PL184960B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowegoĆ polipeptydĆ gen hybrydowyĆ wektorĆ komórka sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptyduĆ układ ekspresyjnyĆ pożywka dla niemowlątĆ kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Abstract

1 Czasteczka kwasu nukleinowego kodujpolipeptyd bedacy wanantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawiona jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR 3 10 Polipeptyd beda y wanantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, któr y to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR 3 19 Gen hybrydowy zawierajmy czasteczke kwasu nukleinowego kodujaca polipeptyd bedacy wanantem lipazy stymulowanej solanu zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR 3 28 Zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierajacy gen hybiydowy zawierajasy czasteczke kwasu nukleinowego kodujaca poli- peptyd bedacy wanantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR. 3 39 Komórka bedaca nosicielem genu hybrydowego, któr y, zawiera czasteczke kwasu nukleinowego kodujaca polipeptyd bedacy wa- nantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR. 3 50 Sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu, znamienny tym, ze (1) dokonuje sie inscrcji czasteczki kwasu nukleinowego kodujacej polipeptyd bedacy wanantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, któr y to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR 3, do genu hybrydo- wego, zdolnego do replikacji w okreslonej komórce gospodarza albo w organizmie, (1 1) wprowadza sie ten rekombinantowy gen hybiydowy do komór ki gospodarza albo do organizmu, (111) identyfikuje sie i prowadzi sie wzrost wytworzonej komórki w lub na pozywce hodowlanej albo identyfikuje sie i reprodukuje sie organizm, w któr ym zachodzi ekspresja tego polipeptydu i (iv) odzyskuje sie ten polipeptyd. 70 Pozywka dla niemowlat zawierajaca modyfikowany polipeptyd, znamienna tym, ze jako modyfikowany polipeptyd zawiera poli- peptyd bedacy wanantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, któr y to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR.3 79 Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca polipeptyd jako czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienna tym, ze polipeptydem jest polipeptyd bedacy wanantem lipazy stymulowanej solami zólciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wanant BSSL zawiera czesc sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR 3 PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe polipeptydy będące wariantami lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL; EC 3.1.1.1). Wynalazek dotyczy również cząsteczek DNA kodujących te polipeptydy, półproduktów zawierających te cząsteczki DNA, a także sposobów wytwarzania tych wariantów BSSL.

Przedmiotem wynalazku są ponadto pożywki dla niemowląt zawierające mleko pochodzące od tych transgenicznych zwierząt. Wynalazkiem są też objęte kompozycje farmaceutyczne zawierające te polipeptydy i zastosowanie tych polipeptydów i cząsteczek DNA do wytwarzania leków.

Hydroliza lipidów pokarmowych

Lipidy pokarmowe są ważnym źródłem energii. Ponad 95 procent tych lipidów stanowią bogate energetycznie trójacyloglicerole. Niektóre lipidy, np. niektóre kwasy tłuszczowe oraz rozpuszczalne w tłuszczach witaminy są podstawowymi składnikami pożywienia. Przed absorcjąw układzie trawiennym trójacyloglicerole, pomniejsze składniki, np. zestryfikowane rozpuszczalne w tłuszczach witaminy oraz cholesterol i diacylofosfatydyloglicerole dla konwersji w produkty bardziej hydrofobowe i zdolne do absorpcji wymagają hydrolizy wiązań estrowych. Reakcje te są katalizowane przez specjalną grupę enzymów, zwaną lipazami.

U ludzi, za podstawowe lipazy uważa się lipazę żołądkową, lipazę zależną od kolipazy trzustkowej (hydrolizujące trój- i diacyloglicerole), trzustkową fosfolipazę A2 (hydrolizującą diacylofosfatydyloglicerol) i hydrolizę estrów karboksylowych (CEH; hydrolizującą estry cholesterolowe i estry witamin rozpuszczalnych w tłuszczach oraz trój-, dwu- i monoacyloglicerole). U noworodków karmionych piersią lipaza stymulowana solami żółciowymi (BSSL) odgrywa zasadniczą rolę w hydrolizie kilku z wyżej wymienionych lipidów. Razem z solami żółciowymi, produkty trawienia lipidów tworzą mieszane micele lub jednowarstwowe pęcherzyki (Hemell i wsp., 1990), z których odbywa się absorpcja.

Lipaza stymulowana solami żółciowymi

Lipaza stymulowana solami żółciowymi (BSSL) występuje jako składnik mleka u niewielkiej liczby gatunków, np. u ludzi, goryli, kotów i psów (Hemell i wsp., 1989; Hamosh i wsp., 1986). Zmieszana z żółcią w górnym odcinku jelita cienkiego, BSSL ulega swoistej aktywacji przez pierwszorzędowe sole żółciowe (Hemell, 1975). Lipaza BSSL, stanowiąca około 1% całkowitego białka mleka (Blackberg i Hemell, 1981) nie ulega degradacji podczas przechodzenia z mlekiem przez żołądek a w dwunastnicy jest chroniona przez sole żółciowe przed inaktywacją przez proteazy trzustkowe, takie jak trypsyna i chymotrypsyna.

Obróbka termiczna mleka ludzkiego (pasteryzacja w temperaturze 62,5°C przez 30 minut), inaktywująca całkowicie BSSL (Bjurksten i wsp. 1980), obniża u wcześniaków współczynnik absorpcji tłuszczu o około 1/3 (Williamson i wsp., 1978; Atkinson i wsp., 1981). Tak więc, pełniejsza utylizacja trójacyloglicerolu ze świeżego mleka ludzkiego w porównaniu z jego utylizacją z pożywek dla niemowląt o podobnym składzie tłuszczu wynika z występowania w nim BSSL (Hemell i wsp. 1991, Chapell i wsp., 1986).

184 960

BSSL jest lipazą niespecyficzną (EC 3.1.1.1), w tym znaczeniu, że hydrolizuje nie tylko trójacyloglicerol lecz również di- i monoacyloglicerol, estry cholesterolu i estry witamin rozpuszczalnych w tłuszczach (Blackberg i Hemell, 1983). Tak więc, po aktywacji, BSSL sama posiada właściwości hydrolizowania większości ludzkich lipidów mleka, chociaż najbardziej wydajna utylizacja trójacyloglicerolu mleka ludzkiego wymaga synergicznego działania lipazy żołądkowej (EC 3.1.1.3), lipazy trzustkowej zależnej od kolipazy (EC 3.1.1.3) i BSSL (Bemback i wsp., 1990).

Ostatnie badania wykazały, że ten enzym mleka ma szczególne znaczenie przy utylizacji długołańcuchowych polinienasyconych kwasów tłuszczowych u noworodków (Hemell i wsp., 1993). Te kwasy tłuszczowe są ważnymi prekursorami eikozanoidów i odgrywają rolę w rozwoju neuronów. Niemowlęta, zwłaszcza wcześniaki, mają ograniczone możliwości syntezy tych kwasów tłuszczowych z prekursorów. Są one zatem uznawane za podstawowe składniki pokarmowe dla niemowląt przez pewien okres po urodzeniu, dokładnie jeszcze nie zdefiniowany.

W ostatnich latach w kilku laboratoriach scharakteryzowano struktury cDNA zarówno dla lipazy występującej w mleku jak i dla trzustkowej hydrolazy estrów karboksylowych (CEH; E.C.3.1.1.1). Badania te prowadzili Baba i wsp.(1991), Hui i wsp. (1991), Nilsson i wsp. (1990) i Reue i wsp. (1991). Stwierdzono, że enzym występujący w mleku i enzym trzustkowy są produktem tego samego genu. Sekwencja cDNA i wyprowadzona z niej sekwencja aminokwasowa BSSL/gen CEH (SEQ ID NR: 1) są również ujawnione w opisach patentowych PCT, WO 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) i WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra).

BSSL jest glikoprotemąjednołańcuchową. Wyprowadzone białko (SEQ ID NR: 3) zawiera 722 reszty aminokwasowe i jest w wysokim stopniu zglikozylowane (Abouakil i wsp., 1989). N-końcowa połowa białka wykazuje ścisłą homologię do acetylocholinestreazy i niektórych innych esteraz (Nilsson i wsp., 1990).

Teoretyczne aktywne miejsce reszty seryny jest zlokalizowane w pozycji seryny -194. Sekwencja wokół tej seryny jest zgodna z sekwencją consensus aktywnego miejsca w serynohydrolazach. Pojedyncze teoretyczne miejsce N-glikozylacji jest usytuowane w odległości jedynie 7 reszt N-terminalnych od aktywnego miejsca seryny (Nilsson i wsp., 1990).

Sekwencja BSSL zawiera w swej części C-końcowej 16 bogatych w prolinę powtórzeń, z których każde jest złożone z 11 reszt aminokwasowych. Różnica w ilości powtórzeń wydaje się być głównym wytłumaczeniem różnic w masie cząsteczkowej i w składzie aminokwasowym występujących między odpowiednimi enzymami pochodzącymi z różnych gatunków (Han i wsp., 1987; Fontaine i wsp., 1991; Kyger i wsp., 1989). W tych powtórzeniach zawarta jest główna część z ogólnej zawartości 15-20% węglowodanów w stosunku do masy białka (Baba i wsp., 1991; Abouakil i wsp., 1989).

Unikalna różnica strukturalna między BSSL a typowymi esterazami leży w C-terminalnej części łańcucha polipeptydowego, to znaczy, w 16 bogatych w prolinę powtórzeniach, złożonych z 11 reszt aminokwasowych. Odpowiednie enzymy trzustkowe krowie i szczurze posiadają tylko odpowiednio 3 i 4 powtórzenia (Han i wsp., 1987, Kyger i wsp., 1989). Wysunięto zatem całkiem prawdopodobną hipotezę, że część C-końcową, a przynajmniej jej część, jest niezbędna dla funkcji tego białka jako lipazy, to znaczy, dla aktywności w stosunku do zemulgowanego długołańcuchowego trójacyloglicerolu.

Upośledzone wchłanianie lipidów

Częstymi przyczynami nieprawidłowego wchłaniania lipidów i w związku z tym niedożywienia, są obniżone poziomy w jelitach lipazy trzustkowej zależnej od kolipazy i/lub od soli żółciowych. Typowymi przykładami takich niedoborów lipazy są niedobory występujące u pacjentów z mukowiscydozą, powszechną wadą genetyczną prowadzącą do niedoborów występujących przez całe życie u 80% pacjentów i w przewlekłym zapaleniu trzustki, często w wyniku chronicznego alkoholizmu.

Obecne leczenie pacjentów cierpiących na niedobór lipazy trzustkowej polega na doustnym podawaniu bardzo dużych dawek surowego preparatu enzymów trzustkowych świni. Jednakże zależna od kolipazy lipaza trzustkowa ulega inaktywacji przy niskim pH w żołądku.

184 960

Inaktywacji tej nie można całkowicie przezwyciężyć przez podawanie ogromnych dawek enzymu. Tak duże dawki nie nadają się dla większości pacjentów a poza tym, preparaty te są zanieczyszczone i źle znoszone.

Opracowano przechodzące przez kwaśne obszary żołądka formy tabletkowe, z których uwalnia się enzym dopiero we względnie alkalicznym środowisku jelita czczego. U wielu pacjentów cierpiących na zaburzenia funkcji trzustki występuje jednak nienormalnie kwaśny odczyn w jelicie czczym i w tego typu przypadkach można nie uzyskać uwalniania enzymu z tabletek.

Ponadto, ponieważ dostępne obecnie na rynku preparaty są pochodzenia nieludzkiego, istnieje ryzyko reakcji immunologicznych mogących powodować niebezpieczne skutki u pacjentów lub zmniejszać skuteczność leczenia. Następną wadą znajdujących się na rynku preparatów jest to, że nie jest w nich ustalona zawartość innych aktywności lipolitycznych poza aktywnością lipazy trzustkowej zależnej od kolipazy. W rzeczywistości, większość z nich zawiera bardzo niskie poziomy aktywności BSSL/CEH. To może być jedną z przyczyn faktu, że wielu pacjentów cierpiących na mukowiscydozę, pomimo terapii uzupełniającej odczuwa braki witamin rozpuszczalnych w tłuszczach i podstawowych kwasów tłuszczowych.

Istnieje zatem ogromne zapotrzebowanie na produkty o właściwościach i strukturze wywodzącej się z lipaz ludzkich, o szerokiej swoistości wobec substratu, które to produkty mogłyby być podawane doustnie pacjentom, u których występuje niedobór jednego lub kilku trzustkowych enzymów lipolitycznych. Produkty, które można otrzymać przez zastosowanie niniejszego wynalazku odpowiadają, tym wymaganiom, zarówno same, jak i w kombinacji z preparatami zawierającymi inne lipazy.

Rekombinantowe warianty BSSL według wynalazku zachowały aktywność katalityczną ale mają mniej miejsc glikozylacji niż BSSL o pełnej długości, a zatem, są wytwarzane z potencjalnie zmniejszonym stopniem heterogenności węglowodanów. Ta mniejsza złożoność struktury ułatwia oczyszczanie i charakteryzację rekombinantowego białka, co będzie owocować w mniej kosztownej produkcji polipeptydów wykazujących aktywność BSSL.

W innym aspekcie, zmniejszony stopień glikozylacji pozwala na ograniczenie wymagań w stosunku do gospodarza, umożliwia większą produkcję w wielu rodzajach komórek gospodarzy. W jeszcze innym aspekcie, zmniejszona ilość miejsc glikozylacji w wariantach BSSL pozwala na wy^ajn^. produkcję w organizmach niższych eukariotów i zmniejsza ryzyko nieprawidłowej glikozylacji, co mogłoby nasilać reakcje immunologiczne. Zmniejszona wielkość i mniejsza złożoność glikozylacji daje wybór z szerszego zakresu gospodarzy niż w przypadku białka posiadającego bardzo złożone i ciężkie reszty węglowodanowe.

Zastosowanie lecznicze wariantu BSSL, który ma mniejszą wielkość ale jest równie aktywny oznacza, że do wzbogacenia pożywki potrzebna jest mniejsza masa substancji. Inną możliwą korzyścią stosowania rekombinantowych wariantów BSSL, które utraciły większość lub wszystkie O-zglikozylowane powtórzenia jest mniejsze ryzyko odpowiedzi immunologicznej u biorcy. Wynika to z faktu, że O-związane reszty cukrowe mogą wykazywać wysoką heterogenność, zależnie od komórki, w której zostały wytworzone.

W literaturze naukowej istnieją doniesienia, że natywny BSSL wiąże się z błoną śluzowąjelit, gdzie jest wchłaniany. Wariant BSSL wybrany pod kątem zmniejszonej wchłanialności, będzie aktywny w stosunku do lipidowych substratów pożywienia przez dłuższy okres czasu, co da bardziej wydajne trawienie wewnątrz światła jelit. Przykładami takich wariantów są cząsteczki o zmniejszonym stopniu zglikozylowania.

Jak wspomniano powyżej, przypuszcza się, że BSSL ma szczególne znaczenie w procesie utylizacji długo łańcuchowych polinienasyconych kwasów tłuszczowych (Hemell i wsp., 1993), co ma ogromne znaczenie dla rozwoju układu nerwowego noworodka i przyswajalności witaminy A. Odpowiedni wariant BSSL według wynalazku korzystniejszy w tych aspektach można wyselekcjonować w znany sposób. Obcięty albo skrócony enzym powinien wykazywać różnice w konformacji, mogące wpływać na swoistość wobec różnych substratów lipidowych.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 amino10

184 960 kwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SeQ ID NR: 3.

Korzystnie, koduje ona wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Równie korzystnie koduje ona wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, koduje ona wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Równie korzystnie koduje ona wariant BSSL zawierający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Równie korzystnie koduje ona polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5,6 albo 9.

Korzystnie, koduje ona polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencc^ aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.

Korzystnie, koduje ona polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowi przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 a^ninokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, posiada on w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, posiada on w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, posiada on w części C-terminalnej sekwencję aminokwasowi przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, zawiera on mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Korzystnie, jego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasowi przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, zawiera on sekwencję aminokwasową. przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Przedmiotem wynalazku jest także polipeptyd, którego sekwencja aminokwasową jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwenc^ aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek, które posiadają resztę asparaginy w pozycji 187. Korzystnie, zawiera on sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

Przedmiotem wynalazku jest także gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SeQ ID NR: 3.

Korzystnie, w genie hybrydowym według wynalazku wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, w genie hybrydowym według wynalazku wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, w genie hybrydowym według wynalazku wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, w genie hybrydowym według wynalazku wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

184 960

Korzystnie gen hybrydowy według wynalazku koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie gen hybrydowy według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Przedmiotem wynalazku jest także gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną, w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.

Korzystnie, w genie hybrydowym według wynalazku polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

Przedmiotem wynalazku jest także zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ED NR: 3.

Korzystnie, wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Korzystnie, wektor według wynalazku koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sek^e^^ją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, wektor według wynalazku koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, wektor według wynalazku jest wektorem wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.

Przedmiotem wynalazku jest także zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.

Korzystnie, wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, ze polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

Korzystnie, wektor według wynalazku jest wektorem wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka będąca nosicielem genu hybrydowego, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

184 960

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową. przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych. Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że kwas nukleinowy koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasową jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją, aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9. Korzystnie, komórka według wynalazku pochodzi z mysiej linii komórkowej C127 albo z E. coli.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka będąca nosicielem genu hybrydowego, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

Korzystnie, komórka według wynalazku pochodzi z mysiej linii komórkowej C127 albo z E. coli.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu charakteryzujący się tym, że:

(i) dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR:3, do genu hybrydowego, zdolnego do replikacji w określonej komórce gospodarza albo w organizmie, (ii) wprowadza się ten rekombinantowy gen hybrydowy do komórki gospodarza albo do organizmu, (iii) identyfikuje się i prowadzi się wzrost wytworzonej komórki w lub na pożywce hodowlanej albo identyfikuje się i reprodukuje się organizm, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu i (iv) odzyskuje się ten polipeptyd.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji SEQ ID NR 3.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL zawierający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako sEq ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się gen hybrydowy zawarty w wektorze wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu, znamienny tym, że: (i) dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej

184 960 polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją. aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187, do genu hybrydowego, zdolnego do replikacji w określonej komórce gospodarza albo w organizmie, (ii) wprowadza się ten rekombinantowy gen hybrydowy do komórki gospodarza albo do organizmu, (iii) identyfikuje się i prowadzi się wzrost wytworzonej komórki w lub na pożywce hodowlanej albo identyfikuje się i reprodukuje się organizm, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu i (iv) odzyskuje się ten polipeptyd.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający sekwencję amnokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako sEq ID NR:7.

Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się gen hybrydowy zawarty w wektorze wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.

Przedmiotem wynalazku jest także układ ekspresyjny obejmujący gen hybrydowy zdolny do ekspresji w komórce gospodarza albo w organizmie posiadającym ten hybrydowy gen, przy czym podczas ekspresji genu hybrydowego uzyskiwany jest rekombinowany polipeptyd, znamienny tym, że hybrydowy gen uzyskuje się przez insercję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, której to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR:3, do genu zdolnego do pośredniczenia w ekspresji tego genu hybrydowego.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasową jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Przedmiotem wynalazku jest także układ ekspresyjny obejmujący gen hybrydowy zdolny do ekspresji w komórce gospodarza albo w organizmie posiadającym ten hybrydowy gen, przy czym podczas ekspresji genu hybrydowego uzyskiwany jest rekombinowany polipeptyd, charakteryzujący się tym, że hybrydowy gen uzyskuje się przez insercję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, którego sekwencja aminokwasową jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187, do genu zdolnego do pośredniczenia w ekspresji tego genu hybrydowego.

Korzystnie, układ ekspresyjny według wynalazku charakteryzuje się tym, że wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ iD NR: 7.

Przedmiotem wynalazku jest także pożywka dla niemowląt zawierająca modyfikowany polipeptyd, charakteryzująca się tym, że jako modyfikowany polipeptyd zawiera polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.

184 960

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL posiadający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Przedmiotem wynalazku jest także pożywka dla niemowląt zawierająca modyfikowany polipeptyd charakteryzująca się tym, że modyfikowanym polipeptydem jest polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek, które posiadają resztę asparaginy w pozycji 187.

Korzystnie, pożywka dla niemowląt zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca polipeptyd jako czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że polipeptydem jest polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL posiadający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca modyfikowany polipeptyd charakteryzująca się tym, że modyfikowanym polipeptydem jest polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek, które posiadają. resztę asparaginy w pozycji 187.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.

W jednym z aspektów, przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd będący wariantem BSSL krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR:3.

184 960

Określenie „część sekwencji aminokwasowej” należy rozumieć jako określenie obejmujące zarówno pojedynczy aminokwas jak i sekwencję złożoną z kilku aminokwasów lub kilka takich sekwencji ze sobą związanych.

Określenie „wariant BSSL” oznacza polipeptyd wykazujący aktywność BSSL i zawierający część sekwencji aminokwasowej z ludzkiego BSSL zamieszczonego w wykazie sekwencji pod symbolem SEQ ID NR: 3.

Określenie „polipeptyd wykazujący aktywność BSSL” oznacza polipeptyd posiadający przynajmniej następujące właściwości:

(a) nadaje się do podawania doustnego, (b) jest aktywowany przez specyficzne sole żółciowe, (c) działa jak nieswoista lipaza w świetle jelita cienkiego, to znaczy ma zdolność hydrolizowania lipidów w sposób w zasadzie niezależny od ich struktury chemicznej i stanu fizycznego (np. stopnia zemulgowania, formy miceli, stanu rozpuszczenia), i ewentualnie jedną lub większą ilość następujących właściwości:

(d) zdolność hydrolizowania trójacylogliceroli posiadających reszty kwasów tłuszczowych o różnej długości łańcucha i o różnym stopniu nienasycenia, (e) zdolność hydrolizowania również estrów diacyloglicerolu, monoacyloglicerolu, cholesterolu, lizofosfatydyloacyloglicerolu oraz retinylu i innych rozpuszczalnych w tłuszczach estrów witamin, (f) zdolność hydrolizowania nie tylko wiązań estrowych sn-1(3) w trójacyloglicerolu lecz również wiązań estrowych sn-2, (g) zdolność interakcji nie tylko z pierwszorzędowymi lecz również z drugorzędowymi solami żółciowymi, (h) zależność optymalnej aktywności od soli żółciowych, (i) stabilność, w tym znaczeniu, że zawartość przewodu pokarmowego nie będzie w znaczącym stopniu wpływać na skuteczność katalityczną enzymu, (j) odporność na inaktywację przez proteazy trzustkowe, np. trypsynę, chyba, że są obecne sole żółciowe, (k) zdolność wiązania się z heparyną i z pochodnymi heparyny, np., z siarczanem heparanu, (l) zdolność wiązania na granicy faz: lipid - woda, (m) trwałość wystarczająca do przeprowadzenia liofilizacji;

(n) trwałość przy zmieszaniu ze składnikami pokarmowymi, takimi jak mleko albo mieszanki mleczne.

W następnych aspektach, przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego opisana powyżej, kodująca wariant BSSL posiadający resztę fenyloalaniny w pozycji C-terminalnej albo zawierający sekwencję Gln-Met-Pro w części C-końcowej albo sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty 712-722 na sekwencji SEQ ID NR: 3 w jej części C-końcowej.

W powyższym opisie, termin „pozycja C-końcowa” oznacza pozycję ostatniej reszty C-końcowej, natomiast termin „część C-końcowa” oznacza około 50 reszt aminokwasowych stanowiących koniec karboksylowy wariantu BSSL.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu nukleinowego opisana powyżej, kodująca wariant BSSL zawierający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych. Termin Jednostka. powtarzalna” oznacza jedną z powtarzalnych jednostek, z których każda jest złożona z 33 nukleotydów, przedstawionych w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 1.

W dalszych aspektach, przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego opisana powyżej, kodująca polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa wykazuje przynajmniej 90 procentową homologię z sekwencją aminokwasową przedstawioną na wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9, a także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa wykazuje przynajmniej 90 procentową homologię z sekwencją aminokwasową przedstawioną na wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem tych cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.

184 960

Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd przedstawiony na wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6, 7 albo 9 oraz polipeptyd kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego opisaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego opisaną powyżej, zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający ten gen hybrydowy i komórka posiadająca ten gen hybrydowy. Komórka ta może być komórką prokariotyczną, jednokomórkowym organizmem eukariotycznym albo komórką, pochodzącą z organizmu wielokomórkowego, np. ssaka.

W powyższym opisie, termin „gen hybrydowy” oznacza sekwencję kwasu nukleinowego zawierającą z jednej strony sekwencję kwasu nukleinowego kodującą wariant BSSL zdefiniowany powyżej, a z drugiej strony sekwencję kwasu nukleinowego genu pośredniczącego w ekspresji produktu tego hybrydowego genu. Termin „gen” oznacza cały gen oraz jego podsekwencje zdolne do pośredniczenia w ekspresji i kierujące ekspresję tego hybrydowego genu do odpowiedniej tkanki. Na ogół, taka podsekwencja posiada przynajmniej jeden region promotora, miejsce początku transkrypcji, regiony niekodujące 3' i 5' i sekwencje strukturalne lub większą ilość tych elementów.

Gen hybrydowy korzystnie tworzy się, wykorzystując znane techniki, przez insercję in vitro sekwencji kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL do genu pośredniczącego w ekspresji. Alternatywnie, można dokonać insercji in vivo takiej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL, metodą rekombinacji homologicznej.

W niniejszym opisie określenie „zdolny do replikacji” oznacza, że dany wektor jest zdolny do replikacji w danym typie komórki gospodarza, do którego został wprowadzony. Bezpośrednio w górę od tej sekwencji kwasu nukleinowego można wprowadzić sekwencję kodującą peptyd sygnalny, którego obecność zapewnia wydzielanie wariantu BSSL przez komórki gospodarza zawierające ten wektor. Taką sekwencję sygnalną może stanowić sekwencja naturalnie związana z daną sekwencją kwasu nukleinowego albo sekwencja innego pochodzenia.

Jako wektor można stosować dowolny wektor, który w łatwy sposób można poddać procedurom rekombinacji DNA. Wybór takiego wektora będzie często zależał od rodzaju komórki gospodarza, do której ma być wprowadzony. Tak więc, takim wektorem może być wektor replikujący się autonomicznie, to znaczy, wektor istniejący jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomu. Przykładami takich wektorów są plazmidy, fagi, kosmidy, minichromosomy albo wirusy. Alternatywnie, jako wektor można zastosować taki wektor, który po wprowadzeniu do komórki gospodarza ulega integracji z genomem komórki gospodarza i replikuje się wraz z replikacja chromosomu, z którym został zintegrowany. Przykładami takich wektorów są bakteryjny wektor ekspresyjny i drożdżowy wektor ekspresyjny. Wektor według wynalazku może zawierać każdą z sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

W innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu, który to proces polega na: (i) insercji cząsteczki kwasu nukleinowego opisanej powyżej do genu hybrydowego, zdolnego do replikacji w określonej komórce gospodarza albo w organizmie, (ii) wprowadzeniu tego rekombinantowego genu hybrydowego do określonej komórki gospodarza albo do organizmu, (iii) prowadzeniu wzrostu wytworzonej komórki w/lub na pożywce hodowli albo na identyfikacji i reprodukcji organizmu, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu i (iv) odzysku polipeptydu.

Do hodowli komórek można użyć dowolną pożywkę odpowiednią do tego celu. Jako wektor można zastosować dowolny opisany powyżej wektor a jako komórkę gospodarza można użyć dowolny, odpowiedni typ komórek opisany powyżej. Do konstruowania wektora i wprowadzania go do komórki gospodarza można stosować dowolne znane techniki stosowane do tych celów w technologi i rekombinacji DNA. Rekombinacyjny, ludzki wariant BSSL wytwarzany przez komórki może być wydzielany, to znaczy, eksportowany na zewnątrz komórki poprzez błonę komórkową, zależnie od typu komórki i od budowy wektora.

Jeśli dany wariant BSSL wytwarzany jest przez rekombinantowego gospodarza wewnątrzkomórkowo, co oznacza, że enzym nie jest wydzielany z komórki, wówczas można go

184 960 odzyskać w standardowych operacjach polegających na mechanicznym niszczeniu komórek, np. przez działanie ultradźwiękami, przez homogenizację albo przez obróbkę enzymatyczną lub chemiczną, i na następnym oczyszczaniu.

Aby enzym mógł być wydzielany z komórki, należy poprzedzić sekwencję kodującą dany wariant BSSL sekwencją kodującą peptyd sygnalny, obecność którego umożliwia sekrecję tego wariantu BSSL z komórek, w wyniku czego przynajmniej znaczna część wytwarzanego wariantu BSSL jest wydzielana do pożywki hodowli i odzyskiwana.

Przedmiotem wynalazku jest również układ ekspresyjny, w skład którego wchodzi gen hybrydowy zdolny do ekspresji w komórce gospodarza albo w organizmie posiadającym ten hybrydowy gen, w którym to układzie wytwarzany jest rekombinantowy polipeptyd w wyniku ekspresji tego hybrydowego genu, który to hybrydowy gen uzyskuje się przez insercję sekwencji kwasu nukleinowego opisanej powyżej do genu zdolnego do pośredniczenia w ekspresji tego hybrydowego genu.

Możliwym sposobem wytwarzania rekombinantowego wariantu BSSL według wynalazku jest użycie transgenicznych ssaków, oprócz ludzi, w organizmach których może zachodzić wydzielanie tego wariantu BSSL do mleka. Użycie takich ssaków (nie ludzi) ma tę zaletę, że można uzyskać ogromne wydajności i tego rekombinantowego wariantu BSSL przy możliwych do przyjęcia kosztach, zwłaszcza, gdy takim ssakiem jest krowa. Taki rekombinantowy wariant BSSL jest wówczas produkowany z mlekiem, będącym normalnym składnikiem np. pożywek dla niemowląt i jeśli taki rekombinantowy wariant BSSL jest przeznaczony jako uzupełnienie pokarmowe produktów mlecznych, to nie jest potrzebne żadne dogłębne oczyszczanie.

Należy zwrócić uwagę, że wytwarzanie w organizmie wyższym, takim jak ssak (nie człowiek) wiąże się z prawidłowym przetwarzaniem takiego ssaczego białka, np. w odniesieniu do procesów posttranslacyjnych i prawidłowego sfałdowania, co opisano powyżej. Ponadto, można uzyskać ogromne ilości w zasadzie czystego wariantu BSSL.

Zgodnie z powyższym, opisany powyżej układ ekspresyjny może być układem ekspresyjnym ssaczym, zawierającym kodującą wariant BSSL sekwencję DNA wbudowaną do genu kodującego białko mleka ssaka (nie człowieka), z utworzeniem genu hybrydowego posiadającego zdolność ekspresji w gruczole mlecznym dorosłej samicy ssaka, będącej nosicielem tego hybrydowego genu.

Gruczoł mleczny jako tkanka, w której zachodzi ekspresja genów kodujących białka mleka jest powszechnie uznawany jako szczególnie nadający się do użycia do produkcji heterologicznych białek w ssakach ( oprócz człowieka), ponieważ białka mleka wytwarzane są w sposób naturalny dając wysokie poziomy ekspresji, w gruczole mlecznym. Co więcej, mleko łatwo się zbiera i jest dostępne w ogromnych ilościach. W tym rozwiązaniu, użycie genów białka mleka do wytwarzania rekombinantowego wariantu BSSL ma następną zaletę, polegającą na tym, że enzym ten jest wytwarzany w warunkach podobnych do warunków naturalnych, pod względem regulacji ekspresji i lokalizacji produkcji (gruczoł mleczny).

Opisany powyżej gen hybrydowy przeznaczony do uzyskania transgenicznego ssaka, korzystnie zawiera sekwencję kodującą peptyd sygnalny, co umożliwia prawidłowe wydzielanie produktu tego hybrydowego genu do gruczołu mlecznego. Takim peptydem sygnalnym może być peptyd normalnie występujący w genie dla białka mleka albo taki, który jest związany z sekwencją DNA kodującą dany wariant BSSL. Odpowiednie będą również inne sekwencje sygnale biorące udział w wydzielaniu produktu tego hybrydowego genu do gruczołu mlecznego. Jest oczywiste, że różne elementy tego hybrydowego genu powinny być połączone w taki sposób, aby umożliwić prawidłową ekspresję i przetwarzanie produktu tego genu. Tak więc, w zasadzie, sekwencja DNA kodująca wybrany peptyd sygnalny powinna być prawidłowo związana z N-końcową częścią sekwencji DNA kodującej ten wariant BSSL. W tym genie hybrydowym, sekwencja dNa kodująca dany wariant BSSL będzie na ogół zawierać jej kodon stopu, ale nie jej własny sygnał rozszczepienia i miejsce poliadenylacji. W dół od sekwencji DNA kodującej wariant BSSL będą na ogół zachowane sekwencje przetwarzania mRNA z genu białka mleka.

184 960

Za rzeczywisty poziom ekspresji danego genu hybrydowego odpowiedzialnych jest wiele czynników. Żywotne znaczenie dla uzyskiwanego poziomu ekspresji mają takie czynniki jak właściwości promotora oraz innych sekwencji regulacyjnych wspomnianych powyżej, miejsce integracji układu ekspresyjnego w genomie ssaka, miejsce integracji sekwencji DNA kodującej BSSL w genie kodującym białko mleka, elementy odpowiedzialne za regulację procesów post-translacyjnych i inne podobne czynniki. W oparciu o wiedzę o różnych czynnikach wpływających na poziom ekspresji hybrydowego genu, specjalista biegły w tej dziedzinie powinien wiedzieć, jak zaprojektować układ ekspresyjny użyteczny do niniejszego celu.

Jako gen białka mleka można stosować gen pochodzący z tego samego gatunku, do którego dokonuje się insercji układu ekspresyjnego albo gen ten może pochodzić z innego gatunku. W związku z tym wykazano, że elementy regulacyjne kierujące ekspresję genu do gruczołu mlecznego zachowują swe funkcje poza granicami danego gatunku, co można tłumaczyć wywodzeniem się ze wspólnego przodka (Hennighausen i wsp., 1990).

Przykłady odpowiednich genów kodujących białko mleka albo zachowujących tę funkcję podsekwencji takich genów, nadających się do konstruowania układu ekspresyjnego według wynalazku znajdują się wśród genów dla białek serwatki pochodzących od różnych ssaków, np. genu kwaśnego białka serwatki (WAP), korzystnie pochodzącego od gryzoni i genu β-laktoglobuliny, korzystnie owczego. Do celów transgenicznego wytwarzania wariantu BSSL mogą się również okazać odpowiednie geny kazeiny różnego pochodzenia, np. bydlęcy gen kazeiny a-S1 i króliczy gen kazeiny β. Genem korzystnym w niniejszym wynalazku jest mysi gen WAP, gdyż okazało się, że gen ten daje wysoki stopień ekspresji wielu obcych białek ludzkich w mleku różnych zwierząt transgenicznych (Hennighausen i wsp., 1990).

Inną sekwencją korzystnie związaną z układem ekspresji według wynalazku jest tak zwana sekwencja stabilizująca ekspresję, przyczyniająca się do utrzymania wysokiego poziomu ekspresji. Istnieją mocne dowody na to, że takie sekwencje stabilizujące znajdują się w sąsiedztwie i w górę od genów białka mleka.

Opisano również sposób uzyskiwania transgenicznego ssaka (nie człowieka), w organizmie którego zachodzi ekspresja wariantu BSSL, który to sposób polega na:

(a) wprowadzeniu układu ekspresyjnego opisanego powyżej do zapłodnionego jaja albo komórki zarodka tego ssaka (nie człowieka) włączając ten układ ekspresyjny do linii zarodkowej tego ssaka i (b) prowadzeniu rozwoju otrzymanego zapłodnionego jaja lub zarodka do stadium dorosłej samicy ssaka (nie człowieka).

Powyższy układ ekspresyjny wprowadza się do linii zarodkowej tego ssaka stosując dowolną odpowiednią technikę dostosowaną do tego celu, np. taką, jaka jest opisana w podręczniku: „Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manuał”, wyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Przykładowo, można dokonać bezpośredniej iniekcji kilkuset cząsteczek tego układu ekspresyjnego do zapłodnionego jaja, np. do zapłodnionej jednej komórki jajowej albo do przedjądrza, bądź do zarodka wybranego ssaka i następnie, po zabiegu mikroiniekcji, można przenieść jajo do jajowodu matek-karmicielek z ciążą rzekomą i prowadzić rozwój.

Sposób uzyskiwania transgenicznego ssaka (nie człowieka) zdolnego do ekspresji wariantu BSSL może również obejmować sposób, w którym uzyskuje się ssaka w zasadzie niezdolnego do ekspresji swego własnego BSSL. Sposób ten polega na (a) pozbawieniu tego ssaka zdolności ekspresji BSSL, tak, że nie wytwarza on w zasadzie wcale tego BSSL i dokonuje się insercji układu ekspresyjnego opisanego powyżej do linii zarodkowej tego ssaka w taki sposób, że w organizmie tego zwierzęcia zachodzi ekspresja tego wariantu BSSL i/lub (b) dokonuje się zamiany genu lub części genu BSSL tego ssaka na układ ekspresyjny zdefiniowany powyżej.

Można zniszczyć własny układ ekspresji BSSL danego ssaka drogą wprowadzenia mutacji w sekwencji DNA odpowiedzialnej za ekspresję tego BSSL. Takie mutacje mogą polegać na doprowadzeniu sekwencji DNA do niezgodnej ramy odczytu, wprowadzeniu kodonu stopu albo delecji jednego lub większej ilości nukleotydów w tej sekwencji DNA.

184 960

Gen albo część genu BSSL danego ssaka można zastąpić układem ekspresyjnym zdefiniowanym powyżej albo sekwencją DNA kodującą dany wariant BSSL stosując dobrze znane zasady rekombinacji homologicznej.

Opisany jest także transgoniczny ssak (nie człowiek) posiadający w swym genomie sekwencję DNA opisaną powyżej. Taka sekwencja DNA może korzystnie występować w linii zarodkowej tego ssaka oraz w genie białka mleka tego ssaka. Ten transgonlczny ssak (nie człowiek) może być korzystnie wybrany spośród myszy, szczurów, królików, owiec, świń i krów.

Zakresem ujawnienia objęte jest również potomstwo transgenicznego ssaka (nie człowieka) opisanego powyżej oraz mleko uzyskane od takiego trjnsgonicznego ssaka.

Przedmiotem wynalazku jest również pożywka dla niemowląt zawierająca mleko opisane powyżej oraz pożywka dla niemowląt zawierająca wariant BSSL zdefiniowany powyżej. Tę pożywkę dla niemowląt można wytwarzać stosując znane dogodne procedury. Pożywka ta może zabierać niezbędne dodatki, takie jak sole mineralne, witaminy i podobne.

W dalszym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca wariant BSSL zdefiniowany powyżej, a także użycie tego wariantu BSSL w lecznictwie.

W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest użycie wariantu BSSL zdefiniowanego powyżej do wyrobu leku przeznaczonego do leczenia stanu patologicznego związanego z niedoborem produktów wydzielania zewnętrznego trzustki, mukowiscydozy, przewlekłego zapalenia trzustki, upośledzenia wchłaniania tłuszczy, upośledzenia wchłaniania witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, upośledzenia wchłaniania tłuszczy z powodów fizjologicznych. Wynalazkiem objęte jest również zastosowanie wariantu BSSL do wytwarzania leku przeznaczonego do polepszania utylizacji tłuszczów pokarmowych, zwłaszcza u wcześniaków.

PRZYKŁADY

1. Eksprceja rekombimaitowego BSSL w ks)móresch eιU;sιriotycznych i prokstfrotycznych

1.1. Procedury doświadczalne

1.1.1. Rekombinantowe plazmidy

Plazmid pS146 zawierający ludzki cDNA dla BSSL o wielkości 2,3 kilozasad (Nilsson i wsp., 1990) klonowany do plazmidu pUC19 trawiono eojtryktazjmi HindlU i SaII i następnie ten cDNA dla BSSL wprowadzono do bydlęcego wirusa Papilloma (BPV) jako wektora ekspresyjnego, pS147 (fig. 1). Ten wektor zawiera ludzki cDNA dla BSSL pod kontrolą mysich elementów wzmacniacza i promotora metalotioneiny 1 (mMT-1) (Pavlakis i Hamer, 1983). Sygnały przetwarzania mRNA uzyskano z fragmentu genomowego zawierającego część egzonu n, intron II, egzon III i elementy znajdujące się w niższej części genu β-globiny królika. Tę jednostkę tranckrypcyjną klonowano do wektora zawierającego cały genom BPV. Transkrypcja biegła w tym samym kierunku dla BPV i dla jednostki teansSrypcyjnoj BSSL. W celu namnożenia tego wektora w E. coli, wektor ten zawiera również plazmid pML2d, będący pochodną plazmidu pBR322 (Sarver i wsp., 1982).

Prowadzono ko-transfekcję wektora ekspresyjnego pS147 wektorem zawierającym gen oporności na neomycynę sterowany przez sygnały długiego ó-końcowego powtórzenia wirusa mięsaka Harvey'a i polladonylacji wirusa Simiana 40 (Lusky i Botchan, 1984).

W celu ekspresji BSSL w E. coli, klonowano cDNA dla BSSL w postaci fragmentu Ndel-BamHI z plazmidu pT7-7 (Ausubel i wsp., 1992) do plazmidu pGEMEX-1 uzyskanego z firmy Promega, Madison, WI, Stany Zjednoczone Ameryki (Studier i Moffat, 1986). W tej operacji klonowania, sekwencję kodującą 10 genu T7 zastąpiono genem BSSL kodującym dojrzałe białko poprzedzonym kodonem startu. Końcowy wektor ekspresyjny, pGEMEX/BSSL, weryfikowano metodą sekwencjonowania DNA z użyciem specyficznych wewnętrznych primerów BSSL.

184 960

1.1.2. Mutageneza

Nukleotyd A w kodonie inicjacji ATG oznaczono jako nukleotyd 1. W celu ustalenia numeracji aminokwasów, pierwszą metioninę w peptydzie sygnalnym -23 i pierwszą resztę aminokwasową dojrzałego białka, alaninę, oznaczono numerem 1.

W celu skonstruowania wariantu delecyjnego A (SEQ ED NR: 4), zsyntetyzowano dwa primery: PCR-1 i PCR-E (tabela 1). Utworzono miejsca dla HindIII SalI i BamHI do klonowania do różnych plazmidów. Miejsce dla BeII generowano w sekwencji BSSL bez zmiany sekwencji aminokwasowej. Przeprowadzono to w celu ułatwienia addycji syntetycznego DNA potrzebnej do konstruowania innych wariantów. Primer PCR-2 zawiera dwa syntetyczne kodony stopu. Otrzymane fragmenty PCR trawiono restryktazami BamHI i HindIII i klonowano do plazmidu pUCIS dla przeprowadzenia analizy sekwencji. Ten plazmid oznaczono symbolem pS157. Prawidłowy fragment PCR wbudowano do wektora ekspresyjnego BPV przez fuzję z sekwencją BSSL w unikalnym miejscu Asp700 (pozycja 1405 w cDNA BSSL) i w miejscu Sali na początku fragmentu genu β-globiny, uzyskując plazmid pS257.

Konstruowanie wariantu B (SEQ ID NR: 5) przeprowadzono stosując oligonukleotydy o numerach 3, 4, 7 i 8 (tabela 1). Połączone (zgrzane) oligonukleotydy kodują końcową, sekwencję aminokwasową C-terminalną odpowiadającą długości od lizyny 712 do fenyloalaniny 722 w białku o pełnej długości. Ten fragment poddano fuzji z miejscem dla glutaminy 535. Koniec translacji wbudowano bezpośrednio po ostatniej fenyloalaninie. Ten fragment posiada miejsce BeII w końcu 5' i miejsce Sali w końcu 3’, co pozwala na wprowadzenie do plazmidu pS157. Otrzymany plazmid trawiono restryktazami Asp700 i Sali i fragment o wielkości 313 par zasad wprowadzono do wektora ekspresyjnego opisanego powyżej. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pS258.

Tabela 1

Syntetyczne oligonukleotydy użyte do konstruowania wariantów BSSL. Nukleotydy miejsc restrykcyjnych są podkreślone. Sygnały końca translacji są oznaczone grubymi literami. Kodon zmieniony w wariancie N jest oznaczony w PCR-3 grubymi literami i gwiazdką.

Oligonu- kleotyd	Sekwencja (5’ 3’)
PCR-1	CGGGATCCGAAGCCCTTCGCCACCCCCACG
PCR-2	CGAAGCTTCTCGACTTACTACTGATCAGTCACTGTGGGCAGCGCCAG
PCR-3	GGGAATTCTGGCCATTGCTTGGGTGAAGAGGAATATCGCGGCCTTCGGGGGGGACCCC AACCAGATCACGCTCTTCGGGGAGTCT
PCR-4	CGGGATCCCACATAGTGCAGCATGGGGTACTCCAGGCC
1	GATCAGGGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCGGG
2	GCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCCAAGGAAGCTCAGA
3	TGCCTGCAGTCATTAGGTTTTAGTAAGTCGACA
4	AGCTTGTCGACTTACTAAAACCTAATGACTG
5	CAGGCATCTGAGCTTCCTTGGAGTCACCCGTGGGCGGCACGGGGGGGG CCCCGGA
6	GTCACCCGTGGGCGGCACGGGGGGGGCCCCCT
7	GATCAGAAGGAAGCTCAGA
8	CAGGCATCTGAGCTTCCTTCT

W celu skonstruowania genu kodującego wariant C (SEQ ID NR: 6), użyto oligonukleotydy od 1 do 6 (tabela 1). Zgrzany fragment DNA zawiera dwa powtórzenia, kodujące 11 aminokwasów, identyczne z sekwencją konsensus (Nilsson i wsp., 1990) wstawione między glutaminą 535 a sekwencją: lizyna 712 do fenyloalanina 722. Ten fragment, również zawiera

184 960 miejsce BelI w końcu 5' i miejsce SalI w końcu 3', co pozwala na zastosowanie takiej samej strategii, jaką opisano powyżej. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pS259.

Konstruowanie wariantu N (wariant niezglikozylowany, (SEQ ID NR: 7) rozpoczęto od zsyntetyzowania dwóch primerów (PCR-3 i PCR-4 w tabeli 1). Utworzono miejsca dla EcoRI i BamHI w celu klonowania produktu reakcji PCR o wielkości 360 par zasad do plazmidu pUC 19 do analizy sekwencji. Potencjalne miejsce N-glikozylacji przy asparaginie 187 zastąpiono glutaminą. Tak modyfikowaną sekwencję izolowano w postaci fragmentu Ball-HindnI i klonowano do trawionego restryktazami SacI i HindIII plazmidu pUC19 łącznie z fragmentem SacI i BaII zawierającym promotor mMT-1 i koniec 5’ z cDNA BSSL. Z tego plazmidu izolowano fragment SacI-DraIII o wielkości 1,2 kilozasad i dokonano jego insercji odpowiednio w elemencie mMT-1 i w sekwencji cDNA BSSL, w wektorze ekspresyjnym. Otrzymany plazmid oznaczono symbolem pS299.

1.1.3. Hodowla komórek ssaczych i transfekcje

Wektory użyto do ko-transfekcji linii komórek mysich C127 (ATCC CRL 1616) metodą precypitacj i fosforanem wapnia (Graham i Van der Eb, 1973).

Komórki C127 hodowano w pożywce Eagla modyfikowanej pożywką Ham'a F12Dulbecco (DMEM; 1:1), wzbogaconej ilością 10 procent płodowej surowicy bydlęcej. Wyselekcjonowano klony oporne na neomycynę, G418, w ilości 1,5 mg x ml'¹ i po 10-15 dniach izolowano klony opornych komórek z płytek podstawowych i pasażowano do analizy.

1.1.4. Szczepy bakteryjne i warunki hodowli.

Do prób ekspresji wprowadzano wektor pGEMEX/BSSL do szczepów E. coli JM109(DE3) i BL21(DE3)pLysS. Próby ekspresji prowadzono w sposób opisany przez Studier’a i wsp. (1986). Po zebraniu bakterii, komórki peletkowano przez wirowanie (5,000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C). W celu przygotowania frakcji periplazmy i cytoplazmy, peletkę zawieszano w 4 ml roztworu zawierającego 20 mM Tris-Cl, 20% sacharozy (pH = 8,0) 200 pl 0,1M EDTA i 40 pl wodnego roztworu lizozymu (o stężeniu 15 mg/ml) na gram pelelki. Zawiesinę inkubowano na lodzie w czasie 40 minut, dodano 160 p1 0,5M roztworu MgCl₂ na gram peletki i następnie zawiesinę wirowano w czasie 20 minut przy 12,000 x g. Otrzymany supernatant zawiera białka periplazmatyczne a w peletce zawarta jest frakcja cytoplazmatyczna. Alternatywnie, w celu przygotowania białek rozpuszczalnych, komórki zawieszano w roztworze o składzie: 40 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu (pH = 8,2), poddawano kilkakrotnie operacji zamrażania - rozmrażania i działania ultradźwiękami dla wywołania lizy komórek. Lizat komórkowy wirowano z szybkością 30.000 x g w czasie 30 minut w temperaturze 25°C.

1.1.5. Analiza kwasu nukleinowego

Z izolowanych linii komórek ssaczych albo z komórek E. coli (Ausubel i wsp., 1992) preparowano RNA i DNA. Ten RNA i Dna frakcjonowano na żelach agarozowych, nanoszono na filtry GeneScreen Plus (New England Nuclear) i hybrydyzowano według instrukcji dostawcy.

1.1.6. Przygotowanie natywnego enzymu

Z mleka ludzkiego oczyszczono stymulowaną solami żółciowymi lipazę w sposób opisany przez Blackberg’a i HemelPa, 1981). Oczyszczony preparat był jednorodny w badaniu elektroferotycznym SDS-PAGE i posiadał aktywność właściwą 100 pmoli uwolnionego kwasu tłuszczowego x minuta'¹ x mg' przy zastosowaniu długołańcuchowego trójacyloglicerolu jako substratu.

1.1.7. Oznaczanie enzymu

Enzym oznaczano metodą opisaną przez Blackberg^ i 'HemelPa (1981) stosując jako substrat trójoleinę zemulgowaną gumą arabską. Inkubacje prowadzono z dodatkiem 10 mM cholanu sodu jako aktywującej soli żółciowej. Przy oznaczaniu zależności od soli żółciowych, do zawiesin dodawano cholan sodowy i dezoksycholan sodowy (Sigma Chem., Co.) w stężeniach podanych na fig. 3.

1.1.8. Hybrydyzacja Westema

W celu otrzymania wyraźnych reakcji w próbach Westema, zatężano kondycjonowane pożywki metodą chromatograficzną na żywicy Blue Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology).

184 960

Odpowiednie pożywki mieszano z Blue Sepharose (około 10 ml pożywki na ml żelu). Żel przemywano 0,5 M buforem Tris-Cl (pH = 7,4) zawierającym 0,1M KCl w ilości 10 ml buforu na 1 ml żelu. Aktywność enzymu eluowano roztworem 1,5M KCl w tym samym buforze. W tej procedurze uzyskano 25-30-krotne zatężenie oraz 3-5-krotne oczyszczenie. Elektroforezę SDS-PAGE prowadzono na 10 procentowych żelach poliakryloamidowych, w zasadzie w sposób opisany przez Laemmliego (1970). Po przeniesieniu na filtry nitrocelulozowe i inkubacji z poliklonalną antysurowicą królika przeciw oczyszczonemu BSSL, dokonywano detekcji stosując kozią IgG anty-króliczą skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą i odczytywano wyniki w zestawie Bio-Rad.

1.1.9. Traktowanie N-glukozydiaząF.

Do 10 μΐ wariantu B charakteryzującego się aktywnością BSSL równą 2,5 μmola uwalnianego kwasu tłuszczowego x min'¹ dodano 1 μΐ 1M roztworu p-merkaptoetanolu i 0,5 μl 10 procentowego (wagowo-objętościowo) SOS. Po 5 minutowym wrzeniu dodano 10 μΐ 0,1M buforu fosforanu sodowego (pH = 8,0), 6 μl 0,1M EdTa, 4 μl 7,5% (wagowo-objętościowych) odczynnika Nonidet P40 i 5 μl (1 jednostkę) N-glukozydazy F (Boehringer Mannheim). W próbach kontrolnych tę samą ilość wariantu B traktowano identycznie, z tym, ze nie dodawano glukozydazy. Po dobowej inkubacji w temperaturze 37°C próbki poddawano elektroforezie SDS PAGE i hybrydyzacji na filtrach wobec poliklonalnej antysurowicy królika przeciw BSSL.

1.2. Wyniki

1.2.1. Konstruowanie wariantów BSSL

Modyfikacje wariantów BSSL w stosunku do BSSL o pełnej długości są zebrane w tabeli 2 i na fig. 1. Strategie zaprojektowane do generowania tych wariantów są opisane w sekcji 1.1. Dla wariantu A (SEQ ID NR: 4), kodon stopu wprowadzono za glutaminą w pozycji 535, usuwając przez to ostatnie 187 aminokwasów z białka o pełnej długości. W celu skonstruowania wariantu B (SEQ ID NR: 5) dokonano fuzji domeny kodującej 11 ostatnich Ckońcowych aminokwasów i oryginalnego stopu translacji z glutaminą w pozycji 535. Jednak w tym wariancie nie występują żadne powtórzenia. Wariant C (SEQ ID NR: 6), konstruowano w ten sposób, że fragment posiadający dwa powtórzenia i zawierający sekwencję identyczną z sekwencją consensus (Nilsson i wsp., 1990) wbudowano między pozycją glutaminy 535 a sekwencją lizyny 712 do fenyloalaniny 722.

Dla zanalizowania roli jedynej przypuszczalnej N-związanej struktury węglowodanowej usytuowanej w pobliżu aktywnego miejsca seryny 194, skonstruowano następny wariant. Wariant N (SEQ iD NR: 7) otrzymano przez zmianę potencjalnego miejsca N-glikozylacji przy asparaginie 187 na glutaminę.

Tabela 2

Sekwencja aminokwasowa wariantów BSSL w odniesieniu do ludzkiego BSSL

Wariant	Reszty wycięte	Reszty zmienione
A (SEQ ID NR: 4)	536-722
B (SEQ ID NR: 5)	536-711
C (SEQ ID NR: 6)	536-568, 591-711
N (SEQ ID NR: 7)		Asn 187 -> Gln

1.2.2. CharaCearaktyr^ i^^ł^omr^ik^a^tbinantiDe^jo. dIiaiach komorkowych ssaczych Z linii komórkowych transfekowanych wektorami ekspresyjnymi kodującymi różne warianty BSSL wypreparowano próbki DNA. Otrzymany DNA trawiono restryktazą BamHI, frakcjonowano na żelach agarozowych i przenoszono na filtry habrydyzacyjne. Jako sondę stosowano znaczony ³²P cDNA dla BSSL. Wyniki hybrydyzacji potwierdziły obecność genów rekombikantowach oraz to, że liczba kopii wektora jest w zasadzie jednakowa w różnych liniach komórkowych (fig. 2). Pozycje habradyzującyce fragmentów odzwierciedlają różne długości różnych sekwencji BSSL i są zgodne z rozmiarami założonymi. Pozycje były

184 960 również podobne do DNA pochodzącego z bakterii, stosowanego w doświadczeniu transfekcji, co wskazuje, że w liniach komórkowych nie nastąpiło poważniejsze przegrupowanie wektorowego dNa (fig. 2) Górne sygnały hybrydyzacji w próbce DNA reprezentującej wariant A powstały prawdopodobnie w wyniku częściowego trawienia.

1.2.3. Ekspresja w komórkach ssaczych mRNA dla BSSL o pełnej długości i zmutowanego

W celu zanalizowania ekspresji różnych rekombinantowych genów BSSL, z izolowanych linii komórkowych wypreparowano RNA. Próby hybrydyzacji typu Northern i hybrydyzacji ze znakowanym ³²P cDNA dla BSSL wykazały, że rekombinantowy mRNA był wykrywalny we wszystkich liniach komórkowych posiadających wektor BSSL (fig. 3). Nie stwierdzono hybrydyzacji w próbce kontrolnej pochodzącej z linii komórkowej zawierającej identyczny wektor ale nie posiadający cDNA BSSL (fig. 3).

Różne długości hybrydyzujących mRNA były zgodne z modyfikacjami w próbkach cDNA. Poziomy w stanie ustalonym rekombinantowych wariantów mRNA BSSL w różnych próbkach były w zasadzie takie same, za wyjątkiem wariantu A (fig. 3). Nie jest znana przyczyna obniżonej akumulacji mRNA w wariancie A ale zaobserwowano ją w dwu populacjach linii komórkowych oraz w wyizolowanych klonach. Występowanie jednakowych ilości RNA w różnych próbkach potwierdzono metodą hybrydyzacji z sondą mysiej β-aktyny (fig. 3, panel niższy).

1.2.4. Wytwarzanie BSSL o pełnej długości i wariantów w komórkach ssaczych

Zebrano pożywki z poszczególnych klonów komórek C127, transfekowanych genem dla BSSL o pełnej długości i różnych form zmutowanych i oznaczano w nich aktywność BSSL (fig. 4). Aktywność cząsteczki o pełnej długości i wariantów N, B i C w klonach o najwyższej ekspresji wynosiła od 0,7 do 2,3 pmola uwolnionego kwasu tłuszczowego x min'¹ x 1 ml'¹ pożywki. W porównaniu z aktywnością właściwą BSSL występując ą w naturalnym mleku odpowiada to poziomom ekspresji 7-23 pg x ml pożywki¹. W przypadku wariantu A, wszystkie analizowane klony wykazywały aktywność poniżej 0,05 pmola uwolnionego kwasu tłuszczowego x min'¹ x 1 ml pożywki. Po zatężeniu na żywicy Blue-Sepharose i liofilizacji klonu wykazującego najwyższą aktywność wykazano, że rzeczywiście wytwarzany jest aktywny enzym ale niestety w bardzo małej ilości. Nie można wykluczyć możliwości, że niska aktywność oznaczona w wariancie A może być częściowo wytłumaczona znacznie niższą aktywnością właściwą,

Wyniki prób hybrydyzacji Westema dla klonów pochodzących z różnych prób transfekcji są przedstawione na fig. 5A. Pozorne masy cząsteczkowe Mr wariantów BSSL były zgodne z założonymi. Jednak należy zauważyć, że dla BSSL o pełnej długości oraz dla wariantów B i C otrzymano pasma podwójne. Wszystkie te trzy enzymy posiadają nienaruszone, pojedyncze miejsce N-glikozylacji, podczas gdy wariant N, który nie wykazywał podwójnego pasma, nie posiada tego miejsca, a wiec prawdopodobne jest tłumaczenie, że podwójne pasmo wynika z różnic w N-glikozylacji. Dlatego też, wariant B poddano trawieniu N-glukozydazą F. Jak to jest przedstawione na fig. 5B, pozostały jedynie śladowe ilości pasma górnego, natomiast dolne pasmo stało się bardziej intensywne, co wskazuje, że tylko część wytwarzanego wariantu ma postać N-zglikozylowaną.

Jedną z cech charakterystycznych BSSL jest to, że enzym ten jest swoiście aktywowany przez pierwszorzędowe sole żółciowe, np. cholan (Hemell, 1975). Dla wszystkich poszczególnych rekombinantowych form BSSl wykazano tę samą zależność stężenia od aktywacji cholanem (fig. 6). Maksymalną aktywność uzyskano przy stężeniu około 10 mM w użytym układzie analitycznym. Przy zamianie cholanu na dezoksycholan (drugorzędowa sól żółciowa), aktywacja nie pojawiła się. Tak więc, zarówno BSSL o pełnej długości jak i różne jego warianty wykazują tę samą swoistość odnośnie aktywacji solą żółciową

1.2.5. Ekspresja i charakteryzacja biochemiczna BSSL o pełnej długości w E. Coli.

Transformowano dwa szczepy E. coli, JM109 (DE3) i BL21(DE3)pLysS (Studier i wsp., 1986) wektorem ekspresyjnym pGEMEX/BSSL zawierającym cDNA dla ludzkiego BSSL pod kontrolą promotora T7. Transformanty z obydwu szczepów identyfikowano, hodowano i indukowano za pomocą IPTG przez około 90 minut. (Studier i wsp., 1986). Analiza całkowitego mRNA metodą hybrydyzacji typu Northern z użyciem znakowanego ³²P cDNA

184 960 dla BSSL jako sondy wykazała, że w obydwu szczepach wystąpiła wydajna indukcja ekspresji i że transkrypcja podlegała ścisłej regulacji (fig. 7A). Pozorna wielkość mRNA dla rekombinantowego BSSL wynosząca około 2,4 kilozasad była zgodna z długością oczekiwaną. Rozdział próbek białka metodą elektroforezy SDS-PaGe i detekcja immunologiczna z użyciem przeciwciał przeciw BSSL wykazały, że w E. coli zachodzi wydajna produkcja BSSL o pełnej długości (fig. 7B). W szczepie BL21 (DE3)pLysS więcej białka wydziela się do periplazmy niż w szczepie JM109 (DE3) (fig. 7B).

Hodowle E. coli indukowane przez IPTG zawierały aktywny, rozpuszczalny enzym BSSL w ilości odpowiadającej 0,5-4 pg białka BSSL/ml hodowli. Metodą planowania Westema wykazano, że w nierozpuszczalnej peletce znajduje się od 20 do 60% reaktywnego materiału. Bakterie nieindukowane nie zawierały jakiejkolwiek znaczącej aktywności BSSL.

Lipaza pochodząca z hodowli bakteryjnych charakteryzowała się taką samą zależnością od soli żółciowych jak natywna BSSL występująca w mleku.

2. Oczyszczayie i t^irarakc^iy^r^ć^itjcipehjej długo ścł zmutowanychrekombinantowach form lipazy stymulowanej solami żółciowymi

2.1. Metody doświadczalne

2.1.1. Enzymy i warianty enzymów

Skonstruowano rekombieentowk BSSL o pełnej długości i warianty BSSL B, C i N i dokonano ekspresji tych konstrukcji w sposób opisany powyżej. W porównaniu z enzymem eetkwekm, w wariancie B (SEQ 10 NR: 5) brakuje wszystkich 16 unikalnych, O-zglikozylowenkch, bogatych w prolinę powtórzeń C-terminalnych (aa 536-711), za wyjątkiem ostatniego fragmentu C-terminalnego (aa 712-722) związanego z zlutemieą-535. Wariant C (SEQ ID NR: 6) zawiera ten sam fragment C-końcowy i dwa powtórzenia jedenastu reszt miedzy głutemieą-535 a ltakeą-712. W wariancie N (wariant bez N-glikozy^ch; (SEQ ID NR: 7) αsperagteę-187 odpowiedzialną za jedyną N-związaną resztę cukrową, wymieniono na resztę glutaminy.

Natywny BSSL oczyszczono z mleka ludzkiego w sposób opisany przez Blackberg'a iHemeH'ą 1981).

2.1.2. Oznaczanie enzymu

Aktywność lipazy oznaczano w sposób opisany przez Blackberg^ i Hemela, 1981) stosując jako substrat trójoleinę z emulgowaną gumą arabską. Jako aktywującą sól żółciową, użyto c^lan sodowy (10 mM). Różne modyfikacje tego oznaczenia są podane w objaśnieniach do figur.

2.1.3. Prakgotoweeta immunosorbeetu

Oczyszczoną lipazę BSSL z mleka (5 mg) sprzęgano z żywicą Sepharose za pomocą CNBr w sposób podany przez producenta Przez kolumnę przepuszczono 40 ml poliklonalnej aetksurcwtzk królika przeciw enzymowi BSSL oczyszczonemu z mleka. Swoiste przeciwciała eluowano roztworem 0,1M chlorowodorku glicyny (pH = 2,5). Wartość pH natychmiast ustawiano na około 8 za pomocą stałego Tris. Po odsoleniu i liofilizacji sprzęgano 6 mg oczyszczonych metodą powinowactwa przeciwciał z żywicą Sepharose w sposób opisany powyżej.

2.1.4. Proces oczyszczania

Kcedycjoeowaee pożywki hodowli zawierające od 5 do 25 pg rekombieαntowego wytworzonego BSSL albo wariantu BSSL mieszano z żywicą Blue Sepharose (Phermeoie, Szwecja) w proporcji 10 ml pożywki na ml osadzonego żelu. Po 30 minutowym mieszaniu żel przemywano roztworem o składzie: 0,05 M Tris-Cl (pH = 7,0), 0,05M KCl, po czym eluowano aktywność lipazy roztworem o składzie: 0,05M Tris-Cl (pH = 7,0), 1,5M KCl. Frakcje odpowiadające pikowi aktywności pulowano i dializowano wobec 5 mM roztworu soli sodowej weronalu (pH = 7,4) w 0,05M NaCl. Dializat podawano na kolumnę hepαrkeo-Sepherozk. Kolumnę aluoweeo gradientem 0,05 do 1,0M NaCl w 5 mM buforze soli sodowej weronalu (pH = 7,4). Frakcje zawierające aktywność lipazy pulowano i podawano na kolumnę wypełnioną immueosorbaetam. Po przemyciu roztworem zawierającym 0,05M Tris-Cl (pH = 7,5) i 0,15M NaCl, eluowano związaną lipazę roztworem 0,1M chlorowodorku glicyny (pH = 2.5). Wartość pH frakcji natychmiast ustawiano na około 8 za pomocą stałego Tris.

184 960

2.1.5. Elektroforeza

Elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem dodecylosiarczanu sodu (SDSPAGE) prowadzono w zasadzie w sposób opisany przez Laommli'ogo (1970). Białka barwiono błękitem Commassie Brilliant Blue.

2.1.6. Analiza sekwencji N-terminalnych

Analizę sekwencji aminokwasowych prowadzono w aparacie do sekwoncjonowania Applied Biosystems Inc. 477A z pulsacyjnym podawaniem fazy ciekłej i w analizatorze on-line 120A z fenylotiohydantoiną, z programami regularnych cykli i z odczynnikami dostarczonymi przez producenta. Wyliczone w stosunku do joSwencjonowanogo białka standardowego (β-laktoglobiny) początkowe i powtarzane wydajności wynosiły odpowiednio: 47% i 97%.

2.2. Wyniki

2.2.1. Oczyszczanie rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL

Chromatografię kondycjonowanych pożywek na żywicy Blue Sepharose traktowano przede wszystkim jako etap zatężania. Następna chromatografia na heparyno-Sepharozie pozwoliła na wstępne oczyszczenie przede wszystkim przez usunięcie większości albuminy występującej w pożywce hodowli. W tym etapie stwierdzono również, że wszystkie cząsteczki rekombinantowego BSSL zachowują właściwość wiązania z heparyną. Po oczyszczaniu z użyciem immunosorbentu, wszystkie warianty BSSL wykazywały czystość powyżej 90%, jak wskazywały wyniki elektroforezy SDS-PAGE (fig. 8). Enzym o pełnej długości oraz wariant B i C migrowały jako dublety. Pozorne masy cząsteczkowe, M,, różnych wariantów są podane w tabeli 3. Analiza sekwencji N-terminalnej dała jedną sekwencję dla wszystkich wariantów dla 8 cykli:

Ala-Lys-Leu-Gly-Ala-Val-Tye-Thr-.

2.2.2. Aktywność lipazy

W tabeli 3 podane są masy cząsteczkowe różnych preparatów. Aktywności właściwe tych preparatów wynoszą od 75 do 120 pmoli uwalnianego kwasu tłuszczowego/min/mg białka. Nie zaobserwowano znaczącej różnicy w aktywności BSSL o pełnej długości i wariantów BSSL.

Wszystkie preparaty bezwzględne wymagały obecności pierwszorzędowych soli żółciowych (cholanu sodowego) w próbie na aktywność wobec z emulgowanego długołańcuchowego glicerolu (fig. 9A). Dezoksycholan sodu utrzymywał aktywność wszystkich tych wariantów (dane nie są przytoczone). Jednakże, w połączeniu z innymi solami żółciowymi, dezoksycholan wykazywał dwa działania (fig. 9B i 9C). Po pierwsze, obniżał stężenie cholanu potrzebnego do aktywacji, po drugie - hamował aktywność enzymu przy wyższych stężeniach soli żółciowych.

T ab ela3

Pozorna masa cząsteczkowa, M_n BSSL o pełnej długości i wariantów BSSL

Enzym	Mr (kDa) Oznaczona metodą SDS-PAGE
o pełnej długości	105, 107
Wariant B	63,65
Wariant C	60, 62
Wariant N	95

2.2.3. Stabilność rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL

Rekombinantowy enzym BSSL oraz warianty BSSL są stabilne przy tej samej wartości pH, w której jest stabilny natywny enzym BSSL z mleka (fig. 10). Aktywacja następowała we wszystkich przypadkach przy wartości pH około 2,5-3. Przy wartości pH powyżej 3 wszystkie warianty były całkowicie stabilne pod warunkiem, że stężenie białka było wystarczająco wysokie. Stężenie takie zapewniano dodając albuminę surowicy bydlęcej albo owalbuminę (dane nie są przytoczone). Próbki rozcieńczone były mniej stabilne przy wszystkich testowanych wartościach pH ale próg pozostał taki sam (dane nie są przedstawione). Na fig. 11 przedstawiona jest stabilność cieplna rekombinantowych enzymów w porównaniu z natywnym enzy26

184 960 mem z mleka. W temperaturze 37-40°C aktywność zaczyna spadać. Warianty (B, C i N) wydają się nieco mniej stabilne niż enzym rekombinantowy o pełnej długości i enzym z mleka. Jednakże, jeśli podwyższono zawartość białka przez dodanie albuminy surowicy bydlęcej, wszystkie warianty były stabilne również w temperaturze 40°C (fig. 11).

Zarówno natywny BSSL z mleka jak i wszystkie warianty rekombinantowe były wrażliwe na trypsynę. Otrzymano wykres inaktywacji zależnej od czasu (fig. 12). Jeśli jednak do buforu dodawano sole żółciowe, np. cholan, warianty lipazy były chronione i została utrzymana aktywność lipazy (fig. 12).

Tak więc, pod względem wielu właściwości oznaczanych in vitro, to znaczy aktywacji przez sole żółciowe, wiązania z heparyną stabilności przy danej wartości pH i stabilności cieplnej oraz ochrony przez sole żółciowe przed inaktywacją przez proteazy, nie obserwowano znaczących różnic między różnymi wariantami BSSL a natywnym BSSL z mleka.

3. Ekspresja w zwierzętach transgenicznych

3.1. Konstruowanie wektorów ekspresyjnych

W celu skonstruowania wektora ekspresyjnego do produkcji rekombinantowego ludzkiego wariantu BSSL w mleku transgenicznych zwierząt, przyjęto następującą strategię (fig. 13). Trzy plazmidy zawierające różne części genu ludzkiego BSSL (pS309), pS310 i pS311) otrzymano metodami opisanymi przez Liaberga i wsp. (1992). Plazmid pS309 zawiera fragment, SphI obejmujący gen BSSL od niepodlegającego transkrypcji regionu 5’ do części czwartego intronu. Plazmid pS310 zawiera fragment SacI obejmujący sekwencję genu wariantowego BSSL od części pierwszego intronu do części szóstego intronu. Plazmid pS311 zawiera fragment BamHI obejmujący sekwencję genu BSSL od większej części piątego intronu i resztę struktury intron/egzon z delecjami w egzonie 11. Delecyjne sekwencje stanowią 231 par zasad, co daje sekwencję kodującą wariant BSSL posiadający dokładnie 77 aminokwasów albo siedem powtórzeń mniej niż BSSL o pełnej długości. Sekwencja nukleotydowa otrzymanego wariantu BSSL (wariant T) jest przedstawiona w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ED NR 8. Sekwencja aminokwasowa wariantu T jest przedstawiona w wykazie sekwencji jako sekwencja SEQ ID NR 9.

Przy wysoce repetytywnej sekwencji w egzonie 11 ludzkiego genu dla BSSL można z góry przewidzieć względnie dużą częstotliwość przegrupowań podczas klonowania tej sekwencji do plazmidu i namnażania w bakteriach. Opierając się na tym założeniu, zidentyfikowano, wyizolowano i poddano analizie przez sekwencjonowanie jeden taki żądany wariant BSSL zawierający skrócony egzon 11.

Inny plazmid, pS283, zawierający część cDNA dla ludzkiego BSSL, klonowany do plazmidu pUC19 w miejscach HindIII i SacI użyto do fuzji sekwencji genomowych. Plazmid pS283 użyto również do wprowadzenia właściwego miejsca dla enzymu restrykcyjnego Kpnl, zlokalizowanego w końcu 5’ nie podlegającej translacji sekwencji lideroweJ BSSL.

Ten plazmid pS283 trawiono restruktazami NcoI i SacI i w procesie elektroforezy wyizolowano fragment o długości 2,7 kilozasad. Plazmid pS309 trawiono enzymami Ncol i BspEI i wyizolowano fragment o długości około 2,3 kilozasad zawierający część 5' genu BSSL. Plazmid pS310 trawiono restryktazami BspEI i SacI i wyizolowano fragment około 2,7 kilozasad zawierający część środkowego regionu genu BSSL. Te trzy fragmenty poddano ligacji i następnie transformowano do kompetentnych komórek E. coli, szczep tG2. Transformanty izolowano po selekcji ampicyllną.

Z wielu transformantów wypreparowano plazmidy i jeden plazmid, o nazwie pS312 (fig. 14) zawierający żądaną konstrukcję użyto do dalszych doświadczeń.

W celu uzyskania modyfikacji plazmidu pS311, w której miejsce BamHI zlokalizowane w dół od kodonu stopu zamienione jest na miejsce dla Sali dla ułatwienia następnego klonowania, zastosowano następującą metodykę: plazmid pS311 linearyzowano przez częściowe trawienie enzymem BamHI. Ten linearyzowany fragment izolowano i dokonywano insercji syntetycznego linkera DNA, w wyniku czego dokonano konwersji miejsca BamHI na miejsce SaU(5’GATCGTCGAC-3’), niszcząc przy tym miejsce dla BamHI. Ponieważ były dwie potencjalne pozycje, w których mogła przebiegać integracja tego syntetycznego linkera, otrzymane plazmidy

184 960 analizowano metodą rozszczepienia enzymem restrykcyjnym. Wyizolowano plazmid z insercją linkera w żądanej pozycji w dół od egzonu 11. Oznaczono go symbolem pS313.

Dla otrzymania końcowej konstrukcji wektora ekspresyjnego zawierającego genomowe sekwencje wariantu BSSL, użyto gotowy wektor ekspresyjny, pS314, zaprojektowany do pośredniczenia w etapowej, tkankowo swoistej ekspresji komórek gruczołów mlecznych w okresach laktacji. Plazmid pS314 zawiera fragment genomowy z mysiego genu kwaśnego białka serwatki (WAP) (Campbell i wsp., 1984) klonowany jako fragment Notl. Ten genomowy fragment składa się z około 4,5 kilozasad górnych sekwencji regulatorowych (URS) wszystkich czterech mysich egzonów WAP i wszystkich sekwencji intronowych oraz z około 3 kilozasad sekwencji w dół od ostatniego egzonu. Unikalne miejsce dla KpnI jest zlokalizowane w pierwszym egzonie, w odległości 24 par zasad w górę od kodonu inicjacji translacji naturalnego WAP. Innym unikalnym miejscem restrykcyjnym jest miejsce dla Sali zlokalizowane w egzonie 3.

Tę sekwencję genomową wariantu ludzkiego BSSL wbudowano pomiędzy te miejsca, to znaczy miejsca KpnI i Sali postępując według następującej strategii: Na początku trawiono pS314 enzymami KpnI i Sali i izolowano metodą elektroforezy odpowiedni fragment reprezentujący rozszczepiony plazmid. Następnie plazmid pS312 trawiono enzymami KpnI i BamHI i wyizolowano fragment o długości około 4,7 kilozasad reprezentujący część 5’ genu ludzkiego BSSL. W trzeciej operacji trawiono pS313 restryktazami BamHI i Sali i wyizolowano część 3' genu ludzkiego BSSL. Te trzy fragmenty poddawano ligacji i produktem tej ligacji transformowano kompetentne komórki E. coli. Transformanty izolowano po selekcji ampicyliną

Z kilku transformantów przygotowano plazmidy i dokładnie je analizowano metodami mapowania enzymami restrykcyjnymi i analizą sekwencji. Zdefiniowano jeden plazmid, reprezentujący żądany wektor ekspresyjny i oznaczono go symbolem pS317 (fig. 15).

Dla usunięcia prokariotycznych sekwencji plazmidowych, pS317 trawiono enzymem Notl. Następnie wyizolowano metodą elektroforezy w żelu agarozowym element rekombinantowego wektora składający się z mysiej sekwencji WAP flankującej fragment genomowy wariantu ludzkiego BSSL. Wyizolowany fragment oczyszczano metodą elektroeluowania następnie wstrzykiwano do zarodków mysich.

Rekombinantowy gen do ekspresji wariantu ludzkiego BSSL w mleku transgenicznych myszy jest przedstawiony na fig. 16.

3.2. Generowanie transgenicznych zwierząt

Z plazmidu pS317 opisanego w sekcji 3.1 wyizolowano fragment Notl. Ten fragment DNA zawierał mysi promotor WAP związany z genomową sekwencją kodującą ludzki wariant BSSL. Ten wyizolowany fragment, w stężeniu 3 ng/μΐ wstrzyknięto do przedjąder 350 zarodków C57Bl/6JxCBA/2J-f₂ pochodzących od myszy-dawczyń, napiętnowanych ilością 5 jednostek międzynarodowych gonadotropiny z osocza ciężarnych klaczy dla wywołania superowulacji. Szczep zwierząt C57Bl/6JxCBA/2J-f, otrzymano z ośrodka Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd., Ry, Dania. Po zebraniu zarodków z jajowodów, oddzielono je od komórek wzgórka przez działanie hialuronidazą w pożywce M2 (Hogan i wsp., 1986). Po przemyciu, zarodki przeniesiono do pożywki M16 (Hogan i wsp., 1986) i utrzymywano w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Wstrzyknięć dokonywano w mikrokropli pożywki M2 w świetle oleju parafinowego, stosując mikromanipulatory hydrauliczne Narishigi i mikroskop inwersyjny Nikon z układem optycznym Nomarski. Po iniekcji, 267 wyglądających zdrowo zarodków implantowano do 12 biorczyń C57Bł/6JxCBA/2J-f₁ z ciążą rzekomą, którym dootrzewnowo podano po 0,37 ml 2,5% preparatu Avertin. Myszy, u których nastąpiła integracja obcego genu identyfikowano metodą analizy w reakcji PCR DNA pochodzącego z próbek biopsji z ogona pobranych po trzech tygodniach po urodzeniu się zwierząt. Wyniki pozytywne potwierdzono metodą hybrydyzacji Southenia.

W celu zebrania mleka, samicom w okresie laktacji podawano drogą iniekcji dootrzewnowej jednostki międzynarodowe oksytocyny i po 10 minutach myszy usypiano ilością 0,40 ml 2,5% roztworu awertyny. Urządzenie do zbierania mleka przymocowywano do sutka przez silikonowaną rurkę i zbierano mleko do 1,5 ml probówek Eppendorfa przez łagodny masaż

184 960 gruczołu mlecznego. Ilość zebranego mleka była różna, zależna od dnia laktacji i wynosiła od 0,1 do 0,5 ml/mysz/zbiór.

3.3. Ekspresja wariantu BSSL w transgenicznych myszach

Teansgonlczno myszy identyfikowano przez analizę DNA wypreparowanego z próbek pobranych z ogonów. Próbki tkanki inkubowano z proteinazą K i ekstrahowano fenolem i chloroformem. Wyizolowany DNA użyto do reakcji amplifikacji z udziałem polimerazy (reakcji PCR) łącznie z primerami amplifikującymi określone fragmenty jeśli był obecny heterologiczny, wprowadzony DNA reprezentujący dany fragment wektora ekspresyjnego. Zwierzęta analizowano również w próbach hybrydyzacji DNA dla potwierdzenia danych uzyskanych z reakcji PCR i w celu oznaczenia możliwych przegrupowań, struktury zintegrowanych elementów wektora i dla uzyskania informacji o ilości kopii zintegrowanych elementów wektora.

W jednej serii doświadczeń analizowano 31 myszy tymi dwiema metodami. Wykazano, że jedna mysz była nosicielką heterologicznego elementu wektora DNA pochodzącego z plazmidu pS317. Wyniki analizy metodą reakcji PCR i hybrydyzacji były identyczne (fig. 17). Ogółem, na 65 testowanych zwierząt u 10 wykryto elementy teansgeniczne z pS317.

Mysz, u której stwierdzono obecność elementu wektora DNA (samicę zarodową) kryto i analizowano miot F1 na obecność elementów teansgonicznych tą samą metodą.

RNA wyizolowany z różnych tkanek teansgenicznych samic posiadających pS317 podczas laktacji rozdzielono metodą elektroforezy żelowej w agarozie sieciowanej formaldehydem, nanoszono na filtry i hybrydyzowano ze znakowanym ⁷²p-cDNA dla BSSL jako sondą, Otrzymane wyniki wskazują, że ekspresja ogranicza się do gruczołu mlecznego podczas laktacji (fig. 18).

Od uśpionych samic zarodowych traktowanych oksytocyną w celu pobudzenia laktacji, pobrano próbki mleka i próbki te analizowano na obecność rekombinantowego wariantu ludzkiego BSSL. Analizę prowadzono metodą SDS-PAGE, przeniesienia na filtry nitrocelulozowe i inkubacji z przeciwciałami poliklonalnymi przeciw natywnemu ludzkiemu BSSL. Otrzymane wyniki wykazały ekspresję eokombinjntowego wariantu ludzkiego BSSL w mleku transgenicznych myszy. Na fig. 19 przedstawiona jest obecność eekombinantowogo wariantu ludzkiego BSSL w mleku teansgonicznych myszy. Rozdział metodą SDS-PAGE i hybrydyzacja immunologiczna próbek mleka pochodzących z różnych transgenicznych myszy pS317 wykazały wydajne wytwarzanie rekombinantowego wariantu BSSL o niższej pozornej masie cząsteczkowej w porównaniu do m^mb^a^owego BSSL o pełnej długości pochodzącego z mleka myszy trjnjgenlcznych, nosicielek plazmidu pS314. Plazmid S314 jest podobny do plazmidu pS317, z tą różnicą, że pS314 zawiera cDNA dla ludzkiego BSSL o pełnej długości zamiast wariantu genomowego. Podwójne pasmo, które jest widoczne we wszystkich próbkach mysiego mleka reprezentuje mysi BSSL, a zatem wykazuje ono reaktywność krzyżową z antysurowicą. Tę konkluzję potwierdzono obserwacją, że to podwójne pasmo jest widoczne w paśmie 9 na fig. 19, które reprezentuje oczyszczony mysi BSSL.

Generowano ustalone linie zwierząt teansgenicznych.

W podobny sposób można uzyskać inne zwierzęta teansgoniczne, takie jak króliki, krowy i owce, zdolne do ekspresji wariantów ludzkiego BSSL.

Depozyty

Zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim zdeponowano następujące plazmidy w DSM (Deutsche Sammlung von Mlkeooeganismen und Zellkulturen):

Plazmid	Numer depozytu	Data zdeponowania
1	2	3
pS309	DSM 7101	12 czerwca 1992
pS310	DSM 7102
pS311	DSM 7103
pS317	DSM 7104

184 960 cd. tabeli

1	2	3
pS147	DSM 7495	26 lutego 1993
pS257	DSM 7496
pS299	DSM 7497
pS258	DSM 7501	3 marca 1993
pS259	DSM 7502

Figura 1A przedstawia mapę wektora opartego na BPV użytego do ekspresji różnych wariantów BSSL.

Figura 1B przedstawia schematycznie różne zanalizowane warianty BSSL. FL oznacza BSSL o pełnej długości. Miejsce aktywne jest oznaczone kółkiem a miejsce ewentualnego N-związanego węglowodanu jest wskazane trójkątem. Region zawierający powtórzenia jest oznaczony polem zakreskowanym, a konserwatywny C-koniec jest oznaczony polem wypełnionym na czarno.

Figura 2 przedstawia wyniki hybrydyzacji Southema DNA z linii komórkowych wytwarzających warianty BSSL. Analizowano DNA wypreparowany z linii komórkowych, w których zachodzi ekspresja BSSL o pełnej długości (FL), wariantu A (A), wariantu B (B), wariantu C (C) i wariantu N (N). Ilość 5 pg odpowiedniego DNA wypreparowanego, pochodzącego z komórek (po stronie lewej) i 1 ng oczyszczonego wektorowego DNA pochodzącego z bakterii (po stronie prawej) trawiono enzymem BamHI. Próbki DNA rozdzielano na żelu agarozowym, przenoszono na filtr GeneScreen Plus i hybrydyzowano ze znakowanym ³²P cDNA dla ludzkiego BSSL.

Figura 3 przedstawia wyniki hybrydyzacji typu Northern RNA z izolowanych linii komórkowych wytwarzających rekombinantowe warianty BSSL. Analizowano ilość 10 pg całkowitego RNA wypreparowanego z linii komórkowych wytwarzających BSSL o pełnej długości (FL), wariant A (A), wariant B (B), wariant C (C) i wariant N (N). Jako kontrolę negatywną (-) (panel górny) użyto RNA z linii komórkowej C127 zawierającej wektor BPV identyczny z wektorem na fig. 1, ale kodujący białko nie wykazujące pokrewieństwa z BSSL. Filtry hybrydyzowano ze znakowanym ³²P cDNA dla BSSL. Filtr rehybrydyzowano z sondą cDnA mysiej β-aktyny. Sygnały mRNA β-aktyny (panel niższy) użyto jako wewnętrznej kontroli do oznaczania ilości RNA występującego w każdym paśmie.

Figura 4 przedstawia ekspresję aktywności BSSL w komórkach C127 transfekowanych genami dla ludzkiego BSSL o pełnej długości i form zmutowanych. Komórki C127 transfekowano różnymi konstrukcjami BSSL: dla BSSL o pełnej długości (FL), dla wariantu N (N), dla wariantu C (C), wariantu B (B) i wariantu A (A). Po początkowym okresie wzrostu selekcjonowano poszczególne klony i prowadzono ich hodowlę do fazy rozpłynięcia. Ilość wyselekcjonowanych klonów (n) jest wskazana na figurze. Aktywność lipazy oznaczano na pożywkach kondycjonowanych. Aktywność wyrażano w pmolach uwolnionego kwasu tłuszczowego x minuta'1 x ml kondycjonowanej pożywki⁴.

Figura 5A przedstawia wyniki hybrydyzacji Westema rekombinantowego BSSL o pełnej długości i zmutowanego. Ilości aktywności lipazy wyrażonej w pmolach uwolnionego kwasu tłuszczowego x minuta⁴ podawanej na żele były następujące: BSSL o pełnej długości: 0,2 (pasmo 1), wariant N: 0,16 (pasmo 2), wariant. C: 0,6 (pasmo 3), wariant B: 0,8 (pasmo 4) i natywny BSSL: 0,1 (pasmo 5). Jako antysurowicę stosowano antysurowicę królika przeciw BSSL oczyszczonemu z mleka ludzkiego. Po lewej stronie podane są pozycje znaczników masy cząsteczkowej (wstępnie plamione standardy SDS-PAGE, zakres niski, BioRad).

Figura 5B przedstawia wyniki hybrydyzacji Westema wariantu B traktowanego N-glikozydazą F. Wariant B trawiono N-glikozydazą F w sposób opisany w części doświadczalnej. Pasmo 1 przedstawia nietraktowany, a pasmo 2 - traktowany wariant B.

Figura 6 przedstawia zależność od soli żółciowych BSSL o pełnej długości i zmutowanych. Aktywność lipazy oznaczano w obecności różnych stężeń cholanu sodowego (linie ciągłe) albo dezoksycholanu sodowego (linie przerywane) w kondycjonowanych pożywkach

184 960 w próbkach reprezentujących rekombinantowy BSSL o pełnej długości (*), wariantu A (□), wariantu B (Δ), wariantu C (), wariantu N (o) i oczyszczonego BSSL z mleka ludzkiego (O). W przypadku wariantu A kondycjonowaną pożywkę zatężano na żywicy Blue Sepharose w sposób opisany w sekcji „Procedury doświadczalne”. Ilość źródła odpowiedniego enzymu dobierano tak, aby uzyskać ten sam poziom maksymalnej aktywności, za wyjątkiem wariantu A, który wykazywał maksymalną aktywność na poziomie 1/10 aktywności innych wariantów. Kontrolne eksperymenty wykazywały, że pożywki wzrostowe nie wpływają na poziom aktywności ani na zależność natywnego BSSL od soli żółciowych (dane nie są przytoczone).

Figura 7A przedstawia wyniki hybrydyzacji typu Northern BSSL wytwarzanego w różnych szczepach E. coli z zastosowaniem pGEMEX. Bakterie indukowano działaniem IPTG w sposób opisany w sekcji „Procedury doświadczalne”. Warunki doświadczalne są takie same jak podane w opisie fig. 2. Pasmo 1 odpowiada szczepowi BL21(DE3)pLysS nie indukowanemu, pasmo 2 odpowiada szczepowi BL21 (DE3)pLysS indukowanemu, pasmo 3 oznacza JM109(DE3) nieindukowany, pasmo 4 oznacza szczep JM109(DE3) indukowany.

Figura 7B przedstawia wyniki hybrydyzacji Westem’a próbek z elektroforezy w 8-18% żelu SDS-PAGE z zastosowaniem przeciwciał przeciw oczyszczonemu BSSL z mleka, przedstawiający ekspresję rekombinantowego BSSL w różnych szczepach E. coli z użyciem plazmidu pGEMEX. Bakterie indukowano IPTG i z lizatów preparowano białka cytoplazmatyczne i periplazmatyczne w sposób opisany w sekcji „Procedury doświadczalne. Ilości białek bakteryjnych znajdujące się w pasmach 2 do 5 (preparaty periplazmatyczne) i w pasmach 7 do 10 (preparaty cytoplazmatyczne) reprezentują, tę samą objętość hodowli, co daje plamę proporcjonalną do wytwarzanego poziomu. Pasmo 1 oznacza markery wielkości cząsteczki firmy Pharmacia, pasma 2 i 8 oznaczają szczep JM109(DE3) indukowany, pasma 3 i 7 oznaczają szczep JM109(DE3) nieindukowany, pasma 4 i 10 oznaczają szczep BL21 (DE3)pLysS indukowany, pasma 5 i 9 oznaczają szczep BL21 (DE3)pLysS nieindukowany, pasmo 6 oznacza 25 ng oczyszczonego, natywnego BSSL z mleka.

Figura 8 przedstawia wyniki elektroforezy SDS-PAGE oczyszczonego rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL. Rekombinantowy BSSL o pełnej długości (FL) i warianty BSSL N, B i C oczyszczano w sposób opisany powyżej. Na żele naniesiono po 3 pg każdego BSSL za wyjątkiem wariantu B, który naniesiono w ilości 1,5 pg. Zastosowano 5 pg oczyszczonego natywnego BSSL z mleka (MAT). Pozycje markerów wielkości cząsteczek znajdują się po lewej stronie.

Figura 9 przedstawia vw>ływ dezoksycholanu sodowego na aktywację rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL przez cholan sodowy. Oczyszczone preparaty rekombinantowego BSSL o pełnej długości (·), rekombinantowych wariantów BSSL B (O), C () i N (A) oraz BSSL oczyszczonego z naturalnego mleka (□) analizowano na aktywność lipazy wobec różnych stężeń cholanu sodowego, przy braku (lewy panel) i w obecności 5 mM (środkowy panel) albo 10 mM (prawy panel) dezoksycholanu.

Figura 10 przedstawia stabilność rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL przy różnych wartościach pH. Natywny BSSL, rekombinantowy BSSL o pełnej długości i warianty BSSL inkubowano w temperaturze 37°C w różnych buforach w zakresie pH od 2 do 8. Wszystkie bufory zawierały 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. Po 30 minutach pobierano próbki i oznaczano w nich aktywność lipazy. Znaczenie symboli jest takie samo jak na fig. 9.

Figura 11 przedstawia stabilność cieplną rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL. Oczyszczony, rekombinantowy BSSL o pełnej długości, warianty BSSL i natywny BSSL z mleka inkubowano we wskazanych temperaturach w buforze 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Do jednego zestawu próbek dodano albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w ilości dającej stężenie 1 mg/ml. Po 30 minutach pobierano próbki i oznaczano w nich aktywność lipazy. Aktywność wyrażano jako procent aktywności oznaczonej w każdej próbce w czasie 0 minut.. Znaczenie symboli jest takie samo jak na fig. 9.

Figura 12 przedstawia wpływ soli żółciowych na inaktywację rekombinantowego BSSL i wariantów BSSL przez trypsynę. Oczyszczony, rekoTmbinanto''^/ BSSL o pełnej długości, warianty BSSL i natywny BSSL z mleka (15 pl zawierające 1-4 pg) dodano do 60 pl 1,0M buforu Tris-Cl (pH = 7,4) z dodatkiem 10 pg trypsyny (TPCK-trypsin, Boehringer Mannheim)

184 960 w temperaturze 25°C przy braku (linie przerywane) i w obecności (linie ciągłe) 10 mM cholanu sodowego. We wskazanych na wykresie odstępach czasu pobierano próbki i oznaczano w nich aktywność lipazy. Aktywność tę wyrażano jako procent wartości uzyskanych w inkubacjach kontrolnych przy braku trypsyny. Znaczenie symboli jest takie samo jak na fig. 9.

Figura 13 przedstawia sposób otrzymywania plazmidu pS317. Szczegóły podane są w sekcji 3.1.

Figura 14 przedstawia schematycznie strukturę plazmidu pS312.

Figura 15 przedstawia schematycznie strukturę plazmidu pS317.

Figura 16 przedstawia mapę fizyczną reprezentującą fizyczne wprowadzenie struktury genomowej ludzkiego wariantu BSSL do pierwszego egzonu w genie WAP w sposób opisany w sekcji 3.1.

Figura 17A przedstawia schematycznie lokalizację pr^erów PCR użytych do identyfikacji zwierząt transgenicznych. Primer 5' jest usytuowany w sekwencji WAP zaczynając od pozycji -148 par zasad w górę od fuzji między WAP a wariantem BSSL. Primer 3' jest zlokalizowany w pierwszym intronie wariantu BSSL kończącym 400 par zasad w dół od miejsca fuzji.

Figura 17B przedstawia sekwencje użytych primerÓD.

Figura 17C przedstawia 'żel agarozowy ilustrujący typową analizę PCR potencjalnych zwierząt zarodowych. M oznacza markery masy cząsteczkowej. Pasmo 1 oznacza kontrolny produkt reakcji PCR generowany z plazmidu pS317. Pasma 2 do 13 oznaczają reakcje PCR przeprowadzone przy użyciu preparatów DNA pochodzących od potencjalnych zwierząt zarodowych.

Figura 18 przedstawia wyniki analizy przez hybrydyzację typu Northern RNA wypreparowanego z różnych tkanek wyizolowanych od samic myszy transgenicznych, nosicielek pS317. Tkanki izolowano w czwartym dniu laktacji. Ilości po 10 μg całkowitego RNA z każdej tkanki analizowano przez rozdział na agarozie sieciowanej formaldehydem, przenoszono na filtry i hybrydyzowano ze znaczonym ³²P cDNA dla ludzkiego BSSL. Poszczególne pasma reprezentują: gruczoł mleczny (Mg), wątrobę (Li), nerki (Ki), śledzionę (Sp), serce (He), płuca (Lu), ślinianki (Sg) i mózg (Br). Wielkości RNA wyrażone w ilości nukleotydów są wskazane po lewej stronie.

Figura 19 przedstawia wyniki hybrydyzacji metodą Westema mleka otrzymanego od transgenicznych myszy pS317, od myszy traksgekijznach zawierających cDNA dla BSSL o pełnej długości w wektorze pS314 i od zwierząt kontrolnych. Próbki rozdzielano metodą elektroforezy SDS-PAGE, przenoszono na filtry eybrydazacyjne imwobilon i poddawano hybrydyzacji z aktysuraDicą przeciw katawnewu ludzkiemu BSSL. Pasmo 1 oznacza markery masy cząsteczkowej, pasma 2.3 i 4 o^^ai^^^tytąpo 2 μΐ mleka od trzech samic, córek z miotu F1 (F1 30, 31 i 33) od samicy zarodowej FO #91 transformowanej plazmidem pS317, pasmo 5 oznacza 2 μΐ mleka od samicy zarodowej #90 transformowanej plazmidem pS314, pasma 6, 7 i 8 oznaczaj’ąpo 2 μΐ mleka od trzech zwierząt nie transformowanych genem BsSl, pasmo 9 oznacza oczyszczony BSSL mysi, pasmo 10 oznacza oczyszczony ludzki natywny BSSL.

184 960

Piśmiennictwo

Abouakil, N., Rogalska, E. and Lombardo, D. (1989): Biochim. Biophys. Acta 1002, 225-230

Atkinson, S. A., Bryan, M. H. and Andersson, G. H. (1981): J. Pediatr. 99,617-624 Ausubel, F M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A.,

Struhl, K. (eds.) in: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York; edition of 1992)

Baba, T., Downs, D., Jackson, K. W., Tang, J. and Wang, C.S. (1991): Biochemistry 30, 500-510.

Bemback, S., Blackberg, L., and Hemell, O. (1990): J. Clin. I^est. 85,1221-1226 Bjδekjten.B., Burman, L. G., deChateau, P., Fredr^on, B., Golhefors, L. & Hemell, O.

(1980): Br. Med. J. 201, 267-272.

Blackberg, L. & Hemell, O. (1981): Eur. J. Biochem 116,221-225.

Blackberg, L. and Hemell, O. (1983): FEBS Lett. 157, 337-341

Campbell, S. M., Rosen, J. M., Honnighaujon, L. G., Strech-Jurk, U. and Sippel, A. E.

(1984): Nucleic Acid Res. 12, 8685-8697.

Chappell, J. E., Ciandinin, M. T., Keamey-Volpo, C., Reichman, B. and Swyer, P. W. (1986): J. Pediatr. 108,439-447

Fontaine, R., Carter, C. and Hui, D. (1991): Biochemistry 30, 7008-1014

Graham, F. L., and Van der Eb, A. J. (1973): Virology 52, 456-467

Hamosh, M., Freed, L. M., York, C. M., Sturman, J. A. and Hamosh, P. (1986): Fed.

Proc. 45,1452

Han, J. H., Stratowa, C., and Ruder, W. J. (1987): Biochemistry 26,1617-1625 Honnighaujen, L., Ruiz, L. & Wali, R. (1990): Current Opinion in Biotechnology 1, 7478.

Hemell, O. (1975): Eur. J. Clin. I^est. 5,267-272

Hemell, O., Blackberg, L., and Liπdbeeg, T. in: Textbook of gapteoonteeology and nutrition in infancy (Lebenthal, E. ed) pp. 209-217 (Raven Press, New York 1989)

Hemell, O., Staggoej, J. E. and Carey M.C. (1990): Biochemistry 29,2041-2056 Hemell, O. and Blackberg, L. in: Encyclopedia of human biology (Dulbecco, R. ed.)

Vol. 3, pp. 47-56 (Academic Press, San Diego 1991)

Hemell, O., B^ck^rg, L, Chen, Q., Stemby, B. and Nilsson, A.. (1993): J. Pediatr. Gastroontorol. Nutr. (In press)

Hogan, B., Constantini, F. and Lacy, E. (1986): Manipuladng the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Hui, D. and Kassel, J. A. (1990): Febs Lett. 276,131-134.

Kyger, E. M., Wiegand, R. C., and Lange, L. G. (1989): Biochem. Biophys. Res. Commun. 164,1302-1309

Ljommli, U. K. (1970): Nature (London) 227, 680-685

Lidberg, U., Nilsson, J., Stromberg, K., Stenman, G., Sahiin, P., Enerback, S.G. and Bjursell, G. (1992): Genomics 13, 630-640

Lusky, M., and Botchan, M. R. (1984): Cell 36, 391-401

Nilsson, J., Blackberg, L., Carlsson, P., Enerback, S, Hemell, O. and Bjursell, G. (1990): Eur. J. Biochem. 192, 543-550.

Pavlakis, G. N., and Hamer, D. H. (1983): Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 397-401 . Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T. H., Ronk, M., Shively, J. E., Stemby, B., Borgstrom, B., Ameis, D. and Schotz, M. C. (1991): J. Lipid. Res. 32, 267-276.

Saryer, N., Byrne, J. C., and Howell, P. M. (1982): Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79,

7147-7151

Studier, F. W. and Moffat, B. A. (1986): J. Mol. Biol. 189,113-130

Williamson, S., Finucane, E., Ellis, H., and Gamsu, H. R. (1978): Arch. Dis. Childhood

53, 555-563

184 960

WYKAZ SEKWENCJI (1 ) I INFORMACJA OGOLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: AB ASTRA (B) ULI CA: Kvarnbergagaten 16 (C) MIASTO: Sodetalje (E) PAŃSTWO: Szwecja (F) KOD POCZTOWY: (ZIP): S-151 05 (G) TELEFON: +45-8-553 260 OO (H) TELEFAKS: +46-8-553 288 20 (I) TELEKS: 19237 astra s (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Nowe poi ipeptydy (iii) I LOSC SEKWENCJI: 9 (i v) FORMA KOMPUTEROWA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dysk i etka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release #1.0, versja #1.25 (EPO) (vi) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: SE 9300686-4 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 01 MARZEC 1993 (vi) DANE O WCZEŚNIEJSZYM ZGŁOSZENIU:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: SE 9300722-7 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 04 MARZEC 1993 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE ID NR: 1:

( i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2428 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOSC NICI: podwójna

184 960 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI : cDNA komplementarny do mRNA (iii) HIPOTETYCZNA: n i e (iii) ANTYSENSOWNA: n i e (vi i OR? YG HALNE ZRóDŁoO:

(A) ORGANIZM!: człowiek (ho^ sapiens) (F) TYP TKANKI: gruczoł mleczny (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: COS (B) LOKALIZACJA: 82 .2319 (D) POZOSTAŁE INFORMACJE: (produkt ekspresji genu jest lipazą stymulowaną solami żółciowymi (i x) CECHA:

(A) HNZWA/KLUCZ: egzon (B) LCOKA_IZZACJA: 985. 3173 (ix) CECHA:

(A) hAAZWA/KLlUCZ: egzon (B) LOKALI2ZACJA: 3374. 3377 ( i x) CECHA:

(A) HAAZA/KLUCZ: egzon (B) LCOKA-liZACJA: 3378. 3575 (ix) CECHA:

(A) łNAZtfA/KLUCZ: egzon (B) LOKA-I ZACJA: 3333».. ..2435 (i x) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: mat-peptyd (B) LOKALIZACJA: 323....2336 (ix) CECHA:

(A) HAAZWA/KLUCZ: sygnał po! i A (B) LOKL.I ZACJA: 2393.....2402 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: region powtarzalny (B) LOKALIZACJA: 3323...2233 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: 2* UTR (B) LOKAL i ZACJA: 3 83 (i x) CECHA:

184 960 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: jednostka powtarzana (B) LOKALIZACJA: 2218.....2250 (i x) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: j^c^n^c^i^l^l^a powtarzana (B) LOKALIZACJA: 2251....2283 (xi) OOIS SEKWENCJI : SEQ ID IR?: 1:

ACCTTCTCTA TCAGTTAAGT CTCAlGATGC AAGGAACAGC AGTCTCAAGA TATTCAAAG

AGTTTATTCA TTCACACGCT G

CTG Met -23

CTC Leu

ACC Jhrr

ATC Met -20

/·*<*<* IcC» Gly

CGC Arg

CTC Leu

CAA Gln

CTC Leu -15

<CT Vv1

GTG

TTG

GGC

CTC

ACC

TTC

cgc

TCJ

GCA

CTG

TCG

AGT

GCC

cgc;

AAG

CCTJ

Val

Leu

Gly

Leu -10

Tthr

Cc^s

cyn

Trp

AAu --

Val

Alu

Ser

Ala

Ala 1

Lys

Llu

GGC

GCC

GTC

TAC

ACA

GA

GGT

GGG

ttt:

GTG

GA

JCJC

GTC

JAT

AG

AA

Gly

Ala 5

Val

Tyr

Tłu:

du

Gly 0 c

Gly

PPe

Val

Glu

Gly 15

Val

JC»n

Lvs

Lls

CTC

GGC

CTC

CTG

TCT

cca

TCT

GTC

GGC

CTC

ttt:

JAG

JCGC

ATC

CCC

TTT

Leu 20

Gly

Leu

Leu

Gly

Alp 25

Ser

Val

Aip

Ile

PPh 33

Cys

Gly

Ile

Pro

PPh 32

GCA

GCT

CCC

ACC

AG

ccc

ctg

GAA

JAT

CCT

CTA

CCA

CAT

CCT

(GGiC

TTC

Ala

Ala

Pro

Thr

Lys 40

Tlu

Leu

Glu

Arn

Pro 05

Glu

Pito

His

Pro

Cly 50

Trp

CAA

GGG

ACC

CTG

JAG

GOC

ACG

JAC

ttt:

AAC

JAG

AGA

TGC

TCTG

CAG

GCC

Gln

Gly

Thr

Leu 55

Lls

Alu

Lys

An

PPh 60

Lys

Lls

Arg

cys

Leei 60

Gln

Alu

ACC

ATC

ACC

CAG

GAC

acg:

CCC

TAC

GGC

CAT

GJA

GAC

tjcc

cttg

TAC

CTT

Thr

Ile

Thr 70

Gln

Jas

Cer

Thr

*T<r 75

Gll

Asp

Glu

Asp

cys 80

Jlu

Tyr

Llu

AAC

ATT

•TGG

GTG

ccc:

CAG

GGC

ATC

JAC

CAA

GCT

TCC

ccc;

TAC

(CTJ

CCC

Asn

Ile 85

Trp

Val

Ppo

Gln

Gly 0C

Arg

Lys

Cln

Vv1

Ser 95

JCrg

JAp

Leu

Ppp

GTT

ATG

ATC

TGG

ATC

TAT

cgga

GGC

GCC

TTC

CCT

ATC

JCC

TCC

GGC

CTA

Val 100

Met

Ile

Trp

IIe·

lyr 110

Gly

Gly

Ala

Phe

Llc 111

Met

Glu

Cee

Gly

His 111

GGG

GCC

AAC

TTC

CTC

AC

AAC

TAC

CCT!

TAT

GCC

ccc:

GAG

cca;

TTC

GGC

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu 120

JAn

Cnn

T^r

Llu

Tyr 125

Acp

Gly

Glu

Clu

JIe 110

Alu

ACA

CGC

TCA

AAC

CCT

AAT

CTC

GTC

ACC

TTC

JAC

CAC

CCT

crc

(CCC

CCC

Thr

Arg

Gly

Asn 135

Val

IIu

Val

Val

TTh- 110

Phe

Arn

Tys

ja-

Cv1 110

Gly

Ppp

184 960

CTT GGG TTC

CTC Leu

AGC Ser

Ce. C

CCGC GAC GCC Gly Ατρ ACu 105

GCT CCG CCC GGT AAC

TAT Tyr

Gd Gly

63?

Leu

Gly

Phe 150

Asn

Leu

Pro

Gly 160

Asn

CTT

CGG

GAT

CAG

CCG

GCC AGT GCT

CCGC

GTG

AAG

Ad

AAT

ATC

GCC

630

Leu

Arg

Asp

Gln

His

Mee

Ala Ile Ala

Trp

Val

Lys

Arg

Asn

Cle

Ala

165

150

1-75

GCC

TTC

GGG

G\CC

GAG

pCC

CCCe CCe CA t

Α3ί

CCC

“TTC

^lCl

GAG

TCT

GCT

735

Ala

Phe

Gly

Gly

Aes

Ppo

Ces Ces Cle

Thr

Leu

Phe

Gly

Glu

Ser

Ala

080

158

190

105

GGA

GGT

GCC

AGC

GTC

TCT

CTC CAC ACC

CTC

TCC

CCC

TAC

AAC

cg;

GGC

783

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Per

Leu Gil CTh

Leu

Ser

Pro

Cyc

Asn

Lys

Gly

200

205

210

CTC

ATC

CGG

CGA

GCC

ATC

AGC CAG ACC

CGC

GTG

GCC

CTC

ACT

CCC

CGC

831

Leu

Ile

Arg

Arg

ACu

Uli

See Clu Cee

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Pro

TCps

205

220

22S

GTC

ATC

CAG

AGC

CAG

CCA

ccc: ptcpcg

CCC

AAA

AAG

CCCl

GCT

GAG

CCGl

8-79

Val

Ile

Gln

Lys

Aen

Ppo

Leu PPh CCp

Ala

Lys

Lys

Val

Ala

Glu

Lys

230

225

240

GTG

GGT

TGC

CCT

CGG

CGG

GAT GCC CCC

CCGC

ATG

GCC

CAG

CCT

CCCC

ccc;

927

Val

Gly

Cys

Pro

Val

Gly

Aes ACu AGu

Arg

Met

Ala

Gln

cys

Leu

Lys

245

225

255

GTT

ACT

GAT

CCC

CGA

CGCC

CCC ACG CCTC

CGCC

TAT

AAG

GTC

CCG

CCC

CCCC

9-75

Val

Thr

Asp

Pro

JCrg

AGa

Leu CTh Cee

Ala

T^r

Lys

Val

Pro

Lee

Ala

260

266

270

220

GGC

CTG

GAG

TAC

CCC

ATC

ccc; cactat

CTG

CGCC

TTC

CGCC

CCT

CCC

ATT

1023

Gly

Leu

Glu

Tyi:

Ppo

Mec

Leu His: CTs

Cal

GIi:

Phe

Val

Ppo

Val

Ile

280

28S

225

GAT

GGA

GAC

TTC

AGTC

CCC

gcc cgcccc

ATC

AAC

CCTC

TAC

GOC

CCCC

CGCC

1071

Asp

Gly

Asp

Phe

Illi

CPro

ACu Aes Ppo

Cle

Asn

Leu

tyr

AGu

CGn

ACa

295

300

3355

GCC

GAC

ATC

GAC

TAT

ATA

CCA CGCACC

AAC

AAC

ATC

GAC

cgg:

CAC

AGC

1009

Ala

Asp

Ile

Asp

typ

He

CGu Gly CTh

Csn

Asn

Met

Asp

Gly

His

Illi

310

330

330

TTC

GCC

AGC

ATC

GAC

ATC

CCT CCC CGC

CCGC

CCCC

CCGC

CCCC

CCG

CCG

CGC

1067

Phe

Ala

Ser

Ile

JAp

Met

Ppo ACu Clu

Asn

Lys

Gly

CG;n

Lls

Cys

Cal

325

333

333

ACG

GAG

GAG

GAC

TTC

TAC

CCG CCG CGT

CCT

GAG

ctt:

ACA

ACC

acc

CCCC

im

Thr

Glu

Glu

Asp

Phe

CTy

Lls Ceu Aal

Ser

Glu

Phe

Thr

Illi

CCh·

Ays

340

334

3S0

335

GGG

CTC

AGA

GGC

GCC

ccc;

ACGACC CTTC

GAT

GTC

TAC

ACC

CGA

CCC

CCG

1H3

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

CTh CCh Chh

Csp

Val

CCh·

GGu

Psu

PCp

360

365

337

GCC

CAG

GAC

CCA

TCC

ccc;

GAG CCG CAG

AAG

CCCG

ACC*

CGCC

CGCC

CGC

PTT*

1011

Ala

Gin

Asp

Pro

Gln

Glu Cen Ays

Cys

Lys

Tłhr

Val

Cal

Aes

Chh

375

330

338

GAG

ACC

GAT

CTC

CCTC

pctc

CCC CGT: CCC

A<CCC

GAG

AGT

CGCC

CCA

AGC

CCG

1039

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phh

Clu Cal Cpo

CTh·

Glu

Ile

CGa

Lee

AGu

Alu

390

335

440

CAC

AGA

GCC

AAT

CCCC

ccc;

ACG' CGC ccc:

ACC

TAC

GOC

TAC

CCTC

ccc

CCC

10(^7

His

Arg

Ala

Asn

Ala

Lls

See ACu Cls

AThr

ccyr

CGa

pyr

Clu

Phe

Psu

405 410 415

184 960

CAT His 420

CCC Pro

TCT CGG ATG CCC

GTC Val

TAC Tyr

CCC Pro

% » Ί» Lys

TGG Trp 430

GTG G^j\^

GCC Ala

GAC Asp

CAT His 435

1455

Ser

Ąrg

Mec

Pro 425

Val

Gly

GCA

GAT

GAC

ATT

CAG

TAC

GTT

TTC

Z-»/—Χ-»

AAG

CCC

TTC

GCC

ACC

CCC

ACG

1503

Ala

Asp

Asp

Ile

Gln 440

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys 44 5

Pro

Phe

Ala

Thr

Pro 450

Thr

GO _

TAC

CG\j

CCC

CAA

GAC

ACA

GTC

« — i

AAG

GCC

ATG

ATC

GCC

TAC

1551

Gly

Tyr

Arg

Pro 455

Gln

Asp

Arg

Thr

al 4 = 0

Ser

Lys

Ala

Met

Ile 465

Ala

T/r

TGG

ACC

AAC

TTT

GCC

AAA

ACA

GGG

GAC

CCC

AAC

ATG

GGC

GAC

TCG

GCT

1559

Trp

Thr

Asn 470

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly 475

Asp

Pro

Asn

Met

Gly 480

Asp

Ser

Ala

GTG

CCC

ACA

CAC

TGG

GAA

CCC

TAC

ACT

ACG

GAA

AAC

AGC

GGC

TAC

CTG

1647

Val

Pro 485

Thr

His

Trp

Glu

Pro 490

Tyr

Thr

Thr

Glu

Asn 495

Ser

Gly Tyr

Leu

GAG

ATC

ACC

AAG

AAG

ATG

GGC

AGC

AGC

TCC

ATG

AAG

CGG

AGC

CTG

AGA

1695

Glu 500

Ile

Thr

Lys

Lys

Met 505

Gly

Ser

Ser

Ser

Mec 510

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg 515

ACC

AAC

TTC

CTG

CGC

TAC

TGG

ACC

CTC

ACC

TAT

CTG

GCG

CTG

CCC

ACA

1743

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg 520

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr 525

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro 53 0

Thr

GTG

ACC

GAC

CAG

GAG

GCC

ACC

CCT

GTG

CCC

CCC

ACA

GGG

GAC

TCC

GAG

1791

Val

Thr

Asp

Gln 535

Glu

Ala

Thr

Pro

Val 540

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp 545

Ser

Glu

GCC

ACT

CCC

GTG

CCC

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

1839

Ala

Thr

Pro 550

Val

Pro

Pro

Thr

Gly 555

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala 560

Pro

Val

Pro

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

1887

Pro

Thr 565

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala 570

Pro

Pro

Val

Pro

Pro 575

Thr

Gly

Asp

Ser

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

1935

Gly 580

Ala

Pro

Pro

Val

Pro 585

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 590

Gly

Ala

Pro

Pro

Val 595

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

1983

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp 600

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro 605

Val

Pro

Pro

Thr

Gly 610

Asp

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

2031

Ser

Gly

Ala

Pro 615

Pro

Val

Pro

Pro

Thr 620

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala 625

Pro

Pro

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

2079

Val

Pro

Pro 630

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 63 5

Ala

Pro

Pro

Val

Pro 640

Pro

Thr

Gly

GAC

GCC

GGG

CCC

CCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

2127

Asp

Ala 645

Gly

Pro

Pro

Pro

Val 650

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp 655

Ser

Gly

Ala

Pro

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

GTG

ACC

CCC

ACG

2175

Pro 660

Val

Pro

Pro

Thr

Gly 665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 670

Pro

Val

Thr

Pro

Thr 675

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

2223

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr 680

Ala

Pro

Val

Pro

Pro 685

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 690

Ala

184 960

CCC

CCT

CTC

CCC

CCC

ACG

GGT

GAC

TCT

GAG

GCT

GCC

CCC

GTC

CCC

CCC 2271

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Giu

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

695

700

705

ACA

/·« % »T» GA T

CGA

TCC

AAG

GAA

GCT

CAG

* A TG

CCT

GCA

GTC

AAT

AAG

TCTf

TAGCGTCCCA 0005

Thr

Asp

Asp)

Ser

Lys

Glu

Ala

Gln

Met

Ppo

Ala

Val

Ile

Phh

710

715

770

TOAA — TATCAA^A*^^ C—AAAAGAAT CcaCc^CAG A^CC*^CCCCT AAAAT3T*GjA 233o

GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA 2428 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 2 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 745 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEKWENCJA ID NR: 2:

Met

Leu

Ttuc

M ee

Tly

JArg

Leu

Gln

Leu

Val

Val

Leu

Gly

Ilu

Tii

TCr

-23

--2

-15

--1

cys

Trp

Ala

Val

Tla

Ser

Ala

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

Val

iyr

PTh-

dl

-5

1

5

Gly

Gly

Phi)

Val

Glu

Gly

Val

Asn

Lys

Lys

Leu

Gly

Leu

leu

Gly

Aa^P>

10

15

20

22

Ser

Val

Asp

Ile

Phe

Lys

Gly

Ile

Pro

Phe

Ala

Ala

Pro

Thir

Lys

All

30

35

44

Leu

Glu

Asn

Pro

Pin

IPro

His

Pro

Gly

Tr?

Gln

Gly

Thr

Ilu

Ter

TAl

' 45

50

55

Lvs

Asn

Ph<*

Lls

Tys

drg

cys

Lee

Gln

Ala

Tlrr

11«

Thr

dn

TAp

Teu-

60

65

77

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ile

Trp

Val

Pro

Gln

75

80

85

Gly

Arg

Lys

(Gln

Val

Ser

Arg

Asp

Leu

Pro

Val

Met

Ile

Trp

Ile

ITr

90

95

100

115

Gly

Gly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

Ser

Gly

His

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Ais

110

115

110

Asn

Tyr

Leu

Tyr

Asp

Gly

Glu

Glu

Ile

Ala

Tr

JArg

Gly

Asn

Val

TIe

125

13 0

113

Val

Val

Thr

Prr

Asn

ITsc

Arg

Val

Gly

IPro

leu

Gly

Phe

Ilu

Tsr

TTh·

140

145

155

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

Asn

Tyr

Gly

Luu

Arg

Asp

Gln

His

Met

155

160

166

Ala

Ile

Ala

Top

Val

Lys

Arg

Asn

Ile

Ala

Ala

Phe

Gly

Gly

Asp

Ppo

170

1-75

180

115

Asn

Asn

Ile

Thr

Leu

Phe

Gly

Glu

Ser

Ala

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Seu

190

195

220

Leu

Gln

TTn

Leu

Ser

Pro

ciy-r

Asn

Lys

Gly

Leu

Ile

Arg

Arg

AAl

Tle

205

210

221

184 960

Ser

Gln

Ser 220

Gly lal

Ala Leu Ser 225

Pro Trp Val

Ile

Gln 223

Lys

Asn

Puc

Leu

Phe

~i-r

Ala

Lys

Lys

Vs L

ACs

,, VJ X KU

Tua

igI

ciy

Ups

Peu

css

Gly

235

243

22S

Asd

Ala

Mu

Arg

Mec

All

Gln

Cys

Leu

Lys

lal

Thr

ASp

Pro

Arg

Aut

25C

255

250

255

Leu

Thr

Leu

Ala

Mu

Lls

lal

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glut

Tyr

Pro

Mee

270

27

23·:

Leu

His

Tyu

Val

Gly

Phe

Vai

Pro

Val

He

Aep

PMp

Asp

Phe

H^e

Pro

285

290

295

Ala.

Asp

Ppo

Ile

Asn

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ala

Ala

Asp

IIu

Asp

Tyr

Ile

300

305

330

Ala

Gly

TThr

Asn

Asn

Met

Asp

Giy

t is

Ile

yhs

Ala

Ser

IAu

Aeu

Met

315

320

322

Pro

Ala

Ile

Asn

Lys

Gly

Asn

Lys

Lys

Val

Thr

GGu

Glu

Asp

Phe

“sr

330

333

340

345

Lys

Leu

Vvl

Ser

Glu

Phh

Thr

Ile

Thr

Lvs

Gly

Luu

Aug

Gly

Ala

Lvs

350

355

336

Thr

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Tht

GTu

S er

hrp

ASe

TUs

Asp

Peu

ter

Sln

365

370

335

Glu

Asn

Lys

Lys

Lys

Thr

Val

Val

Asp

Phe

Glu

Thu

PAS

Tal

Leu

Phe

380

3S5

335

Leu

Val

Ppo

Thr

Glu

Ile

Ala

Leu

Ala

Gln

Kis

Aug

AAu

Tsn

Ala

Lys

395

400

445

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyu

Ala

Tyr

Leu

Phe

Ser

his

Psu

Ter

Arg

Mit

Pro

410

411

440

445

Val

Tyr

Pro

Lys

TUp

Vil

Gly

Ala

Asp

His

Ala

Asp

Asp

Ilu

Gln

T^r

430

435

440

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

Thr

Pro

Thr

Gly

Tyr

Aug

Pro

Gln

Asp

445

450

445

Arg

TTu·

Val

Ser

Lys

Ala

Mst

Ile

Ala

Trr

Uap

TSu

Ust

PTh

Tla

Sys

460

465

447

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

Asp

Ser

Ala

lal

t ro

TUh

HTh

hrs

Ule

475

4830

448

Pro

Tyr

Thr

Thr

Glu

Asn

S er

Gly

Tyr

Leu

Glu

CUu

Pui

eyh

Lys

Mei

490

445

500

550

Gly

Ser

Ser

Ser

MSt

Lys

Arg

Ser

Seu

eug

gTh

Asn

Phe

Leu

Arg

iyr

510

555

552

Trp

TTh

Leu

Thr

T^h

Leu

Ala

Leu

Pro

laU

Thu

aup

GTh

Glu

Sle

525

530

553

Thr

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

S er

Glu

Ala

GUu

Pro

VaU

Tro

hut

540

545

555

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

roo

Psu

Thr

Ufy

Usp

Aes

UUg

555

560

556

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Ppo

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

IUo

Pro

lal

Pro

570

577

5130

5585

184 960

Pro Thr Gly Asp Ser

Cly

Ala

Pro

Pro Val 595

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp 600

Ser

590

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

605

610

615

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

620

625

630

Ser

Gly

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

G .y

Asp

Ala

Gly

Pro

Pro

Pro

635

640

645

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

650

655

660

665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

67 0

675

680

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

685

690

695

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Asp

Asp

Ser

Lys

Glu

700

705

710

Ala

Gln

Met

Pro

Ala

Val

Ile

Arg

Phe

715

720

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI ED NR: 3 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 722 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: człowiek (homo sapiens) (F) Typ tkanki gruczoł mleczny (xi) Opis sekwencji SEKWENCJA ED NR; 3:

Ala 1

Lys

Leu

Gly

Ala 5

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly 10

Gly

Phe Val

Glu

Gly 15

Val

Asn

Lys

Lys

Leu 20

Gly

Leu

Leu

Gly

Asp 25

Ser

Val

Asp Ile

Phe 30

Lys

Gly

Ile

Pro

Phe 35

Ala

Ala

Pro

Thr

Lys 40

Ala

Leu

Glu

Asn Pro 45

Gln

Pro

His

Pro

Gly 50

Trp

Gln

Gly

Thr

Leu 55

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe Lvs 60

Lys

Arg

Cys

Leu 65

Gln

Ala

Thr

Ile

Thr 70

Gln

Asp

Ser

Thr

Tyr 75

Gly Asp

Glu

Asp

cys 80

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ile 85

Trp

Val

Pro

Gln

Gly 90

Arg

Lys Gln

Val

Ser 95

Arg

Asp

Leu

Pro

Val 100

Met

Ile

Trp

Ile

Tyr 105

Gly

Gly

Ala Phe

Leu 110

Met

Gly

184 960

Ser Gly His

Gly

Ala

Asn

Phe Ceu Asn Asn Tyo Ceu Tyr Asp Gly

Glu

115

122

125

Glu

Ile

Ala

Thr

Aog

Gly

Asn

WU

I le

Val

VaV

Thr

Phe

Asn

Ag

130

135

140

Val

Gly

Pro

lysu

Gly

Phe

Leu

Se

Thr

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

145

150

115

166

Asn

Tyr

Gly

Leu

Ara

Asp

Gin

Vk.s

Met

Ala

IIe

Ala

Trp

Wll

Lw

ko

165

117

115

Asn

Ile

All

Ala

Phe

Cly

Gly

Asp

Pro

Asn

Asn

I1v

Thr

Leu

Ph<e

Gly

180

185

115

Glu

Ser

All

Gly

G1g

Ala

Ser

VaS

Oer

Leu

Gln

Thr

Leu

Ser

Vro

Tus

195

200

205

Asn

Lys

dl

Leu

Ile

Arg

Ag

Ala

Ile

Ser

Gln

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

210

215

222

Ser

Pro

Tto

Lal

Ile

Gin

Lys

An

Pro

Ceu

PPe

Top

Ala

Lys

Lys

Val

225

230

223

224

Ala

Glu

Lys

Lal

Gly

CCys

Pro

Val

Gly

Asp

Ala

Ala

Ag

Met

Ala

Gla

245

225

225

Cys

Leu

Lys

Val

Tho

Asp

Pro

Ag

Ala

Ceu

Tło

Leu

Ala

TTy

Lyy

wa

260

265

220

Pro

Leu

Ala

Gly

leu

Glu

ifyr

Pito

Met

Ceu

His

Tyo

Val

Gly

LPh

wa

275

22C

285

Pro

Val

IIu

Asp

Gly

Asp

Phe

Ile

Pro

Ala

Ap

Pro

VIl

Asn

Lee

LTs

290

225

330

Ala

Asn

All

Ala

Asp

Ile

Asp

Tyr

Ile

Ala

Gly

Thr

Asn

Asn

Met

Alf)

305

310

331

332

Gly

His

IIl

Vhe

Ala

Ser

Ile

Asp

Met

Pro

All

Ile

Asn

Lys

Gly

Asm

325

333

333

Lys

Lys

Vvl

Thr

Glu

Glu

Asp

Piie

Tyr

Cys

Leu

Val

Ser

Glu

Lhe

Tło

340

345

330

Ile

Thr

Lyy

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys

Tho

Tho

Phe

Asp

Vv1

lyr

LTo

355

360

365

Glu

Ser

Tro

Ala

Gln

Asp

Pro

Ser

Gln

Glu

Asn

Lyy

Lyy

Lyy

LTo

Vv1

370

375

338

Val

Asp

Phe

Glu

Tho

Asp

Val

Leu

Phe

Ceu

Va!

Pro

Tho

Glu

Ile

Ala

385

390

335

440

Leu

Ala

GGu

His

Aog

Ala

Asn

Ala

Lys

Ser

All

Cys

Tho

Tyr

Ala

TTs

405

411

441

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

Arg

Met

Pro

Val

Tyo

Pro

Lys

TTP

wa

Gly

420

425

443

Ala

Asp

HHs

Ala

Asp

Asp

Ile

Gln

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Lł^e

Ala

435

440

445

Thr

Pro

TTo

Gly

Tyo

Aog

Pro

Gln

Asp

Aog

Tho

Wal

See

Lyy

All

Mee

450

455

446

Ile

Ala

Tyo

Trp

Tho

Asn

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

465

470

475

480

184 960

Asp

Ser

Ala

Val

Pro 485

Thr

His

Trp

Glu

Pro 490

T/t

Thr

Thr

Glu

Asr· 455

Ser

Cly

Tyr

Leu

Glu 500

Ile

Thr

Lys

Lys

Met 505

ciy

Sez

Ser

Ser

Met 510

Lys

Arg

Ser

Leu

Aro 515

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg 52C

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr CT Ϊ

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro 530

Thr

Val

Asp

Gln 535

Glu

A^d.

Thr

Pro

Val 540

Pro

Pro

Gly

Asp 545

Ser

Glu

Ala

Thr

Pro 550

Val

Pro

?ro

Thr

Gly 555

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala 560

Pro

Val

Pro

Pro

Thr 565

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala 570

Pro

Pro

Val

Pro

Pro 575

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 580

Ala

Pro

Pro

Val

Pro 585

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 590

Gly

Ala

Pro

Pro

Val 595

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp 600

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro 605

Val

Pro

Pro

Thr

Gly 610

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 615

Pro

Val

Pro

Pro

Thr 620

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala 625

Pro

Pro

Val

Pro

Pro 630

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 635

Ala

Pro

Pro

Val

Pro 640

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala 645

Gly

Pro

Pro

Pro

Val 650

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp 655

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro 660

Val

Fro

Pro

Thr

Gly 665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 670

Pro

Val

Thr

Pro

Thr 675

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr 680

Ala

Pro

Val

Pro

Pro 635

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 690

Ala

Pro

Pro

Val

Pro 695

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 700

Glu

Ala

Ala

Pro

Val 705

Pro

Pro

Thr

Asp

Asp 710

Ser

Lys

Glu

Ala

Gln 715

Met

Pro

Ala

Val

Ile 720

Arg Phe (2) WORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 4 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 535 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm· człowiek (homo sapiens) (F) Typ tkanki gruczoł mleczny (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Lokalizacja: 1.....535 (D) Inne informacje: / znacznik (nazwa) = wariant A

184 960 (xi) Opis sekwencji: SEKWENCJA ID NR: 4

Ala

Lys

Leu

Gly

Ala

aae

Tyr

Thr

Glu

Gly

Gly

Phu

^rl

Glu

Gln

Vrl

1

5

0 A

15

Asn

Lys

Ler

Leu

GLu

Glu

Leu

GLu

Tsp

Uui

nys

Auo

ll A

PAs

cys

Gly

20

25

30

Ilu

Pro

PPe

Aia

All

All

rop

Lys

Lis

liu

u Gl

Csn

sec

Gir.

ilo

Pro

35

0C

45

Pro

Gly

Tip

G ln

G ly

Thr

Leu

Lys

A la

Lys

Asn

PPe

Len

Lys

Arg

Cys

50

55

60

Luu

Gln

lic

UOc

Ile

TAr

Gln

Asp

Ser

Thr

Tyr

Gly

Asp

Glu

Asp

<Cns

65

70

75

80

Leu

Tyr

Uuc

sec

Ile

TOp

aan

Pro

Gln

Gly

Aog

Lys

Gln

Val

Ser

Arg

55

0

95

Asp

Luu

Ppo

Val

Mv1

eet

lep

Ile

Ile

roi

Sil

Tla

lic

Lru

Luu

Gly

100

105

110

Ser

Gly

Hii

Gly

All

All

Phe

Lrs

Csn

hUL

Tys

Asy

noc

Alu

Tly

SOr

115

12A

125

Glu

Ile

Ala

Thr

Aro

Gly

Asn

Val

Ile

Val

Val

TTh

PPe

Asn

Tyr

Arg

130

135

114

Val

Gly

Ooc

Uep

Gly

Phe

Leu

Ser

Thr

Gly

Asp

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly

145

150

155

HO

Asn

Tyr

G1g

Seu

,Arg

Tsp

sic

Hll

His

Mr

lIl

Tla

lrc

VaO

are

isy

165

17C

175

Asn

Ile

All

Ala

Pre

PSy lip

Agi

Asi

Osr

yrs

A le

lUc

Lie

LUu

Plu

150

155

190

Glu

Ser

All

Gly

Gll

Glr

Ser

Vrl

C er

Uea

lSu

LUu

lec

Sta

Pro

Uus

195

20C

205

Asn

Lys

Gly

Peu

A Ie

Arg

Aog

Ala

IIe

Ser

Gln

Ssi

Cll

Tal

Ala

Leu

210

215

222

Ser

Pro

Tip

Vv1

CH

Tin

lyc

Aen

Asy

Oee

uhe

Trp

Oic

Lyl

Lys

VsV

225

230

235

220

Ala

Glu

Lye

Vv1

All

Cys

isc

VrO

aln

lny

ill

Tla

lap

MrO

Ala

lin

245

25A

255

cys

Luu

Ler

Val

TVr

Tro

Pro

Ars

Tla

Oer

TAl

Leu

A0p

Tyr

Tys

Vrl

260

265

270

Pro

Leu

AAl

Gly

Lgi

LUu

Tyr

Pro

Met

Sn

oeu

Luu

VsA

Gly

Phe

Val

275

20A

285

Pro

Vae

IIl

Trs

Tly

Asp

Phe

Ile

Pro

Ali

Asp

Pro

CH

Asn

Leu

lrr

290

295

330

Ala

Asn

Ala

AAl

Ars

C le

lep

Tys

lir

lUr

lly

Thr

Arc

Ars

Met

Utp

305

30A

315

320

Gly

His

Il«i

PPh

AAl

Per

UO c

Aii

Asi

Utr

All

A le

ιΙΤ

Lys

Lis

lsy

325

30C

335

Lys

Lys

Val

Thr

Glu

Glu

Asp

PGl

Tyr

spr

Uin

Lis

Uuc

GVr

Che

UOi

340

345

350

184 960

Ile Thr

Lys 355

Gly Leu Arg

Cly

Ala 300

Lys

Thrr

Thr

etc

Asp 305

Val

Tyr

Thr

Glu

Sep

Trp

Ala

Gln

Ap

Pro

Srr

Gln

Glu

Asn

L’sc

Lys

Lys

Thr

Val

370

3775

330

Val

Asp

Phe

G Gl

Thr

Asd

Vai

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

I le

Ala

385

3 90

395

4 0C

Leu

Ala

Gln

H is

Cta

Alu

Anr.

Ala

Lys

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyr

Ala

nr y ± J -

¢05

010

405

Leu

Phe

Ssu

T is

Pres

S er

Arg

Mee

Pro

AgJ

Tyr

P ro

AoP

Trp

Tal

sr c

020

42S

433

Ala

Asp

Hss

Ala

Asp

Asp

Ile

Cln

ryp:

Val

Phe

Gly

Lys

Pro

Phe

Ala

035

000

005

Thr

Pro

Thr

Gly

Tyr

Arg

Pro

Gln

Asp

Ag

re—

Val

Srr

Lys

Ala

Met

050

455

400

Ile

Ala

Tyr

Typ

Thr

Arn

Phe

Ala

Lys

Thir

Cly

Αρ

Pro

Ann

Met

Gly

005

470

075

408

Asp

Ser

Ala

Vv1

Pro

Thr

His

Tr—

Clu

Pro

ryp

TTe

Thr

Clu

Asn

Ser

085

090

405

Cly

Typ

Llu

Tlu

Ile

Thr

Lys

Lye

Met

yly

Sis

Ser

ttc

Mel

Cys

Arp

500

505

511

Ser

Leu

Arg

Thr

An

Phu

Leu

Arg

ry—

TAp

TłA

Leu

Thr

Tj-y

Leu

Alu

515

520

525

Leu

Pro

Thr

Val

TUa

Asp

Gln

530 555 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI ID NR: 5 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 546 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: człowiek (homo sapiens) (F) Typ tkanki: gruczoł mleczny (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Lokalizacja: 1.....546 (D) Tm informacje: / znacznik (nazwa) = wariant B (xi) Opis sekwencji: SEKWENCJA ID NR: 5:

Alp 1

Lyn

itu

Cly Ala Val Typ Thr Clu Cly Gly Phe VpI Clu Cly VpI

5

10

15

Ann

Lys

Lys

Len

Gly

Leu

Leu

Git

Ap

ter

Val

Ap

Ile

Phe

Pys

Gly

20

25

30

Ile

Prp

Phe

Ału

Ala

Ppo

Thr

Lys

Mla

hu

Glu

Acn

Pra

Gln

Pro

His

35

00

05

184 960

Pro

Gly 50

Trp

Gln

Gly

Thr

Leu 55'

Lys

Ala

Lys

Asn

Phe 60

Lys

Lys

log

Cys

Lei 65

Gln

Ala

Thr

He

Thr 70

Gln

Asp

Ser

Thr

Tyo 75

GU-

As.

GL·

Asp

Crs 8*0

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ile 85

Trp

Val

Pro

Gln

Gly 00

Arg

ŁY.

G1l

1uL

Seo 95

Arg

Asp

Leu

Pro

vaL 100

Mer

Zie

Trp

He

*T\. T/o 105

Gly

Cly

Ala

Phe

LeU 111

Met

Gly

Ser

Gly

His 115

Gly

Ala

Asn

Pne

Leu 120

Asn

Asn

Tyr

Leu

U^r 125

Asp

Gly

Glu

Glu

Ile 130

Ala

Thr

Llrg

Gly

Asn 13 5

Val

Ile

Val

Val

Thr 114

Phe

Asn

*y/r

Arg

Val 145

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe 150

Leu

Ser

Thr

Gly

Asp 155

Ala

ASsn

Leu

Pro

Gly 1(6(0

Asn

Tyr

Gly

Leu

Arg 165

Asp

Gln

His

Met

Ala 770

Ile

Ala

TOp

Val

Lys 115

Arg

Asn

Ile

Ala

Ala 180

Phe

Gly

Gly

Asp

Pro 115

Asn

3A;n

Ile

Tłh

Llu 119

Phe

Gly

Glu

Ser

Ala 195

Gly

Gly

Ala

Ser

Val 200

Ser

Leu

Gln

Thr

Leu 205

Lsu

Pro

l^r

Asn

Lys 210

Gly

Leu

Ile

Arg

Arg 215

Ala

Ile

Ser

Gln

Ser 222

dy

La i

Ala

Leu

Ser 225

Pro

LTy?

V.al

Ile

Gln 230

Lvs

Asn

Pro

Leu

Phe 235

TUp

Ala

Lys

Lys

Val 220

Ala

Glu

Lys

Val

Gly 245

Cys

Pro

Val

Gly

,te;p 250

Ala

Ala

Arg

Met

Ala 255

giu

Cys

Leu

Lys

Val 260

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala 2(65

Leu

T!h

Leu

Al^

Lys 227

Lys

vai

Pro

Leu

Ala 275

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro 280

Met

Leu

Hii

Tyo

Val 285

Lty

LPe

Val

Pro

Val 290

Ile

Asp

Gly

Asp

Phe 295

Ile

Pro

Ala

AAp

Pro 330

IIl

Lap

Llu

Lyr

Ala 305

Asn

Ala

Ala

Asp

Ile 310

Asp

T/r

Ile

Ala

Gly 315

Thr

Asn

Asn

M^t

•tep 332

Gly

His

Ile

Płie

Ala 325

Ser

Ile

Asp

Met

Ppo :3:30

Ala

Ile

Asm

Lys

dy 333

.tes

Lys

Lys

Val

Thr 340

Glu

Glu

Asp

Phe

Τ/γ 345

Lys

Llu

Lal

See

du 335

LP^e

TThr

Ile

Thr

Lys 355

Gly

Ieeu

Arg

Gly

Ala 360

Lys

Thr

Thr

Phe

Aap 365

Lal.

Lyr

LTu

Glu

Ser 370

τη?

Ala

Gln

Asp

Pro 3-75

Ser

Gln

Glu

Aap

Lys 338

Lys

Lys

LTut

Lal

Val 385

Asp

Phe

Glu

TJhr

Asp 390

Val

Leu

Phe

Leu

Val 395

Pro

«UL

Glu

IIli

AAu 440

Leu

Ala

Gln

His

Arg 405

Ala

Asn

Ala

Lys

See 400

Ala

Lys

Tło

Tyr

All 411

“U^r

184 960

Leu

Pee

Ser

His 420

Pro

Spr

terr MeA

Pro 425

Val

Oyr

Sro

Lys

Tpp 430

Val

Gly

Ala

Asp

Hh;

Ala

Asp

Asp

He

Gln

Tyr

Gal

Phe

Gly

Lys

PPh

Phe

G-y

435

440

445

Thr

?PO

Thr

Gly

Tyr

Arg

Ppo

Gle

Asp

Ara

Thr

Val

Ser

Lls

AAa

Met

4 5 0

445

4 40

Ile

Ala

Ty*3T

Trp

Asn

? pe

Ala

Lys

t er

Gly

AAP

Pro

AAn

Met

Gl-/

455

470

475

430

Asp

Ser

Ala

Val

Pro

Thr

His

Trp

Glu

Pro

Tyr

Thr

Thr

Glu

Ase

Ser

435

490

495

Gly

Tyr

Leu

Glu

Ile

TAsr

Lys

Lys

Met

Gly

Ser

S er

Sos

MsU

Lys

JU:g

500

555

551

Ser

Leu

Arr

Thr

Asn

Oas

Leu

Arg

Tyr

TOg>

sott

Leu

Thr

Tyr

Leu

Air

515

520

552

Leu

Pro

Thr

Val

Thr

Asp

Gln

Lys

Glu

Ala

Gln

Mit

Pro

Ala

Val

Ile

530

533

554

Arg Phe

545 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 6 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 568 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm· czfowikk (homo sapiens) (F) Typ tkanki: gruczoł mleczny (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: peptyd (B) Lokalizacja: 1.....568 (D) Inne informacje: / znacznik (nazwa) = wariant C (xi) Opis sekwencji: SEKWENCJA ID NR: 6

Ala 1

Lys

Leu

Gly

Ala 5

Val

TTr

Tho

Glu

Gly 10

Gly

Phe

Val

Glu

Gly Val 15

Asn

Lys

Lys

Leu 20

Gly

Leu

Le^u

Gly

Asp 25

Ser

Val

Asp

Ile

Phe 30

Lys Gli

Ile

Pro

Phe 35

Ala

Ala

Pro

Tlo·

Lys 40

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro 45

Gln

Pro His

Pro

Gly 50

mp

Gln

Gly

Tho

Leu 5S

Lys

Ala

Lys

As»n

Phe 00

Lys

Lys

Arg Cys

Lut 65

Gln

Ala

Thr‘

Ile

OSr 7S

G ln

Asp

Ser

Tin

Tyr 77

G ly

Asp

Glu

OTy Sys 80

Lut

Tyr

Llu

Asn

Ilei 85

Tsp

Val

Pro

C ln

Gly 90

Arg

Lys

Gln

Val

Srr Srg 95

184 960

Asp

Leu

Pro Val 10C

Met

lit Trp

lit

Τ/Γ 115

GPy

Gly

AR

Phe

Luu 110

Met

Ply

Seu

Gly

His

Gly

All

Asn

Phe

Leu

Ass

Asn

Tyt

Leu

m a « *

Asp

Cly

Phi

115

122

IH

Glu

Ile

Ala

Thr

Aro

Gly

Asn

Val

Ile

Vai

Val

TłrU

Phe

Asn

Thu

Arg

130

125

114

Vil

Gly

Pro

Luu

Glu

Phe

Leu

Ser

Thu

Gly

Asp

Ala

Asn

Luu

Pro

Gly

145

150

115

10 i

Asn

Tyu

Gly

Leu

Aa·

Asp

Gln

His

Met

Ala

Ile

Ala

Trp

Vil

Lys

AUt

165

110

175

Asn

Ilu

Ala

All

Phe

Gly

Gly

Asp

Ppo

LAn

Asn

IIu

Thu

Leu

Phu

GSy

180

110

110

Glu

Auu

AR

GUy

Gly

Ala

Ser

Val

Siu

Leu

Gln

Thr

Luu

Ser

Pro

Mur

195

220

22^

Asn

Lys

Glp

Teu

Ile

Aug

Am

AR

lie

Atu

Gln

Ser

Gly

Val

Ali

Uuu

210

215

222

Ser

Puo

TTu·

Val

Ile

Gln

Lys

Asn

Pro

Luu

Phr

Tup

Ala

Lys

Lys

Vul-

225

233

223

200

Ali

GUu

Lys

VtU

Gly

Ccs

Puo

Val

Gly

Asp

AAu

All

Aug

Met

Ali

GR

245

220

255

Cys

Leu

Lys

Vil

Thu

Asp

Pro

Aug

AR

Lee

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

260

226

220

Puo

Luu

AR

Gly

Leu

Glu

Tyu

Pro

Mit

Teu

his

ITr

Val

Gly

Phe

'lal

275

220

220

Puo

Vil

Ile

LAs

Gly

Asp

Phe

Het

Pro

Ali

Asp

Pro

IIu

LAn

Luu

Tyr

290

295

330

Ala

Asn

Ala

Ala

Asp

IIu

Asp

TMu

Ile

Ala

Glp

Thu

Asn

Asn

Mur

Asp

305

310

3 31

300

GUy

his

Ile

Phe

Ala

Se r

lt e

Asp

Met

Puo

AAu

T Ie

Asn

Lys

Gly

Asn

325

333

335

Lys

Lys

Val

Thu

Glu

Glu

Asp

Phe

TTr

Tys

Leu

Vv1

Seu

Glu

Phe

Thr

340

334

335

Ilu

Thu

Lys

Gly

Luu

Aug

Gly

AUt

Lys

TTru

Thu

Phr

Asp

Val

Tyr

Thr

355

336

335

Glu

Auu

LAa

Gln

Asp

Pro

Siu

GUn

Glu

Asn

Lys

Lys

Tys

Thu

Val

370

3-75

330

Vil

Asp

Phe

Glu

Thu

Asp

ViU

Luu

Phe

Luu

Val

Puo

Thu

Glu

t l

Ala

385

330

330

400

Leu

AUt

Gln

His

Ar-s

Ala

Ugn

TT a

Lys

Snt

AR

Lys

MSt

Tlu

Ala

Tyr

405

440

415

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

AUg

Met

Pso

Val

Tyr

Ppo

Tys

OTus

Vil

GSy

420

442

440

Ala

Asp

His

AUR

Asp

Asp

Ile

Gln

TTs

Val

Phu

Glp

Tys

Pro

Phu

Ala

435

440

444

Thu

Puo

flhu

Gly

Tyr

Arrg

Pro

Gln

Asp

AUg

Thu

Vil

Siu

Tys

Ali

Mrt

450

455

446

184 960

Ile 333

SUi

Tyr Trp

Th.r

Ssn 330

hhe

Ala

ly/s

Thr

Gly 333

Asp

P ro

Asn

Met

Gly 430

Asp

Ser

AUa

viu

Pro

Thr

His

Trp

Glu

Pro

GPo

Tho

Thr

Glu

An

Ser

333

390

393

Gly

Tyr

Leu

Clu

Ug

Thr

Lyr

Oys

M et

Cly

Ser

(Gur

Ser

Met

Lys

Arg

300

505

513

Ser

Leu

Arg

« * ·*

Ast

Phe

Arnu

Ary

u, . „

Trp

« » g·

Leu

Thr

Tyr

Leu

Ala

333

52C

325

Ceu

Pro

Thr

VhO

Thr

Asp

Ghn

ClG

n La

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

330

333

330

Ssp

Ser

GUy

Ala

iOo

hro

Val

Pro

Pro

Thr

GUy

Ssp

Ser

lys

Glu

Sla

533

3^0

333

530

Gin

Met

Pro

Ala

Val

IUt

Sog

Phe

333 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 7 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 722 aminokwasów (B) Typ: amrnokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (iii) Hipotetyczna: nie (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: zziowiek (h^omo apierns) (F) Typ tkanki: gruczoł mleczny (ix)-Cecha:

(A) Nazwa/ klucz: peptyd (B) Lokalizacja: 1.....722 (D) Inne informacje: / znacznik (nazwa) = wariant N (xi) Opis sekwencji: SEKWENCJA ID NR: 7

Sla

eys

Leu

Gly

SUi

ViU

Tyr

TTh·

Glu

Gly

GIgu

Phe

Vu1

Phe

V1u

GaA

3

5

0V

15

Asn

Cys

Lys

Leu

Gly

Leu

Leu

Gly

Alp

Ser

Val

Asp

isp

Phe

Ols

V1u

20

25

30

Ile

Poo

Phe

kia.

AULa

PrO

Gho

Lys

Ala

Leu

Glu

An

Pro

GUn

Pro

His

33

40

45

hro

Gly

ur?

Gln

G1g

Thr

Gus

Lyr

OLa

CTa

An

Phe

Sys

Lys

Ag

Ssn

30

H

30

Ceu

Gln

Ala

Thr

I1g

Thr

Gln

Ap

O vr

GUt

Tyr

GLy

St-

Gir.

Ap

Gyy

33

30

73

80

Ctu

Tyo

Leu

Asn

He

Trp

VaL

Pry

G Ln

dy

Ag

Lys

GUt

VaG

Sso

As

33

9L

95

Asp

Ceu

Pro

Val

Met

Ile

TOp

Ue

pyr

Gly

Gly

Ala

Phe

Leu

Met

Gly

300

105

110

Ser

Gly

His

Gly

jua

Asn

Phe

Leu

An

Asn

Tyr

Leu

Gyr

Ap

GGy

Glu

U3

12L

123

184 960

Glu

llu 030

Cla

Thr

Arg

Gly

Csn 135

aal

llu

Vi1

aal

Thr 104

Phe

Csn

Tyr

Crg

ail 045

Gly

Ppo

Leu

Gly

Phe 150

Leu

S^-rP

Tlhr

Gly

Csp 155

Cli

Csn

Leu

Pro

Gl·/ 105

Asn

Typ

Gly

Leu

Arg 065

Asp

Gln

KiS

Met

Ala 170

Ilu

Ala

Trp

aal

Lys Hó

Arg

Asn

lle

ACu

Ala 080

Phe

Gly

Gly

Asp

Pro Us

Arr.

1 _ uiH

Ile

Thr

euu li?C

Phe

Gly

Glu

Sur

ACu 055

Gly

Gly

Ala

Ser

P’al 200

Ser

Leu

Gln

Thr

Leu 205

Ser

Pro

ITs

Csn

Lys

Gly

Leu

Ile

er^g

CPrg 2H

Ala

Ile

Sur

Gln

Ser 222

Gly

Val

Cla

Leu

Sur 225

Pro

ICp

Val

He

Gln 220

Lys

Asn

Pro

Leu

Phe 235

Trp

Ala

Lys

Lys

Pal 224

Cla

Glu

Lys

Val

Gly 245

cys

Pro

Val

Gly

Asp 250

kia

Ala

Arg

Mut

Alu 225

Clu

Cys

Luu

Lys

Val 260

Thn

Asp

Ppo

Arg

Ala 265

Luu

Tłhr

Leu

Ala

Tyr 270

Lys

Val

Pro

Luu

ACa 27 5

Gly

Leu

Glu

TCs

Pro 280

Met

Luu

His

ty^r

Val 213 5

Gly

Phe

Val

Pro

aal 250

Ile

Asp

Gly

Asp

Phe 220

Ile

Pro

Cla

Asp

Pro 330

Ile

A»n

Leu

Tcy

Ali 305

Csn

ACa

Cla

Asp

Ilu 330

Aep

Pyr

Uu

ACu

All 330

ACh

Aes

Pm

Pet:

Asp 332

Gly

Hss

Ile

Phe

Cla 325

See

lle

Gsp

Met

Pro 300

Ala

Ilu

Asn

Lys

Glu 333

Pm

Lys

Lys

Val

Thr 340

Glu

Glu

Aes

Phe

•fyr 345

Lys

Leu

Val

Ser

Glu 3S0

Phe

TTh

llu

Thr

Lys 355

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala 360

Lys

Thr

TChr

PPh

Asp 335

Val

^yr

TTh

Glu

Sur 370

ICpj

Ala

Gln

Asp

Pro 337

Ser

Gln

Glu

Csn

Lys 380

Lys

Lys

CChr

Val

Val 385

Csp

Phe

Glu

Thr

Asp 330

aal

Leu

Phe

Leu

Val 335

•ho

Tłhr

Glu

IPe

Alu 440

Luu

cla

Gln

His

CPrg 405

Ala

Asn

Gli

Lys

See 4H

Ala

Lys

Tłhr

*^yr

AGu 4H

Pcs

Leu

Phe

Ser

His 420

Pro

Ser

Arg

Met

Pro 425

aal

TCm

Ppo

Lys

•cpp 440

Vai

Glu

Ala

Csp

His 435

Ala

Asp

Cs^p

Ilu

Gln 4 40

Tyr

aal

Phe

Gly

Lys 444

Pro

Phe

Alu

Thr

Pro 450

ICh·

Gly

cyn·

Arg

Pro 4455

Gln

Asp

Cng

Thn·

Val 466

Ser

Lys

Ala

MeU

llu 465

Cla

Tyr

COpc

Tin·

Asn 41/0

Phe

Cla

Lys

TCh·

Gly 447

CGp

Pro

Asn

Mee

All 448

Csp

Sur

Ala

Val

Pro 485

Tłhr

His

TOp

Glu

Pro 440

pyr

PCir

Tlhr

Glu

Aes 445

Pee

184 960

Gly

Tyr

Leu

Glu 500

Ile Thr

Lys

Lys

Met 50=

Gly

Ser Ser

Ser

Met 510

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg

Tr.r

Asr.

Phe

Leu

Aro

7vr

Thr

Leu

Trr

• 2 *

Le-

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Thr

Val

Tn* • 4 **

Asp

Gln

Glu

Ala

Tr.r

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

530

53 =

540

Aso

Ser

Glu

Ala

T

Pro

'.'al

Pro

Pro

Trr

Gly

Asp

Ser

Glu

Trr

Al a

54Ś

550

555

550

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

565

570

57S

Gly

Asp

Ser

Glv

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

580

585

590

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

595

600

605

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

610

615

620

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

625

630

635

640

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala

Gly

Pro

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

645

650

655

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

660

665

670

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

675

680

685

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Ala

Pro

690

695

700

Val

Pro

Pro

Thr

Asp

Aso

Ser

Lys

Glu

Ala

Gln

Met

Pro

Ala

Val

Ile

705

710

715

720

Arg Phe (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID NR: 8 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 2184 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Bóść nici: dwie (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (genomowy) (iii) Hipotetyczna: nie (iii) Antysensowna; nie (vi) Oryginalne źródło:

(A) Organizm: człowiek (homo sapiens) (F) Typ tkanki: gruczoł mleczny (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Lokalizacja: 82....2088 (D) Inne informacje: / znacznik (nazwa) = wariant T

184 960 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptyd (B) Lokalizacja: 151....2085 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: region powtórzeń (B) Lokalizacja: 17:56....2052 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 1756 . ...1788 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/khicz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 1789 ....1821 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/khicz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 1822....1854 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/khicz: jednostka powtarzalna (B) Lokalizacja: 1855....1887 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/khicz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 1888.... 1920 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/khicz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 1921.....1953 .(ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 1954.....1986 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: jednostka powtarzana (b) Lokalizacja: 1987......2019 (ix) Cecha:

(A) Nazwa/klucz: jednostka powtarzana (B) Lokalizacja: 2020....2052 (xi) Opis sekwencji: SEKWENCJA ID NR; 8 ryyττyτlTA tcagtta-Agt G1TCAATATT SArnACCn:: agtctcaaga taatgcaaag 60

AlTTTATTyA TCyAlAlGyT G ATC Mut	GCTACC ATC SU CGC CTC CAA CTC GTT	111
Leu	Tho Met Gly Aog -20	Leu Gin Leu Val -15
	-23
GTG	TTG GGC CTC AAC STGC TGC	'GGC	GCA GTG KC GGT	GCC GCG CAA CTC	159
rai	Leu Gly Leu TTh Gys Cys -10	TOp	Ala rai JAu Sur -5	Ala Ala Lls Ce»U 1
GGC	GCC GTC TAC AAC GJAA GGT		TTC GTC CGA GGC	GTC AAT GAG SAG	207
Gly	Ala Val TTyr TTh Glu Gly 5 10	dy	Phe rai du Gly 15	Val Asn Lys Lys
CTC	GGC CTC CTC GGT GAC TCT	GTGS	GAC ATC ITT: AAG	GGC ATC CCC TTC	255
Luu 20	Gly Leu Leu du CA»p Sur 25	Val	JA;p Ile PPe Lys 30	Gly Ile Ppo Phe 35

184 960

CCA Alp

TCT AAl

CCC Pro

ACC AAG

CCC Aid.

CCG Liu

CCA Glu

ACT Asn

CCT Pro 45

PTC Cln

PCA Pro

CCT His

CCT Pro

cecc Gl’/ 50

(yyy Trp

30 3

Thr

Lys 00

CCA

ACC

CTG

(ATG

(^JTC

TAG

CTCc

pyTQ

JAC

PAC

TTA

TCC

CTG

CAG

GCC

3H

Gln

GGu

Thr

Leu 5 5

Lys

(Ad

Lys

Asn

Pne 50

Lys

cys

Cap

Oys

Leu 65

Gin

Ala

ATC

#“»/·»

CAA

CAA

CGAc

Λ- —

»·»»«» * Λ—.

AAA

GAA

CjA a

^TC

CTG

·»»» tC A

ATC

33?

T « t n

Ile

Thr 70

Gln

Asp

w ? *

Thr

77

Gly

Asp

Glu

Asp

Cvs 80

Leu

r-A

Leu

«·»»—· AAC

AAT

PTGG

G*TG

CCC

CAC

gcc

* CTyj

(AG

CCA,

PCT

PTC

CTC

GAC

(cri

CCC

4-J7

Asn

IIe 85

Trp

Val

Gln

Glu 50

Targ

Lys

Glu

Tv1

Pet 55

Trg

Asp

Siu

Pito

CTT

ATG

ATC

ί;;

ATC

TAT

TCA

TGCC

(GCC

TTC

(CTC

ATI

ceii

TCC

TCC

CAP

495

Val 100

Met:

Trp

IIe

Tyr 105

Gll

Cly

Ala

Phe

Leu 110

Met

Gly

Ser

Gl^l

Pis 115

Cee

GCC

CAC

TTC

CTC

TAC

AAA

TAC

CTC

TAT

GAC

OGC

GAG

GAG

ATC

GCC

543

Cly

Ala

lAsn

Phe

Leu 120

Asn

Aap

Pyr

Leu

Tyr 125

.te;p

Giy

Glu

Clu

IIl 113

AAa

CCA

CGC

TCA

PAAC

(GTC

ATC

GGG

(GTC

ACC

TTC

CAC

TAC

CCT

pct:

CGC

CCC

591

Thr

Arg

Gly

Asn 135

Val

He

Val

Va!

Tler 140

Phe

(A>n

(Trr

CArg

Val 110

Glu

Pro

CT

CTC

GTTC

(CTC

(ACC

ACT

CCCI

GAC

GCC

JCCT

CCG

CCA

cccr

TAC

TTT

CCC

S3S

Leu

Gly

Phe 150

Leu

Ser

Thr

GGu

Aso 153

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly 110

ten

(Jy

τι.

CTT

CTC

GAT

CAG

CAC

AAG

GCC

ATT

GCT

CTCl

JGTJ

cacG

CAGJ

JAT

ttt:

CCC

607

Leu

Arg 105

Asp

Gln

His

Met

Alu 117

He

Ala

Trp

Val

Lvs 115

(Arg

ten

PIl

TAu

CCC

ttt:

CGGJ

GAC

CC^^

pac:

PCCC

ATC

ACG

CCT

PTT

CCCi

GCA

TTC

TGC'

75

Ala 180

Phe

Gly

Cly

Asp

Pro 115

(An

Asn

Ile

TTr

Plu 110

Phe

Tly

Glu

Per

Tln 195

GCA

TCT

TCC

ATC

(CTC

TCT

CCT

CAG

ACC

CTC

TCC

CCC

TAC

ccc::

CAT

CCG

773

Cly

Gly

Ala

Ser

Val 200

Ser

Leu-

Gln

Thr

Leu 205

Ser

Hro

Tyr

^n

cys 221

Tly

CTC

AIG

CTC

CGA

TCC

ATC

acg:

CAG

AGC

(ClC

pyyi

TCC

CCG

ACT

TCC

PTC

831

Ltu

Hi

Ag

Ag 215

Ale

IIl

Ser

Gln

Ser 220

Gly

Val

CCLa

Pyr

Ser 222

Pro

Trp

CTC

ATAJ

CAG

AAA

AAC

CCA

crc

TTC

TCG

(CCC

PACA

TAG

CCT

CCT

CCC

PAT

877

Vpl

Ile

Gln 230

Lys

Asn

Pro

Lir

Phe 23 5

ta?

Ala

Lys

Lys

Val 220

TAu

Clu

Cys

CTG

GGT

JTCC

CTT

GTG

cecr

GAT

TCC

TCC

ATC

ATI

(GCC

TAJ

PTC

PTT

TAC

952

Vpl

Gly 205

cys

Pro

Val

Cly

Aap 225

Ala

Ala

Arg

Met

TA. a 255

Gln

PTr

Tlu

cys

CTT

ACT

GAT

CCC

CGA

cecc

CCT

ACG

CTG

GCC

TAT

TAG

(CG

CCC

PTT

TCC

957

Vpl 200

Thr

Ap

Pro

Arg

Ala 265

Leu

•Ππα

Leu

Ala

(^rr 2170

Lys

Val

Pro

Siu

TAu 275

CGC

CTG

GAG

TAC

CCC

ATC

CCG

CTCC

TAT

GTG

cec:

TTC

CCT

CCTT

cyr:

ATT

1102

Cly

Leu

Glu

Tyr

Pro 280

Met

Leu

His

Tyr

Val 285

Gly

Phe

Val

Pro

Tv1 225

PIl

CAT

TCA

GAC

TTC

ATC

CCC

GCT

GAC

CCG

ATC

CAC

(CTl

TAC

TCC

pat

ccc:

1107.

Asp

Gly

Ap

Phe

Ile

Pro

Ala

Asp

Pro

lit

CAin

Picu

•tyr

ACu

Pap

Tlu

255 300 3Q0

184 960

GCC Ali

GAC Asp

ATC GAC TAT

ATA GCA

^^30 Gly 315

ACC CCCG Thr Ain

CAC d^n

ATG GGC

(Gic Gly

CAC His

ATC Ile

1115

Hi 310

Asp Tyr

He

Ala

Mut

Asp 332

TTC

GCC

AGC

GAC

AA*^*

CCCT

GCC

ATC

(AiC

(GCA;

(Gic

AAC

AAG

A^JT

<GTC

1167

PUe

Ali

See

IIii

Aro

Met

Pro

Ala

He

Asn

Li'i

Gl·/

Asn

Lys

Lys

Val

325

330

333

GCG

GGG

GAG

GAC

TAC

AAG

ACTG

(GTC

(Tvj «

GA.?

• iC

ACA

ATCC

·*

(GAG

ms

Glu

Gil

Alp

Pre

TTsr

Lyu

Leu

Val

Seu

GGu

Phe

Thr

He

Tissr

Lvs

340

345

335

3*5 5

GGG

CTC

AGA

Alei

GCC

TACC

ACG

ACC

(ttt

«ΎΊ (cc c

AGlC

TAC

ACC

GCG

TGG

HóCi

Gln

Luu

Arg

Gly

Ala

Lys

«er

Tt^sr

Phe

kss>

Vv1

tyr

Tłur

Glu

S<er

-Tn

3 60

3 35

330

GCC

CAG

GAC

CCA

ATCC

CCCG

GAG

AAT

(CG

(ACG

ACA

ACCT

(GTC

(GTG

GAC

TTl

im

Ala

Gle

Asp

Pro

Ser

Gln

Glu

Asn

Lyn

Luu

Llu»

Tter

Val

Val

Alp

Phe

375

330

335

GAG

ACC

GAT

GTC

TTC

CTC

<GTC

CCC

ACC

GGG

AAT*

(GCC

CTA

GCC

CAG

113 5

Glu

Thr

Asp

V«1

Leu

Phe

Leu

Val

Pro

Tłur

Gil

IIe

All

Leu

Ala

Gln

390

335

440

CAC

AGA

GCC

CAAł

GCC

CCCG

ACG?

(GCC

AAG

ACC

TTC

dC

TAC

PCT?

TlTł

TCC

1140

His

Aog

Ala

Asn

Ala

Lys

Ssi

Ala

Len

Tl.r

tyr

Ala

Tlrr

Luu

PPu

Ser

405

441

441

CAT

CCC

TCT

Cd

ATCG

CCC

GTC

TAC

CCC

(ACC

TTG

CGT?

CCC

dC

TAC

CAT

1145

His

Pro

Ser

(Arg

Met

Pro

Val

'tyr

Pro

Leu

TTr

Tal

Gly

Ala

(Cp

Ηϊβ

420

445

443

445

GCA

GAT

GAC

AAT

CCAG

TAC

CTT

TTC

(GGG

dAC

ccc:

TTC

CCC

TCC

Pd

Ad

1150

Ali

Asp

Asp

Ile

Gln

tyr

Val

Phe

Gly

Leu

Pro

PPu

PAu

Ple

Aro

TTur

440

44^

445

GGC

TAC

Cd

CCC

CCAC

GAC

Ad

ACA

(GTC

TTCT

CCG

tgc

TATG

pat:

TCC

TAC

HU

Gly

Tyo

Arg

Pro

Gln

Asp

drg

Thr

Val

Ser

Ler

All

Tet

ΑΠ

Tll

tyr

455

440

446

TGG

ACC

AAC

TCTT

GCC

AAA

ACA

(GGG

GAC

CCC

(CC

AAl?

Pd

TAC

ATCC

GCT

1159

Top

TUo

Asn

Phe

Ala

Lys

Tłur

Gly

(Asp

Pro

Aap

MeU

CGl

(Cp

Peu

Ala

470

445

485

GTG

CCC

ACA

CAC

TGG

GAA

CCC

TAC

ACT

ACG

G(C

(CC

TGG

Pd

TTC

(CTC

1167

Val

Poo

Thr

His

uri

Glu

Pro

Tłur

Tter

GGl

CCP

Peu

Gil

tys

Leu

455

440

449

GAG

ATC

ACC

CCAG

ACG

ATG

(GGC

Ad

(AGC

TCC

aat;

ACG

CCG

TGG

CCT?

ACGC

1169

Glu

Ilu

TUr

Lys

Lys

Met

Gly

Ser

Ser

Ser

MeU

Llv

(Cr

Peu

Tue

drg

500

505

5H

51^

ACC

AAC

TTC

(CTG

coc

TAC

-TGG

ACC

(CTC

ACC

TAT

CTT?

TGC?

PCT

CCC

ACCC

1504

TUo

Asy

Phe

Leu

Arg

tyr

Tn

Thr

Leu

Tler

tyr

Teu

TAu

Alu

Ppo

TTur

520

525

553

GTG

ACC

GAC

CAG

GAG

(GCC

ACC

CCl

(GlG

CCC

CCC

TCC

CGG

CCC

TTC

GGA?

1179

Vrl

TUo

Asp

Gll

Glu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Ppo

Tler

GGl

(Cp

Per

Glu

535

550

554

GCC

ACT

CCC

GTG

CCC

CCC

Ad

(GGl

GAC

TCC

GAG

ACC

CCC

CCC

AGT

Cd

1501

Ali

TUr

Pro

Val

Pro

Pro

Tlrr

Gly

dsp

Ser

GGu

TlA

All

Prr

Av1

(Pro

550

55515

556

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC

ζ-·*»ν· (gtg

CCG

CCC

ACG

TCT

TACC

TTCC

1155

Pro

TUo

GGy

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro

Val

Ho

Pro

TłA

Gly

Alp

Ser

565

5-70

577

184 960

Gly

Arp 155

Ala

Aia

Lee

Sro

Gly 116

Asn

T/r

Gly Leu Arg 165

Asp dn His Met

Ala

Ile

Alei

Trp

sra

Lls

Sao

Asl

He

Ala

Ala

Phe

Gly

Gl/

Asp

Pro

17 0

17 5

130

185

Asn

Asn

Ilei

Thr

Leu

PPe

cly

Glu

Ser

Ala

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Ser

19C

115

22C

Leu

Gln

Thr

Lee

Sse

Pro

Tys

Asl

Lls

Gly

Luu

Ile

Arg

Arg

Aia

Ile

205

221

221

Sur

Gin

Ser

G Ga

sra

Ala

Leu

Ser

Ppo

Top

rai

Ile

Gln

Lys

Asn

Pro

220

222

230

Luu

PPe

Trp

Ala

Lls

Lys»

v^1·

Ala

Glu

Lys

rai

Gly

cys

Pro

Val

Gly

235

220

245

Asp

Ala

Ala

Arg

Met

Ala

du

Cys

Leu

Lys

Val

Thr

Asp

Pro

SArg

Ala

250

255

260

225

Luu

Tho

Leu

Ala

Tyr

Lys

Val

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

270

227

228

Luu

iss

Tyr

osra

Gly

Phe

Vrl

Pro

Vrl

Ile

Asp

Gly

Asp

Phe

IIe

Pro

285

229

229

Ala

Asp

Pro

I Ii

Asn

Leu

Ty

Ala

Ars

Ala

Ala

Asp

Ile

Asp

syr

IIe

300

330

310

Ala

du

Thr

Asn

Asn

Met

SAp

Gly

His

Ile

Phe

Ala

Ser

IIe

A:p

Met

315

322

325

Poo

Ala

Ile

Asn

Lys

Gly

CA;n

Lvs

Lys

Val

Thr

Glu

Glu

Asp

PPu

syr

330

335

340

334

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

TThr

Ile

Thr

Lys

Gly

Ie»u

Arg

Gly

Ala

Lys

350

335

336

Thr

Thr

Phe

Ars

Val

Tyr

Thr

Glu

Ssr

Trp

Ala

Gln

Asp

Pro

Ser

Gln

365

335

337

Tlt

Asn

Lys

Lls

Lys

Thr

Val

rai

,A;p

Phu

du

Thr

Asp

Val

Leu

PPe

380

338

330

Leu

Val

Pro

Thr

Glu

Ile

Ala

Leu

Ala

Gln

Hss

Arg

Ala

Arn

Ala

Lls

395

440

405

Ser

Ala

Lys

Thr

Tyl

Ala

Tyr

Leu

Phe

Ser

His

Pro

Ser

Arg

Mee

Pro

410

415

420

442

rai

Tyo

Pro

Lys

To?

Vai

Gly

Ala

Asp

His

Ala

Asp

Asp

IIe

Gln

syr

430

443

444

rai

Phe

du

Gys

Pro

Phe

Ala

Tho

Pro

Tho

Gly

Tor

Arg

Pro

Gln

Asp

445

440

445

Aog

Tho

Vrl

Sst

Lys

Ala

Met

Ile

Ala

Tyo

TOp

Thr

Asn

Phe

Ala

Lys

460

445

470

Thr

Gly

Asp

Pro

Asn

Met

Gly

Asp

Ser

Ala

Val

Pro

Thr

His

TTp

Glu

475

480

485

Poo

Tyo

TTr

Tho

Glu

Asn

Ser

Gly

Tor

ieu

Glu

Ile

ΤΤγ

Lys

Lys

Met

490

495

500

SQ0

Gly Sur Sur Sur Met Lys Arg Ser Leu Arg Tho Asn Phe Luu Aog Tyr 510 515 520

184 960

Trp The Leu Tłu·

Tyr

Leu ri. Leu Lro T1l VlU TOr hi. Gln G lu Ail

525

530

535

Tho

Ppo

Val

Pro

Pro

Thr

Cly

Asp

Ses

Clu

Ala

Thi

Ppo

Val

Pro

Pro

S00

555

555

Tho

Gly

Alp

Ser

Glu

Thr

Ab

Pro

Va.l

On

Pal

Thr

Ol.

Asp

Ses

Gly

555

560

565

Ala

Poo

Pro

Val

Pro

Pro

Thi

Cly

Asp

Ser

Gly

Ali

Pro

Pro

Val

Pro

570

555

550

555

Poo

hhr

Gly

Asp

Ser

Gly

All

Pro

Pro

Val

Pro

Pio

Thr

Gly

AS;p

Ser

590

595

600

Gly

All

Pro

Pro

Val

Pro

Ir.

Thr

G ly

Aop

Sta

Gly

Ala

Pro

Pro

Gly l

605

660

66!5

Pro

Ppo

Thr

Gly

Asp

S er

Gly

Ala

Pro

Pro

Vai

Lro

Pro

Thr

Aip

Ast

620

66^

663

Ser

Lys

GUi

Ala

Gln

Met

lro

A lii

Vao

Ile

Arg

Phe

635

600

645

333 930

184 960

Sali

^ις7

535 722 i^!;;h_;j Η·!ΐ-ΓΠΠΗ

Kiren 5SSL o

FL. ΝΗ,-ΗΖ

N. NH—H

Ś22L

122

	1	i 37 5o	535
c.			!b COOH
	z	187	ttt
	1	^3
8.	NH~—		KCCH
	/ -	137
A.	SI-		535 _i-mm

FIG.1B

184 960

Całkowity DNA komórki

Plazmidowy DNA

FL A B C N

FL A B C N

RNA aktywny

FIG. 3

184 960

Ilość klonów FIG.4

184 960

2 3 4 5

FIG.5

184 960

J00 u	„ __&
	Jr\
xn O c
Łeo +J AA		$7
<0		ί
<u 60 a r-ł		-
Π3 ε		$
2 40 (0 ε 3·?		i
20	-		*

-S-—αχΡ' . tg-.-=234 6 S 10 12

184 960

3 4

4.4-

, 123456789 10

M_rx ΙΟ⁴

FIG. 7

184 960

FIG.8

184 960

<*>

Temperatura, °C

Czas minuty

184 960

184 960

HindIII

Natl

Natl

BamHI

5ell

FIG.15

BamHI

184 960

CU

C3

Π3 -z. LO

Es s

E3 o gg σ>

co c

asa c o sa (--so sD

ID β

ω —<

σ> ur o CJ

E3 κπ

E3 <r ro

C^l

β)

W ω

s +J β

n) •H

M >

r-ł

Ό <

Q cr o

o

Lu)

O zz

2Z

O g

β

0)

Cn

184 960

Notl ΚρηΙ

Sali . 7·

WAP /

Z z

x

V \ genomowy DNA nBSSL

-148 _ -400

FIG.17A

Primer Sekwencja( 5' -~5')

5-pnmer CTGTGTGGGAAGAAGGAAGrGTTGT

3'-primer CMCTCCTGACCTCAAGTGATC

FIG.17B

184 960

α.

JC cc

-J<_n

o o tn

ΓΜ «—O

184 960

Mg U Ki Sp He Lu Sg Sr

et.

FIG.18

1234 5678 9 10

FIG.19

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (87)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.
2. 2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
3. 3. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo zastrz. 2, znamienna tym, że koduje wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
4. 4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 3, znamienna tym, że koduje wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
5. 5. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje wariant BSSL zawierający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
6. 6. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasowąprzedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5,6 albo 9.
7. 7. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 6, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5,6 albo 9.
8. 8. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.
9. 9. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 8, znamienna tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
10. 10. Polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR:3.
11. 11. Polipeptyd według zastrz. 10, znamienny tym, że posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
12. 12. Polipeptyd według zastrz. 10 albo zastrz. 11, znamienny tym, że posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
13. 13. Polipeptyd według zastrz. 12, znamienny tym, że posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasowąprzedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
14. 14. Polipeptyd według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
15. 15. Polipeptyd według zastrz. 10, znamienny tym, że jego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją. aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
16. 16. Polipeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
17. 17. Polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek, które posiadają resztę asparaginy w pozycji 187.

    184 960
18. 18. Polipeptyd według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
19. 19. Gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SeQ ID NR: 3.
20. 20. Gen hybrydowy według zastrz. 19, znamienny tym, że wariant BSSL pooiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
21. 21. Gen hybrydowy według zastrz. l9 albo 20, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
22. 22. Gen hybrydowy według zastrz. 21, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną. jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
23. 23. Gen hybrydowy według zastrz. 19, znamienny tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
24. 24. Gen hybrydowy według zastrz. 19, znamienny tym, że koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
25. 25. Gen hybrydowy według zastrz. 24, znamienny tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowi przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
26. 26. Gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.
27. 27. Gen hybrydowy według zastrz. 26, znamienny tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasowi przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
28. 28. Zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.
29. 29. Wektor według zastrz. 28, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
30. 30. Wektor według zastrz. 28 albo 29, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
31. 31. Wektor według zastrz. 30, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
32. 32. Wektor według zastrz. 28, znamienny tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
33. 33. Wektor według zastrz. 28, znamienny tym, że koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
34. 34. Wektor według zastrz. 33, znamienny tym, że koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasowi przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
35. 35. Wektor według zastrz. 28, znamienny tym, że jest wektorem wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.
36. 36. Zdolny do replikacji wektor ekspresyjny zawierający gen hybrydowy zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekw-encją. aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.

    184 960
37. 37. Wektor według zastrz. 36, znamienny tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasowąprzedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
38. 38. Wektor według zastrz. 36, znamienny tym, że jest wektorem wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.
39. 39. Komórka będąca nosicielem genu hybrydowego, który, zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.
40. 40. Komórka według zastrz. 39, znamienna tym, że wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
41. 41. Komórka według zastrz. 39 albo 40, znamienna tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
42. 42. Komórka według zastrz. 41, znamienna tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQIDNR: 3.
43. 43. Komórka według zastrz. 39, znamienna tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
44. 44. Komórka według zastrz. 39, znamienna tym, że kwas nukleinowy koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5,6 albo 9.
45. 45. Komórka według zastrz. 44, znamienna tym, że polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
46. 46. Komórka według zastrz. 39, znamienna tym, że pochodzi z mysiej linii komórkowej C127 albo z E. coli.
47. 47. Komórka będąca nosicielem genu hybrydowego, który zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187.
48. 48. Komórka według zastrz. 47, znamienna tym, że, polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SeQ ID NR: 7.
49. 49. Komórka według zastrz. 47, znamienna tym, że pochodzi z mysiej linii komórkowej C127 albo z E. coli.
50. 50. Sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu, znamienny tym, że: (i) dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu sEq ID NR:3, do genu hybrydowego, zdolnego do replikacji w określonej komórce gospodarza albo w organizmie; (ii) wprowadza się ten rekombinantowy gen hybrydowy do komórki gospodarza albo do organizmu; (iii) identyfikuje się i prowadzi się wzrost wytworzonej komórki w lub na pożywce hodowlanej albo identyfikuje się i reprodukuje się organizm, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu i (iv) odzyskuje się ten polipeptyd.
51. 51. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
52. 52. Sposób według zastrz. 50 albo 51, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
53. 53. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
54. 54. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej wariant BSSL zawierający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.

    184 960
55. 55. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną, w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
56. 56. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
57. 57. Sposób według zastrz. 50, znamienny tym, że stosuje się gen hybrydowy zawarty w wektorze wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.
58. 58. Sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu, znamienny tym, że: (i) dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187, do genu hybrydowego, zdolnego do replikacji w określonej komórce gospodarza albo w organizmie; (ii) wprowadza się ten rekombinantowy gen hybrydowy do komórki gospodarza albo do organizmu; (iii) identyfikuje się i prowadzi się wzrost wytworzonej komórki w lub na pożywce hodowlanej albo identyfikuje się i reprodukuje się organizm, w którym zachodzi ekspresja tego polipeptydu i (iv) odzyskuje się ten polipeptyd.
59. 59. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że dokonuje się insercji cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
60. 60. Sposób według zastrz. 58, znamienny tym, że stosuje się gen hybrydowy zawarty w wektorze wirusa brodawczaka będącego pS258, pS259 albo pS299.
61. 61. Układ ekspresyjny obejmujący gen hybrydowy zdolny do ekspresji w komórce gospodarza albo w organizmie posiadającym ten hybrydowy gen, przy czym podczas ekspresji genu hybrydowego uzyskiwany jest rekombinowany polipeptyd, znamienny tym, że hybrydowy gen uzyskuje się przez insercję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, której to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3, do genu zdolnego do pośredniczenia w ekspresji tego genu hybrydowego.
62. 62. Układ ekspresyjny według zastrz. 61, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
63. 63. Układ ekspresyjny według zastrz. 61 albo 62, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
64. 64. Układ ekspresyjny według zastrz. 63, znamienny tym, że wariant BSSL posiada w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
65. 65. Układ ekspresyjny według zastrz. 61, znamienny tym, że wariant BSSL zawiera mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
66. 66. Układ ekspresyjny według zastrz. 61, znamienny tym, że wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
67. 67. Układ ekspresyjny według zastrz. 66, znamienny tym, że wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
68. 68. Układ ekspresyjny obejmujący gen hybrydowy zdolny do ekspresji w komórce gospodarza albo w organizmie posiadającym ten hybrydowy gen, przy czym podczas ekspresji genu hybrydowego uzyskiwany jest rekombinowany polipeptyd, znamienny tym, że hybrydowy gen uzyskuje się przez insercję sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za

    184 960 wyjątkiem takich cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują polipeptydy posiadające resztę asparaginy w pozycji 187, do genu zdolnego do pośredniczenia w ekspresji tego genu hybrydowego.
69. 69. Układ ekspresyjny według zastrz. 68, znamienny tym, że wstawiona sekwencja kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
70. 70. Pożywka dla niemowląt zawierająca modyfikowany polipeptyd, znamienna tym, że jako modyfikowany polipeptyd zawiera polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR:3.
71. 71. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 70, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
72. 72. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 70 albo 87, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
73. 73. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 72, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawioną jako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
74. 74. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 70, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
75. 75. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 70, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5,6 albo 9.
76. 76. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 75, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.
77. 77. Pożywka dla niemowląt zawierająca modyfikowany polipeptyd, znamienna tym, że modyfikowanym polipeptydem jest polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek, które posiadają, resztę asparaginy w pozycji 187.
78. 78. Pożywka dla niemowląt według zastrz. 77, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.
79. 79. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca polipeptyd jako czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że polipeptydem jest polipeptyd będący wariantem lipazy stymulowanej solami żółciowymi (BSSL) krótszym od 722 aminokwasów, który to wariant BSSL zawiera część sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako reszty 536-722 w sekwencji o symbolu SEQ ID NR: 3.
80. 80. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 79, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający w pozycji C-terminalnej resztę fenyloalaniny.
81. 81. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 79 albo 80, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję Gln-Met-Pro.
82. 82. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 81, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający w części C-terminalnej sekwencję aminokwasową przedstawionąjako reszty od 712 do 722 w sekwencji: SEQ ID NR: 3.
83. 83. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 77, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL posiadający mniej niż 16 jednostek powtarzalnych.
84. 84. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 77, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9.

    184 960
85. 85. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 77, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 5, 6 albo 9. .
86. 86. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca modyfikowany polipeptyd znamienna tym, że modyfikowanym polipeptydem jest polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90 procentach homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7, za wyjątkiem takich cząsteczek, które posiadają resztę asparaginy w pozycji 187.
87. 87. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 86, znamienna tym, że zawiera wariant BSSL, który zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 7.