KR19990036084A - 유전자전이 동물의 젖에서 생산된 리소조옴 단백질 - Google Patents
유전자전이 동물의 젖에서 생산된 리소조옴 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 그들의 젖에 인산화된 리소조옴 단백질을 생성하는 유전자전이된 비인류 포유동물과, 그를 생산하는 방법에 관한 것이다. 인산화는 만노즈 측쇄잔여기의 6' 위치에서 발생한다. 또한, 젖으로부터 리소조옴 단백질을 정제하고, 효소교환 요법에서 사용되는 약학적 조성물에 그 단백질을 결합하는 방법이 제공된다.
Description
〔관련된 출원에 대한 교차 참조〕
본 발명은 1995년 8월 2일 출원된 미국특허출원 60/001,796 호의 부분계속 출원이다.
다른 분비단백질처럼, 리소조옴 단백질은 소포체에서 합성되고 골지체로 이동된다. 그러나 대부분의 다른 분비단백질과는 달리, 리소조옴 단백질은 세포외 분비액에서의 분비작용이 아니라 세포내의 세포 소기관에서 충당된다. 골지체 내부에서 리소조옴 단백질은 이들을 세포내 목적지에 도달시키기 위한 준비를 위한 특별한 과정을 겪는다. 대부분의 모든 리소조옴 단백질은 만노즈 그룹의 말단 6' 위치에서의 글리코실화와 인산화를 포함하여 다양한 번역후 변이를 겪는다. 인산화된 만노즈 잔류물은 트랜스 골지체 망상조직의 내부표면에서 특정 수용체에 의해서 인식된다. 리소조옴 단백질은 이러한 수용체를 거쳐 결합되고 그것에 의해 다른 분비단백질로부터 분리된다. 계속하여 수용체와 결합된 단백질을 포함한 작은 운송 소포체는 트랜스 골지체 망상조직으로 부터 잘려지고 세포내 목적지로 목표가 정해진다. Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18, 367-374 (1990) 를 참조한다.
30여 이상의 리소조옴 병이 있으며, 이들은 각각 특별한 리소조옴 단백질의 결핍으로 부터 생기며, 대개는 유전학적인 돌연변이의 결과로서이다. Cotran et al., Robbins Pathologic Basis of Disease (4th ed. 1989) 를 참조한다. (전체적으로 모든 목적을 위한 참조로서 언급됨). 리소조옴 단백질의 결핍은 대게 유해한 대사중간체의 축적으로 귀착한다. 예를 들면 훌러(Hurler), 헌터(Hunter), 모키오(Morquio) 및 산필리포(Sanfilippo) 증후군에서 무코(muco)다당의 축적이 있고, 타이-사크(Tay-Sachs), 고커(Gaucher), 크라베(Krabbe), 니이만-픽(Niemann-Pick) 및 파브리(Fabry) 증후군에서 스핑고(sphingo)지질의 축적, 또한 후코시도시스(fucosidosis) 와 만노시도시스(mannosidosis)에서 후코제(fucose)를 함유한 스핑고지질과 당단백질 단편의 축적, 그리고 만노즈를 함유한 올리고당의 축적이 각각 있다.
글리코겐 저장질환 타입Ⅱ(GSD Ⅱ ; 폼프(pompe)병 ; 산성 말타아제 결핍증)는 리소조옴효소 산성α-글루코시다아제 (산성 말타아제)의 결핍으로 말미암아 생긴다. 3개의 임상형태는 유아, 아동, 성인으로 구별된다. 유아의 GSD Ⅱ는 출생 후에 짧게 시작되고 점진적인 근육 약화와 심장쇠약을 일으킨다. 이러한 임상의 변화는 생후 2년 이내에 치명적이다. 성인과 아동환자의 증후는 좀 더 늦게 일어나고, 단지 골격 근육만이 관련된다. 환자들은 최후에는 호흡부족으로 사망한다. 환자들은 예외적으로 60세 이상 생존할 수 있다. 이병의 심각성과 잔여산성 α-글루코시다아제 활성도의 사이에는 좋은 상관관계가 있는데, 활성도는 이 병의 말기 개시에서는 정상의 10-20% 이고 초기 개시형태에서는 2% 이하이다. (참조 Hirschhorn, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Dieases (Scriver et al., eds., 7th ed., McGraw-Hill, 1995), pp. 2443-2464).
리소조옴 축적질환의 첫번째 원인으로서 리소조옴 효소 결핍이 발견됨에 따라(참조, e.g, Hers, Biochem. J.86, 11-16 (1963)), 상실 효소의 투여(정맥 내), 즉 효소요법에 의하여 리소조옴 축적질환을 가지는 환자를 치료하기 위한 시도가 이루어져 왔다. 고커질환이외의 리소조옴질환에 있어서, 효소요법은 투여된 효소가 만노즈 측쇄기의 6' 위치에서 인산화되었을때 가장 효과적임이 제시되었다. 글리코게네시스(glycogenesis) 타입Ⅱ에 대하여는, 인산화된 상태와 비인산화된 형태의 정제된 산성 α-글루코시다아제를 쥐에게 정맥내투여하고 근육 조직에서의 흡수력을 분석함으로써 시험되었다. 가장 높은 흡수력은 만노즈 6-인산을 힘유한 효소가 사용되었을 때 얻어졌다. (Van der Ploge et.al., Pediat. Res. 28, 344-347(1990); J. Clin. Invest. 87, 513-518 (1991)). 효소의 인산화된 형태의 보다 많은 축적은 근육과 다른 세포들의 표면에 존재하는 만노즈 6-인산 수용체에 의하여 전달된 흡수력에 의하여 설명될 수 있다.
이론적으로, 몇몇 인산화된 리소조옴 효소는 인뇨와 소과 동물의 고환같은 천연원료로 부터 분리될 수 있다. 그러나, 치료적 투여를 위한 효소의 충분한 양의 생산은 어렵다. 인간의 산성 α-글루코시다아제의 생산을 위한 선택적인 방법은, 산성α-글루코시다아제 유전자를 cDNA 와 같은 안정된 진핵세포(眞核細胞)계열(예를 들어 CHO) 또는 적절한 프로모터(promoter)에 기능적으로 결합된 유전학적구조로 형질이입(形質移入)하는 것이다. 포유류 세포의 형질발현 시스템은 그와 같은 세포의 번식 및 보존비용 때문에 조환형(組換型) 단백질의 생산용으로 완전히 만족스러운 것은 아니다. 조환형단백질의 생산을 위한 선택적인 접근은 DeBoer 등에 의하여 WO 91/08216에서 제안되었으며, 그에 의하여 조환형 단백질이 유전자전이 동물의 젖에서 생산되고 있다. 이 접근방법은 포유류 세포 배양에 대한 비용을 피하고, 조환형 단백질의 정제를 단순화한다.
유전자전이 동물의 젖으로부터 여러 조환형 단백질의 형질발현의 실현 가능성이 증명되어왔음에도 불구하고, 이러한 기술이 만노즈 6-인산을 함유한 리소조옴 단백질의 형질발현까지 확장될 수 있을 지는 예견할 수 없었다. 젖 단백질과 같은 전형적인 분비단백질은 6' 위치에서 인산화된 만노즈기를 함유하지 않으며, 이들 세포들이 필요한 보체(補體)와 외인성 리소조옴 단백질의 실질적인 양의 인산화를 위한 효소의 활성을 지니고 있는지가 볼확실했기 때문이다. 또한, 그러한 세포들이 효소의 필요한 보체를 소유한다면, 세포외 위치보다 오히려 세포내 위치로 만노즈 6-인산 수용체를 거쳐 인산화된 리소조옴 단백질을 인산화의 목표로 하는 것처럼 나타날 수도 있다. 실질적인 리소조옴 단백질의 세포내 축적은 유전자전이 동물의 유선 기능에 유해하고 치명적인 결과가 예상될 수도 있다.
상기와 같은 불확실성 및 어려움에도 불구하고, 본 발명은 자신의 젖에서 인산화된 리소조옴 단백질을 확실히 분비하는 건강한 유전자전이 포유류를 제공한다.
〔발명의 요약〕
그의 한 실시형태에 있어서, 본 발명은 젖에서 리소조옴 단백질을 생산하는 유전자전이 비인류(非人類) 포유류를 제공한다. 리소조옴 단백질은 만노즈 측쇄잔기의 6' 위치에서 인산화된다. 유전자전이 포유류는 그들의 게놈에서 유전자 전이를 가진다. 유전자 전이는 특정한 유선 프로모터와, 특정한 유선 인핸서(enhancer)와, 유전자전이 비인류 포유류의 유선분비세포의 기능적인 시그널 펩티드를 암호화하는 분비 DNA단편및, 대개는 효소인, 리소조옴 단백질을 암호화하는 조환형 DNA단편을 포함한다. 조환형 DNA 단편은 분비조환형 DNA단편을 형성하기 위하여 분비 DNA 단편에 기능적으로 연결되어 있다. 비인류 포유류의 성인형태 또는 비인류 포유류의 암컷 자손에서, 유전자전이는, 리소조옴 단백질을 함유한 만노즈 6-인산으로서 젖내에 유선분비 세포에 의해 처리되고 분비된 리소조옴 단백질의 형태를 생산하기 위한 유선분비세포내에서 분비성 조환형 DNA 단편을 발현할 수 있다. 젖내에서의 리소조옴 단백질을 함유하는 만노즈 6-인산의 농도는 일반적으로는 최소한 100㎍/㎖이다. 그러한 동물들에 의해 발현된 하나의 유용한 효소는 산성 α-글루코시다아제이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 동물은 쥐, 토끼, 염소, 양, 돼지 또는 소과의 동물이다. 조환형 DNA단편은 cDNA, 게놈 또는 두 개의 잡종세포일 수 있다. 어떤 유전자전이에서, 분비 DNA 단편은 조환형 DNA 단편에 의해서 암호화된 리소조옴 단백질 유전자로부터 생산된다.
또 다른 실시형태에서 본 발명은, 유전자전이 포유류의 젖에서 리소조옴 단백질을 함유하는 만노즈 6-인산을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 그 방법은 상기 기술된 유전자전이 비인류 포유류의 성장한 형태로부터 젖을 재생하는 것을 수반한다. 임의적으로, 단백질을 함유한 만노즈 6-인산은 젖로부터 정제될 수 있다. 그때 정제된 단백질은 정맥내의, 피내(皮內)의, 근육내의, 또는 경구 치료를 위한 약학적 담체와 혼합될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 리소조옴 단백질을 함유한 만노즈 6-인산을 함유한 상기 기술된 유전자전이 비인류 포유류로부터 생산된 젖을 제공한다.
본 발명은 유전자전이 포유동물의 젖에서 리소조옴 단백질을 포함하는 만노즈(mannose) 6-인산의 생산과 대응하는 내인성 단백질의 부족으로부터 유발되는 병으로 고생하는 환자에게 단백질을 공급하는 것에 관한 것이다.
도 1 : 산성 α-글루코시다아제 cDNA 를 함유한 유전자전이 α1-카제인 엑손(exons)은 개방된 상자로 나타낸다; α-글루코시다아제 cDNA는 음영처리된 상자로 나타낸다. αS1-카제인 인트론(intron)과 측면 배열은 굵은선으로 나타낸다. 가는 선은 IgG 수용체 위치를 나타낸다. 전사개시 위치는번역개시위치(ATG) 중지코돈(TAG) 및 폴리아데닐레이션 위치(pA)로 표시된다.
도 2 (패널 A.B.C) : 산성 α-글루코시다아제 게놈 DNA를 함유한 3개의 유전자전이. 음영지역은 αS1 카제인 배열이고 개방된상자는 산성 α-글루코시다아제 엑손을 나타내고 개방된 상자 사이의 가는 선은 α-글루코시다아제 인트론을 나타낸다. 다른 심볼은 도 1에서와 동일하다.
도 3 (패널 A.B.C) : 게놈 유전자전이의 구조. α-글루코시다아제 엑손은 개방된 상자로 나타낸다. α-글루코시다아제 인트론(intron)과 비번역된 배열은 가는 선으로 나타낸다. pKUN 벡터 배열은 두꺼운 선에 의해 표시된다.
도 4 : 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 유전자전이 쥐의 젖에 있어서 산성 α-글루코시다아제의 검출.
〔정 의〕
"실질적인 동일성" 또는 "실질적인 상동(相同)"이라는 용어는 프로그램 GAP이나 디폴트 갭 웨이츠(default gap weights)를 사용한 BESTFIT에 의한 것처럼 두 개의 펩티프 배열이 가장 적절하게 일렬로 되었을 때 최소한 65% 배열 일치를, 바람직하게는 80 또는 90%, 더욱 바람직하게는 최소한 95% 또는 그 이상의 배열 일치를 의미한다. (e.g., 99% 배열 일치). 바람직하게는, 일치하지 않는 잔재 위치는 보존성 아미노산 치환에 의하여 차이가 난다.
"실질적으로 순수한" 또는 "분리된" 이라는 용어는 대상종이 인지되거나 분리되거나 또는 자연환경의 구성요소로부터 회복되는 것을 의미한다.
통상, 대상종은 현재에 우월한 종(즉, 몰을 표준으로 하여 조성에 있어서 다른 개별적인 종보다 훨씬 풍부하다)이며, 바람직하게는 실질적으로 순종화된 분류는 대상종이 현존하는 모든 고분자 종의 최소한 약 50%(몰을 표준으로)를 함유하는 조성이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성은 조성내에 존재하는 모든 고분자 종의 중량대비 약 80부터 90% 이상을 포함하여 구성된다. 가장 바람직하기로는, 대상종은 혼합물이 본래 하나의 고분자종의 유도체로 구성되어 있는 점에서 본질적인 동종성으로 정제되어진다.(오염물질 종은 보통의 검출법에 의해 혼합물에서 검출되어질 수 없다)
DNA 단편은 다른 DNA 단편과 기능적인 관계에 놓여졌을 때 사용가능하게 연결된다. 예를들면 단일 배열을 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에서 예견되는 (前)전단백질로서 나타내어진다면 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 사용가능하게 연결되어 있다; 프로모터 또는 인핸서는 배열의 전사를 자극하면 코딩(coding) 배열에 사용가능하게 연결되어져 있다. 일반적으로 사용가능하게 연결된 DNA 배열은 인접하고 단일 배열이 인접하고 읽을 수 있는 상태의 경우이다. 그러나, 인핸서는 그들이 조절하는 코딩(coding)배열에 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 위치에서, 또는 어댑터나 그의 삽입된 링커에서 결찰에 의해 완성된다.
외인성 DNA 단편은 세포에게는 외부의 것이거나, 숙주세포 게놈에서 부자연스러운 위치에서 세포의 DNA 단편과 상동이다. 외인성 DNA 단편은 외인성 폴리펩티드를 생산하기 위해 발현되어 진다.
유전자전이 포유류에서 생식세포와 체세포의 전부 또는 사실상 전부는, 포유류에 도입된 유전자전이 또는 초기 태아단계에서 포유류의 원형을 포함한다.
〔상세한 설명〕
본 발명은 젖에서 리소조옴 단백질을 함유한 만노즈 6-인산을 분비하는 유전자전이 비인류 포유류를 제공한다. 분비는 리소조옴 단백질을 암호화하는 유전자전이의 혼성 및 유선에 대한 유전자의 형질발현을 목표로 할 수 있는 규정된 순서에 의하여 달성될 수 있다. 유전자가 발현되고, 형질발현 생산물은 유선내에서 번역후 변이되고 그 후 젖에서 분리된다. 번역후의 변이는 글리코실화와 인산화단계를 포함한다.
A.리소조옴 유전자
본 발명은 리소조옴 효소와 하기와 같은 다른 타입의 리소조옴 단백질을 암호화하는 30여 이상의 알려진 유전자를 함유하는 DNA단편을 발현하는 유전자전이 비인류 포유류를 제공한다. 즉α-글루코시다제(glucosidase), α-L-이두로니다제(iduronnidase), 이두로네이트-설페이트 설파타제(induronate-sulfate sulfatase), 헥소사미니다제(hexosaminidase) A 및 B, 강글리오시드 활성화 인자 단백질, 아릴설파타제 A 및 B, 이두로네이트 설파타제(iduronate sulfatase), 헤파란 N-설파타제(heparan N-sulfatase), 갈락토세라미다제(galactoceramidase), α-갈락토실세라미다제A(α- galactosylceramidase A), 스핀고미에리나제(sphingomyelinase), α-후코시다제(α-fucosidase), α-만노시다제(α-mannosidase), 아스파르틸글리코사민 아미드 히드로라제(aspartylglycosamine amide hydrolase), 산성 리파아제, N-아세틸-α-D-글루코사민-6-설페이트 설파타제, α-및-β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, β-만노시다제, 세라미다제, 갈락토세레브로시다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 그리고 보호 물질 단백질과 다른 것을 포함한다. allelic, 동족과 어떤 알려진 리소조옴 단백질 유전자 배열의 유발된 변이를 발현하는 유전자전이 포유류가 또한 함유되어진다. 그러한 변이는 대개 알려진 리소조옴 단백질 유전자와 함께 아미노산 단계에서 사실상의 배열 일치를 보인다. 그러한 변이는 대개 엄중한 조건하에 알려진 유전자를 교배시키거나 알려진 유전자의 하나에 의해 암호화된 폴리펩티드에 대한 항체와 교차반응시킨다.
게놈을 함유한 DNA 분지계(clone)나 리소조옴 단백질을 암호화한 많은 알려진 유전자의 cDNA배열은 유용하다(Scott et al., Am.J.Hum. Genet. 47, 802-807(1990); Wilson et al., PNAS 87, 8531-8535(1990); Stein et al., J.Biol.Chem. 264, 1252-1259(1989); Ginns et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 123, 574-580 (1984); Hoefsloot et al., EMBO J. 7, 1697-1704 (1988); Hoefsloot et al., Biochem.J. 272, 473-479(1990); Meyrtowitz & Proia, PNAS 81, 5394-5398(1984) ; Scriver et al., 상기, part 12, pages 2427-2882 및 그 중에 인용된 참조사항). 게놈의 다른 예와 cDNA 배열은 유전자은행(GenBank)로부터 입수가능하다. 리소조옴 유전자의 부가적인 복제된 배열의 한도까지 요구되어지고 그것들은 알려진 리소조옴 단백질 DNA 배열이나 조사한 것 처럼 알려진 cDNA 라이브러리 (되도록 인간)로부터 얻어질 수 있다.
B.리소조옴 단백질의 구조
조환형 리소조옴 단백질은 바람직하게는 천연적으로 존재하는 리소조옴 단백질과 동일 또는 유사구조를 가지도록 처리된다. 리소조옴 단밸질은 소포체(RER)에 결합된 리소조옴에서 합성된 당단백질이다. 그들은 N-말단 시그널 펩티드에 의해 함께 번역으로 인도된 세포소기관으로 들어간다.(Ng et al., Current Opinion in cell Biology 6, 510-516(1994)). N-결합된 글리코실화 처리는 돌리콜 담체로부터 하이-만노즈 올리고사카라이드 전구체의 전이와 함께 소포체에서 시작된다. 탄수화물 사슬변형은 소포체에서 출발하고 글리코시다아제Ⅰ과 Ⅱ에 의해 3개의 가장먼 글루코즈 잔여물의 이동과 함께 소포체에서 계속된다. 인산화는 두단계의 절차를 거치는데 첫째, 특정한 N-아세틸클루코사민-1-포스페이트는 리소조옴 단밸질 전이효소에 의해 만노즈기를 선택하도록 연결되고 둘째, N-아세틸글루코사민은 소화효소에 의해 절개된다. (Goldberg et al., Lysosomes: their Role in protein Breakdown (A cademic press Inc., London, 1987).PP.163-191). 분할은 리소조옴으로 대부분의 리소조옴 단백질의 운반체를 중재하는 만노즈 6-인산수용체를 위한 인지표시와 리간드로서 만노즈 6-인산을 보여준다. (Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18, 367-374 (1992) ).
또, 대부분 리소조옴 단백질은 단백질분해 과정을 겪는데 탄수화물 사슬변형에서 첫번째 결과는 시그널 펩티드의 이동이다. 대부분 리소조옴 단백질의 시그널 펩티드는 단백질이 용유가능하게 된 후에 시그널 펩티다아제에 의한 전위후에 분할된다. 이는 산성 α-글루코시다아제의 시그널 펩티드는 효소가 소포체를 떠난후에, 그러나 리소조옴 또는 분비통로에 들어가기 전에 분할되는 것을 시사하는 증거이다. (Wisselaar et al., J. Bial. chem. 268, 2223-2231(1993)). 산성 α-글루코시다아제의 단백질분해 과정은 복잡하고 여러 가지 하위세포 위치에서 발생하는 시그널 펩티드의 분할에 더하여 일련의 단계를 수반한다. 폴리펩티드는 특정 촉매의 활성이 증가됨에 따라 N과 C말단 끝양쪽에서 분할된다. 인지된 주된 종은 110/100 KDa 전구물질, 95 KDa 중간체 그리고 76KDa와 70KDa완성형태이다.(Hasilik et al., J. Biol. chem. 255, 4937-4945(1980); Oude Elferink et al., Eur, J. Biol chem.139, 498-495(1994); Reuser et al., J. Biol. chem. 260, 8336-8341(1985); Hoefsloot et al., EMBO j.7,1697-1704(1998)).
천연적인 인간의 산성 α-글루코시다아제와 COS세포 BHK세포 CHO세포와 같은 배양된 포유류 세포에서 보여진 것과 같은 인간의 산성 α-글루코시다아제의 조환형 형태의 번역후의 과정은 상기와 유사하다(Hoefsloot et al., (1990) 상기; Wisselaar et al.,(1993)상기).
만노즈기의 6'위치에서 인산화된 리소조옴 단백질을 발생하기 위한 확실한 과정은 만노즈 6-인산을 위한 수용체를 생기게 하는 세포에 의해 기질의 흡수력을 측정함으로써 시험될 수 있다. 정확하게 수식된 기질은 비수식된 기질보다 빠르게 흡수되어지고 어떤 의미로는 수식된 기질의 흡수력은 만노즈 6-인산의 첨가에 의해 경쟁적으로 억제되어 질 수 있다.
C.유전자전이 설계
유전자전이는 유전자전이의 은신처인 유전자전이 비인류 포유류의 유선에 대한 조환형 리소조옴 단백질의 형질발현을 목표로 설계되어 있다. 기본적인 접근은 시그널 배열, 프로모터와 인핸서와 단백질을 암호화하는 외인성 DNA단편을 연결가능하도록 한다. DNA단편은 게놈·소유전자(하나이상의 인트론으로 된 게놈은 생략되었음), cDNA, YAC단편, 두 개의 다른 리소조옴 단백질 유전자의 키메라(chimera), 또는 이들의 어떤 혼성물 일 수 있다. 게놈 배열의 증가는 일반적으로 형질발현의 수준의 원인이 된다.
형질발현의 지나친 고수준은 번역후 변이와 리소조옴 단백질의 분비를 수행하기 위한 유선의 용량을 지나치게 할 수도 있다. 그러나 하기 데이터는 ㎎/㎖범위에서 고형질발현 수준에도 불구하고, 실질적인 번역후 일시적변이 만노즈-6인산기의 구성물을 구비하여 일어남을 나타낸다. 실질적인 변이는 분비된 분자의 최소한 약 10, 25, 50, 75 또는 90%가 최소한 하나의 만노즈 6-인산기를 생산함을 의미한다. 그래서 게놈구조 또는 혼성 cDNA -게놈구조는 일반적으로 택해진다.
게놈구조에서 모든 인트론의 배열을 보유할 필요는 없다. 예를들면, 어떤 인트론의 배열은 DNA촉진과 후속의 미소주입을 촉진하는 좀더 작은 유전자전이를 얻기 위해 이동되어 질 수 있다. Archibald et al., wo 90/05188 참조(전체적으로 모든 용도에 대한 참조 언급함). 어떤 인트론의 이동은 또한 형질발현 수준을 고치기 위한 몇몇 경우에 유용하고 그것에 의해서 번역후 변이는 실질적으로 완수된 것을 보장한다. 그것은 또한 비암호화된 엑손의 몇 개 또는 전부를 삭제하는 것이 가능하다. 어떤 유전자전이에서, 배열를 암호화하는 리소조옴 단백질에서 선택된 뉴클레오티드는 단백질분해 분할부위를 이동하기 위해 변화되어 진다. 유전자전이 포유류에 의해 생산된 리소조옴 단백질의 의도된 용도는 대개 인간에게 투여되기 때문에 종들로 부터 리소조옴 단백질 배열를 암호화하는 DNA단편이 얻어진 종들은 바람직하게는 인간이다. 의도된 용도가 가축병 치료요법에서 유사하게 있었다면 바람직한 DNA사슬은 동일한 종으로부터 생길것이다.
프로모터와 인핸서는 오로지 또는 최소한 우선적으로 유선에서 형질발현된 유전자로부터 온다(즉 유선 특정 유전자). 프로모터 와 인핸서의 출처로서 바람직한 유전자는 β-카제인, K-카제인, αS1-카제인, αS2-카제인, β-락토글로블린, 웨이산 단백질(whey acid protein), 및 α-락트알부민을 함유한다. 프로모터와 인핸서는 대개 그러나 항상 동일 유선 특정 유전자로부터 얻어지지는 않는다. 이 유전자는 때때로 그러나 반드시 그 속으로 유전자전이가 발현되어지는 포유류처럼 포유류의 동일 종으로부터 생기지 않는다. 형질발현 조절순서는 인간유전자로 부터 생긴 것이 또한 사용되어질 수 있는 것 처럼 다른 종으로부터 생성된다.
시그널 배열은 유선으로부터 리소조옴 단백질의 분비를 지휘할 수 있어야만 한다. 적당한 시그널 배열은 분비단백질을 암호화하는 포유류 유전자로부터 파생될 수 있다. 의외로 리소조옴 단백질의 천연적인 시그널 배열은 이러한 단백질이 정상적으로 분비되지 않고 세포내 조직으로 목표되어짐에도 불구하고 적절하다. 그러한 시그널 배열에 더하여 시그널 배열의 바람직한 원천은 프로모터와 인핸서가 얻어지는 것과 동일한 유전자로부터이다.
임의적으로, 부가적인 제어배열은 발현수준을 활용하기 위하여 유전자전이에 포함된다. 그러한 배열은 5′즉면구역 5′에서 번역된 비번역구역, 인트론의 배열, 3′에서 번역된 그러나 비번역된구역, 폴리아데닐레이션 위치 그리고 3′측면 구역을 포함한다. 그러한 배열은 대개 프로모터와 인핸서가 얻어지는 것으로부터 유선 특정 유전자나 발현된 리소조옴 단백질로부터 얻어진다. 그러한 배열의 포함은 확실한 유선 특정 유전자 및/또는 확실한 리소조옴 단백질 유전자를 모의한 유전자 환경을 생성한다. 이러한 유전자환경은 전사된 유전자의 높은 형질발현에서 몇가지 경우를 야기한다. (예를 들면, 소과의 αS1-카제인) 선택적으로 3′측면 부위와 비번역된 부위는 β-글로블린 유전자 또는 바이러스 유전자와 같은 다른 비대응 유전자로부터 얻어진다. 리소조옴 단백질 유전자로부터 3′과 5′비번역된 부위의 함유 또는 다른 비대응유전자는 또한 전사의 안정성을 증가시킬 수 있다.
어떤 실시예에서, 5′측면 배열의 약 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 또는 30Kb는 리소조옴 단백질 유전자가 발현된 것으로 부터 온 약 1, 5, 10, 15, 20 또는 30Kb 또는 3′측면 배열과의 결합에서 포유류 특정 유전자로 부터 함유된다. 단백질이 cDNA 배열로부터 발현되면 프로모터와 암호 배열사이에서 인트론의 배열를 함유하기에 유리하다. 인트론의 배열은 오히려 5`부분으로 부터, 개재 배열로 부터, 프로모터가 얻어지는 유선 특정 부위의 첫번째 인트론으로 부터 형성된 혼성 배열이고 IgG 개재 배열의 개재 배열로 부터 온 3`부위이다. DeBoer et al., WO 91/08216 참조 (전체적으로 모든 용도로서의 참조로서 언급됨).
리소조옴 단백질을 발현하기 위하여 선택된 유전자전이는 카제인 프로모터와 인핸서에 5′이 연결된 cDNA-게놈 혼성 리소조옴 단백질 유전자를 함유한다. 혼성 유전자는 시그널 배열, 암호 부위 그리고 리소조옴 단백질 유전자로부터 3′측면 부위를 포함한다. 임의적으로 cDNA 단편은 5′카제인과 리소조옴 단백질을 암호화하는 비번역된 부위의 유전자 사이에서 인트론의 배열를 함유한다. 물론 대응 cDNA와 게놈단편은 인접한 단백질이 융합 결과로부터 발현될 수 있다면 유전자 범위내에서 다른 위치에서 융합될 수도 있다.
다른 선택된 유전자전이는 카제인 조절 배열에 5′연결된 게놈 리소조옴 단백질 단편을 가지고 있다. 게놈단편은 대개 5′비번역 부위로부터 유전자의 3′측면 부위에 인접하다. 그래서, 게놈 단편은 리소조옴 단백질 5′비번역된 배열, 시그널 배열, 교체 인트론과 암호 엑손, 3′비번역된 부위, 그리고 3′연결부위의 일부를 함유한다. 게놈 단편은 5′비번역 부위를 거쳐 프로모터와 인핸서를 함유한 카제인 단편과 대개 5′ 비번역 부위로 연결된다.
DNA 배열정보는 상기한 최소한 하나 또는 여러 유기체에서 유선 특정 유전자의 전부에 유효하다. 참조, Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (α-락트알부민 쥐) ; Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (쥐 WAP) ; Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) ) (쥐 β-카제인) ; Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (쥐 γ-카제인) ) ; Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987)(α-락토알부민 인간) ; Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) ( 소과의 αS1 및 κ카제인 cDNAs) ; Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988) (소과의 β 카제인 ) ; Alexander et al., Eur. J. Biolchem. 178, 395-401 (1988) (소과의 κ카제인) ; Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexnder et al., Nuclic Acids Res. 17, 6739 (1989) (소과의 β 락토글로부린); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987) (소과의 α-락트알부민)(전체적으로 모든 용도에 대한 참조로서 언급). 다양한 젖단백질 유전자의 구조와 기능은 Mercier & Vilotte, J.Dairy Sei. 76, 3079-3098(1993)에 의해 검토되었다. 부가적인 배열 데이타의 한도까지 면밀히 조사한 바대로 현재의 배열를 사용하여 즉시 복제될수 있다. 다른 유기체로부터 유선 특정 제어배열은 마찬가지로 알려진 동종의 뉴클레오티드 배열 또는 조사한 바대로, 같은 종류의 단백질에 대한 항체를 사용한 그러한 유기체로부터 스크리닝 라이브러리에 의해 얻어진다.
일반적인 수단과 유선으로 리콤비넘트 단백질의 형질발현을 목표로한 αS1-카제인 조절 배열을 소비하는 DeBoer et al., WO 91/08246과 WO 93/25567에서 보다 상세히 기술되어져 있다.(전체적으로 모든 용도로서의 참조로 언급함). 다른 유선 특정 유전자로부터 조절 배열을 소비하는 유전자전이의 예들은 또한 서술되어 진다. Simon et al., Bio/Technology 6, 179-183 (1988) 및 WO88/ 00239 (1988) 참조. (양에서의 발현을 위한 β-락토글로부린 조절 배열) ; Gordon, Biotechnology 5, 1183 (1987) (쥐에서 의 발현을 위한 WAP 조절 배열 ) ; WO 88/ 01648 (1988) 및 Eur. J. Biochem. 186, 43-48 (1989) ( 쥐에서의 발현을 위한 α-락트알부민 조절 배열) (전체적인 목적을 위한 참조로서 언급됨)
유전자전이로부터 젖에서 리소조옴 단백질의 형질발현은 co-형질발현 또는 번역후의 변이에 수반된 유전자의 기능적 비활성(즉, 압도적)과 리소조옴 단백질의 목표에 의해 영향을 받는다. 예에서 데이터는 놀랍게도 유선이 이미 고레벨에서 단백질을 함유하는 만노즈 6-인산의 분비와 수집을 위해 충분한 양으로 변이효소를 발현한 것을 나타낸다. 그러나, 고레벨에서 이러한 단백질은 발현하는 몇몇 유전자전이 포유류에서, 그것은 때때로 유전자전이 형질발현으로부터 유래한 추가한 효소와 작용효소의 내인성레벨을 추가하는 것이 바람직하다. 그러한 유전자전이는 리소조옴 단백질 암호 배열을 대신하여 작용효소 암호 배열에 대하여 논의되었던 것에 대한 유사원리를 사용하여 구성되어져 있다. 번역후 작용효소는 분비되어지는 것이 일반적으로 필요하지 않다. 그래서 리소조옴 단백질 암호 배열에 연결된 분비 시그널 배열은 분비없이 소포체로 작용효소를 목표로 하는 시그널 배열로 교체되어 진다. 예를들면, 시그널 배열은 일반적으로 이들 효소가 적당하다는 것이 연상된다.
D. 유전자전이화
상기 기술된 유전자전이는 비인류 포유류에 삽입되어 있다. 쥐, 토끼같은 설치류, 양, 염소같은 양류, 돼지같은 돼지류 소, 물소같은 소과를 포함한 대부분 비인류 포유류는 적당하다. 소과는 쥐가 유전자전이화와 번식의 수월함의 장점을 제공함에 반하여 토끼는 이러한 장점의 절충안을 제공한다. 한 마리의 토끼는 약 14%의 단백질 함유량으로 일당 100㎖의 젖을 생산할 수 있고 (참고 Buhler et al., Bio/Technology 8,140(1990)) (전체적으로 모든 목적을 위한 참조로서 언급됨) 여전히 쥐처럼 유사한 용이성으로 동일한 원리를 사용하고 다루어지고 번식시킬 수 있다. 젖의 많은 수득율의 장점을 제공한다. 가시 특성의 개미핥기 또는 오리너구리 같은 비태생 포유류는 대표적으로 사용되어지지 않는다. 유전자전이화의 몇몇 방법에서 유전자전이는 수정된 난모세포의 전핵내로 삽입된다. 쥐와 토끼와 같은 몇몇동물을 위해 수정작용이 생체내에서 실행되고, 수정된 난자는 외과적으로 이동되어 진다. 다른 동물에서 특히 소과는 생존하거나 도살장 동물로부터 난자를 이동하고 시험관내에서 난자를 수정하는 것이 바람직하다.
DeBoer et al., WO 91/08216 참조. 시험관내에서의 수정은 유전자전이가 편입을 위해 세포순환의 최적상태에서 실제적으로 동조 세포내로 개입되어지는 것을 가능케 한다.(s-상태보다 늦지 않다. 유전자 전이는 대개 전이에 의해 개입되어진다. 참조 VS 4,873,292 수정된 난모세포는 이식전 배가 약 16∼150세포를 함유하여 얻어질때까지 시험관내에서 그때 배양된다. 배의 16∼32세포시기는 상실배로서 기술된다. 32세포보다 더 많이 함유하고 있는 이식전배는 배반포라고 칭해진다. 이러한 배는 대표적으로 64세포 시기에서 포배강 구멍의 발달을 나타낸다. 수정된 난모세포를 이식전 시기에서 배양하는 방법은 Gordon et al., Methods Enzymol, 101, 414(1984)에 의해 기술된다. 101, 414 (1984); Hogen et al., Manipulation of the Mouse Embryo : A Laboratory Manual, C.S.H.L. N Y. (1986)(쥐의 배); 및 Hammer et al., Nature 315, 680 (1985) (토끼와 돼지의 배); Gandolfi et al. J. Reprod. Fert. 81, 23-28(1987); Rexroad et al., J.Anim. Sci. 66, 947-953(1988)(양의 배) 및 Eyestone et al. J. Reprod. Fert. 85, 715-720 (1989) ; Camous et al., J. Reprod. Fert. 72, 779-785 (1984) ; 그리고 Heyman et al. Theriogenology 27, 5968 (1987) (소의배) (전체적으로 모든 목적을 위한 참조로서 언급됨통합) 때때로 이식전 배는 이식될 때 까지는 시기를 위해 냉동상태로 저장되어 진다. 이식전 배는 유전자전이의 탄생으로 귀착되는 가임신 암컷 또는 유전자전이가 통합돠었을때 발달단계에 의존하는 키메라 포유류의 수란관으로 이동되어 진다. 키메라 포유류는 진정한 생식계열 유전자전이 동물을 형성하기 위해 양육되어질 수 있다.
선택적으로, 유전자전이는 난소 스텐 세포(Es)내로 개입되어질 수 있다. 이들 세포들을 비트로에서 배양된 이식전 배로부터 얻어진다. Bradley et al., Nature 309, 255-258(1984) 참조. (전체적으로 모든 목적을 위한 참조로서 언급됨). 유전자전이는 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 현미주사에 의해 그러한 세포내로 주입되어질 수 있다. 변형된 ES세포는 비인류 동물로부터 배반포와 결합되어진다. ES세포는 배를 이식하고 몇몇 배는 키메라 동물과의 생식계열을 형성한다. Jaenisch, Science, 240, 1468∼1474(1988) 참조(전체적으로 모든 목적을 위한 참조로서 언급됨). 선택적으로, ES세포는 유전자전이 포유류를 낳는 수정된 난모세포에서 세포핵을 제거하는 이식을 위한 소핵의 근원으로서 사용될 수 있다.
두 개 또는 그 이상의 유전자전이를 포함하는 유전자전이 동물의 생산을 위해 유전자전이는 단일 유전자전이에 관해서 동일 절차를 순간적으로 사용하여 개입되어 질 수 있다. 선택적으로, 유전자전이는 분리된 동물에 초기에 개입되어질 수 있고 그때 동물을 번식함에 따라 동일 게놈안에서 결합되어진다. 선택적으로 첫 번째 유전자전이 동물은 유전자전이의 하나를 함유하여 생산된다. 두 번째 유전자전이는 그때 수정된 난자 또는 그 동물로부터 난자 스텐세포내에 개입되어진다. 어떤 구성화에서, 길이가 딴 방법으로 약 50Kb를 초과하는 유전자전이는 중복단편으로서 구성되어진다. 그러한 중복 단편은 수정된 난모세포 또는 난자 스텐세포에서 동시에 개입되어지고 생체내에서 상동 재결합을 겪는다. Kay et al., WO 92/03917 참조 (전체적으로 모든 목적을 위한 참조로서 언급됨)
E. 유전자전이 포유류의 특징.
본 발명의 유전자전이 포유류는 상기 기술한 바대로 최소한 하나의 유전자전이로 통합한다. 유전자전이는 최소한 현저하게 유선에 대한 리소조옴 단백질을 암호화하는 DNA 단편의 형질발현을 목표로 한다. 놀랍게도, 유선은 올리고사카라이드 첨가와 인산화의 단계를 포함한 확실한 번역후 과정을 위해 요구된 단백질을 발현할 수 있다. 유선에서 효소에 의한 과정은 만노즈기의 6′위치의 인산화로 귀착한다.
리소조옴 단백질은 최소한 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000 ㎍/㎖의 고레벨에서 분비될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 유전자전이 포유류는 실질적으로 정상적인 건강상태를 나타낸다. 유선과는 다른 조직에서 리소조옴 단백질의 2차적인 형질발현은 해로운 효과를 유발하는 충분한 정도를 일으키지 않는다. 게다가, 유선에서 생성된 외인성 리소조옴 단백질은 어떤 중요한 문제가 분비장치를 방해하는 부착물에 의해 존재하지 않는 충분한 효과로서 분비되어 진다.
유전자전이 포유류가 젖 생산을 시작할 수 있는 시기는 물론 동물의 성질에 따라 변화한다. 유전자전이 쥐의 시기가 약 5∼6주임에 반하여 유전자전이 소과를 위하여 그 시기는 약 2년반, 또는 호르몬 자극으로 6개월, 물론, 단지 종의 암컷 멤버는 젖을 생산하기에 유용하다. 그러나, 유전자전이 수컷은 또한 암컷 자손을 번식하기 위하여 가치가 있다. 유전자전이 수컷으로부터의 정액은 비트로에서 연속적인 수정과 암컷 자손의 세대를 위하여 냉동상태로 저장되어 질 수 있다.
F. 젖로부터 단백질의 회수
유전자전이 성인 암컷 포유류는 외인성 리소조옴 단백질의 고농도를 함유하는 젖을 생산한다. 단백질은 원할 경우, 물리적·화학적 성질의 차이에 의하여, 그리고 침전과 표준정제절차, 이온변화, 크로마토그라피에서 분자 추출 또는 친화력의 힘으로 젖로부터 정제되어질 수 있다. 일반적으로 Scopes, Protein Purification 참조 (Springer - Verlag, N. Y., 1982)
G.조환형 리소조옴 단백질의 용도
본 발명에 의하여 생산된 조환형 리소조옴 단백질이 효소 교환 치료절차에서 사용됨이 발견되었다. 유전학적으로 또는 기능적인 리소조옴 효소의 불충분으로 귀착되는 다른 결핍을 갖고 있는 환자는 외인성 효소를 투여함으로서 치료될 수 있다. 그러한 치료의 필요에서 환자들은 증상으로부터 확인되어질 수 있다(예를 들면 소인증을 포함한 훌러 신드롬증상, 각막의 흐림, hepatosplenmegaly, 심장판막의 장해, 신장의 관상동맥장애, 골격기형, 관절경직 그리고 진행성 정신지체). 선택적으로 또는 부가적으로, 특별한 리소조옴 효소 또는 특별한 리소조옴 효소 활성의 결핍을 나타내기 위한 인공의 또는 천연기질을 사용한 효소분석에 의해 처리된 특색을 이루는 대사물의 과도한 축적을 알리기 위하여 환자는 조직샘플의 생화학분석으로부터 진단될 수 있다. 대부분의 병을 위해 진단은 특별한 효소결핍을 측정함으로써, 또는 증상발생 전 또는 대사물의 과도한 축적 전에 DNA 분석에 의하여 이루어질 수 있다 (Scriver et al., supra, chapters on lysosomal storage disorders). 모든 리소조옴 축적병은 유전성이다. 그래서, 리소조옴 병으로부터 고생하는 사람을 소유하고 있는 것으로 알려진 가족에 대해서, 때때로 명확한 진단이 내리기 전이라도 예방치료를 시작하는 것이 적절하다.
몇몇 방법에서 리소조옴 효소는 운반체와 함께 정제된 형태로 공급되어진다. 약물 구성으로서 선호된 형태는 투여의 의도된 방법과 치료적인 약의 사용에 의존한다. 약물의 운반체는 무엇이든지 조화되어질 수 있는데 비독성 물질은 환자에게 폴리펩티드를 송달하기에 적당한다. 살균한 물, 알콜, 지방, 왁스 그리고 비활성 용액은 운반체로서 사용되어질 수 있다. 약학적으로 용납되는 보조제, 완충제, 분산제등과 같은 종류의 것은 또한 약물의 구성에 포함될 수 있 있다.
약물의 구성에서 효소의 농도는 넓게 변이할 수 있다. 즉, 중량 약 0.1% 보다 적은것부터 중량 20% 또는 더 많은것 까지 대개는 최소한 중량 약 1%이다.
경구복용을 위해, 활성성분은 캡슐, 정제, 파우더 같은 고체 복용형태 또는 농축액, 시럽 그리고 현탁액같은 액체복용 형태로 복용되어질 수 있다. 활성성분은 비활성성분과 파우더로 된 담체와 함께 젤라틴 캡슐 캡슐로 보호될 수 있고, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 전분, 셀룰로오즈 또는 셀룰로즈 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아릭산, 소디움사카린, 활석, 탄산마그네슘 그리고 그와 같은 종류의 것과 같은 파우더로 된 담체로 될 수 있다. 부가적인 비활성 성분의 예들은 바람직한 색, 냄새, 안정성, 완충제용량, 산란 또는 다른 알려진 바람직한 형상들은 적색산화철, 실리카겔, 소듐 라우릴 설페이트, 이산화티타니움, 식용의 배색잉크등과 같은 것을 제공하도록 부가될 수 있다. 유사한 희석제는 압축된 평판을 만들기 위하여 사용될 수 있다. 알약과 캡슐 양자는 여러시간에 걸친 약품의 연속적인 제공을 위하여 지연적인 방출 생산물로서 제조되어질 수 있다. 압축된 알약은 어떤 불쾌한 냄새를 감추고 대기로부터 알약을 보호하기 위하여 설탕이나 필름으로 입혀질 수 있거나 위장관에서 선택적인 분해를 위해 장내사용 피복이 입혀질 수 있다. 경구의 투약을 위한 액체 투약형태는 환자의 복용감을 증가시키기 위하여 색과 맛내기를 함유할 수 있다.
정맥내의 주입을 위한 대표적인 구성은 살균한 0.9% Nacl의 100에서 500㎖ 또는 20% 알부민 용액으로 임의로 보충된 5% 글루코즈 그리고 효소의 100에서 500㎎을 포함하기 위하여 조제될 수 있을 것이다. 근육내 주입을 위한 대표적인 제약구성은 예를들면 살균한 완충수 1㎖와 본 발명의 정제된 리간드 10㎎을 포함하여 조제될 수 있다. 비경구적으로 투여 가능한 합성물을 조제하기 위한 방법은, 공지된 것이며, 예를 들면 Remington’s pharmaceatical Science(15th ed. Mack Publishing, Easton, PA. 1980)를 포함한 여러문헌에서 보다 상세히 기술되어 있다. (전체적으로 모든 용도를 위한 참조로서 언급됨)
본 발명의 약학적 조성물은 대개 정맥주사로 투여된다. 피부내, 근육내 또는 경구의 투여도 마찬가지로 어떤 상황에서 가능하다. 이 조성물은 리소조옴 효소결핍병의 위험상태에서 또는 이로 인해 고통받는 개인의 예방적 치료를 위해 투여된다. 치료제로서의 적용을 위하여, 약학적 조성물은 축적된 대사산물의 농도를 감소하도록, 또는 예방 또는 대사산물의 더 많은 축적을 막기 위하여 충분한 양으로 만성병으로 고생하는 환자에게 투여될 수 있다. 리소조옴 효소 결핍증의 위험을 가지는 개인을 위해 약학적 조성물은 대사산물의 축적을 예방하거나 금하기 위해 충분한 양으로 예방적으로 투여되어진다. 이를 달성하기 위한 적당한 양은 "치료학적으로" 또는 "예방학적으로 효과적인 1회의 복용량"으로서 한정된다. 그러한 효과적인 1회분의 투약량은 조건의 엄격성과 환자의 일반적인 건강상태에 의존할 것이나 체중의 ㎏당 정제된 효소의 약 0.1부터 10㎎까지 일반적으로 분포되어 있을 것이다.
유전자전이 동물의 젖에서 생산된 리소조옴 단백질은 많은 다른 용도를 가진다. 예를들면, 다른 α-아밀라아제와 마찬가지로 α-글루코시다아제는 전분, 맥주, 그리고 조제의 생산에서 중요한 도구이다. 참조, Vihinen & Mantsala, crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 329-401(1989) (전체적으로 모든 용도에 대한 참조로서 언급됨). 리소조옴 단백질은 화학실험에 관한 생성물 또는 식품생성물에 유용하다. 예를들면, 산성α-글루코시다아제는 1,4 및 1,6 α-글루코시드 결합체를 감성하고 글루코즈를 생산하기 위하여 말토즈, 이소말토즈 전분 그리고 글리코겐 같은 결합을 포함한 여러 탄수화물의 감성을 위해 사용되어 질 수 있다. 산성 α-글루코시다아제는 또한 장내의 말타아제 또는 이소말타제가 결핍된 환자에게 투여하기에 유용하다. 소화되지 않은 말토즈의 존재로부터 유발된 다른 증상들은 피해진다. 그러한 약의 사용에서, 효소는 그러한 젖(e.g., 아이스크림 또는 치즈)로부터 유도된 음식산물로서 젖로부터 첫 번째 분별없이 또는 조제의 구성물로서, 정제된 조환형 리소조옴 효소는 또한 조직샘풀에서 그러한 효소의 미지의 특성을 분석하기 위한 특징적인 키트에 대한 제어로서 함유물에 유용하다.
실시예 1: 유전자전이의 구조
(a) cDNA 구조
인간의 산성 α-글루코시다아제를 암호화하는 cDNA를 함유하는 형질발현 벡터의 구조는 플래즈미드로부터 시작된다. (참조, DeBoer et al. (1991)&(1993), 상기). 이 플래즈미드는 소과의 αS1-카제인 제어배열을 포함한다. 모체 플래즈미드의 삽입물 이온결합단백질 cDNA는 도 1에서 보여진 것처럼 형질발현 카세트의 ClaⅠ부위와 SalⅠ부위에서 α-글루코시다아제 cDNA 단편 플래즈미드 pSHAG2 Cid.) 인간 α-글루코시다아제를 암호화한 완벽한 cDNA를 포함한 인산 산성α-글루코시다아제를 위해 변화되었다 (Hoefsloot et al. EMBO J.7, 1697-1704(1998)). α-글루코시다아제 DNA 단편의 말단에서, 인류의 α-글루코시다아제를 암호화하는 완전한 cDNA를 함유하는 플래즈미드 pSHAG2 (id.)에서 적합한 제한부위를 얻기 위한 것은 EcoRI와 SphI 와 3.3kb c-DNA-단편과 함께 소화되어 졌고 벡터 뉴클레오티드 배열내에서 파괴된 ClaI 부위와 새롭게 디자인된 폴리린터(polylinter) : Hind III ClaI EcoRI SphI XhoI EcoRI SfiI SfiI/SmaI NotI EcoRI*(*= 파괴된 위치) 와 함께 pKUN7△C, pKUN1 유도제(Konings et al., Gene 46, 269-276 (1986))에서 하부복제되었다. 플래즈미드 pαgluCESX 결과로부터 3,3-kb cDNA단편은 ClaⅠ와 XhoⅠ에 의해 절개될 수 있다. 이러한 단편은 ClaⅠ 부위와 XhoⅠ-(compatible)SalⅠ 부위에서 도 1 에서 나타낸 형질발현 카세트내로 삽입되었다. 결과적으로 형질발현 플래즈미드 p16,8αglu는 도 1에서 보여진 것과 같은 소과의 αS1-카제인 배열에 의해 측면에 정해진 인강의 산성 α-글루코시다아제를 암호화하는 cDNA 배열로 이루어져 있다. 완성된 형질발현 카세트를 포함한 27.3-kb 단편은 NotⅠ로 분할에 의해 절개되어질 수 있다. (도 1 참조)
(b)게놈구조
구조 c8αgluex1은 인간의 산성 α-글루코시다아제 유전자를 포함한다.(Hoefsloot et al., Biochem, j. 272, 493-497(1990); exon 1에서 전사개시 부위의 바로 아래로 출발(도 2 패널 A 참조) 그러므로, 구조는 인간의 산성 α-글루코시다아제 유전자의 거의 완전한 5′UTR를 암호화한다. 이 단편은 소과의 αS1-카제인 유전자의 프로모터 배열에 융합되어졌다. αS1-카제인 개시 부위는 αS1-카제인/산성α-글루코시다아제 합체의 위로 22bp에 존재한다. 구조물은 인간의 산성 α-글루코시다이제 폴리아데닐레이션 시그널과 3′측면 배열을 가진다. 구조물 c8αgluex2는 인간의 산성 α-글루코시다아제 유전자의 exon 2에서 번역개시부위에즉시 융합된 소과의 αS1-카제인 프로모터를 포함한다. 그래서 αS1-카제인 전사개시부위와 α-글루코시다아제 번역 개시부위는 이 구조물에서 22-bp 떨어져 있다. 그러므로 어떠한 α-글루코시다아제 5′UTR도 보전되지지 않는다. 이 구조물은 또한 인간의 산성 α-글루코시다아제 폴리아데닐레이션 시그널과 도 2, 패널 B에서 나타낸 바와 같이 3′측면 배열을 포함한다.
구조물 c8, 8αgluex 2-20은 단지 3′부위에서 구조물 c8αgluex2과 다르다. exon 20에서 SphⅠ 부위는 인간의 산성 α-글루코시다아제 구조물에 b·소과의 αS1-카제인 3′배열을 융합하기 위하여 사용되어졌다. 폴리아데닐레이션 시그널은 이 3′αS1-카제인 배열에 위치된다. (도 2, 패널 c)
게놈구조의 구성을 위한 방법
인간의 산성α-글루코시다아제 유전자를 포함한 3개의 인접한 BglⅡ단편은 상기 Hoefsloot et al.에 의해 분리되었다. 이러한 단편들은 주문에 따라 만들어진 폴리링커와 함께 pKUN8△c, pKUN7△c 유도제의 BglⅡ-부위에서 결찰된진다. 즉 HindⅢ ClaⅠ stuⅠ SstⅠ BglⅡ PvnⅠ NcoⅠ EcoRⅠ SphⅠ XhoⅠ SmaⅠ/sfiⅠ NotⅠ EcoRⅠ*(*=파괴되어진 위치) 이러한 결찰은 플래즈미드 p7·3αgluBES, p7·3αgluBSE, p8·5αgluBSE, p8·5αgluBES, p10αgluBSE 그리고 p10αgluBES를 발생시키는 단편의 두배향으로 귀착되어진다. 형질발현 카세트의 끝에서 유일한 NotⅠ-부위가 현미주사를 위해 사용된 단편의 분리를 위해 뒤에 사용되어지기 때문에, 인간의 산성 α-글루코시다아제의 인트론 17에서 intragenic NotⅠ 부위는 파괴되어져야만 한다. 그러므로 p10αgluBES는 ClaⅠ와 XhoⅠ함께 소화되어진다. 즉 3′α-글루코시다아제말단을 함유하는 단편은 분리되어졌다. 이 단편은 pKUN10△C의 ClaⅠ와 XhoⅠ부위에 삽입되어 졌고pKUN10△C의 ClaⅠ와 XhoⅠ부위에서 삽입되어 졌고 p10αglu△NV로 끝난다. D121 pKUN10△C(즉, pKUN8△C의 유도제)는 NotⅠ과 함께 pKUN8△C를 소화함으로써, 끈적거리는 말단에 클레노우(Klenow)로 충전함으로써 그리고 직후에 둔탁한 말단 결찰에 의해 플래즈미드를 달구어 서서히 식힘으로써 얻어질 수 있었다. 마지막으로, p10αglu△NV는 NotⅠ과 함께 소화되어졌다. 이러한 끈적거리는 말단은 또한 Klenow로 채워졌고 단편은 결찰되어졌고 플래즈미드 p10αglu△NotⅠ로 끝난다.
c8αgluex1의 구성
α-글루코시다아제 유전자의 첫 번째 exon에서 SstⅠ부위는 소과의 αS1-카제인 배열에 대한 융합을 위해 정선되어졌고 p8.5αgluBSE는 SstⅠ와 함께 부분적인 소화에 의해서 뒤이어 BglⅡ과 함께 소화되어졌다. exon 1-3을 함유한 조작은 pKUN8△C의 BglⅡ와 SstⅠ 부위에서 분리되고 결찰되어졌다. 그 결과 플래즈미드는 p5`αgluex로 명명되었다(도 3, 패널 A 참조).
다음 단계 (Fig.3. panel B)는 p5`αgluexl에 대한 3′부분의 결찰이었다. 첫째, p10αglu△N은 BglⅡ와 BamHⅠ와 함께 소화되었다. exon 16-20을 포함한 단편은 격리되었다. 둘째, p5`αgluex은 BglⅡ와 함께 소화되어졌고 자기결찰을 예방하고 끈적거리는 BglⅡ 말단을 탈인산화하기 위하여 포스포릴라아제(BAP)로 처리되어졌다. BamHⅠ 끈적거리는 말단은 BglⅡ끈적거리는 말단과 양립하고 이러한 말단은 서로 결찰된다. 그 결과 플래즈미드, 즉 p5`3`αgluexl이 선택되었다. 이 플래즈미드는 최후의 구조물 단계에 유효한 유일한 BglⅡ 부위를 가진다(도 3, 패널 B 와 C 참조).
α-글루코시다아제 유전자의 중간부분은 후자의 구조내로 삽입되었다. 이 단계를 위하여, p7.3αgluBSE는 BglⅡ와 함께 소화되었고, 8.5-kb 단편은 분리되고, 소화되고 탈인산화된 p5`3`αgluex1 플래즈미드인 BglII에 결찰되었다. 그 결과 플래즈미는 pαgluexl이다(도 3, 패널 C 참조)
소과의 αSl-카제인 프로모터 배열은 3개의 단편을 수반하는 결찰을 거쳐 다음 단계에서 통합되어졌다. pWE1.5 코즈미드 벡터는 NotⅠ과 함께 소화되었고 인산화되었다. 소과의 αSl-카제인 프로모터는 8Rb NotⅠ-ClaⅠ단편으로서 분리되었다(상기 de Boer al., 1991. 참조). 인간의 산성α-글루코시다아제 단편은 동일효소를 사용한 pαgluexl 로부터 분리되었다. 이러한 3개의 단편은 결찰되었고 1046 E.coli host 세포에서 Stratagene GigapackⅡ kit를 사용하여 한묶음으로 되었다. 그 결과 코즈미드 c8αgluexl은 E.coli strain DH5α에서 번식되어졌다. 벡터는 마이크로 주사전에 NotⅠ와 함께 선형화되었다.
c8αgluex2와 c8,8αgluex 2-20의 구성
다른 두 형질발현 플래즈미드(Fig.2, panel B 와 C)의 구성은 c8αgluexl의 것과 유사한 방법을 따랐다. 플래즈미드 p5`αgluStuⅠ 은 StuⅠ과 함께 플래즈미드의 효소에 의해 p8, 5αgluBSE로부터 유도되었고 exon 2-3과 벡터 배열을 포함한 분리된 단편의 자기결찰에 의해 뒤따라졌다. 플래즈미드 p5`αgluStuⅠ은 여러단편으로 귀착된 NcoⅠ과 함께 선형 단편의 부분적 소화에 의해 뒤따라진 pglⅡ과 함께 소화되었다. exon 2와 3을 포함한 2.4kb 단편은 분리되었고 벡터 pKUN12△C의 NcoⅠ과 BglⅡ부위 내에서 결찰되고 p5`αgluex2로 끝난다. pKUN12△C는 polylinker 즉 ClaⅠ NcoⅠBalⅡ HindⅢ EcoRⅠ SphⅠ XhoⅠ SmaⅠ/SfiⅠ NotⅠ를 포함한 pKUN8△C의 유도체임을 주목한다.
플래즈미드 p10αglu△NotⅠ은 BalⅡ과 HindⅢ과 함께 소화되어졌다. 엑손 16-20을 포함한 단편은 분리되고 BalⅡ과 HindⅢ과 함께 소화된 p5`αgluex2에서 결찰되었다. 그 결과 플래즈미드는 p5`3`αgluex2였다. p5`3`αgluex2에서 중간 단편은 pαgluexl으로서 삽입되었다. 이를 위해, p7.3αglu는 BalⅡ과 함께 소화되었다. 그 단편은 분리되고 소화된 BalⅡ과 탈인산화된 p5`3`αgluex2에 결찰되었다. 결과 플래즈미드, pαgluex2는 c8αgluex-20과 c8, 8αgluex2-20의 구성에서 사용되었다(도 2, 패널 B 와 C).
3개의 형질발현 플래즈미드 c8, 8αgluex2-20(Fig.2, panel c)의 구성을 위하여 α-글루코시다아제의 3′측면 부위는 삭제되었다. 이를 달성하기 위하여 pαgluex2는 SphⅠ과 함께 소화되었다. exon 2-20을 포함한 단편은 분리되고 자기결찰되어 pαgluex 2-20으로 끝났다. 계속하여 소과의 αS1-카제인 유전자의 3′측면 부위를 포함하는 단편은 SphⅠ과 NotⅠ과 함께 소화에 의하여 p16,8αglu로부터 분리되었다. 이 단편은 pαgluex2-20-3αS1으로 귀착하는 polylinker 배열에서 SphⅠ 부위나 NotⅠ부위를 사용한 pαgluex2-20내에 삽입되었다.
c8, 8αgluex2-20을 발생하는 마지막 단계는 c8αgluex1에 이르는 구성에서, 최후의 단계에서 처럼 3단편의 결찰이다. pαgluex2-20-3′αS1과 pαgluex2에서 ClaⅠ 부위는 메틸화때문에 절개할 수 없는 것 처럼 보였기 때문에, 플래즈마는 E coli DAM(-) 스트레인 ECO343에서 번식되어야 했다. 그 스트레인(strain)으로부터 분리된 pαgluex2-20-3′αs1은 ClaⅠ와 NotⅠ과 함께 소화되어졌다. exon 2-20에 3′αs1-카제인 측면부위를 더해서 함유한 단편은 벡터 배열로부터 정제되었다. 이러한 단편, 소과의 αs1 프로모터 (참조 DeBoer(1991) & (1993), 상기)을 포함한 8kb NotⅠ-ClaⅠ단편과 소화된 NotⅠ, 탈인산화된 pWE15는 결찰되고 한 묶음으로 되어졌다. 결과 코즈미드는 c8, 8αgluex2-20이다.
코즈미드 c8αgluex2(Fig.2, panelB)는 몇 개의 다른 단계를 거쳐 구성되어졌다. 첫째, 코스미드 c8, 8αgluex2-20는 SalⅠ과 NotⅠ과 함께 소화되어졌다. αs1-프로모터와 산성 α-글루코시다아제 유전자의 엑손 2-6 부분을 포함한 10.5-kb 단편은 분리되었다. 둘째, 플래즈미드 pαgluex2는 산성α-글루코시다이제 유전자의 3′부분을 포함한 단편을 얻기 위하여 SaⅠ과 NotⅠ과 함께 소화되어졌다. 최후로, 코즈미드 벡터 pWE15는 NotⅠ과 함께 소화되고 탈인산화되었다. 이러한 3개의 조작은 결찰되고 한 묶음으로 되었다. 결과 코즈미드는 c8αgluex2이다.
실시예 2 : 유전자전이화
cDNA와 게놈 구조는 NotⅠ과 함께 선형화되고 수정된 쥐 난모세포의 전핵에 주입되어졌고 그때 가임신한 쥐(양모)의 자궁에 이식되어졌다. 자손은 잘라내어진 말미로부터 분리된 DNA의 Southern blotting 에 의하여 인간의 α-글루코시다아제 cDNA또는 게놈 DNA유전자 구조의 삽입을 위해 분석되어졌다. 유전자의 쥐는 선택되어지고 양육되어졌다.
NotⅠ과 함께 선형화된 게놈구조는 또한 수정된 토끼 난모세포의 전핵에 주입되어졌고 양모인 가임신 토끼의 자궁에 이식되었다. 자손은 Southern blotting 에 의하여 α-글루코시다아제의 삽입을 위해 분석되어졌다. 유전자전이 토끼는 선택되어지고 양육되어졌다.
실시예 3 : 유전자전이 쥐의 젖에서의 산성α-글루코시다아제의 분석
유전자전이 쥐로부터 생산된 젖와 비유전자전이적 제어는 Western Blotting에 의해 분석되어졌다. 그 시험은 인간의 산성α-글루코시다아제를 위한 종특유의 쥐 항체였다(즉 쥐 효소에 묶이지 않는다). 유전자전이 1672와 1673은 젖에서 인간의 산성 α-글루코시다아제의 형질발현을 보였다(Fig.4). 100-110 kD와 76kD에서 크고 작은 무리가 α-글루코시다아제를 위해 기대한 것처럼 관찰되어졌다. 비유전자전이의 쥐로부터 생산된 젖에서 어떤 무리도 관찰되지 않았다.
인간의 산성 α-글루코시다아제의 활성은 유전자전이의 쥐 계열의 젖에서 인조물질 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside와 함께 측정되었다(Galiaard, Genetic Metabolic Disease, Early Diagnosis와 Prenatal Analysis, Elsevier/North Holland, Amsterdam, pp. 809-827(1980)참조). cDNA 구조(Fig.1)를 포함한 쥐는 시간당 0.2에서 2μmol/㎖까지 변화했다. 게놈 구조(Fig.2, panel A)를 포함한 쥐계열은 시간당 10에서 610μmol/㎖ 레벨에서 발현되었다. 이러한 형상은 180μmol/㎎의 조환형 효소의 평가된 종특유의 활성에 근거한 0.05부터 3.3g/ℓ(게놈구조)와 1.3부터 11.3㎎/ℓ(cDNA구조)의 생산에 상당한다. (Van der ploeg et al., J. Neutrlo. 235:392-396(1988))
조환형 산성 α-글루코시다아제는 ConA-SepharoseTM과 SephadexTMG200에서 젖의 연속적인 크로마토그래피에 의하여, 유전자전이된 쥐의 젖로부터 분리되어졌다. 7㎖젖은 pH 6.6과 100mM Nacl. 인산나트륨 10mM를 함유하는 3㎖ Con A 완충액에서 Con A sepharose의 1:1 현탁액은 그때 첨가되어졌고, 젖은 완만하게 흔듦으로써 4℃에서 하룻밤 동안 방치되어졌다. 콘 A 세파로제 비드는 그때 원심에 의해 모여졌고 Con A 완충액으로 5번, 100mM 대신에 1M Nacl을 함유한 Con A완충액으로 3번, 100mM 대신에 0.5M Nacl을 함유한 Con A완충액으로 1번 씻겨지고 그때 0.5M Nacl과 0.1M 메틸-α-D-만노피라노시드를 함유한 Con A 완충액으로 용출된 샘플에서 산성α-글루코시다이제 활성은 인공적인 4-메틸룸베리페리(methylumbellifery)1-α-D-클리코피라노시드 물질(상기참조)를 사용하여 측정되어졌다. 산성 α-글루코시다이제 활성를 포함한 분별은 모여졌고 20mM 초산나트륨, pH 4.5와 25mM Nacl를 함유한 Sephadex 완충액에 대하여 농축되고 투석되어졌고 SephadexTM200컬럼에 적용되어졌다. 이 칼럼은 동일 완충액이 흐르게 되었고, 분별은 산성α-글루코시다아제 활성과 단백질 함유량을 위해 분석되어졌다. 산성 α-글루코시다아제 활성이 풍부하고 다른 단백질과 실제적으로 유리된 상기 기술된 방법은 본질적으로 Reuser et al., Exp. Cell Res. 155:178(79:1984)에 의해 출판된 것과 같다. 방법의 여러 가지 수정은 정확한 구성과 완충시스템의 pH와 정화단계의 수효의 선택과 컬럼물질의 선택에 대하여 가능하다.
젖으부터 정제된 산성α-글루코시다이제는 그때 GSDⅡ(외인성 산성 α-글루코시다아제가 결핍된)와 함께 환자로부터 배양된 섬유아세포까지 효소를 공급함으로써 인산화를 위해 시험되었다. 이 시험에서 단백질을 포함한 만노즈 6-인산은 섬유아세포의 세포표면에 만노즈 6-인산 수용체에 의해 결합되어지고 실질적으로 내재화된다. 그 결합은 유리된 만노즈 6-인산에 의해 억제되어진다(Reuser et al., Exp. Cell Res. 155:179-189(1984)). 유전자전이된 쥐의 젖로부터 분리된 산성 α-글루코시다아제의 인산화를 위한 대표적인 시험에서, 산성 α-글루코시다아제는 20시간의 기간 동안 시간당 4-methyl-umbelliferyl-α-D-glucopyranoside 1㎛ole을 신진대사시키기 위한 충분한 양으로 배양 매개물(Ham F10, 10% 태아의 송아지 혈청과 3mM 파이프를 공급한) 500㎕에서 104- 106섬유아세포에 더해졌다. 그 실험은 (본질적으로 Reuser et al., 상기(1984)에 의해 기술된 바와 같음) 경쟁상대로서 5mM 만노즈 6-인산과 함께 또는 없이 수행되어졌다. 이러한 조건하에서, 환자 섬유아세포의 산성 α-글루코시다아제는 건강한 개체로부터 섬유아세포에서 측정된 레벨까지 재생되어졌다. 쥐젖로부터 분리된 산성 α-글루코시다아제에 의한 외인성 산성 α-글루코시다아제 활성의 재생은 소과의 고환, 사람의 오줌과 transfected (형질전환일종)된 CHO 세포의 매개물로 부터 정제된 산성 α-글루코시다아제에 의한 복원만큼이나 효과적이다. 젖로 부터 α-글루코시다아제에 의한 복원은 다른 근원으로부터 생긴 α-글루코시다아제를 위해 관찰된 것 처럼 5mM 만노즈 6-인산에 의해 억제되어졌다. (Reuser et al., 상기 ; Van der ploeg et al., (1988), 상기 ; Van der pleog et al., Ped. Res. 24 : 90-94 (1988).
젖에서 생산된 α-글루코시다아제의 더 한층 확실한 증거로서, 쥐의 젖에서 생산된 조환형 α-글루코시다아제의 N-말단 아미노산 결합 서열은 AHPGRP로 출발한 Hoefsloot et al., EMBO J. 7 : 1697-1704 (1988)에 의해 출판된 인간의 오줌으로부터 생긴 α-글루코시다아제 전구체의 그것과 동일하게 되는 것을 보여주었다.
한편 선행발명은 명확성과 이해의 목적을 위해 다소 상세한 기술로써 표현되어져 왔다. 그것은 형식과 세부상황에 대한 다양한 변화가 이 발명의 진정한 범위로 부터 이 설명서를 읽음으로써 이 기술분야에서 숙련된 사람에게 명확해 질 것이다. 모든 공개와 이 출원에서 인용된 특허서류는 각각의 개별적인 공개 또는 특허서류가 매우 개별적으로 표시되는 것처럼 동일 정도까지 모든 목적을 위하여 전적으로 참고로써 통합되어진다.
Claims (20)
- 유선특이 프로모터와;유선특이 인핸서와;유전자전이된 비인류 포유류의 유선분비세포내의 기능성 시그널 펩티드를 암호화하는 분비 DNA 단편; 및프로모터와 인핸서에 기능성적으로 결합되는 분비-조환형 DNA단편을 형성하기 위하여 분비 DNA 단편에 기능적으로 결합된 리소조옴 단백질을 암호화하는 조환형 DNA 단편을 포함하여 구성되는 전이유전자를 가지며,비인류 포유류의 성장된 형태 또는 비인류 포유류의 암컷내에서, 상기 전이유전자는 유선분비세포에 의하여 리소조옴 단백질을 함유하는 만노즈 6-인산으로서 젖으로 제조 및 분비된 리소조옴 단백질의 형태를 생산하기 위하여 유선 분비세포내의 분비 조환형 DNA단편을 발현할 수 있는 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 1 항에 있어서, 리소조옴 단백질이 효소인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 2 항에 있어서, 젖내에서 리소조옴 단백질을 포함하는 만노즈 6-인산의 농도가 적어도 100㎍/㎖인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 1 항에 있어서, 리소조옴 단백질이 인류의 것인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 4 항에 있어서, 리소조음 단백질이 산성 α-글루코시다아제인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 5 항에 있어서, 쥐, 토끼, 염소, 양, 돼지 또는 소과의 동물인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 6 항에 있어서, 조환형 DNA 단편은 cDNA인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 6 항에 있어서, 조환형 DNA 단편은 게놈인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 6 항에 있어서, 조환형 DNA 단편은 cDNA-게놈 혼성세포인 비인류 유전자전이 포유동물.
- 제 1 항에 있어서, 분비 DNA 단편은 리소조옴 단백질 분비 DNA 단편인 유전자전이된 비인류 포유동물.
- 제 1 항의 유전자전이된 비인류 포유동물 또는 그의 암컷의 성장형태로 부터 젖을 회수하는 것을 포함하여 구성되는, 리소조옴 단백질을 포함한 만노즈 6-인산의 제공 방법.
- 제 11 항에 있어서, 음식물에 젖을 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 젖로부터 리소조옴 단백질을 함유한 만노즈 6-인산을 정제하는 것을 더욱 포함하여 구성되는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 만노즈 6-인산 리소조옴 단백질은 적어도 95% 순도로 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 정맥, 피내, 근육내 또는 경구내 투여를 위하여 약학적 담체와 인산화된 리소조옴 효소를 혼합하는 것을 더욱 포함하여 구성되는 방법.
- 제 1 항의 유전자전이된 동물의 젖으로서, 인산화된 리소조옴 단백질을 함유하는 젖.
- 제 16 항에 있어서, 리소조옴 단백질의 농도가 적어도 100㎍/㎖인 젖.
- 제 11 항의 방법에 의하여 제조된 리소조옴 단백질을 포함하는 만노즈 6-인산.
- 제 18 항의 리소조옴 단백질을 포함한 만노즈 6-인산 및 약학적 담체를 포함하여 구성되는 약학적 조성물.
- 제 19 항에 있어서, 약학적 담체는 정맥 내 투여용인 약학적 조성물.
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