SK285420B6

SK285420B6 - Varianty lipázy stimulovanej soľou žlčových kyselín, DNA molekuly ich kódujúce a transgénne cicavceodlišné od človeka

Info

Publication number: SK285420B6
Application number: SK1085-95A
Authority: SK
Inventors: Lars Bl�Ckberg; Michael Edlund; Lennart Hansson; Olle Hernell; Lennart Lundberg; Mats Str�Mqvist; Jan T�Rnell
Original assignee: Arexis Ab
Priority date: 1993-03-01
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 2007-01-04
Also published as: CZ216995A3; AU6223794A; NO953426D0; CN1187450C; JP3837444B2; CA2156083C; CA2156083A1; KR100312825B1; PL310413A1; US5827683A; IL144015A; KR100357016B1; HU221119B1; HU9502561D0; NO953426L; WO1994020610A1; PT687296E; SK108595A3; EP0687296B1; UA48109C2

Abstract

Sú opísané polypeptidy, ktoré sú variantmi lipázystimulovanej žlčovými soľami (BSSL, EC 3.1.1.1), DNA molekuly kódujúce tieto polypeptidy, spôsoby prípravy týchto BSSL variantov a produkcie transgénnych cicavcov odlišných od človeka, schopných exprimovať BSSL varianty. Tiež sú opísané transgénne cicavce odlišné od človeka, rovnako ako kojenecká výživa obsahujúca mlieko z opísaných transgénnych živočíchov, farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú tieto polypeptidy, a použitie uvedených polypeptidov a DNA molekúl na výrobu liečiva.

Description

Predložený vynález sa týka polypeptidov, ktoré sú variantmi lipázy stimulovanej žlčovými soľami (BSSL - Bile Salt-Stimulated lipase; EC 3.1.1.1). Týka sa aj molekúl nukleových kyselín kódujúcich tieto polypeptidy a subproduktov zahŕňajúcich tieto molekuly DNA. Vynález sa ďalej týka spôsobov produkcie spomenutých variantov BSSL a produkcie transgénnych cicavcov odlišných od človeka schopných expresie variantov BSSL. Vynález sa ďalej týka takých transgénnych živočíchov ako aj dojčenskej výživy obsahujúcej mlieko zahŕňajúce tieto polypeptidy z takýchto transgénnych zvierat. Vynález sa týka aj farmaceutických kompozícií obsahujúcich tieto polypeptidy a použitia týchto polypeptidov a molekúl DNA na výrobu liečiv.

Doterajší stav techniky

Hydrolýza dietámych lipidov

Dietáme lipidy sú dôležitým zdrojom energie. Vyše 95 % týchto lipidov tvoria energeticky bohaté triacylglyceroly. Niektoré lipidy, napr. určité mastné kyseliny a vitamíny rozpustné v tukoch, sú esenciálnymi zložkami stravy. Pred gastrointestionálnou absorpciou musia triacylglyceroly ako aj menej zastúpené zložky, t. j. esterifikované vitamíny rozpustné v tukoch, cholesterol a diacylfosfatidylglyceroly, prejsť hydrolýzou esterových väzieb, aby vznikli menej hydrofóbne, absorbovateľné produkty. Tieto reakcie katalyzuje špecifická skupina enzýmov nazývaných lipázy.

U ľudí sa za esenciálne lipázy považuje žalúdočná lipáza, lipáza závislá od pankreatickej kolipázy (hydrolýza tria diacylglycerolov), pankreatická fosfolipáza A2 (hydrolýza diacylfosfatidylglycerolov) a karboxyester hydroláza (CEH) (hydrolýza esterov cholesterolu a esterov vitamínov rozpustných v tukoch, ale aj tri-, di- a monoacylglycerolov). U dojčeného novorodenca má lipáza stimulovaná žlčovými soľami (BSSL) podstatnú úlohu pri hydrolýze niekoľkých uvedených lipidov. Spolu so žlčovými soľami tvoria produkty trávenia lipidov zmiešané micély alebo unilameláme vezikuly (Hemell et al., 1990), z ktorých dochádza k absorpcii.

Lipáza stimulovaná žlčovými soľami

Lipáza stimulovaná žlčovými soľami (BSSL) je zložkou mlieka pri obmedzenom počte druhov, napr. ľudí, goríl, mačiek a psov (Hemell et al., 1989, Hamosh et al., 1986). Po zmiešaní so žlčou v hornej časti tenkého čreva sa BSSL špecificky aktivuje primárnymi žlčovými soľami (Hemell, 1975). BSSL, ktorá tvorí približne 1 % celkového mliečneho proteínu (Blackberg & Hemell, 1981), sa nedegraduje počas prechodu cez žalúdok s mliekom a v duodenálnom obsahu je chránená žlčovými soľami pred deaktiváciou pankreatickými proteázami, ako je trypsín a chymotrypsín.

Tepelné spracovanie ľudského mlieka (pasterizácia pri 62,5 °C, 30 min ), ktorá úplne deaktivuje BSSL (Bjorksten ct al., 1980), znižuje koeficient absorpcie tuku o približne 1/3 u predčasne narodených detí (Williamson et al., 1978, Atkinson et al., 1981). Preto je lepšie využitie triacylglycerolu čerstvého ľudského mlieka v porovnaní s triacylglycerolom z dojčenských výživ s podobným tukovým zložením dôsledkom BSSL (Hemell et al., 1991, Chapell et al., 1986).

BSSL je nešpecifická lipáza (EC 3.1.1.1) vzhľadom na to, že hydrolyzuje nielen triacylglycerol, ale aj di- a monoacylglycerol, cholesterylestery a estery vitamínov rozpust ných v tukoch (Blackberg a Hemell, 1983). Po aktivácii má teda BSSL potenciál hydrolyzovať väčšinu lipidov ľudského mlieka samotná, hoci najúčinnejšie zužitkovanie triacylglycerolu ľudského mlieka vyžaduje synergické pôsobenie žalúdočnej lipázy (EC 3.1.1.3), pankreatickej lipázy závislej od kolipázy (EC 3.1.1.3) a BSSL (Bembäck et al., 1990).

Nedávne štúdie naznačujú osobitnú dôležitosť mliečneho enzýmu pri využití polynenasýtených mastných kyselín s dlhým reťazcom u novorodencov (Hemell et al. 1993). Tieto mastné kyseliny sú dôležitými prekurzormi eikozanoidov a pre vývoj nervovej sústavy. Novorodenci, najmä predčasne narodení, majú obmedzenú kapacitu syntézy týchto mastných kyselín z ich prekurzorov. Preto sa považujú za esenciálne pre dosiaľ nedefinovaný časový úsek po narodení.

V nedávnych štúdiách z niekoľkých laboratórií boli charakterizované štruktúry cDNA z mliečnej lipázy aj z pankreasovej karboxyester hydrolázy (CEH) (E.C. 3.1.1.1) (Babaetal., 1991; Hui et al., 1991; Nilsson et al, 1990; Reue et al., 1991) a dospelo sa k záveru, že mliečny enzým a pankreasový enzým sú produktmi toho istého génu. Sekvencia cDNA a dedukovaná aminokyselinová sekvencia génu BSSL/CEH (sekvencia č. 1) sú publikované aj vo WO 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) a vo WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra).

BSSL je jcdnorcťazcový glykoproteín. Dedukovaný proteín (sekvencia č. 3) obsahuje 722 aminokyselinových zvyškov a je vysoko glykozylovaný (Abouakil et al., 1989). N-koncová polovica proteínu má nápadnú homológiu s acetylcholínesterázou a niektorými inými esterázami (Nilsson etal., 1990).

Serínový zvyšok navrhovaného aktívneho miesta sa nachádza na seríne 194; sekvencia okolo tohto serínu je v súlade s konsenzuálnou sekvenciou aktívneho miesta pre serínové hydrolázy. Jediné navrhované miesto N-glykozylácie je umiestnené len sedem zvyškov ku koncu N od serínu aktívneho miesta (Nilsson et al., 1990).

Sekvencia BSSL obsahuje vo svojej C-koncovej časti 16 opakovaní bohatých na prolín, každé po 11 aminokyselinových zvyškov. Zdá sa, že variácia v počte opakovaní je významným vysvetlením rozdielov v molekulovej veľkosti a aminokyselinovom zložení medzi zodpovedajúcimi enzýmami z rôznych druhov (Han et al., 1987, Fontaine et al., 1991, Kyger et al., 1989). Tieto opakovania nesú väčšinu z 15 - 20 % uhľohydrátov proteínu (Baba et al., 1991, Abouakil etal., 1989).

Unikátny štruktúrny rozdiel medzi BSSL a typickými esterázami spočíva v C-koncovej časti polypeptidového reťazca, t. j. v 16 opakovaniach 11 aminokyselinových zvyškov bohatých na prolín. Zodpovedajúce pankreatické enzýmy z kravy a potkana majú len 3, resp. 4 opakovania (Han et al., 1987, Kyger et al., 1989). Pravdepodobnou hypotézou preto je, že C-koncová časť alebo aspoň jej časť, je nenahraditeľná pre lipázovú aktivitu, t. j. aktivitu proti emulgovanému triacylglycerolu s dlhým reťazcom.

Lipidová malabsorpcia

Bežnými príčinami lipidovej malabsorpcie a tým aj podvýživy sú znížené intraluminálne hladiny lipázy závislej od pankreatickej kolipázy a/alebo žlčových solí. Typickými príkladmi takej lipázovej deficiencie sú pacienti trpiaci cystickou fibrózou, bežnou genetickou poruchou vedúcou k celoživotnej deficiencii u 80 % pacientov, a chronickou pankreatitídou, často v dôsledku chronického alkoholizmu.

Súčasnou liečbou pacientov trpiacich deficienciou pankreatickej lipázy je orálne podávanie veľmi veľkých dávok surového prípravku bravčových pankreasových enzýmov. Lipáza závislá od pankreatickej kolipázy sa však deaktivuje nízkym pH v žalúdku. Tento efekt nemožno úplne potlačiť použitím veľkých dávok enzýmu. Podávané veľké dávky sú teda neadekvátne pre väčšinu pacientov a navyše prípravky majú nízku čistotu a nepríjemnú chuť.

Boli formulované určité tablety, ktoré prechádzajú cez kyslé oblasti žalúdka a uvoľňujú enzým až v pomerne alkalickom prostredí jejuna (lačníka). Mnohí pacienti trpiaci pankreatickými poruchami však majú abnormálne kyslé jejunum a v týchto prípadoch tablety nemusia enzým uvoľniť.

Navyše keďže prípravky dostupné na súčasnom trhu sú nehumánneho pôvodu, existuje tu riziko imunitných reakcií, ktoré môžu mať škodlivé účinky na pacientov, alebo môžu viesť k zníženiu účinnosti liečby. Ďalším nedostatkom súčasných prípravkov je, že ich obsah lipolytických aktivít iných ako lipázy závislej od kolipázy nie je uvedený. V skutočnosti väčšina z nich obsahuje veľmi nízke hladiny aktivity BSSL/CEH. Mohla by to byť jedna z príčin, prečo mnoho pacientov trpiacich na cystickú fibrózu trpí napriek doplnkovej terapii deficitom vitamínov rozpustných v tukoch a esenciálnych mastných kyselín.

Preto sú veľmi potrebné produkty s vlastnosťami a štruktúrou odvodenou od humánnych lipáz a so širokou substrátovou špecifickosťou, ktoré sa môžu podávať orálne pacientom trpiacim deficitom jedného alebo niekoľkých pankreatických lipolytických enzýmov. Produkty, ktoré možno získať využitím predloženého vynálezu, spĺňajú túto potrebu samy osebe alebo v kombinácii s prípravkami obsahujúcimi iné lipázy.

Podstata vynálezu

Rekombinantné varianty BSSL podľa vynálezu majú zachovanú katalytickú aktivitu, ale obsahujú menej glykozylačných miest ako BSSL s plnou dĺžkou a produkujú sa teda s potenciálne zníženým stupňom uhľohydrátovej heterogénnosti. Táto znížená zložitosť uľahčuje čistenie a charakterizáciu rekombinantného proteínu, čo povedie k nákladovo efektívnejšej výrobe polypeptidov s aktivitou BSSL.

Z ďalšieho aspektu je znížený stupeň glykozylácie menej náročný na hostiteľa a umožňuje vyššiu produkciu v niekoľkých hostiteľských bunkách. Podľa ďalšieho aspektu umožňuje znížený počet glykozylačných miest vo variante BSSL účinnú produkciu v nižších eukaryotoch a obmedzuje potenciálne riziko aberantnej glykozylácie, ktorá môže vyvolať imunologické reakcie. Zo zníženej veľkosti a menej zložitej glykozylácie tiež vyplýva, že výber hostiteľov je širší ako pre proteín s veľmi zložitými a ťažkými uhľohydráte vými zvyškami.

Terapeutické využitie variantu BSSL, ktorý je menší veľkosťou, ale je rovnako aktívny, znamená, že sa zníži hmotnosť látky potrebnej na suplementáciu. Ďalšou možnou výhodou pri rekombinantnom variante BSSL, ktorému chýba väčšina O-glykozylovaných opakovaní alebo všetky tieto opakovania, je znížené riziko imunologickej reakcie u príjemcu. Je to v dôsledku skutočnosti, že cukor pripojený cez kyslík môže byť veľmi heterogénny v závislosti od bunky, v ktorej sa produkuje.

V odbornej literatúre sa uvádza, že natívna BSSL sa viaže a absorbuje črevnou sliznicou. Variant BSSL, ktorý je vybraný na základe zníženej absorpcie, bude aktívny proti dietámym lipidovým substrátom dlhšie, čo povedie k účin nejšiemu intraluminálnemu štiepeniu. Príkladmi takých variantov sú molekuly so zníženou glykozyláciou.

Ako je spomenuté, uvádza sa, že BSSL má osobitnú dôležitosť pri využití polynenasýtených mastných kyselín s dlhým reťazcom (Hemell et al. 1993), ktoré sú veľmi dôležité pre vývoj nervovej sústavy novorodencov, a vitamínu A. Variant BSSL podľa vynálezu, ktorý je v týchto ohľadoch účinnejší, možno selektovať známymi metódami. Skrátený enzým bude pravdepodobne odlišný v konformácii, čo môže mať dopad na špecifickosť proti rôznym lipidovým substrátom.

Podľa jedného aspektu sa vynález týka molekuly nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid s hydrolytickou aktivitou proti triacylglycerolom s dlhým reťazcom aktivovanou žlčovými soľami, pričom týmto polypeptidom je variant BSSL kratší ako natívny 722-aminokyselinový polypeptid BSSL plnej dĺžky, keďže obsahuje len časť aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako zvyšky 536 - 722 v SEQ ID NO:3, a pričom tento variant BSSL obsahuje menej ako 16 opakujúcich sa jednotiek, pričom pojem „opakujúca sa jednotka“ označuje jednu z opakujúcich sa jednotiek 33 nukleotidov, z ktorých každý je uvedený v SEQ ID NO: 1 v zozname sekvencií.

Pojem „časť aminokyselinovej sekvencie“ sa má chápať tak, že zahŕňa jednu jedinú aminokyselinu ako aj sekvenciu niekoľkých aminokyselín alebo niekoľko takých sekvencií v kombinácii.

Pojem „variant BSSL“ sa má chápať ako polypeptid s aktivitou BSSL a zahŕňajúci časť aminokyselinovej sekvencie humánnej BSSL uvedenej ako SEQ ID NO:3 v zozname sekvencií.

Pojem „polypeptid s aktivitou BSSL“ sa má chápať ako polypeptid, ktorý má všetky z nasledujúcich vlastností:

a) je vhodný na orálne podávanie;

b) je aktivovaný špecifickými žlčovými soľami;

c) pôsobí ako nešpecifická lipáza v obsahu tenkého čreva, t j. je schopný hydrolyzovať lipidy pomerne nezávisle od ich chemickej štruktúry a fyzikálneho stavu (emulgované, miceláme, rozpustné);

a voliteľne jednu alebo viacero z nasledujúcich vlastností:

d) schopnosť hydrolyzovať triacylglyceroly s mastnými kyselinami rôznej dĺžky reťazca a rôzneho stupňa nenasýtenia;

e) schopnosť hydrolyzovať aj diacylglycerol, monoacylglycerol, cholesterylestery, lyzofosfatidylacylglycerol a estery retinolu alebo iných vitamínov rozpustných v tukoch;

f) schopnosť hydrolyzovať nielen sn-1 (3) esterové väzby v triacylglycerole, ale aj sn-2 esterovú väzbu;

g) schopnosť interakcie nielen s primárnymi, ale aj sekundárnymi žlčovými soľami;

h) závislosť optimálnej aktivity od žlčových solí; stabilita v zmysle, že žalúdkový obsah v podstatnom rozsahu neovplyvní katalytickú účinnosť;

i) stabilita proti deaktivácii pankreatickými proteázami, napr. trypsinom, za predpokladu prítomnosti žlčových solí;

k) schopnosť viazať sa na heparín a heparínové deriváty, napr. heparansulfát;

l) schopnosť viazať sa na medzifázy tuk-voda;

m) dostatočná stabilita na umožnenie lyofílizácie;

n) stabilita pri zmiešaní so zložkami potravín, napríklad s ľudským mliekom alebo mliečnymi prípravkami.

V rámci ďalších aspektov sa vynález týka molekuly nukleovej kyseliny podľa uvedeného, kde má variant BSSL fenylalanínový zvyšok vo svojej C-koncovej polohe, alebo zahŕňa sekvenciu Gln-Met-Pro vo svojej C-koncovej časti, alternatívne zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu uvedenú

SK 285420 Β6 ako zvyšky 712 - 722 v SEQ ID NO:3 vo svojej Ckoncovej časti.

V tomto kontexte pojem „C-koncová poloha“ označuje polohu posledného C-koncového zvyšku, zatiaľ čo pojem „C-koncová časť“ sa má chápať ako približne 50 aminokyselinových zvyškov, ktoré tvoria C koniec variantu BSSL.

Vynález sa ďalej týka molekuly nukleovej kyseliny podľa uvedeného, kde variant BSSL zahŕňa menej ako 16 opakujúcich sa jednotiek, pričom pojem „opakujúca sa jednotka“ označuje jednu z opakujúcich sa jednotiek 33 nukleotidov, z ktorých každý je uvedený v SEQ ID NO:1 v zozname sekvencií.

V rámci ďalších aspektov sa vynález týka molekuly nukleovej kyseliny podľa uvedeného, ktorá kóduje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je na aspoň 90 % homologická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako SEQ ID NO: 5, 6 alebo 9 v zozname sekvencií.

Vynález sa týka aj polypeptidu uvedeného ako SEQ ID NO: 5, 6, 7 alebo 9 v zozname sekvencií, ako aj polypeptidu kódovaného sekvenciou nukleovej kyseliny podľa uvedeného.

Vynález sa ďalej týka hybridného génu zahŕňajúceho molekulu nukleovej kyseliny podľa uvedeného, replikovateľného expresného vektora zahŕňajúceho taký hybridný gén, a bunky, ktorá má v sebe taký hybridný gén. Touto bunkou môže byť prokaryotická bunka, jednobunkový eukaryotický organizmus alebo bunka získaná z mnohobunkového organizmu, napr. cicavca.

V tomto kontexte pojem „hybridný gén“ označuje sekvenciu nukleovej kyseliny zahŕňajúcu na jednej strane sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu variant BSSL s uvedeným významom a na druhej strane sekvenciu nukleovej kyseliny génu, ktorý je schopný sprostredkovať expresiu hybridného génového produktu. Pojem „gén“ označuje celý gén ako aj jeho podsekvenciu schopnú sprostredkovať a zacieliť expresiu hybridného génu na tkanivo, ktorc je predmetom záujmu. Bežne je touto subsekvenciou subsekvencia, ktorá má aspoň jednu alebo viacero promótorových oblasti, miesto štartu transkripcie, 3' a 5' nekódujúce oblasti a štruktúrne sekvencie.

Hybridný gén je výhodne vytvorený in vitro inzerciou sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej variant BSSL do génu schopného sprostredkovať expresiu pomocou techník známych v danej oblasti techniky. Alternatívne možno sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu variant BSSL inzerovať in vivo homologickou rekombináciou.

V tomto kontexte pojem „replikovateľný“ znamená, že vektor je schopný replikácie v danom type hostiteľskej bunky, do ktorej bol zavedený. Bezprostredne nahor proti smeru sekvencie nukleovej kyseliny môže byť sekvencia kódujúca signálny peptid, ktorej prítomnosť zabezpečuje sekréciu variantu BSSL exprimovaného hostiteľskými bunkami, v ktorých sa nachádza vektor. Signálnou sekvenciou môže byť sekvencia prirodzene spojená so sekvenciou nukleovej kyseliny, alebo môže byť iného pôvodu.

Vektorom môže byť akýkoľvek vektor, ktorý môže byť konvenčné podrobený postupom rekombinantnej DNA, a voľba vektora bude často závisieť od hostiteľskej bunky, do ktorej sa má zaviesť. Vektorom môže teda byť autonómne sa replikujúci vektor, t.j. vektor, ktorý existuje ako mimochromozómová entita, ktorej replikácia je nezávislá od chromozómovej replikácie; príkladmi takých vektorov sú plazmidy, fágy, kozmidy, minichromozómy alebo vírusy. Alternatívne môže byť vektorom vektor, ktorý sa po zavedení do hostiteľskej bunky integruje do genómu hostiteľskej bunky a replikuje sa spolu s chromozómami, do ktorých bol integrovaný. Príkladmi vhodných vektorov sú bak teriálny expresný vektor a kvasinkový expresný vektor. Vektor podľa vynálezu môže niesť ktorúkoľvek zo sekvencií nukleových kyselín podľa vynálezu s uvedeným významom.

V rámci ďalšieho aspektu sa vynález týka spôsobu produkcie rekombinantného polypeptidu, pričom tento proces zahŕňa (i) kultiváciu hostiteľskej bunky v kultivačnom médiu alebo na ňom, do ktorej bola inzerovaná molekula kyseliny podľa uvedeného v hybridnom géne, ktorý je schopný replikovať sa v konkrétnej hostiteľskej bunke, alebo identifikáciu a reprodukciu organizmu, do ktorého bola zavedená molekula nukleovej kyseliny podľa uvedeného v hybridnom géne, ktorý je schopný replikovať sa v tomto konkrétnom organizme, (ii) expresiu polypeptidu a (iii) izoláciu polypeptidu.

Médiom použitým na kultiváciu buniek môže byť akékoľvek konvenčné médium vhodné na tento účel. Vhodným vektorom môže byť ktorýkoľvek z vektorov opísaných a vhodnou hostiteľskou bunkou môže byť ktorýkoľvek z uvedených typov buniek. Metódy použité na skonštruovanie vektora a dosiahnutie jeho zavedenia do hostiteľskej bunky môžu byť ktorékoľvek z metód známych na také účely v oblasti rekombinantnej DNA. Rekombinantný ľudský variant BSSL exprimovaný bunkami môže byť vylučovaný, t. j. exportovaný cez bunkovú membránu, v závislosti od typu bunky a zloženia vektora.

Ak je variant BSSL produkovaný vnútrobunkovo rekombinantným hostiteľom, teda nie je vylučovaný bunkou, možno ho izolovať štandardnými postupmi zahŕňajúcimi rozrušenie buniek mechanickými prostriedkami, napr. ultrazvukom alebo homogenizáciou, alebo enzymatickými, alebo chemickými prostriedkami s nasledujúcim čistením.

Aby sa dosiahlo vylučovanie, sekvencií DNA kódujúcej variant BSSL by mala predchádzať sekvencia kódujúca signálny peptid, ktorej prítomnosť zabezpečuje sekréciu variantu BSSL z buniek tak, že aspoň podstatný podiel exprimovaného variantu BSSL sa vylúči do kultivačného média a izoluje sa.

Vynález sa týka aj expresného systému zahŕňajúceho hybridný gén, ktorý je exprimovateľný v hostiteľskej bunke alebo organizme, v ktorom sa nachádza tento hybridný gén, tak, že pri exprimovaní hybridného génu sa produkuje rekombinantný polypeptid, pričom hybridný gén sa pripraví inzerciou sekvencie nukleovej kyseliny podľa uvedeného do génu schopného sprostredkovať expresiu tohto hybridného génu.

Možným postupom na produkciu rekombinantného variantu BSSL podľa vynálezu je použitie transgénnych cicavcov odlišných od človeka schopných expresie variantu BSSL do svojho mlieka. Využitie transgénnych cicavcov odlišných od človeka má tú výhodu, že možno získať veľké výťažky rekombinantného variantu BSSL za rozumnú cenu a najmä, keď je týmto cicavcom krava, že rekombinantný variant BSSL sa produkuje v mlieku, ktorc jc bežnou zložkou napr. dojčenských výživ, takže nie je potrebné rozsiahle čistenie, keď sa má rekombinantný variant BSSL používať ako doplnok výživy v produktoch na báze mlieka.

Navyše produkcia vo vyššom organizme, napríklad v cicavcovi odlišnom od človeka, bežne vedie k správnemu spracovaniu cicavčieho proteínu, napr. vzhľadom na posttranslačné spracovanie, ako je diskutované skôr, a správnemu konformačnému zvinutiu. Možno tiež získať veľké množstvá v podstate čistého variantu BSSL.

V súlade s uvedeným môže byť expresným systémom spomínaným skôr cicavčí expresný systém zahŕňajúci sekvenciu DNA kódujúcu variant BSSL inzerovanú do génu kódujúceho mliečny proteín cicavca odlišného od človeka, aby sa vytvoril hybridný gén, ktorý je exprimovateľný v mliečnej žľaze dospelej samice cicavca, v ktorej sa nachádza tento hybridný gén.

Mliečna žľaza ako exprimujúce tkanivo a gény kódujúce mliečny proteín sa všeobecne považujú za osobitne vhodné na použitie pri produkcii heterológnych proteínov v transgénnych cicavcoch odlišných od človeka, keďže mliečne proteíny sa prirodzene produkujú v mliečnej žľaze vo vysokých hladinách expresie. Mlieko sa tiež ľahko získava a je dostupné vo veľkých množstvách. V tomto spojení má použitie génov mliečneho proteínu pri produkcii rekombinantného variantu BSSL ďalšiu výhodu, že sa produkuje za podmienok podobných prirodzeným produkčným podmienkam v súvislosti s reguláciou expresie a miestom produkcie (mliečna žľaza).

Pri použití v transgénnom cicavcovi uvedený hybridný gén výhodne zahŕňa sekvenciu kódujúcu signálny peptid, aby sa umožnila správna sekrécia produktu hybridného génu do mliečnej žľazy. Signálnym peptidom bude spravidla peptid bežne sa vyskytujúci v géne mliečneho proteínu alebo peptid spojený so sekvenciou DNA kódujúcou variant BSSL. Relevantné sú však aj iné signálne sekvencie schopné sprostredkovať sekréciu produktu hybridného génu do mliečnej žľazy. Samozrejme rôzne prvky hybridného génu by mali byť fúzované tak, aby sa umožnila správna expresia a spracovanie génového produktu. Teda bežne by sekvencia DNA kódujúca zvolený signálny peptid mala byť presne fúzovaná na N-koncovú časť sekvencie DNA kódujúcej variant BSSL. V hybridnom géne sekvencia DNA kódujúca variant BSSL bežne zahŕňa svoj stop kodón, ale nie svoju vlastnú informáciu o štiepení a polyadenylačné miesto. V smere sekvencie DNA kódujúcej variant BSSL budú bežne zachované spracovacie sekvencie mRNA génu mliečneho proteínu.

Predpokladá sa, že za skutočnú hladinu expresie konkrétneho hybridného génu je zodpovedných niekoľko faktorov. Schopnosť promótora ako aj iných regulačných sekvencií podľa uvedeného, miesto integrácie expresného systému v genóme cicavca, miesto integrácie sekvencie DNA kódujúce variant BSSL v géne kódujúcom mliečny proteín, prvky konferujúce post-transkripčnú reguláciu a iné podobné faktory môžu byť zásadne dôležité pre získanú hladinu expresie. Na základe poznania rôznych faktorov ovplyvňujúcich hladinu expresie hybridného génu by odborník v danej oblasti vedel, ako navrhnúť expresný systém vhodný na tento účel.

Gén mliečneho proteínu, ktorý sa má použiť, môže byť získaný z toho istého druhu ako druh, do ktorého sa má zaviesť expresný systém, alebo ho možno získať z iného druhu. V tejto súvislosti sa ukázalo, že funkčnosť regulačných prvkov, ktoré sa zameriavajú na expresiu génu do mliečnej žľazy, presahuje hranice druhov, čo môže byť dôsledkom možného spoločného predka (Hennighausen et al., 1990).

Príklady vhodných génov kódujúcich mliečny proteín alebo jeho účinné subsekvencie na použitie v konštrukcii expresného systému podľa vynálezu sa bežne vyskytujú medzi srvátkovými proteínmi rôzneho cicavčieho pôvodu, napr. gén srvátkového kyslého proteínu (WAP), výhodne myšacieho pôvodu, a |3-laktoglobulínový gén, výhodne ovčieho pôvodu. Aj kazeínové gény rôzneho pôvodu sa môžu ukázať ako vhodné na transgénnu produkciu variantu BSSL, napr. hovädzí aSl-kazeín a králičí β-kazein. V súčasnosti preferovaným génom je myšací WAP gén, keďže sa ukázalo, že je schopný zabezpečiť vysokú hladinu expresie pre niekoľko cudzích humánnych proteínov v mlieku rôznych transgénnych zvierat (Hennighausen et al, 1990).

Ďalšou sekvenciou výhodne spojenou s expresným systémom podľa vynálezu je takzvaná expresiu stabilizujúca sekvencia schopná sprostredkovať expresiu vysokej úrovne. Existujú silné indikácie, že také stabilizujúce sekvencie sa nachádzajú v blízkosti génov mliečneho proteínu a nahor v sekvencii od neho.

Vynález zahŕňa aj spôsob produkcie transgénneho cicavca odlišného od človeka, schopného exprimovať variant BSSL, zahŕňajúci (a) zavedenie expresného systému podľa uvedeného do oplodneného vajíčka alebo bunky embrya cicavca iného ako človeka tak, aby sa expresný systém zabudoval do zárodočnej línie cicavca a (b) vývoj získaného oplodneného vajíčka alebo embrya zavedeného do dospelej samice cicavca iného ako človeka.

Zabudovanie expresného systému do zárodočnej línie cicavca možno uskutočniť použitím akejkoľvek vhodnej techniky, napr. podľa „Manipulating the Mouse Embryo“; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Napríklad niekoľko sto molekúl expresného systému možno priamo injektovať do oplodneného vajíčka, napr. oplodneného jednobunkového vajíčka alebo jeho pronuklea, alebo do embrya zvoleného cicavca, a mikroinjektované vajíčka možno potom preniesť do vajíčkovodov pseudogravídnych matiek a nechať ich vyvinúť sa.

Postup produkcie transgénneho cicavca odlišného od človeka, schopného exprimovať variant BSSL, môže zahŕňať aj spôsob, pri ktorom je tento cicavec v podstate neschopný exprimovať BSSL z cicavca samotného. Taký spôsob zahŕňa (a) likvidáciu schopnosti cicavca exprimovať BSSL tak, že sa neexprimuje v podstate žiadny cicavčí BSSL, a inzerciu expresného systému podľa uvedeného do zárodočnej línie cicavca tak, že sa v cicavcovi exprimuje variant BSSL; a/alebo (b) nahradenie cicavčieho génu BSSL alebo jeho časti expresným systémom s uvedeným významom.

Schopnosť exprimovať cicavčí BSSL možno prakticky zlikvidovať zavedením mutácii do sekvencie DNA zodpovednej za expresiu BSSL. Také mutácie môžu zahŕňať mutácie, ktoré urobia sekvenciu DNA mimorámcovou, zavedenie stop kodónu alebo deléciu jedného alebo viacerých nukleotidov sekvencie DNA.

Cicavčí gén BSSL alebo jeho časť možno nahradiť expresným systémom s uvedeným významom alebo sekvenciou DNA kódujúcou variant BSSL pomocou známych zásad homologickej rekombinácie.

V rámci ďalšieho dôležitého aspektu sa vynález týka transgénneho cicavca odlišného od človeka, v ktorého genóme sa nachádza sekvencia DNA podľa uvedeného. Táto sekvencia DNA môže byť výhodne prítomná v zárodočnej línii cicavca a géne mliečneho proteínu cicavca. Transgénny cicavec odlišný od človeka môže byť výhodne vybraný zo skupiny, ktorú tvoria myši, potkany, králiky, ovce, ošípané a dobytok.

Vynález zahŕňa aj progény transgénneho cicavca odlišného od človeka podľa uvedeného, ako aj mlieko získané z takého transgénneho cicavca odlišného od človeka.

Vynález sa ďalej týka dojčenskej výživy obsahujúcej mlieko podľa uvedeného a dojčenskej výživy obsahujúcej variant BSSL s uvedeným významom. Dojčenská výživa môže byť pripravená pomocou konvenčných postupov a môže obsahovať akékoľvek potrebné prísady, ako sú minerály, vitamíny atď.

V rámci ďalších aspektov sa vynález týka farmaceutickej kompozície obsahujúcej variant BSSL s uvedeným významom, ako aj takého variantu BSSL na použitie pri terapii.

V rámci ďalších aspektov sa vynález týka použitia variantu BSSL s uvedeným významom na výrobu liečiva na liečenie patologického stavu súvisiaceho s exokrinnou pankreatickou nedostatočnosťou; cystickou fíbrózou; chronickou pankreatitídou; malabsorpciou tuku; malabsorpciou vitamínov rozpustných v tukoch; malabsorpciou vitamínov v dôsledku fyziologických príčin. Vynález sa týka aj použitia variantu BSSL na výrobu liečiva na zlepšenie využitia dietámych lipidov, najmä u predčasne narodených novorodencov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Expresia rekombinantnej BSSL v eukaryotických a prokaryotických bunkách

1.1 Experimentálne procedúry

1.1.1 Rekombinantné plazmidy

Plazmid pSl 46 obsahujúci 2,3 kb ľudskej BSSL cDNA (Nilsson a kol., 1990) klonovaný do pUC19 sa štiepi s Hid III a Sali a BSSL cDNA sa zavedie do hovädzieho papilómu vírusového (BPV) expresného faktora, pS147 (obr. 1). Tento vektor obsahuje ľudský BSSL cDNA pod kontrolou myšacieho metalotioneinového 1 (mMT-1) enhancéru a promótujúceho elementu (Pavlakis a Hamer, 1983). mRNA opracujúce sa signály sa vybavia gemomickým fragmentom obsahujúcim časť exónu II, intrónu II, exónu III a elementov v smere z králičieho β-globínového génu. Táto transkripčná jednotka sa klonuje do vektora, ktorý obsahuje celú BPV zárodkovú líniu. Transkripcia je jednosmerná pre BPV a BSSL transkripčnú jednotku. Pre propagáciu vektora v Escherchia coli vektor tiež obsahuje pML2d, derivát pBR322 (Sarver a kol., 1982).

Expresný vektor pS147 tiež kotransfekuje s vektorom kódujúcim gén rezistentný k neomycínu riadený Harvey Sarcoma vírus 5'-Long terminálnymi opakujúcimi sa a Simian vírus 40 polyadenylačnými signálmi (Lusky a Botchan, 1984).

Pre expresiu BSSL v E. coli sa BSSL cDNA subklonuje ako Ndel-BamHI fragment z plazmidu pT7-7 (Ausubel a kol., 1992) do plazmidu pGEMEX-1 (Promega, Madison, WI, USA) (Studier a Moffat, 1986). Touto klonovacou procedúrou T7 gén 10 kódujúci sekvenciu sa nahradí BSSL génom kódujúcim pre hotový proteín predchádzaný štart kodónom. Konečný expresný vektor, pGEMEX/BSSL, sa overí DNA sekvencovaním s použitím špecifických BSSL interných primerov.

1.1.2 Mutagény

Nukleotid číslo 1 sa označí A v iniciačnom kodóne ATG. Pre aminokyselinové číslovanie prvý metionín v signálnom peptide je -23 a prvý aminokyselinový zvyšok hotového proteínu, alanin, je označený číslom 1.

Pre konštrukciu delečného variantu A (SEQ ID č. 4§ sa syntetizujú dva PCR primery, PCR-1 a PCR-2 (tabuľka 1). Miesta HindlII, Sali a BamHl sa vytvoria pre klonovanie v rozdielnych plazmidoch. Namiesto Beli sa vytvorí v BSSL sekvencii bez altemovania aminokyselinovej sekvencie. To sa uskutočňuje na uľahčenie adície syntetickej DNA, na získanie iných variantov. Primer PCR-2 obsahuje dva syntetické stop kodóny. Výsledné PCR fragmenty sa štiepia s BamHl a HindlII a klonujú do pUC18 pre sekvenčnú analýzu. Tento plazmid sa označí ako pS 157. Správny PCR fragment sa inzertuje do BPV expresného vektora fúziou k BSSL sekvencii v jedinečnom mieste Asp700 (poloha 1405 v BSSL cDNA) a v mieste Sali vpredu β-globulínového génového fragmentu, čo má za výsledok pS257.

B-variant konštrukcie (SEQ ID č. 5) sa uskutočňuje s použitím oligonukleotidov číslo 3, 4, 7 a 8 (tabuľka 1). Anelované oligonukleotidy kódujú dokonca aj C-terminálnu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá reprezentuje lyzín 712, k fenylalanínu 722 v proteíne s plnou dĺžkou. Tento fragment sa fúzuje ku glutamínu 535. Translantačný stop sa inzertuje priamo za posledný fenylalanin. Tento fragment obsahuje miesto Beli na 5'-konci a miesto Sali na 3'-konci, čo dovoľuje zavedenie do pS157. Výsledný plazmid sa štiepi s Asp700 a Sali a 313 bp fragment sa zavedie do expresného vektora, ako je opísané. Výsledný plazmid je označený pS258.

Tabuľka 1

Syntetické oligonukleotidy používané na konštrukciu BSSL variantov. Nukleotidy restričných miest sú nepodčiarknuté. Translačné stop signály sa označujú silnými písmenami. Upravený kodón pri variante N je označený v PCR-3 silnými písmenami a hviezdičkou.

Oligonukleotid	sekvencia.(5*-3’)
PCft-1	CGCGATCCCAACCCCTTCGGCACCCCCÄCG
PCR-2	ccaaccttctccacttačtactgatcagtcactgtgggcagcgccag
PCR-3	GGGÄATKTCGCCArrCCTTGCGTCAACACCAATATCGCCGCCTrCCG GGCGGACCCCAACCACATCACGCTCTTCGGGCAC1CT
PCR-4	ČCCCATCCC ACATAGTCCAGCATCGGCTACTCCAGGCC
1	CATCACCGCGCCCCCCCCGTCCCGCCCACGGCTGACTCCGGG
2	GCCCCCCCCGTCCCGCCCACGCGTGACTCCAAGGAÄGCTCAGA
3	TCCCTGCACTCATTAGCTTI-rAGTAJ^TCCACA
4	AGCTTCTCGACTTACŤAAAACCTAATGACTC
5	CAGGCATCTCAGCrTCCTTGGAGTCACCCGTGGGCCGCACGGGCGGGG CCCCGCA
€	eTCACeCCTGGCCGGCACCCGGGGGCCCCCCT
Ί	GATCACAACGAAGCTCACA
8	CAGGCATCTGAGCTTCCTTCT

Na účely konštrukcie sa použije gén kódujúci C-variant (SEQ ID č. 6), oligonukleotidy 1 až 6 (tabuľka 1). Anelovaný DNA fragment obsahuje dve opakujúce sa časti, kódujúce 11 aminokyselín, identické pre konsenzus (Nilsson a kol., 1990), inzertované medzi glutamín 535 a lyzín 712 k fenylalanínovej 722 sekvencii. Tento fragment taktiež obsahuje Beli miesto na 5'-konci a Sali na 3'-konci, čo dovoľuje rovnakú stratégiu klonovania, ako je uvedená. Výsledný plazmid je označený pS259.

Pre konštrukciu variantu N (ne-N-glykozylovaný variant, SEQ ID č. 7) sa syntetizujú dva PCR priméry (PCR-3 a PCR-4 v tabuľke 1). Miesta EcoRI a BamHl sa vytvoria klonovaním 360 bp PCR produktu do pUC19 pre sekvenčnú analýzu. Potenciálne N-viazané glykozylované miesto na asparagíne 187 sa vymení za glutamín. Modifikovaná sekvencia sa izoluje ako Ball-HindlII fragment a klonuje na Sací a HindlII štiepený pUC19 spolu s Sací a Balí fragmentom obsahujúcim mMT-1 promótor a 5'-koniec BSSL cDNA. Približne 1,2 kb Sacl-Dralll fragment sa izoluje z tohto plazmidu a inzertuje do mMT-1 elementu a BSSL cDNA sekvencie s expresným vektorom. Výsledný plazmid je označený ako pS299.

1.1.3 Cicavčia bunková kultúra a transfekcia

Vektor sa zavedie kotransfekciou do myšacej bunkovej línie C127 (ATCC CRL 1616) podľa metódy kalciumsulfátovej precipitácie (Graham a Van der Eb, 1973).

C127 bunky sa kultivujú v Hamovom F12-Dulbesccoom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM) (1:1), doplnenom 10 % fetálnym teľacím sérom. Bunkové klony rezistentné k neomycínu sa podrobia selekcii s 1,5 mg x ml-1 G148 a po 10 až 15 dňoch sa rezistentné bunkové klony izolujú zo základnej dosky a podrobia sa pasáži pre analýzu.

1.1.4 Bakteriálne kmene a kultivačné podmienky

Pre experimenty expresie sa vektor pGEMEX/BSSL transformuje do kmeňa E. coli JM109(DE3) a BL21(DE3)pLysS. Experimenty expresie sa uskutočňujú ako opísal Studier a kol. (1986). Po zachytení baktérii sa bunky peletujú odstreďovaním (preťaženie 5000 g za teploty 4 °C počas 10 minút). Na prípravu periplazmových a cytoplazmových frakcií sa pelety resuspendujú v 4 ml 20 mM Tris-Cl/20 % sacharózy, s hodnotou pH 8,0, 200 μΐ 0,1 M EDTA a 40 pl lyzozýmu (15 mg/ml vo vode) na 1 g peliet. Suspenzia sa inkubuje na ľade počas 40 minút. Potom sa pridá na 1 g peliet 160 μΐ 0,5 M chloridu horečnatého a potom sa suspenzia odstreďuje pri preťažení 12 000 g počas 20 minút. Výsledný supemantant obsahuje periplazmové proteíny a pelety predstavujú cytoplazmovú frakciu. Alternatívne, na výrobu rozpustných proteínov, sa bunky suspendujú v 40 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluoridu, s hodnotou pH 8,2, lyofilizujú a roztavia a k lýza niekoľkokrát vystaví pôsobeniu ultrazvuku. Bunky lyzátu sa odstreďujú pri preťažení 30 000 g za teploty 25 °C počas 30 minút.

1.1.5 Analýza nukleových kyselín

RNA a DNA sa pripravia z izolovaných cicavčích bunkových línií alebo buniek E. coli (Ausubel a kol., 1992). RNA alebo DNA sa frakcionuje na agarózovom géli alebo prenesie na GeneScreen Plus (New England Nuclear) a hybridizuje podľa inštrukcií dodávateľa.

1.1.6 Príprava natívneho enzýmu

Žlčové soli stimulujúce lipázu sa čistia od ľudského mlieka ako už bolo opísané (Bläckberg a Hemell, 1981). Vyčistený prípravok je homogénny, ako sa usúdi podľa SDS-PAGE a má špecifickú aktivitu 100 pmol uvoľnených mastných kyselín x min-l.x mg-1, pokiaľ sa skúša s triacylglycerolom s dlhým reťazcom ako substrátom.

1.1.7 Skúšanie enzýmov

Skúšanie enzýmov sa uskutočňuje, ako je opísané (Bläckberg a Hemell, 1981), s použitím trioleínu emulgovaného s arabskou gumou ako substrátom. Inkubácia sa uskutočňuje s 10 mM nátriumeholátu ako aktivujúcou žlčovou soľou. Pokiaľ sa testuje závislosť žlčovej soli, žlčové soli (nátriumeholát alebo nátriumdeoxychlolát, Sigma Chem. Co.) sa pridávajú ku koncentráciám uvedeným v tabuľke 3.

1.1.8 Westemový prenos (Westem blotting)

Na účely dosiahnutia významných reakcií pri experimentoch prenosu sa kondicionované médium koncentruje chromatografiou na Blue Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology). Príslušné médiá sa zmiešajú s Blue Sepharose (približne 10 ml média na ml gélu). Gél sa premyje (10 ml na ml gélu) 0,5 M Tris-Cl pufrom, s hodnotou pH 7,4, ktorý obsahuje 0,1 M chloridu draselného. Aktivita enzýmu sa eluuje 1,5 M chloridom draselným do rovnakého pufra. Týmto postupom sa dosiahne 25- až 30-násobná koncentrácia, rovnako ako 3- až 5- násobného vyčistenia. SDS-PAGE sa uskutočňuje na 10 % polyakrylamidových géloch v podstate ako opísal Laemmli (1970). Po transfere na nitrocelulózové membrány a inkubácii s polyklonálnym králičím antisérom na vyčistenie BSSL, sa uskutoční detekcia s použitím kozieho anti-králičieho IgG konjugovaného s alkalickou fosfatázou a s použitím vyvíjajúcej súpravy od firmy Bio-Rad.

1.1.9 Spracovanie s N-glykozidázou F

K 10 μΐ variantu B, obsahujúcej BSSL aktivitu zodpovedajúcu 2,5 pmol uvoľnených mastných kyselín x min.'¹, sa pridá 1 μΐ IM β-merkaptoetanolu a 0,5 μΐ 10 % (hmotnosť/objem) SDS. Všetko sa vari počas 5 minút a potom sa pridá 10 μΐ 0,1 M nátriumfosfátového pufra, s hodnotou pH 8,0 6 μΐ 0 ,1 M EDTA, 4 μΐ 7,5 % (hmotnosť/objem) Nonidet P 40 a 5 μΐ (1 jednotka) N-glykozidázy F (Boehringer Mannheim). Ako kontrolné stanovenie sa identicky spracuje rovnaké množstvo variantu B s tým rozdielom, že sa nepridá žiadna glykozidáza. Po inkubácii za teploty 37 °C cez noc sa vzorky podrobia SDS-PAGE a prenosu s použitím polyklonálneho králičieho BSSL antiséra.

1.2 Výsledky

1.2.1 Konštrukcia BSSL variantov

Modifikácia BSSL variantov vo vzťahu k BSSL plnej dĺžky sú zhrnuté do tabuľky 2 a uvedené na obr. 1. Stratégia použitá pri vytváraní týchto variantov je opísaná v časti 1.1. pre variant A (SEQ ID č. 4), stop kodón sa zavedie po glutamíne v polohe 535, pričom sa odstráni posledných 187 aminokyselín z proteínu s plnou dĺžkou. Pre variant B (SEQ ID č. 5) doména kódujúca 11 celkom C-terminálnych aminokyselín a pôvodný translačný stop sa fúzujú na glutamín 535. Preto tento variant ruší všetky opakovania. Pre variant C (SEQ ID č. 6) fragment obsahuje dve opakujúce sa časti, ktoré majú sekvencie identické ku konsenzu (Nilsson a kol., 1990), sa inzeruje medzi glutamín 535 a lyzín 712 k fenylalanínovej 722 sekvencii.

Variant sa konštruuje k analýze dôležitosti iba experimentálne N-viazanej cukrovej štruktúry, umiestnením klonu k aktívnemu miestu serínu 194. Variant N (SEQ ID č. 7) sa dosiahne úpravou potenciálneho N-glykozylačného miesta v asparagíne 187 na glutamín.

Tabuľka 2

Aminokyselinová sekvencia BSSL variantov vo vzťahu k ľudskej BSSL

Variant	Deletované zvyšky	Znenené zvyšky
A (SEQ ID Č. 4)	536 - 722
B (SEQ ID 6. S)	536 - 711
C (SEQ ID č. S)	536 · 568, 591 - 711
N (SEQ ID č. 7)		Asn 187 —>Gln

1.2.2 Charakterizácia rekombinantnej DNA v bunkovej línii cicavcov

DNA vzorky sa pripravia z bunkových línií transfekovaných s expresnými vektormi kódujúcimi rozdielne BSSL varianty. Pripravená DNA sa štepí s BamHI, frakcionuje na agarózovom géli a transferuje na membrány pre hybridizáciu. Použitá skúšobná látka je ³²P značená BSSL cDNA. Výsledky hybridizácie potvrdzujú prítomnosť rekombinantných génov a tiež to, že počet kópií vektora je približne rovnaký v rozdielnych bunkových líniách (obr. 2). Polohy hybridizujúcich fragmentov odrážajú rozdielne dĺžky rôznych BSSL sekvencií a sú v súlade s očakávanou veľkosťou. Polohy sú tiež podobné DNA odvodenej od baktérií, použité pri transfekčných experimentoch, čo ukazuje, že nedochádza k hlavnému znovupreskupeniu vektora DNA pri bunkových líniách (obr. 2). Horné hybridizačné signály v DNA vzorke predstavujúcej variant A sú pravdepodobne dôsledkom čiastočného štiepenia.

1.2.3 Expresia nmRNA pre BSSL s plnou dĺžkou a mutovanou BSSL u cicavčích buniek

K analýze expresie rôznych rekombinantných BSSL sa pripravia gény RNA z izolovanej bunkovej línie. Experimenty s Northenovým prenosom (Northen blot) a hybridizácie s ³²P značenou BSSL cDNA ukazujú, že rekombinantná mRNA sa dá detekčne stanoviť vo všetkých bunkových líniách nesúcich BSSL vektor (obr. 3). Nezistí sa žiadna hybridizácia v kontrolnej vzorke odvodenej od bunkovej línie obsahujúcej identický vektor s výnimkou BSSL cDNA (obr. 3).

Rôzne dĺžky hybridizačných mediátorových RNA sú v súlade s modifikáciami komplementárnych DNA. Stav trvalých úrovni rekombinantného BSSL mRNA variantov v rozdielnych vzorcoch je približne rovnakého rozsahu ako pre variant A (obr. 3). Príčina pre zníženú akumuláciu variantu A mRNA je neznáma, ale pozoruje sa s dvoma populáciami bunkových línií, rovnako ako s izolovanými klonmi. Prítomnosť rovnakých množstiev RNA v rozdielnych vzorcoch je potvrdená hybridizáciou na skúšobnom myšom β-aktine (obr. 3, nižšia plocha).

1.2.4 Produkcia BSSL s plnou dĺžkou a variant BSSL pri cicavčích bunkách

Médium z individuálnych klonov z C127 buniek, transfekované s BSSL s plnou dĺžkou a rôzne mutačné formy sa zachytia a skúšajú na BSSL aktivitu (obr. 4). Pre plnú dĺžku molekuly a varianty N, B a C aktivity v klonoch s najvyššou expresiou sú v rozmedzí od 0,7 do 2,3 (imol uvoľnených mastných kyselín x min. x ml média, so špecifickou aktivitou zrovnateľnou so špecifickou aktivitou natívnej mliečnej BSSL by mali zodpovedať expresným úrovniam od 7 do 23 pg x ml média’¹. Pre variant A všetky analyzované klony majú aktivitu pod 0,05 pmol uvoľnených mastných kyselín x min.’¹ x ml média'¹. Koncentrácia Blue-Sepharose a lyofilizácia klonu prejavujúca najvyššiu aktivitu ukazujú, že skutočná aktivita enzýmu je exprimovaná, aj keď pri veľmi nízkych úrovniach. Možnosť, že sa dosiahne nízka aktivita s variantom A, by sa sčasti dala vysvetliť žiaduco nižšou špecifickou aktivitou, ktorá by nebola vylúčená.

Westemové prenosy z klonov z rôznych transfekačných experimentov sú znázornené na obr. 5A. Zrejmé M_r BSSL variantov sú podľa očakávania. Je treba poznamenať, že však pre BSSL plnej dĺžky, rovnako ako pre varianty B a C, sa dostáva dvojitý pás. Pretože všetky tri majú jediné N-glykozylačné miesto neporušené, zatiaľ čo variant N, ktorý nemá dvojitý pás, má porušené toto miesto, pravdepodobné vysvetlenie je v tom, že dvojitý pás vyplýva z rozdielov v N-glykozylácii. Preto variant B sa podrobí štiepeniu s N-glykozydázou F. Ako je znázornené na obr. 5B, iba stopové množstvo z horného pásu je zachované, zatiaľ čo nižší pás má vzrastajúcu silu, čo ukazuje, že iba časť exprimovaného variantu je N-glykozylovaná.

Jedným z charakteristík BSSL je jej špecifická aktivácia primárnymi žlčovými soľami, napríklad cholátom (Hernell, 1975). Všetky rozdielne rekombinantné formy BSSL ukazujú rovnakú závislosť koncentrácie pre cholátovú akti váciu (obr. 6). Maximum aktivity sa dosahuje približne pri 10 mM pri použitom skúšobnom systéme. Pokiaľ sa cholát zamení za deoxycholát (sekundárna žlčová soľ), nedosiahne sa taká aktivácia. Tak rekombinant s plnou dĺžkou, rovnako ako rôzne varianty, prejavujú rovnakú špecifickosť s ohľadom na aktiväciu žlčovou soľou.

1.2.5 Expresia a biochemická charakterizácia BSSL s plnou dĺžkou v E. coli

Transformujú sa dva kmene E. coli, JM109(DE3) a BL21(DE3)pLysS (Studier a kol., 1986) s expresným vektorom pGEMEX/BSSL obsahujúcim ľudskú BSSL cDNA za riadenia T7 promótorom. Transformanty z oboch kmeňov sa identifikujú, kultivujú a indukujú s IPTG počas približne 90 minút (Studier a kol., 1986). Analýza celkovej mRNA Northénovým prenosom s použitím BSSL cDNA ako 32P značeného ako skúšobnej vzorky dokladá, že expresia sa účinne indukuje pri oboch kmeňoch a že transkripcia je pevne regulovaná (obr. 7A). Zrejmá veľkosť rekombinantnej BSSL mRNA, približne 2,4 kb, je v súlade s očakávanou dĺžkou. SDS-PAGE separácia vzoriek proteínu a imunodetekcie s anti-BSSL protilátkou ukazuje, že BSSL s plnou dĺžkou je dostatočne produkovaná v E. coli (obr. 7B). Väčšia časť proteínu sa sekrétuje do periplazmy v kmeni BL21(DE3)pLysS ako v kmeni JM109(DE3) (obr. 7B).

IPGT indukované E. coli kultúry obsahujú aktívnu rozpustnú BSSL, čo zodpovedá 0,5 až 4 pg BSSL proteínu na mililiter kultúry. Westemový prenos ukazuje, že medzi 20 a 60 % reaktívneho materiálu je vo forme nerozpustných peliet. Neindukované baktérie neobsahujú akúkoľvek významnú BSSL aktivitu.

Aktivita lipázy z kultivovaných baktérií ukazuje rovnakú závislosť od žlčovej soli ako natívna mliečna BSSL.

2. Čistenie a charakterizázia rekombinantu s plnou dĺžkou a mutačných foriem z lipázy stimulovanej žlčovou soľou

2.1 Experimentálne procedúry

2.1.1 Enzýmy a enzýmové varianty

Rekombinatné plné dĺžky BSSL a BSSL varianty B, C a N sa konštruujú a exprimujú ako už bolo opísané. V porovnaní k natívnemu enzýmu variant B (SEQID č. 5) porušuje všetkých 16 jedinečných, O-glykozylovaných, na prolin bohatých, C-terminálnych opakujúcich sa častí (aa 536 až 711), ale s väčšinou C-terminálneho fragmentu (aa 712 až 722) fúzuje ku glutamínu 535. Variant C (SEQ ID č. 6) obsahuje rovnaký C-terminálny fragment a dve opakujúce sa časti z 11 zvyškov medzi glutamínom 535 a lyzínom 712. Vo variante N (ne-N-glykozylovaný variant, SEQ ID č. 7) je asparagín 187 zodpovedný iba za N-viazaný cukor vymenený za glutamínový zvyšok.

Natívna BSSL sa čistí z ľudského mlieka, ako bolo opísané (Bläckberg a Hemell, 1981).

2.1.2 Skúška enzýmov

Aktivita lipázy sa skúša, ako je opísané (Bläcberg a Hemell, 1981), s použitím trioleínu emulgovaného v arabskej gume ako substrátu. 10 mM nátriumeholátu sa použije ako aktivujúca žlčová soľ. Rôzne modifikácie skúšky sú uvedené v legendách k obrázkom.

2.1.3 Príprava imunosorbentu mg vyčistenej mliečnej BSSL sa kondenzuje s Sepharose s použitím CNBr ako opisuje výrobca. 40 ml polyklonálneho antiséra získaného od králika sa vedie kolónou proti vyčistenej mliečnej BSSL. Špecifické protilátky sa eluujú s 0,1 M glycin-hydrochloridom s hodnotou pH 2,5. Hodno ta pH sa bezprostredne potom upraví na približne 8 pridaním tuhého Tris. Po odsolení a lyofílizácii sa 6 mg afinitne vyčistených protilátok kondenzuje k Sepharoze, ako je opísané.

2.1.4 Čistiaci postup

Kondicionované kultivačné médium, obsahujúce 5 až 25 pg rekombinantnej exprimovanej BSSL alebo BSSL variant sa zmieša s Blue Sepharose (Pharmacia, Švédsko), 10 ml média na mililiter sedimentovaného gélu. Po miešaní koniec ku koncu (end-to-end) počas 30 minút sa gél prepláchne 0,05 M Tris-Cl, s hodnotou pH 7,0, 0,05 M chloridu draselného a lipázová aktivita sa eluuje s 0,05 M TrisCl, s hodnotou pH 7,0 a 1,5 M chloridu draselného. Vrchol aktivity sa zachytí a dialýzuje proti 5 mM nátriumveronalu, s hodnotou pH 7,4 a 0,05 M chloridu sodného. Dialyzát sa aplikuje na kolónu heparín-Sepharoze. Kolóna sa eluuje s gradientom 0,05 až 1,0 M chloridu sodného v 5 mM nátriumveronalového pufra, s hodnotou pH 7,4. Frakcie obsahujúce lipázovú aktivitu sa zachytia a aplikujú na imunosorbentovú kolónu. Po prepláchnutí s 0,05 M TrisCl, s hodnotou pH 7,5, a 0,15 M chloridu sodného, sa viazaná lipáza eluuje s 0,1 M glycín-hydrochloridom, s hodnotou pH 2,5. Hodnota pH sa bezprostredne potom upraví na približne 8 pridaním tuhého Tris.

2.1.5 Elektroforéza

Gélová elektroforéza s nátriumdodecylsulfát polyakrylamidovým gélom (SDS-PAGE) sa uskutočňuje v podstate ako opísal Laemmli (1970). Proteíny sa zafarbia modrou Commassie Bnlliant Blue.

2.1.6 N-Terminálna sekvenčná analýza

Analýza aminokyselinovej sekvencie sa uskutočňuje na zariadení Applied Biosystems Inc. 477 a Pulse Liquidphase Sequencer a analyzére on-line fenyltiohydantoín 120 A s riadnym cyklačným programom a chemikáliami od výrobcu. Na základe výpočtu zo sekvenčného štandardného proteínu (β-laktoglobulín) sú počiatočné a opakované výťažky 47 a 97 %.

2.2 Výsledky

2.2.1 Čistenie rekombinantnej BSSL a BSSL variantov

Chromatografia na Blue Sepharose kondicionovaného média sa najprv použije ako koncentračný stupeň. Nasledujúca chromatografia na heparín-Sepharose poskytne počiatočné vyčistenie hlavne odstránením väčšiny albumínu prítomného v kultivačnom prostredí. Tento stupeň tiež ukazuje, že rekombinantné BSSL molekuly vždy zachovávajú heparínovú väzbu. Potom na imunosorbente všetky BSSL varianty ukazujú viac ako 90 % čistotu, ako sa usudzuje podľa SDS-PAGE (obr. 8). Enzým s plnou dĺžkou, rovnako ako variant B a C migrujú ako dvojice. Zrejmé M_r rôznych variantov sú ukázané v tabuľke 3. N-Terminálna sekvenčná analýza poskytne jedinú sekvenciu pre všetky varianty pre 8 cyklov: Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tyr-Thr-.

2.2.2 Aktivita lipázy

V tabuľke 3 je uvedená zrejmá molekulová hmotnosť rôznych prípravkov. Špecifická aktivita prípravkov je v rozmedzí od 75 do 120 μ mol uvoľnených mastných kyselín x min.¹ x mg proteínu . V dôsledku toho sa nemôže nepozorovať žiadny významný rozdiel v aktivite medzi BSSL plnej dĺžky a BSSL variantmi.

Všetky prípravky ukazujú absolútne požiadavky na primárnu žlčovú soľ (nátriumcholát) pre aktivitu proti emulgovanému triacylglycerolu s dlhým reťazcom (obr.

9A). Nátriumdeoxycholát poskytuje ľubovoľné aktívne varianty (hodnoty nie sú uvedené). Pokiaľ sa však kombinujú rôzne deoxycholátové žlčové soli, dosahujú sa dva účinky (obr. 9B a 9C). Po prvé sú znížené koncentrácie cholátu potrebného pre aktiváciu a po druhé pri vyššej koncentrácii žlčovej soli je inhibovaná aktivita enzýmu.

Tabuľka 3

Zdanlivá M_r rekombinantná BSSL plnej dĺžky a BSSL variantov

Enzým	Mj. (kDa) Stanovené pomocou SDS-PAGE
Plná dĺžka	105,	107
Variant B	63,	65
variant c	60,	62
Variant N	95

2.2.3 Stabilita rekombinantnej BSSL a BSSL variantov Rekombinantná BSSL, rovnako ako BSSL varianty, prejavujú rovnakú stabilitu pri pH ako natívna mliečna BSSL (obr. 10). Inaktivácia nastáva vo všetkých prípadoch pri hodnote pH okolo 2,5 až 3. Nad hodnotou pH 3 sú všetky varianty celkom stabilné, za predpokladu, že koncentrácia proteínu je dostatočne vysoká. To sa spája s pridávaním hovädzieho sérového albumínu alebo ovalbumínu (údaje nie sú uvedené). Zriedené vzorky sú menej stabilné pri všetkých testovaných hodnotách pH, ale prahové hodnoty zostávajú rovnaké (hodnoty nie sú uvedené). Obr. 11 znázorňuje tepelnú stabilitu rekombinantných enzýmov, v porovnaní s natívnym mliečnym enzýmom. Pri teplote 37 až 40 °C začína klesať aktivita. Varianty (B, C a N) sa zdajú o niečo menej stabilné ako rekombinantný enzým plnej dĺžky a mliečny enzým. Ale pokiaľ koncentrácia proteínu vzrastie pridaním hovädzieho sérového albumínu, všetky varianty sú stabilné tiež pri teplote 40 °C (obr. 11).

Natívna mliečna BSSL a všetky rekombinantné varianty sú vždy citlivé k trypsínu. Dosahuje sa časová závislosť inaktivácie (obr. 12). Pokiaľ sa však žlčové soli, to znamená cholát, vložia do pufra, lipázové varianty sú chránené a lipázová aktivita sa zachová (obr. 12).

S ohľadom na počet charakteristík in vivo, to znamená aktiváciu žlčovej soli, heparínové viazanie, stabilitu proti hodnote pH a teplote a ochranu žlčovej soli proti inaktivácii proteázami, nepozorujú sa žiadne významné rozdiely, pokiaľ sa porovnajú rozdielne BSSL varianty s natívnou mliečnou BSSL.

3. Expresia do transgénnych zvierat

3.1 Konštrukcia expresných vektorov

Ku konštrukcii expresného vektora pre produkciu rekombinantného ľudského BSSL variantu v mlieku z transgénnych živočíchov bola použitá nasledujúca stratégia (obr. 13).

Tri plasmidy obsahujúce rôzne časti ľudského BSSL génu (pS309, pS310 a pS311) boli získané s použitím metód, ktoré opísal Lidberg a kol. /1992/. Plasmid pS309 obsahuje Sphl fragment pokrývajúci BSSL gén z 5 netranskribovanej oblasti k časti štvrtého intrónu. Plazmid pS310 obsahuje Sací fragment pokrývajúci génovú sekvenciu BSSL variantu od časti prvého intrónu do časti šiesteho intrónu. Plazmid pS311 konečne obsahuje BanHI fragment pokrývajúci BSSL gén od hlavnej časti piateho intrónu a zvyšok štruktúry intrón/exón s deflekciou v exóne 11. Deletované sekvencie sú 231 bp s výsledkami v sekvencii kó dujúcej BSSL variant, ktorý má presne o 77 aminokyselín alebo 7 opakujúcich sa častí menej ako BSSL v plnej dĺžke. Nukleotidová sekvencia výsledného BSSL variantu („variant T“) je znázornená v zozname sekvencií ako SEQ ID č. 8. Aminokyselinová sekvencia variantu T je znázornená v zozname sekvencií SEQ ID č. 9.

Vďaka vysoko sa opakujúcej sekvencií exónu 11 ľudského BSSL génu sa môže predpokladať vysoký počet opakujúceho sa usporiadania, pokiaľ sa táto sekvencia klonuje do plazmidu a propaguje v baktériách. Na základe tohto predpokladu je žiaduci BSSL variant, ktorý obsahuje skrátený exón 11, ktorý sa identifikuje, izoluje a podrobí sekvenčnej analýze.

Iný plazmid, pS283, obsahujúci časť ľudskej BSSL cDNA klonovaný do plazmidu pUC19 v HindlII a Sací miestach sa použije na fúziu genómových sekvencií. Plazmid pS283 sa tiež použije, aby sa dosiahlo vlastné reštrikčné enzýmové miesto, KpnI, umiestnené v 5 netranslatovanej vedúcej sekvencií BSSL.

Plazmid, pS283 sa potom štiepi s Ncol a Sací a fragment asi 2,7 kb sa izoluje elektroforézou. Plazmid pS309 sa štiepi Ncol a BspEI a izoluje sa fragment približne 2,3 kb obsahujúci 5 -časť BSSL génu. Plazmid pS310 sa štiepi BspEI a Sací a izoluje sa fragment asi 2,7 kb obsahujúci časť strednej oblasti BSSL génu. Tieto tri fragmenty sa ligujú a transformujú do kompetentného E. coli kmeňa TG2 a transformanty sa izolujú ampicilinovou selekciou.

Plazmidy sa pripravia z mnohých transformantov a jeden plazmid, nazvaný pS312 (obr. 14), obsahujúci požadovaný konštrukt, sa použije pre ďalšie pokusy.

Na získanie modifikácie pS311, v ktorej je BamHI miesto lokalizované po smere stop kodónu, a konvertuje sa na Sali miesto na uľahčenie ďalšieho klonovania, s použitím nasledujúcej metódy. Plazmid pS311 sa linearizuje čiastočným BamHI štiepením. Linearizovaný fragment sa izoluje a jc inzerovaný syntetický DNA linker, ktorý konvertuje BamHI na Sali miesto (5 -GATCGTCGAC-3 ), čím sa rozruší BamHI miesto. Pretože sa tu vyskytujú dve potenciálne polohy pre integráciu syntetického linkeru, výsledné plazmidy sa analyzujú štiepením reštrikčným enzýmom. Plazmid s linkerom inzerovaným v požadovanej polohe po smere od exónu 11 sa izoluje a označí ako pS313.

Na získanie konečného konštruktu expresného vektora, ktorý nesie genómové štruktúry ľudského BSSL variantu, sa použije excitujúci expresný vektor pS314, ktorý bol zostavený na sprostredkovanie a tkanivovú špecifickú expresiu v bunkách mliečnej žľazy za laktačnej periódy. Plazmid pS314 obsahuje genómový fragment z génu myšacieho srvátkového kyslého proteínu (WAP) (Campbell a kol., 1984), klonovaný ako Nôti fragment.

Genómový fragment je približne 4,5 kb od smeru regulačných sekvencií (URS), celé štyri myšacie WAP exóny a celé intrónové sekvencie a asi 3 kb sekvencie po smere posledného exónu. Jedinečné KpnI miesto je umiestnené v prvom exóne 24 bp od prirodzeného WAP translačného iniciačného kodónu. Ďalšie jedinečné miesto pre reštrikčný enzým je Sali miesto, umiestnené v exóne 3.

Genómová sekvencia ľudského BSSL variantu sa inzeruje medzi tieto miesta, KpnI a Sali, s nasledujúcou stratégiou. Najskôr sa pS314 štiepi s KpnI a Sali a fragment predstavujúci štiepený plazmid sa elektroforeticky izoluje. Za druhé pS312 sa štiepi KpnI a BamHI a asi 4,7 kb fragment predstavujúci 5 - časť ľudského BSSL génu sa izoluje. Po tretie pS3413 sa štiepi s BamHI a Sali a 3 -časť ľudského BSSL génu sa izoluje. Tieto tretie fragmenty sa ligujú, transformujú do kompetentnej E. coli baktérie a transformanty sa izolujú po ampicilínovej selekcii.

Plazmidy sa pripravia z niekoľkých transformantov a starostlivo analyzujú mapovaním reštrikčnými enzýmami a sekvenčnou analýzou. Jeden plazmid, predstavujúci požadovaný expresný vektor, sa definuje a označí pS317 (obr. 15).

Na odstránenie prokaryotických plazmidových sekvencií sa pS317 štiepi s Notl. Rekombinantný vektorový element, obsahujúci myšaciu WAP sekvenciu, priliehajúcu ku genómovému fragmentu ľudského BSSL variantu, sa potom izoluje agarózovou elektroforézou. Izolovaný fragment sa ďalej čistí s použitím elektroelúcie pred tým, ako sa injekčné zavedie do myšacích embryí.

Rekombinantný gén pre expresiu ľudského BSSL variantu v mlieku z transgénnej myši je uvedený na obr. 16.

3.2 Generovanie transgénnych zvierat

Notl fragment sa izoluje z plazmidu pS317 podľa časti 3.1.. Tento DNA fragment obsahuje myšací WAP promótor napojený ku genómovej sekvencií, kódujúcej ľudskú BSSL variantu. Izolovaný fragment, v koncentrácii 3 ng/μΙ, sa injikuje do pronuclea 350 C57Bl/6JxCBA/2J-f₂ embryí získaných od myšacieho darcu primovaného 5 medzinárodnými jednotkami pregnantného sérového gonadotropínu kobyly pre superovuláciu. C57Bl/6JxCBA/2J-f| zvieratá boli získané od Bomholtg rd Breeding and Research Centre LTD, Ry, Dánsko. Po odobratí embryí z vajcovodu sa tieto oddelili od cumulus buniek spracovaním s hyaluronidázou v médiu M2 (Hogan a kol., 1986). Po premytí sa embryá transferujú na médium M16 (Hogan a kol., 1986) a udržujú v inkubátore s atmosférou obsahujúcou 5 % oxidu uhličitého. Injekcie sa uskutočnia v mikrokvapačke M2 pod ľahkým parafínovým olejom s použitím Narishigi hydraulických mikromanipulátorov a Nikon invertovaného mikroskopu vybaveného Nomarski optikou. Po injekcii sa zdravo vyzerajúce embryá implantujú do 12 pseudopregnantných príjemcov C57Bl/6JxCBA/2J-f₁ pomocou 0,37 ml a 2,5 % Avertínu intraperitoneálne. Myši, ktoré majú integrovaný transgén sa identifikujú PCR analýzou DNA zo vzoriek chvostovej biopsie získaných tri týždne po narodení zvierat. Pozitívne výsledky sú potvrdené analýzou Southemový prenos.

Na zachytenie mlieka sa taktujúce samice zvierat injikujú 2 medzinárodnými jednotkami oxytocínu intraperitoneálne a o 10 minút neskôr anestetizujú 0,40 ml 2,5 % Avertínu intraperitoneálne. Zariadenie na zber mlieka je pripojené ku struku silikonizovanou rúrkou a mlieko je zbierané do 1,5 ml Eppendorfovej skúmavky opatrným maskovaním mliečnej žľazy. Množstvo mlieka sa mení v závislosti odo dňa laktácie, medzi 0,1 a 0,5 ml na myš a zber.

3.3 Expresia BSSL variantu v transgénnej myši

Transgénna myš sa identifikuje analýzou DNA, ktorá bola pripravená z vyrezaných vzoriek chvosta. Vzorky tkaniva sa inkubujú s proteinázou K a extrahujú fenolom a chloroformom. Izolovaná DNA sa použije v reakciách polymerázovej výstavby reťazca s primérmi, ktoré amplifikujú špecifické fragmenty, ak je prítomná heterológna zavádzaná DNA, predstavujúca expresný vektorový fragment. Zvieratá sa tiež analyzujú DNA hybridizačnými experimentmi na potvrdenie PCR údajov a na test možných znova preskupení, štruktúru integrovaných vektorových elementov a na získanie informácie o počte kópií integrovaných vektorových elementov.

V jednom sete pokusov sa analyzuje 31 myší dvoma metódami a výsledky demonštrujú, že 1 myš nesie heterológny DNA vektorový element odvodený od pS452. Výsledok z PCR analýzy a hybridizačných experimentov je iden tický (obr. 17). Pri celkom 10 zo 65 testovaných zvierat je zistené, že sú transgénne pre pS317.

Myš identifikovaná ako nesúca vektorový DNA element (základné zviera,) bola potom spárená a F1 vrh sa analyzuje na transgén rovnakými postupmi.

RNA izolovaná z rôznych tkanív pS317 transgénnych samíc počas laktácie sa oddelí agarózo formaldehydovou gélovou elektroforézou, prenesie na membrány a hybridizuje s ³²P značenou BSSL cDNA ako skúšobnou vzorkou. Dosiahnuté výsledky ukazujú, že pri expresii nastáva reštrikcia na mliečnu žľazu počas laktácie (obr. 18).

Vzorky mlieka sa zachytávajú z anestetizovaných základných zvierat ošetrených oxytocínom na zavedenie laktácie a analyzujú na prítomnosť rekombinantného ľudského BSSL variantu. To sa uskutočňuje SDS-PAGE, transférom na nitrocelulózové membrány a inkubáciou s polygonálnymi protilátkami generovanými proti natívnej ľudskej BSSL. Získané výsledky demonštrujú expresiu rekombinantného ľudského BSSL variantu do mlieka transgénnej myši. Obr. 19 demonštruje prítomnosť rekombinantnej ľudskej BSSL variantu v mlieku transgénnej myši. SDS-PAGE separácia a imunoblotovanie vzoriek mlieka derivovaných z rôznych pS317 transgénnych myší ukazuje účinnosť produkcie rekombinantného variantu so zníženou zdanlivou molekulovou hmotnosťou v porovnaní s rekombinantnou BSSL s plnou dĺžkou derivovanou z mlieka myši transgénnej pre pS314. Plazmid pS314 je podobný ako pS317, s tým rozdielom, že pS314 obsahuje ľudskú BSSL cDNA namiesto genómového variantu. Dvojitý pás, ktorý je zrejmý pri všetkých vzorkách myšacieho mlieka, reprezentuje myšaciu BSSL a tak ukazuje krížovú reaktivitu antiséra. Tento záver je ďalej podporený pozorovaním, že tento dvojitý pás je zrejme v páse 9 z obr. 19, ktorý obsahuje čistú myšaciu BSSL.

Stabilné línie transgénnych zvierat sú generované.

Podobným spôsobom môžu byť pripravené iné transgénne zvieratá, ako sú králiky, kravy alebo ovce, schopné expresie ľudského BSSL variantu.

Uloženie

Nasledujúce plazmidy boli uložené podľa Budapeštianskej zmluvy pri DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen):

Plazmid číslo uloženia Dátum uloženia

pS309	DSM 7101
pS310	DSM 7102
pS311	DSM 7103	12. júna 1992
PS317	DSM 7104
pS147	DSM 7495
pS257	DSM 7496	26. februára 1993
pS299	DSM 7497
pS258	DSM 7501
pS259	DSM 7502	3. marca 1993

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1

A. Mapa vektora založeného na BPV, použitého na expresiu rôznych BSSL variantov.

B. Schematické znázornenie rôznych analyzovaných BSSL variantov. FL označuje BSSL s plnou dĺžkou. Aktív ne miesto je označené krúžkom a miesto na potenciálne viazanie N-pripojeného cukru je označené trojuholníkom. Oblasť obsahujúca opakujúce sa časti je označená ako prúžkovaná plocha a konzervovaný C-terminál ako plná plocha.

Obr. 2

Analýza Southemovým prenosom DNA z bunkovej línie exprimujúcej BSSL variant. Analyzuje sa DNA pripravená z bunkových línií exprimujúcich BSSL s plnou dĺžkou (FL), variant A (A), variant B (B), variant C (C) a variant N (N). Potom sa s BamHI štiepi 5 pg príslušne pripravenej DNA derivovaných buniek (vľavo) a 1 ng vektora derivovaného z čistených baktérií (vpravo). DNA vzorky sa oddelia na agorózovanom géli, transferujú na GeneScreen Plus membránu a hybridizujú s ³²P značenou BSSL cDNA.

Obr. 3

Analýza Northenovým prenosom RNA z izolovaných bunkových línií exprimujúcich rekombinantné BSSL varianty. Analyzuje sa 10 pg celkovej RNA pripravenej z bunkových línií produkujúcich BSSL s plnou dĺžkou (FL), variant A (A), variant B (B), variant C (C) a variant N (N). RNA z C127 bunkovej línie nesúcej BPV vektor identický k vektoru z obr. 1 s tým rozdielom, že kóduje proteín nepríbuzný BSSL, sa použije ako negatívna kontrola (-) (horná plocha). Filtre sa hybridizujú s ³²P značenou BSSL cDNA. Filter sa potom rehybridizuje s myšacou β-aktivovou cDNA ako skúšobnou vzorkou. Signály β-aktínu mR -NA (nižšia plocha) sa použijú ako vnútorná kontrola na množstvo RNA zachytené na každom páse.

Obr. 4

Expresia BSSL aktivity v C127 bunkách transfekovaných s plnou dĺžkou a mutovaných foriem ľudskej BSSL. C127 bunky sa transfekujú s rozdielnymi BSSL konštruktmi: BSSL s plnou dĺžkou (FL), variantom N (N), variantom C (C), variantom B (B) a variantom A (A). Po počiatočnej rastovej perióde jednotlivých klonov sa uskutoční selekcia a nechá sa rásť až do súvislého nárastu. Na obrázku je uvedený počet vybraných klonov (n). Aktivita lipázy sa dokladá na kondicionovanom médiu. Hodnoty sa vyjadrujú ako pmol uvoľňovanej voľnej mastnej kyseliny x min.^-1 x kondicionované médium¹.

Obr. 5

A. Analýza Westemovým prenosom rekombinantnej BSSL s plnou dĺžkou a mutovanej rekombinantnej BSSL. Množstvo lipázovej aktivity, vyjadrenie ako pmol uvoľňovanej mastnej kyseliny x min.'¹ aplikovanej na gél je: plná dĺžka 0,2 (pás 1), variant N 0,16 (pás 2), variant C (pás 3), variant B 0,8 (pás 4) a natívnej BSSL (pás 5). Použité antisérum sa odoberá od králika proti BSSL čistenej z ľudského mlieka. Poloha miesta markera (Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range, BioRad) je uvedená naľavo.

B. Analýza Westemovým prenosom N-glykozidázou F opracovaného variantu B. Variant B sa štiepi s N-glykozidázou F, ako je opísané v experimentálnych procedúrach. Pás 1 ukazuje neopracovaný a pás 2 opracovaný variant B.

Obr. 6

Žlčová soľ-dependentnej BSSL s plnou dĺžkou a mutovaná BSSL. Aktivita lipázy sa stanovuje v prítomnosti meniacej sa koncentrácie nátriumeholátu (plná čiara) alebo nátriumdeoxycholátu (čiarkovaná čiara) na kondicionovanom médiu z rekombinantnej BSSL s plnou dĺžkou (hviezdička), variant A (nevyfarbený štvorček), variant B (vyfarbený trojuholník), variant C (vyfarbený štvorček), variant N (vyfarbený krúžok) a čistená mliečna ľudská BSSL (nevyfarbený krúžok). Pre variant A sa kondiconované médium koncentruje na Blue Sephadose, ako je opísané v experimentálnych procedúrach. Množstvo príslušného zdroja enzýmu sa volí tak, aby sa dosiahla rovnaká úroveň maximálnej aktivity okrem prípadu variantu A, ktorý má maximálnu aktivitu vo výške iba jednej desatiny ostatných. Kontrolné experimenty ukazujú, že rastové médium neovplyvňuje úroveň aktivity.

Obr. 7

A. Analýza Northenovým prenosom BSSL produkovanej rôznymi kmeňmi E. coli s použitím pGEMEX. Baktérie sa zavádzajú pomocou IPTG, ako je opísané v experimentálnych procedúrach.

Experimentálne podmienky sú opísané v legende k obr. 2. Pás 1 je kmeň BL21(DE3)pLysS, neindukovaný, pás 2 je kmeň BL21(DE3)pLysS, indukovaný, pás 3 je kmeň JM109(DE3), neindukovaný a pás 4 je kmeň JM109(DE3), indukovaný.

B. Westemový prenos využívajúci protilátky k čistenej mliečnej BSSL, z 8 až 18 % SDS-PAGE ukazujúcej expresiu rekombinantnej BSSL v rôznych kmeňoch E. coli s použitím pGEMEX. Baktérie sa zavádzajú pomocou IPTG a cytoplazmové a periplazmové proteiny sa pripravia z lyzátu, ako je opísané v experimentálnych procedúrach. Množstvo bakteriálnych proteínov zachytených v pásoch 2 až 5 (periplazmové prípravky) a v pásmach 7 až 10 (cytoplazmové prípravky) predstavuje rovnaký objem kultúry vedúcej kmeň proporcionálne k produkčnej hladine. Pás 1 je marker molekulárnej veľkosti Pharmacia, pásy 2 a 8 sú kmeň JM109(DE3), indukovaný, pásy 3 a 7 sú kmeň JM109(DE3), neindukovaný, pásy 4 a 10 sú kmeň BL21(DE3)pLysS, indukované, pásy 5 a 9 sú kmeň BL21(DE3)pLysS, neindukovaný a pás 6 je 25 ng čistenej natívnej mliečnej BSSL.

Obr. 8

SDS-PAGE čistenej rekombinantnou BSSL a BSSL variantom. Rekombinantná BSSL s plnou dĺžkou (FL) a BSSL varianty N, B a C sa čistia ako je opísané. Aplikuje sa vždy 3 ug každej z týchto látok, s výnimkou variantu B, ktorého sa použije 1,5 pg. Čistená natívna mliečna BSSL (NAT) sa aplikuje v množstve 5 pg. Poloha miesta markera je uvedená vľavo.

Obr. 9

Účinok nátriumdeoxycholátu na aktiváciu rekombinantnej BSSL a na BSSL variant pôsobením nátriumcholátu. Vyčistené prípravky z rekombinantnej BSSL s plnou dĺžkou (vyfarbený krúžok), rekombinantného BSSL variantu B (nevyfarbený krúžok), C (vyfarbený štvorček), N (vyfarbený trojuholníček) a čistenej mliečnej ľudskej BSSL (nevyfarbený štvorček) sa skúšajú na aktivitu lipázy s rozdielnymi koncentráciami nátriumcholátu v neprítomnosti (ľavá plocha) a v prítomnosti 5 mM (stredná plocha) alebo 10 mM (pravá plocha) deoxycholátu.

Obr. 10

Stabilita rekombinantnej BSSL a BSSL variantov pri rozdielnych hodnotách pH. Natívna BSSL, rekombinantná BSSL s plnou dĺžkou a BSSL varianty sa inkubujú za teploty 37 °C v rozdielnych pufroch s hodnotami od 2 do 8. Všetky pufry obsahujú 1 mg/ml hovädzieho sérového al bumínu. Po 30 minútach sa odtiahnu alikvoty a skúšajú sa na aktivitu lipázy. Vysvetlenie symbolov je uvedené v legende k obr. 9.

Obr. 11

Tepelná stabilita rekombinantnej BSSL a BSSL variantov. Čistená mliečna BSSL s plnou dĺžkou, BSSL varianty a natívna mliečna BSSL sa inkubujú za uvedených teplôt v 50 mM Tris-Cl pufra, hodnota pH 7,5. K jednému setu vzoriek sa pridá 1 mg/ml hovädzieho sérového albumínu (BSA). Po 30 minútach sa odtiahnu alikvoty a skúšajú na aktivitu lipázy. Aktivita sa vyjadruje ako percento z aktivity pre každú vzorku v čase 0 minút. Vysvetlenie symbolov je uvedené v legende k obr. 9.

Obr. 12

Účinok žlčových kyselín na inaktiváciu rekombinantnej BSSL a BSSL variantov trypsínom. Čistená mliečna BSSL s plnou dĺžkou, BSSL varianty a natívna mliečna BSSL (15 μΐ s obsahom 1 až 4 pg) sa pridajú k 60 pl 1,0 M Tris-Cl, s hodnotou pH 7,4, s 10 pg trypsínu (TPCK-trypsín, Boehringer - Mannheim) za teploty 25 °C v neprítomnosti (čiarkovaná čiara) a v prítomnosti (plná čiara) 10 mM nátriumcholátu. V uvedených časoch sa odtiahnu alikvoty a skúšajú na aktivitu lipázy. Hodnoty sa vyjadrujú ako percentá z hodnoty dosiahnutej pri kontrolných inkubáciách v neprítomnosti trypsínu. Vysvetlenie symbolov je uvedené v legende k obr. 9.

Obr. 13

Metóda na produkciu plazmidu pS317. Podrobnejšie pozri časť 3.1.

Obr. 14

Schematická štruktúra plazmidu pS312.

Obr. 15

Schematická štruktúra plazmidu pS317.

Obr. 16

Fyzická mapa predstavujúca fyzické zavedenie ľudského BSSL variantu genómovej štruktúry do prvého exónu WAP génu, ako je opísané v časti 3.1.

Obr. 17

A. Schematické znázornenie lokalizácie PCR-primérov použitých na identifikáciu transgénnych zvierat. 5 -Primér je umiestnený vo WAP sekvencii začínajúc v polohe -148 bp proti fúzii medzi WAP a BSSL variantom. 3 -Primér je lokalizovaný v prvom BSSL variante intrónu, končiac 400 bp po smere od bodu fúzie.

B. Sekvencie použitých PCR primérov.

C. Agarózový gél predstavujúci typickú analýzu PCR analýzy potenciálne základných zvierat.

M: markery molekulovej hmotnosti.

Dráha 1: kontrolný PCR-produkt generovaný z plazmidu pS317.

Dráhy 2 až 13: PCR reakcia s DNA prípravkami z potenciálnych základných zvierat.

Obr. 18

Analýza Northenovým prenosom RNA pripravenej z rôznych tkanív izolovaných zo samičích myší transgénnych pre pS317. Tkanivá sa izolujú v deň 4 laktácie. 10 pg celkovej RNA z každého tkaniva sa analyzuje agarózo formaldchydovou separáciou, transferuje na membrány a hyb ridizuje s ³²P značenou BSSL cDNA. Dráhy zahŕňajú mliečnu žľazu (Mg), pečeň (Li), ľadviny (Ki), slezinu (Sp), srdce (He), pľúca (Lu), slinnú žľazu (Sg) a mozog (Br). RNA veľkosť v nukleotidoch je označená vľavo.

Obr. 19

Westemový prenos mlieka získaného z pS317 transgénnej myši, myšací transgénny pre vektor pS314 cDNA s plnou dĺžkou a kontrolné zvieratá. Vzorky sa oddelia z SDS-PAGE a transferujú na filtre Immobilon a imunoblokujú s antisérom dostávaným proti natívnej ľudskej BSSL. Dráha 1: markery molekulovej hmotnosti.

Dráhy 2, 3 a 4: 2 μΐ mliečnej vzorky od troch FI dcér (FI 30,31 a 33) pS317 základnej FO #91.

Dráha 5: 2 μΐ mliečnej vzorky od pS314 základnej #90. Dráhy 6, 7 a 8 : 2 μΐ mliečnej vzorky od troch ne-BSSL transgénnych zvierat.

Dráha 9: čistená myšacia BSSL.

Dráha 10: čistená ľudská natívna BSSL.

Literárne odkazy:

N. Abouakil, E. Rogalska a D. Lombardo, Biochim. Biophys. Acta, 1002. 225 - 230 (1989),

S. A. Atkinson, M. H. Bryan a G. H. Andersson, J. Pediatr., 99,617-624(1981),

F. M. Ausubel, R. Brent, R. E.Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (eds.) v Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, vydanie z roku 1992),

T. Baba, D. Downs, K. W. Jackson, J. Táng a C. S. Wang, Biochemistry, 30, 500 - 510 (1991),

S. Bembäck, L. Bläckberg a O. Hemell, J. Clin. Invest, 85, 1221 - 1226(1990),

B. Bjôrksten, L. G. Burman, P. deChateau, B. Fredrikzon,

L. Gothefors a O. Hemell, Br. Med. J., 201. 267 - 272 (1980),

L. Bläckberg a O. Hemell, Eur. J. Biochem., 116, 221 - 225 (1981),

L. Bläckberg a O. Hemell, FEBS Lett., 157, 337 - 341 (1983),

S. M. Campbell, J. M. Rosen, L. G. Hennighausen, U. Strech-Jurk a A. E. Sippel, Nucleic Acid Res., 12, 8685 - 8697 (1984),

J. E. Chappell, M. T. Clandinin, C. Keamey-Volpe, B. Reichman a P. W. Swyer, 108, 439 - 447 (1986),

R. Fontaine, C. Carter a D. Hui, Biochemistry, 30, 7008 -7014(1991),

F. L. Graham a A. J. Van der Eb, Virology, 52., 456 - 467 (1973),

M. Hamosh, L. M. Freed, C. M. York, J. A. Sturman a P. Hamosh, Fed. Proc, 45, 1452 (1986),

J. H. Han, C. Stratowa a W. J. Rutter, Biochemistry 26, 1617- 1625(1987),

L. Hennighausen, L. Ruiz a R. Wall, Current Opinion in Biotechnology, 1,74 - 78 (1990),

O. Hemell, Eur, J. Clin. Invest, 5, 267 - 272 (1975),

O. Hemell, L. Bläckberg a T. Lindberg v Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (vyd. E. Lebenthal), str. 209 - 217 (Raven Press, New York (1989)),

O. Hemell, J. E. Staggers a M. C. Carey, Biochemistry 29, 2041 -2056(1990),

O. Hemell a L. Bläckberg v Encyklopédia of human biology (vyd. R. Dulbecco), zv. 3, str. 47 - 56 (Academic Press, San Diego (1991)),

O. Hemell, L. Bläckberg, Q. Chen, B. Stemby a Ä. Nilsson, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. (1993) (v tlači),

B. Hogan, F. Constantini a E. Lacy, Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1986),

D. Hui a J. A. Kissel, FEBS Lett., 276, 131 - 134 (1990),

E. M. Kyger, R. C. Wiegand a L. G. Lange, Biochem. Biophys. Res. Commun., 164.1302 - 1309 (1989),

U. K. Laemmli, Náture (Londýn), 227, 680 - 685 (1970),

U. Lidberg, J. Nilsson, K. Strômberg, G. Stenman, P. Sahlin, S. G. Enerbäck a G. Bjursell, Genomics, 12, 630 - 640 (1992),

M. Lusky a M. R. Botchan, Celí, 36,391 - 401 (1984),

J. Nilsson, L. Bläckberg, P. Carlsson, S. Enerbäck, O. Hernell a G. Bjursell, Eur. J. Biochem., 192, 543 - 550 (1990), G. N. Pavlakis a D. H. Hamer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80.397-401 (1983),

K. Reue, J. Zambaux, H. Wong, G. Lee, T. H. Leete, M. Ronk, J. E. Shively, B. Stemby, B. Borgstrôm, D. Ameis a

M. C. Schotz, J. Lipid. Res., 12, 267 - 276 (1991),

N. Sarver, J. C. Byme a P. M. Howell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 29,7147-7151 (1982),

F. W. Studier a B. A. Moffat, J. Mol. Biol., 189. 113 - 130 (1986),

S. Williamson, E. Finucane, H. Ellis a H. R. Gamsu, Árch. Dis. Childhood, 52,555 - 563 (1978).

Zoznam sekvencií

1. Všeobecné informácie

i) Prihlasovateľ

a) Meno: AB ASTRA

b) Ulica: Kvambergagatan 16

c) Mesto: Sodertalje

e) Krajina: Švédsko

f) PSČ(ZIP): S-15185

g) Telefón: +46-8-553 260 00

h) Telefax: +46-8-553 288 20

i) Ďalekopis: 19237 astra s ii) Názov vynálezu: Nové polypeptidy iii) Počet sekvencií: 9 iv) Počítačová čítacia forma :

a) Typ média: Floppy disk

b) Počítač: IBM PC kompatibilný

c) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS

d) Softvér: Patentin Release # 1,0,

Verzia #1,25 (EPO) vi) Prioritné údaje prihlášky:

a) Číslo prihlášky: SE 9300686-4

b) Dátum podania: 1. marca 1993 vi) Prioritné údaje prihlášky:

a) Číslo prihlášky: SE 9300722-7

b) Dátum podania: 4. marca 199 3

2. Informácie o sekvencií ID č. 1:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) dĺžka: 2428 párov báz

b) Typ: nukleová kyselina

c) Reťazec: dvojitý

d) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA iii) Podmienenosť: nie iii) Proti zmyselnosti: nie iv) Zdroj pôvodu:

a) Organizmus: Homo sapiens

b) Typ tkaniva: mliečna žľaza ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: CDS

b) Lokácia: 82..2319

d) Ďalšie informácie: (produkt - „žlčové kyseliny stimulujúce lipázu“) ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: exon

b) Lokácia: 985..1173 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: exon

b) Lokácia: 1174..1377 ix) Rysy:

a) Meno kľúč: exon

b) Lokácia: 1378..1575 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: exon

b) Lokácia: 1576..2415 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: mat_peptid

b) Lokácia: 151..2316 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: polyA_signál

b) Lokácia: 2397..2402 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1756..2283 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: 5 UTR

b) Lokácia: L.81 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1756..1788 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1789..1821 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1822.. 1854 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1855..1887 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1888..1920 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1921..1953 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1954..1986 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1987..2019 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2020..2052 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2053..2085 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2086..2118 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť:

b) Lokácia: 2119..2151 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2152..2184 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2185..2217 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2218..2250 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2251..2283 xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 1:

ACCTTCTCTA TCAGTTAACT CTCAACATCC AACGAACAGC

AGTCTCAAGA TAATGCAAAG

AGTTTATTCA TCCACAGGCT C

ATG Met -21

CTC Leu

ACC Thr

ATG Met -20

GGC Gly

CGC Arg

CTC Leu

CAA Gin

CTC Leu 15

GTT Val

111

GTG

TTG

GGC

CTC

ACC

TGC

TGG

GCA

GTG

GCC

AGT

GCC

GCG

AAG

CTG

159

Val

Leu

Gly

Leu

Thr

cys

Trp

Ale

Val

Ala

Ser

Ala

Lys

Leu

-10

-5

1

GGC

GCC

GTG

TAC

ACA

GAA

GGT

GGG

TTC

GTG

GAA

GGC

GTC

AAT

AAG

207

Gly

ALa

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly

Phe

Val

Glu

Gly

Val

Asn

Lys

5

10

1S

CTC

GGC

CTC

CTG

CGT

GAC

TCT

GTG

GAC

ATC

TTC

AAC

GGC

ATC

CCC

TTC

255

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Ser

Val

Asp

íle

Phe

Lys

Gly

íle

Pro

Phe

20

25

3 0

35

CCA

GCT

CCC

ACC

AAG

GCC

CTG

GAA

ΑΛΤ

CCT

CAG

CCA

C AT

CCT

GGC

TGG

303

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Gin

Pro

Hi«

Pre

Cly

Trp

40

45

50

CAA

GGC

ACC

CTG

AAG

GCC

AAG

AAC

TTC

AAG

AGA

TGC

CTG

CAG

GCC

351

Gin

CXy

Thr

Leu

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

Cys

Leu

Gin

Ala

SS

60

65

ACC

ATC

ACC

CAG

GAC

AGC

ACC

TAC

GGG

GAT

GAA

GAC

TGC

CTG

TAC

CTC

399

Thr

íle

Thr

Gin

Asp

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

Leu

Tyr

Leu

70

75

80

AAC

ATT

TGG

GTG

CCC

CAG

GCC

ACG

AAG

CAA

GTC

TCC

CGG

GAC

CTG

CCC

447

Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

Asp

Leu

Pro

85

90

95

GTT

ATG

ATC

TGG

ATC

TAT

GGA

GGC

GCC

TTC

CTC

ATG

GGG

TCC

GGC

CAT

495

Val

Met

íle

Trp

1 le

Tyr

Cly

G ly

Ala

Phe

Leu

Mat

Gly

£er

Gly

His

100

10S

110

115

GGC

GCC

AAC

TTC

CTC

AAC

TAC

CTG

TAT

CAC

GGC

GAG

ATC

GCC

543

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Cly

Glu

íle

Ala

120

125

130

ACA

CGC

GGA

AAC

GTC

ATC

GTC

ACC

TTC

AAC

TAC

CGT

GTC

GGC

CCC

591

Thr

Ärg

Gly

Asn

Val

Íle

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

13S

140

14S

CTT CGG Leu Gly

TTC Phe 150

CTC Leu

AGC Ser

ACT Thr

GGG Gly

GAC Asp 155

GCC Ala

AÄT Asn

CTG Leu

CCA GGT

AAC Asr.

TAT Tyr

GGC Gly

63?

Pro

Ch v lbC

CTT

CGG

GAT

CAG

CAC

ATG

GCC

ATT

GCT

TGC

GTG

AAG

AAT

ATC

GCG

68'

Leu

Arg

Asp

Gin

His

Het

Ala

íle

Ala

Trp

Val

Lvs

Arg

Asn

íle

Ala

165

170

175

GCC

TTC

GGG

G.-.C

CCC

AAC

ÄTC

ACG

TTC

>

GCT

l 4. -

Ala

Pr.e

Giy

Gly

Asp

Pro

Asr.

Asn

T i A

Th ^v

Leu

Phe

Gly

Git

Ser

Ala

180

185

190

195

GGA

GGT

GCC

AGC

GTC

TCT

CTG

CAG

ACC

CTC

TCC

CCC

TAC

AAC

AAG

GGC

7S 5

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

Asr.

Lys

Gly

200

20S

210

CTC

ÄTC

CGG

CGA

GCC

ATC

AGC

CAG

AGC

GGC

GTG

GCC

CTG

AGT

CCC

TGG

831

Leu

íle

Arg

Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Pro

Trp

215

220

22$

GTC

ÄTC

CAG

AAA

AÄC

CCA

CTC

TTC

TGG

GCC

AAA

AAG

CTG

GCT

GAG

AAG

87 9

Val

Íle

Gin

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Val

Ala

Glu

Lys

230

235

240

GTG

GGT

TGC

CCT

CTC

GGT

GAT

GCC

AGG

ATG

GCC

CAG

TGT

CTG

AAG

927

Val

Clv

Cys

Pro

val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Cln

Cys

Leu

Lys

245

250

2SS

GTT

ACT

GAT

CCC

CGA

GCC

CTG

ACG

CTG

GCC

TAT

AAG

GTG

CCG

CTG

GCA

975

Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

Pro

Leu

Ala

260

265

270

275

GGC

CTG

GAG

TAC

CCC

ATG

CTG

CAC

TAT

GTG

GGC

TTC

GTC

CCT

CTC

ATT

1023

Cly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Phe

Val

Pro

Val

íle

280

285

290

GAT

GGA

GAC

TTC

ATC

CCC

GCT

GAC

CCG

ATC

AAC

CTG

TAC

GCC

AAC

GCC

1071

Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ala

295

300

305

GCC

GAC

ATC

GAC

TAT

ATA

GCA

GGC

ACC

AAC

ATG

GAC

GGC

CAC

ATC

1119

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

Gly

His

íle

310

315

320

TTC

GCC

AGC

ATC

GAC

ATG

CCT

GCC

ATC

AAC

AAG

GGC

AÄC

ÄAG

AAA

GTC

1167

Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

Lys

Val

325

330

335

ACG

GAG

GAC

TTC

TAC

AAG

CTG

GTC

AGT

GAG

TTC

ÄCA

ATC

ACC

AAG

1215

Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

íle

Thr

Lys

340

345

350

355

GGG

CTC

AGA

GGC

GCC

AAG

ACG

ACC

TTT

GAT

GTC

TAC

ACC

GAG

TCC

TGG

1263

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

Glu

Ser

Trp

360

365

370

GCC

CAG

GAC

CCA

TCC

CAG

GAG

ÄAT

AAG

ACT

GTG

GAC

TTT

1311

Ala

Gin

Asp

Pro

Ser

Gin

Glu

Asn

Lys

Thr

Val

Asp

Phe

375

380

385

GAG

ACC

GAT

GTC

CTC

TTC

CTG

GTG

CCC

ACC

GAG

ATT

GCC

CTÄ

GCC

CAG

1359

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

Leu

Ala

Gin

390

39S

400

CAC

AGA

GCC

AÄT

GCC

ÄAG

AGT

GCC

AAG

ACC

TAC

GCC

TAC

CTG

TTT

TCC

1407

His

Arg

Ala

Asn

Ala

Lys

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Phe

Ser

405

410

415

C AT H L Ľ 420

CCC Pro

TCT CCG ATG

CCC Pro 42S

GTC V a 1

1 ML T’/r

CCC AAA

1 Trp 4 10

GTG V a 1

GGG Gly

GCC A1 a

GAC Asp

CAT His 4 3 5

1455

Ser

Arg Met

Pro

U/³

GCA

G AT

GAC

ATT

CAG

TAC

GTT

TTC

GGG

AAG

CCC

TTC

GCC

ACC

CCC

ACG

1503

Ala

Asp

íle

Gin

Tyr

Val

Phe

Gly

Lvs

Pro

Phe

Ala

Thr

Pro

Thr

440

445

4 50

GGC

TAC

CCC

C AA

GAC

X *· “» Λ «·**·/

ACA

GTT

TCT

rev-'

GCu

ATG

ATC

r'-'f'

TAC

1551

Gly

Tyr

Arg

Pro

Cir

Asp

/\Γ c

Thr

Ta 1

Ser

Lys

Ala

Me:

íle

Ala

T,'r

4 5í

4 δΰ

465

TGG

ACC

AAC

CCC

AAA

ACA

OGG

GAC

CCC

AAC

ATG

GGC

GAC

TCG

GCT

1599

Trp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

Asp

Ser

Ala

470

475

480

GTG

CCC

ACA

CÄC

TCG

GÄA

CCC

TAC

s Ä 4

ACG

GAA

AAC

AGC

GGC

TAC

CTG

1647

Val

Pro

Thr

Hís

Trp

Glu

Pro

* /*

Thr

Clu

Asn

Ser

Gly

Tyr

Leu

485

490

495

GAG

ATC

ACC

ÄAC

AAG

ATC

GGC

AGC

TCC

ATG

AAG

CGG

AGC

CTG

AGA

1695

Clu

íle

Thr

Lys

Met

Cly

Ser

Met

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg

500

505

510

515

ÄCC

ÄAC

TTC

CTG

CGC

TAC

TGG

ACC

CTC

ACC

TAT

CTG

CCG

CTG

CCC

ACA

1743

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro

Thr

520

525

530

GTG

ACC

GAC

CAG

GAG

GCC

ACC

CCT

GTG

CCC

ACA

GGG

GAC

TCC

GAG

1791

Val

Thr

Asp

Gin

Clu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

535

540

545

GCC

ACT

CCC

GTG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

1839

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

550

555

560

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

1887

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

56S

57 C

575

GGG

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

1935

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

580

58 S

590

595

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

1983

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

600

605

610

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

2031

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

615

620

625

GTG

CCG

CCC

ACC

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

2079

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

630

635

640

GAC

GCC

GGG

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

2127

Asp

Ala

Gly

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

645

650

65S

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

ACC

CCC

ACG

2175

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Thr

Pro

Thr

660

665

670

675

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

2223

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

£80

685

690

Pro

CC? Pro

GTC Vil

CCC CCC

ACG Thr

GCT CAC

TCT Ser 900

GAG GCT GCC

CCT GTG CCC CCC 2291

Pro 695

Pro

Gly

Asp

Glu

Ala

Pro

Vôl 705

Pro

M

CAT

CAC

TCC

GAA

GCT

CÄG

ATC

CCT

CCA

CTC

ATT

AGG

TTT

TACCGTCCCA 2 3 2 S

Thr

Asp

Ser

Lys

Glu

Al a

Gin

Het

Pro

Ala

Val

Ile

Arg

Phe

9 1 0

715

920

CGCCTCCCCT CCCATCTTGÄ

3 S ó

GCTCTTCCTC ÄATAAäGCCT CATACCCC7Ä ΑΛΑΑΑΑΆΆΛΑ AA

242δ

2. Informácia pre SEQ ID č. 2:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 745 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

d) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 2:

Met Leu Thr Met

Gly

Arg

Leu

Gin

Leu Val Val Leu Gly Leu

Thr

Cys

-23

-20

-15

-10

Cys

Trp

Ala

Val

Ala

Ser

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Glu

-5

1

5

Gly

Phe

Val

Glu

Gly

Val

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

10

15

20

25

Ser

Val

Asp

Ile

Phe

Lys

Gly

Ile

Pro

Phe

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

30

35

40

Leu

Glu

Asn

Pro

Gin

Pro

His

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

45

SO

55

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

Cys

Leu

Gin

Ala

Thr

Ile

Thr

Gin

Asp

Ser

60

65

70

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ile

Trp

Val

Pro

Gin

7S

80

85

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

Asp

Leu

Pro

Val

Met

íle

Trp

Ile

Tyr

90

95

100

105

Gly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

Ser

Gly

His

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

110

115

120

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Gly

Glu

Clu

Ile

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn

Val

Ile

125

130

135

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

140

145

150

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

Asn

Tyr

Gly

Leu

Arg

Asp

Gin

His

Met

1SS

160

165

Ala

Ile

Ala

Trp

Val

Lys

Arg

Asn

Ile

Ala

Phe

Gly

Asp

Pro

17 0

17S

180

185

Asn

Ile

Thr

Leu

Phe

Gly

Glu

Ser

Ala

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

190

195

200

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

Asn

Lys

Gly

Leu

Ile

Arg

Ala

Ile

205 210 215

SK 285420 Β6

Ser

Gin

Ser 220

Gly

Val

Ala

Leu

Ser 22$

Pro

Trp

Va I

íle

Cln 230

Lys

As n

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

L y s

Val

Ala

C! c

Ly s

V a 1

Glv

Cys

Pro

V a ί

Gly

235

2 4 0

245

Asp

Ala

Ara

Met

Ara

Gin

Cys

Leu

Lys

7a 1

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

250

255

2-e

255

Leu

Thr

Leu

Ala

T.· r

Ly s

Val

pro

Leu

Ala

•-j 1 V

Leu

Glu

T/r

Pro

Met

270

27>

230

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Phe

Val

Pro

Val

íle

Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro

285

290

295

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

300

30$

310

Ala

Glv

Thr

Asn

Met

Asp

Gly

His

íle

Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

315

320

325

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

Lys

Val

Thr

Glu

Clu

Asp

Phe

Tyr

330

335

340

345

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

íle

Thr

Lvs

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

350

3 55

360

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

Glu

Ser

Trp

Ala

Gin

Asp

Pro

Ser

Gin

365

370

375

Glu

Asn

Lys

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phe

380

385

390

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

Leu

Ala

Gin

His

Ara

Ala

Asn

Ala

Lys

395

400

405

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

Arg

Met

Pro

410

415

420

425

Val

Ty r

Pro

Lys

Trp

Val

Gly

Ala

Asp

His

Ala

Asp

íle

Gin

Tyr

430

435

440

Val

Phe

Gly

Lvs

Pro

Phe

Ala

Thr

Pro

Thr

Gly

Tyr

Arg

Pro

Gin

Asp

445

450

455

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

íle

Ala

Tyr

Trp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

460

465

470

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

Asp

Ser

Ala

Val

Pro

Thr

His

Trp

Glu

475

480

485

Pro

Tyr

Thr

Glu

Asn

Ser

Gly

Tyr

Leu

Glu

íle

Thr

Lys

Met

490

495

500

505

Gly

Ser

Met

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg

Tyr

510

515

S20

Trp

Thr

Leu

Thr

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro

Thr

Val

Thr

Asp

Gin

Glu

Ala

S25

530

S35

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

540

545

550

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

555

560

565

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

570 $75 580 58S

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser Gly 590

Ala

Pro

Val 595

Pro

Thr

Gly

Asp 600

Set

Gly

Aia

Pro

V A ¹

Pro

Thr

Gly

Asp

Se r

Gly

Ala

Pro

Va 1

605

610

615

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Giy

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

620

625

630

Ser

Giy

Ala

Pro

VaL

Pro

Thr

Giy

Asp

Ala

ciy

Pro

?rc

635

640

645

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

650

6SS

660

665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

67 0

675

680

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

685

690

695

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Asp

Aso

Ser

Lys

Glu

700

7 05

710

Ala

Gin

Met

Pro

Ala

Val

íle

Arg

Phe

715

720

2. Informácia pre SEQID č. 3:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 722 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina d) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín iii) Podmienenosť: nie i v) Zdroj pôvodu:

a) Organizmus: Homo sapiens f) Typ tkaniva: mliečna žľaza xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 3:

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly

Phe

Val

Glu

Gly

Val

1

5

10

15

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Ser

Val

Asp

íle

Phe

Lys

Gly

20

25

30

íle

Pro

Phe

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Clu

Asn

Pro

Gin

Pro

His

35

40

45

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

Cys

50

55

60

Leu

Gin

Ala

Thr

íle

Thr

Gin

Asp

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

6S

70

75

80

Leu

Tyr

Leu

Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

85

90

95

Asp

Leu

Pro

Val

Met

íle

Trp

íle

Tyr

Gly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

100

105

110

Ser

Gly

His Gly 115

Ala

Asn

Phe

Leu Asn 7 Λ *

Asn T/r

Leu

T.'ľ 12$

Asp

Gly

Glu

G1 u

I ie

m , Λ á Γ» ľ

Arg

Gly

Asr.

V a 1

11 e

f

V a 1

Thr

Phe

Asr,

'Ts.

Ar;

1 3 ύ

135

140

Va 1

Gly

Le'j

Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

Giy

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

145

150

155

1 ŕ I-

Asn

T.'r

CI'J Lvu

Arg

Asp

Gin

His

Met

Ala

íle

Ala

Trp

Val

Lvs

Are

165

170

175

Asn

íle

Ai& Alä

Phe

Giy

Gly

Asp

Pro

Asn

íle

Thr

Leu

Phe

Gly

180

18S

190

Glu

Ser

Ala Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

195

200

20S

Asn

Lys

Gly Leu

íle

Arg

Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Trp Val

íle

Gin

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Val

225

230

235

240

Ala

Glu

Lys Val

Gly

Cys

Pro

Val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Gin

245

250

255

Cys

Leu

Lvs Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

260

265

27 0

Pro

Leu

Ala Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Pne

Val

275

280

285

Pro

Val

íle Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

Ala

Asn

Ala Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

305

310

315

320

Gly

His

Íle Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

325

330

335

Lys

Val Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

340

345

350

íle

Thr

Lvs Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

355

360

365

Glu

Ser

Trp Ala

Gin

Asp

Pro

Ser

Gin

Glu

Asn

Lys

Thr

Val

370

375

380

Val

Asp

Phe Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

385

390

395

400

Leu

Ala

Gin His

Arg

Ala

Asn

Ala

Lvs

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

40S

410

415

Leu

Phe

Ser His

Pro

Ser

Arg

Met

Pro

Val

Tyr

Pro

Lys

Trp

Val

Gly

420

425

430

Ala

Asp

His Ala

Asp

íle

Gin

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

435

440

445

Thr

Pro

Thr Gly

Tyr

Arg

Pro

Gin

Asp

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

450

455

460

íle

Ala

Tyr Trp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

455

470

475

480

Asp Ser ALa

Val

Pro 485

Thr

His

Trp

Glu

Pro 490

Ty r

Thr

Glu

Asn 495

Ser

Gly

T/r

Leu

Glu

I le

Thr

LV S

Lys

Gly

Ser

Met

Ly s

Arg

500

505

510

Ser

Leu

Aro

Thr

Asn

Phe

Leu

Ara

Τ’/r

Trp

Thr

Leu

Thr

T-yr

Leu

Λ A A

515

52Ó

= 25

Leu

Pro

Thr

Val

'T'f· v

Asp

Gin

G lu

zn j. A

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

SJ - '·*

530

535

540

Asp

Ser

Clu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

545

550

555

560

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

565

570

575

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

580

585

590

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

595

600

605

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

610

61S

620

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

625

630

635

640

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala

Gly

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

645

650

655

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

660

665

670

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

67 5

680

6Θ5

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Pro

690

695

700

Val

Pro

Thr

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin

Met

Pro

Ala

Val

Ile

705

710

715

720

Arg Phe

2. Informácia pre SEQ ID č. 4:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) dĺžka: 535 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

d) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín iii) Podmienenosť: nie iv) Zdroj pôvodu:

a) Organizmus: Homo sapiens

f) Typ tkaniva: mliečna žľaza ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: peptid

b) Lokácia: 1..535

d) Ďalšia informácia: (značenie = Variant A) xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 4:

Ala Lys 1

Leu Gly

A1 ä ς

V a 1

. w 1 V Λ.

Thr

Glu

GJy lv

Gly

Phe

Val Glu

Gly 1 5

V a i

Asn

Lys

Lvs Leu

Gly

Leu

G’y

Aso

Ser

Val

Asp

11 e

Phe

Lys

Gly

20

2 5'

30

íle

Pro

Phe Ala

Ala

Pro

Tn *

Ly s

ΓΛ 1 Ô

Leu

Giu

ÄGG

Pro

U - r.

Pre

His

3S

4 C¹

45

Pro

Gly

Trp Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

cys

50

5S

60

Leu

Gin

Ala Thr

íle

Thr

Gin

Asp

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

65

70

75

80

Leu

Tyr

Leu Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

85

90

95

Asp

Leu

Pro Val

Het

íle

Trp

íle

Tyr

Gly

Ala

phe

Leu

Met

Gly

100

105

11-

Ser

Gly

His Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

Tyr

Leu

Tur

Asp

Gly

Glu

115

120

125

Glu

íle

Ala Thr

Arg

Gly

Asn

Val

íle

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

130

135

140

Val

Gly

Pro Leu

Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

145

150

155

160

Asn

Tyr

Gly L-eu

Arg

Asp

Gin

His

Met

Ala

íle

Ala

Trp

Val

Lys

Arg

165

170

175

Asn

íle

Ala Ala

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

íle

Thr

Leu

Fhe

Gly

180

185

19C

Glu

Ser

Ala Glv

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

195

200

205

Asn

Lys

Gly Leu

íle

Arg

Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Trp Val

íle

Gin

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Val

225

230

235

240

Ala

Glu

Lys Val

Gly

Cys

Pro

Val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Gin

245

250

255

Cys

Leu

Lys Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

260

265

27 0

Pro

Leu

Ala Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Phe

Val

2*7 5

280

285

Pro

Val

íle Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

Ala

Asn

Ala Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

305

310

315

320

Gly

His

íle Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

325

330

33S

Lys

Val Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

340 345 3522

I L e

Thr

Lys 355

Gly

Leu

A ľ* o C i'/

A1 a 360

Lys

Thr

Phe

Asp 365

Val

Tyr

Thr

G L u

Ser

Trp

Ala

Gin

.-.sp

Pre

Ser

Gin

Glu

Asn

Lys

Thr

Val

370

37$

3 60

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

ÄSD

Val

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

385

3 90

395

4CC

Leu

Ala

Gin

His

Ara

Ala

Asn

Ala

Lys

Ser

Ala

Lys

Tn **

Ty r

Ala

Tyr

405

410

415

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

Arg

Met

Pro

Val

Tyr

Pro

Lys

Trp

Val

Gly

420

42$

430

Al a

Asp

His

Ala

Asp

íle

Gin

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

435

440

445

Thr

Pro

Thr

Gly

Ty r

Arg

Pro

Gin

Asp

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

450

455

460

íle

Ala

Ty r

Trp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

46$

470

475

480

Asp

Ser

Ala

Val

Pro

Thr

His

Trp

Glu

Pro

Tyr

Thr

Glu

Asn

Ser

485

490

495

Gly

Tyr

Leu

Glu

íle

Thr

Lys

Met

Gly

Ser

Het

Lys

Arg

500

505

510

Ser

Leu

Arg

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr

Tyr

Leu

Ala

515

520

52S

Leu

Pro

Thr

Val

Thr

Asp

Gin

530 535

2. Informácia pre SEQID č. 5:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) dĺžka: 546 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

d) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín iii) Podmienenosť: nie i v) Zdroj pôvodu:

a) Organizmus: Homo sapiens

f) Typ tkaniva: mliečna žľaza ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: peptid

b) Lokácia: 1 ..546

d) Ďalšia informácia: (značenie = Variant B) xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 5:

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly

Phe

Val

Glu

Gly

Val

1

5

10

15

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Ser

Val

Asp

íle

Phe

Lys

Gly

20

25

30

íle

Pro

Phe

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Gin

Pro

His

35

40

45

Pro Gly 50

Trp

Glr, Gly Thr

Leu 55

Lys

Ala

Lys Asn

Pha Lys 60

Lys Arg Cys

Leu C1 r.

Ala

Thr Iie

Thr

Gin

Aso

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

•j *u

Asp

Cys

65

70

75

8 C

Leu Tyr

Leu

Asn íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

$5

90

95

Asp Leu

Pro

Val Met

I le

--r¹

ϊ le

Tv r

Gly

m ä

Pr.e

Leu

Met

G Í y

100

105

110

Ser Gly

His

Gly Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Gly

Glu

115

120

125

Glu íle

Ala

Thr Arg

Gly

Asn

Val

íle

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

130

135

140

Val Gly

Pro

Leu Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

145

150

155

160

Asn Τ'/r

Gly

Leu Arg

Asp

Gin

His

Met

Ala

íle

Ala

Trp

Val

Lys

Arg

165

170

175

Asn íle

Ala

Ala Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

íle

Thr

Leu

Phe

Gly

180

185

190

Glu Ser

Ala

Gly Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

xyr

195

200

205

Asn Lys

Gly

Leu Xle

Arg

Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

210

215

220

Ser Pro

Trp

Val íle

Gin

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Val

225

230

235

240

Ala Glu

Lys

Val Gly

Cys

Pro

Val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Gin

245

250

255

Cys Leu

Lys

Val Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

260

265

270

Pro Leu

Ala

Gly Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

Leu.

His

Tyr

Val

Gly

Phe

Val

275

280

285

Pro Val

íle

Asp Gly

Asp

Phe

íle

Pro

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

SK 285420 Β6

Ala

Asn

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

305

310

315

320

Gly

His

íle

Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

325

330

335

Lys

Val

Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

340

345

350

íle

Thr

Lys

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

ThT

355

360

365

Glu

Ser

Trp

Ala

Gin

Asp

Pro

Ser

Gin

Glu

Asn

Lys

Lvs

Lys

Thr

Val

370

375

380

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

385

390

395

400

Leu

Ala

Gin

His

Arg

Ala

Asn

Ala

Lys

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

405

410

415

Leu

Pne

Ser

His 420

Pro

Ser

Arg Met

Pro 425

Va i

Τ'/r

Pro

Lys

Trp 43 C

Val

Gly

λ 1 a

Asp

His

Älä

Asp

Iie

Gin

rrv . v

Val

Phe

Gly

Lvs

Pro

Phe

Ala

435

440

445

Thr

Pro

Thr

Gly

. v

Arg

Pro

Gin

Asp

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

450

455

460

lie

Ä . ä

Ty r

Thr

Asr.

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asr.

Met

G! V

465

47 0

475

4 80'

Asp

Ser

Al a

val

Pro

Thr

His

Trp

Glu

Pre

Tyr

Thr

Glu

Asn

Ser

485

490

495

Gly

Tyr

Leu

Glu

Íle

Thr

Lys

Met

Gly

Ser

Met

Lys

Arg

500

505

510

Ser

Leu

Arg

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr

Tý'r

Leu

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Thr

Val

Thr

Asp

Gin

Lys

Glu

Ala

Gin

Met

Pro

Ala

Val

íle

530

535

540

Arg Phe

545

2. Informácia pre SEQ ID č. 6:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) dĺžka: 568 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

a) Organizmus: Homo sapiens

f) Typ tkaniva: mliečna žľaza ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: peptid

b) Lokácia: 1..568

d) Ďalšia informácia: (značenie = Variant C) xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 6:

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Glu

Cly

Gly

Phe

Val

Glu

Gly

Val

1

S

10

1S

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Ser

Val

Asp

Íle

Phe

Lys

Gly

20

25

30

íle

Pro

Phe

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Gin

Pro

His

35

40

45

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

Cys

50

55

60

Leu

Gin

Ala

Thr

íle

Thr

Gin

Asp

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

65

70

75

80

Leu

Tyr

Leu

Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

85

90

95

Asp

Leu

Pro

V Λ 1 10 0

Het

I i e

Trp íle

Tyr Glv Gly 105

Ala

Phe b;

Met Cly

Ser

Cly

His

C1 y

Ala

A S l'l

Ph<? Leu

Asr.

Asn

Ty r

Leu

T·.·:·

A S

C1

Clu

115

120

125

Ghu

Iie

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn Val

íle

Val

7a i

Thr

Phe

As.-.

Tyr

Arg

130

13í

u:

Vil

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe

Leu Ser

Ti-.r

Gly

Asp

Ala

Asr.

Leu

Pre

Cly

145

150

155

160

Asn

Tyr

Gly

Leu

Arg

Asp

Gin His

Met

Ala

íle

Ala

Trp

Val

Lys

Arg

165

170

175

Asn

íle

Ala

Phe

Gly

Gly Asp

Pro

Asn

íle

Thr

Leu

Phe

Gly

130

ies

190

Glu

Ser

Ala

Gly

Cly

Ala

Ser Val

Ser

Leu

Cln

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

195

200

205

Asn

Lys

Gly

Leu

íle

Arg

Arg Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Trp

Val

íle

Cln

Lys Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lvs

Lys

Val

225

23C

235

240

Ala

Glu

Lys

Val

Glv

Cys

Pro Val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Gin

24Š

250

2S5

Cys

Leu

Lys

Val

Thr

Asp

Pro Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

260

265

270

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Tyr Pro

Met

Leu

His

Tyr

Val

Cly

Phe

Val

275

280

285

Pro

Val

íle

Asp

Cly

Asp

Phe íle

Pro

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

Ala

Asn

Ala

Asp

íle

Asp Tyr

íle

Ala

Clv

Thr

Asn

Met

Asp

305

310

315

320

Gly

His

íle

Phe

Ala

Ser

íle Asp

Met

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

325

330

33 5

Lys

Val

Thr

Clu

Asp Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Clu

Phe

Thr

340

345

350

íle

Thr

Lys

Cly

Leu

Arg

Gly Ala

Lys

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

355

360

365

Glu

Ser

Trp

Ala

Gin

Asp

Pro Ser

Gin

Glu

Asn

Lvs

Lys

Thr

Val

370

375

380

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp

Val Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

385

390

395

400

Leu

Ala

Gin

His

Arg

Ala

Asn Ala

Lys

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

405

410

415

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

Arg Met

Pro

Val

Tyr

Pro

Lys

Trp

Val

Gly

420

425

430

Ala

Asp

His

Ala

Asp

íle Gin

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

435

440

445

Thr

Pro

Thr

Cly Tyr

Arg

Pro Gin

Asp

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

450 455 460

Ile 46$

Ala

Tyr

Trp Thr

Asn 470

Phe

Ala Lys

Thr Gly 475

Asp

Pro

Asn

Het

Gly 480

Asp

Ser

Ala

Vi 1

Pro

Thr

His

Trp

O l u

Pro

Thr

Glu

Asn

Ser

46$

490

495

Gly

Tyr

Leu

Clu

Ile

Thr

Lys

M.* t

Gly

Ser

Het

Lys

Arg

500

505

51 ľ

Ser

Leu

Ara

Thr

Asn

Phe

Leu

Ara

TV . ·

Trp

Thr

Leu

Thr

•Tx ,

Leu

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Thr

Val

Thr

Asp

Gin

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

530

535

540

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

545

550

555

560

Gin

Met

Pro

Ala

Val

Ile

Arg

Phe

565

2. Informácia pre SEQ ID č. 7:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 722 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

a) Organizmus: Homo sapiens

f) Typ tkaniva: mliečna žľaza ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: peptid

b) Lokácia: 1..722

d) Ďalšie informácie: (značenie = Variant N) xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 7:

Ala 1

Lys

Leu

Glv Ala Val 5

Tyr

Thr Glu Gly Gly 10

Phe

Val

Glu

Gly 15

Val

Asn

Lys

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Ser

Val

Asp

Ile

Phe

Lys

Gly

20

25

30

Ile

Pro

Phe

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro Gin

Pro

His

35

40

45

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

Cys

50

55

60

i Léu

Gin

Ala

Thr

Ile

Thr

Gin

Asp

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

65

70

75

80

Leu

Tyr

Leu

Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

85

90

95

Asp

Leu

Pro

Val

Met

Ile

Trp

Ile

Tyr

Gly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

100

105

110

Ser

Gly

His

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Gly

Glu

115

120

125

Glu

1 Le

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn

Val

Ile

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

130

135

140

Val

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe

Leu

íer

Thr

C Jy

Asp

Asn

Leu

F ro

Gly

145

150

155

160

Asn

Tyr

Gly

Leu

Arg

Asp

Gin

His

Met

Ala

Ile

Ala

Trp

Val

Lys

Arg

165

170

17$

SK 285420 Β6

A s r.

i i -

Ala

Ala 180

Phe

Gly

Asp

f y läS

Asr.

Gin

- - e

Thr

LéU 190

Pne

Gly

Glu

Ser

Ala

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pre

Ty r

19 5

200

205

Asn

Lys

Gly

Leu

Ile

Arg

Ala

Ile

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Trp

Val

Ile

Gin

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Val

22S

230

235

240

Ala

Glu

Lys

Val

Glv

Cys

Pro

Val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Cln

245

2S0

255

Cys

Leu

Lys

Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

260

265

270

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Het

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Phe

Val

275

280

285

Pro

Val

Ile

Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro

Ala

Asp

Pro

Ile

Asn

Leu

Tyr

250

295

300

Ala

Asn

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

Ile

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

305

310

315

320

Gly

His

I le

Phe

Ala

Ser

Ile

Asp

Met

Pro

Ala

Ile

Asn

Lys

Glv

Asn

32S

330

335

Lys

Val

Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Clu

Phe

Thr

340

345

350

Ile

Thr

Lys

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

355

360

365

Glu

Ser

Trp Ala

Gin

Asp Pro

Ser

Gin

Glu

Asn

Lys

Thr

Val

370

375

380

Val

Asp

Phe Clu

Thr

Asp Val

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

Ile

Ala

385

390

395

400

Leu

Ala

Gin His

Arg

Ala Asn

Ala

Lys

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

405

410

415

Leu

Phe

Ser His

Pro

Ser Arg

Met

Pro

Val

Tyr

Pro

Lys

Trp

Val

Gly

420

425

430

Ala

Asp

His Ala

Asp

Asp Ile

Gin

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

435

440

445

Thr

Pro

Thr Gly

Tyr

Arg Pro

Gin

Asp

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

450

455

460

Ile

Ala

Tyr Trp

Thr

Asn Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

465

47 0

475

480

Asp

Ser

Ala Val

Pro

Thr His

Trp

Clu

Pro

Tyr

Thr

Glu

Asn

Ser

485

490

495

Gly

Tyr

Leu Glu

Ile

Thr Lys

Lys

Met

Giy

Ser

Met

Lys

Arg

so c-

505

510

Ser

Leu

Ara Thr

nS Fi

Phe Leu

Ara

T·..’ r

Trp

Thr

Leu

<Tu

Leu

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Thr Val

Thr

Asn Gin

Glu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

530

535

54 0

Asp 545

Ser

Clu

A L 3

i nr

Pro 550

• i/

Pre

Pro

·”·’’

v 555

Asp

Ser

T.-.r

AU 560

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Va'

Pro

Thr

S65

570

575

Gly

Asp

Ser

Glv

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

530

585

590

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

AU

Pro

Val

Pro

595

600

605

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

610

615

620

Αΐά

Pro

Val

Pro

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

625

630

635

640

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala

Gly

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

645

650

655

Gly

Ala

Pro

val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

660

665

670

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Clu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Pre

Thr

Gly

Asp

67 5

680

685

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Glv

Asp

Ser

Glu

Ala

AU

Pro

690

695

700

Val

Pro

ΤΪΊΓ

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin

Met

Pro

Ala

Val

íle

705

710

715

720

Arg Phe

2. Informácia pre SEQ ID č. 8:

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 2184 párov báz

b) Typ: nukleová kyselina

c) Reťazec: dvojitý

d) Topológia: lineárna ii) Typ molekuly: DNA (genomická) iii) Podmienenosť: nie iii) Protizmyselnosť: nie iv) Zdroj pôvodu:

a) Organizmus: Homo sapiens í) Typ tkaniva: mliečna žľaza ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: CDS

b) Lokácia: 82..2088

d) Ďalšia informácia: /značenie = Variant_T ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: mat-peptid

b) Lokácia: 151..2085 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1756..2052 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1756..1788 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1789 .1821 ix) Rysy:

a) Menou/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1822..1854 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 1855..1887 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť.

b) Lokácia: 1888..1920 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť bjLokácia: 1921..1953 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť bjLokácia: 1954..1986 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť bjLokácia: 1987..2019 ix) Rysy:

a) Meno/kľúč: opakujúca sa oblasť

b) Lokácia: 2020..2052 xi) Opis sekvencie : SEQ ID č. 8 :

ACCTTCTCTA TCACTTAAGT GTCAAGATCG AAGGAACAGC

AGTCTCAAGA TAATCCAAAG

ACTTTATTCA TCCAGACCCT G ATC CTC ACC

ATG Met -20

GGG CGC Gly Arg

CTC Leu

CAA CTG

GTT Val

111

Met -23

Leu

Thr

cln

Leu -15

GTC

TTC

GGC

CTC

ACC

TGC

TGG

GCA

GTG

GCG

AGT

GCC

GCG

AAC

CTG

159

Val

Leu

Gly

Leu

Thr

cys

Cys

Trp

Ala

Val

Ala

Ser

Ala

Lys

Leu

-10

-5

1

GGC

GCC

GTC

TÄC

ACA

GAA

GGT

GGG

TTC

GTG

GAA

GGC

GTC

AAT

AAG

207

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly

Phe

Val

Clu

Cly

Val

Asn

Lys

5

10

15

CTC

GGC

CTC

GGT

GAC

TCT

CTC

GAC

ATC

TTC

AAG

CGC

ATC

CCC

TTC

255

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Ser

Val

Asp

íle

Phe

Lys

Cly

íle

Pro

Phe

20

25

30

3S

CCA

CCT

CCC

AAG

CCC

CTC

GAA

AAT

CCT

CAG

CCA

CAT

CCT

GGC

TCC

303

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Cln

Pro

Siis '

Pro

Gly

Trp

40

45

50

CAA

GGG

ACC

CTG

AA<*

GCC

AAC

ÄÄ-

TTC

AAG

AAaj

ACA

TCC

CTC

CAG

GCC

3S1

Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

l y s

Α5Π

Phe

Lys

Ara

Cys

Leu

Cln

Ala

c c

60

65

ATC

ACC

CAG

GAC

ACC

T A C

GGG

GAT

GAA

GAC

TCC

CTC

399

Thr

lis

Thr

Gin

Asp

Ser

Thr

Ty r

Giy

Asp

Glu

Asp

Cvs

Leu

Tyr

Leu

70

75

80

AAC

ATT

TCC

GTG

CCC

CAG

GGC

AGG

AAG

CAA

GTC

TCC

CGG

GAC

CTG

CCC

447

Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

Gly

Arg

Lys

Gin

Val

Ser

Arg

Asp

Leu

Pro

85

90

95

GTT

ATG

ATC

TGG

ATC

TAT

GGA

GGC

GCC

TTC

CTC

ATG

GGG

TCC

GGC

CAT

495

Val

Met

íle

Trp

íle

Tyr

Gly

Cly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

Ser

Cly

His

100

105

110

115

GCG

GCC

AAC

TTC

CTC

AAC

TAC

CTC

TAT

GAC

GGC

GAG

ATC

GCC

543

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Gly

Clu

íle

Ala

120

125

130

ACA

CGC

GGA

AAC

CTC

ATC

GTG

GTC

ACC

TTC

AAC

TAC

CCT

CTC

GCC

CCC

591

Thr

Arg

Gly

Asn

Val

íle

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

135

140

145

CTT

GGC

ttc

CTC

ÄGC

ACT

CGG

GAC

GCC

AAT

CTG

CCA

GGT

AAC

TAT

GGC

639

Leu

Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

cly

Asn

Tyr

Gly

150

155

160

CTT

CGC

GAT

CAG

CAC

ATG

GCC

ATT

GCT

TGG

CTG

AAG

AGG

AAT

ATC

GCG

687

Leu

Are

Asp

Gin

His

Mat

Ala

Iie

Ala

Trp

Val

Lvs

Arg

Asn

íle

Ala

165

170

175

GCC

TTC

GGG

GGC

GAC

CCC

AAC

ATC

ACG

CTC

TTC

GGG

CAG

TCT

GCT

735

Ala

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

íle

Thr

Leu

Phe

Gly

Clu

Set

Ala

180

185

190

195

GCA

GGT

GCC

ACC

ctc

TCT

CTG

CAC

ACC

CTC

TCC

CCC

TAC

AAC

AAG

GGC

783

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

Asn

Lys

Gly

200

205

210

CTC

ATC

CGG

CGA

GCC

ATC

ACC

CAG

AGC

GGC

GTG

GCC

CTC

AGT

CCC

TGG

631

Leu

íle

Arg

Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

Set

Pro

Trp

215

220

225

CTC

ATC

CAG

AAA

AAC

CCA

CTC

TTC

TGG

GCC

AAA

AAG

GTG

GCT

GAG

AAC

va i

íle

Gin 230

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe 235

Trp

Ala

Lys

Val 24 0

Ala

Glu

Lys

CTC

GCT

TGC

CCT

GTG

GCT

GAT

GCC

AGG

ATG

CCC

CAG

TGT

CTG

AAG

Val

Cly 24S

Cys

Pro

Val

Gly

Asp 250

Ala

Arg

Met

Ala 25S

Gin

Cys

Leu

Lys

CTT

ACT

GAT

CCC

CCA

CCC

CTG

ACG

CTG

GCC

TAT

AAG

GTG

CCG

CTG

GCA

Val 260

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala 265

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr 270

Lys

Val

Pro

Leu

Ala 275

GGC

CTG

GAG

TAC

CCC

ATC

CTC

CAC

TAT

GTG

GGC

TTC

CTC

CCT

GTC

ATT

Gly i

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Phe

Val

Pro

Val

íle

280

285

290

GAT

GGA

GAC

TTC

ATC

CCC

GCT

CAC

CCG

ATC

AAC

CTG

TAC

GCC

AAC

GCC

Asp

Gly

Asp

Phe 29S

íle

Pro

Ala

Asp

Pro 300

íle

Asn

Leu

Tyr

Ala 305

Asn

Ala

CC C

GAC

ATC

GAC

TAT

ATA

CCA

GCC

ACC

AA',

AAC

ATG

GGC

CAC

ATC

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

Gly

H1S

íle

310

315

330

TTC

GCC

AGC

ATC

GAC

ATC

CCT

GCC

ATC

AAC

AAG

GGv-

AAC

AAG

AAA

CTC

phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

Pro

Ala

11«

Asn

Lys

Gly

Asn

Lys

Val

325

330

335

Λ'-G

GAG

CAG

GAC

TTC

TAC

AAG

CTG

GTC

» ŕ*>\J .

CAj

CTC

ACA

ATC

ACC

AAC

Tŕir

Clu

C1 u

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Va 1

Ser

Glu

Phe

T i, r

íle

Thr

L'/s

340 345 350 355

CCC CTC

ÄCA GGC CCC Arg Gly Ala 360

AAG ACC

ACC TTT GAT CTC

TAC Tyr

ACC Thr

CAG Clu

TCC Ser 370

TGG Trp

Gly

Leu

Lys

Thr

Phe Asp 365

Val

CCC

CAG

GAC

CCA

TCC

CAG

GAG

AAT

AAG

ACT

GTG

GAC

TTT

Ala

Cln

Asp

Pro

Ser

Gin

Glu

Asn

Lys

Thr

Val

Asp

Phe

37S

380

385

GAG

ACC

GAT

GTC

ctc

TTC

CTG

GTG

CCC

ACC

GAG

ATT

GCC

CTA

GCC

CAG

G1U

Thr

Asp

Val

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Al*

Leu

Ala

Gin

390

395

400

CAC

AGA

CCC

AAT

GCC

AAG

AGT

CCC

AAG

ACC

TAC

GCC

TAC

CTG

TTT

TCC

His

Arg

Al*

Asn

Ala

Lys

Ser

Al*

Lys

Thr

Tyr

Ala

Leu

Phe

Ser

405

410

415

CAT

CCC

TCT

CGG

ATC

CCC

GTC

TAC

CCC

AAA

TGG

GTG

CvG

GCC

CAC

CAT

His

Pro

Ser

Arg

Met

Pro

Val

Tyr

pro

Lys

Trp

Val

Gly

Ala

Asp

His

420

425

430

435

GCA

GAT

GAC

ATT

CAG

TAC

GTT

TTC

GGC

AAC

CCC

TTC

GCC

ACC

CCC

ACG

Ala

Asp

íle

Gin

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Äl*

Thr

Pro

Thr

440

445

450

GGC

TAC

CGG

CCC

CAA

GAC

AGG

ACA

GTC

TCT

AAG

GCC

ATG

ATC

GCC

TAC

Cly

Tyr

Arg

Pro

Gin

Asp

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

íle

Ala

Tyr

45S

460

465

TGG

ACC

AAC

TTT

GCC

AAA

ACA

GCC

GAC

CCC

AAC

ATC

GGC

GAC

TCG

GCT

Trp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

Asp

Ser

Ala

470

475

480

GTG

CCC

ACA

CAC

TGG

GAA

CCC

TAC

ACT

ACG

GAA

AAC

AGC

GGC

TAC

CTG

Val

Pro

Thr

His

Trp

Glu

Pro

Tyr

Thr

Clu

Asn

Ser

Gly

Tyr

Leu

485 490 4SS

879

27

97S

1023

1071

1119

116

12’5

12ó3

1311

1359

1407

1455

1503

1551

1599

1647

GAG

ATC

ACC

AAG

ATC

CCC

ACC

AGC

TCC ATG

AAG

CGG

AGC

CTC

AGA

169S

Glu

íle

Thr

Lys

Met

Gly

Ser

ser

Ser Met

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg

500

505

S10

515

ACC

AAC

TTC

CTG

CGC

TAC

TCC

ACC

CTC

ACC TAT

CTG

GCG

CTG

ccc

ACA

17 43

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro

Thr

520

525

530

GTG

ACf

GAC

CAG

GAG

GCC

ACC

CCT

CTC

CCC CCC

ACA

GGG

GAC

TCC

GAG

1791

Val

Thr

Asp

Gin

Glu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

535

540

545

GCC

ACT

CCC

CTG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

1839

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Glv

Asp

Ser Glu

Thr

Ala

Pro

V* L

Pro

550

555

560

ccc

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CTG CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

1887

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val Pro

Pre

Thr

Gly

Asp

Ser

565

570

575

GGG

CCC

CTG

CCC

ACG

CCT

GAC TCC

GGG

GCC

ccc

CCC

GTG

1935

Glv

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp Ser

Gly

Ala

Pro

Val

580

585

S90

595

ccg

CCC

acg

CCT

GAC

TCC

CCC

CCC CTC

CCC

ACG

GGT

GAC

1983

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro Val

Pro

Thr

Cly

Asp

600

605

610

T*—,-

iajG

GCC

CCC

GTC

CCC

n »

uGT GAC

^CC

GCG

GCC

CCC

CCT

2031

Šer

Cly

Aia

Pro

Pre

Val

Pro

Prš

Thr

Gly Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

615

620

625

GTC

ccc

CCC

ACA

GAT

GAC

TCC

AAC

GAA

GCT CAG

ATG

CCT

GCA

GTC

ATT

2079

Val

Pro

Thr

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala Gin

Met

Pro

Ala

Val

íle

630

635

640

ACG TTT TAGCCTCCCA TGAGCCTTGG TATCAAGAGG CCACAAGACT CGGACCCCAG 2135

Arg Phe 645

CGGCTCCCCT CCCATCTTGA GCTCTTCCTG AATAÄAGCCT CATACCCCT 2184

2. Informácia pre SEQ ID č. 9 :

i) Charakteristiky sekvencie:

a) Dĺžka: 688 aminokyselín

b) Typ: aminokyselina

c) Topológia : Lineárna ii) Typ molekuly : proteín xi) Opis sekvencie : SEQ ID č. 9:

Met -23

Leu

Thr Met -20

Gly

Arg

Leu G Ír.

Leu Val Val Leu Gly Leu

Thr

Cys

-15

-10

Cys

Trp

Ala

Val

Ala

Ser

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Glu

'5

1

5

Gly

Cly

Phe

Val

Clu

Cly

Val

Asn

Lys

Leu

Cly

Leu

Gly

Asp

10

15

20

25

Ser

Val

Asp

íle

Phe

Lys

Gly

íle

Pro

Phe

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

30

35

40

Leu

Glu

Asn

Pro

Gin

Pro

His

Pre

Gly

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu

Lys

Ala

45

50

55

Lys

Asn

Phe

Lys

Arg

Cys

Leu

Gin

Ala

Thr

íle

Thr

Cln

Asp

Ser

60

65

70

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

Leu

Tyr

Leu

Asn

íle

Trp

Val

Pro

Gin

75

80

85

Gly

Arg

Lys

cln

Val

Ser

Arg

Asp

Leu

Pro

Val

Met

íle

Trp

Íle

Tyr

90

95

100

105

Gly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

Ser

Gly

His

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

110

115

120

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Gly

Glu

íle

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn

Val

íle

125

130

135

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

140

145

150

ciy

Asp Ala 15$

Asn Leu

Pro Gly Asn 160

T/r

Gly

Leu

Ä: g 16 í

Asp

Glr.

Hl S

Met

A 1 ä

I le

Ala

Trp

Val

Lvs

Arg

Asn

I i e

Ala

? r.

Gly

Asp

Pre

170

175

130

135

Asn

íle

Thr

Leu

Phe

Gly

Clu

Ser

Ala

Gly

31y

Ala

Ser

V a 1

Ser

190

195

20 0

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

T/r

Asn

Lvs

Gly

Leu

21 λ

Arg

Ara

Alô

íle

205

210

215

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Pro

Trp

Val

Zle

Gin

Lys

Asn

Pro

220

225

230

Leu

Phe

Trp

Ala

Lys

Lvs

Val

Ala

Glu

Lys

Val

Gly

Cys

Pro

Val

dy

23S

240

245

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Gin

cys

Leu

Lys

Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

250

255

260

265

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

270

275

280

Leu

His

Tyr

Val

Gly

Pne

Val

Pro

Val

íle

Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro

285

290

29S

Ala

Asp

Pro

íle

Asn

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

300

305

310

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

Gly

His

íle

Phe

Aia

Ser

íle

Asp

Met

315

320

325

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

Lys

Val

Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

330

335

340

345

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

íle

Thr

Lys

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

350

355

360

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

Glu

Ser

Trp

Ala

Gin

Asp

Pro

Ser

Gin

3 65

370

375

Clu

Asn

Lys

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phe

380

385

390

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

íle

Ala

Leu

Ala

Gin

His

Arg

Ala

Asn

Ala

Lys

395

400

405

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

Tyr

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

Arg

Met

Pro

410

415

420

425

Val

Tyr

Pro

Lys

Trp

Val

Gly

Ala

Asp

His

Ala

Asp

íle

Gin

Tyr

430

435

440

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

Thr

Pro

Thr

Gly

Tyr

Arg

Pro

Gin

Asp

445

450

455

Arg

Thr

Val

Ser

Lys

Ala

Met

íle

Ala

Tyr

Trp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

460

465

47 0

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

Asp

Ser

Ala

Val

Pro

Thr

His

Trp

Glu

475

480

485

Pro

Tyr

Thr

Glu

Asn

Ser

Gly

Tyr

Leu

Glu

íle

Thr

Lys

Met

490

495

500

SOS

Gly

Ser

ser

Met

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg

Tyr

510

515

520

Trp

Thr

Leu

Thr 525

Ty r

Leu Ala

Leu

Pro 536

Tr.r

Val

Thr

Asp

Gin 555

Glu

Ala

T n r

Pro

V a i

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

·*

Pro

Val

Pro

540

545

550

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

G ľy

Asp

Ser

Gly

555

560

565

n x i

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

G1V

Ala

r

Pro

Val

Pro

570

575

S8Ô

535

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

550

S9S

600

Gly

Ala

Pro

Va 1

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Pro

Val

60S

610

615

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Asp

620

625

630

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin

Met

Pro

Ala

Val

íle

Arg

Phe

635

640

645

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Molekula nukleovej kyseliny kódujúca polypeptid s hydrolytickou aktivitou proti triacylglycerolom s dlhým reťazcom aktivovanou žlčovými soľami, pričom týmto polypeptidom je variant BSSL kratší ako natívny 722-aminokyselinový polypeptid BSSL plnej dĺžky, keďže obsahuje len časť aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako zvyšky 536 - 722 v SEQ ID NO:3, a pričom tento variant BSSL obsahuje menej ako 16 opakujúcich sa jednotiek, pričom pojem „opakujúca sa jednotka“ označuje jednu z opakujúcich sa jednotiek 33 nukleotidov, z ktorých každý je uvedený v SEQ ID NO:1 v zozname sekvencií.

2. Molekula nukleovej kyseliny kódujúca polypeptid s hydrolytickou aktivitou proti triacylglycerolom s dlhým reťazcom aktivovanou žlčovými soľami, pričom týmto polypeptidom je variant BSSL zahŕňajúci všetky aminokyseliny 1 - 535 a časť aminokyselinovej sekvencie uvedenej ako zvyšky 538 - 722 vSEQ!DNO:3.

3. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1 alebo 2, kde variant BSSL má vo svojej C-koncovej polohe fenylalaninový zvyšok.

4. Molekula nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde variant BSSL zahŕňa vo svojej C-koncovej časti sekvenciu Gln-Met-Pro.

5. Molekula nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde variant BSSL zahŕňa vo svojej C-koncovej časti aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako zvyšky 712 - 722 v SEQ ID NO:3.

6. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1 alebo 2, ktorá kóduje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je aspoň na 90 % homologická s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako SEQ ID NO:5, 6 alebo 9 v zozname sekvencií.

7. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 6 kódujúca polypeptid, ktorý zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO: 5, 6 alebo 9 v zozname sekvencií.

8. Polypeptid uvedený ako SEQ ID NO: 5, 6, 7 alebo 9 v zozname sekvencií.

9. Polypeptid kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

10. Polypeptid podľa nároku 8 alebo 9, ktorý má viac ako 90 % čistotu.

11. Hybridný gén zahŕňajúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

12. Replikovateľný expresný vektor zahŕňajúci hybridný gén podľa nároku 11.

13. Vektor podľa nároku 12, ktorým je vektor vírusu hovädzieho papilómu s depozitným číslom DSM: 7501, 7502 alebo 7497.

14. Bunka, v ktorej sa nachádza hybridný gén podľa nároku 11.

15. Bunka podľa nároku 14, ktorá je z myšacej bunkovej línie C127 alebo z E. coli.

16. Spôsob produkcie rekombinantného polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa (i) kultiváciu hostiteľskej bunky v kultivačnom médiu alebo na ňom, do ktorej bola inzerovaná molekula nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v hybridnom géne, ktorý je schopný replikovať sa v konkrétnej hostiteľskej bunke, alebo identifikáciu a reprodukciu organizmu, do ktorého bola zavedená molekula nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v hybridnom géne, ktorý je schopný replikovať sa v tomto konkrétnom organizme; (ii) expresiu polypeptidu a (iii) izoláciu polypeptidu.

17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že hybridný gén je obsiahnutý vo vektore vírusu hovädzieho papilómu s depozitným číslom DSM: 7501, 7502 alebo 7497.

18. Expresný systém zahŕňajúci hybridný gén, ktorý je exprimovateľný v hostiteľskej bunke alebo organizme, v ktorom sa nachádza tento hybridný gén, tak, že pri exprimovaní hybridného génu sa produkuje rekombinantný polypeptid, pričom hybridný gén sa pripraví inzerciou sekvencie nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 do génu schopného sprostredkovať expresiu tohto hybridného génu, pričom tento expresný systém nezahŕňa ľudí.

19. Spôsob produkcie transgénneho cicavca odlišného od človeka, schopného expresie variantu BSSL, zahŕňajúci (a) zavedenie expresného systému podľa nároku 18 do oplodneného vajíčka alebo bunky embrya cicavca odlišného od človeka tak, aby sa expresný systém zabudoval do zárodočnej línie tohto cicavca a (b) vývoj získaného oplod34 neného vajíčka alebo embrya zavedeného do dospelej samice cicavca odlišného od človeka.

20. Spôsob produkcie transgénneho cicavca odlišného od človeka, schopného expresie variantu BSSL, zahŕňajúci (a) likvidáciu schopnosti tohto cicavca exprimovať BSSL a inzerciu expresného systému podľa nároku 18 do zárodočnej línie tohto cicavca tak, že sa v cicavcovi exprimuje variant BSSL; a/alebo (b) nahradenie cicavčieho génu BSSL alebo jeho časti expresným systémom podľa nároku 18.

21. Transgénny cicavec odlišný od človeka, v ktorého genóme sa nachádza sekvencia DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

22. Transgénny cicavec odlišný od človeka podľa nároku 21, v ktorom je sekvencia DNA prítomná v zárodočnej línii tohto cicavca.

23. Transgénny cicavec odlišný od človeka podľa nároku 21 alebo 22, v ktorom je sekvencia DNA prítomná v géne mliečneho proteínu tohto cicavca.

24. Transgénny cicavec odlišný od človeka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 23, ktorý je vybraný zo skupiny, ktorú tvoria myši, potkany, králiky, ovce, ošípané a dobytok.

25. Progény transgénneho cicavca odlišného od človeka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 24, pričom v genóme týchto progénov sa nachádza sekvencia DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

26. Mlieko získané z transgénneho cicavca odlišného od človeka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 25 obsahujúce polypeptid kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

27. Dojčenská výživa obsahujúca mlieko podľa nároku 26.

28. Dojčenská výživa obsahujúca polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10.

29. Spôsob prípravy dojčenskej výživy, vyznačujúci sa tým, že sa doplní dojčenská výživa polypeptidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10.

30. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 ako doplnok dojčenskej výživy.

31. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10.

32. Polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na použitie v terapii.

33. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie cystickej fibrózy.

34. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie chronickej pankreatitídy.

35. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie malabsorpcie tuku.

36. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie malabsorpcie vitamínov rozpustných v tukoch.

37. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie malabsorpcie tuku v dôsledku fyziologických príčin.

38. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na zlepšenie využitia dietárnych lipidov.

39. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na zlepšenie využitia dietárnych lipidov u predčasne narodených novorodencov.