JPH03244332A - 遺伝子移入動物及びその作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は外来遺伝子を発現する哺乳動物、ならびにその
作製方法に係わる。

［発明の背景及び従来の技術］ 自然治癒の期待できない絶望的な臓器を置換して救命す
る臓器移植療法は、すでに血液、皮膚、角膜、腎臓、骨
髄、心臓において一般化されており、肝臓、肺、すい臓
移植が臨床研究の段階にあり、その他の内分泌臓器の移
植が動物実験によって試みられており、今後、心筋ある
いは脳の一部の移植が研究されていくと予測される。

このような臓器移植の研究において移植臓器とそれを受
容する生体との生着の進行を細胞しベルで簡便かつ迅速
に検定する動物実験系は極めて有望であり、大いに待望
されている。

また近年キメラ動物の作製が可能になっており、ある動
物の初期胚細胞と、他の動物の初期胚細胞からキメラ動
物を作製した場合に、いずれかの動物由来の細胞が染色
により識別できれば、繁殖学あるいは発生学において、
極めて有用である。また疾患モデル動物とのキメラ動物
を作製した場合、疾患の伝達と疾患組織の由来との関連
を染色により明らかにする事が出来る。

キメラ遺伝子を哺乳動物の初期胚の細胞に注入し、発生
を継続させて得られる動物はトランスジェニック動物と
呼ばれ、ゴートン等の報告（プロシーディングスオブザ
ナショナルアカデミーオプサイエンス、７７巻、　７３
８０．１９８０　）以来、数多くの報告が為されている
。

また、ヘルペスシンプレックスウィルスのチミンカイネ
スのプロモーターとβ−ガラクトシダーゼの遺伝子とを
用いたキメラ遺伝子を初期胚の細胞に注入して作製した
トランスジエニ・ンク動物の報告にコルスゲイーアレン
等。ネイチャー、　３３３　％、　８５２．１９８８）
がある。

［発明が解決しようとする課題］ しかし上記報告のトランスジェニックマウスは個体ごと
にβ−ガラクトシダーゼを発現する組織が異なるとされ
ており、この酵素活性を利用した染色によれば、まばら
に染色されるという欠点がある。

また近年、着床前のマウス胞胚を培養して得られたセル
ラインであるＥＳ＠　Ｊ！１を、マウスの他の胞胚内に
注入してキメラマウスを作製する方法も報告されている
。

従ってＥＳ細胞にあらかしめ染色識別用のマーカー遺伝
子を導入しておき、キメラマウスを作製することが可能
である。しかしＥＳ細胞の分化の全能性を保持したまま
、長期にこの細胞を維持するのは一般に相当に困難であ
る。

［課題を解決する手段］ 本発明は、β−アクチンのプロモーターとβ−ガラクト
シダーゼの遺伝子とのキメラ遺伝子を含む遺伝子断片を
哺乳動物の初期胚の細胞に注入し、発生を継続させる事
を特徴とするβ−ガラクトシダーゼを発現する哺乳動物
の作製方法、ならびにその動物を提供するものである。

このようにして作製された動物は、キメラ遺伝子を含む
遺伝子断片がその生殖系列に伝達され、子孫にその表現
形質が伝達される。したがって継代によりその性質が保
存可能であり、更に所望によりマウスの受精卵は凍結し
て保存する事も可能である。

本発明の動物の細胞は、β−ガラクトシダーゼの酵素活
性により、簡便かつ迅速に染色可能であるため、他の同
種の動物細胞と混在しても、染色により容易に識別でき
るという特徴がある。

染色の方法としては、例えば常法により組織切片を作製
し、Ｘ−ｇａＮ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）の溶７夜と反応させ
て発色させる事が出来る。

以下本発明を更に詳細に説明する。

β−アクチンは細胞の骨格を構成する蛋白質の一種であ
り、哺乳類や鳥類においてはほとんど全ての細胞で発現
されている。すなわち、β−アクチンのプロモーターは
本質的にほとんど全ての細胞で機能する能力を持ってい
る。また高いレベルの発現を期待する目的で、転写の増
幅に働くエンハンサ−を挿入するのは良し）方法である
。本発明に用いるβ−アクチンのプロモーターおよびエ
ンハンサ−の由来は、特に限定するものではないが、ニ
ワトリ由来のもの力≦好便に利用出来る。

またβ−ガラクトシダーゼの遺伝子も特に限定するもの
ではないが、大腸菌由来のものが好便に利用出来る。し
かしながら、本発明に用いるキメラ遺伝子断片において
、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写が、β−アクチン
のプロモーターの制御下にある配列様式は必須である。

さらにその下流には、ポリＡ付加シグナルが配列されて
いる事が重要である。ポリＡ付加シグナルの種類ならび
に由来は、特に限定するものではなく、−船釣に良く用
いられるＳＶ４０のそれを用いてもなんらさしつかえは
無く、また化学合成によって得られたものを用いても良
い。

これらの機能素子とも言える各遺伝子断片を結合し、キ
メラ遺伝子を構築する方法は特に新規な方７去を用いる
必要も無く、例えば続生化学実験講座第−巻ｒ遺伝子研
究法Ｉ〜ＩＩＩＪ（東京化学同人発行、Ｉ〜ＩＩ、１９
８７、ＩＩＩ　、１９８８　）　、あるいはマニアティ
ス等のｒモレキュラークローニング」　（コールドスプ
リングハーバ−１９８２）などを参照して行えば良い。

本発明に用いる哺乳動物としては、ヤギ、ブタ、ウサギ
、ハムスター、ラット、マウスなどがあげられるが、げ
っ歯類、特にマウスが好便に用いられる。

β−アクチンのプロモーターとβ−ガラクトシダーゼの
遺伝子とのキメラ遺伝子を含む遺伝子断片を哺乳動物の
初期胚の細胞に注入し、発生を継続させ、β−ガラクト
シダーゼを発現する哺乳動物の作製方法としては、基本
的には従来知られている方法、例えば、野村達次監修の
発生工学実験マニュアル／トランスジェニックマウスの
作り方（講談社発行１９８７　）を参照して行う事が出
来る。本発明でＤＮＡ断片の注入に用いる初期胚の発生
段階としては、受精直後の一細胞期胚を用いるのが最適
である。何故ならば一細胞期に７主人した場合は染色体
に導入されたキメラ遺伝子が体細胞全体に分布する確率
か高く、従って生殖細胞、そして子孫へ伝達される確率
が高いからである。

キメラ遺伝子を注入し、発生を継続させ、底体にまで発
生したその哺乳動物は、その尾からＤＮＡを抽出し、例
えばサザンハイプリダイゼーションによって、注入した
キメラ遺伝子が存在しているかどうかを検定出来る。そ
の方イ去は特に特別な方法は必要なく、基本的には既に
記した文献の記述に準じて行うことができる。

本発明の動物の組織あるいは細胞におけるβ−ガラクト
シダーゼの発現の検定は、常注によりメツセンジャーＲ
ＮＡの検出によっても良いが、酵素活性を調べる方法が
簡便である。すなわち、常７去により組織切片を作製し
、Ｘ−ｇａｌの溶液と反応させて発色させると、組織切
片内に存在するβ−ガラクトシダーゼにより、Ｘ−ｇａ
ｌが加水分解され、色素団を形威し、組織が染色される
（例えばヒストケミ−２３巻、　２６６−２８８頁（１
９７９）参照）。

［効　　　果コ 本発明の動物は、その細胞が、β−ガラクトシダーゼの
酵素活性により、簡便かつ迅速に染色可能であるため、
他の動物細胞と混在しても、染色により容易に識別でき
るという効果がある。

従って本発明の動物は、臓器移植による組織修復、細胞
増殖および細胞分化の研究に利用することができるとい
う効果がある。例えば同系の遊支系動物に本発明の動物
の骨髄細胞を移植すれば、この細胞分化の様式を、染色
により容易に解明できる。また例えば移植臓器がいかに
生着するか、または脱落するかを染色により鮮明に描き
出すことかできるなど、臓器移植の研究にも有用である
。このような例は枚挙にいとまが無い。

本発明は畜産領域および医学領域等における有用性は大
きい。

［実　施　例］ 以下に実施例によって更に詳細に本発明を説明する。但
しこの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

（１）キメラ遺伝子の調製 フレジン等（Ｆｒｅｇｉｎｅ　Ｎ、Ｇｅｎｅ、４８巻、
１〜１１．１９８６　）の作製したプラスミド　ｐβａ
ｃｔ−ＣＡＴ　９を制限酵素）ｆｉｎｄ　ＩＩＩ　／　
ＢａｍＨＩで切断後、ポリアクリルアミド電気沫動によ
り分離し、β−アクチンのプロモーターおよびエンハン
サ−がｐＵｃ１８ベクターに連結されたＤＮＡ断片のみ
を回収した。

一方大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とＳＶ４０の
ポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片は、プラスミド、
　ｐｃｉ（１１０（ファルマシア社、製品番号２７−４
５０８−０１　）を、制限酵素的ｎｄｌｌｌ　／　Ｂａ
ｍＨＩで切断後、ポリアクリルアミド電気泳動により分
離し、入手した。このＤＮＡ断片には、大腸菌由来の翻
訳開始領域が含まれているため、ざらにＫｐｎ　Ｉで消
化して大腸菌由来の翻訳開始領域にあたる２０７塩基対
を除去した。さらに哺乳類細胞での発現を有利にするた
め、ヘルペスシンプレックスウィルスのチミジンカイネ
ス（以下）ＩＳＶ−ｔｋと記す）の翻訳開始領域と交換
した。すなわちｌｌ５Ｖ−ｔｋ遺伝子の翻訳開始点と転
写開始点の間に存在するＢｇｌ　ＩＩ切断部位を同酵素
で切断した後、フレノウ処理により末端を平滑化し、つ
いてＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩリンカ−を連結し、末端をＨ
ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ＋切断部位に変えた。また翻訳開始点
より２７０塩基対下流のＮｒｕ　Ｉ切断部位を同酵素で
切断した後、フレームを合わせる為もあり、８塩基対の
Ｋｐｎ　Ｉリンカ−を連結した。このようにして作製さ
れた両端をリンカ−にはさまれた３４３塩基対のＤＮＡ
断片を、Ｋｐｎ　ＩついでＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで消化
した後ｐＣ）Ｉ　１１０から先に調製したβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片と連結し、改変プラス
ミドｐＣＨ１１０−ＴＫを調製した。ついでｐｃＨｌｌ
ｏＴＫをＨｉｎｄｌＴＩ　／　ＢａｍＨＩで切断後、ポ
リアクリルアミド電気泳動により分離し、ＩＳＶ−ｔｋ
の翻訳開始点部分とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とＳＶ
４０のポリＡ付加シグナルを含むＤＮＡ断片を調製した
。このＤＮＡ断片と、先にβａｃｔ−Ｃ八Ｔ９からへ限
酵素的ｎｄｌｌｌ　／　ＢａｍＨＩで切断した、β−ア
クチンのプロモーターを含むＤＮＡ断片とを連結し、β
アクチンのプロモーターの制御下で、β−ガラクトシダ
ーゼを発現する機能を持つプラスミド、ｐβａｃｔ−１
ａｃＺを完成した。このプラスミドから生ずるβ−ガラ
クトシダーゼは、ＩＳＶ−ｔｋとの融合蛋白質として発
現する。なお、これらの連のプラスミドの改変、および
増幅は大腸菌ＨＢ　１０１　（宝酒造株式会社製〉を用
いた。そしてＥＲＭ　　　Ｐ−１１２７４））　　。

次にｐβａｃｔ−１ａｃＺを、制限酵素Ｐｓｔｌ／　Ｂ
ａｍＨｌで消化する事により、約１．９に塩基対のβ−
アクチンのプロモーターとエンハンサ−１β−ガラクト
シターセ遺伝子、およびＳＶ４０のポリＡ付加シグナル
を含む、約５．７に塩基対のＤＮＡ断片を調製した。す
なわち、Ｐｓｔｌ／Ｂａｍ）ＩＩ消化後、４２％ポリア
クリルアミド電気沫動泳動離し、５７〜５．８　ｋ塩基
対の部分のゲルを切り出し、透析チューブに入れ、電位
差をかけてＰｓｔｌ／Ｂａ＋ｎＨ１断片を溶離した。つ
いでフェノール／クロロホルム（１／’１）　７昆７夜
で抽出し、不純物を除去した。０．６Ｍの塩化ナトリウ
ムを含むＴＥ溶？ｆｆ１（ｐＨ７，６トリス塩酸緩衝ゼ
夜、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）
）で前洗浄し、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む同じＴ
Ｅ温溶液平衡化した、０．６ｍ１２のＤＥＡＥ陰イオン
２換カラム（ＤＥ５２．ワットマン４製）にかけて吸着
させた。ついで０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＴＥｉ
液でゲル由来の不純物を溶出除去した後、０．６Ｍの塩
化ナトリウムを含むＴＥｉ？夜で溶出させ、目的のキメ
ラ遺伝子断片を回収した。

このキメラ遺伝子断片を含む溶出７夜をフェノール／ク
ロロホルム（１／１）混液で２回抽出操作を行い、不純
物を除去した後、水飽和エーテルで３回抽出操作を行い
残留する有機溶媒等を除去した。ついでエチルアルコー
ルを加え、目的のキメラ遺伝子断片を沈澱として回収し
た。

この沈澱を１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ８，０，１０ｍ
Ｍのトリスバッファーに１３５　μｇ／ｎ＋ｌになるよ
うに溶解し、分注し、凍結して保存した。

（２）キメラ遺伝子の注入 上記　（１）で調製したキメラ遺伝子を０．１ｍＭのＥ
ＤＴＡを含むｐＨ７，４，１０ｍＭのトリスバ・ソファ
−で約　４μｇ／ｍｌに希釈し、注入用ＤＮＡ　ｍ液と
した。

本実施例の（２）において、単に培地と記された培地は
笠井ら（家畜繁殖誌、２４巻、１９〜２２、１９７８）
の報告による修正クレブスリンゲル重炭酸ｉ衝液を用い
た。

Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊ（日本チャールスリバー社）の
雌マウス腹腔に、妊馬血清性性腺刺激ホルモンを５０ｉ
、ｕ、／ａｎで含む生理食塩水、０．１ｍＡを注射し、
４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを５０ｉ、ｕ
、／ｍｊ２で含む生理食塩水、０．１ｍＪ２を腹腔に注
射した。　Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｊの雌マウスと一晩同
居後、交尾したマウスから摘出した卵管を、０．０１％
のヒアルロニダーゼを含む培地内に入れた後、受精卵を
採取し、０．０１％のヒアルロニダーゼを含む培地に入
れ、５％の炭酸ガス下に３７℃で数分保持し、卵丘細胞
を除去した後、受精卵を培地で２回洗浄した。この受精
卵を培地に移し、ＤＮＡの注入まで５％の炭酸ガス下に
３７℃で保持した。

ガラスシャーレに６ｍｇ／ｍｆｌで牛血清アルブミンを
含むダルベコの燐酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ　と言
う）を、マイクロピペットで１滴ずつ、１０か所に滴下
した。ついでこの近傍の５か所に、先に調製した注入用
ＤＮＡ溶液を１滴ずつ滴下した後、ミネラルオイルを注
いで覆った。

滴下したＰＢＳの１滴あたり、先に調製した前核期の受
精卵を６〜７個ずついれた。　ＤＮＡの注入は微分干渉
顕微鏡下にマイクロマニピュレーターにより実施した。

すなわち、１〜２μｍの直径の注入用ピペットに先に滴
下したＤＮＡＩ？夜を吸い取った。保持ピペットを用い
て一個の受精卵を固定した。ついで注入用ピペットを前
核に向かって受精卵に刺し、ざらに前核に刺し、ＤＮＡ
溶液を約２ｐｌ注入した後、注入用ピペットを引き抜く
。この場合、前核としては特別の事情が無いかぎり雄性
前核に注入した。この注入操作を繰返し、シャーレの受
精卵への注入が終わったら炭酸ガスインキュベーター内
にて５％の炭酸ガス下に３７℃で次の操作まで保持した
。この途中で注入用ピペット内のＤＮＡ　ｍ液が不足す
れば、ＤＮＡ溶液の液滴から補充し、また注入用ピペッ
トは時々よくきれるものと交換した。この操作を繰返し
、−実験当たり約７０個の受精卵に注入した。

このような処理を施した受精卵のうち形態が正常なもの
を、培地で洗浄後、プラスチックシャーレの中に滴下さ
れ、ミネラルオイルで覆われた培地に集めた。なおこれ
らのプラスチックシャーレおよび培地はあらかじめ３７
℃、５％の炭酸ガス下に保持し平衡化されたものを使用
した。受精卵の入ったプラスチックシャーレは、炭酸ガ
スインキュベーター内にて５％の炭酸ゴス下に３７℃て
保持した。

これらの受精卵７〜２１個を、あらかじめ精管結紮雌マ
ウスとの交尾により、偽妊娠を誘導した成熟したＩＣＲ
系（日本タレア社）の雌マウスの卵管の一方のみに移植
した。この操作を繰返し、ＤＮＡを注入した後、正常な
形態を保持している受精卵の全てを偽妊娠マウスに移植
した。

移植後２０日８に帝王切開により胎児を出産させた。も
ちろん帝王切開によらず、自然分娩によっても良い。産
仔は当日ないし前日出産した１１ｊのＩＣＲマウスの母
親につけ、哨育させた。３週間後に離乳させ、さらに１
週間後にその尾を４〜５ｃｍ程切断し、導入遺伝子の検
定の時まで凍結保存するとともに、産仔は飼育を継続し
た。

この一連の操作により、９６個の受精卵にＤＮＡを注入
し、正常とみなされる５７個を偽妊娠マウスに移植し、
１２匹の産仔を得た。

（３）導入遺伝子の検定 上記で得られたマウスの尾から約２ｃｍをとり、１００
ｍＭ、　ＥＤＴＡ、　０．５９６ＳＤＳ　　（ソデイウ
ムドデシイルサルフエイト）を含むｐＨ８，０の５０ｍ
Ｍ　トリスバッファー、０．７ｍＡに浸し、１０ｍｇ／
ｍｕのブロティナーゼに？８液を３５μ℃加え、５５℃
で１２時間静置した。この溶イ夜に、あらかじめトリス
バッファー（ｐＨ８，０）で平衡化したフェノール０．
７ｍＪＺを加え激しくイ昆和した後、１５００回転／分
で３分間遠心分離をした。上層を採り、フェノール／ク
ロロホルム（１／１）　による抽出操作をさらに１回繰
り返し蛋白質を除いた後、ｐＨ６，００，３Ｍ酢酢酸ナ
トリウム緩衝後夜７０μ角０．７＋ｎＩｔの工チルアル
コールを加え、振盪した。析出する糸状のＤＮＡの沈漬
を遠心分離により集め、上清を除去した。ついで、この
沈渣に１ｍｊ２の７Ｈエチルアルコール水を加え、攪拌
した後１５００回転／分で１分間遠心分離をし、ついで
上清を出来る限り除去した後、／ｆ、漬を乾燥した。

得られた沈漬を１００μ℃のＴＥ温溶液ｐＨ８，０。

１０ｍＭトリス、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　に溶解させた
後、その一部をとり含まれるＤＮＡの濃度を２６０ｒ＋
ｍの吸光度より測定した。通常このＤＮＡ　ｍ液の濃度
は１〜２　ｍｇ／ｍＩｌとなる。

かくして得られたＤＮＡ溶液を、含まれるＤＮＡが約１
５μｇになる量を採取した。１００ｍＭの塩化マグネシ
ウムと、ＩＭの塩化ナトリウムと２０ｍＭの２−メルカ
プトエタノールを含むｐＨ７，８の５００ｍＭトリスバ
ッファーを、２５μ℃と、１００単位の制限酵素Ｅｃｏ
Ｒ１またはＰｖｕ　ＩＩ　（この場合はトリスバッファ
ーの塩化ナトリウムの濃度を５００ｍＭとした）を加え
た後、蒸溜水を加え、全量を２５０μ℃にした。緩やか
に温和後、３７℃て一晩静置した。この反応液にエチル
アルコールを加え、生ずる酵素消化断片の沈漬を遠心分
離により回収し、再び１２μ立のＴＥ温溶液溶解した。

ついで３０零グリセロール、０．２Ｘブロモフエノール
ブルー　０．２＊キシレンシアツールを含む色素溶液３
μ互を加えて良く混合した。この溶液を０．７９６アガ
ロースゲルで５〜６時間電気沫動じた後、このゲルを０
．１Ｍ塩酸中で１０分間緩やかに振盪した後、蒸溜水で
洗浄した。さらに１．５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．
５Ｍ水酸化ナトリウム中で３０分振盪した後、蒸溜水で
洗浄した。さらに中和溶７夜（３Ｍ、ｐＨ５，５の酢酸
ナトリウム緩衝７夜）中で振とうした後、蒸溜水で洗浄
した。ついでナイロン膜に移した後、８０℃、１時間の
熱処理により、ＤＮＡを膜に固定し、プローブＤＮＡ　
とハイブリダイゼーションした。プローブとしてはｐＣ
）Ｉ　１１０−ＴＨのＰｖｕ　ＩＩ　／　　Ｐｖｕ　１
１断片（β−ガラクトシダーゼ遺伝子の部分に対する、
約２．５に塩基対の断片）を用いた。なお、マウスの尾
から抽出したＤＮＡをＰｖｕ　ＩＩまたはＥｃｏＲｌの
二種類の制限酵素で切断したのは、遺伝子の導入の確認
をより明確にする為である。

上記ステップ（２）で得られた１２匹のマウスのＤＮＡ
をＥｃｏＲｒで消化した場合の電気泳動結果を第２図に
示した。注入したキメラ遺伝子がＤＮＡに移入されたマ
ウスは約６に塩基対の位置にバンドが検出された。すな
わち７６２３，７２６５．７２６６７２６１２に目的の
遺伝子が移入されていた。

（４）トランスジェニックマウスの子孫の作製上記（３
）で注入した遺伝子断片が導入されたと認められたファ
ウンダーが５ないし８週齢に達した時、それぞれを通常
のＣ５７ＢＬ１５ＮＣｒｊと交配させた。得られたＦｌ
のＤＮＡを（３）の方法で検定した結果、第−産におい
て、７２６１２のＦｌには６匹の内２匹に、７２６５の
Ｆｌには７匹の内１匹に、７２６３の１１には５匹の内
１匹に目的の遺伝子が伝達されていた。この様にして目
的の遺伝子が伝達された目的の遺伝子が伝達された数多
くのＦｌを作製するとともに、Ｆ１相互の交配により子
孫を作製した。

（５）β−ガラクトシダーゼの　現の検上記（４）で作
製されたトランスジェニックマウスのβ−ガラクトシダ
ーゼの発現を検定した。すなわち、この検定に供すべき
組織を０５＊グルタルアルデヒドを含む゛燐酸緩衝７夜
で活流固定した後、燐酸緩衝液で洗浄し、液体窒素で凍
結後、クリオスタットで薄切し、切片を作製した。つい
でこの切片を、２ｍＭの塩化マグネシウムを含むｐ）Ｉ
　３．５のクエン酸緩衝液に溶解したＸ−ｇａｌ　　（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）と３７℃で反応させた。なおこれら
の操作において、組織間の被検定物質の拡散を防止する
ためには５ｍＭのフェリシアン化カリウムと５［［ＩＭ
のフェロシアン化カリウムを添加しても良く、反応基質
の拡散を高める為には、０．１零のトリトンＸ−１００
を添加しても良い。

反応は染色液を除去後、２ｍＭのＥＤＴＡを含む燐酸緩
衝７夜で洗浄する事により停止させた。

この方７去により、（４）で得られた７２６１２およ４ び７２６３のＦｌのいずれにおいても、例えば、骨、胃
、肝臓、大腸、小腸、腎臓、大脳、小脳など、検定した
全ての組織において青色に染色される細胞が検出された
。

従ってこれらのマウスは注入した遺伝子に基づきβ−ガ
ラクトシダーゼを発現する動物であるといえる。

【図面の簡単な説明】 第１図は、実施例の（１）で調製し、（２）で注入した
キメラ遺伝子断片の概略を説明する図である。 第２図は実施例の（３）で得られた遺伝子導入マウスの
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合の電気泳動結果を示
した図である。 他４名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、体細胞及び生殖細胞が、β−アクチンのプロモータ
   ーとβ−ガラクトシダーゼの遺伝子とのキメラ遺伝子を
   含む遺伝子断片をもち、β−ガラクトシダーゼを発現す
   る非ヒト哺乳動物。 ２、請求項１において、哺乳動物がげっ歯類であること
   を特徴とする哺乳動物。 ３、請求項２において、げっ歯類がマウスであることを
   特徴とする哺乳動物。 ４、β−アクチンのプロモーターとβ−ガラクトシダー
   ゼの遺伝子とのキメラ遺伝子を含む遺伝子断片を哺乳動
   物の初期胚の細胞に注入し、発生を継続させる事を特徴
   とするβ−ガラクトシダーゼを発現する非ヒト哺乳動物
   の作製方法。 ５、請求項４において、哺乳動物がげっ歯類であること
   を特徴とする哺乳動物の作製方 法。 ６、請求項５において、げっ歯類がマウスであることを
   特徴とする哺乳動物の作製方法。