ES2237849T3 - Sistema de expresion especifico de tejido de glandula mamaria que usa el sitio promotor de la beta-caseina de cabra coreana. - Google Patents

Sistema de expresion especifico de tejido de glandula mamaria que usa el sitio promotor de la beta-caseina de cabra coreana.

Info

Publication number
ES2237849T3
ES2237849T3 ES98944319T ES98944319T ES2237849T3 ES 2237849 T3 ES2237849 T3 ES 2237849T3 ES 98944319 T ES98944319 T ES 98944319T ES 98944319 T ES98944319 T ES 98944319T ES 2237849 T3 ES2237849 T3 ES 2237849T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
pgbc
gene
vector
cells
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98944319T
Other languages
English (en)
Inventor
Ook Joon Yoo
Kyung Kwang Lee
Young Mahn Han
Sun Jung Kim
Hae Young Jeong
Jung Ho Ko
Won Jun Oh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanmi Pharmaceutical Co Ltd, Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST, Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd filed Critical Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2237849T3 publication Critical patent/ES2237849T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Dairy Products (AREA)

Abstract

Un vector recombinante pGbc (KCTC 0515BP), que usa un sitio promotor de â-caseína de cabras nativas coreanas.

Description

Sistema de expresión específico de tejido de glándula mamaria que usa el sitio promotor de la \beta-caseína de cabra coreana.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un sistema de expresión específico de tejido de la glándula mamaria que usa el sitio promotor para el gen de la \beta-caseína de las cabras nativas coreanas, a través del cual se pueden producir sustancias activadoras fisiológicas. Más particularmente, la presente invención se refiere a vectores de expresión en mamíferos recombinantes novedosos en los cuales están unidas una región reguladora de la expresión del gen de la \beta-caseína, una sustancia activadora fisiológica y una región reguladora de la terminación. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir sustancias activadoras fisiológicas en las líneas celulares derivadas de glándula mamaria y en animales, usando los vectores recombinantes novedosos.
Antecedentes de la técnica
Las sustancias activadoras fisiológicas se producen y segregan en cantidades traza en el cuerpo humano y juegan un papel esencial en diversos metabolismos y modulaciones. Las sustancias activadoras fisiológicas conocidas hasta la fecha incluyen insulina, interleucinas, factores reguladores del crecimiento hematopoyético, tales como factor de las células troncales, factor estimulante de las colonias de granulocitos, eritropoyetina, etc., y son demasiado numerosos para describir en detalle sus funciones importantes en el cuerpo humano. La razón por la que tales sustancias activadoras fisiológicas, a pesar de su importancia, no se han industrializado aún, es que son difíciles de aislar y purificar debido a su cantidad vestigial en el cuerpo humano. Adicionalmente, las sustancias activadoras fisiológicas producidas usando un sistema de expresión procariótica, tal como el que se obtiene a partir de E. coli, frecuentemente no lleva a cabo sus funciones normales en el cuerpo humano igual que no ha superado aún sus problemas de estabilidad los cuales se deben de disolver antes de su administración.
De acuerdo con las notificaciones contribuidas a los círculos académicos, se sabe que, incluso si se ha usado un sitio promotor para un gen el cual se expresa específicamente en un tejido de glándula mamaria, el nivel de expresión es diferente dependiendo de las especies de las cuales se obtiene el promotor y en los genes a expresarse (Clark y col., (1987) Trends Biotech. 5, 20-24; Simons y col., (1987) Nature 328, 530-532; Lee y col., (1988) Nucl. Acids Res. 16, 1027-1041; Vilotte y col. (1988) Eur. J. Biochem. 186, 43-48; Gorden y col., (1987) Bio/Technology 8, 443-446; Shani y col., (1992) Transgenic Res. 1, 195-208; Wright y col., (1991) Bio/Technology 9, 830-834; Elbert y col., (1991) Bio/Technology 9, 835-838; Mega y col., (1994) Transgenic Res. 3, 36-42; Wei y col., (1995) Transgenic Res. 4, 232-240; Gutiérrez y col., (1996) Transgenic Res. 5 271-279).
Con el fin de producir sustancias fisiológicamente activas, los sistemas de expresión tomará ventaja de E. coli (publicación de patente de Corea, Nº. 94-5585) y las células animales se han usado usualmente. Estas técnicas ocasionalmente provocan éxitos industriales, pero aún tienen problemas significativos para resolverse. Por ejemplo, en el caso de la expresión que utiliza E. coli, la producción en masa es posible con bajo coste. Sin embargo, dado que E. coli, un procariota, no lleva a cabo una modificación postraduccional, la cual es una característica de eucariotas, tal como una sustancia activadora fisiológica humana como EPO no puede ejercer su actividad si se produce en E. coli. Para evitar este problema, la investigación activa se ha dirigido y continua dirigiéndose al desarrollo de sistemas de expresión los cuales toman ventaja de las células animales. Los productos expresados en estos sistemas son activos en el cuerpo humano debido a que ellos experimentan modificaciones postraduccionales. Sin embargo, el problema del alto coste para cultivas células animales permanece insoluble.
Casi todas las sustancias fisiológicamente activas que se producen industrialmente utilizan las técnicas anteriormente mencionadas, de forma que los problemas tienen que resolverse, incluyendo el sustento de la actividad, el coste y el aislamiento y purificación.
Exposición de la invención
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un vector recombinante pGbc (KCTC 051BP), usando un sitio promotor de \beta-caseína de cabras nativas coreanas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un vector recombinante pGbc_L (KCTC 0514BP), usando un sitio promotor de \beta-caseína de cabras nativas coreanas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un vector recombinante pGbc_S (KCTC 0513BP), usando un sitio promotor de \beta-caseína de cabras nativas coreanas.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un procedimiento para producir las proteínas deseadas, en el cual las proteínas deseadas se expresan en células derivadas del tejido de glándula mamaria las cuales se transfectan con el vector pGbc_L o el vector pGbc_S.
Preferiblemente, dichas células derivadas del tejido de la glándula mamaria son de la línea HC11.
Preferiblemente, las células HC11 se transfectan con un vector que lleva genes pGbc_L o un vector pGbc_S mediante coprecipitación con fosfato de calcio o electroporación.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado un procedimiento para producir las proteínas deseadas, en el cual las proteínas deseadas se expresan en células de la glándula mamaria de animales no humanos transgénicos con el vector pGbc.
Los sistemas de expresión específicos de la glándula mamaria desarrollados por la presente invención, llamados pGbc, pGbc_L y pGbc_S, depositados en la colección coreana de tipos de cultivos, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, en el 17 de agosto de 1998 (nº^{s}. de depósito KCTC 0515BP, 051BP y 0513BP, respectivamente) hacen posible que proteínas deseadas se produzcan mediante expresión en células animales derivadas del tejido de la glándula mamaria o a través de la leche segregada de los animales transgénicos con los sistemas de expresión, resolviendo de este modo los problemas anteriormente mencionados, es decir, el sustento de la actividad, coste de la producción, y aislamiento y purificación de las proteínas deseadas.
El uso de la región reguladora de expresión de un gen de la \beta-caseína, expresado específicamente en células de tejidos mamarios, en la producción de sustancias humanas fisiológicamente activas, ocasiona las siguientes ventajas industriales. Primero, debido a que las proteínas diana que se producen por la técnica de la recombinación de la presente invención experimentan la misma modificación postraduccional que las que hacen las proteínas correspondientes que se dan en la naturaleza, las proteínas diana pueden sostener su actividad en el cuerpo humano. En segundo lugar, en virtud de tomar ventaja de la especificidad para el tejido de la glándula mamaria, los sistemas de expresión de la presente invención emplean células derivadas del tejido de la glándula mamaria o animales transgénicos que producen sustancias activadoras fisiológicas a mucho más bajo coste que lo hacen los sistemas de expresión que usan células animales en general. Las proteínas producidas en las células derivadas del tejido de la glándula mamaria o a través de la leche segregada de animales transgénicos son pocas en número, de tal forma que la proteína diana es fácil de aislar y purificar. Adicionalmente, los animales transgénicos no requieren adicionalmente coste significativo en aumentar la producción de las proteínas diana igual que para no producir ninguna polución durante su producción. Una tercera ventaja es la seguridad de las sustancias activadoras fisiológicas producidas. Debido a que no hay toxinas en los productos segregados de los tejidos de la glándula mamaria, el sistema de expresión de la presente invención es más seguro que otros de los sistemas convencionales.
Con el fin de producir sustancias activadoras fisiológicas, se desarrollaron procedimientos que utilizan E. coli, o células animales y más recientemente, se ha tomado ventaja de los animales transgénicos. Las técnicas de expresión que usan E. coli como un animal hospedador o que usan células animales tienen ahora una limitación en aplicación industrial debida a los problemas anteriormente mencionados, es decir, el sustento de la actividad, el coste de la producción y el aislamiento y purificación de las sustancias producidas fisiológicamente activadoras. Como una medida de resolver estos problemas, los animales transgénicos y las técnicas relacionadas se han desarrollado rápidamente y ahora realizan un gran avance en los estudios biológicos.
La presente invención usa una línea celular derivada del tejido de la glándula mamaria en producción de proteínas. Por esto, la tecnología biológica molecular y otras técnicas punteras se emplean en la presente invención. Por ejemplo, las técnicas de recombinación del DNA se necesitan para construir los vectores de expresión en mamíferos los cuales son capaces de expresarse específicamente en tejidos de glándula mamaria y una técnica de microinyección es para producir un animal transgénicos con los vectores.
Aunque es bien conocido por aquellos expertos en la técnica usar los sitios promotores de los genes expresados específicamente en tejidos de glándula mamaria en construir un vector de expresión de mamíferos el cual es capaz de expresar proteínas específicamente en los tejidos de glándula y el vector de expresión en mamíferos de la presente invención se origina a partir de pRC/RSV, un vector comercial (Invitrogen Inc.), los sistemas de expresión de la presente invención son bastante diferentes de aquellos de otras técnicas convencionales en los siguientes aspectos. Primero, el promotor de \beta-caseína de cabra usado en la presente invención se obtiene de cabras nativas coreanas. Un segundo punto característicamente diferente es que el sitio promotor de la \beta-caseína de cabra está unido al primer exón de un gen estructural por medio del primer exón de la \beta-caseína de cabra. En la mayoría de los casos, un intrón se interpone entre el sitio promotor y el primer exón de un gen estructural. Tercero, en los vectores de expresión de mamíferos de acuerdo a la presente invención, una hormona de crecimiento bovina sigue a un gen estructural, con la ventaja de que realiza una terminación de transcripción preferible. Con independencia de si la señal de poliadenilación del gen estructural esté o no presente, el terminador de la hormona del crecimiento bovina está unido al gen estructural.
Breve descripción y dibujos
Los objetos y aspectos anteriores de la invención y otros llegarán a ser patentes a partir de la siguiente descripción de realizaciones con referencia a las figuras acompañantes en las cuales:
la figura 1 es una vista esquemática que muestra una parte de la estructura común de los vectores novedosos pGbc_S y pGbc_L para transfección dentro de células animales y un vector novedoso pGbc para animales transgénicos;
la figura 2 es la secuencia base del promotor de la \beta-caseína de cabras nativas coreanas;
la figura 3 es un diagrama esquemático que ilustra la construcción del vector recombinante pGbc_S, de acuerdo con la presente invención;
la figura 4 es un diagrama esquemático que ilustra la construcción del vector recombinante pGbc_L, de acuerdo con la presente invención;
la figura 5 es un diagrama esquemático que ilustra la recombinación del vector pGbc_S con un gen hGCSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 6 es un diagrama esquemático que ilustra la recombinación del vector pGbc_S con un gen hGMCSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 7 es un diagrama esquemático que ilustra la recombinación del vector pGbc_L con un gen hGCSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 8 es un diagrama esquemático que ilustra la recombinación del vector pGbc_L con un gen hGMCSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 9 es un diagrama esquemático que ilustra la recombinación del vector pGbc con un gen hGCSF o un gen hGMCSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 10 muestra un análisis de bandas de Western de las proteínas hGM-CSF producidas a partir de las células HC11 derivadas del tejido de glándula mamaria de ratón las cuales están transfectadas con un vector recombinante pGbc_L o pGbc_S que lleva un gen hGM-CSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 11 es un gráfico de ELISA de las proteínas hGM-CSF producidas a partir de las células HC11 derivadas del tejido de glándula mamaria de ratón las cuales están transfectadas con un vector recombinante pGbc_L o pGbc_S que lleva un gen hGM-CSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 12 es un gráfico de ELISA de las proteínas hGM-CSF producidas a partir de las células HC11 derivadas del tejido de glándula mamaria de ratón las cuales están transfectadas con un vector recombinante pGbc_L o pGbc_S que lleva un gen hG-CSF, de acuerdo con la presente invención;
la figura 13 es una fotografía de los productos de PCR obtenidos usando los DNAs genómicos de ratones transgénicos como plantillas;
la figura 14 muestra un análisis de bandas de Western de las proteínas hG-CSF segregadas en la leche de los ratones transgénicos, de acuerdo con la presente invención;
la figura 15 es un gráfico de ELISA de las proteínas hG-CSF segregadas en la leche de los ratones transgénicos, de acuerdo con la presente invención; y
la figura 16 es un gráfico de ELISA de las proteínas hGM-CSF segregadas en la leche de los ratones transgénicos, de acuerdo con la presente invención.
Los mejores modos de llevar a cabo la invención [1] Construcción de los vectores de expresión 1) Amplificación del promotor de la \beta-caseína y exones 1 y 2 de las cabras nativas coreanas
Dos pares de cebadores se diseñan para amplificar a través de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) una parte del gen de la \beta-caseína el cual se notifica que se expresa específicamente en las cabras nativas coreanas. Un par de los cebadores es responsable de la amplificación de un gen parcial incluyendo el sitio promotor de la \beta-caseína de cabra y exón 1 y el otro de la amplificación de un gen parcial que incluye el intrón 1 y el exón 2 de la \beta-caseína de cabra. El producto de PCR para el promotor y el exón 1 de la \beta-caseína de cabra se digiere con endonucleasas Sac I y Hind III mientras que el producto de PCR del intrón 1 y el exón 2 de la \beta-caseína de cabra se digiere con endonucleasas Hind III y Sal I. Los dos cebadores anterior y posterior para la amplificación de la \beta-caseína de cabra y el exón 1 se denominan GBC-F1 y GBC-R1, respectivamente y tiene las siguientes secuencias básicas: GBC-F1, 5'-GCT GAG CTC TTT AGT ATA TTG TTA AGG A-3'; y GBC-R1, 5'-TGT CAA GCT TAT CTT AAA CAC CCT TA-3'. Los dos cebadores anterior y posterior para la amplificación del intrón 1 y el exón 2 de la \beta-caseína de cabra se denominan GBC-F2 y GBC-R2, respectivamente, y tienen las siguientes secuencias de base: GBC-F2, 5'-GCA TAA GTC TTA CAC TAT TTT CAG CAG-3'; y GBC-R2, 5'-ATA GTC GAC CCA GAG TTG TTG TC-3'. Después los dos productos de digestión PCR se insertan juntos en un vector pBluescrip II SK, comercialmente disponible de Stratagene, el plásmido resultante se somete a análisis de secuencia de doble hebra para identificar la secuencia de bases de los fragmentos de genes ligados.
2) Construcción de pGbc_S y pGbc_L
De la región de gen subclonada en el pBluescrip II SK (Stratagene), un tramo de DNA que varía de 501 nucleótidos a un nucleótido en la parte anterior del codón de iniciación de la transcripción para el exón 1 se amplifica por PCR. Este producto de PCR se digiere con enzimas de restricción Nru I y Hind III. Por separado, el pRC/RSV, un vector de expresión de mamíferos, se trata con los mismos enzimas para eliminar la región LTR. A este plásmido abierto, se inserta el producto de digestión de PCR por ligazón para dar pGbc_S.
El producto de PCR digerido se trata adicionalmente con enzima de restricción Dra I y la extracción y purificación se hace para el fragmento génico cuyos extremos opuestos se cortan mediante Hind III y Dra I. El pBluescrip II SK que comprende las regiones promotora, exón 1, intrón 1 y exón 2 de la \beta-caseína de cabra se somete a doble digestión con las enzimas de restricción Stu I y Dra I, seguida por extracción y purificación del fragmento que no comprende ningún exón I del gen. Estos dos fragmentos de genes juntos están ligados a un vector pRc/RSV el cual se escinde previamente mediante Nru I y Hind III, para dar pGbc_L.
Si pGbc_S y pGbc_L están construidos correctamente o no se confirma mediante análisis de secuenciación de bases.
3) La construcción de pGbc y recombinación con genes de sustancia fisiológica activadora (factor estimulador de colonias de granulocitos de humano (hGCSF) y factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos de humano (hGMCSF))
El fragmento de gen del producto A de PCR incluye el sitio promotor y la región del exón I se digiere doblemente con Sac I y Dra I para dar un fragmento de gen incluyendo el sitio promotor y un exón 1 parcial que se continúa en un nucleótido en el lado 5' del codón de iniciación de traducción. Por separado, el producto de PCR de 500 pares de bases obtenido en 2) anteriormente, se digiere con Dra I y Hind III. Por ligazón, estos dos fragmentos se insertan juntos en un vector pBluescrip II SK (Stratagene) escindido con Sac I/Hind III el cual, después, se abre mediante la escisión con Hind III y EcoR I. A este plásmido abierto, se liga un fragmento truncado de gen el cual incluye un gen estructural ligado a una terminador de hormona de crecimiento bovina y el cual se trunca con Hind III y EcoR I. La estructura general de los vectores de tipo pGbc se muestra esquemáticamente en la figura 1.
[2] Recombinación de los vectores de expresión específicos del tejido de la glándula mamaria y el gen hGCSF con el gen hGMCSF
1) Usando técnicas bien conocidas de búsqueda de genes y PCR (Sambrock y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York), y gen hGCGF y gen hGMCSF se clonan en pUC19, un vector plásmido comercialmente disponible.
2) Recombinación del gen hGCSF y los vectores de expresión específica en tejido de la glándula mamaria pGbc_S y pGbc_L
El vector pUC19 en el cual el gen hGCSF se clona se digiere con enzimas de restricción BamH I y Xba I. El fragmento I, el cual incluye una región 2 a través de una señal de poli-A, se aísla y purifica. El vector así abierto se digiere con la enzima de restricción Pst I para dar el fragmento 2 el cual incluye una región que varía de un nucleótido en el lado 5' del codón de iniciación de traducción a través de un nucleótido en el lado 5' del exón 2. Los fragmentos 1 y 2 se insertan y ligan a un vector pBluescrip II SK el cual se abre con enzimas de restricción Pst I y Xba I, para producir un plásmido recombinante pBluescrip II SK-hGCSF. Este plásmido está sometido a doble digestión con endonucleasas Hind III y Xba I para obtener un gen modificado hGCSF el cual, después se liga a un vector pGbc_S el cual se digiere en los mismos sitios de endonucleasas Hind III y Xba I, para fabricar un plásmido novedoso pGbc_S-hGCSF.
De forma similar, se construye un plásmido novedoso pGbc_L-hGCSF ligando un fragmento el cual se obtiene mediante la digestión por endonucleasas de un promotor de \beta-caseína de cabra y un gen modificado hGCSF el cual se obtiene mediante doble digestión del pBluescrip II SK-hGCSF con Hind III y Xba I a un vector pGbc_L abierto con las mismas endonucleasas.
3) Recombinación del gen hGMCSF y vectores de expresión específicos de glándula mamaria pGbc_S y pGbc_L
El gen hGMCSF el cual se subclona en el vector pUC19 se extrae mediante digestión con enzimas de restricción BamH I y EcoR I y después, insertado mediante ligazón con un vector pBluescrip II SK (Stratagene) el cual se digiere con las mismas endonucleasas, para producir un plásmido recombinante pBluescrip II SK-hGMCSF. Un gen modificado se recuperó mediante la digestión del plásmido recombinante con Hind III y Xba I y después, se ligó a un vector pGbc_S el cual se digiere en los mimos sitios endonucleasa Hind III y Xba I, para construir un plásmido novedoso pGbc_S-hGMCSF.
De forma similar, un plásmido novedoso pGbc_L-hGMCSF se construye ligando un fragmento el cual se obtiene por la digestión mediante endonucleasa de un promotor de \beta-caseína de cabra y un fragmento de gen modificado hGMCSF el cual se obtiene mediante doble digestión del pBluescrip II SK-hGMCSF con Hind III y Xba I a un vector pGbc_L abierto con las mismas endonucleasas.
La construcción exitosa de los vectores de expresión se confirma a través de análisis de secuenciación de bases.
[3] Transfección de pGbc_S-hGCSF/hGMCSF y pGbc_L-hGCSF/hGMCSF en células HC11 derivadas de tejido de glándula mamaria de ratón e inducción de expresión con hormona de producción de leche 1) Cultivo de la cepa de células H11
Las células HC11 se cultivan en medios RPMI, comercialmente disponibles a partir de Gibco BRL, suplementados con suero fetal bovino a una concentración final de 10% de factor de crecimiento epidérmico a 10 ng/ml, insulina a 5 \mug/ml y gentamicina (Sigma) a 50 \mug/ml.
2) Transfección de pGbc_S-hGCSF, pGbc_S-hGMCSF, pGbc_L-hGCSF y pGbc_L-hGMCSF en células HC11
Los cuatro plásmidos novedosos construidos en la presente invención se purifican usando QIAGEN-tip 100, comercialmente disponible a partir de la compañía Qiagen, de acuerdo con el protocolo recomendado de la compañía Qiagen. La introducción de los plásmidos purificados en las células HC11 se lleva a cabo usando un electroporador, elaborado por Invitrogen. Un procedimiento detallado sigue el protocolo recomendado por el proveedor.
3) Selección con antibióticos
Las células HC11 se transfieren a los matraces T25 y se cultivan durante 24-48 horas en un incubador el cual se mantiene a 5% de CO_{2} y a 37ºC, después de lo cual los medios de cultivo se cambian con medios frescos RPMI 1640 (Gibco BRL), suplementado con suero fetal bovino a una concentración final factor de crecimiento epidérmico al 10% a 10 ng/ml, insulina a 5 \mug/ml y los antibióticos gentamicina (Sigma) a 50 \mug/ml y geneticina (Sigma) a 200 \mug/ml, para seleccionar las células transfectadas.
4) Inducción de expresión con hormona de producción de leche
Después de la selección, los medios selectivos se cambian con medios de inducción que comprenden medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con insulina a una concentración final de 5 \mug/ml, geneticina (Sigma) a 200 \mug/ml, gentamicina a 50 \mug/ml, prolactina de cabra a 5 \mug/ml y dexametasona a 1 \mum. Las células se cultivan en un incubador con CO_{2} al 5%, a 37ºC, durante 4 días sin refrescar el medio.
5) Ensayo del nivel de expresión
Las sustancias activadoras fisiológicas humanas producidas como un resultado de la inducción de expresión de sus genes se segregan al medio. Una técnica de bandas de Western se usa para el análisis cuantitativo de los productos segregados mientras un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) es para un análisis cuantitativo. Se usa para el análisis de la expresión del factor estimulador de colonias de granulocitos de humano como un anticuerpo primario para realizar la prueba de bandas de Western, el anticuerpo Ig G monoclonal o policlonal de ratón anti G-CSF de humano y se usa la Ig G de ratón anti G-CSF de humano para el análisis de la expresión del factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos de humano. Se usa Ig G antirratón conjugada con peroxidasa de rábano picante como un anticuerpo secundario para la prueba de bandas de Western. Para ELISA, los anticuerpos policlonales Ig G de cabra anti G-CSF de humano o anticuerpos policlonales Ig G de cabra anti GM-CSF de humano se anclan primero a placas de 96 pocillos las cuales se tratan después con el producto expresado como un antígeno correspondiente o con un factor comercialmente disponible usado como un estándar. A esto se unió el anticuerpo monoclonal anti G-CSF de humano o anti GM-CSF de humano los cuales son los mismos que se usan en la prueba de bandas de Western. Los complejos de anticuerpo resultantes se trataron con anticuerpo monoclonal Ig G antirratón conjugado con fosfatasa alcalina con el objetivo de inducir una reacción de coloración (Ed. Harlow y Davis Lane (1989) Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York).
[4] Expresión en ratón transgénico 1) Purificación de los vectores de transcripción
Para la purificación se usan los vectores de trascripción de E. coli, QIAGEN tip 100 (Qiagen) y Elutip (Schleicher & Schuell). Primero, los vectores para transcripción se purifican con la ayuda de QIAGEN tip 100. Los vectores purificados se purifican adicionalmente siguiendo el protocolo recomendado por Schleicher & Schuell y después, se separan por diálisis en una disolución que comprende 10 mM de Tris\cdotHCl (pH 7,2) y EDTA 10 mM, para producir un vector a una cantidad de 40 ng/ml, el cual se usa más tarde para microinyección.
\newpage
2) Microinyección
Dentro del sitio pronuclear masculino de un zigoto de ratón de línea CBA, el vector de expresión finalmente purificado se introduce por microinyección. Este zigoto se implanta en el útero de una madre sustituta usando una técnica de operación quirúrgica.
3) Ensayo de aislamiento del DNA genómico e inducción de genes
Las progenies de la madre sustituta tienen los rabos cortados. A partir de ellos, el DNA genómico se aísla y purifica de acuerdo a un procedimiento conocido (Vilotte, J. -L. y col., (1989) Eur. J. Biochem. 186, 43-48). Se identifica si el gen deseado se introduce correctamente dentro de los ratones o no mediante procedimientos apropiados incluyendo realizar prueba de bandas Southern y PCR.
4) Extracción de leche y ensayo de nivel de expresión
Los ratones de la progenie en los cuales los genes se introducen correctamente se dejan copular con ratones normales no transgénicos para producir las progenies de la siguiente generación. 10 días después del nacimiento, las ratonas transgénicas parturientas se separan de su prole durante 3 horas. Tras la inyección peritoneal de oxitocina, se extrae la leche de las ratonas parturientas. El nivel de expresión de los genes se analiza en la misma manera que a nivel celular, usando prueba de bandas de Western y ELISA para los análisis cualitativo y cuantitativo, respectivamente.
Ahora, se dará una descripción adicional del sistema de expresión de acuerdo con la presente invención, con referencia a las figuras.
Con referencia a la figura 1, hay una estructura que presenta vectores recombinantes pGbc_S, pGbc_L, y pGb. Los dos primeros vectores se construyen para la expresión en células animales mientras el último es para ratones transgénicos. Como se muestra en la figura 1, esta estructura de genes comprende región regulatoria de la expresión de un gen de \beta-caseína de cabra, una región de gen estructural CSF y una región terminadora de hormona del crecimiento.
La región de regulación de la expresión del gen \beta-caseína consta de un exón de gen \beta-caseína parcial la cual se extiende sólo hasta un nucleótido en el lado 5' del codón de iniciación de transcripción, y una reacción flanqueante 5' que incluye sitio promotor de la \beta-caseína de cabra.
En la región del gen estructural CSF, "ATG", el codón de iniciación, se escribe para enfatizar que viene de la sustancia activadora fisiológica a expresarse, por sí mismo. El gen hG-CSF consta de 4 exones mientras que el gen hGM-CSF consta de 5 exones, para lo cual "el exón 4 ó 5" permanece. "TER" designa el codón de terminación para el gen CSF.
En esta figura, las distancias de las regiones no son proporcionales, a sus longitudes actuales.
La figura 2 es la secuencia base del promotor de la \beta-caseína para la cabra nativa coreana utilizada en la presente invención. La secuencia base es idéntica a aquella del promotor y exón 1 de Capra hircus, comunicada por Roberts, B.T., Ditullio, P., Vitale, J., Hehir, K., y Gordon, K. en Gene (1992) 121, 255-262.
Con referencia a la figura 3, se muestra esquemáticamente un procedimiento de construcción para el vector recombinante pGbc_S. En la figura, la longitud de cada región no refleja la escala de su longitud actual. Que dos líneas se unan juntas en una línea de flechas ilustra el ligamiento mientras MCS permanece para el sitio de multiclonación, el producto de PCR es el producto obtenido por una reacción en cadena de la polimerasa, y RSV LTR representa repetición larga en tándem del virus del Sarcoma de Rous. Las líneas más gruesas en el producto PCR y las ilustraciones pGbc_S denotan el exón 1 de un gen de la \beta-caseína de cabra. Las enzimas de restricción se sitúan sobre sus propios sitios de reconocimiento en las ilustraciones.
Con referencia a la figura 4, se ha mostrado esquemáticamente un procedimiento de construcción para el vector recombinante pGbc_L. En la figura, la longitud de cada región no refleja la escala de su longitud actual. Una línea de flechas dentro de la cual tres líneas unidas juntas permanecen en ligazón, MCS permanece para el sitio de multiclonación, el producto PCR es el producto obtenido mediante una reacción en cadena de la polimerasa, y RSV LTR es la repetición larga en tándem del virus del Sarcoma de Rous. Las líneas más gruesas en las ilustraciones del producto PCR, el promotor de la \beta-caseína de cabra y el exón 1 y el pGbc_L denotan el exón 1 de un gen de \beta-caseína de cabra.
Con referencia a la figura 5, se muestra esquemáticamente un procedimiento para la recombinación entre el plásmido pGbc_S y el gen hGCSF.
En esta figura, las longitudes de los plásmidos y los fragmentos de DNA son sólo ilustrativos, pero no reflejan la escala de sus longitudes actuales. Las enzimas de restricción se sitúan sobre sus propios sitios de reconocimiento en las ilustraciones. La ligazón se expresa uniendo dos o más líneas juntas en una línea de flechas. Los exones de genes se expresan por líneas más gruesas que aquellos que expresan intrones de genes. En las ilustraciones de pBluescrip II SK-hGCSF, pGbc_S y pGbc_S-hGCSF, los exones e intrones se expresan indiscriminadamente.
Con referencia a la figura 6, se muestra esquemáticamente un procedimiento para la recombinación entre el plásmido pGbc_S y el gen hGCSF.
En esta figura, las longitudes de los plásmidos y fragmentos de DNA son ólo ilustrativas pero no reflejan la escala de su longitud actual. Las enzimas de restricción se posicionan sobre sus propios sitios de reconocimiento en las ilustraciones. La ligazón se expresa uniendo dos o más líneas juntas en una línea de flechas. Los exones de los genes se expresan por líneas más gruesas que aquellas que expresan intrones de los genes. En las ilustraciones de pBluescript II SK-hGMCSF, pGbc_S y pGbc_S-hGMCSF, los exones y los intrones se expresan indiscriminadamente.
La figura 7 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para la recombinación entre el plásmido pGbc_L y el gen hGCSF.
En esta figura, la longitud de cada uno de los plásmidos y fragmentos de DNA no reflejan la escala de su longitud actual. Las enzimas de restricción se posicionan sobre sus propios sitios de reconocimiento en las ilustraciones. La única línea de flechas en la cual muchas líneas se unen juntas ilustra la ligazón. En la ilustración para el fragmento de DNA obtenido por la digestión del vector pBluescript II SK-hGCSF con enzimas de restricción Hind III y Xba I, las líneas más gruesas siguen siendo para los exones. En las otras ilustraciones, los exones y los intrones se expresan indiscriminadamente.
La figura 8 es un diagrama esquemático que muestra un procedimiento para la recombinación entre el plásmido pGBc_L y el gen hGMCSF.
En esta figura, la longitud de cada uno de los plásmidos y los fragmentos de DNA no reflejan la escala de su longitud actual. Las enzimas de restricción se sitúan sobre sus propios sitios de reconocimiento en las ilustraciones. La única línea de flechas dentro de la cual se unen juntas muchas líneas ilustra la ligazón. En la ilustración para el fragmento de DNA obtenido mediante la digestión del vector pBluescript II SK-hGMCSF con enzimas de restricción Hind III y Xba I, las líneas más gruesas siguen siendo para los exones. En las otras ilustraciones, los exones y los intrones se expresan indiscriminadamente.
La figura 9 muestra una recombinación de los vectores pGbc con genes hGCSF y hGMCSF.
En esta figura, la longitud de cada uno de los plásmidos y fragmentos de DNA no refleja la escala de su actual longitud. Las enzimas de restricción se posicionan sobre sus propios sitios de reconocimiento en las ilustraciones. La única línea de flechas dentro de la cual se unen juntas muchas líneas ilustra la ligazón. En las ilustraciones para el promotor del gen de \beta-caseína de cabra y exón 1, y el producto de PCR, las líneas más gruesas siguen siendo para los exones.
En referencia a la figura 10, se muestra un análisis cualitativo para la expresión de hGM-CSF en células HC11 mediante una técnica de prueba de bandas de Western. Las proteínas para esta prueba de bandas de Western se obtienen de las células HC11, una línea celular derivada del tejido de la glándula mamaria de ratón, el cual se transfecta con cada uno de los vectores de expresión de mamíferos pGbc_S y pGbc-L, cada uno conteniendo un gen hGM-CSF, que induce a las células a la expresión.
En referencia a la figura 11, se muestra un análisis cualitativo para la expresión de hGM-CSM en células HC11 mediante ELISA. Las proteínas de ELISA se obtuvieron de las células transfectadas HC11 con cada uno de los vectores de expresión de mamíferos pGbc_S y pGbc_L, en el cual se clona un gen GM-CSF, que induce a las células a la expresión.
En referencia a la figura 12, se muestra un análisis cuantitativo para la expresión de hGM-CSF en células HC11 mediante ELISA. Las proteínas de ELISA se obtienen de las células HC11 transfectadas con cada uno de los vectores de expresión pGbc_S y pGbc_L, en la cual un gen hG-CSF se clona, que induce a las células a la expre-
sión.
La figura 13 es una fotografía que muestra la electroforesis de los productos de PCR de genes hGCSF en un gel de agarosa. En la figura, la vía (+) denota un producto PCR hGCSF usando como una plantilla el plásmido pGbc-hGSF. Un producto de PCR, usando como una plantilla el DNA genómico de los ratones transgénicos los cuales nacieron de una ratona sustituto en cuyo útero se implantó un zigoto transfectado con el plásmido pGbc-hGCSF, se sometió a electroforesis en la vía TG-2. TG-2.1 siguió siendo para las progenies transgénicas de TG-2. En la vía (-) corre un producto PCR el cual usa como una plantilla el DNA genómicos de los ratones no transgénicos, es decir, ratones normales.
En referencia a la figura 14, se ha mostrado un análisis cualitativo para la expresión de hG-CSF en la leche segregada de ratones transgénicos mediante una técnica de prueba de bandas de Western. Las proteínas para esta prueba de bandas de Western se obtienen de la leche segregada por los ratones transgénicos dentro de la cual se introducen los vectores de mamíferos pGbc_S y pGbc_L, cada uno conteniendo un gen hG-CSF.
En referencia a la figura 15, se ha mostrado un análisis cuantitativo para la expresión de hG-CSF en la leche segregada de ratones transgénicos mediante ELISA. Las proteínas para ELISA se obtienen de la leche segregada del ratón transgénico en el cual están introducidos los vectores de expresión de mamíferos pGbc_S-hGCSF y pGbc_L-hGCSF.
En referencia a la figura 16, se ha mostrado un análisis cuantitativo para la expresión de hG-CSF en la leche segregada de ratones transgénicos mediante ELISA. Las proteínas para ELISA se obtienen de la leche segregada del ratón transgénico en el cual están introducidos los vectores de expresión de mamíferos pGbc_S-hGMCSF y pGbc_L-hGMCSF.
Una mejor comprensión de la presente invención se puede obtener a la luz de los siguientes ejemplos los cuales se explican para ilustrar, pero no se construyen para limitar, la presente invención.
Ejemplo I Construcción de los vectores de expresión para células HC11 que usan promotor de \beta-caseína de cabra y terminador de hormona de crecimiento bovina 1) Construcción de vector pGbc_S
Para un vector pBluescrip II SK (Stratagene) en el cual se subclonó un fragmento de DNA que incluye el sitio del promotor, intrón 1 y exón 2 de un gen de \beta-caseína de cabra, un tramo de DNA el cual cubre de 501 nucleótidos a un nucleótido en el lado 5' del codón de comienzo de la traducción para el exón 1, se obtuvo mediante una PCR que usa cebadores CAS-F1 y CAS-R1, el cual tiene una secuencia base de 5'-TGA TCG, CGA GTC CAC CAG GCT CTA CTG TC-3' y 5'-GAG AAG CTT AAT GGA TAA TGA TCT GA-3', respectivamente. El PCR comprendía 35 ciclos termales en los cuales el calentamiento se lleva a cabo del orden de 94ºC durante 3 minutos, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto durante el primer ciclo, del orden de a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto para los ciclos 2-34, y del orden de a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 5ºC para el último ciclo.
En un vector de expresión en mamíferos pRc/RSV el cual se digirió con endonucleasas Nru I y Hind III para abrirlo y eliminar su LTR, el producto PCR, después de someterse también a doble digestión con las mismas endonucleasas se insertó mediante ligazón. Como resultado, se obtuvo un plásmido novedoso pGbc_S, y se resumió en la figura 3.
2) Construcción del vector pGbc_L
El producto de PCR truncado del 1) anteriormente mencionado se trató con una enzima de restricción Dra I. El fragmento de DNA truncado Dra I/Hind III así obtenido se aisló mediante electroelución. Por separado, a partir del vector pBluescript II SK (Stratagene) en el cual se subclonó un fragmento de DNA que incluye el sitio del promotor, exón 1, intrón 1 y exón 2 de una gen de \beta-caseína de cabra, un fragmento truncado por Stu I/Dra I de DNA truncado que incluye el promotor y un exón parcial I que se extiende a un nucleótido en el lado anterior al codón de comienzo de traducción, se obtuvo mediante escisión enzimática y mediante aislamiento en gel de agarosa. Los dos fragmentos de DNA se insertaron juntos en un vector pRC/RSV el cual se abrió mediante la doble digestión con enzimas de restricción Nru I y Hind III, para fabricar un plásmido novedoso pGbc_L. Este procedimiento se resume en la figura 4.
3) Identificación de constructos pGbc_S y pGbc_L
La construcción exitosa de plásmidos pGbc_S y pGbc_L se confirmó mediante análisis de secuenciación de bases. El análisis de secuenciación de bases se llevó a cabo usando un kit Sequenasa Ver 2.0, proporcionado por Amersham, U.S.A., de acuerdo al protocolo del proveedor. Para la secuenciación, se diseñaron dos cebadores V 1 y V 2 para tener una secuencia básica de 5'-AGG CAA GCG TTG ACC GAC-3' y 5'-GGA GGG GCA AAC AAC AGA TG-3', respectivamente.
Ejemplo II Recombinación entre gen hGCSF y vector de expresión de mamíferos para células HC11
Un gen hGCSF se insertó en cada uno de los vectores pGbc_S y pGbc_L de acuerdo con la estrategia de recombinación ilustrada en figuras 5 y 7. En la recombinación, el exón 1 de la \beta-caseína de cabra se unió directamente al exón 1 del gen hG-CSF mientras el codón de comienzo de traslación para el exón 1 del gen hG-CSF se mantuvo disponible.
Con más detalle, primero, el vector pUC 19 en el cual se subclonó un gen hG-CSF, se digirió con BamH I y Xba I y se electroforetizó en el gel de agarosa para separar el uno del otro los dos fragmentos de DNA resultantes. Estos dos fragmentos de DNA, los cuales constan de fragmento I y el otro fragmento, se purificaron por separado usando un kit Geneclean II, disponible comercialmente de BIO101. Se cree que el fragmento I comprende exón 2 a una señal de poli A. El otro fragmento que comprende el vector y el exón 1 se cortó con una enzima de restricción Pst I y después, los fragmentos menores cortados se corrieron en un gel de agarosa para separarlos unos de otros. La purificación usando un kit Geneclean II, disponible comercialmente de BIO101 produjo fragmento 2 el cual comprende un nucleótido en el lado 5' del codón de traducción a través de un nucleótido en el lado 5' del exón 2. El fragmento 1 y el fragmento 2 juntos se insertaron en un plásmido pBluescrip II SK por ligazón para dar un plásmido novedoso recombinante pBluescrip II SK-hGCSF. Este plásmido se cortó doblemente con enzimas de restricción Hind III y Xba I para obtener un fragmento de gen hG-CSF modificado el cual fue, después, insertado en un vector pGbc_S el cual se abrió previamente mediante digestión con Hind III y Xba I. Como resultado, se obtuvo un plásmido recombinante novedoso pGbc_S-hGCSF.
Por separado, se abrió un vector pGbc_L mediante digestión enzimática con Hind III y Xba I. Después de tratarse con una fosfatasa alcalina y someterse a electroforesis en un gen de agarosa, el vector abierto pGbc_L se purificó usando un kit Geneclean II. Un fragmento de DNA obtenido por la digestión con endonucleasa de un promotor de \beta-caseína de cabra y un fragmento de gen hGCSF modificado obtenido mediante doble digestión del pBluescrip II SK-hGCSF con Hind III y Xba I están conjuntamente ligados al vector abierto para dar un nuevo plásmido recombinante pGbc_L-hGCSF.
La construcción exitosa de los plásmidos recombinantes novedosos pGbc_S-hGCSF y pGbc_L-hGCSF se confirmó mediante análisis de secuencia de base. El análisis de secuencia de base se llevó a cabo usando un kit Sequenasa Ver 2.0, proporcionado por Amersham, U.S.A., de acuerdo al protocolo del proveedor. Para la secuenciación, se diseñaron tres cebadores V1, V2 y P1 para tener una secuencia básica de 5'-AGG CAA GGC TTG ACC GAC-3', 5'-GGA GGG GCA AAC AGA TG-3', y 5'-CAC TAT TGG TTT TAT TTC-3', respectivamente.
Ejemplo III Recombinación entre gen hGMCSF y vectores de expresión de mamíferos pGbc_S y pGbc_L para células HC11
La recombinación se llevó a cabo siguiendo la estrategia ilustrada en las figuras 6 y 8.
Primero, el gen hGMCSF el cual se subclonó en un vector pUC19, se extrajo mediante digestión con enzimas de restricción BamH I y EcoR I y mediante purificación con un kit Geneclean II (BIO101) a partir de un gel de agarosa en el cual los fragmentos de DNA digerido se sometieron a electroforesis. Después el gen hGMCSF se insertó mediante ligazón a un vector pBluescript II SK (Stratagene) el cual se digirió con las mismas endonucleasas y después, con una fosfatasa alcalina bovina, para proporcionar un plásmido recombinante pBluescript II SK-hGMCSF. Un gen modificado se recuperó de este plásmido recombinante mediante digestión con Hind III y Xba I. electroforesis en un gel de agarosa y purificación con un kit Geneclean II (BIO101) y después, ligado a un vector pGbc_S el cual se ha tratado previamente con la misma endonucleasa y después con una fosfatasa alcalina bovina, para construir un plásmido novedoso pGbc_S-hGMCSF.
De forma similar, un plásmido novedoso pGbc_L-hGMCSF se construyó ligando un fragmento de DNA obtenido mediante la digestión con endonucleasa de un promotor de \beta-caseína de cabra y un fragmento de gen hGMCSF modificado obtenido mediante la doble digestión del pBluescript II SK-hGMCSF con Hind III y Xba I a un vector abierto pGbc_L el cual se obtuvo mediante el tratamiento con enzimas de restricción Hind III y Xba I y después con una fosfatasa alcalina bovina y mediante la purificación a partir de un gel de agarosa en el cual se hace la electroforesis.
La construcción exitosa de los vectores de expresión se confirma a través de análisis de secuenciación de base que usa los cebadores V1, V2 y P1.
Ejemplo IV Construcción del vector para transfección
Los vectores de expresión de mamíferos para transfección con la misma estructura del gen que en la figura 1, se construyen de acuerdo a la estrategia de recombinación de la figura 9. Se pudieron preparar insertando un sitio promotor de \beta-caseína de cabra, un gen de sustancia activadora fisiológica y una terminador de hormona del crecimiento bovina en un vector pBluescrip II SK (Stratagene).
En más detalle, de un gen de \beta-caseína de cabra o su fragmento, se obtuvo un fragmento de DNA incluyendo el sitio promotor y un exón parcial que se extiende a un nucleótido en el lado anterior del codón de iniciación de la transcripción, se obtuvo cortando con Sac I y Hind III. Después un procedimiento de purificación comprende las etapas de extraer con una disolución de fenol:cloroformo 1:1, precipitar con etanol al 95%, y disolver con agua destilada, el fragmento de DNA se cortó adicionalmente con una enzima de restricción Dra I. La electroforesis en un gen de agarosa y purificación mediante el uso de un kit Geneclean II ( BIO101) proporcionó fragmento 1, el cual comprende el exón parcial 1.
Por separado, un tramo de DNA el cual abarcó de 501 nucleótidos a 1 nucleótido en el lado 5' del codón de iniciación de la transcripción para el exón 1 del gen de la \beta-caseína, se obtuvo mediante una PCR usando los cebadores CAS-F1 y CAS-R1 y, después, escindido por la Dra I y Hind III. El fragmento 2, el cual comprende el exón 1, se obtuvo por electroelución.
Los fragmentos 1 y 2 se insertaron mediante ligazón en un vector pBluescrip II SK (Stratagene) el cual se ha tratado enzimáticamente con Sac I y Hind III y después, con una fosfatasa alcalina bovina. El plásmido recombinante así obtenido se abrió mediante doble digestión con Hind III y EcoR 1. En este sitio de clonación abierta se insertó un fragmento de DNA en el cual se ligó un gen de sustancia activadora fisiológica a un terminador de hormona del crecimiento bovina.
El éxito del procedimiento de la recombinación anterior se confirmó a través de un análisis de secuenciación de bases usando el cebador P1.
Ejemplo V Expresión de hGMCSF en células HC11 derivadas de glándula mamaria de ratón
Los plásmidos pGbc_S-hGMCSF y pGbc_L-hGMCSF los cuales resultan de la recombinación entre el plásmido pGbc_S y el gen hGMCSF y entre el plásmido pGbc_L y el gen hGMCSF, respectivamente, en el ejemplo III, se purificaron usando QIAGEN-tip 100 (Qiagen) antes de introducirse en células HC11.
Después de transformarse con cada uno de los plásmidos, las células de E. coli se inocularon en 150 ml de medio LB que contiene ampicilina a una concentración de 100 \mug/ml y se incubó a 37ºC durante 10 horas con agitación. Las células se recogieron mediante centrifugación, y los plásmidos se purificaron a partir de las células que usan el protocolo recomendado por Qiagen.
La transfección de los plásmidos purificados en células HC11 se acomplejó usando un electroporador, disponible comercialmente de Invitrogen. Las células HC11 se cultivaron densamente en matraces T75 para el cultivo de tejido en un incubador con atmósfera de CO_{2} al 5%, a 37ºC hasta que cubrieron el 80% del área del fondo del matraz. Por lo tanto, se hicieron flotar con una disolución de tripsina (Gibco BRL) y se suspendieron con un tampón PBS. Esta suspensión de células se centrífugo a 1.500 rpm para recoger las células las cuales, después, se lavaron con un tampón PBS helado. Se tomó un pequeño volumen de la disolución de las células para contar el número de células y el volumen restante se precipitó mediante centrifugación a 1.500 rpm. La masa precipitada de las células se diluyó con un tampón PBS para dar una suspensión de células que tienen 3 x 10^{6} - 1 x 10^{7} células/500 \mul.
Se añadieron 20 \mug del plásmido purificado y 500 \mul de la suspensión de células en una cubeta 0,4 cm la cual, después, se puso en hielo durante 10 minutos. Después de graduarlo a una cualquiera de 71, 250, 500 y 1000 \muF, se controla el electroporador en voltaje y resistencias. El electroporador se cargó durante tres minutos con el fin de aplicar pulsos a la cubeta la cual se trajo dentro de la cámara de electroporador. Después, la cubeta se puso en hielo durante 10 minutos, después de lo cual se añadió la suspensión celular en la cubeta con 1 ml de un medio de crecimiento y se vertió en 4 ml de un medio de crecimiento en una matraz T25. Después de cultivar durante 24-48 horas en un incubador con una atmósfera de CO_{2} al 5%, a 37ºC, se proporcionó a las células un medio RPMI 1640 (Gibco BRL) fresco, suplementado con suero fetal bovino a una concentración final del 10%, factor de crecimiento epidérmico a 10 ng/ml, insulina a 5 \mug/ml y antibióticos gentamicina a 50 \mug/ml y geneticina (Sigma) a 200 \mug/ml, para seleccionar las células transfectadas. El medio selectivo se refrescó cada segundo del tercer día. A 7 días después del cultivo en el medio selectivo, sólo sobreviven las células en las cuales se introducen los plásmidos. Estas células transfectadas continúan creciendo densamente.
Después de la selección, el medio selectivo se cambió con un medio de inducción que comprende medios RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con insulina a una concentración final de 5 \mug/ml, geneticina (Sigma) a 200 \mug/ml, gentamicina 50 \mug/ml, prolactina de cabra a 5 \mug/ml y dexametasona a 1 \muM. Las células se cultivaron en un incubador con una atmósfera de CO_{2} al 5%, a 37ºC, durante 4 días sin refrescar el medio.
El hGMCSF producido como resultado de la inducción de expresión del gen, se segregó en el medio. Una técnica de prueba de bandas de Western se usó para el análisis cualitativo del producto segregado mientras un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) se usó para un análisis cuantitativo. Como un anticuerpo primario para la prueba de manchas de Western, se usó una Ig G anti-GM-CSF humano de ratón para el análisis de la expresión de factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos de humano. Una Ig G antirratón conjugada con peroxidasa de rábano picante se usó como un anticuerpo secundario para la prueba de bandas de Western. Para ELISA, los anticuerpos policlonales Ig G de cabra anti-GM-CSF humano se anclaron primero en placas de 96 pocillos las cuales, después, se trataron con el producto expresado como un antígeno correspondiente o con un factor comercialmente disponible usado como un estándar. A estos se unieron los anticuerpos monoclonales anti-GM-CSF humano los cuales eran los mismos que se usaron en la prueba de bandas de Western. Los complejos de aminoácidos resultantes se trataron con anticuerpo monoclonal Ig G antirratón conjugado con fosfatasa alcalina con el propósito de inducir una reacción colorante (Ed Harlow y Davis Lane (1989) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Sprinng Harbor Laboratory Press, Nueva York).
Los datos obtenidos del análisis de bandas de Western y ELISA se dan en figuras 10 y 11 y muestran que los vectores recombinantes pGbc_S y pGbc_L inducen ambos a la proteína a expresarse a un nivel de 40 ng/ml.
Ejemplo VI Expresión de hGCSF en células HC11
Los plásmidos pGbc_S-hGCSF y pGbc_L-hGCSF los cuales resultan de la combinación entre el plásmido pGBc_S y el gen hGCSF y entre el plásmido pGbc_L y el gen hGCSF, respectivamente, se purificaron usando QIAGEN-tip 100 (Qiagen) de la misma manera que aquella del ejemplo V antes de introducirse en células HC11. La introducción se logró mediante un procedimiento de coprecipitación de fosfato de calcio o un procedimiento de electroporación. Después de la transfección, el cultivo en un medio selectivo que comprende la misma composición que aquella del ejemplo V deja sólo las colonias resistentes a geneticina. Estas colonias rastreadas se transfirieron en matraces T75 y se cultivaron densamente en ellos. Se proporcionó a las células un medio de inducción fresco que contiene hormonas de producción de leche, prolactina y dexametasona, y se cultivaron durante 4 días, después de los cuales el medio y las células se separaron mediante centrifugación. Se utilizó el sobrenadante para análisis de bandas de Western y ELISA. Los datos obtenidos se dan en figura 12, mostrando que los vectores recombinantes novedosos pGbc_S y pGbc_L inducen ambos a la proteína a expresarse a un nivel de 40 ng/ml.
Ejemplo VII Expresión de hGMCSF en ratones transgénicos
El vector recombinante novedoso pGbc-hGCSF el cual resulta de la recombinación entre el vector pGbc y el gen hGMCSF, se purificó con la ayuda de QIAGEN tip 100 y se digirió con enzimas de restricción BssH I y Kpn I, seguida por la extracción con un kit de Geneclean II (BIO101) de un gel de agarosa. Para usar en microinyección, los vectores extraídos se purificaron adicionalmente siguiendo el protocolo recomendado por Schleicher & Schuell y después, someter a diálisis en una disolución que comprende 10 mM de Tris-HCl (pH 7,2) y 10 mM de EDTA, para dar una disolución de DNA a una concentración de 40 ng/ml.
Dentro del sitio pronuclear masculino de un zigoto de ratón de línea CBA, se introdujo el vector de expresión finalmente purificado mediante microinyección. Este zigoto se implantó en el útero de una madre sustituta, el DNA genómico se aisló a partir de los rabos de las progenies de la madre sustituta. Los ratones que son transgénicos se identificaron mediante PCR, como se ve en la figura 13, y se confirmaron con un análisis de bandas de Southern.
Los ratones progenie los cuales se confirmó que tienen el gen introducido dentro de sus DNA genómicos se dejaron copular con ratones normales no transgénicos para producir progenies de la siguiente generación. 10 días después del nacimiento, las ratonas parturientas se separaron de su prole durante 3 horas. Después de la inyección intraperitoneal de oxitocina junto con un anestésico, se extrajo leche de las ratonas parturientas.
El nivel de expresión de los genes se ensayó en la misma manera que en el nivel celular, usando la prueba de bandas de Western y ELISA para los análisis cualitativos y cuantitativos, respectivamente. Los anticuerpos usados en estos análisis fueron los mismos que aquellos que se sugieren en el ejemplo V. Los resultados se dan en las figuras 14 y 15. A partir de la prueba de bandas de Western, es patente que una proteína del ratón transgénico es la misma que un hGCSF comercialmente disponible (Gibco BRL) y se expresa a través del tejido de la glándula mamaria del ratón transgénico, como se muestra en la figura 14. Los datos del ELISA muestran que el hGCSF se expresa a un nivel de 150 ng/\mul, como se muestra en la figura 15.
Ejemplo VIII Expresión de hGMCSF en ratones transgénicos
El vector recombinante novedoso pGbc-hGMCSF el cual resulta de la recombinación entre el vector pGbc y el gen hGMCSF, se purificó con la ayuda de QIAGEN tip 100 y se digirió con enzimas de restricción BssH I y Kpn I, seguido por extracción con un kit Geneclean II (BIO101) a partir de un gel de agarosa. Para usar en microinyección, los vectores extraídos se purificaron adicionalmente siguiendo el protocolo recomendado por Schleicher & Schuell y después, someter a diálisis en una disolución que comprende 10 mM de Tris-HCl (pH 7,2) y 10 mM de EDTA, para dar una disolución de DNA a una concentración de 40 ng/ml.
Dentro del sitio pronuclear masculino de un zigoto de ratón de línea CBA, se introdujo el vector de expresión finalmente purificado mediante microinyección. Este zigoto se implantó en el útero de una madre sustituta, el DNA genómico se aisló a partir de los rabos de las progenies de la madre sustituta. Los ratones que son transgénicos se identificaron mediante PCR, seguida por confirmación con un análisis mediante prueba de bandas de Southern.
La leche se tomó de los ratones transgénicos y se sometió a prueba de bandas de Western y ELISA. Los datos del análisis mediante prueba de bandas de Western en el cual se usó como control positivo un hGMCSF (BIO101), muestran que una proteína del ratón transgénico es hGCSF y se expresa a través del tejido de glándula mamaria. A partir de ELISA, se reveló que el hGCSH de los ratones transgénicos se expresaba a un nivel de 130 ng/\mul, como se muestra en la figura 16.
Aplicabilidad industrial
Como se describe anteriormente en el presente documento, los sistemas específicos de tejido de glándula mamaria que usan el sitio promotor de la \beta-caseína de cabras nativas coreanas, de acuerdo con la presente invención, permite que se produzcan in vivo sustancias activadoras fisiológicas, es decir, en células derivadas del tejido de glándula mamaria igual que en animales transgénicos. Por lo tanto, las proteínas obtenidas son aquellas que experimentan la modificación postraduccional y así pueden mantener su actividad normal en el cuerpo humano. Además,, los sistemas de expresión de acuerdo con la presente invención hacen posible producir fácilmente las proteínas en una gran cantidad. Donde las proteínas se producen en un nivel celular, se usa una hormona de producción de leche como un potente inductor de expresión. En el caso de los animales transgénicos, las proteínas se pueden obtener fácilmente a través de la leche segregada por ellos. Así, se puede lograr el aumento de la producción de las proteínas a un nivel de industrialización. Adicionalmente, los sistemas de expresión específicos de tejido de glándula mamaria de acuerdo con la presente invención son muy ventajosos para aislar y purificar la proteína deseada con facilidad y seguridad.
Las siguientes son grandes ventajas industriales las cuales producirá el sistema de expresión específico de tejido de glándula mamaria de la presente invención.
Primero, debido a que las proteínas diana que se producen en los sistemas de expresión específicos de tejido de la glándula mamaria los cuales emplean el sitio del promotor de la \beta-caseína de las cabras nativas coreanas, experimentan la misma modificación postraduccional como la que experimentan las proteínas correspondientes que se dan en la naturaleza, las proteínas diana que mantienen su actividad en el cuerpo humano. Superando la limitación que tienen los sistemas de expresión convencionales que usan E. coli, los sistemas de expresión de la presente invención se pueden aplicar igualmente a todas las clases de las sustancias activadoras fisiológicas.
Segundo, el promotor de \beta-caseína de cabra usado en la presente invención permite al gen estructural acompañado expresarse induciblemente en una gran cantidad, conduciendo a un gran decrecimiento en el coste de producción de las proteínas correspondientes. Es bien conocido que la expresión del gen de la \beta-caseína de cabra se puede inducir en un nivel alto por las hormonas del tejido de la glándula mamaria, es decir, las hormonas de producción de leche. Las células derivadas del tejido de la glándula mamaria transfectadas con los sistemas de expresión que emplean el promotor de la \beta-caseína de cabra pueden producir las proteínas deseadas en una cantidad de 40 ng/ml por el tratamiento con una cantidad traza de un inductor, una hormona de producción de leche, mientras los animales transgénicos con los sistemas de expresión pueden producir las proteínas deseadas en una cantidad de 130-150 ng/\mul por las propias hormonas de los animales. Para nuestro conocimiento, es posible obtener cantidades más grandes de estos productos modificando la longitud del sitio promotor de la \beta-caseína de cabra y las condiciones de expresión. Por lo tanto, la presente invención sugiere un procedimiento de producción en masa novedoso para proteínas.
Tercero, el aumento de la producción masiva de las proteínas diana se puede lograr fácilmente a través de los sistemas de expresión específicos de tejido de glándula mamaria de la presente invención sin requerir un coste significativo. Debido a las proteínas diana segregadas en la leche, el aumento se puede lograr simplemente incrementando el número de los animales transgénicos. Esto puede ahorrar el coste requerido anteriormente para aumentar la producción de proteínas desde un nivel de laboratorio hasta un nivel industrial. Es decir, el coste de producción de las sustancias activadoras fisiológicas se puede reducir significativamente mediante el uso de los sistemas de expresión específicos de tejido de la glándula mamaria de la presente invención.
Cuarto, la presente invención se basa en la simplicidad e inofensividad de las proteínas segregadas de la glándula mamaria. Hay una pocas clases de proteínas las cuales se expresan en los tejidos de glándula mamaria, de forma que cada una de las proteínas se puede aislar mediante técnicas ordinarias. Adicionalmente, no se han detectado proteínas dañinas de la leche.
La presente invención se ha descrito en una manera ilustrativa, y se entiende que la terminología usada se desea para estar en la naturaleza de la descripción más que en la de la limitación. Son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas mencionadas anteriormente en este documento. Por ejemplo, otras sustancias activadoras fisiológicas diversas se pueden expresar a través de los sistemas de expresión de la invención con una pequeña ayuda de técnicas de recombinación de DNA bien conocidas. Por lo tanto, la presente invención no debería restringirse a sólo a la expresión de hG-CSF o hGM-CSF, el cual se ilustra a través de la especificación. También se entenderá que en el alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención se puede practicar de otro modo que como se describe específicamente.

Claims (7)

1. Un vector recombinante pGbc (KCTC 0515BP), que usa un sitio promotor de \beta-caseína de cabras nativas coreanas.
2. Un vector recombinante pGbc_L (KCTC 0514BP), que usa un sitio promotor de \beta-caseína de cabras nativas coreanas.
3. Un vector recombinante pGbc_S (KCTC 0513BP), que usa un sitio promotor de \beta-caseína de cabras nativas coreanas.
4. Un procedimiento para producir proteínas deseadas, en el cual las proteínas deseadas se expresan en células derivadas de tejido de las glándulas mamarias las cuales se transfectan con el vector pGbc_L o el vector pGbc_S.
5. Un procedimiento para producir proteínas deseadas, en el cual las proteínas deseadas se expresan en células de la glándula mamaria de animales no humanos transgénicos con el vector pGbc.
6. Un procedimiento como se expone en la reivindicación 4, en el que dichas células derivadas de tejido de las glándulas mamarias son de la línea HC11.
7. Un procedimiento como se expone en la reivindicación 6, en el que las células HC11 se transfectan con un vector pGbc_L o vector pGbc_S portador de gen mediante coprecipitación con fosfato de calcio o electroporación.
ES98944319T 1998-09-11 1998-09-11 Sistema de expresion especifico de tejido de glandula mamaria que usa el sitio promotor de la beta-caseina de cabra coreana. Expired - Lifetime ES2237849T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR1998/000277 WO2000015808A1 (en) 1998-09-11 1998-09-11 MAMMARY GLAND TISSUE-SPECIFIC EXPRESSION SYSTEM USING $G(b)-CASEIN PROMOTER SITE OF KOREAN NATIVE GOAT

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2237849T3 true ES2237849T3 (es) 2005-08-01

Family

ID=19531117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98944319T Expired - Lifetime ES2237849T3 (es) 1998-09-11 1998-09-11 Sistema de expresion especifico de tejido de glandula mamaria que usa el sitio promotor de la beta-caseina de cabra coreana.

Country Status (10)

Country Link
US (2) US6635474B1 (es)
EP (1) EP1034281B1 (es)
AT (1) ATE289352T1 (es)
AU (1) AU729668B2 (es)
DE (1) DE69829069T2 (es)
ES (1) ES2237849T3 (es)
HU (1) HUP0102530A3 (es)
NZ (1) NZ505218A (es)
RU (1) RU2191826C2 (es)
WO (1) WO2000015808A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100408429B1 (ko) * 2000-01-24 2003-12-06 한미약품 주식회사 유즙 중에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 생산하는형질전환 흑염소
KR100790514B1 (ko) * 2005-08-26 2008-01-02 (주)엠젠 Ｃｓｆ를 유선에서 발현하는 형질전환 복제 돼지 및 그의제조 방법
KR100912038B1 (ko) 2007-12-31 2009-08-12 전남대학교산학협력단 돼지 β-카제인 게놈 ＤＮＡ, 및 이를 포함하는 재조합벡터 및 형질전환체
RU2525712C2 (ru) * 2012-07-10 2014-08-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук Способ создания трансгенных животных со стабильным и высоким уровнем экспрессии целевого белка в молоке

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2137275A1 (en) * 1992-06-03 1993-12-09 Richard L. Eckert Bandage for continuous application of biologicals
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU6111396A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Utah State University Dna cassettes for expression of lytic peptides in mammalian cells and transgenic organisms containing same
JPH0937786A (ja) * 1995-07-31 1997-02-10 Terumo Corp プロモーター及びそれを含むベクター

Also Published As

Publication number Publication date
US20030145342A1 (en) 2003-07-31
WO2000015808A1 (en) 2000-03-23
US6635474B1 (en) 2003-10-21
AU729668B2 (en) 2001-02-08
AU9188798A (en) 2000-04-03
EP1034281A1 (en) 2000-09-13
NZ505218A (en) 2002-04-26
ATE289352T1 (de) 2005-03-15
EP1034281B1 (en) 2005-02-16
DE69829069D1 (de) 2005-03-24
US7053262B2 (en) 2006-05-30
RU2191826C2 (ru) 2002-10-27
HUP0102530A3 (en) 2006-02-28
DE69829069T2 (de) 2005-12-29
HUP0102530A2 (hu) 2001-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2206444T3 (es) Produccion de una proteina de interes en la leche de un mamifero transgenico.
CN104561095A (zh) 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法
AU652355B2 (en) Improved expression of polypeptides
US20130131317A1 (en) Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals
US6210736B1 (en) Transgenically produced prolactin
ES2237849T3 (es) Sistema de expresion especifico de tejido de glandula mamaria que usa el sitio promotor de la beta-caseina de cabra coreana.
KR20030060772A (ko) 형질전환법으로 생성된 데코린
CN106978416B (zh) 一种基因定位整合表达系统及其应用
EP0771874B1 (en) Transgenic protein production
US6268545B1 (en) Transgenic non-human mammal comprising a rabbit WAP promoter, uses thereof, and a DNA construct comprising the rabbit WAP promoter
US20030051257A1 (en) Transgenic goat producing milk containing human granulocyte-colony stimulating factor
KR100222916B1 (ko) 한국산 재래종 산양의 베타카제인 프로모터를 이용한 유선조직 특이적 발현시스템
KR100336965B1 (ko) 인체 성장 호르몬 생산을 위한 형질 전환용 플라스미드ｐＧｂｃ5.5ｈＧＨ(ＫＣＴＣ 8949Ｐ)
EP1135518A1 (en) Transgenic animals as urinary bioreactors for the production of protein in the urine, recombinant dna construct for kidney-specific expression, and method of using same
US20050043530A1 (en) Seminal vesicle tissue-specific promoters and uses thereof
KR100458792B1 (ko) 탬-홀스팔 유로모둘린 단백질의 프로모터를 이용한 인간 이외의 형질전환 포유동물의 신장조직에서의 비상동 폴리펩타이드의 발현
WO2015042895A1 (zh) 一种转基因定位整合的方法及其应用