JP3801196B2 - 乳からの対象化合物の単離 - Google Patents

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Description

発明の背景
天然の乳成分は、ヒトの食事に取り入れられてから長い歴史があり、比較的単離し易いため、長い間研究対象となってきた(スウェイスグッド,エイチ・イー(Swaisgood,H.E.),ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−I:ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン(Developments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein),(ニューヨークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ(Applied Science Publishers),1982年)。最近になって、研究者らは、対象とする特定の蛋白をトランスジェニック動物の乳腺組織に合成させることにより、乳中に通常は産生されない蛋白の便利な源として乳を利用している。例えば、研究者らは、β−ラクトグロブリン遺伝子およびヒト・抗血友病因子IX遺伝子の暗号配列からなる融合遺伝子をヒツジ・生殖細胞系に導入した(クラーク,エイ・ジェイ(Clark,A.J.)ら,(1989年5月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第7巻:487〜492頁)。結果的に、乳を分泌するトランスジェニックヒツジはその乳中に因子IXを分泌した。同様に、ヤギ・生殖細胞系を操作して、ヒト・長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター(longer-acting tissue-type plasminogen actinator)の暗号配列に結合したネズミ・乳清酸性蛋白の遺伝子由来の調節配列を含む融合遺伝子を取り込ませた(エバート,ケイ・エム(Ebert,K.M.)ら,(1991年9月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第2巻:835〜838頁)。トランスジェニック乳ヤギ由来の乳は、修飾された組織プラスミノゲンアクチベーターを含有していた。
トランスジェニック家畜の乳中の治療薬のごとき対象蛋白の生産は、哺乳動物細胞培養系における複雑な組み換え蛋白の慣用的な生産に典型的に付随する経費が軽減された、かかる蛋白の大規模生産を提供する。乳中における蛋白のトランスジェニック発現は、組み換え蛋白発現という伝統的な方法に優る利点を提供するが、いくつかの問題もある。これらの問題は、乳中における組み換え蛋白の活性の保持および実行可能な商業的生産のための精製度にまで蛋白を精製することを包含する。
乳からの対象蛋白の伝統的単離方法は、しばしば、沈降(スウェイスグッド,エイチ・イー(Swaisgood,H.E.),ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−I:ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン(Developments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein),(ニューヨークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ(Applied Science Publishers),1982年)、沈殿(コーセ(Kothe)ら,米国特許第4644056号;グローブス,エム・エル(Groves,M.L.)ら,(1985年)バイオケミ・エト・バイオフィジ・アクタ(Biochem.et.Biophys.Acta)第844巻:105〜112頁;マッケンジー,エイチ・エイ(McKenzie,H.A.),ミルク・プロテインズ:ケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Milk Proteins:Chemistry and Molecular Biology),ニューヨークのアカデミック・プレス(Academic Press),1971年,88頁)またはレニンもしくはキモトリプシンを用いる酵素的凝固(スウェイスグッド,エイチ・イー(Swaisgood,H.E.),ディベロップメンツ・イン・デイリー・ケミストリー−I:ケミストリー・オブ・ミルク・プロテイン(Developments in Dairy Chemistry-I:Chemistry of Milk Protein),(ニューヨークのアプライド・サイエンス・パブリッシャーズ(Applied Science Publishers),1982年)のいずれかによる主要乳成分の分画を、その最初の段階として必要としていた。これらの方法に伴う問題は、除去されるべき乳成分の沈殿中への捕捉による対象蛋白の損失が原因である低収率、および酸沈殿にしばしば必要とされる低pHによる対象蛋白の生物学的活性の損失を包含する。デンマン,ジェイ(Denmen,J.)ら,(1991年9月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第9巻:839〜843頁参照。そのうえ、乳からの対象蛋白の伝統的単離方法は、主要乳成分の沈降、沈殿または凝固を必要とするため、乳試料は、容易に濾過により処理できない。
発明の概要
本発明は、乳からの蛋白のごとき対象成分の単離方法に関する。本発明は、少なくとも部分的には、伝統的方法を用いて乳試料から得られた対象とする生物学的に活性な成分の低収率は、本質的には、最初の分画段階の沈殿に対象成分が捕捉されるためであるという認識に基づく。本発明方法は、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する安定化剤を提供することにより、対象成分の不活性化および捕捉を回避するものである。安定化した乳試料から沈降または沈殿するというよりはむしろ、そして対象成分と結合するというよりはむしろ、全乳蛋白の少なくとも一部は可溶性のままであり、その結果、対象成分の精製の間に除去される。さらに、本発明方法は、先行方法のような低pHを必要としないため、pH感受性対象成分の不活性化が回避される。
本発明は、対象成分を含有する乳試料から対象成分をその生物学的活性形態で単離する方法に関する。より詳細には、本発明は、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させることによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。安定化後、有意な損失を伴わずに、対象成分をを単離することができ、安定化した乳試料から対象成分をその生物学的に活性な形態で単離することができる。
さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料を、乳試料を濾過により処理可能な形態にする安定化剤と接触させることによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。次いで、対象成分は、濾過により処理可能な乳試料から単離される。
さらに本発明は、上記方法および対象成分を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する方法を用いて単離された対象成分に関する。単離された対象蛋白を、細胞培養用培地への添加物、食料品、医薬組成物として使用することができる。さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料の全蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させるキットを使用するための説明書を伴った上記方法に使用される試薬を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
図1は、12種の異なる濃度のアルギニンに関し、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。
図2は、12種の濃度のアルギニンに関し、図1で示したアルギニン可溶化段階から得られた上清の長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター(LA−tPA)に対する相対蛋白濃度を示す。
図3は、12種の異なるイミダゾール濃度に関し、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。
図4は、12種の異なるイミダゾール濃度に関し、図3で示したイミダゾール可溶化段階からの上清のLA−tPA活性に対する相対蛋白濃度を示す。
図5は、10種の異なる濃度のビス−トリス(Bis−Tris)に関し、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す写真である。
図6は、10種の異なるBis−Tris濃度に関し、図5で示したBis−Tris可溶化段階からの上清のLA−tPA活性に対する相対蛋白濃度を示す。
図7A〜7Eは、pHを変化させた場合の種々の濃度のアルギニンに関する、乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す5枚の写真である。
図8は、乳試料のpHの調節前にアルギニンを乳試料に添加した場合に、アルギニンにより媒介される全乳蛋白の一部の可溶化の際得られた上清のLA−tPA活性に対する相対蛋白濃度を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、対象成分の有意な損失を伴わずに、対象成分を含有する乳試料から対象成分を単離する方法に関する。該方法は、全乳蛋白のうち少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させて対象成分が安定化された乳試料から単離されうるようにすることを包含する。次いで、対象成分は生物学的に活性な形態で、安定化された乳試料から単離される。
「対象成分」なる語は、該対象成分に有意な悪影響を伴わずに、上記方法を用いて乳から単離されうる、乳試料中に存在する物質を包含する。対象成分は、乳試料中の天然物質であってもよく、あるいは乳試料中に通常は存在しない物質であってもよいが、トランスジェニック動物の乳腺組織において、最終的にはかかる動物の乳中に誘導される物質を目的とする。対象成分は遊離形態であってもよく、あるいは乳中に存在する他の物質中、例えば、乳脂肪球および/または乳脂肪球を含んでいる膜の中に捕捉または封入されていてもよい。(例えば、ディトリオ(DiTollio)ら,(1992年)バイオテクノロジー(Biotechnology)第10巻:74〜77頁参照)。対象成分の例は、カゼイン、ラクトフェリン、β−ラクトグロブイン、免疫グロブリンのごとき蛋白、オレイン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸のグリセリドのごとき脂質、ラクトースおよびより複雑なオリゴ糖のごとき多糖、またはビタミンAおよびビタミンB複合体のごときビタミン、リン、カリウム、鉄、マグネシウム、銅ならびにカルシウムのごときミネラルと一緒になった上記成分のいずれかを包含する。例えば、対象成分を、正常な分泌経路を通して乳中に産生させることができる。蛋白の正常な分泌経路は、粗面小胞体での蛋白の合成、小胞体内腔中の蛋白の通過、次いで、ゴルジ体への輸送を包含しうる。最終的には、蛋白(または糖鎖付加蛋白)は、細胞質中につまみ出され、その結果、細胞質膜に融合する小胞中に詰められる。別の分泌経路は、嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)の場合のように、膜から対象成分を含有する乳脂肪球を泡のように放出することを包含する。
天然乳成分は、培養において、ある種の細胞の無血清下での増殖時に添加するのに有用であることがわかっている。ステイマー,ケイ・エス(Steimer,K.S.)ら,(1981年11月)ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー(J.Cell Physiol.)第109巻(2):223〜234頁(上皮細胞および線維芽細胞);ステイマー,ケイ・エス(Steimer,K.S.)およびクラグスブルン,エム(Klagsbrun,M.)(1981年2月)ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell.Biol.)第88巻(2):294〜300頁(正常および形質転換線維芽細胞)参照。乳成分は食品にも使用されうる。例えば、乳成分の餌への混合は、最終産物の栄養価を増大させる。例えば、ルデル,エイチ・ダブリュウ(Rudel,H.W.)ら,米国特許第5178894号参照。別法として、乳成分を、冷凍乳製品デザート類のごとき乳製品に添加してボディーやテクスチャーを成分に付加し、温度不安定性を減少させることもできる(ファング,ブイ・ティー(Huang,V.T.)ら,米国特許第5175013号)。乳成分をチーズ製造に使用することもできる(イー,ジェン−ジュング(Yee,Jen-Jung)ら,米国特許第5165945号)。
さらに、「対象成分」なる語は、非トランスジェニック哺乳動物から得られる乳試料中に通常は存在しないがトランスジェニック哺乳動物から得られる乳試料中に分泌される化合物をも包含する。かかる対象成分の例は治療薬を包含する。治療薬は、適当な条件下で適量投与した場合、哺乳動物に治療効果をもたらす薬剤である。望ましい治療効果は、治療すべき疾病または症状による。上記適量または症状は、個体により決定され、治療すべき個体の大きさ、治療すべき徴候の重大さ、および選択された治療薬の投与経路によるであろう。治療薬の例は、インシュリン、長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター(LA−tPA)、アンチトロンビンIII、a−1−抗−トリプシン、可溶性CD4、インターロイキン−2、免疫グロブリン、嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター、および凝固因子VIIIならびにIXを包含する。
「トランスジェニック哺乳動物」なる語は、例えば、その生殖細胞または体細胞のごとき細胞が、遺伝的に、外来DNAセグメントが導入されるように操作されている哺乳動物をいう。トランスジェニック哺乳動物の例は、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、およびマウスを包含する。典型的には、低費用で対象成分の大規模生産を行うためには、産生する乳量に応じて哺乳動物を選択すべきである。好ましくは、大量の乳を産生できるという理由で、ウシ、ヒツジおよびヤギのごとき大型のトランスジェニック家畜が選択される。
「生物学的に活性のある」なる語は、その意図された機能を発揮することを可能にする対象成分に関する活性を包含する。該対象成分は、天然に存在するものと同等の活性を有することはないが、それに非常に近い活性を有する。
「乳試料」なる語は、対象成分を含有する哺乳動物由来の乳を含んでいる試料を包含する。乳試料は、哺乳動物から直接得られる試料であってもよく、あるいは、意図された機能を発揮するために、対象成分または安定化剤の能力に悪影響を及ぼさないやり方で処理された試料であってもよい。さらに、意図された機能を発揮させるために、対象成分または安定化剤の能力に悪影響を及ぼさない薬剤を用いて乳試料を濃縮または希釈してもよい。乳試料中の乳量は、対象成分の存在を確認するに十分な量である。
「安定化剤」なる語は、全乳蛋白および/または対象成分の少なくとも一部を可溶化および/またはその溶解性を維持させる化合物を包含する。「〜の溶解性を維持」なる語は、後の処理段階、例えば、pH調節の間において、全乳蛋白の一部を乳試料から沈殿させないでおき、乳試料のさらなる処理または対象成分の単離を妨害させないでおく程度の溶解性の維持を包含する。この溶解性の維持は、一定値の溶解性の維持である必要はないが、適当な範囲での溶解性の維持であってよい。かかる薬剤の例は、アミノ酸および正に荷電したバッファーのごとき1価および多価カチオン性薬剤である。正に荷電した有用なバッファーは、アルギニン、イミダゾールおよびBis−Trisを包含する。安定化剤のpHは、典型的には、該薬剤が正に荷電するように選択される。
「溶解性を安定化」なる語は、全乳蛋白の少なくとも一部を可溶化および/またはその可溶化の維持を包含する。カゼインのごときある種の主要乳蛋白は、本質的には乳中において部分的に不溶性または不溶性形態である。乳のpHの低下は、これらの乳蛋白の少なくとも一部の沈殿を生じさせうる。しかしながら、対象成分の単離には、対象成分が可溶性のままであるように乳試料のpHを調節することが必要となりうる。さらに、乳試料のpHの調節は、全乳蛋白の少なくとも一部の沈殿を促進する傾向がある。pH調節の前、調節中、後において、可溶化剤は、これらの蛋白を可溶化そして/またはそれらの溶解性を維持する。さらに、別の対象とする成分の単離は、それを可溶化またはその溶解性を維持するためのpH調節を必要としないが、沈殿した乳蛋白による妨害なしに全乳蛋白の少なくとも一部を可溶化させ、そして/またはその溶解性を維持してさらなる乳試料の処理を行うには、やはり、可溶化剤は必要である。
安定化剤の濃度は、安定化剤が対象成分の機能特性を保存し、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させるように選択される。例えば、対象成分が酵素である場合、高イオン強度は酵素活性を減少させる可能性があるため、バッファー濃度は可能なかぎり低くすべきである。それゆえ、乳からの特定の対象成分の単離に必要な安定化剤の濃度は、安定化剤自体の特性および単離される対象成分の特性に応じて変更されよう。例えば、約0.3Mのアルギニン濃度は、LA−tPAの機能特性の保存および全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化において、0.3Mのイミダゾールよりも効果的である。
安定化剤が乳試料と接触して安定化された乳試料を生成する条件は、対象成分の機能特性が保存され、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるように選択される。通常の当業者は、通常の実験のみにより、乳試料のpH、単離に使用する薬剤濃度、および対象成分の機能特性ならびに全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定性に影響しうる他の因子のごとき条件を操作することができよう。
乳試料対象成分を含有する乳試料のpHは、通常には、対象成分がその溶解性および機能特性を保持し、全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるようなレベルに調節される。pHが調節されるレベルは、いくつかの因子により決定されうる。対象成分が、その天然のおよび/または生物学的な活性形態にあるpH範囲は、これらの因子に包含される。例えば、酵素のごときある種の対象成分は、狭いpH範囲において活性でありうるし、この範囲外のpHに曝露することは不可逆的な活性の損失を引き起こす可能性がある。それゆえ、対象成分の機能的形態または天然型の対象成分を得るためには、許容される範囲内にpHを調節しなくてはならない。約0.5ないし約0.9のpH範囲は、生物学的活性を有する多くの対象成分がその活性を保持する典型的な範囲の例である。「約5.0」なる語は、下記において定義される。「約9.0」なる語は、pH9.0と同一または同様の影響を対象成分に及ぼす9.0に近いpHを包含し、例えば、好ましくは8.5およびそれ以上、より好ましくは8.8およびそれ以上を包含する。
pH調節において考慮すべき別の因子は全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるレベルである。対象蛋白を含有する乳試料のpHは、一般的には、乳成分が乳から沈殿するレベルよりも低くなってはならない。例えば、20℃、約4.6においてカゼインは沈殿する。pHは、対象成分が不溶性になるのを防止するレベルに維持されるべきである。例えば、ヒト・長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター(LA−tPA)含有乳試料のpHを約5.0まで低下させるとLA−tPAは可溶化のままである。「約5.0」なる語は、pH5.0と同一または同様の影響を対象成分に及ぼす5.0に近いpHを包含し、例えば、好ましくは4.6ないし5.4、より好ましくは4.8ないし5.2を包含する。
「有意な損失」なる語は、上記の対象成分単離方法が、対象成分の商業的生産を成功させないような対象成分の損失を包含する。好ましくは、本発明方法は、対象成分の損失が50%未満、より好ましくは約20%未満、最も好ましくは約10%未満である。慣用的乳処理方法は、対象成分が沈降物、沈殿物または凝固物中に捕捉されるため、対象成分の有意な損失を引き起こす。例えば、クラーク,エイ・ジェイ(Clark,A.J.)ら,(1989年5月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第7巻:487〜192頁は、トランスジェニックヒツジから得た乳試料から酸沈殿を用いて乳カゼインを除去した場合、約2.0ないし2.5%の抗血友病因子IXの回収率を報告している。これは損失が約98%と解釈される。デンマン,ジェイ(Denman,J.)ら,(1991年9月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第9巻:839〜843頁は、トランスジェニック乳ヤギから得た乳試料から酸沈殿を用いて乳カゼインを除去した場合、約25%のLA−tPA回収率、よって75%の損失を報告している。さらにデンマンらは、レニン処理および酸沈殿のごとき他の最初の分画段階は、LA−tPA収率の有意な増加を提供しなかったと報告している(デンマン,ジェイ(Denman,J.)ら,(1991年9月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第9巻:839〜843頁)。
「全乳蛋白の少なくとも一部」なる語は、部分的に不溶性または不溶性形態で乳中に通常存在する少なくとも1種の蛋白の少なくとも一部を包含する。溶解性が安定化されている全乳蛋白の一部は、要するに、その除去が対象成分の単離において無意味な段階よりも多くを構成するものでなくてはならない。種々の乳蛋白の一部の溶解性が安定化されうるか、または1種もしくはそれ以上の乳蛋白の全体の溶解性が安定化されうる。下記実施例において、アルギニンおよびイミダゾールは、下記実施例における全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化し、蛋白のうち少なくともカゼイン族、すなわち乳蛋白の少なくとも1つのタイプの全体または実質的に全体の溶解性を安定化させた。
慣用的方法を用いて、対象成分を安定化された乳試料から単離することができることが理解されるべきである。分離または単離方法の選択は、単離されるべき対象成分のタイプおよび乳試料中に存在する対象成分の量による。さらに、安定化された乳試料からの対象成分の単離または分離を、単一方法もしくは連続した複数の方法を用いて行うことができる。これらの方法は、濾過およびクロマトグラフィー法を包含する。濾過の例は、デッドエンド濾過フィルターユニットおよびクロスフロー濾過を包含する。クロマトグラフィー法の例は、イオン交換、疎水性、アフィニティー、およびゲル濾過クロマトグラフィー法を包含する。同様に、対象成分の単離前または後における乳試料の分画によるさらなる処理を、上記分離方法を用いて行うことができる。例えば、蛋白または他の成分の分画を、単離すべき成分の特性に応じた種々のクロマトグラフィー法のいずれかにより行うことができる。蛋白は、最も頻繁には、溶液中の蛋白混合物を多孔性固体マトリックスを有するカラムに通過させるカラムクロマトグラフィーにより分画され、蛋白がカラムの底部から流出するにつれて、蛋白を、それらの元々の機能的状態で分別収集することができる。使用するマトリックスの種類、例えば電荷(イオン交換クロマトグラフィー)、疎水性(疎水性クロマトグラフィー)、特定の化学官能基への結合能(アフィニティークロマトグラフィー)およびサイズ(ゲル濾過クロマトグラフィー)に応じて蛋白が分離される。高度な分析のため、高性能液体クロマトグラフィーを使用してもよい。当業者は、必要な純度にまで対象とする乳成分を単離するために、通常の実験により、上記分離方法の順序および回数を変更することができよう。
さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料を安定化剤と接触させ、濾過により処理可能な乳試料を生成することによる、乳試料からの対象成分の単離方法に関する。次いで、対象成分を、濾過により処理可能な乳試料から単離することができる。対象成分および安定化剤なる語は上記定義に同じである。
「濾過により処理可能」なる語は、安定化された乳試料がフィルターを通過し濾液の一部となりうる程度にまで全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されている乳試料を包含する。フィルターは、乳または乳類似物質の処理に典型的に使用されるタイプのものである。孔は乳中の成分により詰まるため、一般的には、フィルターは、典型的に乳処理に使用されるサイズの孔を有するものである。本発明の乳試料の処理に使用できるフィルターのタイプの例は、約0.2μmないし約5.0μmの範囲の孔サイズを有する。次いで、当業者に知られた順序の蛋白単離法のいずれかにより、対象成分を濾液から単離することができる。
さらに本発明は、対象成分を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる方法に関する。該方法は、対象成分の有意な損失なく全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、乳試料を安定化剤と接触させることを包含する。「安定化剤」、「溶解性を安定化させる条件下」および「全乳蛋白の少なくとも一部」なる語は上記定義に同じである。
また本発明は、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させるためのキットに関する。該キットは、安定化剤を保持する容器、および有意な損失を伴わずに安定化された乳試料からの対象成分の単離を可能にする程度にまで、対象成分を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化を行うための安定化剤の使用に関する説明書を包含する。さらに該キットは、対象成分の生物学的活性が保持され、全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで試料のpHを調節するための薬剤を保持するための容器を包含していてもよい。
「pHを調節するための薬剤」なる語は、通常の当業者が乳試料のごとき溶液のpHを調節するのに用いる化合物を包含する。かかる薬剤は、HClおよび酢酸のごとき酸、NaOHのごとき塩基を包含する。さらに、CO2のごとき気体によってもpHを調節することができる。乳試料のpHを調節するための薬剤が液体である場合、pH調節剤の送達の便利な手段を提供する容器の例は、ピペットまたは医療用ドロッパーの付いたバイアル、ビン等を包含する。
さらに限定的であってはならない下記実施例により、本発明はさらに説明される。本願のすべての部分(発明の背景を含む)において引用されるすべての文献および交付された特許の内容は、参照により特別に取り入れられる。本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。
実施例1アルギニンを安定化剤として用いる、長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター(LA−tPA)を含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
エバート,ケイ・エム(Ebert,K.M.)ら(1991年9月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第9巻:835〜838頁の方法に従って得た乳を分泌するトランスジェニック乳ヤギから得た乳試料を−20℃で凍結保存し、分析前に37℃の水浴中で融解した。乳ヤギの乳中に生成された対象成分はLA−tPA、すなわち野生型tPAよりも長い循環半減期を示すヒト・組織型プラスミノゲンアクチベーターの糖鎖付加変種であった(トランスジェニック乳ヤギの乳中に生成されるLA−tPAの特徴付けについては、デンマン,ジェイ(Denman,J.)らの上で引用した文献参照)。
次いで、1.0M酢酸を用いて乳試料のpHを6.7から5.0にした。次いで、乳試料を500μlずつ12個に分け、それらを1.5mlポリプロピレン試験管に入れた。異なる量の2.0Mアルギニン−HCl(pH5.5)を各試験管に添加して0.0Mから1.0Mの範囲のアルギニン濃度とした(表I)。リン酸緩衝化セイライン(PBS)を添加して最終体積を1.0mlとした。
アルギニン pH5.5
Figure 0003801196
試験管を、ブリンクマン(Brinkman)5315型遠心機で1000rpmで10分間遠心分離した。試験管を取り、写真を取って各アルギニン濃度についてのカゼインペレットのサイズを調べることにより可溶化の程度を示した(図1)。上清を定量分析用に取った。図1は、12種の異なるアルギニン濃度についての乳試料中の全乳蛋白の一部の可溶化の程度を示す。0.4Mより低いアルギニン濃度については、蛋白(おそらく、大部分がカゼインからなるであろう)のペレットがはっきりと認められた。0.4Mより高いアルギニン濃度については、蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。
280nmにおける吸光度測定により上清の蛋白濃度を算出した。12個の上清それぞれをPBSで1:50に希釈し、ベックマン(Beckman)DU−6分光器で読むことにより280nmにおける吸光度を読み取った。12個の試料それぞれには、乳のかわりにPBSを用い、さらにPBSで1:50に希釈したブランクを付けた。LA−tPA活性を、ラウ,ディー(Lau,D.)ら,(1987年9月)バイオテクノロジー(Biotechnology)第5巻:953〜958頁のごとく、プラスミン基質(Val−Leu−Lys−パラニトロアニリド)を用いるアミド分解活性の間接的測定において測定した。結果を図2に示す。必要な希釈は1:500000であった。図2は、アルギニン量を増加させるにつれ、乳試料中の全蛋白濃度およびLA−tPA活性の双方の増加が見られたことを示す。これらの結果は、アルギニンは全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させうることができ、それにより、LA−tPA単離量を増加させることができることを示す。
実施例2イミダゾールを安定化剤として用いる、LA−tPAを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
アルギニンのかわりに2.0Mイミダゾールを用いる以外は実施例1記載の方法に従った。表IIは、試験したイミダゾール濃度範囲を示す。図3は、イミダゾール濃度範囲についての乳試料の可溶化の程度を示す写真である。約0.7Mより低いイミダゾール濃度については、蛋白(おそらく、大部分がカゼインからなるであろう)のペレットがはっきりと認められた。約0.7Mより高いイミダゾール濃度については、蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。図4は、12種のイミダゾール濃度に関するLA−tPA活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。アルギニンの場合と同様に、イミダゾールは、全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させることができ、それにより、LA−tPA単離量を増加させることができた。図4は、乳試料中のイミダゾール濃度の増加に従い、乳試料中の全蛋白濃度およびLA−tPA活性の増加が起こったことを示す。
イミダゾール pH7.0
Figure 0003801196
実施例3: Bis−Trisを安定化剤として用いる、LA−tPAを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
アルギニンのかわりに1.7M Bis−Trisを用いる以外は実施例1記載の方法に従った。表IIIは、実験に用いたBis−Tris濃度範囲を示す。
BIS−TRIS pH6.0
Figure 0003801196
図5は、蛋白ペレットのサイズを示すことにより、試験したBis−Tris濃度の範囲についての乳試料の可溶化の程度を示す。0.2M程度の濃度では蛋白ペレットはほとんどないかまたは認められなかった。図6は、10種のBis−Tris濃度範囲に関するLA−tPA活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。図6は、乳試料中のBis−Tris濃度が増加するにつれ、乳試料中の全蛋白濃度およびLA−tPA活性の増加が見られたが、Bis−Tris濃度が約0.65Mおよびそれ以上の場合はLA−tPA活性が減少したことを示す。
実施例4異なるpHにおいてアルギニンを可溶化剤として用いる、LA−tPAを含有するトランスジェニック乳ヤギの乳からの乳蛋白の溶解性の安定化
乳試料の最初のpHは6.7であった。この点から試料のpHを所望のpH、例えば、4.3、6.0、7.0および8.0に調節した。試験される安定化剤のpHが6.7である場合には、乳試料のpHを調節しなかった。同様に、2.0MのアルギニンのpHを試料のpHに調節し、それを試料に添加して最終試料のpH変動を防止した。次いで、pHを調節した試料を500μlずつに分け、1.5mlポリプロピレン試験管に入れた。種々の量の2.0Mアルギニンを乳試料に添加して種々のpHにおいて種々の濃度のアルギニンを含有する乳試料を得た。PBSを添加して最終体積を1.0mlとした。
試験管を、ブリンクマン(Brinkman)5315型遠心機で1000rpmで10分間遠心分離した。試験管を取り、写真を取って、pH4.3、6.0、7.0および8.0における各アルギニン濃度についてのカゼインペレットのサイズを調べることにより可溶化の程度を示した。写真を図7に示す。図7に示すように、pH6.0においてアルギニンは、約0.5ないし約1.0Mの濃度において乳蛋白の溶解性に対する最良の安定化剤として作用した。pH7.0における約0.6ないし1.0Mの範囲の濃度のアルギニンもまた、乳蛋白の溶解性に対する良好な安定化剤であった。pH4.3においては、アルギニンは、約0.1Mないし約1.0Mの濃度範囲において、乳蛋白の溶解性をほとんど安定化しなかった。
実施例5最初にアルギニン添加、次いで、乳試料のpHを調節することによる、トランスジェニック乳ヤギの乳からのLA−tPAの単離
2.0Mアルギニン(pH5.5)をpH調節前に添加すること以外は、実施例1記載の方法に従った。実験において試験したアルギニン濃度範囲は実施例1において試験したものと同じであり、表Iに示す。図8は、12種のアルギニン濃度についてのLA−tPA活性に対する上清の相対的蛋白濃度を示す。アルギニン濃度の増加に伴い、全乳蛋白濃度およびLA−tPA活性の双方が増加した。しかしながら、LA−tPA活性はピークを形成し、約1.0Mのアルギニン濃度において約1.20e+6IU/mlのレベルであり、対照的に、実施例1においては、同じアルギニン濃度について、ピークLA−tPA活性は約1.50e+6IU/mlであった。
実施例6アルギニンを安定化剤として用いる、トランスジェニックマウスの乳からのアンチトロンビンIIIの単離
乳を分泌するトランスジェニックマウスから得た乳試料を−80℃で凍結し、分析前に室温で融解した。マウスの乳中の対象成分はヒト・アンチトロンビンIIIであった。
体積が非常に小さかったため、乳試料のpHを調節しなかった。次いで、乳試料を500μlずつに分け、1.5mlポリプロピレン試験管に入れた。2.0Mアルギニン500μlを1の試験管に入れ、1.0Mイプシロン−アミノカプロン酸(EACA)を400μlのPBSとともに他の試験管に入れて各試験管中の体積を1.0mlとした。0.45μmのフィルターユニット(マサチューセッツ州ベッドフォード(Bedford)のミリポア(Millipore)社製)を用いて試験管の内容物を濾過した。結果は、アルギニン含有試料は容易に濾過され、初発アンチトロンビンの回収率は83%であったことを示す。EACAを伴う材料は濾過が困難で、アンチトロンビン回収率は50%であった。
実施例7アルギニンを安定化剤として用いる、トランスジェニック乳ヤギの乳からのLA−tPAの単離
乳を室温で融解し、1.0M酢酸を用いてpHを5.0に調節し、同体積の1.0Mアルギニンで希釈し、公称孔径0.22μmのフィルター(ニューヨークのボヘミア(Bohemia)のザルトリウス(Sartorius)社製)、次いで、絶対孔径0.20μmのフィルター(マサチューセッツ州ベッドフォード(Bedford)のミリポア(Millipore)社製)によりデッドエンド濾過した。LA−tPAを、最初にTSK−ブチルカラムに結合させることにより、濾液から精製した。カラムを20mMリン酸ナトリウム(pH6.0)、100mMアルギニン−HCl、0.01%ツイン80で平衡化し、次いで洗浄し、次いで、20mMリン酸ナトリウム、100mMアルギニン−HClおよび70%エチレングリコールを用いて段階的に溶離した。溶離物の収集を、1.0AUFSにおける280nmの吸光度をモニターすることにより行った。ベースラインより上であることが検知された時点で収集を開始した。この最初の段階は、酵素を濃縮し実質的に精製する手段を提供する。この工程からのLA−tPAの回収率は、アルギニン無添加の場合は25ないし50%であるが、これとは対照的に、初発活性の95%であった。
均等物
当業者は、通常の実験以上のものを用いずに、本明細書記載の本発明の特定の具体例の多くの均等物を認識し、あるいは確認することがすることができよう。かかる均等物は、下記の請求の範囲に包含される。

Claims (58)

  1. 全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させて対象蛋白の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から対象蛋白が単離されうるようにし;次いで
    安定化された乳試料から対象蛋白を生物学的に活性な形態で単離すること
    からなる乳試料からの対象蛋白の単離方法。
  2. 接触段階において対象蛋白の溶解性が安定化される請求項1記載の方法。
  3. 乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項1記載の方法。
  4. トランスジェニック哺乳動物が、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスからなる群より選択される請求項3記載の方法。
  5. 対象蛋白が天然に存在する乳成分である請求項1記載の方法。
  6. 対象蛋白がトランスジェニック哺乳動物の乳中に分泌される成分である請求項3記載の方法。
  7. 対象蛋白が治療薬である請求項3記載の方法。
  8. 治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター(longer-acting tissue-type plasminogen activator)である請求項7記載の方法。
  9. 治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項7記載の方法。
  10. 対象蛋白が免疫グロブリンである請求項3記載の方法。
  11. 正に荷電している薬剤を含有している乳試料のpHが5.0ないし9.0の範囲である請求項3記載の方法。
  12. 正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびビス−トリス(Bis−Tris)からなる群より選択される請求項3記載の方法。
  13. 正に荷電している薬剤がアルギニンである請求項12記載の方法。
  14. 請求項1の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を細胞培養培地に含めることからなる細胞培養培地における改良方法。
  15. 請求項1の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を食品に含めることからなる食品における改良方法。
  16. 接触段階における条件が、対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のpHを調節することを包含する請求項3記載の方法。
  17. 乳試料が調節されるpHが5.0ないし9.0の範囲である請求項15記載の方法。
  18. 対象蛋白が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターであり、乳試料が調節されるpHが4.6ないし5.4である請求項16記載の方法。
  19. 全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項1記載の方法。
  20. さらに、安定化された乳試料を濾過し、濾過された乳試料から対象蛋白を単離することからなる請求項1記載の方法。
  21. 対象蛋白が、濾過された乳試料からクロマトグラフィーにより単離される請求項19記載の方法。
  22. 対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させ、濾過により処理可能な乳試料を生成し;次いで
    濾過により処理可能な乳試料から対象蛋白を単離すること
    からなる乳試料からの対象蛋白の単離方法。
  23. 乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項22記載の方法。
  24. 蛋白が治療薬である請求項23記載の方法。
  25. 治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項24記載の方法。
  26. 治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項24記載の方法。
  27. 蛋白が免疫グロブリンである請求項24記載の方法。
  28. 正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびBis−Trisからなる群より選択される請求項23記載の方法。
  29. 正に荷電している薬剤がアルギニンである請求項28記載の方法。
  30. さらに、濾過により処理可能な乳試料を濾過すること、次いで濾過された試料から対象蛋白を単離することからなる請求項22記載の方法。
  31. 対象蛋白が、濾過された乳試料からクロマトグラフィーにより単離される請求項30記載の方法。
  32. 請求項22の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を細胞培養培地に含めることからなる細胞培養培地における改良方法。
  33. 請求項22の方法を用いて対象蛋白を単離し、該単離した対象蛋白を食品に含めることからなる食品における改良方法。
  34. 対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のpHを調節し;
    全乳蛋白の一部の溶解性を安定化する条件下で、対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させて対象蛋白の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から対象蛋白が単離されるようにし;次いで
    安定化された乳試料から対象蛋白を生物学的に活性な形態で単離すること
    からなる乳試料から対象蛋白を単離する方法。
  35. 乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られる請求項34記載の方法。
  36. 蛋白が治療薬である請求項35記載の方法。
  37. 治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項36記載の方法。
  38. 治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項36記載の方法。
  39. 乳試料が調節されるpHが5.0ないし9.0の範囲である請求項35記載の方法。
  40. 対象蛋白が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターであり、乳試料が調節されるpHが4.6ないし5.4である請求項39記載の方法。
  41. 調節および接触段階が同時に行われる請求項34記載の方法。
  42. 接触段階が調節段階の前に行われる請求項34記載の方法。
  43. 正に荷電している薬剤が、アルギニン、イミダゾールおよびBis−Trisからなる群より選択される請求項35記載の方法。
  44. 全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項35記載の方法。
  45. 全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化させる条件下で、対象蛋白を含有する乳試料を正に荷電している薬剤と接触させて対象蛋白の有意な損失を伴わずに安定化された乳試料から対象蛋白が単離されうるようにすることからなる、対象蛋白を含有する乳試料中の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化する方法。
  46. 接触段階における条件が、対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のpHを調節することを包含する請求項45記載の方法。
  47. 接触段階において対象蛋白の溶解性が安定化される請求項45記載の方法。
  48. 全乳蛋白の一部がカゼインを含んでいる請求項45記載の方法。
  49. 乳試料がヒトを除くトランスジェニック哺乳動物から得られるものである請求項45記載の方法。
  50. 蛋白が治療薬である請求項45記載の方法。
  51. 治療薬が長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーターである請求項50記載の方法。
  52. 治療薬がアンチトロンビンIIIである請求項50記載の方法。
  53. 正に荷電している薬剤;および
    前もって全乳蛋白の一部を除去することによる有意な損失を伴わずに安定化された乳試料からの対象蛋白の単離を可能にする程度にまで、対象蛋白を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性の安定化を行うための正に荷電している薬剤の使用に関する説明書
    からなる、対象蛋白を含有する乳試料の全乳蛋白の少なくとも一部の溶解性を安定化するためのキット。
  54. さらに、対象蛋白がその生物学的活性を保持し全乳蛋白の一部の溶解性が安定化されるように選択されたレベルにまで、対象蛋白を含有する乳試料のpHを調節するための薬剤を入れておく容器からなる請求項53記載のキット。
  55. 蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーター(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)である請求項3記載の方法。
  56. 蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項24記載の方法。
  57. 蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項36記載の方法。
  58. 蛋白が嚢胞性線維症膜間伝導率レギュレーターである請求項50記載の方法。
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