ES2206444T3 - Produccion de una proteina de interes en la leche de un mamifero transgenico. - Google Patents

Produccion de una proteina de interes en la leche de un mamifero transgenico.

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ES2206444T3 ES92401635T ES92401635T ES2206444T3 ES 2206444 T3 ES2206444 T3 ES 2206444T3 ES 92401635 T ES92401635 T ES 92401635T ES 92401635 T ES92401635 T ES 92401635T ES 2206444 T3 ES2206444 T3 ES 2206444T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO DE PREPARACION DE UNA PROTEINA HETEROLOGA DE INTERES EN FORMA DE ARBOLADURA O EN FORMA FUSIONADA EN LA LECHE DE UNA HEMBRA DE MAMIFERO, PROCESO EN EL QUE: ECHE DE DONDE SE RECUPERA DICHA PROTEINA QUE SE SEPARA SI ES NECESARIO, CARACTERIZADO EN QUE DICHA HEMBRA ES UN ANIMAL TRANSGENICO EN EL GENOMA DEL CUAL A SIDO INTEGRADA UNA SECUENCIA QUE CODIFICA DICHA PROTEINA DE INTERES BAJO EL CONTROL DE AL MENOS UNA SECUENCIA QUE FIGURA ENTRE LOS ELEMENTOS DE EXPRESION DE LA PROTEINA WAP DE CONEJO Y QUE SE ENCUENTRA EN EL FRAGMENTO DE UNA LONGITUD DE AL MENOS 3 KB A PARTIR DEL EXTREMO 3'' DEL PROMOTOR WAP COMPLETO. TAMBIEN SE REFIERE AL PRODUCTO DE LA LECHE OBTENIDA Y A UNA CELULA EUCARIOTA QUE HA INTEGRADO LAS SECUENCIAS DESCRITAS.

Description

Producción de una proteína de interés en la leche de un mamífero transgénico.
La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una proteína de interés en la leche de una hembra de mamífero distinto al del ser humano. La misma se refiere también a las construcciones que permiten obtener estos animales, a los animales obtenidos así como a las células que contienen las construcciones que permiten la expresión de una proteína heteróloga.
Se han seguido varias vías para obtener unas proteínas que presentan un interés biológico, terapéutico, o industrial, y producidas naturalmente en pequeñas cantidades o en forma difícil de purificar.
Han podido así ser producidas unas proteínas gracias a unas técnicas de recombinación genética, por unos microorganismos, como unas bacterias o unas levaduras. Sin embargo, la mayor parte de las proteínas requieren, después de su síntesis, una fase de maduración que consiste en modificaciones químicas de ciertos grupos de reacción, glicosilación, etc. Las células procariotas no disponen del equipo enzimático adecuado para efectuar esta maduración, de lo que resulta la obtención de proteínas inactivas y/o con alto poder antigénico.
Es por tanto preferible sintetizar estas proteínas en unas células eucariotas, que realizarán las transformaciones enzimáticas apropiadas. Sin embargo, el cultivo a gran escala de células de tejidos plantea un cierto número de dificultades técnicas y económicas.
Otro planteamiento consiste por tanto en hacer producir estas proteínas por unas células in vivo, por medio de animales transgénicos. Es deseable que el sistema utilizado permita la producción de proteínas en gran cantidad, y fácilmente recuperables. Es por tanto interesante que la proteína recombinante sea producida a nivel de la glándula mamaria de animales transgénicos, y excretada en la leche. Se trata en efecto de un fluido biológico fácilmente recolectable, que tiene una complejidad relativamente limitada y una baja actividad proteolítica; además, los procesos de maduración de las proteínas recombinantes estarán probablemente asegurados (glicosilación, fosforilación, escisión, etc.)
Se ha conseguido así hacer sintetizar por la glándula mamaria de ratas o de ovejas unas proteínas de la leche de otra especie o unas proteínas normalmente ausentes de la leche (Ref. 1 a 15). Bühler et al, (febrero 1990) Biotechnology, vol. 8: 140-143 se refiere a la utilización del promotor de la caseína para expresar IL-2 en la leche de los conejos. Los documentos EP 264 166, WO 91/03551 y Andres et al, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84: 1299-1303 se refieren a la utilización del promotor WAP de la rata.
Sin embargo, el porcentaje de proteínas así producidas es extremadamente variable. Es diferente de un animal transgénico a otro, en la medida en que es función del proceso de integración del transgén que es a su vez variable de un animal a otro. La naturaleza de las construcciones de gen es también esencial, pudiendo los elementos que regulan la expresión de los genes de las proteínas de la leche ser múltiples y situados en diversos puntos de la región promotora y de la parte transcrita del gen. Así, los promotores de la beta-lactoglobulina ovina, de la WAP de rata y de la caseína-beta de rata son capaces de hacer sintetizar estas proteínas en unas ratas transgénicas. Los porcentajes sólo son sin embargo sistemáticamente elevados en el caso de la beta-lactoglobulina. Así mismo, el promotor de la beta-lactoglobulina dirige la síntesis de la alfa_{1}-antitripsina humana que alcanza el valor de 7 mg/ml de leche en la leche de una rata transgénica. El promotor de la caseína-alfa_{SI} permite la síntesis de la uroquinasa humana, pero los promotores de los genes de la caseína-beta de rata y de la caseína-beta de conejo utilizados hasta el presente, son de una actividad limitada. El promotor del gen de la WAP de rata dirige la síntesis de varias proteínas extrañas (activador de plasminógeno, CD4) que son secretadas en la leche de ratas transgénicas. Las cantidades de proteínas obtenidas con este promotor son sin embargo relativamente modestas.
Además, sucede que la especificidad del promotor sea modificada por una asociación de un gen extraño. Es así que Günzburg et al. (Molecular Endocrinology 1991) obtienen la secreción de hormona de crecimiento con la ayuda de un ADN recombinante bajo la dependencia del promotor de la WAP de rata, en unos animales transgénicos; pero la hormona de crecimiento es entonces también producida en el cerebelo, en las células gliales de Bergman. Dichos fenómenos pueden dar como resultado una toxicidad y a la muerte prematura del animal.
La presente invención descansa sobre la puesta en evidencia del interés particular del promotor del gen de la WAP de conejo. En efecto, la WAP de conejo ("whey acidic protein") es una proteína relativamente abundante de la leche de conejo (15 mg/ml de leche), y el conejo es potencialmente un animal transgénico utilizable a gran escala. La secuencia del ADNc que codifica para la proteína WAP de conejo se describe en Devinoy et al, (1988) Nucleic Acid Research, vol. 16, página 8180.
La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de una proteína heteróloga de interés en forma madura o en forma fusionada en la leche de una hembra de mamífero distinto del ser humano, procedimiento en el cual:
\newpage
-
se cría dicha hembra y,
-
se recupera la leche de la que se recupera dicha proteína que se separa si es necesario,
caracterizado porque dicha hembra es un animal transgénico distinto de un ser humano, en el genoma del cual ha sido integrada una secuencia que codifica para dicha proteína de interés bajo el control de por lo menos una secuencia que figura entre los elementos de expresión de la proteína WAP de conejo y que se encuentra en el fragmento de una longitud de por lo menos 3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP completo.
Preferentemente, la presente invención se refiere a un procedimiento en el cual la secuencia que controla la expresión de la proteína de interés comprende además unos elementos de expresión situados en el fragmento comprendido entre 3 Kb y 6,3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP.
La obtención de animales transgénicos es conocida y ha sido ampliamente descrita con construcciones próximas en los documentos citados anteriormente pero también en Günzburg et al., Hennighausen et al., Burdon et al., Reddy et al., así como en la patente WO 90 051 88.
La descripción detallada en los procedimientos de transgénesis no será recordada en detalle, los documentos anteriores se citan en la presente descripción como referencia expresa.
Por "proteína heteróloga de interés", se entiende designar esencialmente una proteína que no está naturalmente bajo el control del promotor WAP de conejo.
En el procedimiento según la invención, la hembra de mamífero distinta del ser humano utilizada es preferentemente una coneja pero estas construcciones son eficaces también en otros mamíferos, por ejemplo las ratas.
La leche obtenida contiene la proteína de interés que puede ser aislada o no y después, según que esté en forma madura o fusionada, la misma puede sufrir una escisión química o enzimática si es necesario.
Las construcciones de ADN utilizadas son preferentemente introducidas por microinyección a nivel del huevo fecundado en la fase de una célula hasta 8 células y después se seleccionan los animales que responden a los criterios descritos anteriormente, es decir transgénicos y que expresan dicha proteína en la leche.
La región promotora de este gen WAP injertado al gen transportador de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) bacteriana contiene los elementos sensibles a las dos hormonas lactógenas más importantes, la prolactina y los glucocorticoides. Estas hormonas estimulan de forma intensa la expresión del gen CAT cuando el gen híbrido es transfectado a unas células epiteliales primarias mamarias de coneja. La respuesta a las hormonas depende de la longitud del promotor utilizado. El promotor del gen de la WAP de conejo es por tanto mucho más eficaz que los promotores de los genes de la WAP de ratones y de ratas, utilizados hasta el presente.
En particular, en el procedimiento según la presente invención, la secuencia que codifica para la proteína de interés puede estar precedida hacia su extremo 5', de una secuencia que corresponde al promotor del gen WAP de conejo completa, o de una secuencia equivalente, que asegura la función de promotor. Es así mismo posible, en este caso, utilizar la totalidad del gen WAP y un promotor WAP de dicho gen o de una secuencia equivalente. La figura 5 anexa a la presente solicitud representa dicho gen WAP de conejo.
Por "secuencia equivalente", se entiende designar preferentemente una secuencia que tiene por lo menos una longitud de 3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP y en particular que comprende los elementos de expresión situados sobre el fragmento de una longitud de por lo menos 6,3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP de conejo completo, situado en particular entre los lugares Hind III y BamHI (figura 1).
El promotor puede comprender una secuencia de 17 Kb, comprendida entre los sitios Hind III y EcoRI, o una secuencia que comprende los elementos de expresión situados sobre este fragmento. Los elementos esenciales de las construcciones según la invención se encuentran sobre el fragmento de una longitud de 17,6 Kb a partir del extremo 3' del promotor.
Este largo promotor es susceptible de aportar unos elementos que favorecen también la expresión del gen extraño que le está ligado, o de hacer su expresión más regularmente elevada haciéndola más independiente del lugar de inserción del transgén en el genoma.
El promotor corto de 6,3 Kb dará una respuesta a las hormonas lactógenas prácticamente idéntica a la obtenida con el promotor largo de 17 Kb, y puede dirigir la síntesis de proteínas cuyos genes le están asociados a un vector con unos porcentajes muy elevados.
La invención se refiere también a unas construcciones tales como las definidas anteriormente pero en las cuales, en la secuencia correspondiente al gen de la proteína WAP de conejo, el codón AUG iniciador está delecionado.
Esta modificación puede ser obtenida en particular por mutagénesis dirigida.
Cuando la secuencia que codifica para la proteína de interés está en forma fusionada con la secuencia de la totalidad o parte del gen WAP, es posible suprimir la secuencia ATG de esta proteína.
La proteína WAP de conejo podrá así, con este tipo de construcción, ser expresada por ejemplo en unas ratas transgénicas.
En este tipo de construcción que comprende el gen de la proteína WAP de conejo, que ha perdido eventualmente el codón AUG iniciador, el gen o el ADNc de la proteína de interés puede ser colocado en diferentes lugares que podrán conducir a unos niveles y unos tipos de construcciones diferentes, como destacará de los ejemplos.
Según otro de sus aspectos, la presente invención proporciona un procedimiento para recuperar la leche producida por una hembra de mamífero distinta del ser humano y la proteína que contiene, caracterizado porque, para recuperar la proteína de interés en la leche de dicha hembra de mamífero distinta del ser humano,
a)
se recogen las glándulas mamarias,
b)
se dejan incubar las glándulas mamarias a una temperatura de aproximadamente 0ºC por una duración que varía de dos horas a 18 horas,
c)
se recupera la leche que haya espontáneamente exudado de las glándulas,
d)
se aísla la proteína de interés a partir de la leche y se obtiene dicha proteína purificada
Este procedimiento ha sido puesto a punto en el marco de la producción de proteína heteróloga por un animal transgénico que ha integrado en su genoma unos fragmentos del gen de la proteína WAP, pero puede ser aplicado a la purificación de cualquier proteína que se desee aislar de la leche.
Representa una ventaja considerable con respecto a los procedimientos clásicos de ordeñado de los mamíferos no rumiantes, en el plano de las cantidades obtenidas, sobre todo para unos pequeños animales como las ratas (24). La composición de la leche recogida es idéntica a la de la leche producida naturalmente. Este procedimiento permite además una transferencia más fácil de los productos obtenidos del lugar de producción al lugar de purificación y de tratamiento, por transporte de las glándulas mamarias en hielo.
El procedimiento de preparación de proteína heteróloga de la presente invención, según cualquiera de sus variantes, permite obtener un gran número de proteínas. Entre estas proteínas, es preciso citar:
-
los factores de crecimiento,
-
las interleucinas,
-
los factores de estimulación,
-
las quinasas,
-
los factores de coagulación,
-
la alfa-antitripsina,
-
la hirudina.
y en particular:
-
la eritropoyetina,
-
el G-CSF,
-
la alfa-antitripsina,
-
la uroquinasa
-
el factor VIII.
Se pueden citar las construcciones siguientes:
-
Construcción WAP-alfa_{1}-antitripsina humana (análogo Arg 358): el gen entero alfa_{1}-antitripsina humana que tiene el Arg 358 en lugar de la Meth 358 (Courtney, Bull. Inst. Pasteur (1988) 86, 85-94) ha sido fusionado al promotor largo (17,6 Kb) del gen de la WAP de conejo en el lugar HIND III de la secuencia 5'P no traducida, sobre el modelo de las construcciones WAP-GH. Varias progenies de ratas expresan el gen humano a la concentración de 2 y 5 mg/ml de leche.
-
Construcción WAP-eritropoyetina humana: el gen entero de la eritropoyetina humana (Semenza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 2301-2305) es fusionado con el promotor (6,3 Kb y 17,6 Kb) del gen WAP de conejo.
-
Construcción WAP-factor VIII-delta II humano: el ADNc del factor VIII-deltaII hu mano(delecionado de la región B [Meulien et al., Prot. Engin (1988) 2, 301-306]) precedido del primer intrón del gen del factor VIII y desprovisto de su secuencia de poliadenilación, ha sido introducido en el interior del gen WAP de conejo entero en el lugar Hind III introducido por mutagénesis dirigida y que precede al AUG natural.
Las construcciones según la invención permiten obtener unos resultados totalmente inesperados, en particular el promotor 6,3 Kb de la WAP asociado a los genes de la hormona de crecimiento humano y bovino es capaz de dirigir la síntesis de estas proteínas en la leche de ratas transgénicas con unos porcentajes muy elevados (1-21 mg/ml).
El hGH contenido en la leche de las ratas transgénicas está estructuralmente intacto. El hGH ha conservado también su actividad biológica (evaluada no por su actividad hormonal de crecimiento sino por su actividad prolactina). El test biológico indica que la concentración de la hormona es de 10 mg/ml, un valor de acuerdo con los valores encontrados por el test radioinmunológico y por electroforesis.
El promotor del gen de la WAP de conejo es por tanto mucho más eficaz que los promotores de los genes de la WAP de ratones y de ratas, utilizados hasta el presente.
La tabla 1 siguiente da un resumen de los resultados de las publicaciones 2 a 15 y valora por tanto los resultados obtenidos con las construcciones según la invención, con respecto a los publicados en la técnica anterior.
(Tabla pasa a página siguiente)
1 
\newpage
Una de las razones esenciales puede consistir en el hecho de que el fragmento de ADN de conejo (6,3 Kb) era mucho más largo que su homólogo de rata y de ratón (2,6 Kb y 0,9 Kb). Pueden faltar unos elementos reguladores esenciales en los fragmentos de ADN de ratón y de rata utilizados.
La presente invención se refiere también a unas construcciones que permiten obtener unas hembras de mamíferos distintos del ser humano según la invención.
La presente invención se refiere en particular a las secuencias de ADN y los vectores que permiten la realización del procedimiento; en particular las secuencias de ADN que comprenden por lo menos un gen heterólogo que codifica para una proteína de interés, bajo el control de por lo menos una secuencia que figura entre los elementos de expresión de la proteína WAP de conejo y que se encuentran en el fragmento de una longitud de por lo menos 3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP completo.
La presente invención se refiere también a unas hembras de mamífero distintas del ser humano utilizables en el procedimiento según la presente invención, así como a unas células transformadas con excepción de las células que se encuentran in situ en el cuerpo humano que contienen las construcciones según la invención.
Aunque los animales en cuestión pueden ser muy diversos, el conejo es un animal potencialmente utilizable para obtener unas proteínas recombinantes en abundancia. Hasta 100 ml de leche pueden ser recolectados cada día. Esta leche es muy rica en proteínas (mucho más rica que la leche de los rumiantes). Es por otra parte más fácil y menos oneroso obtener unos conejos que unos animales grandes transgénicos. El promotor del gen de la WAP de conejo tiene, además, todas las probabilidades de dirigir mejor la síntesis de proteínas recombinantes en el conejo.
Otras características y ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos siguientes en los cuales se hará referencia a las figuras siguientes:
Figura 1: cartografía del gen de la WAP de conejo.
Figura 2a: esquema de la construcción del plásmido pW_{3}.
Figura 2b: polilinquer del plásmido p-poli III-I
Figura 3: esquema de la construcción del plásmido pJ_{4}.
Figura 4: producción de hormona de crecimiento humano y bovino en unas progenies de ratas transgénicas que alojan las construcciones pW_{3} y pJ_{4}.
Figura 5: secuencia del gen WAP de conejo.
Figura 6: esquemas de las diferentes construcciones utilizadas in vivo.
Figura 7: esquemas de las construcciones que contienen el gen transportador CAT y de las longitudes variables del promotor WAP.
Figura 8: eficacia de las construcciones descritas en la figura 7.
Ejemplo 1 Construcción del plásmido pW_{3}
Se prepara en principio el plásmido p26C.
El plásmido p26C ha sido obtenido introduciendo la secuencia Bam H_{1}-Hind III del gen WAP (fragmento 6,3 Kb de la Fig. 1) en el polilinquer del vector p-poli III-I (entre los lugares Bam H_{1} y Hind III).
En el curso de esta clonación, el lugar Bam H_{1} ha sido suprimido y reemplazado por el lugar Cla I que figura en el vector p26C (Fig. 2). El vector p26C es por tanto un plásmido capaz de recibir un gen extraño puesto bajo la dependencia del promotor WAP 6,3 Kb. La introducción del gen extraño puede realizarse por ejemplo en el lugar Sal I del polilinquer (Fig. 2). Las inserciones que contienen la totalidad del promotor y de los genes extraños pueden ser aisladas del plásmido después de un corte en los dos lugares Not I que están en los extremos del polilinquer del plásmido p-poli III-I.
El plásmido pW_{3}, obtenido a partir del plásmido p26C (según la figura 2), contiene el promotor del gen de la WAP de conejo (6,3 Kb) y el gen de la hormona de crecimiento humano (hGH). El fragmento utilizado para obtener las ratas transgénicas está comprendido entre los dos lugares Not I.
Un lugar Hind III ha sido introducido en la secuencia de cabeza del gen (líder) por mutagénesis dirigida para servir de lugar de clonación
Ejemplo 2 Construcción del plásmido pJ_{4}
El plásmido pJ_{4}, obtenido a partir del plásmido p26 (según la figura 3), contiene el promotor del gen de la WAP de conejo (6,3 Kb) y el gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH). El fragmento utilizado para obtener las ratas transgénicas está comprendido ente los dos lugares Not I.
La cepa de E. Coli que contiene el plásmido p26 ha sido depositada el 12 de junio de 1991, bajo el nº I-1116 en la colección nacional de cultivo de microorganismos del Institut Pasteur, 25 calle del Doctor Roux, 75724 París Cedex 15.
Ejemplo 3 Obtención de ratas transgénicas
Los fragmentos pW_{3}y pJ_{4} han sido utilizados para obtener unos animales transgénicos. Las ratas transgénicas han sido obtenidas por la técnica clásica de microinyección (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438-4442). El 1-2-pl que contiene 500 copias del gen han sido inyectado en el pronúcleo macho de embriones de ratas. Las construcciones han sido realizadas en el vector p-poli III-I (Lathe et al., Gene (1987) 57, 193-201). Los fragmentos Not 1 - Not 1 de este vector que contiene los genes recombinados han sido microinyectados. Los embriones han sido a continuación transferidos al oviducto de hembras adoptivas hormonalmente preparadas. Aproximadamente el 10% de los embriones manipulados han dado origen a unos ratones y 2-5% de los embriones manipulados a unos ratones transgénicos. La presencia de los transgenes ha sido revelada por la técnica de transferencia de Southern a partir del ADN extraído de las colas de las ratas. Las concentraciones de la hormona de crecimiento en la sangre y en la leche de los animales han sido evaluadas con la ayuda de los tests radioinmunológicos específicos.
La actividad biológica del hGH ha sido evaluada añadiendo leche al medio de cultivo de células o de explantes mamarios de conejo. El hGH contenido en la leche ha inducido la expresión del gen de la caseína-\beta evaluada por la medición de los ARNm y de la proteína.
Ejemplo 4 Producción de hormona de crecimiento humano o bovino en la leche de ratas transgénicas que han incorporado las construcciones pW_{3} y pJ_{4}
Las concentraciones de hormonas han sido determinadas por unos tests radioinmunológicos específicos.
La identificación del hGH en la leche de una rata transgénica se realiza de la forma siguiente. La leche de rata es centrifugada a 150.000 g durante una hora para sedimentar las micelas de caseína. El sobrenadante (1 \mul por pocillo) ha sido recuperado y examinado por una electroforesis en gel de poliacrilamida, en presencia de hormona de crecimiento humano testigo y de una leche control. Los resultados están referidos en la figura 4.
Los animales que han integrado la construcción pW_{3} dan unas concentraciones de hGH del orden de 10 mg/ml de leche y pueden alcanzar 21 mg/ml.
Los animales que han integrado la construcción pJ_{4} producen del orden de 5 mg/ml de leche de bGH y hasta 17 mg/ml.
El procedimiento según la presente invención permite recolectar 1,5 ml de leche/glándula mamaria de rata (poniendo la glándula mamaria en hielo). 200 ratas lactantes que expresen una proteína extraña a la concentración de 3-5 mg/ml proporcionan por tanto 1 g de la proteína bruta.
Ejemplo 5 Construcciones de gen
Las construcciones de los genes utilizadas para expresar unas proteínas recombinantes en la leche de animales transgénicos contienen en todos los casos la región reguladora del gen WAP de conejo: fragmento BamHI-HindIII (6,3 Kb) o fragmento EcoRI-HindIII (17,6 Kb). Los plásmidos WAP-hGH, WAP bGH, WAP \alpha-AT, y WAP-EPO contienen respectivamente los genes enteros (secuencia de cabeza, exones, intrones y terminador de transcripción) de la hormona de crecimiento humano (hGH), de la hormona de crecimiento bovino (bGH), de la \alpha_{1}-antitripsina humana mutada en Arg358 y de eritropoyetina humana. En estas construcciones los genes han sido asociados a la región reguladora del gen WAP en el lugar Hind III. La construcción WAP-FVIII-\DeltaII contiene el ADNc del factor VIII humano en su forma \Delta II precedida de un intrón del gen del factor VIII humano. Este conjunto intrón-ADNc ha sido introducido en el lugar Hind III del gen WAP de conejo entero (figura 6).
Ejemplo 6 Identificación de la actividad de la región reguladora del gen WAP de conejo in vitro
Unas longitudes variables de la región situada corriente arriba del lugar de iniciación de la transcripción del gen WAP han sido asociadas a un gen transportador (el gen CAT: cloranfenicol acetil transferasa) (figura 7). Estas construcciones han sido introducidas en unas células epiteliales mamarias cultivadas sobre un gel de colágeno I de cola de rata por una transfección con la ayuda de lipofectina. Las células han sido a continuación mantenidas durante tres días en presencia de hormonas (insulina, cortisol, prolactina). La enzima ha sido entonces medida en los extractos celulares. Las construcciones sólo contienen 1806 pb o menos de la región reguladora y no expresan el gen CAT. La construcción que contiene 3000 bp es débilmente activa, mientras que las construcciones que contienen 6300 y 17600 bp son francamente expresadas en presencia de las hormonas. La prolactina sola ejerce una función inductora débil pero significativa sobre el gen CAT. La insulina y sobre todo el cortisol, inactivos solos, amplifican la acción de la prolactina. La sensibilidad del gen con respecto a las hormonas es exactamente idéntica a la del gen WAP endógeno de las células. Las regiones -3000-1806 bp y -6300-3000 bp contienen por tanto unos elementos reguladores esenciales para que el gen WAP se exprese de manera intensa (figura 8). El fragmento 17600-6300 bp no aporta estimulación suplementaria in vitro lo que no excluye que pueda tener dicha acción in vitro en los animales transgénicos. Estas experiencias revelan por primera vez la actividad de las regiones reguladoras del gen WAP in vitro por unas transfecciones de las células.
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Leyenda relativa a las figuras Figura 6
Las construcciones utilizadas para obtener la expresión de proteínas recombinantes en la leche de animales transgénicos.
Figura 7
Esquema de las diferentes construcciones que comprende el gen CAT puesto bajo la dependencia de longitudes variables del gen de la WAP de conejo.
Figura 8
Representación de la variación de la actividad CAT en unos extractos de células epiteliales primarias mamarias de conejo transfectadas por diferentes plásmidos.

Claims (19)

1. Procedimiento de preparación de una proteína heteróloga de interés en forma madura o en forma fusionada en la leche de una hembra de mamífero, distinta del ser humano, procedimiento en el cual:
-
se cría dicha hembra, y
-
se recupera la leche de la que se recupera dicha proteína que se separa si es necesario,
caracterizado porque dicha hembra es un animal transgénico en el genoma del cual ha sido integrada una secuencia que codifica para dicha proteína de interés bajo el control de por lo menos una secuencia que figura entre los elementos de expresión de la proteína WAP de conejo y que se encuentra en el fragmento de una longitud de por lo menos 3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP completo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia que codifica para dicha proteína heteróloga de interés está bajo el control de una secuencia que comprende además por lo menos un elemento de expresión situado sobre el fragmento comprendido entre 3 Kb y 6,3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP de conejo completo.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la secuencia que codifica para dicha proteína heteróloga de interés está bajo el control de una secuencia que comprende todos los elementos de expresión situados sobre el fragmento de una longitud de 6,3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP de conejo completo.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia del promotor WAP comprende los elementos de expresión situados sobre la secuencia de 6,3 Kb comprendida entre los lugares Hind III y BamHI representados en la figura 1.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la secuencia que codifica para dicha proteína heteróloga de interés está bajo el control de una secuencia que comprende todos los elementos de expresión situados sobre el fragmento de una longitud de 17 Kb, corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP de conejo completo.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia del promotor WAP comprende los elementos de expresión situados sobre la secuencia de 17 Kb, comprendida entre los lugares Hind III y EcoRI representados en la figura 1.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la secuencia que codifica para dicha proteína de interés está precedida hacia su extremo 5', por una secuencia que corresponde al promotor del gen WAP de conejo completo, o de una secuencia equivalente que asegura la función de promotor.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicha proteína de interés está precedida de la totalidad del gen WAP y del promotor WAP de dicho gen o de una secuencia equivalente.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque, en la secuencia correspondiente al gen de la proteína WAP de conejo, el codón AUG iniciador está delecionado.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque en la secuencia correspondiente a la secuencia que codifica para la proteína heteróloga, el codón AUG iniciador está delecionado.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque para recuperar la proteína de interés en la leche de dicha hembra de mamífero,
a)
se recogen las glándulas mamarias,
b)
se dejan incubar las glándulas mamarias a una temperatura de aproximadamente 0ºC por una duración que varía de dos horas a 18 horas,
c)
se recupera la leche que haya exudado espontáneamente de las glándulas,
d)
se aísla la proteína de interés a partir de la leche y se obtiene dicha proteína purificada.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la secuencia que codifica para la proteína heteróloga es la secuencia que codifica para la hormona de crecimiento humano.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la proteína heteróloga se elige entre:
-
los factores de crecimiento,
-
las interleucinas,
-
los factores de estimulación,
-
las quinasas,
-
los factores de coagulación,
-
la alfa-antitripsina,
-
la hirudina.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la proteína se elige entre:
-
la eritropoyetina,
-
la G-CSF,
-
la alfa-antitripsina,
-
la uroquinasa,
-
el factor VIII.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia quecodifica para la proteína de interés, está constituida por el ADNc del factor VIII-delta II humano, precedido por el primer intrón del gen del factor VIII.
16. Célula eucariota con excepción de las células que se encuentran in situ en el cuerpo humano, caracterizada porque contiene en su genoma una secuencia que codifica para la proteína heteróloga de interés, bajo el control del promotor WAP de conejo o de una secuencia equivalente que asegura la función de promotor.
17. Célula eucariota según la reivindicación 16, caracterizada porque se trata de una célula epitelial primaria mamaria de un mamífero hembra.
18. Hembra de mamífero transgénico distinto del ser humano, caracterizada porque contiene unas células según una de las reivindicaciones 16 y 17.
19. Secuencia de ADN, caracterizada porque comprende por lo menos un gen heterólogo que codifica para una proteína de interés, bajo el control de por lo menos una secuencia que figura entre los elementos de expresión de la proteína WAP de conejo y que se encuentra sobre el fragmento de una longitud de por lo menos 3 Kb corriente arriba del extremo 3' del promotor WAP completo
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