KR100933796B1

KR100933796B1 - 변이체의 제조 방법

Info

Publication number: KR100933796B1
Application number: KR1020037016867A
Authority: KR
Inventors: 다카치카 아즈마
Original assignee: 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤; 다카치카 아즈마
Priority date: 2001-06-25
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2009-12-24
Also published as: DK1411119T3; DE60236660D1; JP2003000243A; US7655466B2; EP1411119B1; EP1411119A4; KR20040012969A; CA2451608A1; CN100497620C; EP1411119A1; WO2003000885A1; AU2002315884B2; CN1520459A; AU2002315884B8; US20040209268A1; MXPA04000066A; CA2451608C; ES2345653T3

Abstract

진핵 생물 프로모터, 외래 DNA 서열, 인트론 인핸서, 및 3'HS3/4 인핸서가 연결된 재조합 발현 백터를 동물 세포에 도입하여 발현시키는 것에 의한, 목적으로 하는 외래 유전자의 고빈도 랜덤 변이체의 생산 방법을 제공한다.

진핵 생물 프로모터, 외래 DNA, 인트론 인핸서, 재조합, 벡터, 유전자 도입, 변이체

Description

변이체의 제조 방법{PROCESS FOR CONSTRUCTING MUTANT}

본 발명은, 개량된 DNA 구축물을 동물 세포에 도입하는 것에 의한 신규의 변이체의 제조 방법, 상기 DNA 구축물, 및 유전자의 변이체 생산용 또는 변이체 유전자의 발현용 키트에 관한 것이다.

현존하는 생물은 오랜 시간 동안 돌연변이의 발현 및 변이체의 환경에 의한 선택에 의해 진화하여 왔다. 통상의 진화 속도는 지극히 완만하여서 많은 세대를 경과하여 진행하지만, 면역계의 항체 생산 세포는 돌연변이의 발현 및 항원에 의한 선택을 한 세대에서 완결하고, 획득한 기능을 다음 세대로 유전하는 것은 아니다. 이러한 면역계의 빠른 진화 속도는, 환경에 의존하는 병원성 미생물의 돌연변이에 대항하는 것이라고 해석되고 있다.

본 발명자는 먼저, 항체 유전자의 돌연변이는 프로모터와 인핸서에 의해 제어되어 있어, 어떤 유전자라도 항체 유전자의 프로모터와 인핸서에서 제어함으로써 돌연변이를 유도할 수 있다는 것을, 박테리아 유래의 효소인 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스를 제작하여 증명하였다(Azuma, T., et al., Int. Immunology, 5(2) 121-130(1992)).

이에 대해, 현재 널리 이용되고 있는 변이체 제조 방법은, 원하는 DNA 서열에 적당히 결실, 삽입 및/또는 부가 변이를 도입한 변이체를 제조하는 방법으로서, 부위 특이적 돌연변이 유발법(Site-specific mutagenesis, Zoller, et al., Nucleic Acid Res., 10, 6487-6500(1982); Zoller, et al., Methods in Enzymol., 100, 468-500(1983))에 의해, 어떤 길이의 DNA 염기를 부위 특이적으로 변환하는 방법으로, 인공적으로 합성한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 이용하는 미스매치 변이법(mismatch mutation)이 일반적이며, 돌연변이를 일으키고자 하는 부위 근방의 염기 서열에 임의의 변이를 가지는 상보적인 20 염기 정도의 올리고 뉴클레오티드를 합성하여, 목적으로 하는 DNA에 하이브리다이즈시킨 후, DNA 폴리머라제에 의해 나머지 DNA에 상보적인 DNA를 작성할 수 있고, 이와 같이 하여 원하는 부위에 원하는 돌연변이를 도입하는 것이 가능하다. 그러나, 상기 방법은 한번에 많은 변이체를 유도할 수 없다.

또한, 그밖의 돌연변이 발현계는 유전자에 손상을 주는 화합물의 존재하에서 특정한 기능의 소실 또는 발현을 조사하는 것(Myers, et al., Science, 232, 613-618(1986)), 또는 박테리아 등을 이용하는 방법이 있지만, 상기 본 발명자들이 실시한 돌연변이를 유도하는 방법과는 근본적으로 다르다.

그런데, 마우스와 인간의 면역글로불린 V 영역에 있어서의 변화(다양화)는, 생식 세포계로 분리되어 존재하는 V, D, 및 J 유전자 세그먼트의 조합 연결(combinatorial joining), 연결 중의 이들 세그먼트의 접합 부위에서의 핵산의 결실 또는 부가, 및 연결된 V-(D)-J 유전자의 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)에 의해 유발된다. 상기 체세포 과돌연변이는, 항체의 친화성 성숙(affinity maturation)과 관련되어 있고, T세포 의존성 항원(T cell- dependent antigen, TD)의 자극 후에 자주 관찰되고 있다(Bothwell, A.L.M., et al., Cell, 24, 625(1981): Gearhart, P.J., et al., Nature, 291, 29(1981): Griffiths, G.M., et al., Nature, 312, 271(1984): Maizels, N., et al., Cell, 43, 715(1985): Wysocki, L.T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1847(1986): Cumano, A., et al., EMBO. J., 5, 2459(1986): Berek, C., et al., Cell, 67, 1121(1991): Taketani, M., et al., Mol. Immunol., 32, 983(1995): Furukawa, k., et al., Immunity, 11, 329(1999): 2-10). 체세포 과돌연변이의 유도에 관여하는 cis-작용 엘리먼트는, κ쇄(O'Brien, R.L. et al., Nature, 326, 405(1987): Sharpe, M.J., et al., Eur. J. Immunol., 20, 1379(1990): Sharpe, M.J., et al., EMBO J., 10, 2139(1991): Betz, A.G., et al., Cell, 77, 239(1994): Yelamos, J., et al., Nature, 376, 225(1995): Peters, A., et al., Immunity, 4, 57(1996): 11-16), λ쇄(Klotz, E., et al., J. Immunol., 157, 4458(1996): 17) 및 H쇄 트랜스제닉 마우스를 이용하여 동정되고 있다(Durdik, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2346(1989): Sohn, J., et al., J. Exp. Med., 177, 493(1993): Tumas-Brundage, K.M. and Manser, T., J. Exp. Med., 185, 239(1997): 18-20).

전술한 바와 같이, 본 발명자는 V_H17.2.25(Loh, D. Y., et al., Cell, 33, 85(1983): Grosschedl, R. and Baltimore, D., Cell, 41, 885(1985): 22, 23) 및 J-C 인트론·인핸서(이하, Eμ라 약칭함)(Gillies, S.D., et al., Cell, 33, 715(1983): Banerji, J., et al., Cell, 33, 729(1983): 24, 25)/매트릭스 결합 영역(matrix attachment region, 이하, MAR이라 약칭함)(Forrester, W.C., et al., Science, 265, 1221(1994): 26)에 의해 제어되는 클로람페니콜·아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 구비한 유전자 재조합 마우스를 제작하였다. 그 결과, 체세포 과돌연변이가 CAT에서 검출되었지만, 그것은 V_H 프로모터 또는 Eμ/MAR 플랜킹(flanking)에서는 검출되지 않았다. 그러나, 변이의 빈도는 내인성의 V_H-D-J_H에서 관찰된 것의 약 1/10이었다. 이들 cis-작용 엘리먼트가 과돌연변이의 유도에 있어서 중요한 것이고, 3'의 Cγ, Cα 또는 Cα(3' 인핸서)(Pettersson, S., et al., Nature, 344, 165(1990): Dariavach, P., et al., Eur. J. Immunnol., 21, 1499(1991): Lieberson, R., et al., EMBO. J., 14, 6229(1995): 27-29)의 인핸서·플랜킹과 같은 다른 구성 요소가 높은 빈도의 체세포 과돌연변이에 대해 책임이 있을 수 있다는 것을 제안한다(Sohn, J., et al., J. Exp. Med., 177, 493(1993): Tumas-Brundage, K.M. and Manser, T., J. Exp. Med., 185, 239(1997): Giusti, A. M. and Manser, T., J. Exp. Med., 177, 793(1997): 19, 20, 30).

IgH 유전자에 있어서의 과돌연변이의 빈도를 증가시키는 중요한 물질을 특정하기 위하여, 본 발명자는 첸 등에 의해 개발된 RAG-2(Recombination Activating Gene: 유전자 재구성 단백-2) 불완전 배반포 상보성 시스템(deficient blastocyst complementation system)을 이용하여(Chen, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4528(1993):31), 3' 플랜킹 영역만이 다른 도입 유전자 구축물을 RAG-2 불완전 배반포 내에 마이크로인젝션하여, 배아 줄기 세포(embryonic stem cells, 이하, ES 세포라 약칭함)를 형질 전환시켰다. 그리고, 이러한 시스템으로 수득한 키메라 마우스를 T 세포 의존성 항원으로 면역시켰다.

그 결과, 도입 유전자의 V_H-D-J_H에 있어서의 체세포 과돌연변이의 빈도는, DNA 분해 효소Ⅰ 감수성 영역 3b(DNase Ⅰ sensitive region 3b: 이하, HS3b) 및/또는 HS4(Madisen, L. and Groudine, M., Genes Dev. 8, 2212(1994): Michaelson, J.S., et al., Nucleic Acids Res., 23, 975(1995): Arulampalam, V., et al., Immunol. Today, 18, 549(1997): 32-34)의 삽입에 의해, 랜덤한 체세포 과돌연변이를 유도하는 것을 발견하였다.

본 발명의 목적은, 개량된 진핵 생물 프로모터, 외래 DNA 서열, 인트론 인핸서 및 3'HS3/4인핸서가 연결된 DNA 구축물을 동물 세포에 도입하여, 랜덤한 변이체를 생산하는 방법을 제공하는데 있다. 또한, 상기 DNA 구축물을 동물 세포 내에서 발현시켜, 상기 변이체 유전자를 수득하는 방법을 제공하는데 있다. 또한, 그러한 변이체의 생산을 위한 DNA 구축물, 및 유전자 변이체의 생산용 또는 상기 변이체의 발현용 키트로 대표되는, 발명을 완성하였다. 또한, 동물 세포를 이용한 발현계에서 수득된 변이체 발현물은, 동물 세포에 대한 독성 스크리닝을 동시에 실시하게 된다.

본 발명은, 이하의 1항~20항을 제공하는 것이다.

1항. 외래 유전자의 랜덤한 변이체를 동물 세포 내에서 제조하는 방법으로서, 적어도 이하의 (a)~(d)를 포함하는 DNA 구축물을 동물 세포에 도입하여, 상기 동물 세포 내에 있어서, 외래 유전자의 변이체를 제조하는 방법:

(a) 프로모터,

(b) 외래 유전자

(c) 인트론 인핸서, 및

(d) DNaseⅠ 고 감수성 영역 중, HS3b 및/또는 HS4를 포함하는 인핸서.

2항. 제1항에 있어서, (d) 인핸서가 HS1 및 HS2를 더 포함하는 제조 방법.

3항. 제1항 또는 제2항에 있어서, (d) 인핸서가 적어도 서열번호:1 또는 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는 제조 방법.

4항. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (c), (d)의 DNA 서열이 면역 글로불린의 DNA 서열에서 유래한 제조 방법.

5항. 제2항에 있어서, (d) 인핸서가 HS1, HS2, HS3b 및 HS4를 포함하는 제조 방법.

6항. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 프로모터가 V_H 프로모터이며, (d) 인핸서가 서열번호:1 및 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는, 제조 방법.

7항. 제5항 또는 제6항에 있어서, DNA 구축물이 pvehc3'EHS3b/4인 제조 방법.

8항. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포가 B 세포계 동물 세포인 제조 방법.

9항. 제8항에 있어서, B 세포계 동물 세포가 프리-B 림프구계 세포(pre-B lymphocyte line cell) 유래인 제조 방법.

10항. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득한 외래 유전자의 변이체를, 상기 동물 세포 내에서 발현시켜, 변이체의 유전자 발현물을 수득하는 방법.

11항. 외래 유전자의 변이체를 생산하기 위한 DNA 구축물로서, 적어도 이하의 (a)~(d)를 포함하는 DNA 구축물:

(a) 프로모터,

(b) 외래 유전자,

(c) 인트론 인핸서, 및

12항. 제11항에 있어서, (d) 인핸서가, HS1 및 HS2를 더 포함하는 DNA 구축 물.

13항. 제11항 또는 제12항에 있어서, (d) 인핸서가 적어도 서열번호:1 또는 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는 DNA 구축물.

14항. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (a), (c), (d)의 DNA 서열이 면역 글로불린의 DNA 서열에서 유래한 DNA 구축물.

15항. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 인핸서가 HS1, HS2, HS3b 및 HS4를 포함하는 DNA 구축물.

16항. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 프로모터가 V_H프로모터이며, (d) 인핸서가 서열번호:1 및 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는 DNA 구축물.

17항. 제11항 또는 제12항에 있어서, DNA 구축물이 pvehc3'EHS3b/4 인 것을 특징으로 하는 DNA 구축물.

18항. 외래 유전자의 변이체를 생산하는 변이된 DNA 서열 발현을 달성하기 위한

(a) 프로모터,

(b) 외래 유전자 삽입 가능 부위,

(c) 인트론 인핸서, 및

(d) DNaseⅠ 고 감수성 영역 중, HS3b 및/또는 HS4를 포함하는 인핸서

를 가지는 벡터를 포함하는, 외래 유전자 변이체 제조용 또는 변이체의 유전 자 발현물 생산용 키트.

19항. 제18항에 있어서, (d) 인핸서가 HS1 및 HS2를 더 포함하는 키트.

20항. 서열번호:14의 서열을 가지는 V_H17.2.25 프로모터.

본 발명에 따르면, 항체 유전자의 프로모터와 인핸서에서 제어되는 계에 외래 유전자를 도입함으로써, 높은 빈도로 랜덤하게 돌연변이된 유전자군을 수득할 수 있고, 넓게는 펩티드나 단백질에 돌연변이를 도입하는 동물 세포계 변이체 생산 방법이 제공되어, 천연에 존재하는 단백질의 원하는 기능 개조·전환을 시험하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 항생제 내성균에 대한 기능이 향상된 새로운 타입의 항생제의 개발, 농약의 개발, 또는 인터페론, 성장 호르몬 등의 기능이 향상된 개량 팹티드 의약품의 개발이 가능해진다. 또한, 동물 세포를 사용함으로써 동물 세포에 대한 독성 스크리닝을 동시에 실시하는 것이 가능하며, 1차 독성이 검사되어, 기능적으로 향상된 작용을 가지는 각종 펩티드 산물을 신속하게 제작할 수 있게 된다.

이하, 본 명세서에 있어서의 아미노산, 펩티드, 염기 서열, 핵산 등의 약호에 의한 표시는, IUPAC-IUB의 규정[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur.J.Biochem., 138:9(1984)], 「염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드 라인」(특허청편) 및 해당 분야에 있어서의 관용 기호를 따른 것이다.

또한, DNA의 합성, 외래 유전자를 함유하는 DNA 구축물(예를 들면, 발현 백 터)의 구축, 상기 DNA 구축물에 의해 형질 전환된 숙주 세포 및 숙주 세포가 분비하는 발현 단백의 제조 방법 등은, 일반적인 유전자 공학적 수법[Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989); 속 생화학 실험 강좌「유전자 연구법Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ」, 일본 생화학회 편(1986)] 또는 유전자 재조합 기술[예를 들면, Science, 224, 1431(1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692(1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990(1983) 등 참조]에 따라 용이하게 제조·취득할 수 있다.

본 발명에 있어서 변이체란, 외래 유전자의 DNA 서열이 랜덤하게 변이된 DNA 서열로 이루어진 유전자, 또는 랜덤하게 변이된 유전자에 의해 코드되는 변이된 아미노산 서열을 가지는 발현 산물을 말한다.

본 발명의 동물 세포에서의 변이체의 생산은, 원하는 단백을 코드하는 유전자를 포함하는 숙주 세포 중으로 발현 가능한 본 발명에 의해 제공되는 변이체 유도용 DNA 구축물(재조합된 DNA)을 작성하여, 세포에 도입함으로써 수득할 수 있다.

본 명세서에서 「DNA 구축물을 동물 세포에 도입」이란, 외래 유전자를 동물 세포의 게놈에 삽입하는 것을 의미한다.

또한, 변이체의 발현 산물은, 상기 외래 유전자의 변이체를 포함하는 형질 전환체를 배양한 후, 수득되는 배양물로부터 회수하는 것에 의해 행하여진다.

상기 본 발명에 의해 제공되는 변이체 유도용 DNA 구축물은, 적어도 (a) 프로모터, (b) 외래 유전자, (c) 인트론 인핸서, 및 (d) DNaseⅠ 고 감수성 영역 중, HS1, HS2에, HS3b 및/또는 HS4를 포함하는 인핸서로 이루어진 구조를 가지며, 일반 적인 유전자 공학적 수법에 의해 용이하게 생산·취득할 수 있다.

본 발명에 있어서의 각 유전자(DNA)의 제조는, 적당한 기원 유래의 것을 사용하여도 좋고, 화학적으로 합성하여도 좋다.

구체적으로는, DNA의 합성은, 포스포아미디트법(phosphoramidite method) 또는 트리에스테르법에 의한 화학 합성에 의한 것일 수도 있고, 시판되어 있는 자동 올리고뉴클레오티드 합성 장치로 행할 수도 있다. 이중 가닥 단편은, 상보 가닥을 합성하고 적당한 조건하에서 상기 가닥을 함께 어닐링시키거나, 적당한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보 가닥을 부가함으로써, 화학적으로 합성한 단일 가닥 생성물로부터 수득할 수도 있다.

또한, 각 유전자는 상기한 바와 같은 DNA의 합성에 의하거나, 상기 유전자를 함유하는 벡터 또는 상기 유전자가 발현되어 있는 적당한 기원으로부터, 일반적인 방법에 따라 cDNA 라이브러리를 제조하고, 상기 라이브러리로부터, 상기 유전자에 대해 특유한 적당한 프로브 또는 항체를 이용하여 원하는 클론을 선택함으로써 실시할 수 있다[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613(1981); Science, 222, 778(1983) 등].

상기에 있어서, cDNA의 기원으로서는, 각 유전자가 발현되는 각종의 세포, 조직이나, 이들에서 유래된 배양 세포 등이 예시된다. 또한, 이들로부터의 전체 RNA의 분리, mRNA의 분리 또는 정제, cDNA의 취득과 그의 클로닝 등은 모두 일반적인 방법에 따라서 실시할 수 있다. 또한, cDNA 라이브러리는 시판되어 있어, 본 발명에서는 그러한 cDNA 라이브러리, 예를 들면 클론테크사(Clontech Lab. Inc.) 등에 의해 시판되고 있는 각종 cDNA 라이브러리 등을 이용할 수도 있다. 상기 유전자를 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법도, 특별히 제한되어 있지 않고, 통상의 방법을 따를 수 있다.

구체적으로는, 예를 들면, cDNA에 의해 생산되는 단백질에 대하여, 상기 단백질의 특이 항체를 사용한 면역적 스크리닝에 의해 대응하는 cDNA 클론을 선택하는 방법, 목적하는 DNA 서열에 선택적으로 결합하는 프로브를 이용하여 플라크 하이브리다이제이션(plaque hybridization), 콜로니 하이브리다이제이션(colony hybridization) 등이나 그들의 조합 등을 예시할 수 있다.

여기에서 사용할 수 있는 프로브로서는, 각 유전자의 염기 서열에 관한 정보를 바탕으로 하여 화학 합성한 DNA 등을 일반적으로 사용할 수 있지만, 이미 취득한 본 발명의 유전자나 그의 단편도 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 외래 유전자의 염기 서열 정보를 기초로 하여 설정한 센스 프라이머, 안티센스 프라이머를 스크리닝용 프로브로서 이용할 수도 있다.

상기 프로브로서 사용할 수 있는 뉴클레오디트 서열은, 각 유전자의 DNA 서열에 대응하는 부분 뉴클레오티드 서열이며, 적어도 15개의 연속한 염기, 바람직하게는 20개의 연속한 염기, 더욱 바람직하게는 30개의 연속한 염기, 특히 바람직하게는 50개의 연속한 염기를 가지는 것도 포함되고, 또는, 상기 서열을 가지는 양성 클론 그 자체를 프로브로서 사용할 수도 있다.

유전자의 취득 시에는, PCR법[Science, 230, 1350(1985)]에 의한 DNA/RNA 증폭법을 바람직하게 이용할 수 있다. 특히, 라이브러리로부터 전체 길이의 cDNA를 수득하기 어려운 경우에는, RACE법[Rapid amplification of cDNA ends; 실험 의학, 12(6), 35(1994)], 특히 5'-RACE법[M.A.Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998(1988)] 등의 채용이 바람직하다.

상기 PCR법의 채용시에 사용하는 프라이머는, 유전자의 서열 정보를 기초로하여 적당히 설정할 수 있고, 이것은 일반적인 방법에 따라서 합성할 수 있다. 한편, 증폭시킨 DNA/RNA 단편의 단리 정제는, 상기한 바와 같은 일반적인 방법을 따를 수 있고, 예를 들면, 겔 전기 영동법 등을 따르는 것이 좋다.

또한, 상기에서 수득할 수 있는 유전자 또는 각종 DNA 단편은, 일반적인 방법, 예를 들면, 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463(1977)]이나, 막삼 길버트법[Methods in Enzymology, 65, 499(1980)] 등에 따라, 또는 간편하게는 시판하는 시퀀스 키트 등을 사용하여, 그의 염기 서열을 결정할 수 있다.

(b) 원하는 외래 유전자

상기 DNA 구축물의 구성 요소에 있어서, (b) 외래 유전자로 사용할 수 있는 DNA는, 변이체를 유도하기 위해 기초가 되는 원하는 유전자, 또는 발현 단백으로부터 수득한 외래 DNA 서열을 이용하거나, 그러한 DNA 서열을 합성하여도 좋다. 또한, 본 발명의 변이체의 제조 방법에 사용할 수 있는 외래 유전자의 길이는, 일반적으로 4Kb까지의 길이, 보다 바람직하게는 3Kb 이하의 길이, 더욱 바람직하게는 2Kb 전후의 길이를 바람직하게 예시할 수 있지만, 4Kb를 초과하는 길이의 외래 DNA 서열을 이용할 수도 있다.

외래 유전자로서는, 유전자의 발현에 의해 생물 활성을 가지는 유전자이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 성장 호르몬(GH), 인슐린, 인터페론, 에리스로포이에틴(erythropoietin) 등이 예시된다.

또한, 외래 유전자가 숙주 세포의 게놈에 삽입되었는지 등을 확인하기 쉽도록 하기 위하여, 소위 마커가 되는 유전자의 DNA 서열을 상기 (b) 외래 유전자의 DNA 서열에 결합시켜 두는 것도 가능하다.

이와 같이하여 수득할 수 있는 외래 유전자에 의하면, 예를 들면 상기 유전자의 일부 또는 전부의 염기 서열을 이용함으로써, 개체 또는 각종 조직에 있어서의 외래 유전자 및 그의 변이체의 발현의 유무를 특이적으로 검출할 수 있다.

그러한 검출은 일반적인 방법에 따라서 행할 수 있고, 예를 들면 RT-PCR[Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S.Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27(1991)]에 의한 RNA 증폭 또는 노던 브롯팅 해석[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab.(1989)], in situ RT-PCR[Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166(1993)]이나 in situ 하이브리다이제이션 등을 이용한 세포 수준에서의 측정, NASBA법[Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92(1991)] 및 그밖의 각종 방법을 들 수 있다. 바람직하게는, RT-PCR에 의한 검출법을 들 수 있다.

상기 외래 유전자의 DNA 단편은, 적당한 제한 효소에 의해 절단된 제한 단편으로서 상기 DNA 구축물의 (b) 외래 유전자로 제공된다.

(a) 프로모터

이어서, 상기 DNA 구축물의 구성 요소에 있어서, (a) 프로모터로서 이용할 수 있는 프로모터는, 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region) 프로모터(V_H 프로모터), SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 아데노바이러스의 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 폴리오머, B형 간염 바이러스와 같은 바이러스 유래의 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 히트 쇼크(heat shock) 프로모터, SRα 프로모터, 또는 포유 동물 세포에 효과적인 기타 프로모터 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서는, V_H 프로모터, 보다 상세하게는 V_H17.2.25의 프로모터(Gillies, S.D., et al., Cell, 33, 715(1983): Banerji, J., et al., Cell, 33, 729(1983))를 보다 바람직하게 예시할 수 있다.

또한, 상기 프로모터는, 예를 들면 네오마이신 내성 유전자, 또는 테트라마이신 내성 유전자를 유도할 수 있는 프로모터를 포함하여도 좋다.

또한, 상기 프로모터는 2 이상이 연속된 연결 형체이어도 좋다,

이들 각종 프로모터의 DNA 서열은 알려진 것이며, 그러한 정보를 이용할 수 있다.

(c) 인트론 인핸서

인트론 인핸서는, 중쇄 유전자의 J_H 유전자와 Cμ 유전자의 엑손 사이를 개재하는 비발현 영역의 서열을 포함하는, 전사를 조절하는 DNA 서열이다. (c) 인트 론 인핸서로서는, 면역 글로불린의 중쇄 인핸서(Cμ 인핸서)와 캅파쇄 인핸서(κ 인핸서)를 들 수 있다.

(d) 데옥시리보뉴클레아제Ⅰ(DNaseⅠ) 감수성 영역

DNaseⅠ감수성 영역이란, 단리된 세포의 핵에 DNaseⅠ을 저농도로 처리할 경우 절단되는 영역이며, 면역 글로불린 중쇄 유전자의 경우에는, HS1, HS2, HS3b 및 HS4의 존재가 알려져 있다. 여기서, HS3b/4란, HS3b 및 HS4의 둘 다 또는 어느 하나이다. 본 발명에 있어서는, HS3b 영역 및/또는 HS4 영역을 포함하는 것을 특징으로 하고, 바람직한 실시 태양으로서는, HS3b 영역 및/또는 HS4 영역에 더하여 HS1 및 HS2(이들을 「3'E」라 함)를 포함한다. 여기서, 3'EHS3b/4는, 리베손 등(Lieberson, R., et al., EMBO. J., 14, 6229(1995))에 개시되어 있는 3' 인핸서의 4.0kb로 이루어진 XbaⅠ 단편과, 메디슨 등에 개시되어 있는 MP11(Madisen, L., et al., Genes Dev., 8, 2212(1994))로부터의 1182bp의 HS3 및 1381bp로 이루어진 HS4의, 인트론 서열을 가지지 않는 서열을 예시할 수 있다.

각 유전자의 연결(DNA 구축물의 제조)

본 발명의 DNA 구축물은 상기 각 유전자를, 예를 들면, 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 수득할 수 있고, 일반적인 방법에 따라 제조할 수 있지만, 예를 들면, 적당한 항생 물질 내성 유전자를 가지는 벡터에 각 요소를 삽입하는 것에 의해 수득하는 것도 가능하다. 구체적으로는, 상기 DNA 구축물은, 임의의 항생 물질 내 성 유전자를 가지는 동물 세포계에 사용되는 벡터에, 임의의 제한 효소로 벡터 클론, 게놈 DNA, 또는 플라스미드 등으로부터 잘라내거나 또는 DNA 합성한, 프로모터, 외래 유전자, 인트론 인핸서, DNA 분해 효소Ⅰ 감수성 영역(HS3b 및/또는 HS4의 DNA 서열을 포함하고, 필요에 따라 3'E로 이루어진 인핸서를 더 포함)을 삽입함으로써 구축할 수 있다.

구체적으로는, 제한 효소, 리가아제 등을 이용한 일반적인 수법에 의해 벡터 내에 삽입할 수 있다.

또한, 원하는 재조합 발현 벡터에 있어서, 인트론 인핸서 및 3'EHS3b/4 인핸서는 5' 말단에서 3' 말단 방향으로 각각 구축하거나, 역으로 3' 말단 방향에서 5' 말단 방향으로 각각 구축하거나, 또는, 5' 말단에서 3' 말단 방향과 그 역인 3' 말단에서 5' 말단 방향으로 엇갈리게 구축하여도 좋다.

또한, 상기 DNA 구축물의 구축에 있어서, 프로모터와 3'EHS3b/4 인핸서와의 사이에 외래 DNA를 내부측에 포함하는 양자의 거리는, 0.1kb에서 100kb, 바람직하게는 1kb에서 10kb, 더욱 바람직하게는 2kb에서 5kb의 거리인 것이 바람직하다.

바람직한 발현 벡터로서는, 레트로 바이러스 백터를 예시할 수 있다. 보다 구체적으로는, pIND(Invitrogen 사), pcDNA 3.1/His(Invitrogen 사), pEGFP-N, -C(Clontech 사) 등을 들 수 있다.

상기 DNA 구축물의 (a) 프로모터 및 (c) 인트론 인핸서를 포함하는 일예로서는, 본 발명자들의 V_H 프로모터와 인트론 인핸서를 포함하는 발현 벡터를 예시할 수 있다(Azuma, T., et al., Int. Immunology, 5(2) 121-130(1993)). 이것을 이용하여, DNA 구축물을 제조하는 것이 바람직하다.

상기에 있어서, 프로모터와 인트론 인핸서를 포함하는 발현 벡터에 있어서는, 통상 도입되는 외래 유전자에 대하여 프로모터를 5' 상류에 위치시키고, 계속하여 외래 유전자, 인트론 인핸서의 순서로 구축한다.

본 발명의 외래 유전자를 포함하는 DNA 구축물을 제조하기 위한 벡터로서, 상기 벡터를, 프로모터, 원하는 외래 유전자의 삽입을 위한 클로닝 싸이트, 변이를 유도하기 위해 필요한 1 이상의 인핸서(특히 면역 글로불린 인핸서이며, 인트론 인핸서) 및 DNA 분해 효소Ⅰ 감수성 영역을 포함하도록 변형하면, 외래 유전자 변이체 제조용 또는 변이체의 유전자 발현물 생산용 키트의 DNA 구축물로서 유용하다.

본 발명의 DNA 구축물은, 환상 DNA인 것이 좋고, 선상 DNA이어도 좋다.

본 발명의 DNA 구축물인지의 확인은, 예를 들면, 제한 효소로 절단하여 전기 영동하거나, PCR, 서던 하이브리다이제이션, 시퀀싱 등을 조합하는 등의 일반적인 수법에 의해 행할 수 있다.

변이체의 제조 방법

외래 유전자를 생산하는 방법으로서는, 우선, 상기 방법에 의해 수득할 수 있는 DNA 구축물을 적당한 숙주 세포의 세포 내에 도입하여, 상동 재조합체(homologous recombinant)를 수득한다.

상기 숙주 세포로서는, 포유 동물, 효모, 식물 세포 등의 세포로 이루어진 진핵 생물이 예시되지만, 바람직하게는, 포유 동물의 동물 세포가 좋고, 상기 세포로서는, 변이를 효과적으로 하도록 할 수 있는 결정 인자와 함께 형질 전환되는 것으로 수립된 세포주, 원숭이 세포인 COS 세포(Cell, 23, 175(1981)), 차이니즈 햄스터 난소 세포, Hela 세포, RatⅡ 섬유아세포, 소화관 상피 세포 및 그의 디히드로폴레이트 리덕타아제 결손주(dihydrofolate reductase defectives)[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216(1980)] 등을 바람직하게 이용할 수 있지만, 특히 수립된 세포주의 경우는, 예를 들면, T 세포 또는 B 세포계 동물 세포, 특히 프리-B 세포계 동물 세포가 바람직하고, 보다 구체적으로는, J558 세포, J558L 세포가 예시되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 효모의 세포를 이용하는 경우에는, 사카로마이세스(Saccaromyces) 속 효모 세포 등을 이용할 수 있다. 또한, 동물 생체의 세포가 숙주 세포의 대상이 되어도 좋다.

숙주 세포의 게놈에 외래 유전자를 도입한 결과, 본 발명의 DNA 구축물에 의해 형질 전환된 형질 전환체를 수득할 수 있다.

이러한 본 발명의 DNA 구축물의 세포에의 도입은, 예를 들면, 전기 천공(electroporation)법, 인산 칼슘 공침(calcium phosphate coprecipitation)법, 리포좀 법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션법, 바이러스 형질 도입(virus transduction) 등에 의해 비롯되고, 세포에 DNA를 도입하는 해당 분야에 이미 알려져 있는 각종의 방법에 따라 행할 수 있다. 바람직하게는, 전기 천공법이 좋다.

본 발명의 DNA 구축물을 도입하는 세포로서는, 수정란, 배, 생식계열의 세포 등을 들 수 있다. 또한, 세포에의 도입은, 일반적인 방법에 따라 행할 수 있다.

변이체가 수득되었는지의 확인은, 공지의 방법, 예를 들면, 랜덤 시퀀스법, 또는 외래 유전자의 발현 산물의 활성을 측정하고, 외래 유전자가 가지는 활성과 다른 활성을 가지는 것을 선택함으로써 확인할 수 있다. 또는, 표준적인 활성과 그 정도에 있어서, 활성이 높은지 또는 낮은지에 의해서도 선택할 수 있다.

또한, 목적으로 하는 외래 DNA로 형질 전환된, 랜덤하게 변이 도입된 유전자를 가지는 세포는, 그 자체의 단리된 상태로도 인간의 외인성 유전자가 관련된, 향상된 기능을 가지는 개량 펩티드가 되고, 질병의 상태를 개선하기 위한 의약이나, 치료 연구를 위한 모델계로서 이용하는 것도 가능하다.

수득할 수 있는 형질 전환체는 일반적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 상기 배양의 결과로서, 외래 유전자의 변이체에 의해 코드된 본 발명의 목적 단백질이, 형질 전환체의 세포 내, 세포 외 또는 세포 막 상에서 발현, 생산(축적, 분비)된다.

상기 배양에 이용할 수 있는 배지로서는, 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있고, 배양도 숙주 세포의 생육에 적합한 조건하에서 실시할 수 있다.

이와 같이하여 수득할 수 있는 본 발명의 재조합 단백질은, 원하는 바에 따라, 그의 물리적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종의 분리 조작[「생화학 데이터북Ⅱ」, 1175-1259 페이지, 제1판 제1쇄, 1980년 6월 23일 주식회사 동경 화학 동인 발행; Biochemistry, 25(25), 8274(1986); Eur.J.Biochem., 163, 313(1987) 등 참조]에 의해 분리, 정제할 수 있다.

상기 방법으로서는, 구체적으로는, 통상의 재구성 처리(reconstitution processing), 단백 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 삼투압 쇼크(osmotic shock)법, 초음파 파쇄, 한외 여과, 분자체 크로마토그래피(molecular sieve chromatography; gel filtration, 겔 투과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합을 예시할 수 있고, 특히 바람직한 방법으로서는, 본 발명의 단백질에 대한 특이적인 항체를 결합시킨 컬럼을 이용한 어피니티 크로마토그래피 등을 예시할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 재조합 발현 백터를 이용하여 동물 세포 내에서 상기 재조합 발현 벡터를 발현시켜 외래 DNA를 수득할 수 있고, 외래 DNA에 의해 코드된 랜덤한 변이체를 생산할 수 있다. 상기 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의해 일어나는 랜덤한 변이체의 빈도는, 적어도 약 1×10^-4~1×10^-3/bp/생성이다.

또한 본 발명은, 유도된 DNA 서열 또는 유전자 변이체의 발현을 달성하기 위한 외래 DNA 또는 외래 유전자 삽입 가능 부위를 가지는 상기 재조합 벡터를 보유하는 진핵 세포, 특히 동물 세포를 포함하는 변이체 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 변이체 제조 방법에 따르면, 예를 들면 항균 작용을 가지지만 동물 세포에 유해하기 때문에 사용 불가능한 펩티드를 개량하여, 동물 세포에 대해 독성이 낮고, 항균 활성이 보다 높은 항균 펩티드를 개조하는 방법을 제공할 수 있 다. 동시에, 본 발명의 변이체 제조 방법에 의해, 천연에 존재하는 인터페론이나 성장 호르몬 등의 단백질의 기능 개조·전환을 시험해 보는 것이 가능하고, 또한 농약의 개발이나 의약품 등의 기능 향상을 위한 유용한 방법이 제공된다.

또한, 본 발명은, 외래 유전자 변이체 제조 또는 변이체의 유전자 발현물의 생산을 위한 외래 DNA 또는 외래 유전자 삽입 가능 부위를 가지는 DNA 구축물을 포함하는 키트를 제공한다. 구체적으로는, 상기 DNA 구축물은,

(a) 프로모터,

(b) 외래 유전자 삽입 가능 부위

(c) 인트론 인핸서, 및

(d) DNaseⅠ 고감수성 영역 중, HS3b 및/또는 HS4, 및 필요에 따라 HS1, HS2를 더 포함하는 인핸서를 포함한다.

본 발명의 변이체 생산용 키트에 의해, 예를 들면 동물 세포에 저독성이고, 개량된 보다 높은 항균 활성을 가지는 항균 펩티드, 또는 천연에 존재하는 인터페론이나 성장 호르몬 등의 단백질 의약품의 기능 향상품을 제공하는 것이 가능하다.

도1 중 A는 본 발명의 키메라 마우스를 생산하기 위해 사용된 IgH 변이체 도입 유전자 구축물의 모식도를 나타낸 도면이다.

도1 중 B는 cDNA를 증폭하기 위해 사용된 프라이머의 위치와 방향이 화살표에 의해 표시되어 있다.

도2는 도1에 나타낸 IgH 변이체 유전자로 형질 전환된 J558L 세포로부터 인간 Cμ를 생산하는 항 NP 항체의 생산을 나타내는 도면이다. 12시간 배양한 형질 전환된 J558L 세포(1×10⁶ 세포/㎖)의 상청은, 항체 생산을 평가하기 위하여 NP₉-BSA로 도포된 플레이트를 사용하는 ELISA의 대상이 되었다.

도3a는 키메라 마우스 A4-3, 2-1, 및 2-3에 있어서의 ES 세포에 의한 RAG-2^-/-마우스 면역 시스템의 재구축을 나타내는 도면이다. 이전 면역 마우스에 있어서의 마우스 IgM의 수준은, 랫 항-마우스 IgM 모노클로날 항체 및 POD 표식 염소 항-마우스 IgM 항체로 도포된 플레이트를 사용하는 ELISA에 의해 측정되었다.

도3b는 이전 면역 또는 면역 혈청에 있어서의 인간 IgM의 수준을, 마우스 항-인간 IgM 항체 및 POD 표식 염소 IgM 항체로 도포된 플레이트를 이용하여 측정한 도면이다. 면역 혈청은 TD로서 참조하였다.

도3a에 있어서는 Balb/c 마우스 및 RAG-2^-/-마우스로부터의 항혈청을, 도3b에 있어서는 그들의 혈청과 J558L의 배양 상청을 더한 것을 대조군으로서 사용하였다.

도3c는 항 NP₉-BSA 항체로 도포된 플레이트에 대한 항 NP 항체의 결합을 분석한 도면이다. 결합 항체는, POD 표식 항-마우스 IgG를 이용하여 측정하였다.

도3d는, NP₁-BSA 또는 NP₁₂-BSA로 도포된 플레이트에 대한 키메라 마우스로부터의 항혈청의 결합 비율을 나타내는 도면이다.

도4는, RT-PCR에 의한 도입 유전자의 특이적 증폭을 나타내는 도면이다. NP₃₄-CGG로 면역된 키메라 마우스로부터의 IgM-B 220⁺ 비장 세포의 mRNA로부터 조제된 cDNA는 PCR에 의해 증폭되었다. 단지 유일하게 키메라 마우스만이 도입 유전자에 상응하는 밴드를 나타내고(레인 1~6), C57BL/6 마우스는 밴드를 나타내지 않았다(레인7). J558L 세포 형질 전환체(레인8) 및 비형질 전환체(레인9)도 또한 양성 또는 음성 대조군으로서 나타낸다.

도5는, 비장 IgM-B220⁺세포(A) 및 복부 B1세포(B)로부터의 도입 유전자 구축물에 있어서의 체세포 과돌연변이의 위치와 빈도를 비교한 도면이다.

2마리의 키메라 마우스로부터의 도입 유전자 구축물에 있어서, 체세포 과돌연변이의 위치 및 빈도를 A에 나누어 나타낸다. 하부에 나타낸 크기는, Kabat의 방법에 따라 숫자가 부여된 아미노산 위치를 나타내는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 실시예를 제시하지만, 본 발명은 그것 등으로 제한되는 것은 아니다.

실시예1

1) IgH 도입 유전자의 구축

상이한 3' 플랜킹 영역을 가지는 인간 Cμ를 구비하고 있는 Ig의 H쇄(IgH)를 구축하였다.

V _H 프로모터를 포함하는 단편 및 Eμ/MAR을 포함하는 단편의 입수

제한 효소 KpnⅠ및 ApaⅠ사이트를 가지는 VH 17.2.25 프로모터(0.55kb: 서열번호14)를 포함하는 단편 및 제한 효소 XhoⅠ및 SalⅠ사이트를 가지는 Eμ/MAR(1kb)를 포함하는 또다른 단편을, CAT 유전자 도입 마우스를 제조하기 위하여 본 발명자가 미리 작성한 구축물[V_H 17.2.25 유래의 V_H 프로모터 및 인트론 인핸서(J-C 인트론 인핸서/매트릭스 부착 영역(Eμ/MAR이라 약칭))에 의해 제어되는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를, pBluescripti SK(+)의 제한 효소 XbaⅠ 및 XhoⅠ 사이트 사이에 구비하고 있는 플라스미드]로부터 PCR로 클론하였다(Azuma, T., et al., Int. Immunology, 5(2) 121-130(1993)).

V _H -D-J _H 유전자 단편의 입수

제한 효소 ApaⅠ및 XhoⅠ사이트를 포함하는 재편성된 V_H-D-J_H 유전자 단편(2.0kb)도, C57BL/6 마우스(도쿄 애니멀 센터에서 구입)로부터 수득한 항(4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸 모노클로날 항체(이하, 항 NP 모노클로날 항체)를 생산하는 하이브리도마(hybridoma)인 A6 유래의 게놈 DNA를 이용하여, PCR로 클론하였다(Taketani, M., et al., Mol. Immunity, 32, 983(1995): Furukawa, K., et al., Immunity, 11, 329(1999)).

이들을 BluescriptⅡSK(스트라타진 사제) 내에 V_H 프로모터, V_H-D-J_H 유전자, Eμ/MAR의 순서로 클론하였다.

인간 Cμ 유전자의 입수

인간 Cμ 유전자의 6.9kb의 XbaⅠ단편을 CH.H.Igμ-24 파지 클론(Takahashi, N., et al., Nucleic Acids Res., 8, 5983(1980); Health Science Research Resources Bank)으로부터 수득하였다.

3' 인핸서의 입수

3' 인핸서(이하, 3'E 라 약칭함)의 XbaⅠ단편(4.0kb)를 더 포함하는 플라스미드(Lieberson, R., et al., EMBO. J, 14, 6229(1995))를, 하버드 의학 대학의 마니스씨 및 알트씨로부터 입수하였다. 서열번호1로 표시되는 HS3b(1.2kb) 및 서열번호2로 표시되는 HS4(1.4kb)를 포함하는 단편은, 서열번호3~6으로 표시되는 프라이머 및 B 세포 림프종의 MPC11(Madisen, L. and Groudine, M., Genes Dev. 8, 2212(1994)) 유래의 게놈 DNA를 이용하여 PCR로 클론하였다. 한편, 각 프라이머 서열 중의 SpeⅠ및 XbaⅠ 제한 효소 인식 서열 부위를 밑줄로 표시하였다.

서열번호3: HS3-S: 5'-TCTAGAACCACATGCGATCTAAGGGATATTGGGG-3'

서열번호4: HS3-항 SpeⅠ: 5'-CAGGACTAGTGATCATTGAGCTCCGGCTCTAAC-3'

서열번호5: HS4-S XbaⅠ: 5'-CTAGTCTAGACTGCAGACTCACTGTTCACCATG-3'

서열번호6: HS4-항 SpeⅠ: 5'-GTGGACTAGTAAGCTTGGAGTTAGGTGGGTAGG-3'

이들 수득한 단편을, 3'E의 3' 말단에 HS3b 및 HS4의 순서로 결합시켰다. 3'E, HS3b 및 HS4는 어떤 Ig 인트론 서열의 삽입없이 일렬로 연결되었다.

상기에서 수득한 각 단편을 이용하여, 유전자 재조합 기술로 pvehcΔ3'E(12kbp), pvehc3'E(16kbp) 및 pvehc3'EHS3b/4(19kbp)의 3종의 구축물을 수득하였다.

2) 도입 유전자의 구조적 특징

본 발명에 있어서 수득한 도입 유전자 구축물은, (4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸 헵텐(Bothwell, A.L.M., et al., Cell, 24, 625(1981))에의 응답에 관련된 우성 V_H인 마우스 V_H186.2에 의해 코드된 V 영역을 포함한다.

항(4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마인 A6(Taketani, M., et al., Mol. Immunity, 32, 983(1995): Furukawa, K., et al., Immunity, 11, 329(1999))로부터 재편성한 마우스 V_H 186.3-DFL 16.1-J_H2 유전자는 인간 Cμ에 결합되어 있으며, 그에 의해 코드된 도입 유전자와 내인성 마우스 H쇄의 사이를 판별하는 것이 용이하였다.

또한, 도입 유전자가 B세포의 표면에서 발현되는 것에 의해 B 세포의 발생이 변화될 가능성이 있으므로, 도입 유전자가 세포 표면 상에서 발현되는 것을 방지하기 위하여, 트랜스맴브레인 엑손을 Cμ로부터 제거하였다. 도입 유전자는 Cμ만을 포함하지만, 그 외 H쇄 아이소타입을 코드하는 유전자 영역은 포함하지 않았다.

모든 3종의 유전자 도입 구축물은, CAT 도입 유전자 구축(Azuma, T., et al., Int. Immunol., 5, 121(1993))에 이용했던 V_H 프로모터와 마우스 J-Cμ 인트론으로부터의 Eμ/MAR을 cis-작용 엘리먼트로서 포함하고 있으며, 도입 유전자의 구 조의 차이는, 3' 플랜킹 영역(도1)에 한정되어 있다.

구축물의 하나인 pvehcΔ3'E는, 3' 인핸서 영역이 흠결된 것이며, V_H 프로모터 및 Eμ/MAR에 의해 제어되어 있다. 또한, 다른 구축물인 pvehc3'E는, V_H 프로모터 및 Eμ/MAR에 더하여 3' 인핸서(Lieberson, R., et al., EMBO. J., 14, 6229(1995))를 포함하고 있다. 3' 인핸서(3'E)를 포함하고 있는 제한 효소 BamHⅠ단편(4.0kb)이, 유전자 구축을 위해 사용되었다. pvehc3'E에 대하여 주어진 HS3b 및 HS4의 부가는, pvehc3'EHS3b/4와 같이 관련된 구축물을 발생시켰다.

내인성의 IgH 유전자는, HS3b와 동일한 핵산 서열을 가지지만, 역의 형태(Arulampalam, V., et al., Immunology. Today, 18, 549(1997))로 존재하고, HS3a(Matthias, P. and Baltimore, D., Mol. Cell Biol., 13, 1547(1993))이라 명명할 수 있는 부가적인 cis-작용 엘리먼트를 포함하고 있다. 본 발명의 도입 유전자 구축물은, 이러한 cis-작용 엘리먼트를 포함하지 않고 있다.

실시예2

1) J558L 세포 내에의 IgH 변이 유전자(Lundblad, A., et al. Immunochemistry 9, 535-544(1972))의 트랜스펙션 및 항체 생산

이들 3종의 구축물의 전사 활성을 평가하기 위하여, 이들 구축물을 마우스 흑색종 세포주의 J558L 세포 내에 형질 전환시켰다. 제한 효소 NotⅠ인식 부위를 가지는 선상쇄의 IgH 유전자 구축물(10㎍)을, 플라스미드 pSV2-gpt(1.6㎍)(Mulligan, R. C. & Berg P. Science 209; 1422-1427(1980))과 함께 J558L 세포 내에 전기 천공을 행하였다(Sahagaw, B.G. et al. 1986, J. Immunol., 137; 1066-1074). 전기 천공의 구체적 조건을 이하에 나타낸다.

기계: Gene Pulser(BIO-RAD 사)

조건:

버퍼: PBS

세포: J558L 2×10⁷ 세포/㎖를 0.5㎖ PBS 중에 둠

직선화 DNA: IgH 도입 유전자(10㎍) 및 pSV2-gpt(1.6㎍),

반응 조건: 커패시턴스(960㎌), 전압(350V).

형질 전환한 세포를, 히포크산틴, 크산틴 및 미코페놀산의 혼합액(시그마사)의 존재하에서 배양하였다(37℃, 5% CO₂하). 약제 저항성 IgH 유전자의 형질 전환체를, 한외 희석하고, 항체 생산에 근거하여 클론을 선택하였다. 구체적으로는, 항 NP 키메라 항체 생산을 ELISA(도2)에 의해 측정하였다.

즉, 항체 생산의 양적 분석을 위하여, 각 도입 유전자 구축물로부터 유도된 형질 전환체의 일부의 클론을, 바닥이 평평한 96 홀 플레이트 내에 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FCS)을 포함하는 전체 용량이 200㎕인 RPMI1640 배지(Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)에서 12시간, 2×10⁶ 세포/㎖의 농도로 배양하였다. 1㎎/㎖ 소 혈청 알부민(bovine serume albumin, BSA)을 포함하는 인산 생리 완충액(phosphate buffer saline, PBS)으로 다양한 농도로 희석한 배양 상청을, NP₉-BSA로 도포된 폴리비닐 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 분석하였다. 한편, 결합한 항체의 검출을 위하여, 페록시다제(peroxidase, POD)-표식 항-마우스 λ1 쇄 항체(Southern Biotech사 제) 또는, 항-인간μ쇄 항체(ZYMED사 제)를 이용하였다.

결과를 도2에 나타낸다.

도입 유전자 구축물은 마우스 항 NP 모노클로날 항체로부터의 V_H 영역 및 인간 Ig로부터의 C 영역을 보유하고 있고, 키메라 H쇄를 코드하도록 설계되었으므로, 이들은 마우스 λ1 쇄와 회합하는 것이 예기되고, 항 NP 키메라 항체를 발생시켰다.

모든 구축물은, J558L 세포에 촉진적으로 형질 도입되어, 내인성의 λ1 쇄와 쌍을 이루는 것에 의해 항 NP 항체를 생산하였다. 이들 구축물 중에서, pvehcΔ3'E는, 다른 것과 비교하여 오히려 보다 약한 생산을 나타내었다. 3'E(pvehc3'E)의 부가는 결과로서, 항체의 생산의 현저한 증가를 얻었다. 그러나, HS3b와 HS4의 부가는, 항체 생산량에는 효과가 없는 것으로 생각되었다. 각 형질 전환한 DNA의 카피수에 관한 전사의 종속 관계에 대해 약간의 정보를 입수할 수 있지만, 본 발명자는, 항체의 생산의 양은, pvehc3'E 및 pvehc3'EHS3b/4 사이에 현저한 차이가 없고, 구축물의 전사의 활성을 의미하고 있다고 생각하였다.

실시예3

1) 키메라 마우스의 생산

본 발명자는 키메라 마우스를 생산하기 위하여, RAG-2^-/-마우스의 배반포 중으로의 마이크로인젝션을 위한 적어도 2개의 독립하는 형질 전환된 ES 클론을 사용하였다. 또한, 본 발명자는, 체세포 과돌연변이의 분석을 위하여 적어도 2개의 키메라 마우스/도입 유전자 구축물을 사용하였다. 이러한 실험에 사용된 형질 전환한 ES 세포주와 키메라 마우스를 표1에 나타낸다.

즉, pGKneo(1.5kb, 1㎍)의 EcoRⅠ단편 및 상기 실시예2와 같은 선상쇄인 3종의 IgH 도입 유전자 구축물(30㎍)을, 바이오 래드 진 펄서(Bio-Rad Gene Pulser: 바이오 래드사 제)를 이용하여 1×10⁷개의 E14-1 세포[Kuhn, R., et al., Science, 254, 707(1991)) 내에 전기 천공시켰다.

그리고, 형질 전환된 세포를, G418(150㎍/㎖: 깁코사 제)로 선택하였다. 수득한 콜로니를, V_H 17.2.25 프로모터 및 J_H2에 국한하여 존재하는 DNA 서열에 하이브리다이즈하는 서열번호7 및 서열번호8로 표시되는 2개의 프라이머를 이용하는 PCR에 의해, 프로브로서 인간 Cμ 유전자를 이용하는 서던 블롯팅에 의해 각각 스크리닝하였다.

서열번호7: 5'-GACTCAGGAGGACTCTAGTT-3'

서열번호8: 5'-GGTGTCCCTAGTCCTTCATG-3'

PCR 증폭은 95℃, 30초, 65℃, 30초 및 72℃, 1분간의 30 사이클의 조건으로 실시하였다. 구성한 pvehc3'E의 카피수는, 서던 블롯팅에 의해 2~3으로 계산되었다. 다른 도입 유전자인 pvehcΔ3'E 및 pvehc3'EHS3b/4의 카피수는, 표준으로서 pvehc3'E-형질 전환한 ES 세포 유래의 DNA를 사용한 PCR의 분석에 의해 평가하였다.

2) 키메라 마우스에 있어서의 항체 생산

IgH 도입 유전자를 포함하는 ES 세포 클론을, RAG-2^-/-마우스(Takahashi, N., et al., Nucleic Acids Res., 8, 5983(1980)) 유래의 배반포 내에 도입하고, ICR 양모(foster mother)(생후 8~12주, 클레아사)의 자궁에 이식하였다. 키메라 마우스에 있어서 ES 세포를 기원으로 하는 B 세포 및 T 세포에 의한 면역 시스템의 상보성은, PE 항 CD3 항체 또는 바이오틴 항 B220/SA-FITC으로 세포를 염색한 후에 플로우 사이토메트리(flow cytometry)로 시험하였다.

POD 표식 양의 항-마우스 μ쇄 항체를, 결합한 항체의 검출을 위해 사용하였다. 인간 Cμ를 가지는 항체의 분석을 위하여, 플레이트를 양의 항-인간 IgM 항체(서던 바이오테크사 제)로 도포하고, POD 표식 항-인간 IgM 모노클로날 항체(자이메드사 제)를 결합 항체를 검출하기 위해 사용하였다. 한편, J558L 형질 전환체의 배양 상청, 인간 왈덴스톰 IgM(human Waldenstrom IgM), 및 항 NP IgM 모노클로날 항체인 B4-3을 대조군 항체로서 사용하였다.

사용한 ES 세포 및 키메라 마우스

구축물	세포 클론	카피수	키메라 마우스
pvehcΔ3'E	3-89	< 3	3-2
pvehcΔ3'E	3-88	< 3	3-4
pvehc3'E	No.6	< 3	1-1, 2/3
pvehc3'E	A-4	< 3	A4-3
pvehc3'EHS3b/4	25-2-5	< 3	2-1
pvehc3'EHS3b/4	25-2-2	< 3	2-3

키메라 마우스가 생성되었는지의 여부는, 도입 유전자의 생식 세포계 유전을 시험하기 위하여 C57BL/6 마우스와 역교배시키고, 수득한 마우스의 꼬리 부분에서 DNA를 추출하여, PCR에 의해 도입 유전자가 포함되어 있는지 분석하였다.

3) 면역 및 항체 생산

면역 시스템이 ES 세포로부터 유도된 림프구와 재구축되어 있는지 시험하기 위하여, 키메라 마우스의 A4-3, 2-1, 및 2-3의 이전 면역 혈청 중의 IgM의 양을 ELISA에 의해 측정하였다.

결과를 도3a에 나타낸다. 마우스 IgM와 동일한 양이, 도입 유전자에 관계없이 이들 마우스의 모든 항혈청에서 검출되었지만, 정상인 BALB/c 마우스에 있어서의 그것보다 IgM이 적었다.

이어서, NP₃₄-닭γ글로불린(NP₃₄-CGG) 및 다른 NP 값을 가지는 NP-BSA를, 아즈마씨의 방법과 동일하게 제조하였다(Azuma, T., et al., Molec. Immunol., 24, 287(1987)).

키메라 마우스에, (4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸 닭γ글로불린(이하, NP₃₄-CGG:사제)을 포함하는 CFA(complete Freund's adjuvant: Difco사 제, 100㎍/마우스)를 투여하고, 추가 면역을 IFA(incomplete Freund's adjuvant)를 이용하여 동량 투여하였다. NP34-CGG를 포함하는 PBS의 최종 투여 3일 후, 항 혈청을 면역한 마우스로부터 수집하였다. 그 후 마우스를 죽여, 조직의 샘플을 수득하였다.

항 NP 항체 생산과 이들의 항체의 친화성 성숙을 측정하기 위하여, NP₁-BSA 또는 NP₁₆-BSA로 도포된 플레이트를 이용하였다. POD 표식 양의 항-마우스 IgG(자이메드사 제)를 항체의 검출을 위하여 사용하였다.

항 NP 모노클로날 항체, F8을 미성숙 항체에 대한 대조군으로서 사용하였고, 성숙한 모노클로날 항체에 대한 대조군으로서는 C6을 사용하였다(Taketani, M., et al., Mol. Immunol., 32, 983(1995); Furukawa, K., et al., Immunity, 11, 329(1999)).

결과를 도3b에 나타낸다. NP₃₄-CGG로 면역한 마우스의 이전 면역 또는 면역 항혈청에 있어서 도입 유전자에 의해 코드된 인간 Cμ을 표현하는 항체를 검출할 수 없었다.

또한, 항 NP 모노클로날 항체(γ1λ1)를 생산하는 하이브리도마를, NP₃₄-CGG로 면역한 pvehc3'EHS3b/4 마우스로부터 제조하였다. 인간 Cμ를 표현하는 분비된 항체는, 이들 중에는 전혀 없었다. 그러나, 이들 중 일부는, 인간 Cμ를 가지는 세포 내 H쇄를 합성하였다.

그 결과로부터, 도입 유전자는, 키메라 마우스의 B 세포 중에서 전사, 번역된 것으로 시사된다. 그러나, 분비된 H쇄 산물은, 검출 가능한 수준 이하였다.

이어서, TD 항원 NP₃₄-CGG에 대한 키메라 마우스의 항체 반응을 ELISA에 의해 시험하였다. 결과를 도3c에 나타낸다. 항체가는 변화되었지만, 모든 마우스는 그들의 면역 시스템이 항 NP 항체의 생산에 응답하는 것을 나타내는, 항 IgG 항체를 생산하였다.

또한, 친화성 성숙의 측정으로서, NP₁₆-BSA에 대한 결합과 관계된 NP₁-BSA에 대한 이들 항체의 결합비를 시험하였다. 결과를 도3d에 나타낸다.

도3d에 나타낸 바와 같이, 대조군의 모노클로날 항체인 F8은, 체세포 과돌연변이를 나타내지 않고, 2×10⁵/M의 NP-Cap에 대한 회합 상수(Ka)를 가지며, 비율은 0.29이었다. 한편, 2×10⁷/M의 Ka를 가지는 잘 성숙한 모노클로날 항체인 C6은(Furukawa, K., et al., Immunity, 11, 329(1999)), 약 1 전후의 비율을 가졌다. 키메라 마우스로부터의 모든 항혈청은 C6과 동일한 비율을 나타내었으므로, 항 NP 항체의 친화성 성숙은, NP₃₄-CGG로 면역한 후의 모든 키메라 마우스에 있어서 동일한 정도까지 진행되었다.

실시예4 V _H 유전자의 클로닝 및 서열 결정

면역 시스템이 키메라 마우스에서 재구축되었지만, 단일의 키메라 마우스로부터 유래된 배의 중심 세포(Rose., M.L., et al., Nature, 284, 364(1980))로서 잘 알려져 있는 PNA^hiIgG⁺B 세포를 충분한 양으로 수득하는 것은, 매우 어려웠다. 따라서, NP₃₄-CGG로 면역한 후, FACS Vantage(모델명)를 이용한 플로우 사이토메트리에 의해, 아이소타입-스위칭 메모리 B 세포를 선택할 것으로 예상되는 비장(spleen)의 IgM^-B220⁺ 세포를 분류하였다.

즉, NP₃₄-CGG로 면역한 키메라 마우스의 비장으로부터의 단일 세포 현탁액을 0.83% 염화 암모니아로 처리함으로써, 적혈구를 용혈시켰다. 일부 실험에서, T 세포도 또한 항 Thy1 항체(T24/40 및 HO 13.4)로 처리함으로써 동일하게 용혈시키고, 계속하여 토끼 보체로 처리하였다. 세포를, PE(phycoerythrin) 표식 항 CD45R/B220(세포 표면 분자, pherMingen사 제), 또는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate) 표식 항-마우스 IgM(자이메드사 제)로 염색하였다.

또한, 복막의 세포는, 바이오틴 표식 항 CD5/FITC 표식 스트렙타비딘(streptavidin, pherMingen사 제) 및 PE 표식 항 CD45R(B220)으로 염색하였다.

CD45R(B220)⁺IgM^-, CD45R(B220)⁺IgM⁺, 또는 CD5⁺CD45R(B220)⁺ 세포는, 형광 활 성화 세포 선별기(fluorescence activated cell sorter, FACS) Vantage(벡톤 디킨스사 제) 상에서 플로우 사이토메트리에 의해 분획하였다.

한편, 대조군 실험으로서, CD4⁺세포 및/또는 CD8⁺ 세포를 염색 및 분류한 후에 흉선으로부터 수득하였다.

모든 RNA를, TRIzo1(RNA 제조시약: 깁코 BRL사 제)를 사용하여 제품 사양서에 따라, 상기의 사이토메트리에 의해 분류한 비장 세포 또는 복부 세포로부터 제조하였다.

cDNA를, 프라이머로서 올리고(dT) 및 SuperscriptⅡ 역전사 효소(깁코 BRL사 제)를 이용하여 모든 RNA로부터 제조하였다. 각 cDNA 샘플은, 도입 유전자에 대하여, 서열번호9로 표시되는 V_H 186.2 프라이머 및 서열번호10로 표시되는 인간 Cμ프라이머의 2개의 프라이머를 각각 이용하고, 내인성의 마우스Ig 유전자에 대하여, 서열번호9로 표시되는 V_H 186.2 프라이머 및 서열번호11로 표시되는 마우스 Cγ1 프라이머를 각각 이용하여 PCR 증폭시켰다.

서열번호9: 5'-CATGCTCTTCTTGGCAGCAAC-3'

서열번호10: 5'-GCAGCCAACGGCCACGCTGC-3'

서열번호11: 5'-GGCCGAATTCCATGGAGTTAGTTTGGG-3'

PCR 반응은, 95℃, 1분간, 62℃, 1분간 및 72℃, 1분간 30 사이클의 조건으로 실시하였다. 도입 유전자와 내인성의 마우스 IgH 유전자의 PCR 산물은, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하거나, 또는 TA 클로닝 키트(인비트로겐사 제)를 이용 하여 pCR-2.1(인비트로겐사 제) 내에 라이게이션하고, 히타치 DNA 서열 분석기(상품명: DNA sequencer model 5500, 히타치제작소사 제)를 사용하고, 서열번호12로 표시되는 M13 프라이머(-20: 다카라 바이오사 제) 및 서열번호13로 표시되는 M13 역 프라이머(다카라 바이오사 제)를 이용하여 서열을 결정하였다.

도4에 나타낸 바와 같이, 도입 유전자를 포함하는 항체 단편의 발현이 확인되었다.

2) 비장 또는 복부의 B 세포에 있어서 도입 유전자의 체세포 과돌연변이

변이의 빈도는, 서열을 결정한 염기의 전체 개수로 변이의 전체 개수를 나누는 것에 의해 산출하였다. 결과를 표2에 나타낸다.

키메라 마우스의 비장 IgM^-B 세포의 V 영역 서열에 있어서의 변이

구축물	pvehcΔ3'E		pvehc3'E		pvehc3'EHS3b/4
ES 클론	3-89	3-88	No. 6	A4	25-2-5	25-2-2
분석한 서열의 수	30	18	51^c	30	21	21
관찰된 변이의 수	16	11	42	25	161	132
CDR 영역에서의 변이의 퍼센트^a(%)	56	36	38	75	57	55
변이빈도^b(%)	0.15	0.17	0.23	0.23	2.14	1.76

^aCDR 영역에서의 변이의 퍼센트

= 100×(CDR 영역에서의 점 돌연변이의 총수)/(점 돌연변이의 총수)

^b변이빈도 = 100×(점 돌연변이의 총수)/(염기쌍의 총수)

^c2마리의 키메라 마우스가 분석됨

도입 유전자에 있어서 체세포 과돌연변이는, V_H 186.2 또는 인간 Cμ에 대하여 하이브리다이즈하는 프라이머를 사용하였다. RT-PCR로 제조한 cDNA의 클로닝 및 서열 결정을 행하였다. 결과를 표3에 나타낸다. 또한, 비장의 B 세포 중에서 도입 유전자 구축물들 간의 체세포 과돌연변이의 분포 및 빈도를 도5에 나타낸다.

상기 프라이머의 조합 사용에 의한 도입 유전자의 특이적인 증폭은, 키메라 마우스로부터의 비장 세포에서만 관찰되었고, NP₃₄-CGG로 면역한 C57BL/6 마우스로부터의 그것에서는 확인되지 않았다. 또한, 모든 서열은, 도입 유전자를 구축하기 위해 사용되는 A6DNA의 특성인, CDR3에 있어서의 동일한 접합적 다양성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.

유전자 구축물 pvehcΔ3'E의 경우, V_H 186.2-DFL 16.1-J_H 2에 있어서 체세포 과돌연변이로부터의 결과로서 복수의 핵산 변화를 관찰하였지만, 빈도는 낮았다. 변이의 빈도는 0.17%인 것으로 추정되었다(표2).

유전자 구축물 pvehc3'E의 경우, 실질적으로 동일한 과돌연변이의 분포를 나 타내었다. 그러나, 빈도는 pvehcΔ3'E와 비교하여 약간 증가하였다(표2).

본 발명의 유전자 구축물인 pvehc3'E에 HS3b/4를 더 부가한 pvehc3'EHS3b/4의 경우, V_H 186.2-DFL 16.1-J_H 2 유전자에 있어서의 체세포 과돌연변이 빈도의 극적인 증가가 결과로서 나타났다(도5). 서열을 결정한 전체 PCR 클론은, 그들이 무작위로 선택되었음에도 불구하고, 핵산의 변화를 포함하고 있었다. 이들의 핵산 변화는, CDR2(초가변영역2, hypervariable region2) 및 CDR3의 주변 영역에서 높은 빈도로 발견되었다(도5 및 표2).

데이터는 도5에 나타낸 각 도입 유전자 구축물에 대응하는 2마리의 키메라 마우스로부터 수득하였지만, 서로 양호한 일치를 나타내었다. pvehc3'EHS3b/4에 있어서 과돌연변이의 높은 빈도는 분명하였다. 그러나, 변이는 동일한 키메라 마우스로부터의 복부의 B1 세포에는 분명히 존재하지 않았다(도5).

이하, 표3에, 도입 유전자에 있어서 특정된 치환의 특징을 나타낸다.

IgH 유전자에 있어서의 변이

치환	구축물
치환	pvehcΔ3'E	pvehc3'E	pvehc3'EHS3b/4
트랜지션
A→G	5	12	25
G→A	3	13	47
C→T	1	5	8
T→C	3	5	34
합계	12	35	114
트랜스버젼
C→A	2	0	8
G→T	1	2	20
A→C	2	2	32
A→T	0	5	12
G→C	4	7	43
C→G	1	4	11
T→A	4	7	26
T→G	1	3	27
합계	15	32	179

IgH 도입 유전자와의 비교에 의해, 염기 트랜지션(transition) 및 염기 트랜스버젼(transversion)이 거의 동일한 빈도로 일어나는 것이 명확해졌다.

또한, RGYW 모티프(motif)(A/G, G, C/T, A/T)(Kabat, E. A., et al., US National Institutes of Health, Bethesda, M.D., U.S.A., p1394(1991): Rogozin, I.B., et al., Biochim. Biophys. Acta., 1171, 11(1992))라 명명할 수 있는 서열(locus sequence)에 있어서, V_H 186.2 도입 유전자 중의 체세포 과돌연변이의 발생을 분석하였다. 생식 세포계 V_H 186.2 유전자(294bp)는 전체 염기의 32%에 상동하는 RGYW/WRCY 모티프(93bp)를 포함하고 있으며, 상기 모티프에 있어서 체세포 과돌연변이의 빈도는, 다른 V_H 영역의 그것보다는 현저하게 높지 않은 34%인 것으로 판명되었다.

상기 실시예에 있어서, 본 발명자는 RAG-2^-/-불완전 배반포 시스템을 이용하고, 다른 cis-작용 엘리먼트로 IgH 도입 유전자를 보유하는 키메라 마우스를 제조하였다.

본 발명의 제조 방법은, 종래의 도입 유전자 기술보다 몇개의 이점, 특히, ES 세포를 적은 카피수의 도입 유전자로 형질 전환시킬 때 그 우수성을 가지는 것이다. 사실, ES 세포 형질 전환체에 있어서 도입 유전자의 카피수는, 서던 블롯팅 및 PCR에 의해 대부분 3 카피 이하로 산출되었다(표1).

pvehcΔ3'E에 있어서, 그다지 중요하지 않은 수의 과돌연변이 만을 발견하였고, cis-작용 엘리먼트, V_H 프로모터와 Eμ/MAR은, 높은 빈도의 과돌연변이의 유도에 대해서는 충분하지 않다는 사실을 확인하였다. pvehcΔ3'E에 3' 인핸서 단편(4kb)을 부가함으로써(pvehc3'E), 과돌연변이의 발현 빈도에 관하여 약 30% 증가하였다.

그러나, 본 발명과 같이, pvehc3'E의 3' 인핸서의 3' 말단에 대하여 HS3b 및 HS4를 도입함으로써, 과돌연변이의 유도 발현 빈도를 매우 증가시키는 것을 발견하였다. 이것은, 구축물 pvehc3'EHS3b/4가 체세포 과돌연변이를 위해 필요한 모든 엘리먼트를 포함하고 있는 것을 나타낸다. 높은 빈도의 과돌연변이 도입 발현에 대하여 책임있는 모티프가 2.6kb의 HS3b/4 영역 내에 있는 것이 본 발명자의 실험에 의해 분명해졌다.

따라서, 원하는 도입 유전자의 랜덤한 변이체를 유도하는 재조합 발현 벡터를 제공할 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터를 동물 세포에서 발현되도록 하여 수득할 수 있는 높은 빈도의 랜덤한 변이체의 생산 방법을 제공할 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터와 동물 세포로 이루어진 랜덤 변이체의 발현용 또는 랜덤 변이체 생산용 키트를 제공하는 것이 가능하다.

<110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. et al <120> PROCESS FOR CONSTRUCTING MUTANT <130> P03SG212/KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tctagaacca catgcgatct aagggatatt ggggcaatac atgtgtagtg agatacctgc 60 ctttctgatg agccctgtct ggcagggata aactctcctt tctgcatctc cagggcctcg 120 atgagctgac tatctagtcc tctgccagaa tagctgtgtg gccttgggtg atgctggctg 180 acctcaggct ggtctgggtt gtctctggct gacacccctt gactctggat gaccctggga 240 agaccatact taatcttaat tggacttgtt ctcattggga gagaacatgg cctcactaag 300 gcacgagtgt ggatggcctt gggtgatggg ggttggggcc tcctcagccc ctggcaggct 360 tccctggctg ccacccctca tccaggtccc aggcccacct ggcctggtcc agtgtggtgt 420 gattctcaga acagtagctg tggtttgggg cacctgtgct gagaaaggct caggatgact 480 cagctgccct cagctcagag ctgctttgaa tgtttcagca ggtgatagac aacagagact 540 tcagaagaga gaaaaacaag ttgctaatgt gaacatccct gccctacccc cacacctgta 600 ctgcaaatct ccccacactg ttgaccccag atagagatcc caggacagca ggtgatagac 660 aaaggaggct ccagaggaga gaaaaatagt atctacaagc 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cacgttgaaa gtcttcagta gactggtatc actagccctg 360 atatgggcaa cacagcaagc ctgggtcaca ctcaagctga gtatcagggt agccagggcc 420 ttctaaccaa gggtagatgc agcctgtgtt ccgtttactg accagtgaga agccatgagc 480 tgaaccagac cagaagaccc ttactgttcc caccccaccc ccacccagtt tagtctcagc 540 aagaccctgt actgtgggcc acagctctcc tctacactcc acctgtagca caaacactat 600 ttgcaaacat ttctaaaaag tagtagaaca ggaaccacag agcagagggg gggactggcg 660 tggaaagccc cattcaccca tgggactgaa actcagggaa ccagaaccgt aaggagattt 720 gcatggtgct gggggaggtt ggccctggat cagtgagccc agagagttac tggtttctca 780 cttccatcat gtcaacctcc tcaaccccca aaaatggcca ggcctaggct atggatgagt 840 ttcaatgacc aggccctaag gacgagtcac agaggacttc ctggtgggct caggcagcag 900 acctgctcag atggattgca gagccagagg gagccatggc caggaaggcc agacgcctta 960 ggggtgtgct gtctctgcat cctttgccct ctctgctcct cacagtccat ctgccatctc 1020 acaatccctg ctgtcgctct ggggcccaga cctggccagt ctgggtacct gtggaataca 1080 cccaaagaag caatccccag cctcaggatc cacaactact tcccctacag acatgagtga 1140 tctcagccca catgtctggg ggccacagaa gcccctaaga ccctactctg ctaataggcc 1200 ctcctcccac cacgcaagac aatacacagg caaggtgatg tggatgagag gaccaaccca 1260 ggtacctgtg tgtgagatac accctgtggg tatcctggcc agaatctggt gaccaaccca 1320 acctgtgtcc ctagaggagt actccgtgcc tgcactcacc tacccaccta actccaagct 1380 t 1381 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tctagaacca catgcgatct aagggatatt gggg 34 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caggactagt gatcattgag ctccggctct aac 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctagtctaga ctgcagactc actgttcacc atg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtggactagt aagcttggag ttaggtgggt agg 33 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gactcaggag gactctagtt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtgtcccta gtccttcatg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catgctcttc ttggcagcaa c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcagccaacg gccacgctgc 20 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggccgaattc catggagtta gtttggg 27 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 12 ctctacagac acgggcc 17 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 reverse primer <400> 13 aaaaagcttg gtgtccctag tccttcatg 29 <210> 14 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> promoter <400> 14 ttcttaaata aaatgctgaa tgaacatttg aatacacata ttgctgagac atgttctctt 60 gctgtcattt gtgtaatatt ttagtatgca accttttgga aaggccatta ttatttaaat 120 atatatgaga gaagattgct aactctcata aatgtattgg tttttttttt aaatttccag 180 taagcgttat cctcattgct actaccacca atcaattttt tcactaagac aagtgagtgt 240 ctcaggttag gattctattt taagattgag atattaggct ttgatactac atctaaatgg 300 tctgtacatg tctcgaagaa agttcttcag acagagttag gacttggatc caggagttag 360 gacttggact gactcaggag gactctagtt tcttcttctc cagctggaat gtccttatgt 420 aagaaaagcc ttgcctcatg agtatgcaaa tcatgtgcga ctgtgatgat taatataggg 480 atatccacac caaacatcat atgagcccta tcttctctac agacactgaa tctcaaggtc 540 cttaca 546

Claims

외래 유전자의 랜덤한 변이체를 동물 세포 내에서 제조하는 방법으로서,

하기 (a)~(d)를 포함하는 DNA 구축물을 동물 세포에 도입하여, 외래 유전자를 동물세포의 게놈에 삽입하여 상동 재조합체를 수득하는 것을 포함하는 상기 동물 세포 내에 있어서, 외래 유전자의 변이체를 제조하는 방법:

(a) 서열번호: 14의 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(V_H) 프로모터;

(b) 외래 유전자;

(c) 인트론 인핸서; 및

(d) DNaseⅠ고감수성 영역 중, 고감수성 영역(HS)3b 및 고감수성 영역(HS)4로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인핸서.
제1항에 있어서,

(d) 인핸서가, 고감수성 영역(HS)1 및 고감수성 영역(HS)2를 더 포함하는

제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

(d) 인핸서가, 서열번호:1 또는 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

(a), (c), (d)의 DNA 서열이 면역 글로불린의 DNA 서열에서 유래한

제조 방법.
제2항에 있어서,

(d) 인핸서가, 고감수성 영역(HS)1, 고감수성 영역(HS)2, 고감수성 영역(HS)3b 및 고감수성 영역(HS)4를 포함하는

제조 방법.
제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

(a) 프로모터가 서열번호: 14의 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(V_H) 프로모터이며,

(d) 인핸서가, 서열번호:1 및 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는,

제조 방법.
제5항에 있어서,

DNA 구축물은

고감수영역(HS) 1, 고감수영역(HS) 2, 및 고감수영역 3b/4를 함유한 3'인핸서로 재조합된 도 1에 도시된 DNA 구축물(pvehc3'EHS3b/4)인

제조 방법.
제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

동물 세포가, B 세포계 동물 세포인

제조 방법.
제8항에 있어서,

B 세포계 동물세포가, 프리-B 림프구계 세포 유래인

제조 방법.
제1항, 제2항 또는 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득한 외래 유전자의 변이체를, 상기 동물 세포 내에서 발현시켜, 변이체의 유전자 발현물을 수득하는 방법.
외래 유전자의 변이체를 생산하기 위한 DNA 구축물로서, 이하의 (a)~(d)

(a) 서열번호: 14의 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(V_H) 프로모터;

(b) 외래 유전자;

(c) 인트론 인핸서; 및

(d) DNaseⅠ고감수성 영역 중, 고감수성 영역(HS)3b 및 고감수성 영역(HS)4로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인핸서;

를 포함하는 DNA 구축물.
제11항에 있어서,

(d) 인핸서가, 고감수성 영역(HS)1 및 고감수성 영역(HS)2를 더 포함하는

DNA 구축물.
제11항 또는 제12항에 있어서,

(d) 인핸서가, 서열번호:1 또는 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는

DNA 구축물.
제11항 또는 제12항에 있어서,

(a), (c), (d)의 DNA 서열이 면역 글로불린의 DNA 서열에서 유래한

DNA 구축물.
제11항 또는 제12항에 있어서,

(d) 인핸서가, 고감수성 영역(HS)1, 고감수성 영역(HS)2, 고감수성 영역(HS)3b 및 고감수성 영역(HS)4를 포함하는

DNA 구축물.
제11항 또는 제12항에 있어서,

(a) 프로모터가 서열번호: 14의 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(V_H) 프로모터이며,

(d) 인핸서가 서열번호:1 및 서열번호:2의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 가지는

DNA 구축물.
제11항 또는 제12항에 있어서,

DNA 구축물은

고감수영역(HS) 1, 고감수영역(HS) 2, 및 고감수영역 3b/4를 함유한 3'인핸서로 재조합된 도 1에 도시된 DNA 구축물(pvehc3'EHS3b/4)인 것을 특징으로 하는

DNA 구축물.
외래 유전자의 변이체를 생산하는 변이된 DNA 서열 발현을 달성하기 위한,

(a) 서열번호: 14의 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(V_H) 프로모터;

(b) 외래 유전자 삽입 가능 부위;

(c) 인트론 인핸서; 및

(d) DNaseⅠ고감수성 영역 중, 고감수성 영역(HS)3b 및 고감수성 영역(HS)4로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 인핸서;

를 가지는 벡터를 포함하는, 외래 유전자 변이체 제조용 또는 변이체의 유전자 발현물 생산용 키트.
제18항에 있어서,

(d) 인핸서가, 고감수성 영역(HS)1 및 고감수성 영역(HS)2를 더 포함하는

키트.
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