

用了KpnI和EcoRV及KpnI和XhoI。鉴定结果如图1所示。经过重复筛选，我们得到了4个阳性的干扰质粒。图1中1-marker；2，3-pBS/U6空载体经双酶切结果(作为阴性对照)；4，5-质粒pBS/U6-Stat3-RNAi经双酶切的结果(阳性结果)。其中第2，4两道为KpnI和EcoRV双酶切，第3，5道为KpnI和XhoI双酶切。在干扰序列插入时选取的内切酶是ApaI和EcoRI，序列插入后将取代多克隆位点中ApaI和EcoRI之间的内切酶识别位点，分别是XhoI，SalI，HindIII和EcoRV。根据pBS/U6质粒图谱可知，在U6启动子前面有三个内切酶识别位点，分别是KpnI，XbaI和BamHI。所以任意选取一个U6启动子前面的内切酶和其后可以被插入序列取代的内切酶进行双酶切，干扰载体都将被单酶切，得到线性化干扰载体，而如果选用干扰序列不能取代的内切酶和启动子前面的内切酶进行双酶切，则应能切出连同U6启动子和干扰序列一起的一个片断，大小应比U6启动子略大。若没有干扰序列插入，则酶切结果应分别出现约300bp的U6启动子和约3kb左右的pBlueScript骨架。由此我们选用KpnI和EcoRV及KpnI和XhoI来鉴定干扰质粒的阳性克隆。

pBS/U6与insert成功连接后使EcoRV酶切位点消失，故KpnI和EcoRV双酶切不能得到大小2条片段，而pBS/U6有EcoRV位点故双酶切后可得到大小2条带。XhoI酶切位点仍然存在，用KpnI和XhoI双酶切pBS/U6可得约3kb大片段与350kbU6启动子小片段。insert成功连接后使EcoRV酶切位点消失，故KpnI和EcoRV双酶切不能得到大小2条片段，而pBS/U6有EcoRV位点故双酶切后可得到大小2条带。因此insert成功地克隆进pBS/U6载体得到了pBS/U6-STAT3-siRNA。

将构建好的质粒转化DH5α菌株，用质粒小量提取试剂盒(购自QIAGEN公司)提取，可不用再纯化。此质粒可直接用于转染等实验。

六.pBS/U6-Stat3-RNAi质粒的有效性的鉴定：

将构建的质粒转染了人胚肾上皮细胞及小鼠黑色素瘤细胞，进行实验。实验部分，包括免疫印记实验，免疫染色实验，RT-PCR实验等。

1、pBS/U6-Stat3-RNAi特异性地抑制细胞内小鼠Stat3基因蛋白的表达

将mStat3-Flag表达质粒和4种pBS/U6-Stat3-RNAi质粒共同转染293T细胞，通过免疫印迹分析Sat3在293T细胞中的表达情况，以研究构建的干扰质粒对小鼠Stat3表达的影响。参见图2。图2中1-Wild Type 293T；2-pBS/U6；3，4，5，6-依次为pBS/U6-Stat3-RNAi-I、II、III、IV。共转染了干扰质粒pBS/U6-Stat3-RNAi后的细胞内Stat3蛋白表达量有不同程度地降低，将上排lane3、4、5、6与2比较，说明pBS/U6-Stat3-RNAi能不同程度地抑制细胞内Stat3基因的表达进而使蛋白合成量下降；其中靶向2334-2351位点的干扰质粒效果最好，几乎把小鼠Stat3的表达降到了最低水平(上排lane6与lane1比较)，因为293T细胞中含有内源性的人源Stat3，而pBS/U6-Stat3-RNAi干扰质粒是小鼠Stat3序列特异的，不能干扰人源Stat3的表达，因此靶向2334-2351位点的干扰质粒几乎把小鼠Stat3的表达全部抑制住了。同时GFP质粒共同转染后，可以看到pBS/U6-Stat3-RNAi只抑制Stat3的表达，对EGFP蛋白的表达没有任何影响(下排lane2、3、4、5、6相互比较)，这显示了Stat3干扰质粒只特异性的抑制Stat3蛋白的表达而对其它基因的表达没有任何影响，说明DNA介导的RNAi具有高度的专一性。中排β-actin的表达量显示了我们每道的上样量基本是一致的。

2、采用RT-PCR的技术半定量地检测了小鼠Stat3基因在293T细胞中mRNA的水平，以进一步明确共转染干扰质粒后小鼠Stat3在293T细胞中蛋白表达减少的原因。在转染质粒36小时后，收取各组的293T细胞，提取细胞总RNA，以此为模板，采用小鼠Stat3基因特异性引物进行了PCR扩增，同时作为细胞总RNA取样量的对照，平行的进行了β-actin基因的扩增。参见图3。图3中M-marker；Stat3组1-Wild Type 293T；2-pBS/U6；3，4，5，6-依次为pBS/U6-Stat3-RNAi-I，II，III，IV；β-actin组-每道上样量一致。共转染了干扰质粒的小鼠Stat3基因在293T细胞中mRNA的表达量明显比共转染了空载体质粒的实验组降低了(lane3、4、5、6与2比较)，尤其靶向2334-2351位点的干扰质粒效果最好，这与免疫印记实验的结果是一致的；另外，尽管第一道所用的野生型293T细胞总RNA模板中有人源Stat3基因的存在，但由于所设计的引物是小鼠Stat3基因特异性的，所以也不能扩增出任何条带来。同样的，下排β-actin条带显示RT-PCR扩增时的总RNA的取样量是基本一致的。

3、pBS/U6-Stat3-RNAi抑制细胞内Stat3基因表达的剂量效应

(1)免疫染色(Immunostainning)可以更直观的观察pBS/U6-Stat3-RNAi对Stat3基因表达的抑制作用。选择效果最好的靶向2334-2351位点的干扰质粒进一步检测对小鼠Stat3基因在293T细胞中的抑制作用。同时转染了不同量的干扰质粒观察这种抑制作用是否具有剂量效应。参见图4。图4中左边一列(a，d，g，j，m，p)显示了共转染的GFP的表达；中间一列(b，e，h，k，n，q)显示了免疫染色Stat3基因表达的结果；右边一列(c，f，i，l，o，r)是左边列和中间列Merge的结果。黄光表示了GFP和Stat3共同表达的情况。转染Stat3干扰质粒与转染空载体pBS/U6以及GFP特异性干扰质粒的细胞相比，Stat3蛋白的表达显著的降低(图4中h与b，e相比)，而且随着干扰质粒转染量的增加，Stat3的表达越来越低(从图4-h到q)，而GFP的表达几乎与对照组是相等的(图4-g、j、m、p与a相比)。同时，GFP干扰质粒也能高效特异的抑制GFP基因的表达(图4-d与a相比)，而对Stat3蛋白没有没有任何影响(图4-e与b相比)。说明靶向小鼠Stat3的干扰质粒可以特异性的抑制小鼠Stat3的表达，而且呈现明显的剂量效应。免疫染色结果直观显示了所构建的pBS/U6-Stat3-RNAi能够在细胞水平高效且特异性地抑制Stat3蛋白的表达。

(2)免疫印迹实验检测不同剂量的干扰质粒对小鼠Stat3表达的影响。参见图5。图5中1-GFPi；2-pBS/U6；3，4，5，6-pBS/U6-Stat3-RNAi-IV的dose效应同免疫染色的结果相一致，随着共转染干扰质粒的量的增加，Stat3的表达量相比对照组降低了，并且呈现明显的剂量效应(图5上排中第3道到第6道)，同时pBS/U6-Stat3-RNAi对EGFP蛋白的表达无任何抑制作用(图5下排中第3道到第6道与第2道比)。共转染了GFP干扰质粒的细胞GFP的表达受到抑制(图5下排中第1道与第2道比)，而Stat3蛋白没有受到任何影响(图5上排中第1道与第2道相比)。同样的，中排β-actin的表达量显示了我们每道的上样量基本是一致的。

(3)采用半定量RT-PCR的实验技术，进一步检测不同剂量的干扰质粒对小鼠Stat3在293T细胞中mRNA表达的影响。把同一实验组总RNA模板RT-PCR扩增出的Stat3与β-actin基因产物各自等量混到一起跑琼脂糖凝胶电泳，参见图6。图6中1-pBS/U6；2-U6-GFPi；3-U6-Stat3-RNAi-IV(0.5ug)；4-U6-Stat3-RNAi-IV(1.0ug)；5-U6-Stat3-RNAi-IV(2.0ug)；6-U6-Stat3-RNAi-IV(3.0ug)。同免疫染色以及免疫印迹实验的结果相一致，随着共转染干扰质粒的量的增加，Stat3的mRNA表达量相比对照组降低了，并且呈现明显的剂量效应(图6上排中第3道到第6道)，下排β-actin的条带显示RT-PCR扩增时的总RNA的取样量是基本一致的。

本发明制备的pBS/U6-Stat3-RNAi质粒可用于抑制肿瘤生长因子的表达，抑制动物模型的肿瘤生长，并为应用于快速鉴别新的肿瘤靶目标提供了理论基础，可以应用在治疗肿瘤的临床实验和制备抗肿瘤药物中。

                                 序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>抑制Stat3基因表达的siRNA及其制备方法

<130>

<160>3303

<170>BioEdit version 7.0.0

<210>1

<211>3303

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctc    60

attttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccga    120

gatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactc    180

caacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacc    240

ctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggag    300

cccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaa    360

agcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccac    420

cacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcg    480

caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg    540

gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg    600

taaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacccg    660

ctctagaactagtggatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacag    720

acttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttccta    780

gtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagc    840

tacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattatttt    900

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Claims (5)

1.一种抑制Stat3基因表达的siRNA，其特征是包含下列四种siRNA的其中任一一种，它们的碱基序列如下：

第一条(作用部位157-174)：5’＞TCACATGCCACGTTGGTG CACCAACGTGGCATGTGACTT

TTTT＜3’

第二条(作用部位1226-1243)：5’＞AGTTCAAGCACCTGACCC

GGGTCAGGTGCTTGAACTCTT

TTTT＜3’

第三条(作用部位1936-1953)：5’＞CAGCTGAACAACATGTCA TGACATGTTGTTCAGCTGCTTT

TTT＜3’

第四条(作用部位2334-2351)：5’＞AAGCTGCAGAGACGTGAC

GTCACGTCTCTGCAGCTTCTTTTTT＜3’。

2.一种如权利要求1所述的抑制Stat3基因表达的siRNA的制备方法，其特征是所述siRNA可以通过体外化学合成并在体内表达。

3.根据权利要求2所述的siRNA的制备方法，其特征是体外化学合成包括以下步骤：

(1)从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AGN18TT”，其中N是任意碱基，结构的长度为22bp的序列；

(2)在正义链和反义链序列上不能连续出现3个或以上的T或A；

(3)干扰序列避免在目的基因的首末端；

(4)排除在起始密码子或无义区域选择目的序列；

(5)选择GC含量为30％-60％的序列；

(6)挑选的序列在公共数据库中进行同源性比较；

(7)克隆到siRNA表达载体中的DNA包括两个短的反向重复序列，中间由环序列分隔，环结构应当靠近寡核苷酸的中央，随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子；

(8)干扰序列末端核苷酸是C或T；

(9)两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点；

(10)siRNA目的序列的第一个碱基是G，若不以G开头，必须在紧连正义链的上游加上一个G；

(11)在启动子下游的酶切位点下方紧连着一个C，使插入片断和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生。

4.根据权利要求2所述的siRNA的制备方法，其特征是所述siRNA表达质粒包括：

含III型RNA聚合酶真核启动子的载体；

编码特异性抑制Stat3基因表达的siRNA的DNA片段。

5.根据权利要求4所述的siRNA的制备方法，其特征是含III型RNA聚合酶真核启动子的载体为pBS/U6。

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