ES2345653T3 - Procedimiento para la construccion de un mutante. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de producción de un mutante aleatorio de gen exógeno, en el que se introduce un constructo de ADN que comprende por lo menos los (a) a (d) siguientes en una célula animal y se produce el mutante de gen exógeno en la célula animal: (a) un promotor de VH, en el que dicho promotor de VH comprende la secuencia de SEC ID nº: 14; (b) un gen exógeno; (c) un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen JH de cadena pesada y el gen Cμ; y (d) un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasaI HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN de las secuencias de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.
Description
Procedimiento para la construcción de un
mutante.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para la producción de un mutante, que comprende
introducir un constructo de ADN mejorado en células animales, el
constructo de ADN, y un kit para producir un mutante de gen o para
expresar un gen mutante.
Los seres vivos existentes actualmente han
evolucionado durante un periodo de tiempo prolongado mediante
mutagénesis y la selección de mutantes por parte del medio
ambiente. La evolución general presenta una velocidad muy lenta y
un avance requiere muchas generaciones. Por otra parte, en el caso
de las células productoras de anticuerpos del sistema inmunológico,
la mutagénesis y la selección por parte de antígenos se completan en
una generación, y la generación siguiente no heredará la función
adquirida. Esta velocidad de evolución tan rápida del sistema
inmunológico se interpreta que se opone a las mutaciones de un
microorganismo patogénico dependiente del medio ambiente.
El presente inventor previamente ha producido
ratones transgénicos en los que se han introducido genes del enzima
cloranfenicol acetiltransferasa de origen bacteriano, y ha
demostrado que la mutación de un gen de anticuerpo se encuentra
controlada por su promotor e intensificador, y la mutación de
cualquier gen puede inducirse mediante el control con un promotor e
intensificador de un gen de anticuerpo (Azuma T. et al.,
Int. Immunology 5(2):121-130, 1992).
El procedimiento para la producción de un
mutante utilizado actualmente es uno de los métodos de producción
de mutantes en los que se introduce convenientemente una mutación
por deleción, inserción y/o adición en una secuencia de ADN
deseada, es decir, mutagénesis sitio-específica para
sustituir sitio-específicamente una determinada
longitud de secuencias de ADN (Site-specific
mutagenesis, Zoller et al., Nucleic Acids Res.
10:6487-6500, 1982; Zoller et al., Methods in
Enzymol. 100:468-500, 1983). En la mutación por
desapareamiento general utilizando un oligonucleótido sintetizado
artificialmente como cebador, se sintetiza un oligonucleótido
complementario consistente constituido por aproximadamente 20 bases
con una mutación opcional en una secuencia de bases próxima a un
sitio en el que debe inducirse una mutación, se híbrida el
oligonucleótido con una ADN diana, produciendo de esta manera una
ADN complementario al resto del ADN diana utilizando un ADN
polimerasa. De esta manera resulta posible introducir una mutación
deseada en un sitio deseado. Sin embargo, este método no puede
inducir muchos mutantes simultáneamente.
En los demás sistemas de mutagénesis, se ha
examinado la desaparición o la manifestación de una función
específica en presencia de un compuesto que daña un gen (Myers
et al., Science 232:613-618, 1986), mientras
que se han utilizado además bacterias, etc. Sin embargo, estos
métodos son fundamentalmente diferentes del método anteriormente
indicado del presente inventor para la inducción de una
mutación.
Se genera variación (diversidad) en la región
IgV de ratones y seres humanos mediante la unión combinatorial de
segmentos génicos V, D y J, que existen separadamente en la línea
germinal, la deleción y adición de nucleótidos en la unión de estos
segmentos durante la unión, y la hipermutación somática de los genes
V-(D)-J unidos. La hipermutación somática se
relaciona con la maduración de afinidad de los anticuerpos y se ha
observado frecuentemente tras la estimulación de los antígenos
dependientes de células T (TD) (Bothwell A.L.M. et al., Cell
24:625, 1981; Gearhart P.J. et al., Nature 291:29, 1981;
Griffiths G.M. et al., Nature 312:271, 1984; Maizels N.
et al., Cell 43:715, 1985; Wysocki L.T. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:1847, 1986; Cumano A. et al., EMBO.
J. 5:2459, 1986; Berek C. et al., Cell 67:1121, 1991;
Taketani M. et al., Mol. Immunol. 32:983, 1995; Furukawa K.
et al., Immunity 11:329, 1999:2-10). Los
elementos de acción en cis responsables de la inducción de la
hipermutación somática han sido identificados utilizando la cadena
\kappa (O'Brien R.L. et al., Nature 326:405, 1987; Sharpe
M.J. et al., Eur. J. Immunol. 20:1379, 1990; Sharpe M.J.
et al., EMBO J. 10:2139, 1991; Betz A.G. et al., Cell
77:239, 1994; Yelamos J. et al., Nature 376:225, 1995;
Peters A. et al., Immunity 4:57, 1996:11-16),
la cadena \lambda (Klotz E. et al., J. Immunol. 157:4458,
1996:17) y ratones transgénicos de cadena H (Durdik J. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2346, 1989; Sohn J. et
al., J. Exp. Med. 177:493, 1993; Tumas-Brundage,
K.M. y Manser T., J. Exp. Med. 185:239,
1997:18-20).
Tal como se ha indicado anteriormente, el
presente inventor preparó ratones transgénicos portadores del gen
de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), que se encuentra
controlado por V_{H}17.2.25 (Loh D.Y. et al., Cell 33:85,
1983; Grosschedl R. y Baltimore D., Cell 41:885, 1985:22,23) y el
intensificador del intrón J-C (en adelante
abreviado E\mu) (Gillies S.D. et al., Cell 33:715, 1983;
Banerji J. et al., Cell 33:729, 1983:24,25)/región de unión
a matriz (en adelante abreviado MAR) (Forrester W.C. et al.,
Science 265:1221, 1994:26). Como resultado, se detectó
hipermutación somática en CAT, pero no en el promotor V_{H} o en
E\mu/MAR flanqueantes. Sin embargo, la frecuencia de mutación era
aproximadamente 1/10 de la observada en
V_{H}-D-J_{H} endógena,
sugiriendo que estos elementos de acción en cis resultan críticos o
importantes para la inducción de la hipermutación y que otros
componentes, tales como C\gamma, C\alpha en situación 3' o el
intensificador flanqueante de C\alpha (intensificador 3')
(Pettersson S. et al., Nature 344:165, 1990; Dariavach P.
et al., Eur. J. Immunol. 21:1499, 1991; Lieberson R. et
al., EMBO. J. 14:6229, 1995:27-29) podrían ser
responsables de hipermutación somática de elevada frecuencia (Sohn
J. et al., J. Exp. Med. 177:493, 1993;
Tumas-Brundage K.M. y Manser T., J. Exp. Med.
185:239, 1997; Giusti A.M. y Manser T., J. Exp. Med. 177:793,
1997:19,20,30).
Con el fin de identificar el componente o
componentes importantes para incrementar la frecuencia de
hipermutación en el gen IgH, el presente inventor utilizó
blastocitos deficientes en RAG-2 Gen de activación
de recombinación: sistema de complemento de blastocisto
proteína-2 de disposición génica, desarrollado por
Chen et al. (Chen J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:4528, 1993:31)). Se microinyectó una serie de constructos de
transgén que diferían únicamente en la región
3'-flanqueante en blastocistos deficientes en
RAG-2 para transfectar células madre embrionarias
(en adelante abreviadas "células ES"). Los ratones quiméricos
obtenidos en este sistema se inmunizaron con un antígeno
dependiente de células T.
Como resultado, la frecuencia de la
hipermutación somática en
V_{H}-D-J_{H} del transgén
reveló que la inserción de la región 3b sensible a la ADNasa I (en
adelante, HS3b) y/o HS4 (Madisen L. y Groudine M., Genes Dev.
8:2212, 1994; Michaelson J.S. et al., Nucleic Acids Res.
23:975, 1995; Arulampalam V. et al., Immunol. Today 18:549,
1997:32-34) induce hipermutación somática
aleatoria.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento de producción para un mutante
aleatorio, en el que se introduce en una célula animal un constructo
de ADN en el que se encuentran ligados un promotor eucariótico
modificado, una secuencia de ADN externa, un intensificador de
intrón y un intensificador HS3/4 3'. Otro objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar un método para obtener un gen
mutante mediante la expresión del constructo de ADN en una célula
animal. Se ha descubierto un constructo de ADN para producir dicho
mutante y un kit para producir un mutante de gen o para expresar el
mutante, realizando de esta manera la presente invención. Además,
un producto de expresión mutante obtenido a partir del sistema de
expresión utilizando células animales implica que ha sido sometido
al cribado de toxicidad frente a células animales.
La presente invención proporciona los ítems 1 a
6 siguientes:
Ítem 1. Un procedimiento de producción en una
célula animal de un gen mutante aleatorio exógeno, en el que se
introduce un constructo de ADN que comprende por lo menos los puntos
(a)-(d) siguientes, y en el que se produce el mutante de gen
exógeno en la célula animal:
- (a)
- un promotor de VH, en el que dicho promotor de V_{H} comprende la secuencia SEC ID nº 14,
- (b)
- un gen exógeno,
- (c)
- un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen JH de cadena pesada y el gen C\mu, y
- (d)
- un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasa I llamados HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de la cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ítem 2: procedimiento de producción según el
ítem 1, en el que la célula animal es una célula animal de una
línea de células B.
Ítem 3: procedimiento de producción según el
ítem 2, en el que la célula animal de una línea de células B se
deriva de una línea celular de prelinfocitos B.
Ítem 4: procedimiento de producción según
cualquiera de los ítems 1 a 3, que comprende además obtener un
producto de expresión de dicho gen mutante mediante la expresión de
dicho mutante de gen exógeno en la célula animal.
Ítem 5: un constructo de ADN para producir un
mutante de gen exógeno, que comprende por lo menos:
- (a)
- un promotor de VH, en el que dicho promotor de VH comprende la secuencia SEC ID nº 14,
- (b)
- un gen exógeno,
- (c)
- un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen JH de cadena pesada y el gen C\mu, y
- (d)
- un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasa I llamados HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de la cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.
\newpage
Ítem 6: un kit para el procedimiento de
producción de un mutante de gen exógeno o para la producción de un
producto de expresión de un gen mutante, que comprende un vector que
presenta:
- (a)
- un promotor de VH, en el que dicho promotor de VH comprende la secuencia SEC ID nº 14,
- (b)
- un sitio de inserción de gen exógeno,
- (c)
- un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen JH de cadena pesada y el gen C\mu, y
- (d)
- un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasa I llamados HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2,
con el fin de conseguir la expresión de una
secuencia de ADN mutada que produce un mutante de gen exógeno.
Según la presente invención, se introduce un gen
exógeno en el sistema controlado por el promotor e intensificador
de un gen de anticuerpo, y por lo tanto puede obtenerse una
agrupación génica que presenta mutaciones frecuentes y aleatorias,
y se proporciona un procedimiento de producción de un mutante de
línea celular animal en el que se introduce ampliamente una
mutación en un péptido o proteína, resultando posible de esta manera
mejorar y modificar una función de una proteína natural. Por
ejemplo, resulta posible desarrollar un nuevo tipo de antibiótico
que presenta una función mejorada contra bacterias resistentes a
antibióticos, compuestos químicos agrícolas, o farmacéuticos
peptídicos mejorados que presentan una mejor función, tal como
interferón y hormona del crecimiento. Además, mediante la
utilización de células animales, resulta posible llevar a cabo
simultáneamente un cribado de toxicidad en células animales, y por
lo tanto puede examinarse la toxicidad primaria y se consigue la
creación rápida de diversos productos peptídicos que presentan una
acción funcionalmente mejorada.
En adelante en la presente memoria, la
representación de aminoácidos, péptidos, secuencias de bases, ácidos
nucleicos y similares mediante abreviatura seguirá las
disposiciones de IUPAC-IUB
(IUPAC-IUB Communication on Biological
Nomenclature, Eur. J. Biochem. 138:9, 1984), "Guideline for the
preparation of specification and others containing a base sequence
or an amino acid sequence" (editado por la oficina de patentes
japonesa) y los símbolos convencionales de la técnica.
La síntesis del ADN, la construcción de
constructo de ADN que contiene un gen exógeno (por ejemplo un vector
de expresión), el método de preparación de una célula huésped
transformada con el constructo de ADN y una proteína expresada
secretada por una célula huésped, etc., pueden prepararse fácilmente
u obtenerse de acuerdo con técnicas de ingeniería genética
generales (Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Lab.
Press, 1989; Continuation of Biochemical Experiment Course, Genetic
Research Method I, II y III, Japanese Biochemical Society, 1986) o
técnicas de recombinación génica (ver, por ejemplo, Science
224:1431, 1984; Biochem. Biophys. Res. Comm. 130:692, 1985; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:5990, 1983).
En la presente invención, un mutante se refiere
a un gen que comprende una secuencia de ADN de mutación aleatoria
de un gen exógeno, o a un producto de expresión que presenta una
secuencia de aminoácidos mutada codificada por un gen mutado
aleatorio.
La producción mutante en una célula animal según
la invención puede conseguirse mediante la preparación de un
constructo de ADN proporcionado por la invención para la inducción
de un mutante (ADN recombinante) que puede expresarse en una célula
huésped que contiene un gen codificante de una proteína deseada, e
introducir el constructo en la célula.
La expresión "introducir un constructo de ADN
en una célula animal" se refiere a incorporar un gen exógeno en
un genoma de una célula animal.
El producto de expresión del mutante se obtiene
mediante cultivo de un transformante que contiene el mutante
anteriormente indicado del gen exógeno y después recogiendo el
producto a partir del cultivo resultante.
El constructo de ADN para la inducción del
mutante proporcionado por la presente invención presenta una
estructura que comprende por lo menos: (a) un promotor según se
define en el ítem 5, anteriormente, (b) un gen exógeno, (c) un
intensificador de intrón según se define en el ítem 5,
anteriormente, y (d) un intensificador que contiene HS1, HS2, HS3b
y HS4 en una región sensible a ADNasa I y que puede producirse
fácilmente u obtenerse mediante una técnica de ingeniería genética
general.
Para la preparación de cada gen (ADN) en la
invención, el gen puede derivarse de un origen adecuado o
sintetizarse químicamente.
Específicamente, la síntesis del ADN puede ser
una síntesis química basada en el método de la fosforamidita o en
el método del triéster, o puede llevarse a cabo en un sintetizador
automático de oligonucleótidos disponible comercialmente. También
puede prepararse un fragmento de doble cadena a partir de un
producto de una sola cadena sintetizado químicamente mediante la
síntesis de cadenas complementarias y la hibridación de estas
cadenas entre sí bajo condiciones adecuadas, o mediante la
utilización de una ADN polimerasa conjuntamente con una secuencia
de cebador adecuada para la adición de una cadena
complementaria.
Además, cada gen puede obtenerse mediante la
síntesis de ADN tal como se ha indicado anteriormente, o mediante
la preparación de una biblioteca de ADNc de acuerdo con un método
ordinario a partir de un vector que contiene el gen, o de un origen
adecuado en el que se expresa el gen, y seleccionando un clon
deseado utilizando una sonda adecuada o un anticuerpo específico
para el gen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6613, 1981; Science
222:778, 1983, etc.).
Como origen de ADNc en lo expuesto anteriormente
se proporcionan, a título ilustrativo, diversos tipos de células y
tejidos en los que se expresa cada gen, células cultivadas derivadas
de los mismos y similares. Además, la separación del ARN total a
partir de estos orígenes, la separación y purificación de ARNm, la
preparación y clonación de ADNc, etc., pueden llevarse a cabo según
un método ordinario. En la presente invención pueden utilizarse
bibliotecas de ADNc comercialmente disponibles, tales como la
biblioteca de ADNc de Clontech Lab. Inc. Un método para cribar el
gen a partir de una biblioteca de ADNc no se encuentra limitado, y
puede llevarse a cabo según un método ordinario.
Específicamente, puede utilizarse un método de
inmunocribado de las proteínas producidas por ADNc utilizando
anticuerpos específicos contra las proteínas y seleccionando el clon
de ADNc correspondiente, la hibridación de placas y la hibridación
de colonias utilizando una sonda combinada selectivamente con una
secuencia de ADN diana, una combinación de dichos métodos, etc.
En la presente invención puede utilizarse como
sonda un ADN químicamente sintetizado basándose en la información
de la secuencia de bases de cada gen, aunque también puede
utilizarse satisfactoriamente un gen ya obtenido según la invención
o un fragmento del mismo. Puede utilizarse un cebador de sentido o
un cebador antisentido diseñados basándose en la información de la
secuencia de bases del gen exógeno como una sonda para el
cribado.
Se utiliza una secuencia parcial de nucleótidos
correspondiente a la secuencia de ADN de cada gen a modo de la
sonda anteriormente mencionada. La secuencia de nucleótidos puede
contener por lo menos 15 bases en serie, preferentemente 20 bases
en serie, más preferentemente 30 bases en serie, y todavía más
preferentemente 50 bases en serie. Alternativamente, puede
utilizarse como sonda un clon positivo que contenga dicha secuencia
misma.
La amplificación de ADN/ARN mediante el método
de PCR (Science 230:1350, 1985) puede utilizarse preferentemente
para obtener un gen. Especialmente, en el caso de que resulte
difícil obtener la longitud completa del ADNc a partir de la
biblioteca, el método RACE (Rapid amplification of cDNA ends,
Journal of Experimental Medicine 12(6):35, 1994),
especialmente el método 5'-RACE (M.A. Frohman et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:8998, 1988), etc., puede
adoptarse preferentemente.
En el caso de que se adopte el método de PCR, el
cebador utilizado puede diseñarse basándose en la información de la
secuencia de bases y sintetizarse de acuerdo con un método
ordinario. El fragmento amplificado de ADN/ARN puede separarse y
purificarse según un método ordinario tal como se ha indicado
anteriormente, por ejemplo electroforesis en gel.
Las secuencias de los genes o diversos tipos de
fragmentos de ADN obtenidos anteriormente pueden determinarse de
acuerdo con un método ordinario, por ejemplo el procedimiento
dideoxi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977) y el método de
Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology 65:499, 1980),
o más fácilmente, utilizando un kit comercial de secuenciación y
similar.
En los constituyentes del constructo de ADN
anteriormente indicado, el ADN utilizado como (b) gen exógeno puede
ser una secuencia de ADN exógeno derivada de un gen deseado, o una
proteína expresada que forma una base para inducir un mutante.
Alternativamente, el ADN utilizada como gen exógeno puede
sintetizarse. La longitud del gen exógeno utilizado para el
presente procedimiento de producción para un mutante puede ser de
generalmente 4 kb o inferior, preferentemente de 3 kb o inferior,
más preferentemente de aproximadamente 2 kb, aunque también puede
utilizarse una secuencia de ADN exógeno que presente una longitud
superior a 4 kb.
El gen exógeno no se encuentra especialmente
limitado, en la medida en que muestre una actividad biológica tras
su expresión. Por ejemplo, a título ilustrativo, hormona del
crecimiento (GH), insulina, interferón, eritropoyetina, etc.
Para una comprobación más sencilla de la
inserción del gen exógeno en un genoma de célula huésped, la
secuencia de ADN del gen que debe utilizarse como un, según se
denomina, marcador, puede unirse a la secuencia de ADN del gen
exógeno (b) expuesto anteriormente.
Mediante la utilización de una parte o de la
totalidad de las secuencias de bases del gen exógeno obtenido de
esta manera, puede detectarse con especificidad la expresión del gen
exógeno y su mutante en un individuo o en diversos tejidos.
Dicha detección puede llevarse a cabo según un
método ordinario, por ejemplo la amplificación del ARN mediante
RT-PCR (reacción en cadena de la
polimerasa-transcripción inversa; E.S. Kawasaki
et al., Amplification of RNA, en: PCR Protocol, A Guide to
methods and applications, Academic Press, Inc., San Diego,
21-27, 1991), análisis de transferencia northern
(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., 1989), la detección a
nivel celular utilizando RT-PCR in situ
(Nucl. Acids Res. 21:3159-3166, 1993) e hibridación
in situ, método NASBA (Nucleic acid
sequence-based amplification, Nature
350:91-92, 1991) y los otros diversos métodos. Se
ilustra preferentemente la detección mediante
RT-PCR.
El fragmento de ADN del gen exógeno se
proporciona en la forma de un fragmento de restricción cortado con
un enzima de restricción adecuado, es decir, el gen exógeno (b) del
constructo de ADN.
El promotor utilizado como un constituyente del
constructo de ADN anteriormente mencionado es el promotor
V_{H}17.2.25 (Gillies S.D. et al., Cell 33:715, 1983;
Banerji J. et al., Cell 33:729, 1983).
Un intensificador de intrón es una secuencia de
ADN que puede regular la transcripción y que contiene la secuencia
de región no expresada situada entre los exones del gen JH de cadena
pesada y el gen C\mu. El intensificador de cadena pesada
(intensificador de C\mu) de inmunoglobulina puede ilustrarse como
(c) intensificador de intrón.
Una región sensible a la ADNasa I es una región
que se fragmenta al tratar el núcleo de una célula aislada con una
concentración reducida de ADNasa I. Se conocen los genes de cadena
pesada de inmunoglobulina HS1, HS2, HS3b y HS4. HS3b/4 es HS3b o
HS4, o ambos. La presente invención se caracteriza porque se
encuentran contenidas las regiones HS3b y HS4. En la presente
invención se incluye HS1 y HS2 (a las que se hace referencia como
3'E), además de HS3b y HS4. Se ilustra a modo de un 3'EHS3b/4 una
secuencia que no presenta secuencias de intrón, que comprende el
fragmento XbaI (4,0 kb) a partir del intensificador 3' dado a
conocer por Lieberson R. et al. (EMBO. J. 14:6229, 1995) y
HS3 (1.182 pb) y HS4 (1.381 pb) procedente de MP11, dado a conocer
por Madisen L. et al. (Genes Dev. 8:2212, 1994).
El constructo de ADN de la invención puede
prepararse, por ejemplo, mediante la inserción de cada uno de los
genes anteriormente indicados en un vector de expresión adecuado de
acuerdo con un método ordinario, por ejemplo mediante la inserción
de cada elemento en un vector que presente un gen adecuado de
resistencia a antibiótico. Específicamente, el constructo de ADN
puede construirse mediante la inserción de promotor, gen exógeno,
intensificador de intrón, región sensible a ADNasa I (incluyendo
las secuencias de ADN de HS1, HS2, HS3b y HS4), que se cortan,
extrayéndolas de un clon vector, ADN genómico o plásmido mediante un
enzima de restricción opcional o se sintetizan, introduciéndolas en
un vector utilizado para una línea celular animal que presenta un
gen opcional de resistencia a un antibiótico.
Específicamente, la inserción puede llevarse a
cabo de acuerdo con un método ordinario utilizando un enzima de
restricción, una ligasa, etc.
En el vector de expresión recombinante deseado,
puede construirse un intensificador de intrón y un intensificador
3'EHS3b/4 en la misma dirección, de extremo 5' a extremo 3', en la
misma dirección, de extremo 3' a extremo 5', o en direcciones
opuestas de extremo 5' a extremo 3' y de extremo 3' a extremo
5'.
En el constructo de ADN anteriormente indicado,
el intervalo entre el promotor y el intensificador 3'EHS3b/4
situado entre un ADN exógeno puede presentar una longitud de entre
0,1 kb y 100 kb, preferentemente de entre 1 kb y 10 kb, más
preferentemente de entre 2 kb y 5 kb.
Un ejemplo de un vector de expresión preferente
es un vector retrovírico. Más específicamente, a título ilustrativo
se proporcionan pIND (Invitrogen), pcDNA3.1/His (Invitrogen),
pEGFP-N, pEGFP-C (Clontech),
etc.
Un ejemplo del constructo de ADN que contiene:
(a) promotor y (c) intensificador de intrón, es un vector de
expresión que contiene un promotor de V_{H} y un intensificador de
intrón según el presente inventor y otros (Azuma T. et al.,
Int. Immunology 5(2):121-130, 1993).
Preferentemente se utiliza para la preparación del constructo de
ADN.
En el vector de expresión anteriormente indicado
que contiene un promotor y un intensificador de intrón, el promotor
se sitúa en el lado 5' cadena arriba del gen exógeno ordinariamente
inducido, y siguen, en orden, el gen exógeno y un intensificador de
intrón.
En el caso de que el vector anteriormente
indicado para la preparación del presente constructo de ADN que
contiene un gen exógeno se modifique para que contenga un promotor,
un sitio de clonación para la inserción del gen exógeno deseado,
uno o más intensificadores necesarios para inducir la mutación
(especialmente un intensificador de inmunoglobulina, así como un
intensificador de intrón) y una región sensible a ADNasa I,
resultará efectivo como constructo de ADN en un procedimiento de
producción de un mutante de gen exógeno o en un kit para la
producción de un producto de expresión de un gen mutante.
El presente constructo de ADN puede ser un ADN
circular o un ADN lineal.
La comprobación de si se ha conseguido producir
el presente constructo de ADN puede llevarse a cabo mediante un
método ordinario, por ejemplo mediante el corte del constructo con
un enzima de restricción y sometiéndolo a electroforesis, o
mediante combinación de PCR, hibridación southern y secuenciación,
etc.
\vskip1.000000\baselineskip
En un procedimiento de producción de un gen
exógeno, en primer lugar se introduce el constructo de ADN
resultante del método anteriormente proporcionado, en una célula
huésped adecuada con el fin de obtener un recombinante
homólogo.
Entre los ejemplos de la célula huésped se
incluyen organismos eucarióticos que comprenden células de un
mamífero, levadura, planta o similar, aunque resultan preferibles
las células animales de mamífero. Preferentemente se utilizan a
modo de dicha célula, líneas celulares establecidas que deben
transformarse conjuntamente con un determinante que puede provocar
que la mutación resulte más efectiva, células COS de mono (Cell
23:175, 1981), oocitos de hámster chino, células HeLa, fibroblasto
RatII, células epiteliales del canal alimentario y las células
defectuosas en dihidrofolato reductasa correspondientes (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:4216, 1980). En el caso de una línea celular
establecida, resulta preferido utilizar, aunque de manera no
limitativa, por ejemplo, células animales de una línea de células T
o de células B, especialmente células animales de una línea de
células pre-B, más específicamente células J558 y
células J558L. En el caso de las células de levadura, se utilizan
células de levadura pertenecientes al género Saccharomyces,
etc. Además, también pueden utilizarse células de un cuerpo animal
vivo como células huésped.
Como resultado de la introducción de un gen
exógeno en el genoma de una célula huésped, puede obtenerse un
transformante transformado con el constructo de ADN de la presente
invención.
Dicha introducción del presente constructo de
ADN en una célula puede llevarse a cabo de acuerdo con diversos
métodos conocidos de la técnica de la introducción de ADN en una
célula, por ejemplo el método de electroporación, el método de
coprecipitación con fosfato cálcico, el método de liposoma, el
método de DEAE-dextrano, el método de
microinyección, la transducción vírica, etc. Preferentemente se
utiliza el método de electroporación.
Son ejemplos de las células en las que se
introduce el presente constructo de ADN, óvulo fertilizado, embrión,
células germinales y similares. La introducción en células puede
llevarse a cabo de acuerdo con un método ordinario.
Puede comprobarse si se ha obtenido un mutante o
no mediante un método conocido, por ejemplo mediante el método de
secuenciación aleatoria o mediante la determinación de la actividad
del producto expresado por un gen exógeno y la selección de un gen
cuya actividad sea diferente de la del gen exógeno.
Alternativamente, puede seleccionarse basándose en una actividad
estándar y el grado de la misma, o en si la actividad es alta o
baja.
La forma aislada de la célula misma que contiene
un gen aleatoriamente mutado transformado con el ADN exógeno de la
invención puede ser un péptido mejorado que presente una función
mejorada relacionada con el gen exógeno humano. Por lo tanto, puede
utilizarse como farmacéutico para mejorar un estado de enfermedad o
como sistema modelo para el estudio terapéutico.
El transformante resultante puede cultivarse de
acuerdo con un método ordinario. Como resultado del cultivo, la
proteína de la invención codificada por un mutante de un gen exógeno
se expresa y se produce (se acumula, se secreta) intracelularmente,
extracelularmente o sobre la membrana celular del transformante.
Pueden seleccionarse apropiadamente diversos
cultivos comunes dependiendo de las células huésped adoptadas y
utilizadas para el cultivo, y el cultivo puede llevarse a cabo bajo
condiciones adecuadas para el crecimiento de la célula huésped.
La proteína recombinante de la invención
obtenida de esta manera puede separarse y purificarse si se desea,
mediante diversos procedimientos de separación utilizando
propiedades físicas o químicas de la proteína recombinante (ver,
por ejemplo, Biochemistry Data Book II, páginas 1.175 a 1.259,
edición 1, publicación 1, publicada por Tokyo Kagaku Dojin (23 de
junio de 1980); Biochemistry 25(25):8274, 1986; Eur. J.
Biochem. 163:313, 1987, etc.).
Se ilustran específicamente como el
procedimiento anterior, el procesamiento de reconstitución común, el
procesamiento mediante precipitación de las proteínas [método de
precipitación con sales, (salting out)], separación centrífuga,
método del choque osmótico, ultrasonicación, ultrafiltración,
cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía
de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
afinidad, diversas cromatografías líquidas, tales como la
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la diálisis, y una
combinación de las mismas. Por ejemplo, la cromatografía de
afinidad utilizando una columna en la que se encuentran ligadas
anticuerpos específicos a la proteína de la invención resulta
particularmente preferente.
De esta manera, el presente vector de expresión
recombinante se expresa en una célula animal, proporcionando un ADN
exógeno, resultando en mutantes aleatorios codificados por dicho
ADN. La frecuencia de mutantes aleatorios mediante el vector de
expresión recombinante de la invención es de entre por lo menos
aproximadamente 1x10^{-4} y aproximadamente
1x10^{-3}/pb/generación.
La presente invención proporciona un
procedimiento de producción de un mutante que comprende un
eucariota, especialmente una célula animal que contiene el vector
recombinante anteriormente indicado que presenta un sitio de
inserción de un ADN exógeno o un gen exógeno para conseguir la
expresión de una secuencia de ADN introducida o un mutante
génico.
Según el presente procedimiento de producción de
un mutante, puede mejorarse un péptido que presenta una actividad
antimicrobiana pero que no se encuentra disponible debido a su
toxicidad para las células animales, proporcionando un péptido
antimicrobiano que presenta una toxicidad reducida para las células
animales y una actividad antimicrobiana más alta. De manera
similar, resulta posible realizar un intento para mejorar o
modificar las funciones de proteínas, tales como el interferón
natural, la hormona del crecimiento y similares. Por lo tanto, puede
proporcionarse un método útil para desarrollar compuestos químicos
agrícolas o para mejorar la función de farmacéuticos o
similares.
Además, la invención proporciona: un kit para un
procedimiento de producción de un mutante de un gen exógeno, o para
producir un producto de expresión de un gen mutante, que comprende
un constructo de ADN que presenta un sitio insertable de un ADN
exógeno o de un gen exógeno. Específicamente, el constructo de ADN
comprende:
- (a)
- un promotor según se ha definido en el ítem 6, anteriormente,
- (b)
- un sitio de inserción de un gen exógeno,
- (c)
- un intensificador de intrón según se ha definido en el ítem 6, anteriormente,
- (d)
- un intensificador que comprende HS1, HS2, HS3b y HS4 en la región sensible a ADNasa I.
Según el presente kit para la producción de un
mutante, puede proporcionarse un péptido antimicrobiano mejorado
con toxicidad para células animales y una actividad antimicrobiana
más alta, y farmacéuticos proteínas que presentan funciones
mejoradas, tales como el interferón natural, la hormona del
crecimiento y similares.
La figura 1A muestra una vista esquemática de un
transgén mutante IgH construido para generar ratones quiméricos.
En la figura 1B, se muestran mediante flechas
las localizaciones y orientaciones de los cebadores utilizados para
amplificar el ADNc.
La figura 2 indica la producción de C\mu
productor de anticuerpos antiNP de células J558L transfectadas con
los genes mutantes de IgH mostrados en la figura 1. Los
sobrenadantes de células J558L transfectadas (1x10^{6}
células/ml) cultivadas durante 12 horas se sometieron a ELISA
utilizando placas recubiertas con NP_{9}-BSA para
la estimación de la producción de anticuerpos.
La figura 3A muestra una reconstitución de los
sistemas inmunológicos de ratones RAG-2^{-/-} por
parte de células ES en ratones quiméricos A4-3,
2-1 y 2-3. Se midieron los niveles
de IgM de ratón en ratones preinmunes mediante ELISA utilizando
placas recubiertas con anticuerpo monoclonal antiIgM de ratón de
rata y anticuerpo antiIgM de ratón de cabra marcado con POD.
La figura 3B muestra la medición de los niveles
de IgM humana en sueros preinmunes o inmunes utilizando placas
recubiertas con anticuerpo IgM antihumano de ratón y anticuerpo IgM
de cabra marcado con POD. Los sueros inmunes se denominan TD.
Los antisueros de ratones Balb/c y de ratones
RAG-2^{-/-} se utilizaron como controles en A, y
se utilizó un sobrenadante de cultivo de J558L además de dichos
sueros como controles en B.
La figura 3C muestra un análisis de la unión de
los anticuerpos antiNP a placas recubiertas con anticuerpo
antiNP_{9}-BSA. Los anticuerpos unidos se
detectaron utilizando antiIgG de ratón marcado con POD.
La figura 3D muestra las proporciones de unión
de antisueros procedentes de ratones quiméricos a placas recubiertas
con NP_{1}-BSA o con
NP_{12}-BSA.
La figura 4 muestra una amplificación específica
de transgenes realizada mediante RT-PCR. Se
amplificó ADNc preparado a partir de ARNm de células de bazo
IgM^{-}B220^{+} procedentes de ratones quiméricos inmunizados
con NP_{34}-CGG. Únicamente los ratones quiméricos
proporcionaron bandas correspondientes a los transgenes (carriles 1
a 6) y los ratones C57BL/6 no proporcionaron dichas bandas (carril
7). También se muestra la célula J558L transfectante (carril 8) y
la célula no transfectante (carril 9), a modo de controles positivos
o negativos.
La figura 5 muestra una comparación entre la
distribución y la frecuencia de hipermutación somática en
constructos de transgén procedentes de células de bazo
IgM^{-}B220^{+} (A) y de células B1 peritoneales (B).
La distribución y la frecuencia de hipermutación
somática en constructos de transgén procedentes de dos ratones
quiméricos se muestran separadamente en A. La escala en la parte
inferior indica la posición del aminoácido, numerada según el
método de Kabat et al.
A continuación, se proporcionan ejemplos
ilustrativos de la presente invención con mayor detalle, y no
limitativos del alcance de la invención.
Se construyó C\mu humano portador de cadena H
de Ig (IgH) que presentaba diferentes regiones 3' flanqueantes.
Se clonó mediante PCR un fragmento que contenía
el promotor V_{H}17.2.25 (0,55 kb; SEC ID nº 14)
con los enzimas de restricción KpnI y ApaI, y otro fragmento que
contenía E\mu/MAR (1 kb) con los sitios de los enzimas de
restricción XhoI y SalI, a partir del constructo [plásmido que
presenta un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) controlado
por el promotor de V_{H} derivado de V_{H}17.2.25 y el
intensificador de intrón (intensificador de intrón
J-C/región de unión de matriz (abreviado
E\mu/MAR)) entre los sitios de los enzimas de restricción XbaI y
XhoI de pBluescript SK(+)], que el presente inventor preparó
previamente para generar ratones transgénicos para CAT (Azuma T.
et al., Int. Immunology 5(2):121-130,
1993).
También se clonó mediante PCR el fragmento
génico V_{H}-D-J_{H}
reorganizado (2,0 kb) que contenía los sitios de los
enzimas de restricción ApaI y XhoI, utilizando un ADN genómico de
A6, un hibridoma productor de anticuerpo monoclonal
anti(4-hidroxi-3-nitorfenil)acetilo
(en adelante denominado anticuerpo monoclonal antiNP) que se obtuvo
a partir del ratón C57BL/6 (Tokyo Animal Center) (Taketani M. et
al., Mol. Immunity 32:983, 1995; Furukawa K. et al.,
Immunity 11:329, 1999).
Éstos se clonaron en Bluescript II SK (de
Stratagene), en orden: promotor de V_{H}, gen
V_{H}-D-J_{H} y E\mu/MAR.
Se obtuvo un fragmento XbaI de 6,9 kb del gen
C\mu humano obtenido a partir de un clon fágico,
CH.H.Ig\mu-24 (Takahashi N. et al.,
Nucleic Acids Res. 8:5983, 1980; Health Science Research Resources
Bank).
Se obtuvo un plásmido (Lieberson R. et
al., EMBO. J. 14:6229, 1995) que contenía el fragmento XbaI (4,0
kb) del intensificador 3' (en adelante denominado 3'E) de los
doctores J. Manis y F. Alt (Harvard Medical School). Los fragmentos
que contenían HS3b (1,2 kb), indicado como SEC ID nº 1, y HS4 (1,4
kb), indicado como SEC ID nº 2, se clonaron mediante PCR utilizando
los cebadores indicados como SEC ID nº 3 a 6, y ADN genómico
procedente de un linfoma de células B, MPC11 (Madisen L. y Groudine
M., Genes Dev. 8:2212, 1994). En cada secuencia de cebador, se
subraya el sitio de reconocimiento del enzima de restricción SpeI o
XbaI.
| SEC ID nº 3: | HS3-S: | 5'-TCTAGAACCACATGCGATCTAAGGGATATTGGGG-3' |
| SEC ID nº 4: | HS3-anti SpeI: | 5'-CAGGACTAGTGATCATTGAGCTCCGGCTCTAAC-3' |
| SEC ID nº 5: | HS4-S XbaI: | 5'-CTAGTCTAGACTGCAGACTCACTGTTCACCATG-3' |
| SEC ID nº 6: | HS4-anti SpeI: | 5'-GTGGACTAGTAAGCTTGGAGTTAGGTGGGTAGG-3' |
Estos fragmentos se unieron al extremo 3' de
3'E, en orden: HS3b y HS4. Se unieron 3'E, HS3b y HS4 en tándem sin
inserción de ninguna secuencia de intrón de Ig intermedia.
Utilizando cada uno de los fragmentos indicados
anteriormente, se obtuvieron tres tipos de constructo:
pvehc\Delta3'E (12 kpb), pvehc3'E (16 kpb) y pvehc3'EHS3b/4 (19
kpb) mediante una técnica de recombinación génica.
Los constructos de transgén obtenidos en la
presente invención contienen una región V codificada por
V_{H}186.2 de ratón, y una V_{H} dominante implicada en la
respuesta frente a los haptenos
(4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo
(Bothwell A.L.M. et al., Cell 24:625, 1981).
El gen
V_{H}186.2-DFL16.1-J_{H}2 de
ratón reorganizado a partir de A6, un hibridoma productor de
anticuerpo monoclonal contra
(4-hidroxi-3-nitrofenil)acetilo
(Taketani M. et al., Mol. Immunity 32:983, 1995; Furukawa K.
et al., Immunity 11:329, 1999) se ligó al gen C\mu humano,
facilitando de esta manera una discriminación entre el transgén
codificado y la cadena H de ratón endógena.
Además, debido a que la expresión de transgenes
sobre la superficie de las células B podría modificar el desarrollo
de las mismas, se eliminó el exón transmembranal de C\mu para
impedir la expresión de los transgenes sobre la superficie celular.
Los transgenes contenían únicamente C\mu, sin regiones génicas
codificantes de otros isotipos de cadena H.
La totalidad de los tres tipos de constructo de
transgén contenía promotor de V_{H} y E\mu/MAR procedentes de
intrón J-C\mu de ratón como elementos de acción en
cis, que habían sido utilizados para la construcción del transgén
de la CAT (Azuma T. et al., Int. Immunol. 5:121, 1993). Por
lo tanto, las diferencias de estructura de los transgenes se
limitaban a la región 3' flanqueante (figura 1).
Uno de los constructos, pvehc\Delta3'E, no
presentaba región intensificadora 3' y se encontraba regulado por
el promotor de V_{H} y E\mu/MAR. Otro constructo, pvehc3'E,
contenía intensificador 3' (Lieberson R. et al., EMBO. J.
14:6229, 1995) además de promotor de V_{H} y E\mu/MAR. El
fragmento del enzima de restricción BamHI (4,0 kb) que contenía el
intensificador 3' (3'E) se utilizó para la construcción del gen. La
adición de HS3b y HS4 a pvehc3'E dio lugar a un constructo
denominado pvehc3'EHS3b/4.
Los genes IgH endógenos contenían un elemento de
acción en cis adicional denominado HS3a (Matthias P. y Baltimore
D., Mol. Cell Biol. 13:1547, 1993), que presenta una secuencia de
nucleótidos idéntica a las de HS3b, aunque se encontraba en una
forma invertida (Arulampalam V. et al., Immunol. Today
18:549, 1997). Los constructos de transgén de la presente invención
no contenían dicho elemento de acción en cis.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estimar la actividad transcripcional de
estos tres constructos, estos se transfectaron en una línea celular
de plasmacitoma de ratón: las células J558L. Los constructos de gen
IgH linearizados (10 \mug) que presentaban un sitio de
reconocimiento del enzima de restricción NotI se sometieron a
electroporación (Sahagaw B.G. et al., J. Immunol.
137:1066-1074, 1986) para introducirlos en células
J558L conjuntamente con el plásmido pSV2-gpt (1,6
\mug) (Mulligan R.C. y Berg P., Science
209:1422-1427, 1980). Las condiciones específicas
de la electroporación fueron las siguientes.
Instrumento: Gene Pulser
(BIO-RAD Laboratories)
Condiciones:
- Tampón: PBS
- Células: J558L, 2x10^{7} células/ml en 0,5 ml de PBS
- ADN linearizado: transgén IgH (10 \mug) y pSV2-gpt (1,6 \mug)
- Condiciones de reacción: capacitancia (960 \muF), voltaje (350 v).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células transfectadas se cultivaron a 37ºC
en presencia de CO_{2} (5%) y de una mezcla de hipoxantina,
xantina y ácido micofenólico (Sigma). Se llevó a cabo la dilución
limitante de transformantes de un gen IgH resistente a fármaco, y
se seleccionaron los clones basándose en la producción de
anticuerpos. Específicamente, se midió mediante ELISA la producción
de anticuerpo quimérico antiNP (figura 2).
Para el análisis cuantitativo de la producción
de anticuerpos, se cultivaron algunos clones de transformante
inducidos a partir de cada constructo de transgén durante 12 horas
en una placa de fondo plano de 96 pocillos que incluía medio
RPMI1640 (volumen total: 200 \mul; Nissui Pharmaceutical Co.,
Ltd.) y contenía suero de feto bovino al 10% (FCS), a una densidad
de 2x10^{6} células/ml. El sobrenadante de cultivo diluido a
diversas concentraciones con solución salina tamponada con fosfato
(PBS) que contenía 1 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) se
analizó mediante ELISA utilizando una placa de polivinilo recubierta
de NP_{9}-BSA. Se utilizó anticuerpo anticadena
\lambda_{1} de ratón marcado con peroxidasa (POD) (Southern
Biotech) o anticuerpo anticadena \mu humana (ZYMED) para detectar
los anticuerpos unidos.
Se muestra el resultado en la figura 2.
Se diseñaron constructos de transgén
codificantes de cadenas H quiméricas, que presentaban la región
V_{H} de un anticuerpo monoclonal antiNP de ratón y la región C
de Ig humana, que se esperaba que se ensamblasen con las cadenas
\lambda_{1} de ratón y diesen lugar a anticuerpo antiNP
quimérico.
Todos los constructos se transfectaron
activamente en células J558L y produjeron anticuerpos antiNP
mediante apareamiento con las cadenas \lambda_{1} endógenas. De
entre estos constructos, pvehc\Delta3'e mostró una producción
bastante débil en comparación con los demás. La adición de 3'E
(pvehc3'E) resultó en un incremento significativo de la producción
de anticuerpos; sin embargo, la adición posterior de HS3b y HS4
aparentemente no presentó ningún efecto sobre la producción de
anticuerpo. Aunque se disponía de poca información sobre la
dependencia de la transcripción del número de copia de cada ADN
transfectado, el inventor partió de la premisa de que la cantidad
de producción de anticuerpo reflejaba la actividad transcripcional
de los constructos, que no difería significativamente en pvehc3'E y
pvehc3'EHS3b/4.
\vskip1.000000\baselineskip
Para generar ratones quiméricos, el presente
inventor utilizó por lo menos dos clones ES transfectados
independientes para la microinyección en blastocistos de ratón
RAG-2^{-/-}. El inventor también utilizó por lo
menos dos constructos quiméricos de ratón/transgén para el análisis
de la hipermutación somática. Las líneas celulares ES transfectadas
y los ratones quiméricos utilizados en el presente experimento se
muestran en la Tabla 1.
El fragmento EcoRI de pGKneo (1,5 kb, 1 \mug)
y los tres tipos de constructos de transgén de IgH de cadena lineal
(30 \mug) se electroporaron de la misma manera que en el Ejemplo 2
en 1x10^{7} células E14-1 (Kuhn R. et al.,
Science 254:707, 1991) utilizando un electroporador "Gene
Pulser" de Bio-Rad.
A continuación, las células transfectadas se
seleccionaron con G418 (150 \mug/ml, Gibco). Las colonias
seleccionadas se cribaron mediante: PCR utilizando dos cebadores
indicados como SEC ID nº 7 y 8 que pueden hibridarse con secuencias
de ADN situadas en el promotor V_{H}17.2.25 y en J_{H}2, y
mediante transferencia southern utilizando el gen C\mu humano
como sonda, respectivamente.
| SEC ID nº 7: | 5'-GACTCAGGAGGACTCTAGTT-3' |
| SEC ID nº 8: | 5'-GGTGTCCCTAGTCCTTCATG-3' |
Se llevó a cabo la amplificación mediante PCR de
30 ciclos de 95ºC de 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 1 minuto. Se estimó mediante transferencia southern que el
número de copia de pvehc3'E integrado era de entre 2 y 3. Se
estimaron los números de copia de otros transgenes, pvehc\Delta3'E
y pvehc3'EHS3b/4, mediante análisis de PCR utilizando ADN
procedente de células ES transfectadas con pvehc3'E a modo de
estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron clones de células ES que contenían
el transgén IgH en blastocistos de ratones
RAG-2^{-/-} (Takahashi N. et al., Nucleic
Acids Res. 8:5983, 1980) y se trasplantaron a úteros de madres
nodrizas de la cepa ICR (de 8 a 12 semanas de edad, CLEA Japan
Inc.). Se sometió a ensayo la complementariedad del sistema
inmunológico respecto a células B y T originadas a partir de células
ES en ratones quiméricos mediante citometría de flujo tras tinción
de las células con anticuerpo antiCD3 marcado con PE o
antiB220/SA-FITC-biotina.
Se utilizó anticuerpo de oveja anticadena \mu
de ratón marcado con POD para la detección de los anticuerpos
unidos. Para analizar los anticuerpos que presentaban C\mu humano,
las placas se recubrieron con anticuerpo antiIgM humana de oveja
(Southern Biotech) y anticuerpo monoclonal antiIgM humana marcado
con POD (ZYMED) para la detección de los anticuerpos unidos. Se
utilizaron como anticuerpos de control, sobrenadante de cultivo de
J558L transformante, de IgM de Waldenström humano y del anticuerpo
monoclonal IgM antiNP B4-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un retrocruzamiento con el ratón
C57BL/6 para examinar la transmisión germinal del transgén, y se
extrajo el ADN de la cola del ratón resultante para analizar la
generación de un ratón quimérico basado en si albergaba el transgén
o no.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de examinar si el sistema
inmunológico se había reconstituido con los linfocitos derivados de
las células ES, se midieron las cantidades de IgM en los sueros
preinmunes de los ratones quiméricos A4-3,
2-1 y 2-3 mediante ELISA.
Se muestra el resultado en la figura 3A. Con
independencia del tipo de transgén, las cantidades detectadas de
IgM de ratón en todos los sueros de estos ratones eran similares,
aunque más reducidas que las presentes en un ratón BALB/c
normal.
A continuación, se preparó globulina \gamma
NP_{34}-de pollo (NP_{34}-CGG)
y NP-BSA que presentaba un valor de NP diferente,
de la misma manera que en Azuma et al. (Azuma T. et
al., Molec. Immunol. 24:287, 1987).
Se administró CFA (adyuvante completo de Freund:
Difco, 100 \mug/ratón), incluyendo
(4-hidroxi-3-nitrofenil)acetil-globulina
\gamma de pollo (en adelante denominada
NP_{34}-CGG), en ratones quiméricos, y se
administró la misma cantidad de suero inmune adicional utilizando
IFA (adyuvante incompleto de Freund). Tres días después de la
administración final de PBS que incluía
NP_{34}-CGG, se recolectaron los antisueros de los
ratones inmunizados. A continuación, se sacrificaron los ratones y
se obtuvieron muestras de tejido.
Se utilizaron placas recubiertas con
NP_{1}-BSA o NP_{16}-BSA para
medir la producción de anticuerpos antiNP y la maduración de
afinidad de estos anticuerpos. Se utilizó anticuerpo de oveja
antiIgG de ratón marcado con POD (ZYMED) para la detección de los
anticuerpos.
Se utilizó el anticuerpo monoclonal antiNP F8
como control de anticuerpo inmaduro, y C6 como control de anticuerpo
monoclonal maduro (Taketani M. et al., Mol. Immunol. 32:983,
1995; Furukawa K. et al., Immunity 11:329, 1999).
Se muestra el resultado en la figura 3B. No se
detectó anticuerpo que expresa el gen C\mu humano codificado por
los transgenes en los antisueros preinmunes o inmunes procedentes de
ratones inmunizados con NP_{34}-CGG.
Se prepararon hibridomas productores de
anticuerpo monoclonal antiNP (\gamma1\lambda1) a partir de
ratones pvehc3'EHS3b/4 inmunizados con
NP_{34}-CGG. Ninguno de dichos anticuerpos
secretados expresaba C\mu humano; sin embargo, algunos de ellos
sintetizaban cadena H intracelular que presentaba C\mu humano.
El resultado sugiere que los transgenes se
habían transcrito y traducido en las células B de ratones
quiméricos. Sin embargo, el nivel de los productos de cadena H
secretados era inferior al nivel detectable.
A continuación, se examinó mediante ELISA la
reacción de los anticuerpos de ratones quiméricos con el antígeno
TD NP_{34}-CGG. Se muestra el resultado en la
figura 3C. El valor del anticuerpo cambió, pero la totalidad de los
ratones produjeron anticuerpos antiIgG, indicando que los sistemas
inmunológicos responden a la producción de anticuerpos antiNP.
Además, la proporción de unión de dichos
anticuerpos a NP_{1}-BSA, que se relaciona con la
unión a NP_{16}-BSA, se examinó midiendo la
maduración de afinidad. Se muestra el resultado en la figura 3D.
\newpage
Tal como se muestra en la figura 3D, un
anticuerpo monoclonal F8 de control no mostró hipermutación somática
y presentaba una constante de asociación (K_{a}) de 2x10^{5}/M
con NP-Cap, y la proporción era de 0,29. Por otra
parte, anticuerpo monoclonal C6 bien madurado que presentaba una
K_{a} de 2x10^{7}/M (Furukawa K. et al., Immunity
11:329, 1999) presentaba una proporción de aproximadamente 1. La
totalidad de los sueros procedentes de ratones quiméricos mostraba
proporciones similares a las de C6; por lo tanto, la maduración de
afinidad de los anticuerpos antiNP avanzó en un grado similar en la
totalidad de los ratones quiméricos tras la inmunización con
NP_{34}-CGG.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque se reconstituyó el sistema inmunológico
en el ratón quimérico, resultó bastante difícil obtener una
cantidad suficiente de células B IgG^{+} Pna^{hi}, que son
populares como células de centro germinal derivadas de un único
ratón quimérico. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, tras la
inmunización con NP_{34}-CGG, se separaron
células de bazo IgM^{-}B220^{+} mediante citometría de flujo
utilizando un FACS Vantage, que se esperaba que seleccionase las
células B de memoria con cambio de isotipo.
La suspensión de células individuales procedente
de bazos de ratones quiméricos inmunizados con
NP_{34}-CGG se trató con 0,83% de cloruro amónico
para inducir la hemolisis. En algunos experimentos, las células T
también se trataron con anticuerpo antiThy1 (T24/40 y HO13.4) para
inducir la hemolisis, y después se trataron con un complemento de
conejo. Las células se tiñeron con anticuerpo antiCD45R/B220 marcado
con ficoeritrina (PE) (molécula de superficie celular, PharMingen)
o con antiIgM de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína
(FITC)
(ZYMED).
(ZYMED).
Se tiñeron las células peritoneales con antiCD5
marcado con biotina/estreptavidina marcada con FITC (pherMingen) y
antiCD45R(B220) marcado con PE.
Las células
CD45R(B220)^{+}IgM^{-},
CD45R(B220)^{+}IgM^{+} o
CD5^{+}CD45R(B220)^{+} se fraccionaron mediante
cito-
metría de flujo en un separador celular activado por fluorescencia (FACS) Vantage (Becton, Dickinson and
Company).
metría de flujo en un separador celular activado por fluorescencia (FACS) Vantage (Becton, Dickinson and
Company).
Además, a modo de experimento de control, se
obtuvieron células CD4+ y/o CD8+ a partir de timo tras la tinción y
separación.
Se preparó ARN total a partir de células de bazo
o peritoneales fraccionadas mediante la citometría anteriormente
indicada, utilizando TRIzol (reactivo de preparación de ARN, GIBCO
BRL) siguiendo las instrucciones del
fabricante.
fabricante.
Se preparó ADNc a partir de ARN total utilizando
oligo(dT) como cebador y transcriptasa inversa Superscript
II (GIBCO BRL). Cada una de las muestras de ADNc se amplificó
mediante PCR utilizando: cebador V_{H}186.2 de secuencia SEC ID
nº 9 y cebador de C\mu humano de secuencia SEC ID nº 10 para los
transgenes; y cebador VH186.2 de secuencia SEC ID nº 9 y cebador de
C\gamma1 de ratón de secuencia SEC ID nº 11 para los genes de Ig
de ratón endógenos, respectivamente.
| SEC ID nº 9: | 5'-CATGCTCTTCTTGGCAGCAAC-3' |
| SEC ID nº 10: | 5'-GCAGCCAACGGCCACGCTGC-3' |
| SEC ID nº 11: | 5'-GGCCGAATTCCATGGAGTTAGTTTGGG-3' |
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la reacción de PCR bajo las
condiciones siguientes: 95ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 1
minuto y 72ºC durante 1 minuto durante 30 ciclos. Los productos de
PCR de los transgenes y los genes endógenos de IgH de ratón se
analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa o se ligaron en
pCR-2.1 (Invitrogen Corporation) utilizando un kit
de clonación TA (Invitrogen Corporation) y se secuenciaron
utilizando el cebador de M13 mostrado como secuencia SEC ID nº 12
(-20, Takara Bio Inc.), el cebador inverso de M13 mostrado como
secuencia SEC ID nº 13 (Takara Bio Inc.) y el secuenciador de ADN
Hitachi modelo 5500 (Hitachi Ltd.).
Tal como se muestra en la figura 4, se
identificó la expresión de los fragmentos de anticuerpo que incluían
transgenes.
\newpage
Se estimó la frecuencia de mutación dividiendo
el total de mutaciones por el total de bases de secuencia
determinada. Se muestra el resultado en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para la hipermutación somática en transgenes, se
utilizaron cebadores para la hibridación con V_{H}186.2 o con
C\mu humano. Se realizó la clonación y secuenciación del ADNc
preparado mediante RT-PCR. Se muestra el resultado
en la Tabla 3. Se muestra en la figura 5 la distribución y
frecuencia de hipermutación somática entre constructos de transgén
en células B de bazo.
La amplificación específica de los transgenes
debido a la utilización combinada de los cebadores se observó
únicamente en las células de bazo de ratones quiméricos, pero no en
aquéllas procedentes de ratones C57BL/6 inmunizados con
NP_{34}-CGG. Además, se observó que la totalidad
de las secuencias presentaban una diversidad de uniones idéntica en
CDR3 que es una característica del ADN de A6 utilizado para
construir los transgenes.
Respecto al constructo génico pveh\Delta3'e,
se observaron cambios de nucleótidos resultantes de la hipermutación
somática en
V_{H}186.2-DFL16.1-J_{H}2,
aunque la frecuencia era baja. Se estimó que la frecuencia de
mutación era de 0,17% (Tabla 2).
El constructo génico pvehc3'E mostró una
distribución esencialmente similar de la hipermutación, aunque la
frecuencia era ligeramente mayor que la de pvehc\Delta3'E (Tabla
2).
En el caso de pvehc3'EHS3b/4, en el que HS3b/4
se añade posteriormente al constructo génico pvehc3'E de la
invención, la consecuencia fue la observación de un incremento
drástico de la frecuencia de hipermutación somática en el gen
V_{H}186.2-DFL16.2-J_{H}2
(figura 5). La totalidad de los clones de PCR secuenciados contenía
cambios de nucleótidos a pesar del hecho de que se habían
seleccionado aleatoriamente. Estos cambios de nucleótidos se
encontraron con una frecuencia elevada en el área circundante a CDR2
(región hipervariable 2) y a CDR3 (figura 5 y Tabla 2).
Los datos se obtuvieron de dos ratones
quiméricos, correspondiendo a cada constructo de transgén mostrado
en la figura 5, y presentaban una buena concordancia entre ellos.
Resultaba evidente una elevada frecuencia de hipermutación en
pvehc3'EHS3b/4. Sin embargo, la mutación se encontraba claramente
ausente en las células B1 peritoneales del mismo ratón quimérico
(figura 5).
\newpage
La Tabla 3 siguiente muestra las características
de las sustituciones identificadas en los transgenes.
Resulta evidente a partir de la comparación
entre los transgenes de IgH que la transición de bases y la
transversión de bases surgen con prácticamente la misma
frecuencia.
Además, en la secuencia de locus denominada
motivo RGYW (A/G, G, C/T, A/T) (Kabat E.A. et al., US
National Institutes of Health, Bethesda, M.D., U.S.A., página
1.394, 1991; Rogozin I.B. et al., Biochim. Biophys. Acta.
11:1171, 1992), se ha analizado la aparición de hipermutación
somática en el transgén V_{H}186.2. El gen de línea germinal
V_{H}186.2 (294 pb) contenía el motivo RGYW/WRCY (93 pb),
correspondiente a 32% del número total de bases, y la frecuencia de
hipermutación somática en este motivo aparentemente era de 34%, que
no es significativamente superior a la presente en otras regiones de
V_{H}.
En los ejemplos anteriores, se utilizó un
sistema de blastocistos RAG-2^{-/-} para preparar
ratones quiméricos que alojaban transgenes de IgH con diferentes
elementos de acción en cis.
El método de producción de la invención presenta
algunas ventajas respecto a las técnicas convencionales de
transgenes y resulta superior especialmente al transformar células
ES de bajo número de copia del transgén. De hecho, se estimó
mediante transferencia southern y PCR que el número de copia del
transgén en células ES transformantes era de 3 o inferior en la
mayoría de casos (Tabla 1).
Únicamente se encontraron números marginales de
hipermutación en pvehc\Delta3'E y se confirmó el resultado de que
los elementos de acción en cis, el promotor de V_{H} y E\mu/MAR
no resultaban suficientes para inducir una frecuencia elevada de
hipermutación. La adición de un fragmento intensificador 3' (4 kb) a
pvehc\Delta3'E (pvehc3'E) resultó en un incremento de
aproximadamente 30% de la frecuencia de hipermutación.
En la presente invención, se encontró que la
frecuencia de expresión de hipermutación inducida se incrementaba
mucho al introducir HS3b y HS4 en el extremo 3' del intensificador
3' de pvehc3'E, indicando que el constructo pvehc3'EHS3b/4 contiene
todos los elementos necesarios para que se produzca la hipermutación
somática. Los experimentos realizados clarifican que los motivos
responsables de la hipermutación de elevada frecuencia se
encuentran comprendidos dentro de una región HS3b/4 de 2,6 kb.
De esta manera, resulta posible proporcionar un
vector de expresión recombinante para la inducción de un mutante
aleatorio del transgén deseado. Además, resulta posible proporcionar
un procedimiento de producción de un mutante aleatorio de elevada
frecuencia obtenido mediante la expresión del vector de expresión
recombinante en células animales. También resulta posible
proporcionar un método para expresar un mutante aleatorio o un kit
para la producción de un mutante aleatorio que comprende el vector
de expresión recombinante y células animales.
<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD.
et al
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PRODUCTION PROCESS FOR MUTANT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> f001jp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 2001-191884
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 1381
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagaacca catgcgatct aagggatatt gggg
\hfill34
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 4
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\hfill33
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 5
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\hfill33
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\hfill33
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<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 7
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\hfill20
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<210> 8
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipcatgctcttc ttggcagcaa c
\hfill21
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<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgcagccaacg gccacgctgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 11
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\hfill27
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<210> 12
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: M13 forward primer
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctacagac acgggcc
\hfill17
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: M13 reverse primer
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaagcttg gtgtccctag tccttcatg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: promoter
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
Claims (6)
1. Procedimiento de producción de un mutante
aleatorio de gen exógeno, en el que se introduce un constructo de
ADN que comprende por lo menos los (a) a (d) siguientes en una
célula animal y se produce el mutante de gen exógeno en la célula
animal:
- (a)
- un promotor de V_{H}, en el que dicho promotor de V_{H} comprende la secuencia de SEC ID nº: 14;
- (b)
- un gen exógeno;
- (c)
- un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen J_{H} de cadena pesada y el gen C\mu; y
- (d)
- un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasaI HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN de las secuencias de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.
2. Procedimiento de producción según la
reivindicación 1, en el que la célula animal es una célula animal
de una línea de células B.
3. Procedimiento de producción según la
reivindicación 2, en el que la célula animal de una línea de células
B se deriva de una célula de una línea de linfocitos
pre-B.
4. Procedimiento de producción según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además obtener un
producto de expresión de dicho gen mutante mediante la expresión de
dicho mutante de gen exógeno en la célula animal.
5. Constructo de ADN para la producción de un
mutante de gen exógeno, que comprende por lo menos:
- (a)
- un promotor de V_{H}, en el que dicho promotor de V_{H} comprende la secuencia de SEC ID nº 14;
- (b)
- un gen exógeno;
- (c)
- un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen J_{H} de cadena pesada y el gen C\mu; y
- (d)
- un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasaI HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN de las secuencias de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.
6. Kit para el procedimiento de producción de un
mutante de gen exógeno o la producción de un producto de expresión
de un gen mutante, que comprende un vector que presenta:
- (a)
- un promotor de V_{H}, en el que dicho promotor de V_{H} comprende la secuencia de SEC ID nº 14;
- (b)
- un sitio de inserción de un gen exógeno;
- (c)
- un intensificador de intrón, en el que la secuencia de ADN puede regular la transcripción y contiene la secuencia de región no expresada situada entre los exones del gen J_{H} de cadena pesada y el gen C\mu; y
- (d)
- un intensificador que comprende los elementos hipersensibles a ADNasaI HS1, HS2, HS3b y HS4 del intensificador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de ADN de las secuencias de SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2,
con el fin de llevar a cabo la expresión de una
secuencia de ADN mutada que produce un mutante de gen exógeno.
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