JPH06508515A - トランスジェニック哺乳類の乳汁中への所望なタンパク質の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニック哺乳類の乳汁中への所望な本発明は、トランスジェニック動 物の乳汁への所望なタンパク質の調製法に関する。本発明はそのような動物を得 ることを可能にする構築物、得られた動物、並びに異種タンパク質を発現させる 構を含む細胞にも関する。

生物学上、治療上または産業上型まれる、天然にはわずかな量でしかまたは精製 が難しい形態でしか産生されないタンパク質を得る目的で、いくつかの方法が検 討されてきた。

これにより、細菌または酵母のような微生物による遺伝子組換え技術を使用して タンパク質を産生ずることが可能となった。しかしながら、大部分のタンパク質 では、合成後にある種の反応基の化学修飾、グリコジル化などの成熟段階が必要 である。原核細胞は、この成熟を行い、したがって不活性タンパク質および／ま たは高い抗原性を有するタンパク質を産生ずるのに十分な量の酵素を含有してい ない。

それ故、真核細胞中でこれらのタンパク質を合成し、適当な酵素的転換を行うよ うにするのが好ましい。しかしながら、組繊細胞を大規模に培養するには、多く の技術的および経済的問題が存在する。

それ故、もう一つの方法は、トランスジェニック動物を用い、イン・ビボで細胞 によってこれらのタンパク質を産生させることからなっている。用いる系には、 回収が容易なタンパク質を多量に産生させることができることが望まれる。それ 故、組換えタンパク質がトランスジェニック動物の乳腺で産生され、乳汁中に排 出されることが有利である。これは実に容易に採集することのできる体液であり 、その複雑さも比較的限られており、タンパク質分解活性も低く、加えて、組換 えタンパク質の成熟工程も確実に行われることになると思われる（グリコジル化 、リン酸化、分裂等）。

このようにして、マウスまたは雌ヒツジの乳腺で、別種の乳汁タンパク質または 通常は乳汁中に存在しないタンパク質を合成することができるようになった（文 献１〜１５）。

しかしながら、このようにして産生されるタンパク質の濃度は極端に変化する可 能性がある。これは、それ自体が動物毎に変化する導入遺伝子＜ｔｒａｎｓｇｅ ｎｅ）の組み込み過程によって、トランスジェニック動物毎に異なってしまうこ とによる。遺伝子構築物の性質もまた重要であり、乳汁タンパク質遺伝子の発現 を調製する要素は多数あり、遺伝子のプロモーター領域および転写部分の各種ノ 地点に位置すると考えられる。ヒツジのβ−ラクトグロブリン、ラットＷＡＰお よびラットβ−カゼインのプロモーターによって、これらのタンパク質をトラン スジェニックマウスで合成させることができる。しかしながら、その濃度は、系 統的にはβ−ラクトグロブリンの場合のみ高い。同様に、β−ラクトグロブリン プロモーターはヒトα１−抗トリプシンの合成を指示し、これはトランスジェニ ックマウスの乳汁中で乳汁１ｍｌ当たり７ｍｇの値に達する。このα、ｌ−カゼ インプロモーターによりヒトウロキナーゼを合成することができるが、今日まで 使用されてきたラットβ−カゼインおよびウサギβ−カゼイン遺伝子のプロモー ターの活性は限定されたものである。マウスＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、ト ランスジェニックマウスの乳汁中に分泌される数種類の異種タンパク質（プラス ミノーゲン活性化因子、ＣＤ４）の合成を指示する。しかしながら、このプロモ ーターによって得られ′るタンパク質の量は比較的少ない。

“更に、プロモーターが外来遺伝子との会合によってその特異性が修飾されるこ とも起り得る。この方法で、Ｑｕｅｎ−ｚｂｕｒｇ等（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１９９１年）は、トランスジェニック動物において、 マウスＷＡＰプロモーターに依存する組み換えＤＮＡを用い成長ホルモンの分泌 物を得ているが、成長ホルモンはこの場合にはＢｅｒｇｍａｎのグリア細胞中に 小脳でも産生される。このような現象が、毒性および動物の早熟死をもたらすこ ともある。

本発明は、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーターの特に興味深い現象に基づくもの である。実際に、ウサギＷＡＰ（ｒ乳清の酸性タンパク質」）は、比較的豊富に 存在するウサギの乳汁タンパク質（乳汁１ｍｌ当たり１５ｍｇ）であり、ウサギ は大規模に使用することのできるトランスジェニック動物と考えることができる 。

本発明は、雌唾乳動物の乳汁中で目的の異種タンパク質を成熟した形態または融 合した形態で調製する方法であって、この方法は、 雌哺乳動物を飼育し、 乳汁を回収し、そこからタンパク質を回収し、必要ならば分離することからなる 方法であって、前記雌哺乳動物は、そのゲノム中に、ウサギＷＡＰタンパク質を 発現させる要素中に存在しかつ完全なＷＡＰプロモータの３′末端かせ少なくと も３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置している少なくとも一つの配列の 制御下にある、目的のタンパク質をコードする配列が組み込まれてなるトランス ジェニック動物であることを特徴とする方法に関する。

好ましくは、本発明は、目的のタンパク質の発現を制御する配列が、ＷＡＰプロ モーターの３′末端から３Ｋｂと６，３Ｋｂとの間のフラグメント上に位置する 発現要素をも含んでいる方法に関する。

トランスジェニック動物の生産は既知であり、前記の報告中に同様の構築物につ いて広汎に説明されているが、Ｇｕｎｚｂｕｒｇら、Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ ら、Ｂｕｒｄｏｎら、Ｒｅｄｄｙらの文献並びに特許Ｗ０９００５１８８号明細 書にも記載されている。

遺伝子導入の方法についての詳細な説明は詳しく繰り返し述べることはしないが 、前記の文書を本明細書の開示の一部として引用する。

「目的の異種タンパク質」とは、天然にはウサギＷＡＰプロモーターによって制 御されないタンパク質を本質的に指すものとする。

本発明の方法では、使用する雌哺乳動物は好ましくはウサギであるが、これらの 構築物は他の哺乳類、例えばマウスでも有効である。

得られた乳汁は目的のタンパク質を含んでおり、これは単離することができ、あ るいは次にそれが成熟した形態であるか融合した形態であるかによって、必要な らば化学的または酵素的な開裂を行わせることができる。

用いるＤＮＡ構築物は、１細胞から８細胞段階までの受精卵へマイクロインジェ クションによって導入した後、前記に説明する基準に適合する動物、すなわちト ランスジェニックであって乳汁中で前記のタンパク質を発現する動物を選択する のが好ましい。

細菌性のクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）のレポーター遺伝子 上にグラフトされたＷＡＰ遺伝子のプロモーター領域は、２Ｎ類の極めて重要な 乳汁分泌ホルモンであるプロラクチンおよび糖質コルチコイドに感受性である要 素を含む。これらのホルモンは、ハイブリッド遺伝子をウサギ乳房の主要上皮細 胞（ｐｒｉｍａｒｙ　ｅｐｌｔｈｅｌｉｓｌ　ｃｅｌｌ）にトランスフェクショ ンすると、ＣＡＴ遺伝子の発現に強い刺激を与える。このホルモン応答は、使用 するプロモーターの長さによって変化する。それ故、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロ モーターは、今日まで使用されてきたマウスおよびラットのＷＡＰ遺伝子のプロ モーターよりも遥かに効果的である。

特に、本発明による方法では、ウサギＷＡＰ遺伝子の完全プロモーターに対応す る配列またはプロモーターの機能を保持する同等の配列を目的のタンパク質をコ ードする配列の５′末端に先行させることができる。この場合には、総てのＷＡ Ｐ遺伝子および前記の遺伝子または同等の配列のＷＡＰプロモーターを使用する ことも可能である。本出願明細書に添付されているｊｆ！５図は、前記のウサギ ＷＡＰ遺伝子を表わしているものである。

「同等の配列」とは、好ましくはＷＡＰプロモーターの３′末端から少なくとも ３Ｋｂの長さを育し、特に完全なウサギＷＡＰプロモーターの３′末端から少な くとも６，３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置し、とり扛けＨｉｎｄｌ ＩＩおよびＢａｍＨ１部位（第１図）の間に位置する、発現要素を含むものを表 わすと理解される。

このプロモーターは、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩおよびＥｃｏＲ１部位の間の１７Ｋｂ の配列、または、このフラグメント上に位置する発現要素を含む配列を含むこと ができる。

本発明の構築物に必須の要素は、プロモーターの３′末端から１７．６Ｋｂの長 さを有する７ラグメント上に位置する。

この長いプロモーターは、これに結び付いている外来遺伝子の発現を更に促進す る要素を提供し、またはこれらをゲノムに導入された遺伝子の挿入部位と更に独 立させることによって、一層規則的に高く発現させることができる。

６．３Ｋｂの短いプロモーターは、乳汁産生ホルモンという、１７Ｋｂの長いプ ロモーターによって得られるものと実際上同一のホルモンに応答し、遺伝子が非 常に高レベルでベクター中においてそれと関連しているタンパク質の合成を指示 することができる。

本発明は、前記で定義した構築物であってウサギＷＡＰタンパク質遺伝子に対応 する配列においてイニシ工−ターＡＵＧコドンが欠失しているものにも関する。

この修飾は特に、部位特異的突然変異誘発によりて得ることができる。

目的のタンパク質をコードする配列がＷＡＰ遺伝子の総てまたは一部の配列と融 合した形態であるときには、このタンパク質のＡＴＧ配列をなくすことができる 。

従って、ウサギＷＡＰタンパク質は、この種類の構築物を用いて例えばトランス ジェニックマウスで発現させることができる。

イニシエーターのＡＵＧコドンを喪失しているいてもよいウサギＷＡＰタンパク 質遺伝子を含むこの種類の構築物においては、目的のタンパク質に対する遺伝子 またはｃＤＮＡを、実施例から明らかになるように、異なる部位に配置して、異 なるレベルおよび種類の構築物を生じさせることができる。

本発明の別の態様によれば、雌哺乳動物の産生ずる乳汁およびこれに含まれるタ ンパク質を回収する方法であって、前記の雌唾乳動物の乳汁から目的のタンパク 質を回収するため、 ａ）乳腺を回収し、 ｂ）この乳腺を、約０℃の温度で２時間〜１８時間インキュベートし、 Ｃ）乳腺から自然に滲出した乳汁を回収し、ｄ）目的のタンパク質を乳汁から単 離して、前記の精製したタンパク質を得ることを特徴とする方法が提供される。

この方法は、異種タンパク質の産生の枠組で、ＷＡＰタンパク質遺伝子をそのゲ ノムフラグメントに組み込んだトランスジェニック動物を用いて開発したが、こ れは乳汁から単離することが所望な任意のタンパク質の精製に応用することがで きる。

これは、反御動物以外の哺乳類の通常の採乳方法と比較すると、その採集量に関 しては、とりわけマウスのような小動物ではかなり有利であることを示しててい る（２４）。回収した乳汁の組成は、自然に産生じた乳汁の組成と同じである。

また、この方法では、乳腺を水中で輸送することによって、生産場所で得られた 生成物を精製および処理の場所へと容易に運搬することができる。

本発明の異種タンパク質の調製法では、その変法のいずれによっても、多種類の タンパク質を得ることが可能である。これらのタンパク質の中で、下記のものが 特記される： 成長因子、 インターロイキン、 刺激因子、 キナーゼ、 凝固因子、 α−抗ヒトリブシン エリスロポエチン、 Ｇ−ＣＳＦ。

α−抗ヒトリブシン ウロキナーゼ、 ＶＩＩＩ因子。

下記の構築物を挙げることができるニ ーＷＡＰ−ヒトα１−抗トリブシン構築物（Ａｒｇ３５８類似体）：　Ｍｅｔｈ ３５８の代わりにＡｒｇ３５８を有するヒトの全α１−抗トリプシン遺伝子（Ｃ ｏｕｒｔｎｅｙ、Ｂｕｌｌ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ、（１９８ｇ）、ｌｉｅ 、８５−９４）を、ＷＡＰ−ＧＨ構築物をモデルとして、未翻訳の５′Ｐ配列の ＨｉｎｄＩ１１部位のウサギＷＡＰ遺伝子の長いプロモーター（１７，６Ｋｂ） に融合した。数種類のラインのマウスが、ヒト遺伝子を乳汁１ｍｇ当たり５ｍｇ の濃度で発現する。

−ＷＡＰ−ヒトエリスロポエチン構築物：　ヒトの全エリスロポエチン遺伝子（ Ｓｅｗｅｎｚａ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　（１９８９）、　８６．２３０１−２３０５ 　）をウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーター（６，３Ｋｂおよび１７゜６Ｋｂ）に 融合した。

−ＷＡＰ−ヒトＶＩＩＩ−ΔＩ！因子構築物：　ヒトのＶＩＩＩ−Δ！Ｉ因子の ｃＤＮＡ　（Ｂ領域から欠失したもの［Ｍｅｕｌ　ｔｅｎら、Ｐｒｏｔ、　Ｅｎ ｇｌｎ、（１９８ｇ）、　２．３０１−３０６１）であってＶＩＩＩ因子遺伝子 の最初のイントロンがその前にあり、ポリアデニル化配列を欠いたものを、部位 特異的突然変異誘発によって導入された Ｈｉｎｄｌ　ｌ　１部位であって天然のＡＵＧより前にウサギの全ＷＡＰ遺伝子 の内側に導入する。

本発明“による構築物によって全く予期しない結果を得ることができ、特にヒト およびウシ成長ホルモン遺伝子と結合したＷＡＰの６．３ｋｂプロモーターが、 トランスジェニックマウス乳汁中でこれらのタンパク質の合成を、極めて高い濃 度（１−２１ｍ　ｇ　／　ｍ　１　）で指示できることができるのである。

トランスジェニックマウスの乳汁に含まれるｈＧＨは、構造的に完全である。こ のｈＧＨは、その生物学的活性も保存していた（その成長ホルモン活性ではなく 、プロラクチン活性により評価）。生物学的試験では、ホルモン濃度は１０ｍｇ ／ｍ　ｌであり、この値は放射免疫学的試験および電気泳動法により得た値と一 致している。

それ故、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、今日まで用いられてきたマウス およびラットのＷＡＰ遺伝子のプロモーターより遥かに効果的である。

下記の第１表は、出版物２から１５の結果をまとめたものであり、従って先行技 術で公表された利点と比較して本発明による構築物を用いて得られる利点を明ら かにしている。

必須の前提の１つは、ウサギのＤＮＡフラグメント（６，３Ｋｂ）が、そのマウ スおよびラットの相同染色体（２，６Ｋｂおよび０．９Ｋｂ）よりも遥かに長か ったということにあると考えることができる。必須の制御要素は、使用したマウ スおよびラットＤＮＡフラグメントでは欠落している場合がある。

本発明はまた、本発明によるトランスジェニック動物を得ることができる構築物 にも関する。

本発明は、とりわけＤＮＡ配列およびベクターであって本発明の方法の実施を可 能にするもの、特に、ウサギＷＡＰタンパク質を発現させる要素中に存在しがっ 完全なＷＡＰプロモータの３′末端から少なくとも３Ｋｂの長さを有するフラグ メント上に位置している少なくとも一つの配列の制御下にある、目的のタンパク 質をコードする少なくとも一つの異種遺伝子を含んでなるＤＮＡ配列に関する。

本発明は、本発明による方法に使用することのできるトランスジェニック動物、 および、本発明による構築物を含む形質転換細胞にも関する。

対象となる動物は様々なものがあげられるが、ウサギは豊富な組換えタンパク質 を得るのに用いることができると考えられる動物である。毎日最大１００ｍ１ま での乳汁を採集することができる。この乳汁は、タンパク質に富む（反御動物の 乳汁より遥かに豊富である）。大型のトランスジェニック動物よりもウサギを得 る方が、一層容易で廉価である。また、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーターは、 ウサギの組換えタンパク質合成を指示する上で最善のものと考えられる。

本発明の他の特徴および利点、［ｓｉｃ］は、下記の図を参照しながら下記の実 施例を読むことにより明らかになろう。

第１図　ウサギＷＡＰ遺伝子地図。

第２ａ図　プラスミドｐ　Ｗ　３構築物の概略図。

第２ｂ図　プラスミドルーポリＩ　Ｉ　Ｉ−Ｉのポリリンカ第３図　プラスミド ｐＪ４構築物の概略図。

第４図　構築物ｐ　Ｗ　３およびｐＪ４を有するトランスジェニックマウスライ ンにおけるヒトおよびウシ成長ホルモンの産生。

第５図　ウサギＷＡＰ遺伝子配列。

第６図　イン・ビボで使用した様々な構築物の概略図。

第７図　ＣＡＴレポーター遺伝子および可変長さのプロモーターＷＡＰを含む構 築物の概略図。

第８図　第７図に記載した構築物の効率。

実施例１：　プラスミドｐ　Ｗ　３の構築物最初にプラスミドｐ２６Ｃを調製す る。

プラスミドｐ２６Ｃは、ＷＡＰ遺伝子転子ａ　ｍ　Ｈ１−ＨｉｎｄｌＩＩ配列（ 第１図の６．３Ｋｂフラグメント）を（ＢａｍＨｌ［ｓ　ｉ　ｃ］およびＨｉｎ ｄＩ　Ｉ　Ｉ部位の間の）Ｐ−ポリＩ　Ｉ　Ｉ−１ベクターのポリリンカーに導 入することによって得た。

このクローニングの際に、ＢａｍＨｌ　［ｓ　Ｌ　ｃ］部位は欠失され、ベクタ ーｐ２６Ｃに存在するＣｌａｌ部位と交換された（第２図）。それ故、ベクター ｐ２６Ｃは６．３ＫｂＷＡＰプロモーターの依存下で配置された外来遺伝子を受 け入れることのできるプラスミドである。

外来遺伝子の導入は、例えばポリリンカーの５ａｌＩ部位で行うことができる（ 第２図）。この全プロモーターおよび外来遺伝子を含む挿入物は、プラスミドの ポリリンカール−ポリＩ　Ｉ　Ｉ−Ｉの末端にある２つのＮｏｔ１部位で切断し た後プラスミドから単離することができる。

プラスミドｐ２６Ｃから得られるプラスミドｐ　Ｗ　３（第２図による）は、ウ サギＷＡＰ遺伝子のプロモーター　（６，３Ｋｂ）およびヒト成長ホルモン遺伝 子（ｈＧＨ）を含む。このトランスジェニックマウスを得るために使用するフラ グメントは、２つのＮｏｔ１部位の間にある。

ＨｉｎｄｌＩＩ部位を部位特異的突然変異誘発によって遺伝子のリーダーシーケ ンスに導入して、クローニング部位として働くようにした。

＊ｔｌＡｆｌ’４２ニ　プラスミドｐＪ４の構築物プラスミドｐ２６から得られ るプラスミドｐＪ４（第３図による）は、ウサギＷＡＰ遺伝子のプロモーター（ ６，３Ｋｂ）およびウシ成長ホルモン遺伝子（ｂ　Ｇ　Ｅ）を含む。トランスジ ェニックマウスを得るのに用いたフラグメントは、２つのＮｏｔＩ部位の間にあ る。

プラスミドｐ２６を含むＥ、ｃｏｌｉ株は、１９９１年６月１２日に寄託番号ｌ −１１１６で、パスツール研究所のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ 　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｓｓ　、　２５Ｒｕｅ 　ｄｕ　Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ　。

７５７２４ＰＡＲＩＳ　ＣＥＤＥＸＩ　５　ｉ：寄託サレタ。

実施例３：　トランスジェニックマウスの産生ｐ　Ｖｉ’　３およびＩ）Ｊ４フ ラグメントを用いてトランスジェニック動物を得た。トランスジェニックマウス は、従来の手法であるマイクロインジェクション（Ｂｒ１ｎｓｔｅｒｅｔ　ａｔ 、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　（１９８５） 、　８２゜４４３８−４４４２　）によって得た。５００コピーの遺伝子を含む ２−ｐ　１を、マウス胎児の雄性前核に注入した。この構築物は、ベクタールー ポリＩ　Ｉ　Ｉ−１で調製した（Ｌａｔｈｅ　ｅｔ　ａｔ、、Ｇｅｎｅ　（１９ ８７）、　５７．１９３−２０１）　。組換え遺伝子を含むこのベクターのＮｏ ｔｌ−Ｎｏｔｌフラグメントをマイクロインジェクションした。次に胎児をホル モン調製した養母の雌性卵管に移した。操作した胎児の約１０％から幼若マウス が生まれ、操作した胎児の２−５％からトランスジェニック幼若マウスが生まれ た。

導入遺伝子の存在は、マウスの尾から抽出したＤＮＡからのサザンブロッティン グの手法によって確認した。動物の血液および乳汁中の成長ホルモンの濃度は、 特異的な放射免疫学的試験によって評価した。

ｈＧＨの生物学的活性は、乳汁をウサギの細胞または乳房の組織片の培地に加え ることによって評価した。乳汁中のｈＧＨ含有量は、ｍＲＮＡおよびタンパク質 の測定によって評価したβ−カゼイン遺伝子の発現を引き起こした。

１ｍ亘４：　構築物ｐ　Ｗ　３およびｐＪ４を組み込んだトランスジェニックマ ウスの乳汁中のヒトまたはウシ成長ホルモンの産生 ホルモン濃度は、特異的放射免疫学的試験によって測定した。

トランスジェニックマウスの乳汁におけるｈＧＨの同定は、下記の手段で行う。

マウス乳汁を１５０，０００ｇで１時間遠心分離してカゼインミセルを沈澱させ る。

この上清（ウェル当たり１μｍ）を回収し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 によって、コントロールのヒト成長ホルモンおよびコントロール乳汁の存在下で 検討した。この結果を第４図に示す。

構築物ｐ　Ｗ　３を組み込んだ動物は、乳汁１ｍｌ当たり１０ｍｇ程度のｈＧＨ 濃度となり、１ｍｌ当たり２１ｍ１に達する場合もある。

構築物ｐＪ４を組み込んだ動物は、乳汁１’ｍ１当たり５ｍｌ程度から１７ｍｇ ／ｍｌまでのｂＧＨを産生ずる。

本発明による方法では、１．５ｍ　ｌの乳汁／マウス乳腺の収穫が可能になる（ 乳腺を水中に入れることによる）。それ故、３〜５ｍｌの濃度で外来タンパク質 を発現する２００匹の授乳マウスは、粗タンパク質１ｇを提供する。

トランスジェニック動物の乳汁で組換えタンパク質を発現するのに使用する遺伝 子構築物は、いずれの場合にもウサギＷＡＰ遺伝子の調節領域であるＢａｍＨｌ −ＨｉｎｄｌＩＩフラグメント（６，３Ｋｂ）またはＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　 Ｉ　Ｉフラグメント（１７，６Ｋｂ）を含む。プラスミドＷＡＰ−ｈＧＨＳＷＡ Ｐ−ｂＧＨＳＷＡＰ−α−ＡＴおよびＷＡＰ−ＥＰＯは、それぞれ、ヒト成長ホ ルモン（ｈＧＨ）　、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）　、Ａｒｇ３５８で変異させ たヒトα１−抗トリプシンおよびヒトエリスロポエチンの全遺伝子（リーダー配 列、エキソン、イントロンおよび複写終結因子）を含む。これらの構築物におい て、遺伝子はＨｉｎｄ１１１部位でＷＡＰ遺伝子の調節領域と関連されていた。

この構築物ＷＡＰ−ＦＶＩ　Ｉ　Ｉ−ΔＩ　ｌは、ヒトＶＩＩＩ因子（７）ＣＤ ＮＡを、ヒトｖ■■工因子遺伝子のイントロンが前にあるΔＩＩの形態で含む。

このイントロン−ｃＤＮＡ集合体を、ウサギの全ＷＡＰ遺伝子（第６図）のＨｉ ｎｄＩＩＩ部位に導入した。

実施例６：　インビトロにおけるウサギＷＡＰ遺伝子の制御領域の活性の同定 ＷＡＰ遺伝子の転写開始部位の上流に位置する領域の種々の長さのものを、レポ ーター遺伝子（ＣＡＴ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ）と結合した（第７図）。これらの構築物は、ラットの尾のコラーゲンニゲル 上で培養した乳房の上皮細胞に、リポフェクチンを用いたトランスフェクション によって導入した。次にこの細胞を、ホルモン（インシュリン、コルチゾール、 プロラクチン）の存在下で３日間保持した。

次いで、この酵素を細胞抽出物中で測定した。１８０６ｂｐまたはそれ未満の調 節領域しか含まない構築物は、ＣＡＴ遺伝子を発現させない。３０００ｂｐを含 む構築物には弱い活性があるが、６３００および１７，６００ｂｐを含む構築物 は、ホルモンの存在下で明らかに発現する。プロラクチンは単独では、ＣＡＴ遺 伝子上では弱いが有意な誘導作用を有する。インスリンおよびとりわけコルチゾ ールは、単独では不活性であるが、プロラクチンの作用を増幅する。遺伝子のホ ルモンに対する感受性は、細胞の内在ＷＡＰ遺伝子の感受性と全（同じである。

それ故、−３０００−１８０６ｂｐおよび−６３００−３０００ｂｐ領域は、Ｗ ＡＰ遺伝子を強力に発現させるのに必須の制御要素を含む（第８図）。１７゜６ ００−６．３００ｂｐフラグメントＣよ、インビトロでは追加の刺激を与えるこ とはなｔ１カ（、これ力（トランスジェニック動物中でインビトロにおけるこの ような作用を有するということを除外するもので（よな０゜これらの実験により 、インビトロでのＷＡＰ遺伝子の制御領域の活性を、細胞のトランスフェクショ ン１こよって初めて明らかにした。

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入　ｍａｍｍａｒｙ−ｓｐａｃｉｆｉｃ　Ｐτｏｍｏセｓｒ　Ｄｉｒｅｃｔｓ　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ロｆＧｒｏｗｅｈ　Ｈｏｒｍｏｎ＠　ｎｏｔ　ｏｎｌｙ 　セｏ　ｔｈｅ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｇｒａｎｄ、ｂｕｔａｌｓｏ　セｏ　Ｂｅｒ ｇｍＩＬｎ　Ｇ１１ａ　ｃ＠Ｌ１ａ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｇａｎ±ｃ　Ｍｉｃｅ。

２１、ＨＥＮＮ工（ＪＡＵ５ＥＮ　Ｉ、、Ｐｒｏヒｓｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ土０ｎ（１９９０）　１．３−１１ ２２、Ｂｔｌ’ＲＤＯＮＴ、　ｅヒａ１．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　 ｗｈａｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏヒｓｉｎヒｒａｎｓｇｅｎｅ　ｄｕｒｉｎｇ　 ｍａｍｍａｒｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎセ：　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｇ　ｏｆ　ｒａｇｕｌａセｉｏｎ　ｄｕｒｉ ｎｇ　ｐｒｅｇｎａｎｃｙａｎｄ　１ａｃｔａｔｉｏｎ ２３　、ＲＥＤＤＹ　Ｂ、Ｖ、　ａＩ＋ａＬ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈ ｏｒｍｏｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓａｉｏｎ　ｉｎＴｒａｎｇｇｅｎｉｃ　Ｍｏｕｓｅ 　Ｍｉｌｋ＋　ａｈａヒｒａｃヒｉｎ　Ｔｒａｎｓｇａｎａｓ。

Ｄａｖｅｌｏｐｍ＠ｎセａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　ｐ、２１２図面の説明 第６図 トランスジェニック動物の乳汁１こ含まむる組換えタンパク質を発現させるのに 用（また構築物。

第７図 ウサギＷＡＰ遺伝子の種々の長さのフラグメントの依存下で配置したＣＡＴ遺伝 子を含む様々な構築物の模式様々なプラスミドによってトランスフェクトされた ウサギ乳房の主要上皮細胞の抽出物中（；含まれる（ＡＴ活性の変化を表す。

プラスミドρＷ３の構築 プラスミドρＪ４の構築 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｉ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．雌哺乳動物の乳汁中への成熟した形態または融合した形態での目的の異種タ ンパク質の製造法であって、前記雌哺乳動物を飼育し、 乳汁を回収して、そこから前記タンパク質を回収して必要ならば単離することを 含んでなり、前記雌哺乳動物は、そのゲノム中に、ウサギＷＡＰタンパク質を発 現させる要素中に存在しかつ完全なＷＡＰプロモータの３′末端かせ少なくとも ３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位置している少なくとも一つの配列の制 御下にある、目的のタンパク質をコードする配列が組み込まれてなるトランスジ ェニック動物であることを特徴とする方法に関する。
2. ２．前記目的の異種タンパク質をコードする配列が、完全なウサギＷＡＰプロモ ーターの３′末端から３Ｋｂと６．３Ｋｂとの間のフラグメント上に位置してい る少なくとも一つの発現要素を更に含んでなる配列によって制御されている、請 求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記の異種タンパク質をコードする配列が、完全なウサギＷＡＰプロモータ ーの３′末端から６．３Ｋｂの長さのフラグメント上に配置された総ての発現要 素を含む配列によって制御されている、請求の範囲第１項または第２項に記載の 方法。
4. ４．ＷＡＰプロモーターの配列が、第１図に示されるＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨ Ｉ部位の間の６．３Ｋｂ配列に位置するた発現要素を含むものである、請求の範 囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記目的の異種タンパク質をコードする配列が、完全なウサギＷＡＰプロモ ーターの３′末端から１７Ｋｂの長さのフラグメント上に位置している総ての発 現要素を含む配列の制御下にある、請求の範囲第１〜４項のいずれか一項に記載 の方法。
6. ６．ＷＡＰプロモーターの配列が、第１図に示されているＨｉｎｄＩＩＩとＥｃ ｏＲＩとの間の１７Ｋｂの配列上に位置している発現要素を含むものである、請 求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．前記目的のタンパク質をコードする配列の前の５′末端側に、ウサギＷＡＰ 遺伝子の完全プロモーターに対応する配列またはプロモーター機能を保持する同 等な配列が存在する、請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
8. ８．前記目的のタンパク質の前に、全てのＷＡＰ遺伝子およびこの遺伝子のＷＡ Ｐプロモーターまたは同等の配列が存在する、請求の範囲第１〜７項のいずれか 一項に記載の方法。
9. ９．ウサギＷＡＰタンパク質遺伝子に対応する配列において、イニシエーターの ＡＵＧコドンが欠失している、請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の方 法。
10. １０．異種タンパク質をコードする配列に対応する配列において、イニシエータ ーのＡＵＧコドンが欠失している、請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載 の方法。
11. １１．前記雌哺乳動物の乳汁から目的のタンパク質を回収するために、 ａ）乳腺を回収し、 ｂ）この乳腺を、温度０℃で２時間〜１８時間インキュベートし、 ｃ）乳腺から自然に滲出した乳汁を回収し、ｄ）この乳汁から目的のタンパク質 を単離して、前記の精製したタンパク質を得る、 請求の範囲第１〜１０項のいずれか一項に記載の方法。
12. １２．異種タンパク質をコードする配列が、ヒト成長ホルモンをコードする配列 である、請求の範囲第１〜１１項のいずれか一項に記載の方法。
13. １３．異種タンパク質が、 成長因子、 インターロイキン、 刺激因子、 キナーゼ、 凝固因子、 α−抗トリプシン、 ヒルジン から選択される、請求の範囲第１〜１２項のいずれか一項に記載の方法。
14. １４．タンパク質が、 エリスロポエチン Ｇ−ＣＳＦ， α−抗トリプシン ウロキナーゼ、 ＶＩＩＩ因子 から選択される、請求の範囲１３項に記載の方法。
15. １５．目的のタンパク質をコードする配列が、ＶＩＩＩ因子遺伝子の最初のイン トロンの後にあるヒトＶＩＩＩ−ΔＩＩ因子のｃＤＮＡである、請求の範囲第１ ４項に記載の方法。
16. １６．請求の範囲第１〜１５項のいずれか一項に記載の方法を使用して得られた 目的のタンパク質を含む乳汁または乳製品。
17. １７．ゲノム中に目的の異種タンパク質をコードする配列を含み、それがウサギ ＷＡＰプロモーターまたはプロモーター機能を保持する同等の配列によって制御 されている、真核細胞。
18. １８．雌哺乳動物の乳房の主要上皮細胞である、請求の範囲第１７項に記載の真 核細胞。
19. １９．請求の範囲第１７および１８項のいずれか一項に記載の細胞を含んでなる 、トランスジェニック動物。
20. ２０．ウサギＷＡＰタンパク質を発現させる要素中に存在しかつ完全なＷＡＰプ ロモーターの３′末端から少なくとも３Ｋｂの長さを有するフラグメント上に位 置している少なくとも１個の配列の制御下にある、目的のタンパク質をコードす る少なくとも１種類の異種遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ配列。