JP2018506984A - Etv2およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年3月3日付の米国仮特許出願第62/127,330号の優先権の恩典を主張し、この優先権の恩典は本明細書により主張され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本文書は、配列表電子テキストファイルを参照により本明細書に組み入れ、これは、EFS-Webを介して電子フォーマットで提出される。「1552048.txt」という名の本テキストファイルは12,288バイトであり、2016年3月1日に作成された。
血液は人体の主要な器官であり、細胞と血漿から構成される。細胞性の部分は赤血球、白血球、および血小板を含む。血漿の構成成分は、水と、とりわけタンパク質、糖または電解質などの溶解した化合物とからなる。
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を (単独でまたは他の遺伝子と共に) 妨害する変異を有する、段階;
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階;
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階;ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階;
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階;
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階;ならびに
(d) ヒトのおよび/またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。一つの態様において、血液細胞は、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および/または血小板である。
(a) ETV2ヌルブタ細胞を生成する段階;
(b) (a) のETV2ヌルブタ細胞由来の核を、除核されたブタ卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌルブタ胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植 (SCNT) により、ETV2ヌルブタ胚盤胞を創出する段階;
(c) ヒト幹細胞をETV2ヌルブタ胚盤胞に導入する段階。
(a) ETV2ヌルブタ細胞を生成する段階;
(b) (a) のETV2ヌルブタ細胞由来の核を、除核されたブタ卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌルブタ胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植 (SCNT) により、ETV2ヌルブタ胚盤胞を創出する段階;
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌルブタ胚盤胞 (胞胚腔) に導入する段階;ならびに、
(d) ヒトの/ヒト化された血液細胞およびヒトの/ヒト化された内皮を有するブタ (ヒト幹細胞が遺伝子編集された胚盤胞に加えられている) を生成するように、(c) の胚盤胞を偽妊娠中の/代理母ブタに移植する段階。一つの態様において、血液細胞および内皮は、ヒトiPS細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する、白血球、赤血球、血小板および/または内皮である。
本明細書には、ブタなどのETV2 (または他の遺伝子のノックアウトと組み合わせたETV2) ノックアウト動物の、臨床および前臨床応用に向けた、個別化されたヒトの/ヒト化された血液および血管系の産生のための宿主としての開発が記載される。心臓血管系および造血系の疾病の治療に向けたヒトの/ヒト化された組織の新規の供給源として役立つ事に加えて、ブタなどのヒト化された動物は、ヒト系列の再生、または薬剤に対する応答の研究のための大型動物モデルとしても役立つであろう。
本発明の記載および請求においては、下記に定める定義の通りの以下の用語法が用いられる。別に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において用いられ得る。遊離基、置換基、および範囲について下記に列挙される特定かつ所望の値は単なる例示であり、それらは遊離基および置換基についての他の所定の値または所定の範囲内の他の値を除外しない。
現在、進行した末期の器官不全に対する唯一の決定的な治療法は移植である。移植の制限因子はドナー器官の入手可能性である。何十万もの患者がこのような治療法の恩恵を受けられるはずであるが、合併する疾病のために、適合する移植候補とならない。したがって、死体または生体のドナー器官が著しく不足している。その上、器官移植は終生の免疫抑制を必要とし、これもまた有害な副作用を有する。本明細書においてはブタにおけるヒト化された組織の生成が記載され、これは移植のための器官の無制限な供給源として役立ち、かつ心臓血管系および造血系の疾病の治療のためのパラダイムシフトとなるプラットホームを提供すると考えられる。
いくつかの理由から、内皮系および造血系を欠損したブタ胚を生成するためにEtv2遺伝子座を変異させた。第一に、本発明者らはマウスにおいてEtv2が内皮系および造血系の発生の主要制御遺伝子であることを実証した (7〜9)。遺伝的な系列追跡戦略を用いて、Etv2発現細胞が内皮系列および造血系列を生み出すことが実証された (9、10)。第二に、包括的遺伝子欠失戦略がとられ、Etv2変異型のマウス胚は、内皮系列および造血系列を欠くので生育不能であることが実証された (図1A、B) (8)。トランスクリプトーム解析を用いて、Etv2非存在下では、Tie2が顕著に調節不全であることが特定された (7、8)。さらには、トランスジェニック技術および分子生物学的技法 (転写アッセイ、EMSA、ChIP、および変異誘発) を用いて、Spi1、Tie2およびLmo2がEtv2の直接の下流の標的であることが確認された (7、8、11)。第三に、分化中のES/EBの系におけるEtv2の強制過剰発現が内皮系列および造血系列の集団を有意に増加させ、これにより、Etv2が、両方の系列を誘導する分子カスケードを決定する能力を有する単一の因子であることが実証された (図1C、D) (8)。
繁殖豚/未経産豚:飼育された母性 (maternal) 雌性ブタ (8〜12月齢) が胚移植のレシピエントとして用いられ、承認済みのIACUCプロトコールのもとで、妊娠期間予測および分娩において通常の飼育ブタと同様に飼養および維持される。
Etv2を欠く胚はおよそE9.5で致死となり血管系および血液を有さないため、Etv2がマウスにおける血管形成および造血に関与していることが、以前の研究により実証されている (7〜10)。ブタにおけるETV2 (ENSSSCG00000002906) の役割を調べるために、ブタ線維芽細胞内で該遺伝子に隣接する2組のTALENのペアを用いてETV2コード配列全体を除去した (図4)。
1) ETV2欠失戦略
TALEN:
2) HDRステッチテンプレート:このテンプレートはTALENが誘導した5'および3’切断を予測可能な領域で融合させる。これは、欠失アリルの回収効率をも増大させた。
HRオリゴ
下線小文字=ETV2 3.2切断部位の右側からの相同性のある42nt
太大文字=ETV2 5.2切断部位の左側からの相同性のある42nt
大文字下線=挿入されたBamHI部位
ETV2 5' NJ F1からETV2 3' NJ R1までの全配列:これは、上記のテンプレートを修復/融合のために用いて欠失アリルが作成された際の予測されるPCR産物である。
3) スクリーニングプライマー:
1) フレームシフトKOアリル:本実施例においては、エクソン3および未成熟終止コドンにフレームシフトが創出される。
1) TALEN:
2) HDRテンプレート:
ssETV2 3.1 HR-KO
太小文字下線=ssETV2 3.1切断部位
大文字イタリック=終止コドン
大文字=挿入された塩基
下線=挿入されたHindIII制限部位
ssETV2 3.3 WT配列
太大文字下線=ssETV2 3.3切断部位
ssETV2 3.3 HR-KO
太小文字下線=ssETV2 3.3切断部位
大文字イタリック=終止コドン
大文字=挿入された塩基
下線=挿入されたHindIII制限部位
3) スクリーニングプライマー:
ブタにおけるヒト化された組織の生成に関する基礎的前提とは、注入された細胞が変異型宿主における発生学的ニッチに優先的に集合し、失われた細胞タイプを生成することである。原理証明研究として、および、Etv2が理想的な標的遺伝子であるかを評価するために、Etv2変異型のマウス胚盤胞を、EYFP標識野生型マウスES細胞により補完した (図6)。野生型細胞存在下において変異型アリルを正の選択により (positively) 同定するために、二つの別個のEtv2変異型系統の半接合体マウスが飼育された (データ不掲載)。胚をE10.5 (Etv2変異型の胚の致死性を観察した一日後) に回収し、遺伝子型決定して、EYFP陽性細胞および内皮系マーカーであるエンドムチンの分布を調べた。Etv2半接合性およびEtv2変異型の胚の両方において、野生型ES細胞は成功裏に胚に取り込まれた (図6A、B)。EYFP標識野生型細胞は、半接合性動物の全ての胚葉の複数の細胞タイプにランダムに分布した (図6C、E、G) のに対し、Etv2変異型においてはEYFP陽性細胞の大多数は内皮系列、心内膜系列、および造血系列で見られた (図6D、F、H) ことが、免疫組織化学的解析により明らかになった。このデータは、全てのエンドムチン陽性内皮系細胞がEYFPを発現したという見解を支持し、このことは、これらが野生型ES細胞からの派生物であることを示すものである (図6D、F、H)。Etv2変異型の胚はまた、血管内に未発達の血液様形態を伴うEYFP標識Tie2陽性細胞も有し、このことは、造血系列もまたレスキューされたことを示唆する (データ不掲載)。
次いで、Etv2ヌルES/EBの補完が可能かどうかが、二つの異なる種を用いてテストされた。インビトロES/EB補完アッセイが、Etv2変異型のマウスES細胞および野生型ラットES細胞を用いて行われた (図7) (22)。野生型またはEtv2変異型のマウスES細胞は、分化培地中で超低接着プレートにES細胞を播種することによる胚様体 (EB) 形成により、分化を誘導された。12日間の培養後、EBを固定し、切片を作り、かつ内皮系マーカーCD31について染色した (8)。野生型マウスEBにおいては、強いCD31+集団が血管様構造を裏打ちすることが観察されたが (図7A)、Etv2変異型のEBにおいてはCD31+細胞は全く観察されなかった (図7B)。対照的に、Etv2変異型のES細胞および野生型ラットES細胞の共分化培養物は、頑強なCD31発現を伴う細胞のパッチを現し、これにより、CD31+集団がこの共培養法によりレスキューされたことが示される (図7C)。マウス-ラット補完アッセイにおけるこの成功は、さらにブタ-ブタおよびブタ-ヒト補完実験への発展のための概念証明および論拠を提供する。
ヒト-ブタキメラを生成する戦略の実行可能性を評価するために、hUCBSCおよびhiPSCがブタ胚盤胞に取り込まれて胚発生に加わる能力を調べた。ブタ単為生殖胚盤胞が、卵母細胞の電気刺激を用いて生成された (42)。活性化の六日後に9〜12個のDiIまたはEdU (24時間) 標識されたhUCBSCまたはhiPSCが胞胚腔に注入された。胚盤胞を二日間培養下で回復させた後、撮影した。標識されたhUCBSCおよびhiPSCは、90%がブタ胚盤胞からなるICM中で観察された (図9A、B、代表的な像が示されている)。DiI分布とヒト核抗原特異的抗体 (HNA) を用いた免疫組織化学との比較により、HNA抗体は注入されたヒト幹細胞を検出することが明らかになった (図9A、矢印)。増殖中の細胞を検出するために、EdU標識hiPSCを注入された胚盤胞を採取前の1時間にわたりBrdUでさらにパルス標識した。EdUを用いた二重標識により、注入されたヒト幹細胞は注入48時間後も増殖を続けていたことが明らかになる (図9B、矢印)。これらの結果は、ブタ胚盤胞のICMへのヒト幹細胞の組み込み、および、キメラ胚盤胞の、子宮への移植の準備における孵化ステージへの発生進行を実証する。ブタ単為生殖胚へのヒト幹細胞の取り込みを調べるため、キメラ胚盤胞を偽妊娠中の繁殖豚に移植し、E28に胚を解析した。すでに報告されたように (30) 正常発生中の胚が得られ、その一つは、HNA抗体で染色されるヒト細胞塊を含むことが見出された。これらの結果は、ヒト幹細胞集団がICMの発生に適合可能であるかどうかおよび/または寄与するかどうかを調べるための迅速なアッセイを支持および提供するものである。その上、単為生殖胚盤胞の移植は、ヒト幹細胞の、発生中の胚への取り込みおよび分化を調べるためのハイスループットな方法を提供する。この戦略の重大な利点は、ブタ卵母細胞が食糧生産の副産物として豊富に入手可能であること、および、単為生殖胚が大量に規則正しく生成され得ることである。単為生殖胚は8週以後は生存せず、したがって、望ましくないヒト-ブタキメラを意図せずに誕生させる懸念がなくなることに留意すべきである。
[本発明1001]
非ヒト動物細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の両方のアリルに変異を有する、該非ヒト動物細胞または胚盤胞。
[本発明1002]
変異がETV2遺伝子の欠失である、本発明1001の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
[本発明1003]
ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1001または1002の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
[本発明1004]
キメラ非ヒト動物または胚盤胞であって、ヒトETV2を発現し、かつ該非ヒト動物ETV2の発現を欠く、該キメラ非ヒト動物または胚盤胞。
[本発明1005]
非ヒト動物が、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト血液細胞を生じる、本発明1004のキメラ非ヒト動物。
[本発明1006]
ヒト内皮を生じる、本発明1004のキメラ非ヒト動物。
[本発明1007]
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1004〜1006のいずれかのキメラ非ヒト動物。
[本発明1008]
以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法:
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階;
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階;
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階;ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。
[本発明1009]
以下の段階を含む、ヒトのおよび/またはヒト化された血液細胞または血管を非ヒト動物において産生する方法:
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階;
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階;
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階;ならびに
(d) ヒトのおよび/またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。
[本発明1010]
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
ヒトドナー幹細胞が組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、多分化能成体幹細胞、人工多能性幹細胞、またはさい帯血幹細胞 (UCBSC) である、本発明1008または1009の方法。
[本発明1012]
幹細胞を提供するドナーが、産生されたヒト化組織または器官のレシピエントである、本発明1009の方法。
[本発明1013]
ヒト人工多能性細胞が繊維芽細胞から形成されたものである、本発明1009の方法。
[本発明1014]
本発明1008または1009の方法によって産生された非ヒト動物。
[本発明1015]
本発明1008または1009の方法により生成された2体の非ヒト動物の交配から産生された子孫非ヒト動物であって、該子孫非ヒト動物がヒトETV2を発現し、該子孫非ヒトのゲノムが該非ヒト動物ETV2遺伝子のホモ接合性欠失を有する、子孫非ヒト動物。
[本発明1016]
非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、本発明1015の子孫非ヒト動物。
[本発明1017]
前記血液細胞が、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および/または血小板である、本発明1009の方法。
Claims (17)
- 非ヒト動物細胞または胚盤胞が機能的ETV2タンパク質を欠くように、ゲノムが、ETV2遺伝子の両方のアリルに変異を有する、該非ヒト動物細胞または胚盤胞。
- 変異がETV2遺伝子の欠失である、請求項1に記載の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
- ブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項1または2に記載の非ヒト動物細胞または胚盤胞。
- キメラ非ヒト動物または胚盤胞であって、ヒトETV2を発現し、かつ該非ヒト動物ETV2の発現を欠く、該キメラ非ヒト動物または胚盤胞。
- 非ヒト動物が、白血球、赤血球、血小板またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるヒト血液細胞を生じる、請求項4に記載のキメラ非ヒト動物。
- ヒト内皮を生じる、請求項4に記載のキメラ非ヒト動物。
- 非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項4〜6のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物。
- 以下の段階を含む、ヒトETV2遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物を産生するための方法:
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のコピーが、該非ヒト動物において機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階;
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞を創出する段階;
(c) ヒト幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階;ならびに
(d) (c) の胚盤胞を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植して、ヒトETV2を発現するキメラ非ヒト動物を生成する段階。 - 以下の段階を含む、ヒトのおよび/またはヒト化された血液細胞または血管を非ヒト動物において産生する方法:
(a) ETV2ヌル非ヒト動物細胞を生成する段階であって、非ヒトETV2遺伝子の両方のアリルが、機能的ETV2タンパク質の産生を妨害する変異を有する、段階;
(b) (a) のETV2ヌル非ヒト動物細胞由来の核を、除核された非ヒト卵母細胞へ融合させること、および該卵母細胞を活性化させてETV2ヌル非ヒト胚盤胞を形成するように分裂させることを含む体細胞核移植により、ETV2ヌル非ヒト胚盤胞または桑実胚を創出する段階;
(c) ヒトドナー幹細胞を (b) のETV2ヌル非ヒト胚盤胞に導入する段階;ならびに
(d) ヒトのおよび/またはヒト化された血液細胞または血管を生じる非ヒト動物を生成するように、(c) の胚盤胞または桑実胚を偽妊娠中の代理母非ヒト動物に移植する段階。 - 非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項8または9に記載の方法。
- ヒトドナー幹細胞が組織特異的幹細胞、多能性幹細胞、多分化能成体幹細胞、人工多能性幹細胞、またはさい帯血幹細胞 (UCBSC) である、請求項8または9に記載の方法。
- 幹細胞を提供するドナーが、産生されたヒト化組織または器官のレシピエントである、請求項9に記載の方法。
- ヒト人工多能性細胞が繊維芽細胞から形成されたものである、請求項9に記載の方法。
- 請求項8または9に記載の方法によって産生された非ヒト動物。
- 請求項8または9に記載の方法により生成された2体の非ヒト動物の交配から産生された子孫非ヒト動物であって、該子孫非ヒト動物がヒトETV2を発現し、該子孫非ヒトのゲノムが該非ヒト動物ETV2遺伝子のホモ接合性欠失を有する、子孫非ヒト動物。
- 非ヒト動物がブタ、ウシ、ウマまたはヤギである、請求項15に記載の子孫非ヒト動物。
- 前記血液細胞が、ヒト人工多能性幹細胞またはヒトさい帯血幹細胞に由来する白血球、赤血球、および/または血小板である、請求項9に記載の方法。
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