JPH06339331A - 遺伝子導入動物の乳汁中での成長ホルモンの生産 - Google Patents

遺伝子導入動物の乳汁中での成長ホルモンの生産

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JPH06339331A
JPH06339331A JP6000169A JP16994A JPH06339331A JP H06339331 A JPH06339331 A JP H06339331A JP 6000169 A JP6000169 A JP 6000169A JP 16994 A JP16994 A JP 16994A JP H06339331 A JPH06339331 A JP H06339331A
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Cha-Mer Wei
ウェイ チャ−メル
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 成長ホルモンを組織特異的に発現し得る遺伝
子導入動物を提供すること。 【構成】 成長ホルモンおよび乳腺組織に特異的なプロ
モーターをコードする遺伝子が、自身の体細胞および生
殖細胞の全てのゲノムに組み込まれ、該遺伝子が授乳中
の雌の遺伝子導入哺乳動物の乳腺で特異的に発現され
る、遺伝子導入哺乳動物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子導入哺乳動物の
乳汁中での成長ホルモンの生産一般に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト成長ホルモン（hGH）は、脊椎動物
の正常な成長に関わるホルモンカスケードの一員であ
る。このカスケードは、神経系の刺激に応答して、成長
ホルモン放出因子（GHRF）と呼ばれる陽性の成長因子、
あるいはソマトスタチンと呼ばれる陰性の因子のいずれ
かを放出する様に視床下部が誘導されて開始される。GH
RFは、脳下垂体を刺激して成長ホルモン（GH）を放出さ
せ、次に、これが肝臓に作用してインシュリン様成長因
子Ｉを生産する。これは、次に、末梢組織の細胞上のレ
セプターに結合して成長を調節する。ソマトスタチン
は、脳下垂体に作用して成長ホルモンの放出を阻害す
る。
【０００３】正常なヒトにおいては、このカスケード
は、幼児期の間には効果的に成長を調節して、その結
果、通常は正常な身長の成人になる。しかし、正常な身
長に達しないケースが少なくとも２つある。１つケース
では、おそらくなんらかの遺伝的欠損の結果、背の低い
子供は内因性のGHを欠損している。外因性のGHの投与
は、これらの個体のほとんどで、この欠損を克服するの
に効果的である。もう一方のケースは、身長の低い子供
は正常レベルの内因性GHを有しているが、おそらくなに
かが外来のGHの効果を妨害している場合である。これら
の患者には有効ではない外来のhGHの投与を包含する処
置が期待されるが、Emory Universityで行われ、Shine
r, G., Research Resources Reporter, U.S. Dept. Hea
lth and Human Services, vol. IV, pg 1-5 (1980)に報
告されている研究では、そのような子供の約30%が、外
来のhGH処置に反応を示していることが示された。この
研究がなされた後に、Rudmanらは、Journal of Clinica
l Endocrinology and Metabolism,49, 92-99 (1979)
で、外来GHに反応を示した身長の低い子供の亜集団で
は、内因性のGHがGHレセプターに結合する能力を欠いて
いることを報告した。この研究は、hGH処置により助け
られ得る身長の低い子供たちの群を効果的に拡大した。
【０００４】身長の低いある種の子供たちの処置に用い
られるのに加えて、免疫調節におけるGHの役割を示唆す
る新たな効果が現れた。Kelseyらは、Nucleic Acids Re
search 15, 1459-1474 (1987)において、ラット中で、G
Hはマクロファージを刺激して正常の２倍以上のスーパ
ーオキサイドアニオン（O2-）を生産し得ることを報告
した。スーパーオキサイドアニオンは、マクロファージ
による病原性微生物の細胞内破壊に関わる中間生成物の
１つである。この機能は、インターフェロンによっても
行われる。マクロファージは、多くの免疫応答の誘導お
よび発現に重要であるので、GHがこのような様式でこれ
らのマクロファージに作用することが発見されたこと
は、GHの他の重要なマクロファージ活性化特性の発見に
導き得る。
【０００５】hGHの他の可能性のある治療上の適応に
は、創傷、軟骨の損傷および骨折の治癒の促進、および
火傷、ストレス潰瘍、高コレステロール血症および骨粗
しょう症の治療での使用が含まれる。
【０００６】成長ホルモンは種特異的であるので、hGH
はヒトの死骸の脳下垂体からの精製産物として限られた
量でのみ入手可能であった。Martialらが、Science 20
5, 602-606 (1979)で最初に報告したように、最近のク
ローニング、および細菌中でのこのクローニングされた
遺伝子の発現が、hGHの入手可能性を増大させたにもか
かわらず、比較的収量が少ないことおよび精製が困難で
あることから、hGH処置は、患者一人当り年間$8,000か
ら$30,000の費用がかかる。hGHの高収量での生産の安価
でより効果的な方法は、患者にとっても、そしてhGHの
他の性質を調べる新たな研究の開始にも有利であるのは
明らかである。
【０００７】提案されたGHの生産の変法は、遺伝子導入
動物での発現を介しての方法である。不運にも、成長ホ
ルモンの遺伝子を組み込む遺伝子導入動物でのホルモン
の発現は、多くの意外な副作用を有していた。例えば、
Ramabhadranらが、Gene 38,111-118に記載しているよう
に、誘導し得るメタロチオネインのプロモーターと組み
合わせてbGHの遺伝子を有するブタにおいては、その動
物は重症の早期発症のリウマチ様関節炎にかかってい
た。A. Bartkeら、J. Experimental Zoo, 248,121-124
(1988)に報告されているように、マウスメタロチオネイ
ンＩプロモーターと融合されたhGHの遺伝子を有する遺
伝子導入マウスは、不妊性である。さらに、Kyung-Kwan
gら、Korean J. Anim. Sci, 31(3),139-147 (1989)も参
照のこと。
【０００８】全身的な影響を避け、精製収量を増大させ
る１つの方法は、組織特異的プロモーターと組み合わせ
てGH遺伝子を組み込んだ遺伝子導入動物を創生すること
である。例えば、細菌中での組換えhGHの生産に変わる
コスト効果的な生産法は、遺伝子導入された家畜の乳汁
中での生産である。高度に発現された遺伝子産物を得る
ために、目的の遺伝子を組織特異的プロモーターに結合
することによって、制御配列に適した組織内で目的の遺
伝子の特異的な発現が達成され得る。組織特異的配列お
よび伴う問題に関するいくつかの方法論は、例えば、イ
ンビトロでの細胞培養での発現とインビボでの発現との
相関関係がないこと、および標的とした組織で通常発現
される制御タンパク質の影響に関して、S.A. CamperのB
iotechniques 5(7), 638, 641-643 (1987)で議論されて
いる。
【０００９】問題はあるが、組換えタンパク質を大量に
生産する手段として、細菌培養あるいは組織培養に変わ
る、外来タンパク質の遺伝子導入動物での生産は、魅力
的である。マウスおよびヒツジ血清中でのヒトαー1ー抗
トリプシンの生産がKelseyら、(1987)により、ならび
に、マウス乳汁中のヒツジβーラクトグロブリンおよび
ヒトt-PAの生産がSimonsら、Nature 328, 530-533 (198
7)およびGordonら、Biotechnology 5, 1183-1187 (198
7)を含む成功例が報告されている。数種類のタンパク質
が乳汁中に、１リッター当り16グラムもの濃度で存在す
ることが、Clarkら、Trends in Biotechnology, 5, 20-
24 (1987)に報告されている。
【００１０】乳腺組織中で選択的に発現される乳汁タン
パク質の、制御領域下にhGH遺伝子を配置することによ
って、このような高レベルで得られ得るかどうかを予測
することは不可能である。しかし、10%の効率でも発現
レベルは１リッターあたり1.6グラムであり、これは細
菌あるいは哺乳類細胞系での現状の生産レベルよりは有
意に高い。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、成長ホルモン、特にヒトの成長ホルモンの組織特異
的発現をし得る遺伝子導入動物の提供にある。
【００１２】さらに、本発明の目的は、自身の乳汁中に
成長ホルモンの発現をさせる遺伝子を安定に転移させる
遺伝子導入動物の提供にある。
【００１３】さらに、本発明の目的は、成長ホルモンの
組織特異的発現をし得る遺伝子導入動物を創生するため
に用いる、成長ホルモン、特にヒトの成長ホルモンの発
現のためのベクターおよび制御配列の提供にある。
【００１４】ヒト成長ホルモン（hGH）をコードするDNA
を、マウスの乳清酸性タンパク質プロモーターのフラグ
メントに結合して、マウスの受精卵にマイクロインジェ
クションした。得られた遺伝子導入マウスの雌を交配し
た。妊娠および腹子の誕生後、母親の乳汁をアッセイし
てhGHタンパク質が含有されていることを確認した。
【００１５】
【課題を解決するための手段】以下に詳細に記載されて
いる、薬学剤としての使用のために単離され得そして精
製され得る、ヒト成長ホルモンを自身の乳腺で発現する
遺伝子導入マウスの構築には、ヒト成長ホルモンの発現
および精製のために、少し改変はあるが、同じ遺伝子お
よび組織特異的プロモーターが、他の種の動物種、例え
ば、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジおよびウシに組み込
むために用い得る。同様に、ウシあるいはブタの成長ホ
ルモンなどの他の起源の成長ホルモンの遺伝子は、同様
のベクターに組み込ませ、所望の種のゲノムに挿入し得
る。
【００１６】遺伝子導入動物中での成長ホルモンの生産
には、正常のグリコシル化および狭雑細菌が存在しない
ことを含む、細菌の培養工程で生産される組換え成長ホ
ルモンと異なる、多くの利点がある。
【００１７】
【実施例】実験計画および実験方法 ： ベクター構築：pmWAPTSIは、Lothar Hennighausen博士
から得られたマウスWAPプロモーターのEcoRI-BamHIフラ
グメントを有する。このプロモーターはPitticesらのPr
oc.Natl.Acad.Sci. 85,5874-5878 (1988)に記載されて
いる。pmWAPTSIを、PvuIおよびBamHIで切断し、PvuIお
よびBamHIで切断したpOGHにライゲーションした。pOGH
は、hGHをコードするDNA配列、および自分自身のポリア
デニル化シグナルを有する。E. coliへの形質転換後、M
aniatisらの方法（Molecular Cloning: A LaboratoryMa
nual (Cold Spring Harbor, NY 1982)）を用いて、作成
したプラスミドpWAPhGHを単離した。これを適切な酵
素、例えばEcoRI、BamHI、SmaI、SphI、およびXhoIでス
クリーニングした。その結果は図１に示されている。
【００１８】マイクロインジェクションのためのDNAの
調製：pWAPhGHをEcoRIで消化して、WAPhGH融合遺伝子を
含有する4754bpのフラグメントを、１％アガロースゲル
上、次いで透析袋内で電気溶出して単離した（Maniatis
ら(1982)の記載に従った）。溶出したDNAを沈澱させ、
水で再び溶解して、製造者の取り扱い説明書の通りelut
ip-Dカラムを通して精製した（Schleicher andSchuell,
Inc., Keene, NH）。精製したDNAを、マイクロインジ
ェクションのために、5mMトリス（pH7.4）および0.1 mM
EDTAで、3μg/ml濃度になるように溶解した。
【００１９】動物および胚：マウスはCharles River La
boratories, Boston, MAおよびJackson Laboratories,
Maineから入手した。試薬、例えばウシ血清アルブミ
ン、ゼラチン、およびプロナーゼはSigma Chemical C
o., St. Louis, MOから入手した。過剰の排卵を誘発す
るホルモンPMSおよびhCGはOrganon, Inc., NJから入手
した。ヒアルロニダーゼはSigmaから入手した。制限酵
素はBiolabs, Beverly, MAから入手した。Narishige, U
SA, Inc., Rainin Instruments Co., Woburn, MA製造の
マイクロマニピュレーターを用いて、前核にDNAをマイ
クロインジェクションした。DMEM、胎児ウシ血清、およ
びDPBSは、GIBCO Laboratories, Gaithersville,MDから
供給された。
【００２０】胚操作およびマイクロインジェクションの
方法は、B. Hogan, F. CostantiniおよびE.Lacyの"Mani
pulating the Mouse Embryo"（Cold Spring Harbor Lab
oratory, 1986）に記載されている。妊馬血清（PMS）
で、次いで４８時間後にヒトのコリオゴナドトロピンで
過剰排卵を誘発させた６週齢の雌から、マウス接合体を
集めた。刺激された雌を雄と同居させ、翌日の朝に膣栓
を調べた。偽妊娠の雌を発情のために選択し、精管切除
され不妊と保証された雄と同居させ、そしてレシピエン
トとして用いる。接合体を集め、ヒアルロニダーゼ（1
mg/ml）で処理して卵丘細胞を除去した。
【００２１】前核胚を、CDI雄と交尾したB6D2の雌のマ
ウスから回収した。雌を、卵胞の成長を誘発するために
妊馬血清PMS（5 IU）で処理し、排卵を誘発するために
ヒトのコリオゴナドトロピンhCG（51 U）で処理した。
胚を、ダルベッコ改変リン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中
に回収して、１０％胎児ウシ血清添加のダルベッコ改変
必須培地（DMEM）中に維持した。
【００２２】マイクロインジェクション：Nikon diapho
t顕微鏡に装着したNarishigeのマイクロマニピュレータ
ーを用いて、マイクロインジェクションを行った。油の
下の100μlのDPBS滴中に、胚を保持しながらマイクロイ
ンジェクションした。DNA溶液を最も大きく見える雄の
前核にマイクロインジェクションした。前核の膨張によ
って、インジェクションの成功をモニターした。
【００２３】胚移植：インジェクションの直後に、胚
を、レシピエント雌（精管切除された雄CDマウスと交尾
した成熟CDIマウス）に移植した。2,2,2-トリブロモエ
タノールを用いてレシピエント雌を麻酔した。雌の腰を
経産腰状態にさせて卵管を露出させ、そして胚を卵管の
膨大部分に移植した。体壁を縫合して、そして皮膚を創
傷クリップで閉めた。同定のために、レシピエントの耳
を適当に切欠きして、出産まで飼った。
【００２４】DNA組込みのためのサンプリング：３週齢
の時、DNA分析のために２〜３ｃｍの長さに尾サンプル
を切った。尾サンプルを、５５℃振盪機で、0.7 mlの50
mMトリス（pH8.0）、100mM EDTA、0.5%SDSおよび350μg
のプロテイナーゼ Kの存在下で一夜インキュベートして
消化した。消化した材料を等容量のフェノールで一回抽
出して、そして等容量のフェノール：クロロホルム
（１：１混合物）で一回抽出した。その上清を70μlの3
M酢酸ナトリウム（pH 6.0）と混合して、等容量の100%
エタノールを添加してDNAを沈澱させた。microfugeで遠
心してDNAを落し、DNAを70%エタノールで洗浄して、乾
燥させ、100μlのTEバッファー（10 mMトリス, pH 8.0
および1 mM EDTA）で溶解した。10〜20μlのDNAをBamHI
およびBglIIあるいはEcoRIで切断して、1%アガロースゲ
ル上で電気泳動し、ニトロセルロース紙上にブロット
し、そして32P標識hGHのDNA配列とハイブリダイゼーシ
ョンさせた。遺伝子導入マウスをオートラジオグラフィ
ーで同定した。
【００２５】遺伝子導入マウスの繁殖：５週齢のとき、
遺伝子導入の雌マウスをCDI雄と交尾させた。出産の５
日後、乳汁サンプルを取り、hGHについてアッセイし
た。６〜７週齢の遺伝子導入雄を２匹のCDI雌と交尾さ
せた。F1同腹子を遺伝子導入について分析した。４匹の
陽性雌を取っておいて、５週齢のときに交尾させた。出
産の５日後、乳汁サンプルをhGHについてアッセイし
た。
【００２６】乳汁の収集：乳汁サンプル（50〜200μl）
を、0.05ユニットの泌乳誘導因子オキシトシンを注射し
た、麻酔したマウスから収集した。乳汁を乳触診の助け
によってガラス毛細管で収集した。
【００２７】ラジオイムノアッセイ：マウスの乳汁中に
生産されるヒト成長ホルモンを、Nichols Institute Di
agnostics, SanJuan Capistrano, CAの市販のRIAキット
でアッセイした。
【００２８】DNAを７２０個の胚にマイクロインジェク
ションを成功した後、６９の生産子孫が生まれた。その
１４匹、すなわち雄４匹および雌１０匹、は遺伝子導入
され、WAPhGHを様々なコピー数で有することがわかっ
た。雌を交尾させて、そして出産後、それらの乳汁サン
プルを収集して、hGHに関してアッセイした。そのアッ
セイ結果を下表に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】マウス＃２７はhGHを970ng/ml（970μg/
l）の割合で乳汁の中に生産している。遺伝子導入マウ
スの胚、胚WAP-hGH(1-49)を、1991年9月11日付けで、th
e American Type Culture Collection, Rockville, MD.
に、受託番号ATCC 72007として寄託した。
【００３１】
【発明の効果】乳汁の中にhGHを発現する遺伝子導入動
物の安定な系統は、乳汁にhGHを最も高いレベルで発現
する雌の交尾によって、および遺伝子導入雄の子孫の交
尾によって、作成される。これらの遺伝子導入動物を創
生するのは比較的高い費用であるが、スケールアップの
費用は比較的低い。これらの生産動物の繁殖の一つの手
段としての従来の育種法に加え、生産目的のために数を
増大するために、人工授精および受精卵移植技術を利用
し得る。
【００３２】本発明の改変および変形は、前記本発明の
詳細な説明から、当業者には自明である。このような改
変および変形は添付の請求の範囲の範囲内にあることが
意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】hGHの遺伝子と組み合わせたWAPの組織特異的プ
ロモーターを有する、pWAPhGH融合ベクターの構築の概
略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 チャ−メル ウェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01604，ウスター，プランテイション ス トリート 285， アパートメント 806 (72)発明者 アンソニー ジェイ． ガラモン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01757 ミルフォード，ハイ ストリート 59

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 成長ホルモンおよび乳腺組織に特異的な
    プロモーターをコードする遺伝子を、自身の体細胞およ
    び生殖細胞の全てのゲノムに組み込んだ、マウス、ラッ
    ト、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群から選
    択される遺伝子導入哺乳動物であって、該遺伝子が授乳
    中の雌の遺伝子導入哺乳動物の乳腺で特異的に発現され
    る、遺伝子導入哺乳動物。
  2. 【請求項２】 前記成長ホルモンがヒト由来である、請
    求項１に記載の遺伝子導入哺乳動物。
  3. 【請求項３】 前記プロモーターが乳清酸性タンパク質
    のプロモーターである、請求項１に記載の遺伝子導入哺
    乳動物。
  4. 【請求項４】 前記哺乳動物が、授乳中のマウス乳汁中
    に、約50ng hGH/ml乳汁あるいはそれ以上のレベルで生
    産される、ヒト成長ホルモンの遺伝子をゲノムに組み込
    んだマウスである、請求項１に記載の遺伝子導入哺乳動
    物。
  5. 【請求項５】 成長ホルモンおよび乳腺組織に特異的な
    プロモーターをコードする遺伝子を、自身の体細胞およ
    び生殖細胞の全てのゲノムに組み込んだ、マウス、ラッ
    ト、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシからなる群から選
    択される遺伝子導入哺乳動物を作成する方法であって、
    授乳中の雌の遺伝子導入哺乳動物の乳腺で特異的に発現
    される該遺伝子が、WAPプロモーターおよび成長ホルモ
    ンをコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを
    提供することを包含し、該プロモーターが、該遺伝子導
    入哺乳動物の乳汁中での該成長ホルモンをコードする配
    列の発現を調節する、方法。
  6. 【請求項６】 マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ
    およびウシからなる群から選択される哺乳動物の胚へ、
    前記ベクターをマイクロインジェクションする工程をさ
    らに包含する、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記成長ホルモンがヒト由来である、請
    求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 授乳中の雌の乳汁中での成長ホルモンの
    産生に関して前記遺伝子導入哺乳動物をテストするこ
    と、および乳汁中に最高レベルの成長ホルモンを含有す
    る動物を交配することを、さらに包含する、請求項６に
    記載の方法。
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