UA48109C2 - Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який являє собою варіант ліпази, яка стимулюється солями жовчі (bssl) і має її активність (варіанти), поліпептид (варіанти), фармацевтична композиція - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується нових поліпептидів, що являють собою варіанти стимульованої солями жовчі ліпази (BSSL ЕС 3.1.1.1) і молекул ДНК, що кодують ці поліпептиди, які застосовуються для виробництва лікарських препаратів. Винахід стосується також фармацевтичних композицій, що містять зазначені поліпептиди.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к новьім полипептидам, которье представляют собой варианть 2 стимулируемой солями желчи липазьі /В55І; ЕС 3.1.1.1./. Оно также относится к молекулам ДНК, кодирующим упомянутье полипептидь), и к субпродуктам, содержащим упомянутье молекульї ДНК. Изобретение также относится Кк способам продуцирования упомянутьхх вариантов ВЗ5Ї, и к продуцированию трансгенньїх млекопитающих, не принадлежащих к человеку, способньїх зкспрессировать вариантьї В55І. Кроме того, изобретение относится к таким трансгенньм животньм, и также к детскому питанию /піапі їогтиїа)/, содержащему молоко таких трансгенньїх животньїх. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим упомянутье полипептидь!; и к применению упомянутьїх полипептидов и молекул ДНК в производстве лекарственньїх препаратов.

Гидролиз пищевьїх липидов.

Пищевьсе липидьї являются важньім источником знергии. Богатье знергией триацилглицероль! составляют 72 более 9595 таких липидов. Некоторье из липидов, например, некоторье жирнье кислотьі и жирорастворимьсе витаминь, являются существенньми составляющими опищи. До желудочно-кишечной абсорбции триацилглицерольі, так же, как и минорнье компоненть, т.е., зстерифицированнье жирорастворимье витаминь! и холестерол, и диацилфосфатидилглицероль, требуют гидролиза сложнозфирньх связей, чтобь! дать начало менее гидрофобньм абсорбируемьм продуктам. Зти реакции катализируются специфической группой ферментов, назьіваемьх липазами.

Полагают, что существенньми для человека липазами являются желудочная липаза, панкреатическая зависящая от колипазьь липаза /лгидролиз три- и диацилглицеролов/, панкреатическая фосфолипаза А2 /гидролиз диацилфосфатидилглицеролов/ и карбоксилостераза /СЕН/ /гидролиз холестерилзфиров и зфиров жирорастворимьх витаминов, но также три- , ди- и моноацилглицеролов/. При грудном вскармливаний с 29 новорожденньіїх стимулируемая солями желчи липаза /)В551/ играет важную роль в гидролизе некоторьїх из Го) вьішеупомянутьїх липидов. Вместе с солями желчи продуктьї переваривания липидов образуют смешаннье мицелль или однослойньсе везикуль! /Неїпеї! еї а!., 1990/, из которьїх происходит абсорбция.

Стимулируемая солями желчи липаза.

Стимулируемая солями желчи липаза /В551/ является составной частью молока ряда видов, например, о 30 человека, горилль, кошек и собак /НегпеїЇ еї аі., 1989, Натозіи еї а)., 1986/. При смешениий с желчью в (є содержимом верхнего отдела тонкого кишечника В55І. специфически активируется первичньіми солями желчи /НегппеїІ, 1975/. В55І,, которая отвечает приблизительно за 195 всего белка молока /Відскрегуд є Негпеї|, 1981/, - не разрушаєтся во время прохождения через желудок, и в дуоденальном содержимом защищается солями Ге) желчи от инактивации панкреатическими протеазами, такими как трипсин и химотрипсин. 3о Тепловая обработка человеческого молока /пастеризация при 62,57"С ЗОмин./, которая инактивирует ВЗ5І. З полностью /Віцкеїеп еї аї!., 1980/, снижает козффициент поглощения жиров у недоношенньїх новорожденньмх приблизительно на 1/3 / УУІШатвгоп еї аї., 1978, АїКІпзоп еї аі.,, 1981/. Следовательно, лучшее усвоение триацилглицерола свежего человеческого молока по сравнению усвоением детского питания с подобньм « жировьїм составом происходит благодаря В55І /Негпеї! еї аі.П, 1991, Спареїі! еї аї., 1986/. З 50 В5З5І является неспецифической липазой /ЕС 3.1.1.1/, поскольку она гидролизует не только триглицерол, но с также и ди- и моноглицерол, сложнье холестерилафирь и сложнье зфирь жирорастворимьїх витаминов

Із» /ВІідсКрего 8 НегпеїІ, 1983/. Так, после активации В55І имеет возможность гидролизовать большинство липидов человеческого молока сама по себе, хотя найболее зффективное усвоение триглицерола человеческого молока требует синергичного действия желудочной липазьі /ЕС 3.1.1.3,/, зависящей от колипазьі! панкреатической 75 липазь/ЕС 3.1.1.3/ и В55І. /Вегодск еї аї.. 1990. е Последние исследования говорят о том, что молочньій фермент является особенно важнь!м для усвоения

Ге | новорожденньіми длинноцепньїх полиненасььщенньїх жирньїх кислот /1993/. Такие жирнье кислоть! являются важньми предшественниками зйкозаноидов и важнь! для развития нервной системьі. Новорожденньсе, особенно - родившиеся преждевременно, имеют ограниченную способность синтеза таких жирньх кислот и их о 20 предшественников. Следовательно, они считаются важньми в течение пока еще не установленного периода после рождения. с В последних исследованиях ряда лабораторий охарактеризовань! структурь! КДНК как молочной липазь, так и карбоксизстеразьї поджелудочной железь! /СЕН/ /Е.С. 3.1.1.1./ /Вара еї аї., 1991; Ниї еї аї., 1991; МіІзвоп еї аІ,, 1990; Кеце еї аї., 1991/, и делается вьівод, что молочньій фермент и фермент поджелудочной железь являются продуктами одного и того же гена. Последовательность КДНК и вьіведенная аминокислотная

ГФ) последовательность гена ВЗ5І /СЕН /5ЕО ІЮ МО:1/ раскриіваются также в ВОЙИС 91/15234 /ОКіанота Меаісаї

Кезеагсп РошпааНоп/ и в ВОИС 91/18923 /"АкПероїадеї Авіга/. о ВБЗ5І является гликопротеином с одной цепью. Вьіведенньій белок /ЗЕО ІЮ МО:3З/ содержит 722 аминокислотньїх остатка и является вьісоко гликозилированньїм /АбБопцакії еї аі., 1989/. М-Концевая половина 60 белка показьіваєт удивительную гомологию с ацетилхолинзстеразой и некоторьми другими зстеразами /МіЇззоп еї а!., 1990/,

Предполагаемьй остаток серина с активньм сайтом располагается в серине-194; последовательность вблизи зтого серина согласуется с консенсусной последовательностью активного сайта серингидролаз.

Единственньій предполагаемьй сайт М-гликозилирования определяется только семью М-концевьіми остатками бо серина активного сайта /МіІззоп еї аї., 1990/,

Последовательность ВЗ5І содержит в своей С-концевой части 16 богатьїх пролином повторов из 11 аминокислотньх остатков каждьй. Оказьваєтся, что изменение в числе повторов является главньм обьяснением различий в размере молекул и аминокислотном составе между соответствующими ферментами Вазличньх видов /Нап еї аї., 1987, РопіаІпе еї аїЇ., 1991, Кудег еї аїІ., 1989/. Зти повторьії несут большую часть 15 - 2095 углевода белка /Ваба еї а/!., 1991, Аропцакі! еї а!., 1989/.

Уникальное структурное различие между ВОЗ5І и типичньми зстеразами кроется в С-концевой части полипептидной цепи, т.е. в 16 богатьїх пролином повторах из 11 аминокислотньїх остатков. Соответствующие ферменть! поджелудочной железь коровь и крьІсь! имеют только З и 4 повтора, соответственно /Нап еї аї., 1987, 70 Кудег еї аі!., 1989/. Следовательно, возможно предположение, что С-концевая часть, или по крайней мере часть ее, обязательньі для липазной активности, т.е., для действия против змульгированного длинноцепного тирацилглицерола.

Липидная малабсорбция

Обьічньмми причинами малабсорбции и, следовательно, недостаточного питания, являются пониженнье 7/5 Внутрипросветньсе /Іпігаїнтіпа)/ уровни панкреатической, зависящей от колипазьї, липазьі и/или солей желчи.

Типичньіми примерами случаев такой липазной недостаточности являются пациентьі, страдающие муковисцидозом - обьічньім генетическим нарушением, приводящим к недостаточности в течение всей жизни у 8095 пациентов, и страдающие хроническим панкреатитом, часто вследствие хронического алкаголизма.

В настоящее время лечение пациентов, страдающих от дефицита панкреатической липазьі, состоит в 2о пероральном введений весьма больших доз сьірого препарата панкреатических ферментов. Однако, зависящая от колипазь! панкреатическая липаза инактивируется при низком рН, преобладающем в желудке. Зтот зффект не может бьіть полностью преодолен применением больших доз фермента. Таким образом, большие вводимьсе дозьі являются неадекватньми для большинства пациентов, и, сверх того, препарать! являются неочищенньіми и неприятньіми. с

Сформулированьі некоторье таблетки, которье проходят через кислотнье отдель! желудка и вьіделяют фермент только в относительно щелочной среде тощей кишки. Однако, многие пациентьі, страдающие і) панкреатическими нарушениями, имеют паталогически кислую среду в тощей кишке, и в таких случаях фермент из таблеток может не вьіделиться.

Более того, так как препаратьї, имеющиеся в настоящее время на рьінке, происходят из нечеловеческого б зо Мсточника, существует опасность иммунореакций, которне могут вьізвать опаснье для пациента зффекть или привести к снижению зффективности лечения. Другим недостатком имеющихся препаратов является то, что не о установлено содержание в них других липолитических активностей, кроме зависящей от колипазь! липазьі. В «- действительности, большинство из них имеет очень низкий уровень активности ВЗ5І /СЕН. Зто может бьть одной из причин, почему многие пациентьї, страдающие от муковисцидоза, вопреки дополнительному лечению, со з5 страдают от недостатка жирорастворимьхх витаминов и основньїх жирньх кислот. «г

Таким образом, существует большая потребность в продуктах со свойствами и структурой, происходящими от липаз человека, и с широкой субстратной специфичностью, которье могут бьіть введень! перорально пациентам, страдающим от нехватки одного или нескольких липолитических ферментов. Продукть!, которне могут бьіть получень! при применений настоящего изобретения, удовлетворяют зтой потребности сами по себе, «

Мли в сочетаний с препаратами, содержащими другие липазь!. в с Вариантьї рекомбинантной В55І по настоящему изобретению сохраняют каталитическую активность, но содержат меньше сайтов гликозилирования, чем полная В55І, и получаются, таким образом, с потенциально ;» пониженной степенью углеводной гетерогенности. Зто уменьшенное разнообразие облегчает очистку и исследование рекомбинантного белка, что будет приводить к более зффективному, по стоимости, производству Пполипептидов, обладающих активностью В55І. ї5» С другой стороньії, пониженная степень гликозилирования менее требовательна к хозяину, и допускает более вьісокое продуцирование в некоторьїх клетках-хозяевах. И еще, уменьшенное число сайтов со гликозилирования в варианте В55І допускает зффективное продуцирование в низших зукариотах и - ограничиваєт потенциальньй риск гликозилирования с отклонениями от нормьі, которье могут вьізвать йМммунологические реакции. Уменьшенньй размер и меньшая сложность гликозилирования также предполагает, о что круг хозяев шире, чем для белка, имеющего очень сложнье и тяжелье углеводнье составляющие.

Ге Терапевтическое применение варианта В55І, которьій меньше по размеру, но равен по активности, означаеєет, что уменьшается масса вещества, необходимая для добавления. Другим возможньмм преимуществом варианта рекомбинантной ВЗ5І. лишенного большинства или всех О-гликозилированньїх повторов, является уменьшенньй риск иммунологической реакции у отдельного реципиента. Зто происходит благодаря тому, что

О-связанньїй сахар может очень гетерогенно зависеть от клетки, в которой он продуцируется. (Ф, В научной литературе имеются указания, что нативная ВОЗІ связьівается с и поглощается слизистой ка оболочкой кишечника. Вариант ВОЗІ, которьій вьібирают для уменьшения поглощения, будет активньмм на субстратах пищевьх липидов в течение более продолжительного периода времени, что ведет к более во Ззффективному внутрипросветному перевариванию. Примерами таких вариантов являются молекуль! с пониженньїм гликозилированием.

Как упоминалось вьіше, предполагается, что ВЗ5І имеет особую важность для усвоения длинноцепньх полиненасьіїщенньх жирньх кислот /Негпеї! еї аі!., 1993/, которне имеют большое значение для развития нервной системь! у новорожденньх, и для усвоения витамина А. Вариант ВЗ5І по изобретению, которьій является в б5 ЗОМ отношений более зффективньм, может бьть вьбран известньми способами. Усеченньйй, или укороченньій, фермент должен, вероятно, отличаться в отношений конформации, которая может влиять на специфичность против различньїх липидньїх субстратов.

С одной стороньі, изобретение относится к молекуле нуклейновой кислотьі, кодирующей полипептид, которьій представляет собой вариант В55І короче 722 аминокислот, причем упомянутьій вариант В55І. содержит часть аминокислотной последовательности, представляемой как остатки 536 - 722 в ЗЕО ІЮ МО:3.

Вьражение "часть аминокислотной последовательности" следует понимать как одну единственную аминокислоту, а также и как последовательность нескольких аминокислот или несколько таких соединенньх последовательностей.

Термин "вариант В55І" следует понимать как полипептид, имеющий активность ВЗ5І и содержащий часть 7/0 аминокислотной последовательности человеческой ВЗЗІ, представленной в списке последовательностей как

ЗБЕО ІЮО МО:3.

Термин "полипептид, имеющий активность ВЗ5І" следуєет понимать, как полипептид, обладающий по крайней мере свойствами /а/ подходить для перорального введения; /р/ активироваться специфическими солями желчи; /с/ активирования, как неспецифической липазь, в содержимом тонких кишок, т.е., способность гидролизовать липидьі, относительно независимье по своей химической структуре и физическому состоянию /змульгированньве, мицелль, растворенньєв/; и, не обязательно, обладающие одним или несколькими из следующих свойств: /д/ способность гидролизовать триацилглицерольй с жирньми кислотами с различной длиной цепи и различной степенью ненасьіщенности; /е/ способность гидролизовать также диацилглицерол, моноацилглицерол, сложнье холестерилзфирь, лизофосфатидилацилглицерол и ретинил и другие сложнье зфирь! жирорастворимьїх витаминов;

Н/ способность гидролизовать в триацилглицероле не только сложнозфирнье связи 5О -1 (3), но также и сч ов сложнозфирньсе связи 5О -2; /д/ способность взаймодействовать не только с первичньми, но так же и со вторичньіми солями желчи; і) /п// зависимость оптимальной активности от солей желчи;

Л/ устойчивость в том смьісле, что содержимое желудка не будет влиять на каталитическую зффективность в сколько-нибудь заметной степени; б зо ЛД/ устойчивость к инактивации панкреатической протеазой, например, трипсином, при условийи, что присутствуют соли желчи; о /к/ способность связьіваться с гепарином или производньми гепарина, например, с гепаринсульфатом; «-

Л/ способность связьіваться с интерфазами липид-вода; /т/ достаточная устойчивость, которая допускает лиофилизацию; со /п/ устойчивость при смешениий с составляющими пищи, такими как человеческое молоко или молочная «г смесь.

С другой сторонь, изобретение относится к омолекуле нуклейновой кКислоть! в соответствии с вьшесказанньм, при зтом упомянутьій вариант В55І имеет остаток фенилаланина в своем С-концевом положении, или содержит в С-концевой части последовательность СіІп-Меї-Рго, альтернативно, содержит « аминокислотную последовательность, представляемую как остатки 712 - 722 в ЗЕ І МО:З своей С-концевой пе) с части.

В контексте настоящего описания термин "С-концевое положение" означает положение заключительного ;» С-концевого остатка в то время как термин "С-концевая часть" следует понимать, как приблизительно 50 аминокислотньїх остатков, которье составляют С-концевое окончание варианта В55І.

Изобретение также относится к молекуле нуклейновой кислоть!, в соответствии с вьішесказанньім, при зтом їх упомянутьій вариант В55І содержит менее 16 повторяющихся единиц. В контексте настоящего описания термин "повторяющаяся единица" означаєет одну из повторяющихся единиц из 33 нуклеотидов каждая, которье бо указьіваются в списке последовательностей в 5ЕО ІЮ МО 1. - В других аспектах изобретение относится к омолекуле нуклеийновой кКислоть, в соответствии с Вьішесказанньм, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере о на 9095 гомологична с аминокислотной последовательностью, показанной как 5ЗЕО ІЮ МО:5, б или 9 в списке

Ге последовательностей, так же, как и к молекуле нуклейновой кислотьі, которая кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 9095 гомологична аминокислотной последовательности, показанной как ЗЕО ІЮ МО:7 в списке последовательностей, за исключением тех молекул Нуклеиновьйх кислот, которне кодируют полипептидь, которне имеют остаток аспарагина в положений 187.

Изобретение также относится к полипептиду, вьіявленному как ЗЕО ІЮО МО:5, 6, 7 или 9 в списке (Ф, последовательностей, так же как и к полипептиду, кодируемому аминокислотной последовательностью, как ка упоминается вьіше.

Изобретение также относится к гибридному гену, содержащему молекулу нуклеийновой кислоть!, в бо боответствий с вьішеупомянутьм, к вектору воспроизводимой зкспрессии, содержащему такой гибридньй ген, й к клетке, несущей такой гибридньй ген. Зта клетка может бьть прокариотной клеткой, одноклеточньм зукариотньм оорганизмом или клеткой, происходящей от многоклеточного организма, например, от млекопитающего.

В контексте настоящего описания термин "гибридньій ген" означает последовательность нуклеиновьмх 65 Кислот, содержащую, с одной стороньі, последовательность нуклейиновой кислотьї, кодирующую вариант В55І, как определяется вьіше, и с другой стороньі последовательность нуклеийновой кислоть! гена, которьій способен посредничать в зкспрессии продукта гибридного гена. Термин "ген" обозначаеєт полньй ген, как и его субпоследовательность, которье способнь! посредничать и нацеливать зкспрессию гибридного гена в ткани, представляющей интерес. Обьчно, упомянутая субпоследовательность представляет собой субпоследовательность, которая включает один или несколько промоторньх участков, сайт инициации транскрипции, З' и 5' -гсекодирующие участки и структурнье последовательности.

Гибридньйй ген образуется, предпочтительно, вставкой Іп міго последовательности нуклеийновой кислоть, кодирующей вариант В5ЗІ, в ген, способньій посредничать в зкспрессии, с применением технических приемов, известньїх в технике. С другой стороньії, последовательность нуклеийновой кислотьі, коюодирующая вариант В55І, 7/0 может бьть вставлена Іп міІмо путем гомологической рекомбинации.

В контексте настоящего описания термин "воспроизводимьй" оозначает, что вектор способен реплицироваться в данном типе клетки-хозлина, в которую он введен. Непосредственно в обратном направлений последовательности нуклейновой кислотьі может бьть получена последовательность, кодирующая сигнальньй пептид, присутствие которого ообеспечиваеєт секрецию варианта В55І, /5 Ззкспрессированного клетками-хозяевами, несущими вектор. Сигнальная последовательность может представлять собой последовательность, естественно ассоциируемую с последовательностью нуклеийновой кислотьі или другого происхождения.

Вектор может представлять собой любой вектор, которьій можно удобно подвергнуть технологий рекомбинантньїх ДНК, и вьібор вектора часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую он должен бьть 2о введен. Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующиьіся вектор, т.е. вектор, которьій существует как внехромосомньй обьект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации; примерами такого вектора являются плазмида, фаг, космида, минихромосома или вирус. С другой сторонь, вектор может представлять собой вектор, которьй, когда вводится в клетку-хозяина, интегрируется с геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой /хромосомами/, с которой он обьединен. Примерами с ов подходящих векторов являются вектор бактериальной зкспрессии и вектор зкспрессии дрожжей. Вектор настоящего изобретения может нести любую из последовательностей нуклеиновьїх кислот по изобретению, о і) которьїх упоминалось вьіше.

С другой стороньі, изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного полипептида, причем упомянутьй способ включает // вставку молекуль! нуклеиновой кислотьї, упоминавшейся вьіше, в гибридньй б зо ген, которьій способен реплицироваться в специфической клетке-хозлине или организме; /І/ введение получающегося в результате рекомбинантного гибридного гена в клетку-хозяина или организм; /ПШ/ о вьращивание образующейся в результате клетки в или на культуральной среде, или идентифицирование и «- репродуцирование организма, для зкспрессии полипептида; и /м/ извлечение полипептида.

Среда, используемая для вниіращивания клеток, может бьіть любой обьічной средой, подходящей для зтой со з5 цели. Подходящим вектором может бьть любой вектор из описанньїх вьіше, и соответствующая клетка-хозяин «г может бьіть любой из типа клеток, описанньїх вьіше. Способьі, используемье для конструирования вектора и осуществления введения его в клетку-хозяина, могут бьіть любьми из известньїх методов, применяемьх для зтих целей в технологий рекомбинантньх ДНК. Вариант рекомбинантной человеческой В55І, зкспрессированньй клетками, может бьть секретирован, т.е. транспортирован через клеточную мембрану, « способом, зависящим от типа клетки и состава вектора. в с Если вариант В5З5І продуцируется внутриклеточно рекомбинантньм хозяином, т.е. он клеткой не

Й секретируется, он может бьть извлечен стандартньми процедурами, включающими разрушение клетки а механическими способами, например, ультразвуком или гомогенизацией, или ферментньімми или химическими способами, с последующей очисткой.

В целях секреции последовательности ДНК, кодирующей вариант В5З5Ї, должна предшествовать ї5» последовательность, кодирующая сигнальньй пептид, присутствие которого обеспечивает секрецию варианта

В5З5І из клеток таким образом, что по крайней мере значительная часть зкспрессированного варианта ВЗ5І. со секретируется в культуральную среду и извлекается. - Изобретение также относится к системе зкспрессии содержащей гибридньй ген, которьій зкспрессируется в 5р клетке-хозяине или организме-хозяине, несущих упомянутьй гибридньй ген, так что рекомбинантньй о полипептид продуцируется, когда зкспрессируется гибридньй ген, причем упомянутьй гибридньй ген

Ге продуцируется посредством вставки последовательности нуклейновой кислотьі, упомянутой вьше, в ген, способньйй посредничать в зкспрессии упомянутого гибридного гена.

Возможньм способом получения варианта рекомбинантной В55І по изобретению является способ с Мспользованием трансгенньїх, не принадлежащих к человеку, млекопитающих, способньїх вьіделять вариант

В5БІ в свое молоко. Использование трансгенньїх, не относящихся к человеку, млекопитающих имеет то (Ф, преимущество, что можно получать большой вьїход варианта рекомбинантной В5З5І при разумной стоимости, и ка особенно то, что когда не относящимся к человеку млекопитающим является корова, вариант рекомбинантной

В5ЗІ продуцируется в молоке, которое является естественной составляющей, например, детского питания, так бо что не требуется дорогостоящей очистки, когда вариант рекомбинантной ВЗЗІ. должен использоваться в качестве питательной добавки к продуктам на основе молока.

Кроме того, продуцирование в вьісшем организме, таком как не принадлежащее к человеку млекопитающее, естественно, ведет Кк правильному процессингу белка млекопитающего, например, в отношений посттрансляционного процессинга, как обсуждаєтся вьше, и к надлежащей складчатости. Также можно бе получить большое количество по существу, чистого варианта В55І.

Соответственно, система зкспрессии, отнесенная к вьішеупомянутой, может представлять собой систему зкспрессиийи у млекопитающего, содержащую последовательность ДНК, кодирующую вариант В55І, вставленную в ген, коюодирующий белок молока не принадлежащего к человеку млекопитающего, с тем, чтобь образовать гибридньій ген, которьій зкспрессируется в молочной железе взрослой самки млекопитающего, несущей упомянутьй гибридньй ген.

Молочная железа, как ткань зкспрессии, и геньї, кодирующие белки молока, вообще, рассматриваются как особенно подходящие для использования при производстве гегерологичньїх белков в трансгенньх, не принадлежащих к человеку, млекопитающих, так как белки молока продуцируются естественно при вьісокКомМ уровне зкспрессии в молочной железе. Кроме того, молоко легко собирается и доступно в больших количествах. 7/0 В связи с зтим использование генов белка молока при продуцирований варианта рекомбинантной В55І., имеет еще то преимущество, что он продуцируется в условиях, подобньім условиям его естественного производства в смьісле регуляции зкспрессии и места продуцирования /молочная железа)/.

Когда гибридньй ген, упомянутьй вьіше, используется в трансгенном млекопитающем, он, предпочтительно, содержит последовательность, кодирующую сигнальньй пептид, с тем, чтобьії создать возможность правильного 7/5 секретирования гибридного генного продукта в молочной железе. Сигнальньій пептид будет, как правило, представлять собой пептид, которьій обьічно обнаруживается в гене молочного белка, о котором идет речь, или пептид, ассоциированньїй с последовательностью ДНК, кодирующей вариант В55І. Однако, другие сигнальнье последовательности, способнье посредничать в секреции продукта гибридного гена в молочную железу, также являются уместньіми. Конечно, различнье злементь! гибридного гена должнь! сливаться таким образом, чтобь го боздать возможность для правильной зкспрессиий и процессинга генного продукта. Таким образом, последовательность ДНК, кодирующая сигнальньій пептид отбора, должна бьіть точно слита с М-концевой частью последовательности ДНК, кодирующий вариант В55І. В гибридном гене последовательность ДНК, кодирующая вариант В55І, будет обьічно, содержать его стоп-кодон, но не расщепление своей собственной информации и сайт полиаденилирования. В прямом направлений последовательности ДНК, кодирующей с ов вариант ВЗЗІ.,, процессинговне последовательности мРНК гена белка молока будут обьічно сохраняться.

Предполагаєтся, что ряд факторов является ответственньм за фактический уровень зкспрессии і) определенного гибридного гена. Способность промотора, как и других регуляторньїх последовательностей, как упоминается вьіше, интеграция сайта системь! зкспрессий с геномом млекопитающего, интеграция сайта последовательности ДНК, кодирующей вариант В55І, с геном, кодирующим белок молока, злементь, Ге! зо сообщающие посттранскрипциональную регуляцию, и другие подобнье факторь), могут представлять существенное значение для получаемого уровня зкспрессии. На основе знаний о различньїх факторах, о влияющих на уровень зкспрессии гибридного гена, специалисту будет известно, как сконструировать систему - де зкспрессии, подходящую для данной цели.

Ген белка молока, которьій используется, может бьть получен из того же вида, в котором должна со з5 размещаться система зкспрессии, или он может бьїть получен от другого вида. В зтой связи показано, что «г регуляторнье злементьі, которние нацеливают зкспрессию гена в молочную железу, являются границами функционально перекрестньїх видов, что может происходить благодаря возможному общему предшественнику /Неппіднацзеп еї а/!., 1990/,

Примерьї подходящих генов, кодирующих белок молока или его зффективнье последовательности, которьіе « Мспользуются при конструирований системь! зкспрессии настоящего изобретения, обьічно находят среди белков 7-3) с молочной сьіворотки, полученной от различньїх млекопитающих, например, ген кислого белка молочной

Й сьіворотки ЛМАР/, предпочтительно происходящей от мьши, и ген р-лактоглобулина, предпочтительно "» происходящего от овцьї. Найдено, что также геньі казеина различного происхождения могут бьіть подходящими для трансгенного получения варианта В55І, например, коровий И51 -казейн и кроличий р-казейин. Предпочтительнь/м, в данном случає, геном является ген мьішиного УАР, так как обнаружено, что он способен г» обеспечивать вьісокий уровень зкспрессии ряда чужеродньх человеческих белков в молоке различньх трансгенньїх животньїх /Неппіднаизеп еї аї!., 1990/, со Другой последовательностью, предпочтительно взаймодействующей с системой зкспрессии настоящего - изобретения, является так назьваемая стабилизующая зкспрессию последовательность, способная посредничать в зкспрессии вьісокого уровня. Существуют твердье указания, что такие стабилизирующие о последовательности обнаруживаются около и в обратном направлений генов белков молока. (Че) В изобретение также включается способ продуцирования трансгенного, не принадлежащего к человеку, млекопитающего, способного зкспрессировать вариант В55І,, включающий /а/ введение вьішеупомянутой системь! зкспрессии в оплодотворенную яйцеклетку или клетку змбриона не принадлежащего к человеку млекопитающего, с тем, чтобьі включить систему зкспрессии в зародьш млекопитающего, и і) /рБ/ развитие получающихся в результате интродуцированньїх оплодотворенной яйцеклетки или змбриона во іме) взрослую самку млекопитающего, не принадлежащего к человеку.

Включение системь! зкспрессии в зародьш млекопитающего может бьїть осуществлено с использованием 60 подходящих технических приемов, описанньїх , например, в "МапіршанНптпуд (те Моизе Етьгуо", А І арогаюгу

Мапаиаї! Соїйа Зргіпд Нагбог І арогаїогу Ргезв, 1986. Например, несколько сот молекул системьі! зкспрессии могут бьіть введеньі непосредственно в оплодотворенную яйцеклетку, например, в оплодотворенную одноклеточную яйцеклетку или в ее пронуклеус, или в змбрион отобранного млекопитающего, и микроиньецированнье яйцеклетки затем переносят в яйцеводь! псевдобеременньїх приемньхх матерей, и оставляют развиваться. 65 Способ продуцирования трансгенного, не принадлежащего к человеку млекопитающего, способного зкспрессировать вариант В55І, может также включать метод, при котором упомянутое млекопитающее, по существу, не способно зкспрессировать В55І из самого млекопитающего. Такой способ включает /а/ разрушение способности зкспрессирования В55І млекопитающего таким образом, что В55І млекопитающего, по существу, не зкспрессируется, и введение виішеупомянутой системь! зкспрессии в зародьіш млекопитающего так, что в млекопитающем зкспрессируется вариант В5З5І, и/или /б/ замещение гена В55І. млекопитающего или его части на вьішеупомянутую систему зкспрессии.

Способность зкспрессирования В5З5І. млекопитающего может бьіть подходящим образом разрушена путем введения мутаций в последовательность ДНК, ответственную за зкспрессию ВО5І. Такие мутации могут включать мутации, которье вьставляют последовательность ДНК из рамки, вводят стоп-кодон или /о осуществляют делецию одного или нескольких нуклеотидов из последовательности ДНК.

Ген В55І млекопитающего или его часть могут бьіть замещеньі системой зкспрессии, определенной вьіше, или последовательностью ДНК, кодирующей вариант В55І, путем использования хорошо известньїх принципов гомологичной рекомбинации.

Важньм аспектом изобретения является также трансгенное, не относящееся к человеку, млекопитающее, /5 Несущее в своем геноме последовательность ДНК, упомянутую вьіше. Упомянутая последовательность ДНК может присутствовать, предпочтительно, в зародьше млекопитающего, и в гене белка молока млекопитающего.

Трансгенное, не принадлежащее к человеку млекопитающее может бьїть, вьібрано, предпочтительно, из группь, состоящий из мьішей, крьіс, кроликов, овец, свиней и крупного рогатого скота.

В изобретение также включаются потомство упомянутого, не принадлежащего к человеку, млекопитающего, го а таюке молоко, полученное от такого трансгенного, не принадлежащего к человеку, млекопитающего.

Изобретение также относится к детской формуле /детскому питанию/, содержащей вьішеупомянутое молоко, и к детской формуле, содержащей вьішеупомянутьій вариант В55І. Детская формула может бьїть получена с использованием обьічньїх технических приемов, и содержать любье необходимье добавки, такие как минеральнье соли, витаминь и т.п. с

Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей вьішеупомянутьй вариант

В5З5І, а также, к применению такого вайанта В55І при лечении. (8)

В других аспектах, изобретение относится к применению вьшеупомянутого варианта В5З5ІЇ для производства лекарственньїх препаратов для лечения паталогического состояния, относящегося к зкзокринной недостаточности поджелудочной железьі; муковисцидозу; хроническому панкреатиту; жировой малабсорбции; ду зо малабсорбции жирорастворимьх витаминов; жировой малабсорбции вследствие физиологических причин.

Изобретение также относится к применению варианта ВЗ5І для производства лекарственньїх препаратов для о улучшения усвоения пищевьїх липидов, в особенности, недоношенньіми детьми. «-

ПРИМЕРЬ

1. Зкспрессия рекомбинантной ВЗ5І в зукариотньїх и прокариотньїх клетках со 1.1. Методики зкспериментов «Е 1.1.1. Рекомбинантиве плазмидь!

Плазмиду раз 146, содержащую кДНК человеческой В55І с 2,3 т.п.о., клонированную в рисС19, переваривают с Ніпа І и заї І, и кКДНК вводят в вектор зкспрессии вируса папилломьї коровьі /«ВРМ/ р5 147 /фиг1А/. Зтот вектор содержит кКДНК человеческой ВЗ5І. под контролем знхансера - мьішиного металлотионеина 1 /тМТ-1/ и « промоторного злемента /Раміакіз Натег, 1983/. Сигнальї процессинга мРНК обеспечиваются геномньм з с фрагментом, содержащим часть зкзона ІІ, интрона ІІ, зкзона П, и в прямом направлений злементь! гена кроличьего р-глобина. Зту единицу транскрипции клонируют в вектор, содержащий полньй геном ВРУ. ;» Транскрипция является однонаправленной для ВРМ и для единиць! транскрипции В55І. Для размножения вектора в Е.соіЇ вектор содержит также рМіІ 2а, производное рВКЗ322 /Заїмег еї а). 1982/.

Вектор зкспрессиий р 147 котрансфецируют вектором, кодирующим ген устойчивости Кк неомицину, ї» произведенному 5 длинньім концевьім повтором вируса саркомьі Харвея и сигналами полиаденилирования обезьяньего вируса 40 /Л изівеу 5 Ворспап, 1984/. бо Для зкспрессии В55І в Е.соЕ! кКДНК В5З5І. субклонируют как фрагмент Маеї! - Ват НІ из плазмидь! р17-7 - /А!йзцБроЇ еї аЇ,, 1992/ в плазмиду рРОЕМЕХ-1 (Рготеда, Мадівзоп, УМІ, ОА) /5іцаІег 5 Мойаї, 1986/. Зтой 5о процедурой клонирования кодирующую последовательность гена 10 Т7 замещают геном ВЗ, кодирующим о зрельій белок, предшествующий инициирующему кодону. Окончательньій вектор зкспрессии, РСЕМЕХ)/ В5З5І, (Че) подтверждаєтся расшифровкой последовательности ДНК с использованием внутренних праймеров специфичной В55І. 1.1.2. Мутагенез

Нуклеотидньй номер 1 присваийваєется А в инициирующем кодоне АТО. Для нумерации аминокислот первьй метионин в сигнальном пептиде является 23, и первьій аминокислотньій остаток зрелого белка - аланин - іФ) снабжаєется номером 1. ко Для конструирования варианта делеции А/ЗЕО ІЮ МО:4/ синтезируются два праймера РОК - РОК -1 и РОК - 2 /табл.1/. Для клонирования в различньїх плазмидах создают сайть! Ніпа Ії, ЗаІ І и Ват НІ. Сайт Всі бо генерируют в последовательности В55І. без изменения аминокислотной последовательности. Зто делается для облегчения добавления синтетической ДНК для получения других вариантов. Праймер РСК - 2 содержит два синтетических стоп-кодона. Получающиеся в результате фрагменть! РСК переваривают с Вам Ні и Ніпа Ш и клонируют в р ОС18 для анализа последовательности. Зту плазмиду обозначают р5 157. Правильньій фрагмент

РСК вставляют в вектор зкспрессий ВРМ путем слияния с последовательностью В55І в уникальном сайте 65 Авр700 /положение 1405 в кКДНК В55І/, и в сайте заї І перед фрагментом гена р-глобина, получая в результате рз 257.

Конструкцию В-варианта /5ЕО І МО:5/ создают, используя олигонуклеотидь! с номерами 3, 4, 7 и 8 /табл.1/.

Гибридизованнье олигонуклеотидьі кодируют самую С-концевую аминокислотную последовательность, представляющую в белке полной длиньі часть с лизина 712 по фенилаланин 722. Зтот фрагмент сливают с

Гглутамином 535. Конец трансляции вставляют прямо после последнего фенилаланина. Фрагмент содержит сайт

Всі І в 5''окончании и сайт заї І в 3 -окончании, допуская интродукцию в р5 157. Получающуюся в результате плазмиду переваривают с Авзр700 и за! І, и фрагмент 313 т.п.о. вставляют в вектор зкспрессии, как описано вьіше. Получающуюся в результате плазмиду обозначают рз 258.

ТАБЛИЦА 1 70 Синтетические олигонуклеотидь!ї, используемье для конструирования вариантов В55І. Нуклеотидьї сайтов рестрикции подчеркнутьі. Стоп-сигнальї трансляции указьваются жирньми буквами. Измененньй кодон в варианте М указьівается в РСК-3 жирньїми буквами и звездочкой.

Олиго- Последовательность нУКЛеОТИЛ

СОООБАССССААССАСАТСАСССТСТТССОССАСТСТ

: сч з 177 (мнтоютютюжєтюню 0000 о

СеССОСА и ИН

Ф

МО спа С: ІННО Фо

Чтобьі сконструировать ген, коюодирующий С-вариант /"ЗЕО ІЮ МО:6/, используют олигонуклеотидь с 1 по 6 -- /табл.1/. Фрагмент гибридизованной ДНК содержит два повторения/ кодирующих одиннадцать аминокислот, (ее) идентичнье консенсусу /МіІвзоп еї аї., 1990/, вставляемьх между глутамином 535 и последовательностью с лизина 712 по фенилаланин 722. Зтот фрагмент содержит также сайт Всі І в 5' - окончанийи и сайт Заі! І в 3 З -окончаний/ создавая условия для такой же стратегии клонирования/ которая описана вьіше. Получающаяся в результате плазмида обозначаєтся р 259.

Для конструирования варианта М /вариант не М-гликозилированньй, ЗЕСО ІЮО МО:7/ синтезируют два « дю праймера РСК /РСК-3 и РОК-4 в табл.1/. Создают сайть! Есок І и Ват НІ для клонирования продукта РСК в 360 з т.п.юо. в рОИС19 для анализа последовательности. Сайт потенциального М-связанного гликозилирования в с аспарагине 187 заменяют на глутамин. Модифицированную последовательность вьіделяют как фрагмент Ваї І - :з» Ніпа І и клонируют в .Зас | и Ніпа І расщепленную руС19 вместе с Зас І и Ваї І Фрагментом, содержащим промотор тМ'тТ-1 и 5-окончание кКДНК В55І. Из зтой плазмидь вьіделяют фрагмент Зас | - Ога приблизительно в 1,2 т.п.о., и вставляют в злемент тМТ-1 и последовательность КДНК В55І, соответственно, в 1» 15 вектор зкспрессии. Получающуюся в результате плазмиду обозначают роз 299. 1.1.5. Культура клеток млекопитающего и трансфекции. (ее) Векторьї котрансфецируют в клеточную линию мьшей С127 /"АТСС СК 1616/ в соответствии со способом - осаждения фосфатом кальция /Зганагп 5 Мапаег Е8, 1973/.

Клетки С127 вьращивают в смеси Нат'з Е12 и модифицированной по способу Дульбекко средьі Игла (ав) 20 /ЮМЕМ/ /1:1/,єс добавлением 1095 фатальной телячьей сьшворотки. Отбирают клоньі клеток, устойчивьмх к

Ге) неомицину, с 1,5 мг х мл"! о 418, и через 10 - 15 дней вьіделяют клоньї устойчивьїх клеток из мастер-планшетов и берут на анализ. 1.1.4. Бактериальнье штаммь и условия культивирования.

Для зкспериментов по зкспрессии вектор РОЕМЕХ/В трансформируют в штаммь! Е.сої! У М109 (О ЕЗ) и ВІ 21 (ОЕЗ) рі из 5. Зксперименть! по зкспрессии вьіполняют так, как описано в ЗіцаПег еї аї. (1986). После сбора (Ф) бактерий клетки осаждают центрифугированием /5000 х д в течение 1Омин. при 4"С/. Для получения фракций

ГІ периплазмьї и цитоплазмь! осадок ресуспендируют в 4мл Трис-СІ с 20905 сахарозьі, рН 8/0, 200мкл 0,1М ЗДТК и 40Омкл лизоцима /15мг/мл в воде/ на грамм клеточного осадка. Суспензию инкубируют на льду в течение 40 бо минут. Добавляют 16б0мкл 0,5М Мас на грамм осадка, после чего суспензию центрифугируют при 12000 х а.

Образующийся в результате супернатант содержит белки периплазмь, и осадок представляет собой цитоплазменную фракцию. С другой стороньі, для получения растворимьїх белков клетки суспендируют в 40ММ

Трис-С1, 01мМ ЗДТК, 0,5мММ фенилметилсульфонилфторида, рН 8,2, замораживают-оттаивают и разрушают ультразвуком, в течение некоторого времени, чтобьї вьізвать лизис. Клеточньій лизат центрифугируют /30000 ч де 9 в течение ЗОмин. при 257. 1.1.5. Анализ нуклеиновьх кислот.

РНК и ДНК получают из изолированньїх клеточньїх линий млекопитающего или из клеток Е.сої!; /А!йизибсі еї аІ., 1992/. РНК и ДНК фракционируют на агарозньхх гелях и блотируют на Сепебсгееп РіІив/Мем/ Епдіапа Мисіеаг/, и гибридизируют в соответствий с указаниями поставщика. 1.1.6. Получение нативного фермента.

Стимулируемую солями желчи липазу очищают от человеческого молока как описано ранее /ВІідскрегд є

НетеїІ, 1981/, Очищенньй препарат является гомогенньм, судя по ЗОЗ - РАСЕ /злектрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия/ и имеет специфическую активность в 100мкмоль вьіделенньїх жирньх кислот х мин" и мг", когда испьітьіваєтся с длинноцепньім триацилглицеролом в качестве 70 субстрата. 1.1.7. Ферментньй анализ.

Ферментньій анализ проводят как описано в /Відскрега 5 НегпеїІ,1981/, используя в качестве субстрата триолеин, змульгированньій с аравийской камедью. Инкубацию вьіполняют с 10ММ холата натрия в качестве активирующей соли желчи. Когда проверяют зависимость от соли желчи, соли желчи /холат натрия или 75 дезоксихолат натрия, Зідта Спет Со./ добавляют до концентраций, данньїх на фиг.3. 1.1.8. Вестерн-блоттинг.

Для ополучения важньх реакций в блоттинг-зкспериментах кондиционнье средь концентрируют хроматографией на сефарозе Віце /Рпаптасіа СВ Віоїесппоіоду/. Соответствующие средьі смешивают с сефарозой /приблизит. 1О0мл средь на мл геля/. Гель промьівают /1Омл на мл геля/ 0,5М буфером Трис-СІ, рн 7.4, содержащим 0,1М КСІ. Ферментную активность оценивают в том же буфере с 1,5М КСІ. По зтой процедуре получают 25 - ЗО-кратную концентрацию, так же, как и З - 5-кратную очистку. ЗО5-РАСЕ вьіполняют на 1090 полиакриламидньх гелях, в соответствии , по существу, с І аеттії! /1970/. После переноса в нитроцеллюлознье мембрань и инкубации с поликлональной кроличьей антисьвороткой к очищенной В5З5І, осуществляют определение, используя козий антикроличий Ід, коньюгированньй с щелочной фосфатазой, и проявляющий с набор от Віо-Каа. 1.1.9. Обработка М-гликозидазой РЕ. о

К ТОмкл варианта В, содержащим активность В55Ї в 2,5МмкмМоль вьіделенньїх жирньїх кислот х мин., добавляют 1мкл 1М р-меркаптозтанола и 0,5мкл 1095 (м/о) 5ХО5. После кипячения в течение 5мин. добавляют 1Омкл Ма-фосфатного буфера, рН 8,0, бмкл 0,1М ЗДТК, 4мкл 7,595 (м/о) нонидета Р 40 и бмкл /ЛЕ/ Ф

М-гликозидазь Е /Воепгідег, МапппеїІт/. для контроля обрабатьввают идентично такое же количество варианта В, о за исключением того, что гликозидазу не добавляют. После инкубации в течениє ночи при 37 С образць прогоняют на ЗХО5-РАСЕ и блотируют, используя поликлональную кроличью антисьіворотку ВЗ5І. - 1.2. Результать!. со 1.2.1. Конструирование вариантов в В55І.

Модификации вариантов В55І по отношению к В55І с полной длиной суммируются в табл. 2 и на фиг.1Б. «І

Стратегия, применяемая для генерации зтих вариантов, описьіваєется в разделе 1.1. Для варианта А /5ЕО ІЮ

МО:4/ вводят стоп-кодон после глутамина в положении 535, удаляя, тем самьм, последние 187 аминокислот белка полной длиньі. Для варианта В /ЗЕО ІЮ МО:5/ домен, кодирующий 11 самьїх С-концевьїх аминокислот, и « первоначальньій трансляционньій конец сливают с глутамином-535. Следовательно, зтот вариант лишен всех повторов. Для варианта С /5ЕО ІЮ МО:6/ фрагмент, содержащий два повтора, имеющих последовательность, - с идентичную консенсусу /МіІззоп еї аїЇ.,, 1990/, вставляют между глутамином-535 и последовательностью с ч лизина-712 по фенилаланин-722. я Чтобьї проанализировать важность единственной зкспериментальной М-связанной углеводной структурь, расположенной около активного сайта серина-194, конструируют вариант. Вариант М /ЗЕО ІЮ МО:7/ получают путем перестройки сайта потенциального М-гликозилирования в аспарагине-187 в глутамин. щ» со - що С вваюкою 11010101 вот

С ввваюкююу 11010101 вот

Фо 0 сввоюкоюу 10101000 вся висті 00000000

С охвваютоту 11111111 леви 1.2.2. Исследование рекомбинантной ДНК в клеточньїх линиях млекопитающего.

Образцьї ДНК получают из клеточньїх линий, трансфецированньїх векторами зкспрессии, кодирующими о различнье вариантьі ВЗ5Ї. Полученнье ДНК расщепляют Ват НІ, фракционируют на агарозньїх гелях и іме) переносят на мембраньії для гибридизации. Используемьм зондом является КДНК В5З5І, меченая З2р,

Результать! гибридизации подтверждают присутствие рекомбинантньїх генов, а также то, что число копий бо вектора приблизительно одинаково в различньїх клеточньїх линиях /фиг.2/. Положения гибридизующихся фрагментов отражают различную длину последовательностей различньїх ВЗ5І, и согласуются с ожидаемьми размерами. Положения подобньі также ДНК, полученной из бактерий, используемой в зксперименте с трансфекцией, что указьіввает, что в клеточньїх линиях не происходит главной реаранжировки векторной ДНК /фиг.27. 65 Верхние сигнальїь гибридизации в образце ДНК, представляющем вариант А, существуют, вероятно, вследствие частичного расщепления.

1.2.3. Зкспрессия МРНК для В5З5І. полной длинь и мутированной в клетках млекопитающего.

Чтобьї проанализировать зкспрессию различньх рекомбинантньх В55І, сгень РНК ополучают из изолированньїх клеточньїх линий. Нозерн-блот-зкспериментьі и гибридизация с кКДНК ВО5І, меченой З2Р, показьівают, что рекомбинантную мРНК можно обнаружить во всех клеточньїх линиях, несущих вектор ВЗ5І. /фиг.3/. Гибридизация не обнаруживается в контрольном образце, полученном из клеточной линии, содержащей идентичньїй вектор, за исключением КДНК В55І. /фиг.3/.

Различная длина гибридизующихся мРНК находится в соответствии с модификациями кДНК. Уровни устойчивого состояния вариантов мРНК рекомбинантньїх В5З5І являются одинаковьми за исключением 70 варианта А /фиг.3/. Причина уменьшенного накопления мРНК варианта А неизвестна, но ее наблюдают в двух популяциях клеточньїх линий, как и в изолированньїх клонах. Присутствие равньїх количеств РНК в различньх образцах подтверждаєтся гибридизацией с зондом к мьішиному р-актину /фиг.3, нижний снимок/. 1.2.4. Получение В55І полной длинь и вариантов В5З5І в клетках млекопитающего.

Средьі из отдельньїх клонов клеток С127 , трансфецированньїх ВЗ5І полной длиньй и В55І различньх 75 мутированньїх форм, собирают и испьітьвают на активность ВЗ5І /фиг.4/. Для молекульі полной длинь и вариантов М, В и С активность в клонах с найвьісшей зкспрессией лежит в интервале от 0,7 до 2,3мМкмМоль вьіделенньїх жирньїх кислот х мин" х(мл средь)". Для специфичной активности, сравнимой с активностью нативной В58І. молока, зто будет соответствовать уровню зкспрессии 7 - 2Змкг х (мл средь)". Для варианта А все анализированнье клоньі имеют активность ниже 0,05мкмоль вьіделенньїх жирньїх кислот х мин" и (мл средь)"!. Концентрация сефарозьі Віче и лиофилизацин клона, демонстрирующего найвьісшую активность, показьівают, что активньій фермент в самом деле зкспрессируется, хотя с очень низким уровнем. Вероятность, что низкая активность, полученная для варианта А, частично может бьіть обьяснена значительно более низкой специфической активностью, не может бьіть исключена.

Вестерн-блоть! клонов различньїх зкспериментов с трансфекцией приводятся на фиг.5А. Как и ожидалось, с 29 существуют явнье М, вариантов ВЗ5І. Однако, следует отметить, что для В55І полной длиньі, как и для Ге) вариантов В и С, получают двойную полосу. Поскольку все три имеют единственньій неповрежденньій сайт

М-гликозилирования, тогда как вариант М, которьій не демонстрирует двойной полосьї, не имеет такого сайта, вероятньім обьяснением будет то, что двойная полоса является результатом различий в М-гликозилирования.

Следовательно, вариант В подвергаєется перевариванию с М-гликозидазой Б. Как видно из фиг.5В, только о следовье количества остаются от верхней полосьі, в то время как нижняя полоса усиливается, указьвая, что ав) только часть зкспрессированного варианта М-гликозилируется.

Одной из особенностей В55І является ее специфическое активирование первичньмми солями желчи, - например, холатом /НегпеїЇ, 1975/. Все различнье рекомбинантнье формь! ВЗ5І показьвают одну и ту же о зависимость от концентрации для активации холатом /фиг.б6/. Максимальную активность в использованной 39 системе испьітаний получают при 10мМ. Когда холат заменяют на дезоксихолат /вторичная соль/, активации не т происходит. Таким образом, рекомбинант полной длиньі, так же, как и различнье вариантьі, обнаруживают одинаковую специфичность относительно активации солями желчи. 1.2.5. Зкспрессия и биохимические исследования В55І. полной длиньї в Е. сої. «

Два штамма БЕ. сої! - УМ109 (ОЕЗ) и ВІ 21 (ОЕЗ) рі уз5/5щшайїйег еї аї., 1986/ - трансформируют вектором 7 70 зкспрессим рОЕМЕХ/В55І, содержащим кДНК человеческой В5З5І под контролем опромотора 17. с Трансформанть! из обоих штаммов идентифицируют, культивируют и индуцируют ІРТО з /изопропилтиогалактозидом/ в течение около ООмин. /Зіца|ег ей а), 1986/. Анализ полной мРНК нозерн-блотированием с использованием кКДНК В55І в виде пробьї, меченой 32р, показьіваєт, что зкспрессия зффективно индуцируется в обоих штаммах, и что транскрипция твердо регулируется /фиг.7А/. Обнаруженньй ї» що размер мРНК рекомбинантной В5З5І. - приблизительно 2,4 т.п.о. - соответствует ожидаемой длине. Разделение образцов белка 5БО5 - РАСЕ и иммунологический анализ с антителами анти- В55І показьшвают, что ВЗ5І. (ее) полной длиньї зффективно продуцируется в Е. сої! /фиг.7В/. В штамме ВІ. 21 (ОЕЗ)ріІ уз5 секретируется белка в - периплазму больше, чем в штамме .) М109 (СЕЗ) /фиг.7В/.

Индуцированнье РТС культурьі ЕЕ. соїЇ содержат оактивную растворимую В55ІЇ в количестве, (ав) соответствующем 0,5 - 4мкг белка В55І на мл культурьі. Вестерн-блоттинг показьіваєт, что в нерастворимом с осадке находится от 20 до 6095 реакционноспособного материала. Неиндуцированнье бактерии не содержат сколь-нибудь заметной активности В55І.

Активность липазьії из вьіращенньїх бактерий показьшаєт такую же зависимость от солей желчи, как и 5 нативная молочная В55І. 2. Очистка и исследование рекомбинантньїх полной длинь! и мутированньїхх форм стимулируемой солями

ГФ) желчи липазь.

Ге 2.1. Методики зкспериментов. 2.1.1. Ферменть и варианть! ферментов. во Конструируют и зкспрессируют рекомбинантнье ВОЗІ с полной длиной и вариантьі В55ЗІ В, С и М, как описано ранее. По сравнению с нативньм ферментом вариант в /"ЗЕО ІЮ МО:5/ не имеет все 16 уникальньх,

О-гликозилированньмх, богатьїх проливом С-концевьїх повторов /аа 536 - 711/, но имеет наибольший С-концєвой фрагмент /аа 712 - 722/, слитьій с глутамином 535. Вариант С /ЗЕО ІЮ МО:6/ содержит такой же С-концевой фрагмент и два сповтора из 11 остатков между глутамином 535 и лизином 712, В варианте М /не-М-гликозилированньій вариант, ЗЕСО 0 МО:7/ аспарагин 187, ответственньй за единственньй б5 М-связьіваемьй сахар, обменивается на остаток глутамина.

Нативную В55І очищают от человеческого молока как описано в ВідсКрега 85: Негпеї! (1981). 2.1.2. Ферментньй анализ.

Активность липазьі проверяют так, как описано в ВідсКрегд 85 Негпеї! (1981), используя в качестве субстрата триолеин, змульгированньй в аравийской камеди. В качестве активирующей соли желчи используют холат натрия /ЛОмМ/. Различнье модификации испьїтаний даются в подписях к рисункам. 2.1.3. Получение иммуносорбента.

Очищенную молочную В55І. /5мг/ связьівают с сефарозой, используя СМВг, как рекомендует производитель.

Через колонку пропускают 40мл поликлональной антисьіворотки, полученной в кролике против очищенной 70 молочной ВЗ5І. Специфичнье антитела злюируют 0,1М глицином с НСІ, рН 2,5. Сразу же доводят рН до приблизит. 8 твердьм Трисом. После обессоливания и лиофилизации бмг аффинньїх очищенньїх антител связьнвают с сефарозой, как описано вьіше. 2.1.4. Процедура очистки.

Кондиционнье культуральнье средьії, содержащие 5 - 25мкг рекомбинантной зкспрессированной ВОЗІ. или /5 Варианта ВЗ5І., смешивают с сефарозой синей /Ррагтасіа, Зм'"едеп/ 10мл сред на мл структурированного геля.

После перемешивания в течение ЗОмин. гель ополаскивают 0,05 М Трис-СІ, рН 7,0, 0,05М КС, и липазную активность злюируют 0,05 М Трис-СІ, рН 7,0, 1,5М КСІ. Пики активности обьединяют и диализуют против 5ММ натрийверонала, рН 7,4, 0,05М Масі. Диализат вносят в колонку с гепаринсефарозой. Колонку злюируют градиентом 0,05 - 1,0М Масі в 5мММ натрийверональном буфере, рН 7,4. Фракции, содержащие липазную го активность, обьединяют и вносят в колонку с иммуносорбентом. После промьівания 0,05М Трис-СІ, рН 7,5, 0,15М Масі, связанную липазу злюируют 0,1М глицином с НОСІ, рН 2,5. Величину рН фракций сразу же доводят до приблизит. 8 твердьім Трисом. 2.1.5. Злектрофорез.

Злектрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия /505-РАСЕ/ осуществляют, по сч гьв существу, в соответствии с ІГагееттії /1970/. Белки подкрашивают кумассийи бриллиантовьм голубьм. 2.1.6. Анализ М-концевой последовательности. (8)

Анализ аминокислотньїх последовательностей осуществляют на пульсирующем жидкофазном секвенаторе

Арріїей Віозувіетв Іпс, 477А и на линейном фенилтиогидантойиновом анализаторе 120А с регулярньіми циклическими программами и химикатами от производителя. Вьічисленнье из секвенированного стандартного /(3у зо белка /р-лактоглобулин/, начальньй вьход и вніход повторов /герецшіме/ составляют 4795 и 9795, соответственно. 2.2.Результать!. - 2.2.1. Очистка рекомбинантной В55І и вариантов В55І. «--

Хроматографию на сефарозе синей кондиционньїх сред оиспользуют, прежде всего, как стадию концентрирования. Последующая хроматография на гепарин-сефарозе дает начальную очистку, главньм со образом, за счет удаления большей части альбумина, присутствующего в культуральной среде. Зта стадия « также показьивает, что молекульь рекомбинантной Ве55І оостаются все связаннье гепарином. После иммуносорбента оказьівается, что все вариантьі В55І имеют чистоту более 9095, судя по БО5-РАСЕ /фиг.8/.

Фермент полной длинь, как и варианть! В и С, мигрирует как дублет. Обнаруженнье М, различньїх вариантов приводятся в табл.3. Анализ М-концевой последовательности дает единственную последовательность для всех « 70 Вариантов для 8 циклов: Аїпа-Г уз-І егі-сІу-АІа-МаІ-Туг-Тнг-. шщ с 2.2.2. Активность липазь. й В табл.3 указьівается найденная молекулярная масса различньїх препаратов. Специфические активности "» препаратов находятся в интервале от 75 до 120мкмоль вьіделенньїх свободньїх жирньїх кислот в мин и на мг белка. Следовательно, нельзя обнаружить существенного различия в активности между В55І с полной длиной

М вариантами ВІ. ї» Все препаратьї демонстрируют абсолютную необходимость первичной соли желчи /холат натрия/ для активности против змульгированного длинноцепного триацилглицерола /фиг.ЗА/. Дезоксихолат натрия бо активирует некоторье варианть! /даннье не приводятся/. Однако, когда соединяют различнье соли желчи, - дезоксихолат имеет двойное действие /фиг.9В и С/. Во-первьїх, он снижаеєт концентрацию холата, необходимую 5р для активации, и во-вторьїх, он ингибирует ферментную активность при более вьісокой концентрации соли о желчи. іЧе) вв о ю 60 2.2.3. Устойчивость рекомбинантной В55І и вариантов В55І.

Рекомбинантная В55І, как и варианть В55І, обнаруживают ту же рН-устойчивость, что и нативная молочная В55І /фиг.10/. Инактивация во всех случаях происходит при рН 2,5 - 3. При рН свьіше З все варианть! совершенно устойчивьі), при условии, что концентрацию белка достаточно вьісока. Зто достигается путем 65 добавления альбумина коровьей сьіворотки или яичного альбумина /даннье не приводятся/. Разбавленнье образцьї менее устойчивь! при всех проверенньмх рН, но предел остается тем же самьїм /даннье не приводятся/.

Фиг.11 показьівает, что термостойкость рекомбинантньїх ферментов сравнима с термостойкостью нативного молочного фермента. При температуре 37 - 407 С активность начинает снижаться. Варианть! /В, С и М/ оказьіваются несколько менее устойчивьми, чем рекомбинантньй фермент с полной длиной и фермент молока. Однако, если концентрация белка увеличиваєтся путем добавления альбумина коровьей сьіворотки, все вариантьї! являются устойчивьіми также при 407 /фиг.11/.

Нативная молочная В55І и все рекомбинантнье вариантьї чувствительньі Кк трипсину. Получают зависимость инактивации от времени /фиг.12/. Однако, если в буфер включаются соли желчи, т.е., холат, варианть!ї липазьї защищаются, и активность липазь! сохраняется /фиг.12/. 70 Таким образом, что касается характеристик Іп міо, т.е., активации солями желчи, связьівания гепарином, рН- и термоустойчивости и защить! солью желчи от инактивации протеазами, то не обнаружено существенньх различий при сравнений различньїх вариантов В55І с нативной молочной В55І. 3. Зкспрессия в трансгенньїх животньх. 3.1. Конструирование векторов зкспрессии.

Чтобьі сконструировать вектор зкспрессий для продуцирования варианта человеческой рекомбинантной

В5З5І в молоке трансгенньїх животньїх, используют следующую стратегию /фиг.13/.

Получают три плазмидьі, содержащие различнье части гена человеческой В55І /рзз309, ра310 и разз311/, используя способь, описаннье в і/ІаВегу еї аї. /1992/. Плазмида рЗ309 содержит фрагмент 5рп 1, перекрьвающий ген В55І от 5 нетранскрибируемой области до части четвертого интрона. Плазмида р5З310 содержит фрагмент засі, перекрьиівающий генную последовательность варианта В55І от части первого интрона до части шестого интрона. Наконец, плазмида р5311 содержит фрагмент Ват НІ, перекрьвающий ген В55І из основной части пятого интрона и остатка структурь! интрон/зкзон с делециями в зкзоне 11. Последовательности с делециями представляют собой 231 п.о., что приводит к последовательности, кодирующей вариант В55І, которьій содержит точно 77 аминокислот, или на семь повторов меньше, чем В55І с полной длиной. сч в Нуклеотидная последовательность получающегося в результате варианта ВЗЗІ. /Вариант Т"/ дается в списке последовательностей как ЗЕО ІЮ МО:8. Аминокислотная последовательность варианта Т приводится в списке (8) последовательностей как 5ЗЕО ІЮ МО:9.

Вследствие вьісоко повторяющейся последовательности в зкзоне 11 гена человеческой В5З5І, можно ожидать относительно вьісокую частоту реаранжировок, когда зту последовательность клонируют в плазмидеи (Фу зо размножают в бактериях. На основе зтого предположения нужньй вариант ВЗЗІ., которьій содержит усеченньй зкзон 11, идентифицируют, изолируют и проводят анализ последовательности. о

Другую плазмиду п 5283, содержащую часть кКДНК человеческой ВЗ5І., клонированную в плазмиде ріЇїС19 в "дн сайтах Ніпа ІШ и Засі, используют для слияния геномньїх последовательностей. Плазмиду рб283 также используют, чтобьі получить сайт правильной рестрикций фермента, Крп І, расположенньй в 5 со нетранслируемой лидерной последовательности В55І. «Е

Плазмиду р5283 раскрепляют Мсої и Засі, и злектрофорезом вьіделяют фрагмент около 2,7 т.п.о. Плазмиду рзЗ0О9 расщепляют Мсо!Ї и В зрЕЇїЇ, и вьіделяют фрагмент около 2,3 т.п.о. содержащий 5 -часть гена В55І.

Плазмиду рЗ310 расщепляют В зрЕЇ и Засі, и вбіделяют фрагмент около 2,7 т.п.о., содержащий часть средней области гена В55І. Зти три Фрагмента лигируют и трансформируют в компетентньій Е. соїЇ, штамм ТО2, и « трансформанть изолируют отбором с ампициллином. в с Получают плазмидь из некоторого количества трансформантов, и одну плазмиду, назьваемую р5з312

Й /фиг.14/, содержащую нужную конструкцию, используют для дальнейших зкспериментов. и?» Чтобьї получить модификацию ро311, в которой сайт Ват НІ, расположенньй в прямом направлений от стоп-кодона, бьіл превращен в сайт за! | для облегчения дальнейшего клонирования, используют следующий способ. Плазмиду рЗ311 переводят в линейную форму частичньм перевариванием Ват НІ. Вьіделяют ї5» фрагмент, приобретший линейную форму, и вставляют линкер синтетической ДНК, которьій конвертирует сайт

Ват НІ в сайт 5аї І (59 -ФАТСОТСОАС-3), разрушая зтим сайт Ват НІ. Так как существуют два возможньх со положения для интеграции синтетического линкера, получающиеся в результате плазмидьі анализируют путем - рестрикционного ферментативного гидролиза. Плазмиду с линкером, вставленньм в нужном положении в 5р прямом направлений зкзона 11, изолируют и обозначают рЗ313. о Чтобьі получить конечную конструкцию вектора зкспрессии, несущего геномнье последовательности

Ге) варианта человеческой В55І, используют существующий вектор зкспрессии, ра314, предназначенньій для промежуточной стадии и специфической зкспрессии ткани в клетках молочной железь! в периодь! лактации.

Плазмида р5З314 содержит геномньій фрагмент из гена кислого белка сьіворотки Л/АР/ мьіши /Сатрреї еї аї. дво 19841, клонированньій как фрагмент Мої І. Геномньій фрагмент имеет приблизительно 4,5 т.п.о. регуляторньх последовательностей все четьре зкзона мьішиного УУАР и все интроннье последовательности, и (Ф, 3-т.п.о.--последовательность в прямом направлений последнего от зкзона. Уникальньй сайт Крп І располагается ка в первом зкзоне в 24 п.о. в обратном направлений от инициирующего кодона трансляции природного МАР.

Другой уникальньйй сайт фермента рестрикции представляют собой сайт заї І, расположенньй в зкзоне 3. во Геномную последовательность варианта человеческой В55І вставляют между зтими сайтами - Крп І и 5аї І - по следующей стратегии. Во-первьїх, ре134 переваривают с Крп І и Заї І, и фрагмент, представляющий собой расщепленную плазмиду, вьіделяют злектрофорезом. Во-вторьїх, ре132 переваривают с Крп І и Ват НІ, и вьіделяют фрагмент приблизительно в 4.7 т.п.о., представляющий собой 5' - часть гена человеческой В55І.

В-третьих, р313 переваривают с Ват НІ и заї І и вьіделяют 3-часть гена человеческой ВЗ5І. Зти три 65 фрагмента лигируют, трансформируют в компетентную бактерию Е. соїї, и трансформанть! изолируют после селекции с ампициллином. Получают плазмидь из нескольких трансформантов и тщательно анализируют путем рестрикционного ферментного картирования и анализа последовательностей. Одну плазмиду, представляющую нужньй вектор зкспрессии, характеризуют, и обозначают ре317 /фиг.15/.

Чтобьї удалить прокариотнье плазмиднье последовательности, рО317 расщепляют Мої І. Злемент рекомбинантного вектора, состоящий из последовательности мьішиного УУАР, примькающей сбоку геномного фрагмента варианта человеческой В55І, затем вьіделяют злектрофорезом в агарозе. Изолированньй фрагмент затем очищают злектрозлюцией перед тем, как вводить его в мьішинье змбрионь.

Рекомбинантньй ген для зкспрессии варианта человеческой В в молоке трансгенньїх мьішей приводится на фиг.16. 70 3.2. Генерация трансгенньїх животньх.

Фрагмент Мої І вбіделяют из плазмидьі ре317 в соответствии с разделом 3.1. Зтот фрагмент ДНК состоит из промотора мьішиного УУАР, связанного с геномной последовательностью, кодирующей вариант человеческой

В5З5І. Вьіделенньій Фрагмент при концентрации Знг/мкл вводят в пронуклеус змбрионов 350 С5781/6.) хСвВА/2) --, полученньїх от доноров-мьішей, подвергнутьїх воздействию 5 МЕ гонадотропина сьіворотки беременной 7/5 Конематки, для суперовуляции. Животньх С57ВІ/6) хСвВА/2у -4 получают из ВотпоїІдага Вгееадіпу апа Кезеагсп

Сепіге. ТО, Ку ЮОептагк. После сбора змбрионов из яйцеводов их отделяют от клеток яйцевого бугорка посредством обработки гиалуронидазой в среде М2 /Нодап еї а!., 1986/. После промьівания змбрионь!ї переносят в среду М16 /Нодап еї аї., 1986/, и вбідерживают в инкубаторе в атмосфере с 596 СО». ЙИньекции вьіполняют в микрокапле М2 под легким парафиновьм маслом, используя гидравлические микроманипуляторьї Магізнйіа| и инвертированньїй микроскоп Мікоп, снабженньій оптикой Мотаїг»КіІ. После иньекции 267 вніглядящих здоровьми змбрионов имплантируют в 12 псевдобеременньх С5781 /6) хСВА/2) - реципиентов, получивших интраперитонеально 0,37мл 2,595 авертина. Мьшей, которье интегрировали трансген, идентифицируют

РСК-анализом ДНК из образцов хвоста для биопсии, полученньїх через три недели после рождения животньх.

Позитивнье результать! подтверждаются саузерн-блот-анализон. с

Для отбора молока дающим молоко самкам вводят 2 ИЙЕ окситоцина, интраперитонеально, и через 10 минут дают наркоз 0,4Омл 2,595 авертина - интраперитонеально. Устройство для накопления молока подсоединяют к (8) ниппелю через силицированньій трубопровод, и молоко собирают в 1,5мл пробирки Зппендорфа /Еррепаогі/, осторожно массирую молочную железу. Количество молока изменяется, в зависимости от дня лактации, от 0,1 до 1,5мл от мьіши за сбор. Ге! зо 3.3. Зкспрессия варианта В в трансгенньїх мьішах.

Трансгенньїх мьшей иидентифицируют посредством анализа ДНК, которую получают из образцов, о отрезанньїх от хвоста. Образцьі ткани инкубируют с протеиназой К и зкстрагируют фенолом с хлороформом. - де

Вьіделенную ДНК используют в полимеразно-цепньїх реакциях /РСК/ с праймерами, которне усиливают специфичнье фрагменть!, если присутствует гетерологичная введенная ДНК, представляющая фрагмент со зв вектора зкспрессии. Животньїх также проверяют опьітами гибридизации ДНК, чтобьї подтвердить даннье РСК и «Е проверить на возможнье реаранжировки, структуру злементов интегрированного вектора, и получить информацию о числе копий злементов интегрированного вектора.

В одной серии зкспериментов анализируют 31 мьішь двумя методами, и результать! показьівают, что 1 мьІШЬ несет злемент вектора гетерологичной ДНК, полученньй из рЗ317. Результать! РСК-анализа и зкспериментов с « гибридизацией являются идентичньми /фиг.17А-С/. Вообще, обнаруживают, что 10 из 65 проверенньх з с животньїх являются трансгенньіми для рЗ317. . Миьішь, идентифицированную как несущую злемент векторной ДНК /животное-основатель/, затем спаривают, а и помет Е1 проверяют на трансген по тем же методикам.

РНК, вьіделенную из различньх тканей раза17-трансгенньїх самок в период лактации, отделяют

Ззлектрофорезом в агарозном геле с формальдегидом, блоттируют на мембраньі и гибридизуют с кКДНК В55І, «» меченной З2Р, в качестве зонда. Полученнье результать! показьівают, что зкспрессия ограничиваєтся молочной железой в период лактации /фиг.18/. со Образцьї молока отбирают под наркозом от животного-основателя, обработанного оксктоцином для - индуцировання лактации, и анализируют на присутствие варианта рекомбинантной человеческой В55І. Зто делается 505 - РАСЕ, переносом на нитроцеллюлознье мембрань и инкубацией с поликлональньми о антителами, генерированньмми против нативной человеческой В55І. Полученнье результать! демонстрируют (Че) зкспрессию варианта рекомбинантной человеческой ВЗ5І в молоке трансгенньїх мьішей. Фиг.19 показьіваєет присутствие варианта рекомбинантной человеческой ВЗ5І в молоке трансгенньїх мьішей. Разделение ЗОЗ -

РАСЕ и иммуноблотирование образцов молока, полученньїх от различньїх трансгенньїх для рз317 мьішей, показьвают зффективное продуцирование варианта рекомбинантной В55І. с уменьшенной определяемой молекулярной массой по сравнению с рекомбинантной В55І с полной длиной, полученной из молока мьіши, іФ) трансгенной для рЗ314. Плазмида рЗ314 подобна рЗ317, за исключением того, что ре314 содержит кКДдаНК ко человеческой В5З5І с полной длиной вместо геномного варианта. Дублетная полоса, которая вьіявляется во всех образцах мьішиного молока, представляет мьішиную В55І, и показьвваєт, таким образом, перекрестную бо реактивность антисьіворотки. Зтот вьівод подтверждаєется также наблюдением, что зта дублетная полоса появляется в узкой полоске 9 на фиг.19, которая содержит очищенную мьішиную В55І.

Генерируют устойчивье линии трансгенньїх животньх.

Подобньм образом могут бьіть получень! другие трансгеннье животньсе, такие как кролики, коровь! или овць, способнье зкспрессировать варианть! человеческой ВЗ5І. 65 Депозити.

Перечисленнье далее плазмидь! депонированьі, в соответствии с Будас Будапештским договором, в ОЗМ

/Шешспе Заттішпд моп МіІКгоогдапізтеп па 2еїїкийКигеп/.

Й 12 июня 1992 25 февраля 1993 о

Краткое описание рисунков

Фиг.1.

А. Карта вектора на основе ВРУ, используемого для зкспрессии различньїх вариантов В55І.

В. Схематичное изображение различньїх анализированньїх вариантов В55І. РІ обозначает ВЗ5І. полной длиньі. Активньй сайт указьівается кружочком, и сайт для возможного М-присоединенного углевода указьівается ор треугльником. Область, содержащая повторьі, указьівается в виде заштрихованного пространства, и область сохраненного С-окончания - в виде зачерненного участка.

Фиг.2

Саузерн блот-анализ ДНК из клеточньїх линий, зкспрессирующих вариантьі В55І. Анализировали ДНК, полученнье из клеточньїх линий, зкспрессирующих В5З5І. полной длинь! /РІ/, варианта А /А/, вариант В /В/, сч ов Вариант С /С/ и вариант М /М/. ДНК, произведеннье соответственньми полученньіми клетками /слева/ /5мкг/ и 1нг векторной ДНК, произведенной очищенньми бактериями /справа/, перевареньі с Ват НІ. Образцьї ДНК (о) разделеньі на агарозном геле, перенесеньь на мембрану Сепе бБсгееп Різ и гибридизованьй с кДнНК человеческой В55І, меченой З2р.

Фиг.3 б зо Нозерн-блот-анализ РНК из изолированньх клеточньїх линий, зкспрессирующих вариантьі! В55І.

Анализировань! 1Омкг полной РНК, полученной из клеточньїх линий, продуцирующих В5О5І полной длинь /Н//, о вариант А /А/, вариант В /В/, вариант С /С/ и вариант М /М/. РНК из клеточной линии С127, таящей вектор ВРМ -/"- ,мидентичньїйй вектору на фиг.1, за исключением того, что он кодирует белок, неродственньій В55І,, использовали в качестве негативного контроля (-) /верхний снимок/. Фильтрьї гибридизованьь с КДНК В58І, меченой ЗР. со Фильтр затем регибридизован с зондом кКДНК мьішиного р-актина. Сигнальї МРНК р-актина /"нижниє снимки/ «фФ использовали в качестве внутреннего контроля количества РНК, загруженной на каждую дорожку (полосу).

Фиг.4.

Зкспрессия активности В5З5І в клетках С127, трансфектированньїх человеческой В5З5І полной длинь и ее « мутированньми формами. Клетки С127 трансфектированьі различньми конструкциями В55І: полной длинь! 40. /РУ, вариантом М /М/, вариантом С /С/, вариантом В /В/, вариантом А /А/. После начального периода роста - с отбирали отдельнье клоньї и давали им возможность расти до слияния. Число отобранньїх клонов /п/ ц указьтвается на рисунке. Активность липазьі определяли на кондиционньїх средах. Значения вьіражаются в » мкмолях вьіделенной жирной кислоть х мин х(мл кондиционной средь) .

Фиг.5.

А. Вестерн-блоттинг полной длиньй и о мутированньїх рекомбинантньх Ве5І. Количество липазной ве активности, виіраженное в мкмолях вьіделенньій жирной кислоть! ч мин", нанесенной на гель, составляеєт: при о полной длине - 0,2 /полоска 1/, для варианта М - 0,16 /полоска 2/, для варианта С - 0,6 /полоска 3/, для варианта В - 0,8 /полоска 4/, и для нативной В55І - 0,1 /полоска 5/. Применяют антисьіворотку, полученную в - кролике против ВЗ5ІЇ, очищенной от человеческого молока. Положение маркеров размера /предварительно о 20 окрашеннье 505 - РАСЕ Зіапаагав. І см Капде, Віо Кад/ указьіваєтся слева.

В. Вестерн-блоттинг варианта В, обработанного М-гликозидазой ще Е. Вариант В переваривали с М-гликозидазой РЕ, как описано в методиках зкспериментов. Полоска 1 относится к необработанному, а полоска 2 - кобработанному, варианту В.

Фиг.6.

Зависимость ВОЗІ полной длиньі и ее мутированньх форм от солей желчи. Липазную активность

ГФ! определяли в присутствии различньїх концентраций холата натрия /сплошнье линий/ или дезоксихолата натрия /прерьівистье линий/ на кондиционньїх средах для рекомбинантной В5З5І полной длинь //, варианта А / гу, о варианта В /д/, варианта С /юд/, варианта Н /6/ и очищенной В55І человеческого молока /0/. Для варианта А кондиционную осреду концентрировали на сефарозе голубой, как описано в методиках зкспериментов. 60 Количество источника соответствующего фермента вьбирали таким образом, чтобьї получить одинаковье уровни максимальной активности, за исключением варианта А, которьій имел максимальную активность только в одну десятую от других. Контрольнье зксперименть! показали, что среда роста не влияєет на уровень активности или на зависимость от солей желчи нативной В5З5І /даннье не приводятся/.

Фиг.7. бо А. Нозерн -блоттинг В55І, полученной различньми штаммами Е. соїЇ с использованием РОЕМЕХ. Бактерийи индуцировали ІРТО, как описано в зкспериментальньх методиках. Условия зксперимента такие же, какие описаньї для фиг.2. Полоса 1 - штамм ВІ. 21 (ОЕЗ)руз5. не индуцирован; полоса 2 - штамм ВІ. 21 (ОЕЗ)рі узз, не индуцирован; полоса З - штамм З /МІТО9(ОЕЗ), не индуцирован; полоса 4 - штамм /М109(ОЕЗ), индуцирован.

В. Вестерн-блоттинг, с использованием антител к очищенной молочной В55І, из 8 - 1895 505 - РАСЕ, показьвающего зкспрессию рекомбинантной В55І в различньх штаммах Е. сої с применением рРОЕМЕХ.

Бактерии индуцировали ІРТО, и цитоплазменнье и периплазменнье белки получали из лизата, как описано в методиках зкспериментов. Количества бактериальньїх белков, загруженньїх на полосьі 2-5 /лериплазменнье препарать/ и 7 - 10 /цитоплазменнье препарать/, представляют одинаковьійй обьем культурьі, дающий окраску, 7/0 пропорциональную уровню продуцирования. Полоса 1 - маркерь! размера молекуль! Рагтасіа; полось! 2 и 8 штамм УМ109 (ОЕЗ) , индуцирован; полось З и 7 - штамм УМ109(ОЕЗ), не индуцирован; полось 4 и 10 - штамм

ВІ 21 (ОБЕЗ)рі уз5, индуцирован; полосьі 5 и 9 - штамм ВІ 21 (ОЕЗ)рі уз5, не индуцирован; полоса 6 - 25нг очищенной нативной В55І.

Фиг.8. 5О5 - РАСЕ очищенньїх рекомбинантной В55І и вариантов В5З5І.

Рекомбинантную В55І. полной длинь /РІ/ и варианть! В55І М, В и С очищали так, как описано. Наносили по

Змкг каждого, за исключением варианта В, которьій использовали в количестве 1,5мкг. Наносили 5Бмкг очищенной молочной В55І. /ПАТ/. Положение маркеров размера указьіваєтся слева.

Фиг.9.

Влияние дезоксихолата на активацию рекомбинантной В5З5І и вариантов В55І холатом натрия. Проверяли липазную активность очищенньїх препаратов рекомбинантной Ве5І полной одлинь /с/, вариантов рекомбинантной ВІ В /0/, С о/ю/ и М/д/, и очищенной нативной молочной В55І /д/ при различньх концентрациях холата натрия в отсутствий /левьій график/ и в присутствий 5ММ /график в центре/ или 10ММ /правьйй график/ дезоксихолата. с

Фиг.10. о

Устойчивость рекомбинантной В55І и вариантов В55І при различньїх рН. Нативную В55І, рекомбинантную

ВЗ5І полной длиньі! и вариантьї ВЗ5І. инкубировали при 37"С в различньїх буферах с рН 2 - 8. Все буферь содержали 1мг/мл альбумина коровьей сьіворотки. Через ЗОмин. отбирали аликвотьї и проверяли липазную активность. Пояснения символов см. в описаний фиг.9. Ге)

Фиг.11.

Термоустойчивость рекомбинантной ВЗ5І и вариантов ВЗ5І. Очищеннье рекомбинантную ВЗ5І. полной о длинь, вариантьї В55І и нативную молочную В55І инкубировали при указанньїх температурах в ХОММ буфере «7

Трис-СІ, рН 7,5. К одной серии образцов добавляли альбумин коровьей сьіворотки /В5 А/ до мг/мл. Через

ЗОмин. отбирали образцьї и проверяли липазную активность. Активность вьіражают в процентах от активности со каждого образца при Омин. Пояснения символов см. в описаний фиг.9. «І

Фиг.12.

Влияние солей желчи на инактивацию рекомбинантной В55І и вариантов ВЗ5І трипсином. Очищеннье рекомбинантную В55І. полной длиньї, варианть! ВЗ5І и нативную молочную ВЗ5І. /15мкл, содержащие 1 - 4мкг/ « добавляли к бОмкл 1,0 Трис-СІ, рН 7,4 с 10мкг трипсина /ТРСК - трипсин, Воепйгіпдег - МаппПпеї!т/ при 257С в отсутствий /прерьівистье линийи/ и в присутствиий /сплошнье линиийи/ 10ММ холата натрия. В указанное время - с отбирали аликвотьі и проверяли на липазную активность. Величинь! вьіражаются в процентах от величин, а полученньх при контрольньїх инкубированиях в отсутствие трипсина. Пояснения символов см. в описаний фиг.9. ,» Фиг.13.

Способ получения плизмидьї ре317. Подробности см. в разделе 3.1.

Фиг.14. т» Схематическое строение плазмидь!ї ре312. бо Фиг.15.

Схематическое строение плазмидь! реЗ317. - Фиг.16. о 50 Физическая карта, отражающая физическое введение геномной структурьі варианта человеческой В55І в первьїй зкзон гена УУАР, как описано в разделе 3.1. іЧе) Фиг.17.

А. Схематическое изображение локализации праймеров РСК, применяемьх для идентификации трансгенньїх животньїх. Праймер 5' располагается в последовательности УУАР, начинающейся в положений -148 п.о. в обратном направлений слияния между УУМАР и вариантом В55І. Праймер 3 располагаєтся в первом интроне варианта В55І,, заканчивающем 400 п.о. в прямом направлений из точки слияния. о В. Последовательности использованньїх праймеров РОК. іме) С. Полученнье на агарозном сгеле показатели типичного анализа анализов РСЖК потенциальньх животньїх-основателей. М: молекулярная масса маркеров. Полоса 1 - контрольньій продукт РСК, 60 генерированньй из плазмидьі ра317. Полосьі 2 - 13 -реакций РСК с препаратами ДНК от потенциальньх животньІх-основателей.

Фиг.18.

Нозерн-блоттинг РНК, полученньїх из различньїх тканей, вьіделенньїх из самки мьіши, трансгенной для ра317. Ткани вьіделяли на четвертьій день лактации. Анализировали 1Омкг полной РНК из каждой ткани б5 посредством агарозно-формальдегидного разделения, переносили на мембраньй и гибридизовали с кКДНК человеческой В58І, меченой ЗР. Полосьі содержат: Мо - молочную железу; ЇЇ - печень; Кі - почку; Зр -

селезенку; Не - сердце; и -легкое; Зд - слюнную железу; Вг - головной мозг. Размерь! ДНК в нуклеотидах указьіваются слева.

Фиг.19.

Вестерн-блоттинг молока, полученного от трансгенньїхх для рО314 мьшей, от мьішей, трансгенньїх для вектора кКДНК полной длинь! р5З314, и контрольньїх животньїх. Образцьі отделяли ЗОЗ - РАСЕ и переносили на иммобилизующие /ІттобіІоп/ фильтрьї, и иммуноблотировали с антисьівороткой против нативной человеческой

В5З5І. Полоса 1 - маркерьї молекулярной массь; полось 2, 3, и 4 - 2мкл молока от трех Е1 - дочерей /Р1 30, 31, и З3/р 5317-основателя ГО Я 91; полоса 5 - 2мкл молока от реЗ314-основателя 52 90. Полось 6,7 и 8 - 2гмкл молока 7/0 от трех нетрансгенньїх для ВЗЗІ- животньїх; полоса 9 - очищенная мьішиная ВІ; полоса 10 - очищенная человеческая нативная ВЗ5І.

Список литературь 1. Ароцакії, М., КодаїзКа, Е., апа І отбагао, 0. (1989): ВіоспІт. ВіІорпуз. Асіа 1002, 225 - 230. 2. АІКІпзоп, 5.А., Вгуап, М.Н., апа Ападегзвоп, О.Н. (1981): 3. Реаіаїг. 99, 617 - 624.

З. А!йЄзиреї, Р.М., Вгепі, К., Кіпрдвіоп, К.Е., Мооге, О.О., ЗеІдтап, 9У.., Зтй, 9.А., Бігийі, К. (еав.)

Іп: Ситепі Ргоїюосоїв Іп МоіІесшіаг Віоїоду (ойп У/Іеу Є Зопв, Мем Хогк; еаШоп ої 1992). 4. Ваба, Т., Оом/пв, О., дасквоп, КМУ., Тапо, 9. апа Мапа, С.5. (1991): ВІіоспетівігу 30, 500 - 510. 5. Вегпрдеск, 5., ВідсКрего, Г.., апа Негпеї, О. (1990): 9. СіІп. Іпмеві. 85, 1221 - 1226. 6. Віцгквіеп, В., Вигтап, І.0., ЗеСпай(еаи, Р., Ргеадгікгоп, В., Соїпегогв, ЇЇ. 85 НегпеїЇ, О. (1980): Вг. Мед. .. 201, 267 - 272. 7. ВІідскКрего, І. 5 Негпеї, О. (1981): Єиг. У. Віоснет 116, 221 - 225. 8. Віаскрего, І. апа Нептеїі, О. (1983): РЕВ5З І ей. 157, 337 - 341. 9. СатррбеїЇ, 5.М., Козвзеп, У.М., Неппіднайвеп, І.0., Зігесп-УигК, ОО. апа 5ірреї, А.Е. (1984): МисівІс Асіа

Кез. 12, 8685 - 8697. с 10. СпарреїІ, 9У.Е., СіІапаІпіп, М.Т., Кеагпеу-МоІре, С., КеІсптап, В., апа Змжуег, Р.МУ. (1986): 9. Реаіаїг. 108, 439 - 447, і) 11. РопіаіІпе, К., Сапег, С., апа Ниї, 0. (1991): Віоспетівігу 30, 7008 - 1014. 12. Сгапат, Р.Г., апа Мап дег ЕБ, А... (1973): МІгоіоду 52, 456 - 467. 13. Натозвгни, М., Егеед, І.М., Могк, С.М., (Шптап, 9.А., апа Натозни, Р. (1986): Ред. Ргос. 45, 1452. Ге! зо 14. Нап, .Н., 5ігаїюуа, С., апа Кибег, МУ.. (1987): Віоспетівігу 26, 1617 - 1625. 15. Неппідпнацизеп, І.., Киї, І. 5 УМаїІ, К. (1990): Ситепі Оріпіоп Іп Віоїеснпоіоду 1, 74 - 78. о 16. Негпеї, О. (1975): Єиг. У. Сіл. Іпмеві. 5, 267 - 272. «- 17. Негпеїї, О., ВідсКрего, Ї., апа Іпарегу, Т. п: ТехірооК ої давзігоепіегоїбду апа пишгШоп о Іп

Іптапсу (І ерепіпаї, Е. ед) рр. 209 - 217 (Камеп Ргезз, Мем Хогк 1989). со 18. НегпеїІ, О., (аддегв, У.Е. апа Сагеу, М.С. (1990): Віоспетівігу 29. 2041 - 2056. «Е 19. Негпеїї, О. апа ВідсКрего, Ї. Іп: Епсудоредіа ої питап Бісіоду (Оцірессо, К. ей.) Мої. З, рр. 47 - 56 (Асадетіс Ргезз, Зап ОіІедо 1991). 20. Негпеїї, О., ВідсКрего, ЇЇ, Спеп, О., бі(егпру, В. апа Міівзоп, А. (1993): 9. Реааїг. СавігоепіегоїЇ.

Мишїг. (Іп ргезв). « 21. Нодап, В., Сопвіапіпі, Р. апа Гасу, Е. (1986): Мапіршанцтпод (Ше тоизе етргуо. А І арогайгу Мапа). ст») с Соа Зргіпд Нагбог І арогаїюгу Ргезв.

Й 22. Ниї, 0. апа Кігзвеї, У.А. (1990): Рерз І ей. 276,131 - 134. и?» 23. Кудег, Е.М., Медапа, К.С., апа І апде, І... (1989): Віоспет. Віорпувз. Кез. Соттип. 164,1302 - 1309. 24. | аетті!, О.К. (1970): Майте (І опдоп) 227, 680 - 685. 25. Парегду, Ш., Мііввоп, .., Зігцтбрего, К., Зіептап, с., Зап, Р., ЕпегодсК, 5.0. апа ВішгвеїЇ, 0. ї5» (1992): Сепотісз 13, 630 - 640. 26. І изКу, М., апа Воїснап, М.МК. (1984): Сеї! 36,391 - 401. бо 27. МіІввоп, У., ВідсКрего, Ї., Сагіввоп, Р., Епеграск, 5., НетеїЇ, О. апа Вішгвеїї, б. (1990): Еиг.П .. - Віоспет. 192, 543 - 550. 28. Раміаків, О.М., апа Натег, О.Н. (1983): Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 80, 397 - 401. о 29. Кеце, К., латраийх, 9., МУопд, Н., їее, О., Іеефе, Т.Н., Копк, М., 5ПпіІмеїуУ, 9.Е., еіегтпру, В.,

Ге) Воговігцт, В., Ате!в5, Ю. апа Зспоїг, М.С (1991): 9. ПІріа. Кев. 32, 267 - 276. 30. Загмег, К, Вугпе, .С., апа НоучеїЇ, Р.М. (1982): Ргос. Май). Асад сі. ОБА 79, 7147 - 7151.

Згцаіег, ЕМ. апа Могйаї, В.А. (1986): 9. Мої. Вісі. 189,113 - 130. 31. М/Шатзвгоп, 5., ГІписапе, Е., ЕППв, Н., апа Сатвги, Н.К. (1978): Агсп. Ів. СпПаноса 53, 555 - 563. (Ф) з

Claims (1)

1. Формула винаходу во 1. Молекула нуклейновой кислотьї, кодирующая полипептид, которьій представляет собой вариант стимулируемой солями желчи липазь (В551І) и имеет ее активность, включающий менее чем 722 аминокислот,

   у которого одна или более, но не все из аминокислот участка, соответствующего аминокислотам 536-722 представленной последовательности, обозначаемой как 5ЕО ІО МО 3 в списке последовательностей, делетировань б5

   А1а уз цец сіу Аїа Уа1ї Тук ТЬг біш біу біу Рбе Ма1ї бі сіу Маї 1 5 ' 10 15 Азп о Пцуз цуз Беч Ссіу ем Ге біу Авр бег Уаї Авр І1е Ріе Буз Сс1у 20 25 30 : Іїе Ркго Рье Аза А1а Ркго Тіт Гуз Аїа Печ сій Азп Рко біп Рко Нівз 35 40 45 Рго б1у Тгр біп б)у Тих Гей Буз Аза Гуз Аєп Рбе Цуз Цув Акд Сув 50 55 60 Ген біп Аіа Тк 112 Твх б)іп Абробег ТпгоТуг бсіу Абр Сі Авр Су 71065 70 75 80 Тем Тук Пцез Авп І1е Ткр Уа1і Рго біп сС1іу Ахд Туз біп уаі1ї бех Акгд 85 90 95 АБр Печ Ріс УМаї Ме І1е Тгр І1е Тук біу с1іу Аїа Рбе Пец Мес б1іу 100 105 110 й

   15 . -Беї біу Ні біу Аїа Азп Рье цем Азп Азп Туг о Гем Туг Авр о біу січ 115 120 125 бі5 І1е А1а Тр о Ако сС1іу АзпоХаї 115 Узі Маї Ту Рве Або о Тут Аха 132 135 140 Уаї Сіу Рко цец біу Рпе цем бег ТіБг сіу Ар діа Ав цем Рго с1У 145 150 155 150 Ап оТУКХ біу Пец Ака Авр о біп Ні Меї А1а І16 Аза Тур Хаї 1у5 АгЗ "185 1760 175 Азп І12е Аїа Аза Ре сіу б)іу Авр Рто Ап о АБп о ЇІ1і2 тТву цем Ре сіу Га 180 185 190 о біч Бет А1а сі1у біу А1їа бет Маії бех Печ біп ТІ Пец бет Рго Тут 195 200 й 205 Азп 1у5 б1у Пез ї1е Ахо Ага Аза 11е беї біп бек біу Ма) д1а цей 210 215 220 о Зет Рхо Ттр Маї Іїе біп Цуз Азп Рго Пе Ріе Ттр А1їа ГЦу5 Гу Маї 225 230 235 240 («в) А1їа сій Гув Маї сіу Суз Рго Маї біу Ар Аїа Аіа Аго Мех Аза біп чє: 245 250 255 Суз рем Пув УМаї ТрІ Авр Рго Агу Аза Ге ТЬг оцей Аіа Туг Гуз Маї со 260 255 270 « Рхо реч А1ї1а біу цеч сі Тут Рто Мес Печ Ні Тук Маї сіу Рпе Уді 275 280 285 Рго Маї ІЗе Авр біу АБр Ре І1е Рго Аза Ар Рго Ізе Ап Пцеч Тух 299 295 300 « дю - . и? г» (ее) -й («в) 3е) іме) 60 б5

   Аза Азп о Аїа Аза АвроІ11е Азр ТУт І11е Аза біу Тпг Або Азп о Меїт Авр І 305 310 315 320 біу Ні5 Ії Рре Аїа 5ег І1е Ар Мех Рга Аїа ї11е Ап Гуз С1у Авп 325 330 335 Гуз Гуз Маї Тк Сі біз Авзр Рпе Тухт ПЦуз реч Ма1ї бех бій Ріе Тік 340 345 350 І1ї1е ТЬБх ПЦув СсСіу Ге Агу сСіу Азїа Пуз5 ТргІ ТвБг РБе Азр о Ма1ї Тут Твх 355 360 365 б1ч беї Ткр Аза Сіп Азр Ркго бег Сіп бі АєпоБуз ГЦуз Бує Тк оМаї 370 375 380 Уаї Ав Рре біз ТБІ Азр Ма1ї Ге Рпе Печ Уа1 Рко ТіК січ І1е А1а 385 390 395 400 реч АчТа біп Ніз Акуд Аза Азп А1а 1у5 бех Аза Гуз Тр о Тук Аза Тут 405 410 415

   15 . - Тем Рпе Бег Ніз Рко бБетг Ага Мес Рхо Уа1ї Тух Рго Гуз Тгр МУМа1 Сс1у 420 425 430 А1а Ар о Ніз А1ї1а Авр Азр І1е біп Тут Маї Рбе сіу Цуз Рхо Рпе Аза 435 440 445 ТВх Рто Ту біу Тук Агу Рго сіп Азр Агур ТБт Маї бег уз Аїа Меє 455 а55 , 460 І1е хліва Тух Тер ТіК Абп Ре Аза Ту ТЬІ Сіу Азр Рго Авп Меє біу 465 470 475 480 Азр Зех АЗа Маї Рко Тиг Нів ТІр біб Рго ТуУук ТрБІ ТКБІ біз Авзп бег с 485 450 495 щі 6) Сіу Туїт Пес біо 712 Тих Суб Гуз Мес біу Бек беї Беї Мес ПЦуз Аг4 а) 505 510 бек Печ Аго Так о Азп Рпе Пец Аго Тут Тер ТВ Без ТІ Тут рез А1а 515 52 5І5 (22) іїем Рго ТБх Маї ТБг Азробіп біс Аза ТВі о Рго Маї РІ Рто ТКІ б1У 30 530 ' 535 542 о Азр Бех біч А1іа Тіг Ро Маї Руо Рто ТВі біу Ар Бех бі Тих А1а 545 550 555 560 -- Рго Ма) Рхо Рго ТіЬг Сіу Азр Бех б3)у Аїа Рго Рго Уаї Рко Ркго ТЬг (ее) 565 570 - 575 35 й : « п1у Азр Бек Ссіу Аїа Рго Рго Уаї Рто Рго Тпх Сіу А5р Бех біу А1а 580 585 590 Рто Рхто Маї Рго Рхго Тіт біу Азр бБет біу Аза Рго РІо Маї Рго Рто 595 бо 65 « ТЕ б1у Авр Бех Сіу Аїа Рго Рго Маї Рто Рго ТахІ бІу Азр Бех с1Уу 40 610 615 629 . - с А1їа Ріо Рго Ууаї Рго Рхто ТВг біу Авр беїг біу Аіїа Рхто Рго Уаї Рго 625 630 635 640 ;» " Рхо Так Сіу Ар А1а біу Рхо Рго Ркго Ма1ї Рхто Рго Тіт біу Авр Бек 645 6550 655 45 С1у Аїа Рго Ркго Уаї Рхо Ркго Трг біу Ар бехт сіу Аїа Рго Рго Ма1 ї» во 665 6570 со ТВІ Рко Тих сіу А5р бет січ Тпг Аза Рго Маї Рто Рто Тіх Сіу Азр 675 68 685 - Бег сіу Аїа Рхо Рхто Ма1ї рхо Рко Тік біу А5р бех Січ Аза А1а Рго 50 690 695 700 («в) Уаї Рхо Рго Тих Ар Азр Бех Цуз бі Аза Сіп Меї Рто А1іа Ма1ї І1є 705 710 715 720 3е) Ах9 Ре

   2. Молекула нуклеийновой кислоть! по п.1, отличающаяся тем, что указанньій вариант В55І имеет остаток фенилаланина в его С-окончании. ГФ) З. Молекула нуклеийновой кислоть по п.1, отличающаяся тем, что указанньій вариант В55І. содержит в своей кю С-концевой части последовательность сіІп-Меї-Рго. . олекула нуклейновой кислоть! по п. лотличающаяся тем, что казанньій вариант включает 4 М 1 вз5і последовательность І уз-СІШ-АІа-С|Іп-Меї-Рго-АІа-МаІ-Пе-Агдо-РНе в своей С-концевой части. 60 5. Молекула нуклейновой кислоть! по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанньій вариант В55І. содержит менее 16 повторяющихся единиц.

   б. Молекула нуклейновой кислотьі, кодирующая полипептид, которьій представляет собой вариант стимулируемой солями желчи липазь! (85513 и имеет ее активность, аминокислотная последовательность которого, по крайней мере, на 9095 гомологична следующей аминокислотной последовательности, вьібранной из бо группьі, включающей последовательности

   Аза Гуз Пец сіу Аза Маї Тух Тих Січ сіу Сіу Рпе Уаї бі сіу МУаї 1 5 10 15 Авп о цув Ппув рем біу Гемш Пец біу Авр Бех Уа1! Ар І1е Ріре Цуз Сіу 20 25 30 Іїе Рго Рпе Аїа Аїа Рго Тіг Пуз Аіїа цем бі Ап Рго біп Рго Нівз 35 40 45 Рго біу Тгр біп біу ТБг о ПЦез Бу5 Аза Цуз Авп Ра Гуз ПЦув Ака Суз 5 55 бо Пес сіп А1іа Тахо І11е ТВі біп Абр обЗехї Тпг о Туг біу Авр біб Авр Су 62 70 75 8 Пезм ТУх Греч Азп І1е Тур МХа1! Рго біп біу Ака Пуз біп МХа1ї Бек Ах9 55 93 255 БЕ цем Рго Уаї Мет І11е Тур Ії1е тТухх біу б1іу Аїа Ре Пем Мет сІУ 100 105 110 й Зек п1у Ніз біу А1їа Ап Рпе ПцЦеч Ап Абп Тух Гем Тук Авр біу Сі 115 120 125 о10 І1е Аза ТБІ Аг біу АБп Уаї І1е Маії Маї ТІ Рне Азп ТУух Агд 130 135 140 , Маї б1у Рхо Пец біу Ріе Меч бех Тіт біу Азр Аїа Авп цей Рго б1у 145 150 155 150 АзпоТуг біу Пец Аку Азробіп Ніз Ме Аза І1е Аза Тур Уа1ї Гуз Агу 165 170 175 Авг І1е Аїа Аза Ре біу біу Азр Рго Азп Аєп І)1е ТБх Пе Ре сіу С 180 185 190 о "біб Бекг Аіїа сіу Ссіу А1їа3 бек Маї бег Геч Сіп Тих ГПеч бек Ркго Туг 135 200 205 Авп оцуз біу Пес І1їе Аг Агу Аза 112 бБег біп Бех Сіу Ма) Аза Геч 210 215 223 Ге») Беї Рко Тур Маї І1е Сіп Був АвпоРрхо Ге Рбе Ттр Аза Гу Гу Ма! о 225 М 230 235 240 А1іа бій пув Маї біу Субз Рго Уаї біу Ар Аза А1їа Агу Меє А1їа біп -- 245 250 255 с Су реч Цув Уа1ї Тах АвроРхо Ак Аза рез Так Печ Аза Тух Гуз Угаї 250 265 270 «І

   - . и? г» (ее) -й («в) 3е) іме) бо б5

   "Рко цец діа сіу пцеч січ Тук Рго,Мех ПЦеч Нів Тух Уа) біу Рпе Ма1 275 280 й 285 Рко Маії Ії Авр Сіу Авр Ре І1е Рго А1а Авр Рко ІЗе Авп Грем ТУх 290 295 300 Аїа Азп Аіа Азіа Ар о І1е Азр о Туг І1е Аза с1іу ТВ Авл о Авп Меє Ар 305 310 315 320 Сіу Нів І1е Рре діа бехг ІЗе Авр Мес Ро А1а І)їе Азп Цуз С1у Ап 30 335 325 3 70 ув Гув Уаї Твг обі Січ Азр Ре Тух Цуз їечм Уаї Бех Сім Ре ТІ й 340 345 350 Іїе тах Цув сіу Пец Аку б1у А1їа уз. ТБх Тйг Рве Ар Уаії Тут Тіг 355 7 360 365 Сі бек Тер Аіа біп А5р Рго бех біп січ Азп Гуз Цуб5 цЦуз ТБг Хаї 370 375 380 У«1 Азр Рпе біц ТВт АзроМаї Гез Рпе Пец.Уаї Рго Трх Січ І1іе діа 385 390 395 400 ГПеч А1а біп Ні Акгу Аіа Азп А1їа Гуз бех Азїа Цу5 ТЬх ТУГ Аза ух 405 410 415 ЩО цем Рпе Бех Ніз Рго бек Агу Мес Рго Ха! Тух Рко Гуз Тур Ма1ї біу 420 425 430 А1їа Азр Ні Аза Азр Азр І12е біп Тут Уа1ї! Рпе Сіу цувз Рхо Рпє А1а 435 440 445 сч ТВжх Рго Тит біу Тукг Акуд Рго біп Азр Ага ТБІ Ма1ї Бех цу Аза Мес

   «в .455 450 (о) І1е Аїа Тут Ттр б7рІ Авп о Рпе Аза Пуз т7рт біу Ар Рго Азп Месї сіуУ 465 470 475 - 480 Ар Бех А1їа Маї Рхто ТБІ Нів Тгтр бі Рго Тут Тіг Тв бі А5п 5ег Ге) 485 490 495 «в) біу Тук реч бій І1е ТЬБІ цЦуз Ццуз Мес біу беї бБег беї Месє цу5 Агд 500 505 . 510 «- Бек цем Акуд Таг Азп Рпе Пец Акгу Тух Тхтр ТВ цеч Тих Тух Геч А1їа со 515 520 525 І Пем Рхо тру Ма1ї ТІ Азроб)п цуз біз діа біп Мес Ркго А1їа Уаі1ї І1Їє З 530 5135 540 АгЯ Ріє , 545 - Ї « ма Гуз цем Ссіу ва Уаї Тук Тах бій ТУ С1у Ре Уа) січ с1іу уві! З 15 с ц А5п о цу5 Пуз Гей біу Беч Печ Сіу Авр бехг Маї Азр І1е Рпе Цув б1у и?» 20 25 30 І1е Рхо Рре Аїа ХА1іа Рго Тах Був Азїа Пцеч бій А5п о Рго біп Рго Ні 35 49 ; 45 ї- Рто біу Тур Сіп с1іу ТІ Пем Пубз Аїа цЦуз Ап Рре Гуз цЦуз Ату Сув со 50 55: 60 цем біп А1а Твх Іїе Трг Сіп Ар бег ТЬх ТУх біу Ар Сіц Авр Сув - 65 70 л5 80 ту ав! 20 цем Тут Пем Авп зе Ттр Уа1 рхо біп біу Ат Цуз біп Уга1і бехг Агу 90 95 іЧе) іме) 60 65

   "Авр цец Рго Уа! Ме: І1е Тгр Ії Туг біу біу діа Ре цем Мес с1іу 100 105 . 110 ек біу Кі Сіу Хіа Ап Рпе Пед Азп Азп о Тук о цеч Тут АБробіу бі 115 126 125 зі І1е А1їа Ту Агуо біу Азп Маі1ї І1е Маї Ма1ї Тлк Рпе Азп Туг Ахгуд 130 11:5 140 Уаї біу Рхо Пе б1у Ріе Пец Бех тих біу Азр А1їа Азпл це Рго б1і1у 145 156 155 й 166 Авп о Тукг сіу реч Ага Ар Сіп Ні Месє Аіа І1є ДіІа Тур Уаї уз Ах 165 170 : 175 Азп І1є Аїа Аїа Рпе біу біу Авр Рго Азп Азп І1е Тіт Гей Рпе сСіу 180 7 185 190 - бій Бек Аза сіу сіу А1!а Бех Ма1і Бек Пцеч сіп ТБх Цей бек Рго Тух 195 200 205 АвпоПпуз біу реч І1е Ахо Аго А1а І1е бег біп бек біу Ма1ї Аза їГеч 210 215 220 Бек Ртго Ттір Уа1 Ї11е біп Гу5 Авзп Рго Печ Рре Тгр А1їа Був Пувз Уаї 225 236 й 235 7240 Аїа Січ Пуз Маї с1іу Суз Рхто Ма1)ї С1у Азр Аза Аїа Агу Меє А1а сів 245 250 255 Суз Пец Гуз Маї Тпг АБр Рго Агу Аза Грем Тахо Пес Аза Тут Буз Ма) 250 265 270 с Ргто Печ А1а біу цеч біс Туї Ро Меє Пец Нівз Тут Ма1ї біу Рпе Уаї 275 280 285 Го) Рто Ма1ї І1е Авр сіу АБр Рпе І1е Рхо Аза Азр Рхо І1е Абп Пе Тух 290 295 300 діа Азп діа А1а АЗр І1е Азр о Туг І1їе Аза сіу Тих Авзп АбЗо Меє Ар Ге!) 305 310 315 320 о сіу Нів І1їе Рре А1їа б5еї Іїе Ар Месє Рго діа Ії Азп цу біу Азп 325 330 335 . «-- їуз Пуз Уаї Тих бі б10 Абр о Рбе Тут Буз Геч Уаї беї бі Ре ТнНЕ: 340 345 350 со т11е Тік уз сіу Печ Ако біу А1їа Гуз ТЬІ Тих Рре Азр Уаї Тух ТНЕ «І 355 360 365 518 бек Тур А1а біп Азр Рго бег біп біш Азп о Пуз Гуз Буз Тк Маї «370 275 380 « Чаї Авр Рпе біз ТІ Авр о Ма! Печ Ріре Пец Уа1ї Ркго Тпу Січ Іїе А1а 20 з85 390 395 400 - с рез А1їа бСіп Ніз Ахуд А1а Азп Аза Ппуз бех Аїа Гуз ТЬх Тут А1а Туг 405 410 415

   "з . " Бей Рье бех Нів Рго Бет Аго Мес Ркго Маї Тут Рго їу5 Тгр Ма1ї біу 420 425 430 Міа Авр Ніз діа Ар Авр І1е Сіп Туг Уаі Рбе СсСіу цЦуз Рго Рне Аіа ї 435 440 445 о ТПтх Рко ТвІ біу Тухг Агу Рго бСіп Авр Аго Ту оМаї бек цу А1а Меє 450 З 455 450 шк поема но п пт поп опо ли поп поп прп пп пп пото номен Іїе Аіа Тут Тер Тл Ап Рпе А1їа Цуз Тпхї Сіу Авр Ркго Азп Мес біу о 455 470 475 480 (Че) Ав Бек діа Хаії Рго ТІ Ні Ткр бі Рто'бТут ТпІ ТЕ бід Азп бе: 485 490 495 біу Тух Печ б1іч І1е Тпг Муз Пуз Меї біу Беї Бет беї Мес цу Аг9 500 525 510 Ф! беї рез Ато ТПІ АЗп Рпе Деу Аго Тут ТІВ ТббІ це ТІ Тут ГПем ліа 515 520 525 о Пен о Рхо Тіт Уа) Так о Азр о біп біу Аза Рхо Рто Ма) Рко Рхо Так біу 530 535 540 60 Азр бех біу Аїа Рго Рго Маі1і Рго Рго ТБІ 0іу А5р бет цуз січ Аїа 515 550 555 550 біп Мас Ртго АЛіа Уаї І1є Ахуд Ре (А: 555 65

   Мет цез Тіт Мес біу Агд ре біп Печ УМаї Маії рез біу це тах Суз -23 -20 -15 -16 С сСуз Тур М: Уаї Аза бет Аїа Азї1а Пуз Пец Сіу А1іа Уа1ї Тух Тк Сс1Ч - 1 5 сіу сіу Рпе Маї біз біу Уаї А5зп Іу5 Цуз цем с1іу Пец Гечп сіу Азр ' 25 Зек УМаї АБр Іїе Ріг ПЦув біу І1е Рго Ріе А1а Аїа Рго Тік Цуз Аїа

   70 реч Сі) Ап Рго бір Рго Нів Рго б1у Тхр сіп б1у ТІ Беч Цуз Аза цу АБп о РБе цу Пує Агу Суз цеч біп Аїа ТВх І1е Тех біп Ар ех 6о 65 70 ТБ ТУ б1у Азр бі Азр Суз Гец Тух Пец Азп оІ1їе Тгр Ууа1ї Рго бід З 80 85 15 С1іу Аку Гуз біп УМаї Бех Ахо АБр це Рго Уаї Мес І1е Тур І1е Туг 90 95 100 105 с1іу с1у А1їа Рае Пец Мес біу бех сіу Ніз сіу Аїа Ап Ріе цеч Авп 110 "115 ' 120 20 Авп Тут цец Тут Азр о біу біц б)ц І1їе А1а Тех Акуд сіу Азп Уаї І1е 125 130 . 135 Маї Маї Трх Рре Азп Тух Ако Уа) біу Рго Пец біу Рбе цем бек ТНЕ 140 145 150 сіу Азр Аза Азп о цес Рко Сіу Азп Тут сіу Гео Агу Азр о біп Ніз Мес 155 160 165 Га 29 Аїа І1їе Аза Тер уаї ув Ага Азп о І11е Аїа А1а Ре біу Сіу Авр Ріс ге) 170 175 й 180 185 Авп о АзпоЇї1е Тв оце Ре біу 030 бет Аїа біу біу Аіа Бех Ма1і Бег 192 185 202 реч біп ТБІ ес о бег рРто Туг Азп оруз біу Меч І1е Аг9 Ако Аїа.

   І12 (2) 30 205 210 - 215 о бек біп беї біу уаї А1іа Ме беї Рго Тур Ма1і 11е біп цЦуз А5а Рго 229 2925 230 ч цем Рпе Ттр Аза цЦуз Цуз Уаї А1їа біч Цув Уаї біу Суз Рто Уаі1 Сс1у со 235 240 245 35 Ар Аї1а А1їа гуд Мес Аза біп Суз цеч Гуз Ма1і ТБІі Ар Рго Агу Аза - 250 255 260 265 Геч Тахо Пе А1їа Тух Пуз Ма1ї Рхо Пцеч Аза сіу цем бій Тут Рко Мес 270 " 275 280 « реч нів Тук Уаї біу Рре Маї Рхо Уаї І1іе Авр Сіу Азр, Рпе І1е Рхто 40 285 290 295 - . и? 45 г» (ее) шк 50 («в) 3е) 55 іме) 60 б5

   А1їа АвБр Рго І1е Авв Пец ТУХ Аіїа Ап Аїа Аза Ар І1е Ар Тут ІТ1е ! Зоо 3а5

   , . 5 31в Аїа сіу ТрЕ Авподяп о Мес Азробіу Ні Іі Рпе А1а бег Іїе Ар Мес 315 320 325 Рго А14 І1їе Азп цуз біу Авп о Пуз Туз Маї ТНг б1у Сі Азр Рпе Тух 330 335 зай 345 цуз Пец МУМаї бек біб Рпе Тих І12ге ТІ Бує б1Уу цеч Акд С1у А1а Гуз 350 355 360 ТрІ ТЬтІ Ре Ар УМаї Тут ТБ бій 5еї Тур Аза Сіп Ар Ртго бех біп 365 370 375 біч АБп оПув Гуз Гуз ТІ Маї Маії Азр Рпе січ ТБІчі Азр Ма1ї греч Ре зво 385 390 Печ Уаї Рго ТрІ бій І)е Аїа цеч Аїа Сіп Нів Атха А1їа Азп Аза Гу 395 400 405 Зехг Аіа ПЦуз Тіт Тух Аза Тут Гем Ріе Бегт Ніз Рко Бек Агу Мес Рхто 410 415 420 425 Уаї Тут Рго Пуз Тур Маї Ссіу Аза Аєр Нів А1їа Азр Азр І1е сіп Тухг 430 425 440 Маї Рпе біу Гуз Рхо Рпе Аза Тпх Рхо Тпт Сіу Тух Агд Рко біп Агр 445 450 455 Ата ТВтІ Маї Бех уз Азїа Меє Іїе Аїа Тух ТІр ТНІ А5п Рпе А1а Гуз 460 465 470 ТЕ бС1у Авзр Рго Азп Мес біу Азр бек Аїа Уа1ї Рго ТІ Ніз Ттр Січ с 475 4в8о 485 о Рго Тух ТЬх ТІ бі Абзп о бетг Сіу Тук Печ біз І1е Тк ПЦуз ПЦуз Мес 490 495 500 505 б1у бет Бех бехг Мес цуз Аху Бех Без Аху Твт Авп о Рпе Печ Агу Тут 510 515 520 Ге) З0 Тер так цем Таг о Тук цем Аїа цеч Ртго Тнг Маї ТБІ Азр біп бі діа о 525 5360 535 ТпІ РІо Ма1ї Рхо Ркго ТпїІ Сіу Авр о бех Січ Аза ТІ Рго Маї Рго Ре: -- 540 545 550 Й (ее) Тапгобіу А5зр бек біз тах Аїа Ргто Ма1ї Рхо Рхо ТБІ 51у АБр бах сіу 555 580 - чІ Аіа Рко Рго Маї Рко Рго Тпх сіу Азр беї С1у діа Рто Рхо Ма) Рктс 570 575 580 5а5 Рго Так Сіу Авр Бех бсіу А1їа Рхо Рто Уаї Рго Рус ТЬх біу Авр Бех « 590 525 600 біу Аїа рго рРго уаї Рко Рхо Тпг біу Ар бег Ссіу Аіїа Рго Рго МУа1 З с 6о5 610 615 . "з Рго Рко Тпг сіу Авр бек б1у Азїа Рго Руто Ма1ї Ріо Рго ТБг о Авр Ар и 620 625 630 Зеї Пуз січ Аза біп Меї Рго Аза Уа1ї 116 Аг9 Ре 635 640 645 шк обозначаємьсе как ЗЕО ІЮ МО:5, 6, 9 в списке последовательностей. Ге | 7. Молекула нуклейиновой кислоть! по п.б, отличающаяся тем, что кодирует полипептид, включающий - следующую аминокислотную последовательность, вьібранную из группьі, включающей последовательности («в) іЧе) іме) бо б5

   Аз1а був цеч біу А1їа Уаїі Туг ТЕГ січ сС1У біу Рбе Ма1ї Сі с1у Уа1ї 1 5 10 15 Азп о цуз уз Ппеч Сіу Пе Пем біу Авзр Бетх Уа1! Азр І1е Рпе Туз Сіу 20 25 30 І1е Рго РПпе Аїа Аіїа Рго Трг Пує Аїа Печ Сі Ап Рго Сіп Рго Ні 35 40 45 Рго біу Ткр біп біу Трт Пе Гу5 Аза Пуз Авп Рве Пуз уз Ага Сув Ба 55 бо Пес о біп Аза Тахо І1е Тк о біп А5робБех ТБт Тут біу АБр біб Авр Суз ве 70 75 87 Пес Тут Пец Авп І1е Ткр Ма)! Рто біп.біу Ако Цу5 біп Маї бег Аху 55 23 25 Ар Сем Рго Уаї Мет ї11е Ттр Іїіе Тут біу б1у А1їа вВБе Пес Мет су 100 105 110

   15 . Бех сіу Ніз біу А1ї1а А5п Рпге Пцез Ап Ап Тут Без Тут Ар біу СіШ 115 120 125 бін І1їе Аза Тнг Ако біу Азп Ма1і І1їее Уаї Маї Трху РрБе Азп Тух Агд 130 135 140 , МУаї б1іу Рхго реч Сіу Рпе цезч Бех ТЬкг біу Ар Аза АБп о цеч Рго сіу 145 150 155 160 АзпоТух б1іу Без Ако Азробіп Ніз Мес Аза І1їе Аї1а Тур УХа1ї Цуз Ахг9д 165 170 175 Авг І1е Аза Аза Ре сіу Сіу Аєр Рго Ап Азп І12е ТБт Пе Ре сіу се 180 185 1950 (8) "біч Бех Аіїа біу біу Аза бек Маї Бех Меч Сіп Тах Гей Бек Рго Тукг 1935 200 205 Азп о Пуз б1у цем Ії Акгд Акуд Аза Іїе бег біп бБеї біу Уаі1і А1їа Гцец 210 215 220 б зеї Рко ТтІр Ма1ї Ії1е сіп уз АвгоРго Мей РрБе ТуІр А1а Гуз Гуз Уаї о 225 230 235 240 діа біз цЦуз УМаї сіу Суз Рго Уаї Сіу Авр Аза Аза Агу Меє Аїа біп -- 245 250 255 с Суз ПЦеч Був Ха1ї Тпг о Абзр о Рго Ахту Аза Пем ТБх Ге Аза Тух уз Маї 250 265 270 , « Рто цем Аза Сіу Пен біб Тут Рго Мех Гем Ні Тук Уа1ї с1у Рре Маї1ї 275 280 285 Рто Уаї І1е АБр сіу Азр Рпе І1е Рго А1їа Азр Ркго І1е АБп цей Туг « 290 295 300 Аїа Азп А1а Аїа Азр о І11е АБр Тут І1е Аіа Сі1у ТЕ Азп Авп о Мес Ар но) с 305 310 315 320 "» сі1у Ніз І1е Ріе Аїа бек Іїе Ар Мес Рхо Аїа І1е Азп Цуз Сіу Авп " 325 330 335 ПУБ пу УМаї Тк Сі біз Азр Ре Тух цуз Печм Уа1і Бехт бі РМпе ТБ: 340 345 350 ї гія Іїіе Тпг Буз біу це Аг Сіу Аза ПЦуз ТБт ТВБгоРпе Азр Ма1ї Тут ТОг 355 360 365 (ее) -з бі бег Ттр А1а Сіп Ар о Рго бЗег Сіп Сі Ап Туз уз Гуз Торг оУаї 370 375 380 («в) Уаї Азр Рре Сіц Тіт Ар Уаї Печ Рпе ГечоУаї Рго Тбг бі Ізїе Аза 385 390 395 400 3е) Печ А1та біп Ніз Агу Аза Авп діа Гуз бех А1їа Гуз Тіт Туг Аза Туг 405 410 415 ко 60 б5

   ГПеч Рпе Бех Ні Рго бег Аг Ме Рго Уаї Тук Рго цЦув Тур Ма1 біу 4209 425 | 430 Аіа Азв о Нів Аза Азр Ар І1е біп Тух Уа1 Рпе біу Цув Рто Рпє А1а 435 440 445 Тих Ро тТвх біу Тук Ак Рто біп Азо Аго ТВгоХМа1ї бБет уз А1а Мех: 5 455 450 Іїе Аіз Тут Ттр Тпт Азп Рпе А1іа Гуз Тпт О1у Авр Рто Авп Меї біу 465 Й 470: 475 . 480 70 Азр бех А1а Уа1 Рго ТЬк Ніє Тгр 619 Ртго Тух ТіК ТВі б1ч Ап о беї . 425 430 495 сіу Тук цем біц 11е ТбхІ Цуз уз Меє сіу бетг бБет бех Меї Туз Агд 500 - 505 . 510 бег Ген Ак Так оАєп Рпе Пец Агу Тут ТІр Так Пе Твах Тух Гцеч А1а 515 . 520 525 реч Рто ТіпгоМаї ТІ Азр обіп Гуз б1ім Аза біп Меї Рго Аїа Уаії І1е 530 535 540 Ак9 Ріє . 545 Й "бом Аїа цпуз цеч біу Аза Уаії Тут ТІ бі біу б1у Рре Уаіїії бі сіу Уаї 1 о 5 10 15 АБп ГУ цу ГПеч б1у Печ Пец б1іу Авр бет Уа1і Азр І1е Рпе ув б1у 20 25 30 - с І1е Рко Ріе Аїа Аза Рго Так Буз Ада Печ біз Авзп Рго біп Рго Нівз

   40 . 45 (о) Рхто біу Тер біп біу Тпї реч цЦув А1а цуз Азп Рпе Пуз ув Ак Суб 50 55: 60 Тез біп Азїа ТЬх Іїе Ті біп АБр 5ехк Тіг Тух біу Авр січ Ар Сув (є) 65 70 75 80 Зо о Бе Туш Печ Азп ІЗїе Тер Уаї Рхо біп б1у Агу цЦуз біп Маі1ї Бех АгдФ 85 90 85 «- дер цем Рко Ма1ї Меї Іі Тгр І1е Тут б1іу сіу А1їа Рпе цем Меє сіу 106 105 110 с ек біу Нів біу Аіа Ава Рпе Печзч Ап о Авп о тТук оЦцец Тух Авр сіу біц 35 115 126 й 125 З Зіч І1е Аїа Тах Аго б1іу Авп Уаї І)е Ма1ї Уа1ї Твіт Рне Авп Тут Аг , 130 115 й - 65140 « угї сіу Рхо Печ 51у РБе Пец Бех ТІ 01уУ Авр А1їа Ап опе Рко 01уУ дю 5 156 155 : 166 - с Азп Тут біу рем Аго Авр біп Кіз Меє Аза І1е Аза Тур Уа! 1у5 Ах 165 170 й 175 ;» " Азп о І1е Аїа Азїа Рре біу Сіу Авр Рго Азп Азп І1е Тк цец Ріе сіу 180 185 190 - бі бБет Аі1їа біу С1іу Аза бехт Уа) бег Пец сСіп Тих Це бег Рго Тух «» 195 200 205 Го) Азп цув біу цеч І1е Ах Аго Аза І1е бег Сіп бехг біу Маї А1а їец 210 215 220 шк й . Бек Рго Ттр Уаї І1е Сіп Цуз Азп Рго Пе Рипе Ттр Аіїа уз ПЦув Уа1 о 50 225 236 Й 235 240 іЧе) іме) 60 65

   Хліа сій цуз уаї біу Суз Рхто Маї С1у Аєр'дїіа А1а Агу Мес А12 біп 245 250 255 Суз Гец цуз Маї Тих Авр Ргто Аг Аіа Печ ТБІ Пем Аїа Тук Пуз Уаї 250 255 270 І

   Рхо Пец діа Ссіу Пец бі Тут Рго Мес цем Ні Тук Маї біу Рне Уа1 275 280 285 Рго Уаї Іїе Абр Сіу А5р Рпе Тіїе Рхо Аза Авр Рко Іїе АБп Геї ТУЇ 230 295 300 І діа АБп діа Аза Аб5ро 116 Азр о Туг 112 Аза б1іу Тих Авп Азоп Меї Азр 305 310 315 320 сіу Ні Іїе Рпе діа бех І1е Авр Меє Рхо А1а І1е Ап Цуз біу Ап 325 й 330 335 цуз Муз Уа1ї Тих біц біз Азр Ре Тук цЦуз цем Уаї бек бі Рпбе Та: 340 345 350 З І1еє Те цуз біу Пем Ага біу А1їа уз ТБх Трх Рве Азр о Уаї Тук Твх 355 360 365, 516 Бек Тур АДіа біп Азр Рго бек біп б1іц Авп Цуз Цуз Цуз Тіт Уаї 370 3215 380 - Чаї Авр Ре Сі Тбг АвроМаї цем Ре цеч Ма) Рго Тіт бі І1е Аза 385 390 395 400 цем Азїа біп Ніз Ах Аза Ап оАїа Цуз бет Аза Гуз ТБІ Тух Аіа Тут 405 410 Й 4157. й с Печз Рпе бек Нів Рго бет Агуд Меб Рко УМа1ї Тут Рго цу Ттр Маї с1у 420 425 430 Ге) діа Авр Ні А1іа Аєр Ар І1є Сіп Тух Маї Рпе Сіу Цуз Ркго Ре діа 435 440 445 ТрптІ Рго Тахо біу Туг Агу Рго біп Авр о Аку ТВ УМа1і бе цуз Аза Мес Ге»! зо 450 . 455 460 1 НН я 1 А1їа Тук Ттр Ту вза Рпе Аїа Гуз ТНІ біу Азр Рхо Ап Меб сбіу (ав) 475 480 «- А5Б бек діа ХУаї1 Бге ТБжІ Нів Ткр бій Рто Тут тет ТІ бі А5п о 5ег 4960 455 (ге) ЗіУу Тух рез СІЧ І1е Тьг Був Гуз Меї біу Бех сеї бег Мес цу Ага « 500 55 510 г Беттьеч Аку Тпх Авп о Рпе Ггци Аго Тух ТІВ ТІ 18) ТНротутгт гей од: "515 б2000777 лез ЕВІ Тут рем дів 525 « їехч гіо Так Маї Ток Авробіп Сіу Хіа Рто Рхо Уа) рРко рхго ТНг віу 535 540 - с ря Бек б1у Аза Рхто Рго Уа) Рго Рго ТБЕ біу Авр бех Цувз сім діа т 50 555 560 ;» " біп Мес Рго А)1а Уаї І1е Ах Ре ДЦ, 555 Мет реч Твг Мес сіу Аго цем біп реч Уаї Уаії ев сі Меч тах г» -23 -30 де еч с1іу ев тах Суз о Суз Тер ма Уаії Аїа Бех А1а ма цЦуз цеч б1у Аза МУаї Тух ТЬг бі 5 - сіу сіу Ра 1 61 1 ІЗ У е Маї біц Сіу Ууаї АБл Був Цу8 Гей сіу еп Гецч б1у Азр о 50 15 20 25 Бех Уаї Ар І1е РНе Гує О1у І1е Ро Ріе А1а Аіа Рто Тлх ув АІа іЧе) зо 35 40 іме) 60 65

   "цеч біч АвпоРго бід Рго Нів Рто біу Тур сіпбсіу ТБгоПем Гуз А1а 45 50 . 55 цув Ап Рре ув ув Ак Суз Пем біп А1іа Трах І1е Тпх біп Ар Бех 60 65 70

   ТЬх Тух біу Азр б) двр о Суз Беч Тут Печ Ап оІ1е Ттр Ма1ї Рго біп 75 80 85 сіу Агу Пув бСіп Маії бет Аго Азр о Геч Рхо Уа1ї Меїс І1е Тур І3е Тух 90 95 100 Й 105 сіу с1у Аїа Рпе цес Меє сіу Бех біу Нізв біу А1а Авзп РБпе Печ Ап 110 "115 120 Азп Тут Печ Тут Азр о сіу Сі Сі І)е А1їа Тег Агу біу Азп Уа1 ї11е 125 130 . 135 Ууаї Маї ТЬх Ріе Азп Тух Ахуд Маї Сіу Рго Ме Сіу Рре цем Бех ТЕ 140 145 -. 150 сіу Ар А1а Азп цем Рко біу Азп Тут біу Печ Аг9д Азр біп Ні Мес 155 160, 165 "А1ї1а Іїе А1а Тур Уаї Гув Ака А5п І1е Аїа Аіа РБе біу біу А5р РЕ 170 175 180 185 Ап оАвт ІТ1е ТБт о Ццеу ве біу Січ бек Аїа б1іу біу Аіа бег Уа1ї Бех 1927 185 202 Пец біп о ТБЕ Гес о бех рРхто Тух Авп о Гиз біу Беч І1е Аху Аха Аіа ї1е 205 210 215 Бех Сіл бет біу Маї А1а Печ бех Рго Тур Маї І1е Сіп цЦуз Азап Ркго се 220 225 І 230 о пем Рпе Тур Аза цЦуз Гуз Маї А1а Січ Бує Маї Ссіу Суз Рко Уаі1і Сіу 235 240 245" й Азр А1а Аза Агу Мес діа Сіп Суз Пе Був Ма1ї Тах Авр Рко Аку А1а 250 255 260 265 б Грем Трх Печ А1ї4 Тух Був Маї Рго Печ А1а сіу цем Сіц Тух Рко Мес о " 270 275 280 Беч нів Тут Маї біу Рле Маї Рхо Уа1ї І1еє Азр Ссіу Ар Рпе І1е Рхо -- 285 290 255 й с Кіа Авр Рго.

   І1е Авп Пец Туг А1а АзлоАіа Аза Азр о ЇІ1е Ар Туг І1е 300 305 310 чІ Аїа сСіу ТЬт А5п Авп о Мес Ар біу Ніз Іїе Рне Аіїа бек І1е Азр Мес 315, 320 325 - Ртго А1а І1е Азп цує б)у Азп о Буз Пуз Уаї ТНК обі біз Ар Ре Тух « 330 335 340 345 Туз Геч Уаї Бек біц Ре Тьх І)Їе ТЬБІ цу біу цем Аго бсіу А1а ув не) с 350 355 360 "» ТрІ Тих Рре Азр Уаї Тут Тії бій Бех ТІр Аза біп Авр Ркго Бех біп ій 365 370 375 біз АвпоБуз Цу5 уз Ту Маї Уві Азр Рпе бі ТБг Азр Маї цем Рпе 38 385 зо ть Пем Маї Рто ТЕ б3)1ц Ії Аїа цем Аза біп Нів Аку Аза Азп Аза Гуз о 395 400 405 Бек Аїа Цуз ТІ Тух Аза Туг Пец Рре бек Нів Рко бег Агу Меє Рго - 410 415 420 425 ; (ав) Маї Тут Рго ПЦуз Тур Уа) Сіу А1а Азр Нів Аїа Ар А5р І1е бій Тух 430 435 440 3е)

   ко 60 б5

   Уа1ї Рпе б1у Гу рго Рре діа Тпг Рго,Тпг сіу Тух Агуд Рго Сіп Авро, 445 450 455 Ат ТВтІ Маї Бех цу А1їа Меїх І1їе А1а Тут Ттр Тік Авп Ріпе Аза Гуз 460 455 470 Тьх п1у Авр Рго Ап Мес сіу Авр бЗех Аіїа Ммаї Рхго Тпт Ні Ттр Січ 475 480 485 Рко Тут Тіх ТБІ Сі Азп обег біу Тут Пем січ І1е Трг Гуз Гуз Мес 490 495 500 505 С1у Бек бек ет Мес Гуз Ах бех Меч Аху Тіт Ап Ре Пец Аг Тут 510 515 520 Тур Тпх Пем Твг о Тут ем Аіа Грем Рто Тах Ха1ї ТБІ Азробіп бів ліг 525 536 5135 Тато Рто МХа1ї Рто Рго ТпІ б1уУ АБр беїх бі Аза Ту Рго Уа) Рго РІС 12 540 545 550 тах біу Азробех біц ТІ Аза Рго Ма! Рго Рго ТІ 01Мм Авр зх с1у 555 550 ЗЕ А1іа Рго Рго Уаї Рго Ркго Тах біу Азр бБеї С1у АТа вхо Рто Маї РІто 570 575 5Вва 585 й , Рго ТІ Сіу Азр бек с1у А1їа Рто Рхо Маї Рго Рус ТрІ біу Азр 5еї 590 595 600 сіу Аїа Рго Ркго Маї Ркго Рго Тпт біу Ар бек біу А1а Рго Рко Уаї1 6О5 610 615 М с Вто Рго ТпІ біу Авзр Бек біу А1їа Рго Рто Ма) Рго Рто ТВПтї АБр Ар (5) 620 625 630 Беї Пуз бі Аїа Сіп Мес Рго Аіа Ма! І1е Ак9 Рібе 635 640 645 обозначаємьсе как ЗЕО ІЮ МО:5, 6, 9 в списке последовательностей. Ге»!

   8. Молекула нуклейновой кислотьі, кодирующая полипептид, которьій представляет собой вариант стимулируемой солями желчи липазь! (85513 и имеет ее активность, аминокислотная последовательность - которого по крайней мере на 9095 гомологична следующей аминокислотной последовательности «- А1їа цуз Пец Сіу Аїа Маї Тук Трх бі біу Сіу Рне Маї Сі сіу Уві 1 5 10 15 со АзпоГуз цув еч сіу реч Пей біу А5р бек УМаї Азр Ії1є Ріе Туз 01Уу « 20 25 30 І1е Рхо Ріре А1а діа Рго ТЬкК Пуз А1а цез б31ії Азп Ргосбіп Рго Нів 35 40 45 « Рто сіу Ттр біп біу Тпх Меч Цуз А1а Гуз Ап Ре Цуз Гуз Аго Суз 20 50 55 бо - с рем біп Аїа ТБ І1є Тйт о біп А5р бек Тк Туг біу Авр сій Авзр Сув 65 70 15 80 ;» " Пез Тух рем Азп І1е Тгр Уаї Рго Сіп біу Аг Туз біп УМаї бех Ахд 85 90 95 49 Авр цей Рго Уаї Мес Іїе Тгр Іїе Туг с1у С1іу Аїд Ре цем Меє б1у Сг» 100 105 110 о бЗех біу Нівз біу Аіїа АвБп о Рпе Пем Авп о Азп о Туг о речц Туг Азр біу 3 115 120 125 шк («в) іЧе) іме) 60 65

   Іі Січ І1їе А1їа ТВх Аго біу Азп УМа1ї І12 Хаї Маї ТЕ: Ре Азп Тут Ахгд 130 125 140 чаї біу Рго Печ біу Ріе цей Бек Тітг біу Авр А1а Азп Пец Ркго біуУ 145 150 155 150

   А5п Тут біу цем Ака Ар біп Ніз Мес ліа І1є Азїа Тур Маї уз Ахго 1655 1: 175 Азпої11е А1а Аза вРпе біу біу Азр РІЗ АБпл о бЗіп І1е ТВх МПез Рбе 01 180 " 185 190 70 су Бех дія сіу біу Аїа бекг Уа1ї бек Ге біп ТБх Гем бек Рко Тух 1935 200 . 205 Азп о цуз біу Пец І1їє Агд Аху Аза І1е бег бів Бех біу Уа1ї Аїа Геч 210 215 220 Бех Рко ТтІр Ма1ї І1е біп Цуз Авп Рго Пец Рпе Ттр А1а Буз Му Маї1 225 230 235 240 Аіа бі Цуз Уаї біу Суз Ргто Уаї сіу Азр А1а А1їа Ако Мес А1а біп 245 250 255 Суз Печ ПЦуз Маї ТЬг Авр Рхо Агу Аза Без Тс Пец А1а Тук Пцуз Маї 260 255 270

   Рхо Пец Аїа біу Пцеч Сі Тут Рго Мес Пцемш Ніз Тут Маї Сб1іу Рібе Уа1ї 275 280 285 Рто Уаі1і Іїе Азр сСіу Азр Ріе І1їе Рко Азїа Ар Рхо І1е Ап Пцез Тухг 290 295 300 с Ака Авп А1а Аїа Авр І1е Азр Тук І1е А1їа біу Трх Азп Азп Мес Авзр 305 310 315 320 (о) сСіу Нів І16 Рре Аїа бек 116 А5р Мес Рхо Аіїа І1е Авп Цу5 Сі1у Авп 325 330 315 цЦуз Пух маї Тахо біз біз Азр Ре Тух Муз Пем Уа1ї Бек біз Ріе Тг (о) 340 345 350 Зо о Ііїе ТІ ЦцЦуз сіу цеч Ахур біу Аїа Ццу5 тах Так Рпе Авзр Уаї Тут Тіг 355 360 365 «-- січ бек Тур Азїа біп Азр о Рго бек біп біз Авп Пуз Пуз Пуз Тік Уаї со 370 375 зво Маї Авр Рпе бій Тптх Ар Уаї Пцед Рбе Гем Уаї Рго Трх січ І1е Аїа - 385 390 395 400 Геч А1а біп Нів Аху Аза Абп Аза Пуз бБет Аїа Буз ТВі Ту Аїа ТУк 405 410 415 : « ТГеч Рпе бек Нів Рго бек Ага Мес Ркго Уаї Тук Рго ПЦуз Тгр Уаі1їі сіу 420 425 430 - с А1а Ар Ніб А)їа Авр о дДБр 112 Сіп Тугт Уа1 Ре Сіу цу5 Рго Ріе Аіа ч 435 - 440 445 и? Тртх Рго Тіт сіу Тут Аго Рго біп Азр Ат ТвВг Уа1і бех Гуз А1їа Меє 450 455 460 ї» Іїе А1а Тух Тер Тік Авп Ре А1а Муз ТБх біу Авр Рхо Авп Меб б1у 465 470 475 . 480 со Азр Бек Аїа Ма1ї Рго ТІ Ніз Ттр біц Рхго Тут ТпПг Тік о сіЗ Азп о 5ех 485 450 485 шк

   («в) 3е)

   іме) 60 65 біу тук Без бі І1е Тк о Пуз Гу5 Мас віх Бетх бБеї бек Мет Гуз Аха , 500 , 525, 510 Яеї Печзч Ака Тпх Азп о Рбе Пец Ага бух Тур ТБкоБес Ту туго Гео А1а 515 525 525

   Пес Ргз ТтТпт Уа1ї ТВі о Азр о біп біб діа ТптІ Ркго Ха1ї Рко Рго ТпІ біу 538 515 540 Азр бет біш Аїа Так Ріс Уа)! Ру Ріо 7лІ ЗіУу Абр Бех бі ТтТпху Аза 545 550 555 58 РІо Ма1і Рго Ріо ТБг біу Авр беї бі1у Аіа Ркто Рхо Уа1ї Рго Рто Тог 555 570 575 сіу Азр бБег сіу Аїа Рхо Рко Уаї Рго Рто Тптг біу Азр б5ет біу А1їа 580 585. 590 Рто Рго Маї Рго Рто ТВх Сіу Азр бек біу Аїа Рго Рго Уа1ї Рго Рго 12 595 600 605 Тит біу Авзр бБеї біу діа Рго Рго Уа1і Рхо Рхто Тих Сіу Азр бех біу 6510 6515 5620 Аї2а Рго Рго Маії Рго Рхо Тнх п1у Азр бех 01у Аза Рко Рго Ма1 Рто є25 630 635 540

   Ро Тк о Сіу Ар А1а біу Рго Ртго Рто Хаїії Рго Рко ТБг б1у Авр 5ег 645 650 655 с1у Аіа Рто Рго Маії Рхо РІто тах су Азр Бех с1у Аїа Рхо Рхто Уаї бео 665 570 с ТІ Рго ТЬї сСіу АБр бБег біц тТБІ А1іа Рго Уа! Рхо Рко ТК б1Уу Ар (5) 675 682 685 ет біу Аза Рго Рго Ма) Рго Рго Трх Сіу Авр Бех С1іч АЗіа А1їа Рго 690 695 700 Ууаї Рко Рхо ТЬІ Авр Авр бек цу Сі діа біп Мес Рго Аза Ма1ї Іїе (о) зо 705 710 715 720 «в) Атх9 Ре К-4 К-4 ьо обозначаемой как ЗЕО І МО:7 в списке последовательностей, за исключением тех молекул нуклеиновьх кислот, которье кодируют полипептид, имеющий остаток аспарагина в положений 187. г) 35 9. Молекула нуклейиновой кислоть! по п.8, отличающаяся тем, что кодирует полипептид, содержащий « следующую аминокислотную последовательность Аїа туз Пес сіу Аїа Уаї Тут Твг бій С1у б1у Рне Уаї бі сіу маг1 1 5 10 15 Азпогув Гуз вч сіу їеч Гей с1у АВР бБегт Маї Азр І1е Ре Гуз сіу ч

   40 - с І1е Рго Рпе А1а А1а Рго ТНг БПуз А1їа їез біч АБп Ргосбіп Рго Нів ч ,; а Рхо 5 Ттр біп С1у ТБЕ Пец Цуз Аза Гуз Авп Ре цуз Гу Ах Суз 55 бо 45 це Сів Аза Тьх І1е Тнг обіп Ар бек Твг Тут б1у Азр січ Азр Сувз 65 70 75 ьч 80 (ее) шк

   («в) 3е)

   іме) 60 б5 їеч Тук Пец Азп І1е Ттр Маї Рго бФіп б1у Ак9 Цуз Сіп Ма)ї бек Ахд в5 90 95 Азр Пей Рго Маї Мес І1є Тгр 112 Тук біу с1у Аза РБе Пцечз Месє С1Уу 100 105 110 беї біу Нівз бс1іу А1а Авп Рре Пец Авп Азп Тут Печ Тут Азр біу січ 115 120 125 сі І11е Аза Тк Акуд біу А5п Маї І12 чаї Хаї Тихш Ре Азп Туг Ахд 130 125 140 чаї сРу Рхто цеч біу Ре Пцез Бег Тпг о бІіу Авро Аза АБп Без Рго біуУ 145 150 155 150 Азп о Тук біу реч Акуд Ар біп Кі Ме одіа І1е А1їа Тер Маї Цуз Ага . 165 іт: 175 АзпоІ11е Аза Аза Рпе біу біу Азр Ро Авпосіп 11е Тк Без Ррбе с1у 180 й 185 190 бій бек Аіїа Сіу Сіу Аза бег Ма1їі бет Ге біп Тпк о Пец бек Рго Туг 195 200 205 Авпоцуз б1у Пец І1є Агд Акту А1а І1е бег Сіп Бек біу Ма1 Аїа Пец 210 215 220 бек Рко Тхтр Маї І1їе біп Цуз Азп Рго Пец Рпе Тур Аіїа цЦуз Цуз Уаї 225 230 235 240 о Аїа січ Цуз УМаї Сіу Су Рго Хаї Сіу Ар А1їа А1а Агу Меї Аїа сіп , 245 250 255 Суз Печ Гуз Маї Тах Авр Рхо Аху Аза Пцеч тт о Печ Аза Тук Гуз Маї 260 265 270 с РІо цем Аїа сіу Геч Сі Тух Рго Мес цей Ніз Тут Уаі1ї б1іу Ріе-Уаї 215 280 285 . (о) Рхо Маї І1е Авр сіу А5р Рібе І)їе Рго Аза Азр Рго І1е Ахп Печ Тук 290 235 зо діа Ап Аза Аза Авр о ЇІ16 Азр Тух І1їе Аіїа Сіу тпг Авзп Азп Мет Авр Ге»! 305 310 315, 320 сіу Нівз І1е РБе Аза бек І1їе Азр Меї Рхо А1а І1їе Ап Цувз б1у Азп о 325 330 335 «- Пувз Муз Ма1і Тахо біз біч А5р Ре Тух БУуз Гец УМаї Бех бій Рре Тіг 340 345 350 со ІзЗе ТЬг Буз с1у Пцеч Аг біу Аїа Гу5 Тну Тіт Рпе Азр Уа1ї Тут ТрЕ Й 355 360 355 « біч Бет Тур Аїа Сіп Азр рРго бех біп біц Азп Цув Був Цуз ТБк Уаї 370 375 380 Уаі Авр Рпе бій Тік о Азр Маії Пем Ре Пезч Уаї Рко ТБх біч І1їе Аза « 385 390 395 400 йеч Аїа біп Ні Аху Аза Азп Аза пуз бек А1їа пуз Тах Туг Аза Туг З с 405 «10 415 ч Пе РБе бек Ні Рко бет Аго Меє Рго уаї Тухк Рко Пуз Ттр Уа1 С1у "» 420 425 430 Аза Азр Ніз Аїа Авр Авр І1е біп Тут Уа1ї Рпе сіу Цуз Рго Ріе А1а 435 - 440 445 т» Тіт Рго Так о біу Тух Атгу Рго біп Азр Агу Трг оУа1і бек цЦуз Аїа Меє 450 455 460 (ее) І І1е А1а Тух Тер Тік Азп Рпе А1а Гуз Тпг біу Авр Рго Азп Меє сіу - 465 470 475 480 Азр Бет А1а Уаї Рго ТЬг Ніз Тур січ Рто Тух Тік ТлхІ біч АБп 5ехг о 485 450 495 3е)

   іме) бо б5 біу Туг Пцеч біс Ї11е Тих Гуз Гуз Меє біу Бек бек бек Мес Цувз Аха 50 525 5і1й

   ' . тет Печ Ага Тпх Азп Ре пе Аго Тутг ТтІр о ТБЕ Ге ТЕ ОТуї Бей А1!а 515 52 525 Пес Ргз ТпгоУаї Тв А5робіп бід Аїіа Тлк о Рко хаї Рко Рхо Так сіу 530 515 540 Азрв бек бі А1їа Таг РІС хХаї Ре РІО 7пІ О1У Авр о бех бі Ту Аза 545 550 555 560 Рто Маї Рко Рхко Тік біу Азр беї С1у Аїа Рко Рго Ма1ї Рго Рго ТБг 5655 . 579 575 с1у Ар Бег біу Аїа Рхо Рго Маї Рго Рто Тах біу Азр бек біу А1а 580 585 590 РІ Рго Маї Рго Рго ТІ Сіу А5р беї біу Аїа Рго Рго Маі1ї Рго Рто 595 БО 605 Тих біу Азр бек С)іу діа Ркго Рко хаії Рхто Рхо Тнх біу Авр 5ех сбіу 610 615 620 Аза Рго Рго Ма) Ртіо Рго Ток сСіу Авр беїх б1у Аза Рго Рго Маї Рто 625 630 635 640 , Рго ТІ біу Авр Аза біу Рго Рто Рго Уаї Рго Рко ТП біу Азр 5ег 645 50 655 біУу Аїа Ркго Рго Ма1і Рхго Рго тах сіу Азр бек б1у А1а Рго Рго Уаї1 66о І-І 670 тр . . с ТБІ Рго ТрІ біу Ар бег бі ТлхІ А1а Рго Ма! Рхто Рко Тк сСіу Азр 675 682 685 о бет біу Аза Рго Рго Маї Рхо Ркго ТІ Сіу Авр бек січ А1а Аїа Ртго 690 695 700 хаї Рго Рто ТНІ Ар Азр бег ПЦуз Сі Аіа біп Меї Рго А1а Уаї І1е 705 710 715 720 (22) Аха Рпе (ав) обозначаемую как ЗЕО ІЮ МО:7 в списке последовательностей. «-

   10. Полипептид, которьій представляет собой вариант стимулируемой солями желчи липазь (В551І) и имеет ее активность, включающий следующую аминокислотную последовательность с з Меє рем Тіг Меє сСіу Аго Мец сіп рец Ма1! Ма) Гец бс1у цеч ТЬхг Су 35-23 -29 -15 -10 в Суз Тур А1а Маї А1їа бек Аза А1а Гу5 Печ біу діа Ма1ї Туг Так січ -5 1 5 сіу сіу Рпе Уаї Сі біу Ма1ї Авп Гуз Гуз Печ біу цеч Пец Сіу двр ч 10 15 20 25 - с Зек Ма1і1 Азр Ііїіе Рпе Гуз біу І1е Рго Ріе А1а Аіа Рго Тбг Гуз Аїа 30 35 40 . а Пец біч Ап овРго біп Ррго Нів Рхо біу Ттр біп сіу Трг Печ Гуз А1їа 45 Пуз АвпоРпе Гуз Гу Агу Суб Гео біп Азфа ТІ І1е ТЬгобіп Азо бег 60 65 79 . г» Тапг Тут біу Азр сіб Авр Суб це Тух Пец Азп І1е Тур о Уа1ї Рго сіп (ог) 15 во 85 -й 50 (ав) 3е) 55 ко 60 б5 с1у Агу цув біп УМаії бер Агу АзроБеч Рго Уа1ї Мес Іїе Тур І1е Туг зо 95 100 105 б1і1у сіу А1а РБе Пцеч Мес сіу бехт біу Ніз біу А1а А5п Рбе цем Авп 110 115 120 Азп Тут Пас Тук Аєв біу біз сі І1е Аїа Ту Акад С1у Ап Маї І1е 125 130 135 Ма1ї Маї Тпх Ре Азп Туг Ак уаї біу Рхто йез б3у Рпе цем бег Тог 140 115 й 150 С1у Ар А1а Ап Пец Рко Сіу Азп Тух С1у Пей Акд Авр сіп Нів Меє 155 160 165: А1а І1їе Аїа Тур Уа1ї туз Акуд Азп І1е А1а Аза Ріе сіу Сіу А5р Рго 170 175 й 180 185 Авп Азп оІ1е ТБІ Пес Ре Сіу бій бех Аза біу біу А1їа бек Уа1ї бех . 190 195 | 200 Бем біп Тв Тез бех Рго Тут Азп Муз біу Бемш І1е Аг9 Ако Аза Іїе 205 210 215 Бек біп беї бСіу УМаї Аї1а Пцецп бек Рко Тур 21 Ї12е біп цЦуз Азп Рго 229 225 2360

   ПечовРпе Тер діа Цуз Цуз Ха1і Аіа 51 Цув Узі Зіу Суз Рко Уаії б1у У 235 " 243 245 о Азр Аїа Аіа- Ага Мес Аїа біп Суз Пем Муз Маї ТпІ Азр Рго Агу Аїа 250 255 2: 252 с рез Тахо оіївц о Аіа тукоцуз Уаї Рто Бей Аїа біу ей біс Тут Рто Ме: (5) 270 275 289 пцеч Ні Тут Ма1ї б51у Рпе Уаї Рто Ма1і І1е АзрБ Сіу Авр Рпе І1е Ртго 285 280 295 А1іа Азр РхІо І1е Азп Пем Туг А14а А5п А1а Аза А5р ІЗ1е Азр Тухг І1е (2) 300 305 310 о Аіїа сіу Ту Азп о Абзп Мес АБробіу Ніз І12е Рпе А1їа бех І1е Авр Мес 315 320 325 ч- Рго діа І1е Азп Гуз біу Азп Пуз Цуз Хаї ТБп бі бій Авр Рбе ТУг с 330 « 335 340 345 Зо Гуз Печ о Уа1ї бехт б1у Рпе ТЬІг І1е Тапх Гуз б1у Без Ах піу Аза Був - 350 155 350 Тк ТЬг Рпе дБ Ма1ї Тук Тік бі бек Тур Аза б)п А5р Рго бетї біп 365 370 375 « іч Азп о цу цу БПуз Тих УМа1ї Уаї Азр Рпе бі ТІ Азр Уаї Меч Ріє з 380 385 390 с 7 Печ Маї Рто ТптІ б10 І1е діа Пец Аза біп Ні Агу Аза Авп о Азїа Гуз ч 395 й 400 405 и? бек А1їа Пцув Тіт Туг А1ї1а Тух Гей Рпе беї Ні Рто Бех Агд Меє РІго 410 415 425 425 ї» Уаї Тут Рго Буз Тур Ма1ї Сіу А1ї1а Авр Ніз Аїа Ар А5р І1їе біп Туг 430 435 440 со Уаї Рпе с1у ПЦуз Рго Рре Аза ТПк Рго ТНІ біу Тух Ахо Рго біп А5р 445 . 450 455 шк й и

   («в) 3е)

   іме) 60 б5

   Аха ТІ Маї Бех Гуз Аїа Меї ї1е Аза Тух Тур ТБх Азп Рбе Аїа Гуз ! 450 465 470 ТпІ С31у Авр Рго Азп Мес Сіу Азр Бех А1а Ма1ї Рго ТЬх Нів Ткр січ 475 4во 485 Рто Тут ТВІ Тіг о біч Ап бек біу Туг реч бій І1їе ТнІ цу Шу Мехс 490 495 500 505 С1у Бек бег бек Меє Гуз Ахд бек Пец Ак Тпх АБп Рпе цеч Аг ТУг 510 "515 520 ТЕр ТБЕ Пей тік о Тук Бей Аза цем Рго Тпх Уаї Таг Азр біп Січ А1а 525 530 й 535 Тпх Рго Уаї Рго Рго Тік Сіу Авр Бех сій А1а Труг Рго Уа) Рго Рго І 540 545 550 . Тих біу Авр бек бій Тк Аза Рго Уаї Рто Рго Тіт біу Авр Бет б1у 555 560 565 Аза Рго Рго Уаї Рго Рго Тіт с1у Ар Сех Сіу А1їа Рго Рко Уа1ї Рго 570 575 580 585 Рго ТпІ біу Азр бет біу Аза Рго Рто Ма1ї Рго Рхто Тиіг біу Авр 5ег 590 595 бо сіу Аіа Рко Ркго Уаії Рго Рго ТЬк біу Азр Бех біу А1іа Рекс Рго Ма1 605 610 615 Рго Рго Так біу Ар бБет біу Аіа Рхо Рко Ма) Рго Рто Так біу Авр 620 625 630 Бех б1у А1іа Рго Ртго Хаї Рго Рго Тіїх Сіу Азр Аза Сіу Ріс Рто Рго с 625 546 645 що о Ууаї Рко Рхо Так 51у Азр Бек сіу А1а Рто Рго Ма1! Рго Рго Тк с1у 650 655 660 665 Азр Беї Сіу Аза Рго Рго Уаї ТпІ Рго Тиг біу Авзр бет б1ч Тіг А1а 670 675 680 . Ге) ВхІо Маї Рго Рго Ту біу А5р Бех б1у Аїа Рго Рго Уа! Рго Рхко Тіх 685 690 695 о Сс1у Азр бБег бі Аза Азїа Рго Ма1ї Рко Рго Тит Авр Ар бех Цуз січ ч 700 705 710 А1а сіп Мес Рго діа Ма1ї І1їе Ага Ре со 715 720 «І обозначаемую как 5ЗЕО ІЮ МО:2 в списке последовательностей, отличающийся тем, что представляет собой делеционньй мутант, вьібранньй из группьі, включающей - полипептид, у которого аминокислотнье остатки -23-0 и 536-711 представленной последовательности « делетировань, - полипептид, у которого аминокислотнье остатки -23-0, 536-568 и 591-711 опредставленной (З с последовательности делетировань, ц - полипептид, у которого аминокислотнье остатки -23-0 представленной последовательности делетировань! и"? и аминокислота Агп в положений 187 заменена на Сп, - полипептид, у которого аминокислотнье остатки 632-708 представленной последовательности делетировань!. «г» 11. Полипептид по п. 10, отличающийся тем, что находится, по существу, в чистой форме. со 12. Полипептид по п. 10 или 11, отличающийся тем, что его применяют в терапии.

   13. Полипептид, кодируемьїй последовательностью молекуль! нуклейновой кислоть! по любому из пп.1-9. - 14. Полипептид по п. 13, отличающийся тем, что находится, по существу, в чистой форме. о 50 15. Полипептид по п. 13 или 14, отличающийся тем, что его применяют в терапии.

   16. Фармацевтическая композиция для использования в лечениий патологических состояний, связанньх с (Че) зкзокринной недостаточностью поджелудочной железьі, муковисцидозом, хроническим панкреатитом, жировой малабсорбцией, вследствие физиологических причин, отличающаяся тем, что включает зффективное количество полипептида по любому из пп. 10, 11, 13 или 14 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемьй носитель.

   17. Полипептид, применяемьй для производства лекарственного препарата для лечения патологического іФ) состояния, относящегося к зкзокринной панкреатической недостаточности, отличающийся тем, что указанньй ко полипептид представляет собой полипептид по любому из пп.10, 11, 13 или 14.

   18. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата бо для лечения муковисцидоза.

   19. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения хронического панкреатита.

   20. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения жировой малабсорбции. 65 21. Полипептид по п. 17, отличающийся тем, что применяется для производства лекарственного препарата для лечения малабсорбции жирорастворимьїх витаминов.

   22. Полипептид поп. 17, отличающийся тем, что применяєтся для производства лекарственного препарата для лечения жировой малабсорбции вследствие физиологических причин.

   23. Полипептид поп. 17, отличающийся тем, что применяєтся для производства лекарственного препарата для улучшения усвоения пищевьІх липидов.

   24. Полипептид поп. 17, отличающийся тем, что применяєтся для производства лекарственного препарата для улучшения усвоения пищевьіх липидов недоношенньми детьми. 70 с з о Ге) (ав) «- (ге) «

   - . а ї» (ее) шк (ав) (Че) ко 6о 65