JPH04506751A - 遺伝子導入動物の乳汁中での成長ホルモンの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子導入動物の乳汁中での成長ホルモンの生産背景技術 本発明は、遺伝子導入哺乳動物の乳汁中での成長ホルモンの生産一般に関する。

ヒト成長ホルモン（ｈＧ）Ｉ）は、を椎動物の正常な成長（こ関わるホルモンカ スケードの一員である。このカスケード＋ｔ、神経系の刺激に応答して、成長ホ ルモン放出因子（ＧＨＲＦ）と呼ばれる陽性の成長因子、あるいはソマトスタチ ンと呼（ずれる陰性の因子のいずれかを放出する様に視床下部力≦誘導されて開 始される。ＧＨＲＦは、脳下垂体を刺激して成長ホルモン（Ｇ）ｌ）を放出させ 、次に、これが肝臓に作用してインシュ１ノン様成長因子Ｉを生産する。これは 、次に、末梢組織の細胞上のレセプターに結合して成長を調節する。゛ソマトス タチン（よ、脳下垂体に作用して成長ホルモンの放出を阻害する。

正常なヒトにおいては、このカスケード（ま、幼児期の間（こは効果的に成長を 調節して、その結果、通常（ま正常な身長の成人になる。しかし、正常な身長に 達しなｌ、Ｘケースカタ少なくとも２つある。１つケースでは、おそらくなんら 力）の遺伝的欠損の結果、背の低い子供は内因性の（Ｊを欠（員して−Ｘる。外 因性のＧＨの投与は、これらの個体のほとんどで、この欠（員を克服するのに効 果的である。もう一方のケース（よ、身長の低い子供は正常レベルの内因性ＧＨ を有して一λる力（、おそらくなにかが外来のＧＨの効果を妨害している場合で ある。これらの患者には有効ではない外来のｈＧＨの投与を包含する処置が期待 されるが、Ｅｍｏｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで行われ、５ｈｉｎｅｒ、Ｇ、、 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅ ｐｔ、　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、ｖｏｌ、　Ｉ Ｖ、　ｐｇ　ｌ−５（１９８０）に報告されている研究では、そのような子供の 約３０％が、外来のｈＧＨ処置に反応を示していることが示された。この研究が なされた後に、Ｒｕｄｍａｎらは、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｊｓｍ、　４９゜９２−９９ 　（１９７９）で、外来ＧＨに反応を示した身長の低い子供の亜集団では、内因 性のＧＨがＧＨレセプターに結合する能力を欠いていることを報告した。この研 究は、ｈＧＨ処置により助けられ得る身長の低い子供たちの群を効果的に拡大し た。

身長の低いある種の子供たちの処置に用いられるのに加えて、免疫調節における ＧＯの役割を示唆する新たな効果が現れた。Ｋｅｌｓｅｙらは、Ｎｕｅｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１５．１４５９−１４７４　（１９８７）に おいて、ラット中で、ＧＨはマクロファージを刺激して正常の２倍以上のスーパ ーオキサイドアニオン（０２−）を’４［し得ることを報告した。スーパーオキ サイドアニオンは、マクロファージによる病原性微生物の細胞内破壊に関わる中 間生成物の１つである。この機能は、イノターフェロンによっても行われる。マ クロファージは、多くの免疫応答の誘導および発現に重要であるので、ＧＨがこ のような様式でこれらのマクロファージに作用することが発見されたことは、Ｇ Ｈの他の重要なマクロファージ活性化特性の発見に導き得る。

ｈＧＨの他の可能性のある治療上の適応には、創傷、軟骨の損傷および骨折の治 癒の促進、および火傷、ストレス潰瘍、高コレステロール血症および骨粗しよう 症の治療での使用が含まれる。

成長ホルモンは種特異的であるので、ｈＧＨはヒトの死骸の脳下垂体からの精製 産物として限られた量でのみ入手可能であった。Ｍａｒｔｉａｌらが、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２０５．６０２−６０６　（１９７９）で最初に報告したように、最近 のクローニング、および細菌中でのこのクローニングされた遺伝子の発現が、ｈ Ｇ）ｌの入手可能性を増大させたにもかかわらず、比較的収量が少ないことおよ び精製が困難であることから、ｈＧＨ処置は、患者−人当り年間＄８、０００か ら＄３０．０００の費用がかかる。ｈＧＨの高収量での生産の安価でより効果的 な方法は、患者のとっても、そしてｈＧＨの他の性質を調べる新たな研究の開始 にも有利であるのは明らかである。

提案されたＧＨの生産の変法は、遺伝子導入動物での発現を介しての方法である 。不運にも、成長ホルモンの遺伝子を組み込む遺伝子導入動物でのホルモンの発 現は、多くの意外な副作用を有していた。例えば、Ｒａｍａｂｈａｄｒａｎらが 、箪３８４１１１−１１８に記載しているように、誘導し得るメタロチオネイン のプロモーターと組み合わせてｂＧＨの遺伝子を有するブタにおいては、その動 物は重症の早期発症のリウマチ様関節炎にかかっていた。Ａ、Ｂａｒｔｋｅら、 Ｊ、ＥＸ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｚｏｏ、２４８．　１２１−１２４　（１９８ ８＞に報告されているように、マウスメタロチオネインＩプロモーターと融合さ れたｈＧＨの遺伝子を有する遺伝子導入マウスは、不妊性である。さらに、Ｋｙ ｕｎｇ−Ｋｖａｎｇう、Ｋｏｒｅａｎ　Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、３１（３） 、１３９−１４７　（＋９８９）も参照のこと。

全身的な影響を避け、精製収量を増大させる１つの方法は、組織特異的プロモー ターと組み合わせてＧＨ遺伝子を組み込んだ遺伝子導入動物を創生ずることであ る。例えば、細菌中での組換えｈＧＨの生産に変わるコスト効果的な生産法は、 遺伝子導入された家畜の乳汁中での生産である。高度に発現された遺伝子産物を 得るために、目的の遺伝子を組織特異的プロモーターに結合することによって、 制御配列に適した組織内で目的の遺伝子の特異的な発現が達成され得る。組織特 異的配列および伴う問題に関するいくつかの方法論は、例えば、インビトロでの 細胞培養での発現とインビボでの発現との相関関係がないこと、および襟的とし た組織で通常発現される制御タンパク質の影響に関して、Ｓ、Ａ、　Ｃａｏ＋ｐ ｅｒのＢｉｏＬｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ５（７）、６３８．６４１−６４３　（１９ ８７）で議論されている。

問題はあるが、組換えタンパク質を大量に生産する手段として、細菌培養あるい は組織培養に変わる、外来タン、ｆり質の遺伝子導入動物での生産は、魅力的で ある。マウスおよびヒツジ血清中でのヒトα−１−抗トリプシンの生産がＫｅｌ ｓｅｙら、（１９８７）により、ならびに、マウス乳汁中のヒツジβ−ラクトグ ロブリンおよびヒ）　ｔ−ＰＡの生産が５ｉｉｏｎｓら・反旦ｕｒｅ　３２８・ ５３０−５３３　（１９８７）およびＧｏｒｄｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ 　５．１１ｇ３−１１１１７（１９８７）を含む成功例が報告されている。数抽 類のタンノくり質が乳汁中に、ｌリッター当り１６グラムもの濃度で存在するこ とが、Ｃ１ａｒｋら、Ｔｒｅ　ｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ」工５．　２０−２ ４　（１９８７）に報告されている。

乳腺組織中で選択的に発現される乳汁タンパク質の、制御領域Ｔ　ｌニア　ｈａ シ遺伝子を配置することによって、このような高レベルで得られ得るかどうかを 予測することは不可能である。

しかし、１０％の効率でも発現レベルは１９／ターあたり１．６グラムであり、 これは細菌あるいは哺乳類細胞系での現状の生産レベルよりは有意に高い。

従って、本発明の目的は、成長ホルモン、特にヒトの成長ホルモンの組織特異的 発現をし得る遺伝子導入動物の提供にある。

さらに、本発明の目的は、自身の乳汁中に成長ホルモンの発現をさせる遺伝子を 安定に転移させる遺伝子導入動物の提供にある。

さらに、本発明の目的は、成長ホルモンの！繊持異的発現をし得る遺伝子導入動 物を創生ずるために用いる、成長ホルモン、特にヒトの成長ホルモンの発現のた めのベクターおよび制御配列の提供にある。

発明の要旨 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードするＤＮＡを、マウスノ乳清酸性タンパク 質プロモーターのフラグメン］・に結合して、マウスの受精卵にマイクロインジ ェクションした。得られた遺伝子導入マウスの雌を交配した。妊娠および腹子の 誕生後、母親の乳汁をアッセイしてｈＧ）Ｉタンパク質が含有されていることを 確認した。

図面の簡単な説明 図１は、ｈＧＨの遺伝子と組み合わせたＷＡＰの組織特異的プロモーターを有す る、ｐＷＡＰｈＧＨ融合ベクターの構築の概略図である。

発明の詳細な説明 以下に詳細に記載されている、薬学剤としての使用のために単離され得そして精 製され得る、ヒト成長ホルモンを自身の乳腺で発現する遺伝子導入マウスの構築 には、ヒト成長ホルモンの発現および精製のために、少し改変はあるが、同じ遺 伝子および組繊特異的プロモーターが、他の種の動物種、例えば、ラット、ウサ ギ、ブタ、ヒツジおよびウシに組み込むために用い得る。同様に、ウシあるいは ブタの成長ホルモンなどの他の起源の成長ホルモンの遺伝子は、同様のベクター に組み込ませ、所望の種のゲノムに挿入し得る。

遺伝子導入動物中での成長ホルモンの生産には、正常のグワコシル化および狭雑 細菌が存在しないことを含む、細菌の培養工程で生産される組換え成長ホルモン と異なる、多くの利点がある。

験計百および　： ベクター構築： ｐｍＷＡＰＴｓ　Ｉは、Ｌｏｔｈａｒ　Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ博士から得ら れたマウスＷＡＰプロモーターのＥｃｏＲｌ−Ｂａｍ旧フラグメントを有する。

このプロモーターはＰｉｔｔｉｃｅｓらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃ　ｉ、８５．５８７４−５８７８　（１９８８）に記載されている。ｐｍ ＷＡＰＴｓ　ｌを、セユＩおよびｂユＨ１で切断し、Ｐｖｕｌおよび担旧で切断 したｐＯＧｌ（ｉこライゲー７ヨノした。ｐＯＧＨは、ｈＧｌ（をコー　ドする ＤＮＡ配列、および目分自身のポリアデニル化シグナルを有する。Ｅ、　ｃｏｄ ｉへの形質転換後、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ ’ｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ＭａｎｕラスミドｐＷＡＰ　ｈＧＨを単離 した。これを適切な酵素、例え（ス樫Ｒ１，Ｂａｍ旧、Ｓｍａｌ、針上１１　お よびＸｈｏ　ｌでスクリーニング゛した。

その結果は図１に示されている。

マイクロインジェクションのためのＤＮＡの調製：ｐＷＡＰｈＧＨを［：ｃｏＲ Ｉで消化して、ｆＡＰｈＧｌ（融合遺伝子を含有する４７Ｓ４ｂｐのフラグメン トを、１％アガロースゲル上、次ＬＳで透析袋内で電気溶出して単離した（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら（１９８２）の記載（こ従った）。溶出したＤＮＡを沈澱させ、 水で再び溶解して、製造者の取り扱い説明書の通りｅｌｕｔｉｐ−Ｄカラムを通 して精製した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｉｎ、ｃ、 、Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ）。精製したＤＮＡヲ、マイクロインジェクションのため （こ、５ｍＭト１ノス（ｐＨ７，４ンおよびＯ，ＩｍＭＥＤ丁Ａで、３μｚ／ｒ ａ　ｌ濃度（こなるようζこ溶解した。

動物および胚： マウスはＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｏｓｔｏ ｎ、　ＭＡおよびＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｍａｉｎｅ力 ）ら入手した。試薬、ｆｌ＋え？２つ７血ｌ青アルフ゛ミン、ゼラチン、および ブロナーセｉ！Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ 、　ＭＯから人手した。過剰の排卵を誘発するホルモンＰＭＳおよびｈＣＧはＯ ｒｇａｎｏｎ、Ｉｎｃ、、　ＮＪから入手した。

ヒアルロニダーゼはＳｉｇｍａから入手した。制限酵素はＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ ｖｅｒｌｙ、　ＭＡから入手した。　Ｎａｒａ　Ｓｈｉｇｅ、ｌｌ５Ａ、Ｉｎｃ 、、Ｒａ１ｎｉｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏ、、　Ｗｏｂｕｒｎ、　ＭＡ Ｎ造のマイクロマニピュレーターを用いて、前核にＤＮＡをマイクロインジェク ションした。

ＤＭＥ′Ｍ１　胎児ウシ直情、およびＤＰＢＳは、ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ。

Ｇａ１ｔｈｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤから供給された。

胚操作およびマイクロインジェクションの方法は、Ｂ、　Ｈｏｇａｎ、　Ｆ、　 Ｃｏ５ｔａｎｔｉｎｉおよびＥ、　ＬａｃｙのＭａｎｉｐＬＩｌａｔ４１ｇ　ｔ ｈｅ　ＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ”　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８６）に記載されている。妊馬血清（ＰＭＳ）で 、次いで４８時間後にヒトのコリオゴナドトロピンで過剰排卵を誘発させた６週 齢の雌から、マウス接合体を集めた。刺激された雌を雄と同居させ、翌日の朝に 膣栓を調べた。偽妊娠の雌を発情のために選択し、精管切除され不妊と保証され た雄と同居させ、そしてレシピエンドとして用いる。接合体を集め、ヒアルロニ ダーゼ（ｌａｇＺｍｌ）で処理して卵丘細胞を除去した。

前核胚を、ＣＤＩ雄と交尾したＢ４Ｃ３の雌のマウスから回収した。

雌を、卵胞の成長を誘発するために妊馬血清ＰＭＳ　（５Ｉｌ＋）で処理し、排 卵を誘発するためにヒトのコリオゴナドトロピンｈｃＧ（５１Ｕ）で処理した。

胚を、ダルベツコ改変リン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中に回収して、１０％ 胎児ウシ血清添加のダルベツコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。

マイクロインジェクノヨン： Ｎ１ｋｏｎ　ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡に装着したＮａｒｉｓｈｉｇｅのマイクｏｖ 二ビュレーターを用いて、マイクロインジエク／ヨンを行った。

油の下の１００μｍのＤＰＢＳ′ａ中に、胚を保持しながらマイクロインＪンエ ク・／９ンまた。ｎＮＡ溶液を最も大きく見える雄の前核にマイクロインジェク シコンした。前核の膨張によって、インジェク／ヨンの成功をモニターした。

肝移植： インジェクンヨンの直後に、胚を、し／ビエント雌（精管切除された雄ＣＤマウ スと交尾した成熟ＣＤＩマウス）に移植した。

２、２．２−　）リブロモエタノールを用いてレシピエンド雌を麻酔した。雌の 腰を経産腰状態にさせて卵管を露出させ、そして胚を卵管の膨大部分に移植した 。体壁を縫合して、そして皮膚を創傷クリノブで閉めた。同定のために、レシピ エンドの耳を適当に切欠きして、出産まで飼った。

ＤＮＡ組込みのためのサンプリング： ３週齢の時、ＤＮＡ分析のために２〜３ｃｍの長さに尾サンプルを切った。尾サ ンプルを、５５℃振盪機で、０．７ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐｕａ、　Ｏ）、１ ００ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５％ＳＤＳおよび３５０μｇのｐｒ。

ｋｉｅｎａｓｅ　Ｋの存在下で一夜インキユベートして消化した。消化した材料 を等容量のフェノールで一回抽出して、そして等容量のフェノール：クロロホル ム（ｌ　ｌ混合物）で−回抽出した。その上清を７０μｍの３Ｍ酢酸ナトリウム （ｐＨ６，０）と混合して、等容量の１００％エタノールを添加してＤＮＡを沈 澱させた。

ｍｉｃｒｏｆｕｇｅで遠心してＤＮＡを落し、ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄 して、乾燥させ、１００μ１（７）ＴＥノ匂７７−　（１０ｍＭト’）　ス、　 ｐＨ８，０およびｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で溶解した。ｌｏ〜２０μｌのＤＮＡを Ｂａｍ旧およびしσ１１あるいはＥｃｏＲＩで切断して、１％アガロースゲル上 で電気泳動し、ニトロセルロース紙上にプロットし、そして３２Ｐ標識ｈＧＨの ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーシヨンさせた。遺伝子導入マウスをオートラジオ グラフィーで同定した。

遺伝子導入マウスの繁殖： ５週齢のとき、遺伝子導入の雌マウスをＣＤＩ雄と交尾させた。

出産の５Ｓ後、乳汁サンプルを取り、ｈＧＨについて７ノセイした。６〜７週齢 の遺伝子導入雄を２匹のＣＤＩ雌と交尾させた。

Ｆ１同腹子を遺伝子導入について分析した。４匹の陽性雌を取っておいて、５週 齢のときに交尾させた。出産の５日後、乳汁サンプルをｈＧＨについてアッセイ した。

乳汁の収集： 乳汁サンプル（５０〜２００μｍ）を、Ｏ，ＯＳユニ／トの泌乳誘導因子オキシ トンンを注射した、麻酔したマウスから収集した。

乳汁を乳触診の助けによってガラス毛細管で収集した。

ラジオイムノアッセイ： マウスの乳汁中に生産されるヒト成長ホルモンを、　Ｎ１ｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　５ａｎＪｕａｎ　Ｃａｐｉｓｔｒａｎ ｏ、　ＣＡの市販のＲＩＡキットでアッセイした。

ＤＮＡを７２０個の胚にマイクロインジェクンヨンを成功した後、６９の生産子 孫か生まれた。その１４匹、すなわち雄４匹および雌１０匹、は遺伝子導入され 、ＷＡＰｈＧＨを様々なコピー数で育することかわかった。雌を交尾させて、そ して出産後、それらの乳汁す／プルを収集して、ｈＧＨに関してアッセイした。

そのアッセイ結果を下表に示す。

裏］、：　６＜＝、）４人マソスり害しジオ中でのｈ邸免易し６４ｉ、）Ａべし て・・〔よ・・フンローＴ−マウスマウス＃２７はｈＧＨを９７０ｎｇ／ｍｌ　 （９７０μｇ／ｌ）の割合で乳汁の中に生産している。

乳汁の中にｈＧＨを発現する遺伝子導入動物の安定な系統は、乳汁にｇＧＨを最 も高いレベルで発現する雌の交尾によって、および遺伝子導入雄の子孫の交尾に よって、作成される。

これらの遺伝子導入動物を創生ずるのは比較的高い費用であるが、スケールアッ プの費用は比較的低い。これらの生産動物の繁殖の一つの手段としての従来の育 種法に加え、生産目的のために数を増大するために、人工授精および受精卵移植 技術を利用し得る。

本発明の改変および変形は、前記本発明の詳細な説明から、当業者には自明であ る。このような改変および変形は添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図さ れる。

Ｒσ（ＪＲＥ　７ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年３月１１日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．成長ホルモンおよび乳腺組織に特異的なプロモーターをコードする遺伝子を ゲノムに組み込んだ、遺伝子導入哺乳動物であって、該遺伝子が授乳中の雌の遺 伝子導入哺乳動物の乳腺で特異的に発現される、遺伝子導入哺乳動物。
2. ２．前記哺乳動物が、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからな る群から選択される、請求項１に記載の遺伝子導入哺乳動物。
3. ３．前記成長ホルモンがヒト由来である、請求項１に記載の遺伝子導入哺乳動物 。
4. ４．前記プロモータ一が乳清酸性タンパク質のプロモーターである、請求項１に 記載の遺伝子導入哺乳動物。
5. ５．前記哺乳動物が、授乳中のマウス乳汁中に、約５０ｎｇｈＧＨ／ｍｌ乳汁あ るいはそれ以上のレベルで生産される、ヒト成長ホルモンの遺伝子をゲノムに組 み込んだマウスである、請求項１に記載の遺伝子導入哺乳動物。
6. ６．成長ホルモンおよび乳腺組織に特異的なプロモーターをコードする遺伝子を ゲノムに組み込んだ、遺伝子導入哺乳動物を作成する方法であって、授乳中の雌 の遺伝子導入哺乳動物の乳腺で特異的に発現される該遺伝子が、成長ホルモンを コードするヌクレオチド配列と適合したＷＡＰプロモーターを含有するベクター を提供することを包含する、方法。
7. ７．マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群から選択され る哺乳動物の胚へ、前記ベクターをマイクロインジェクションする工程をさらに 包含する、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記成長ホルモンがヒト由来である、請求項６に記載の方法。
9. ９．授乳中の雌の乳汁中での成長ホルモンの産生に関して動物をテストすること 、および乳汁中に最高レベルの成長ホルモンを含有する動物を交配することを、 さらに包含する、請求項７に記載の方法。