TW201920266A - Madcam 抗體 - Google Patents

Abstract

本揭露係關於包括特異性結合MAdCAM較佳人類MAdCAM且起抑制MAdCAM作用之人類抗體及其抗原結合部分之抗體。本揭露亦關於人類抗MAdCAM抗體及其抗原結合部分。本揭露亦關於係嵌合抗體、雙特異性抗體、衍生抗體、單鏈抗體、或融合蛋白之部分的抗體。本揭露亦關於衍生自人類抗MAdCAM抗體之單離重鏈及輕鏈免疫球蛋白及編碼此類免疫球蛋白之核酸分子。本揭露亦關於製備人類抗MAdCAM抗體之方法、包含此等抗體之組成物、及使用該等抗體及組成物以供診斷及治療之方法。本揭露亦提供使用編碼構成該等人類抗MAdCAM抗體之該等重鏈及/或輕鏈免疫球蛋白分子之核酸分子之基因療法方法。本揭露亦關於包含本揭露之核酸分子之基因轉殖動物或植物。

Description

MAdCAM抗體

黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM)為細胞黏附受體之免疫球蛋白超家族之成員。淋巴球歸巢(homing)至胃腸道之特化淋巴組織及黏膜部位之選擇性由MAdCAM之內皮表現確定(Berlin,C.等人，Cell,80：413-422(1994)；Berlin,C.等人，Cell,74：185-195(1993)；及Erle,D.J.等人，J.Immunol.,153：517-528(1994))。MAdCAM獨特地在組織性腸淋巴組織之高內皮小靜脈之細胞表面上表現，諸如派亞氏淋巴叢(Peyer's patch)及腸系膜淋巴結(Streeter等人，Nature,331：41-6(1988)；Nakache等人，Nature,337：179-81(1989)；Briskin等人，Am.J.Pathol.151-97-110(1997))，但亦在其他淋巴器官(諸如胰腺、膽囊及脾小靜脈以及脾白髓之邊緣竇)中表現(Briskin等人(1997)，同上；Kraal等人，Am.J.Path.,147：763-771(1995))。

儘管MAdCAM在腸免疫監視中起生理作用，但是其顯示在慢性胃腸道發炎之病況下有助於發炎性腸病中過度的淋巴球外滲。TNFα及其他促發炎細胞介素增加內皮MAdCAM表現，且在取自具有克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎之患者之生檢樣品中，MAdCAM表現在發炎部位局部增加約2-3倍(Briskin等人(1997)；Souza等人，Gut,45：856-63(1999)；Arihiro等人，Pathol Int.,52：367-74(2002))。已經在結腸炎之實驗模型中觀察到類似模式的表現升高(Hesterberg等人，Gastroenterology,111：1373-1380(1997)；Picarella等人，J.Immunol.,158：2099-2106(1997)；Connor等人，J Leukoc Biol.,65：349-55(1999)；Kato等人，J Pharmacol Exp Ther.,295：183-9(2000)；Hokari等人，Clin Exp Immunol.,26：259-65(2001)；Shigematsu等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol.,281：G1309-15(2001))。在發炎性病況諸如胰島素依賴性糖尿病(Yang等人，Diabetes,46：1542-7(1997)；Hänninen等人，J Immunol.,160：6018-25(1998))、移植物抗宿主病(Fujisaki等人，Scand J Gastroenterol.,38：437-42(2003)；Murai等人，Nat Immunol.,4：154-60(2003))、慢性肝病(Hillan等人，Liver,19：509-18(1999)；Grant等人，Hepatology,33：1065-72(2001))、發炎性腦病(Stalder等人，Am J Pathol.,153：767-83(1998)；Kanawar等人，Immunol Cell Biol.,78：641-5(2000))、及胃炎(Barrett等人，J Leukoc Biol.,67：169-73(2000)；Hatanaka等人，Clin Exp Immunol.,130：183-9(2002))之其他臨床前模型中，疾病發病機制中亦存在胎兒MAdCAM表現之再次喚醒及活化α₄β₇ ⁺淋巴球之參與。在此等發炎模型以及半抗原介導之(例如，TNBS、DSS等)或接受性轉移(CD4⁺CD45Rb^高)小鼠結腸炎模型中，阻斷α₄β₇ ⁺淋巴球結合MAdCAM的大鼠抗小鼠MAdCAM單株抗體(mAb)MECA-367減少淋巴球募集、組織外滲、發炎、及疾病嚴重性。抗人類MAdCAM之小鼠單株抗體(mAb)亦經報導(參見例如WO 96/24673及WO 99/58573)。

既知MAdCAM在發炎性腸病(IBD)及與胃腸道或其他組織相關之其他發炎性疾病中之作用，用於抑制α₄β₇結合及MAdCAM介導之白血球募集之手段為合乎需要的。具有此一治療手段為進一步合乎需要的，該治療手段具有的有利性質包括但不限於在患者體內與其他藥物不存在非所要的相互作用以及有利的物理化學性質諸如人體內之pK/pD值、溶解度、穩定性、庫存壽命、及體內半衰期。治療性蛋白質(諸如抗體)應有利地免於非所要的轉譯後修飾或聚集體形成。據此，迫切需要治療性抗MAdCAM抗體。

本文提供一種特異性結合MAdCAM之單離抗體或該抗體之抗原結 合部分，其中至少該抗體之CDR序列為人類CDR序列。在實施例中，抗體為人類抗體，較佳為充當MAdCAM拮抗劑之抗體。亦提供包含該等抗體或部分之組成物。

本揭露亦提供一種組成物，其包含該抗MAdCAM拮抗性抗體之重鏈及/或輕鏈或其可變區或其他抗原結合部分、或編碼前述任一者之核酸分子及醫藥上可接受之載劑。本發明之組成物可進一步包含另一組分，諸如治療劑或診斷劑。本發明亦提供診斷及治療方法。

本揭露進一步提供一種單離細胞株，其產生該抗MAdCAM抗體或其抗原結合部分。

本揭露亦提供編碼該抗MAdCAM抗體之重鏈及/或輕鏈、或其可變區、或其抗原結合部分之核酸分子。

本揭露提供包含該等核酸分子之載體及宿主細胞，以及重組產生由該等核酸分子編碼之多肽之方法。

亦提供表現該抗MAdCAM抗體之重鏈及/或輕鏈或其抗原結合部分之非人類基因轉殖動物或植物。

在實施例中，提供一種特異性結合黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM)之人類單株抗體或其抗原結合部分。

在實施例中，人類單株抗體或抗原結合部分具有以下性質之至少一者：(a)結合人類細胞；(b)對MAdCAM之選擇性優於對VCAM或纖連蛋白之選擇性至少100倍；(c)以3×10^-10M或更小的K_d結合人類MAdCAM；或(d)抑制表現α₄β₇之細胞與人類MAdCAM之結合。(e)抑制淋巴球向胃腸淋巴組織之募集。

在實施例中，人類單株抗體或抗原結合部分以3×10^-10M或更小的K_d結合人類MAdCAM且抑制α₄β₇結合人類MAdCAM。

在實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO：148至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列。

在實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO：148一致之胺基酸序列。

在實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO：148相比1與25之間個胺基酸取代。

在實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO：148相比1與10之間個胺基酸取代。

在實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO：150至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列。

在實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO：150一致之胺基酸序列。

在實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO：150相比1與25之間個胺基酸取代。

在實施例中，輕鏈包含與SEQ ID NO：150相比1與10之間個胺基酸取代。

在實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO：149至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列，且輕鏈包含與SEQ ID NO：150至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列。

在實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO：149一致之胺基酸序列，且輕鏈包含與SEQ ID NO：150一致之胺基酸序列。

在實施例中，提供一種編碼MAdCAM抗體之胺基酸序列之核酸序列。

在實施例中，提供一種產生結合MAdCAM之人類單株抗體之細胞。

在實施例中，提供一種包含編碼MAdCAM抗體之核酸序列之細胞。

在實施例中，提供一種產生人類單株MAdCAM抗體之融合瘤細胞 株。在實施例中，融合瘤係選自由以下組成之群：1.7.2(ECACC登錄號03090901)、1.8.2(ECACC登錄號03090902)、6.14.2(ECACC登錄號03090903)、6.22.2(ECACC登錄號03090904)、6.34.2(ECACC登錄號03090905)、6.67.1(ECACC登錄號03090906)、6.73.2(ECACC登錄號03090907)、6.77.1(ECACC登錄號03090908)、7.16.6(ECACC登錄號03090909)、7.20.5(ECACC登錄號03090910)、7.26.4(ECACC登錄號03090911)、及9.8.2(ECACC登錄號03090912)。

在實施例中，提供由融合瘤細胞株產生之人類單株抗體或該單株抗體之抗原結合部分。

在實施例中，重鏈C端離胺酸經切割。

在實施例中，該抗體或抗原結合部分抑制人類MAdCAM與α₄β₇之結合，且其中該抗體或其部分具有以下性質之至少一者：(a)與參考抗體交叉競爭結合MAdCAM；(b)與參考抗體競爭結合MAdCAM；(c)結合與參考抗體相同的MAdCAM之表位；(d)以與參考抗體實質上相同的K_d結合MAdCAM；(e)以與參考抗體實質上相同的解離速率結合MAdCAM；其中該參考抗體係選自由以下組成之群：單株抗體1.7.2、單株抗體1.8.2、單株抗體6.14.2、單株抗體6.22.2、單株抗體6.34.2、單株抗體6.67.1、單株抗體6.73.2、單株抗體6.77.1、單株抗體7.16.6、單株抗體7.20.5、單株抗體7.26.4、單株抗體9.8.2、X481.2單株抗體、單株抗體6.22.2-mod、單株抗體6.34.2-mod、單株抗體6.67.1-mod、單株抗體6.77.1-mod、及單株抗體7.26.4-mod。

在實施例中，抗體係選自由以下組成之群：(a)包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(b)包含SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(c)包含SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：12中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(d)包含SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：16中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號 序列；(e)包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(f)包含SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：24中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(g)包含SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：28中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(h)包含SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：32中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(i)包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：36中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(j)包含SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：40中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(k)包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：44中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(l)包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(m)包含SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：54中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(n)包含SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：58中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(o)包含SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(p)包含SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：66中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；及(q)包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：68中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(r)包含SEQ ID NO：148及SEQ ID NO：150中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列。

在實施例中，該抗體或其部分之重鏈包含選自由以下組成之群之單株抗體之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，或其中輕鏈包含該單株抗體之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod。

在實施例中，該抗體或部分包含利用人類VH 1-18基因、人類VH 3-15基因、人類VH 3-21基因、人類VH 3-23基因、人類VH 3-30基因、人類VH 3-33基因、或人類VH 4-4基因之重鏈。

在實施例中，該抗體或部分包含利用人類V_K A2基因、人類V_K A3基因、人類V_K A26基因、人類V_K B3基因、人類V_K O12基因、或人類V_K O18基因之輕鏈。

在實施例中，重鏈可變區、輕鏈可變區、或兩者之胺基酸序列與選自由以下組成之群之單株抗體之一或多個對應區至少90%一致：單株抗體1.7.2、單株抗體1.8.2、單株抗體6.14.2、單株抗體6.22.2、單株抗體6.34.2、單株抗體6.67.1、單株抗體6.73.2、單株抗體6.77.1、單株抗體7.16.6、單株抗體7.20.5、單株抗體7.26.4、單株抗體9.8.2、單株抗體X481.2、單株抗體6.22.2-mod、單株抗體6.34.2-mod、單株抗體6.67.1-mod、單株抗體6.77.1-mod、及單株抗體7.26.4-mod。

在實施例中，提供一種特異性結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合部分，其中：(a)重鏈包含選自由以下組成之群之參考抗體之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod(b)輕鏈包含選自由以下組成之群之參考抗體之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod(c)該抗體包含(a)之重鏈及(b)之輕鏈；且(d)(c)之抗體，其中重鏈及輕鏈CDR胺基酸序列係選自相同的參考抗體。

在實施例中，重鏈、輕鏈、或兩者包含參考抗體之分別重鏈、輕鏈、或兩者之自CDR1開始至CDR3結束之胺基酸序列。

在實施例中，該抗體包含：(a)重鏈，其包含選自由以下組成之群之抗體之重鏈可變區胺基酸序列：1.7.2(SEQ ID NO：2)、1.8.2(SEQ ID NO：6)、6.14.2 (SEQ ID NO：10)、6.22.2(SEQ ID NO：14)、6.34.2(SEQ ID NO：18)、6.67.1(SEQ ID NO：22)、6.73.2(SEQ ID NO：26)、6.77.1(SEQ ID NO：30)、7.16.6(SEQ ID NO：34)、7.20.5(SEQ ID NO：38)、7.26.4(SEQ ID NO：42)、及9.8.2(SEQ ID NO：46)、X481.2(SEQ ID NO：148)、6.22.2-mod(SEQ ID NO：52)、6.34.2-mod(SEQ ID NO：56)、6.67.1-mod(SEQ ID NO：60)、6.77.1-mod(SEQ ID NO：64)、及7.26.4-mod(SEQ ID NO：42)；(b)輕鏈，其包含選自由以下組成之群之抗體之輕鏈可變區胺基酸序列：1.7.2(SEQ ID NO：4)；1.8.2(SEQ ID NO：8)；6.14.2(SEQ ID NO：12)、6.22.2(SEQ ID NO：16)、6.34.2(SEQ ID NO：20)、6.67.1(SEQ ID NO：24)、6.73.2(SEQ ID NO：28)、6.77.1(SEQ ID NO：32)、7.16.6(SEQ ID NO：36)、7.20.5(SEQ ID NO：40)、7.26.4(SEQ ID NO：44)、及9.8.2(SEQ ID NO：48)、X481.2(SEQ ID NO：150)、6.22.2-mod(SEQ ID NO：54)、6.34.2-mod(SEQ ID NO：58)、6.67.1-mod(SEQ ID NO：62)、6.77.1-mod(SEQ ID NO：66)、及7.26.4-mod(SEQ ID NO：68)；或(c)(a)之重鏈及(b)之輕鏈。

在實施例中，單株抗體為免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、及IgA或IgD分子、人源化抗體、嵌合抗體、或雙特異性抗體。

在實施例中，抗原結合部分為Fab片段、F(ab)₂片段、F_V片段、或單鏈抗體。

在實施例中，提供一種醫藥組成物，其包含有效量的單株抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑。

在實施例中，提供一種治療有需要之受試者之發炎性疾病之方法，其包含向該受試者投與單株抗體或其抗原結合部分之步驟，其中該抗體或抗原結合部分抑制MAdCAM與α₄β₇之結合。

在實施例中，發炎性疾病為胃腸道之發炎性疾病。

在實施例中，胃腸道之發炎性疾病選自由以下組成之群：發炎性腸 病、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、憩室病、胃炎、肝病、原發性膽道硬化、及硬化性膽管炎。

在實施例中，發炎性腸病為克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、或兩者。

在實施例中，發炎性疾病為胰島素依賴性糖尿病及移植物抗宿主病。

在實施例中，提供一種單離細胞株，其產生單株抗體或抗原結合部分或者該抗體或該其部分之重鏈或輕鏈。在實施例中，細胞株產生選自由1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、及X481.2組成之群之抗體或包含該等抗體之一的胺基酸序列之抗體。在實施例中，細胞株產生選自由6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、7.26.4-mod、及X481.2組成之群之單株抗體或包含該等抗體之一的胺基酸序列之抗體。

在實施例中，提供一種單離核酸分子，其包含編碼抗體之重鏈或其抗原結合部分或者輕鏈或其抗原結合部分之核苷酸序列。

在實施例中，提供一種包含核酸分子之載體，其中該載體視情況包含可操作地連接該核酸分子之表現控制序列。在實施例中，提供一種包含載體或核酸分子之宿主細胞。

在實施例中，提供一種宿主細胞，其包含編碼抗體或其抗原結合部分之重鏈或其抗原結合部分的核酸分子及編碼該抗體或其抗原結合部分之輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子。

在實施例中，提供一種用於產生特異性結合MAdCAM之人類單株抗體或其抗原結合部分之方法，其包含在合適條件下培養宿主細胞或細胞株及回收該抗體或抗原結合部分。

在實施例中，提供一種非人類基因轉殖動物或基因轉殖植物，其包含(a)編碼抗體之重鏈或其抗原結合部分的核酸分子；(b)編碼抗體之輕鏈或其抗 原結合部分的核酸分子；或(c)(a)及(b)兩者，其中非人類基因轉殖動物或基因轉殖植物表現該重鏈或輕鏈或兩者。

在實施例中，提供一種單離出特異性結合MAdCAM之抗體或其抗原結合部分之方法，其包含自非人類基因轉殖動物或基因轉殖植物單離出抗體之步驟。

在實施例中，提供一種用特異性結合MAdCAM且抑制與α₄β₇結合之人類抗體或其抗原結合部分治療有需要之受試者之方法，其包含以下步驟：(a)投與有效量的編碼重鏈或其抗原結合部分之單離核酸分子、編碼輕鏈或其抗原結合部分之單離核酸分子、或編碼輕鏈及重鏈或其抗原結合部分之核酸分子；及(b)表現核酸分子。

在實施例中，提供一種用於產生特異性結合MAdCAM之人類單株抗體之方法，其包含以下步驟：(a)用MAdCAM、用MAdCAM之免疫性部分、或用表現MAdCAM之細胞或組織免疫能夠產生人類抗體之非人類基因轉殖動物；及(b)使該基因轉殖動物發動對MAdCAM之免疫反應。

在實施例中，如上文產生一種人類單株抗體。

在實施例中，提供一種抑制α₄β₇結合表現人類MAdCAM之細胞之方法，其包含使細胞與單株抗體或其抗原結合部分接觸。

在實施例中，提供一種用於抑制MAdCAM介導之白血球-內皮細胞黏附之方法，其包含使內皮細胞與單株抗體或其抗原結合部分接觸。

在實施例中，提供一種用於抑制MAdCAM介導之白血球黏附、遷移、及向組織中浸潤之方法，其包含使內皮細胞與單株抗體或其抗原結合部分接觸之步驟。

在實施例中，提供一種用於抑制α₄β₇/MAdCAM依賴性細胞黏附之方法，其包含使表現人類MAdCAM之細胞與單株抗體或其抗原結合部分接觸之 步驟。

在實施例中，提供一種用於抑制MAdCAM介導之淋巴球向胃腸淋巴組織募集之方法，其包含使表現人類MAdCAM之細胞與單株抗體或其抗原結合部分接觸之步驟。

在實施例中，提供一種特異性結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其部分包含選自由以下組成之群之人類單株抗體之FR1、FR2、FR3、或FR4胺基酸序列之一或多者：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod。

在實施例中，人類單株抗體或抗原結合部分包含：(a)重鏈胺基酸序列，其與選自由以下組成之群之單株抗體之重鏈胺基酸序列至少90%一致：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod；(b)輕鏈胺基酸序列，其與選自由以下組成之群之單株抗體之輕鏈胺基酸序列至少90%一致：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod；(c)(a)及(b)兩者；或(d)(a)、(b)、或(c)，有或無信號序列。

在實施例中，提供一種用於診斷特徵在於循環可溶性人類MAdCAM之病症之方法，其包含以下步驟：(1)使生物樣本與單株抗體或抗原結合部分接觸，及(2)偵測結合。

在實施例中，提供一種用於偵測受試者之發炎之方法，其包含以下步驟：(1)向該受試者投與單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或其部分經可偵測地標記，及(2)偵測結合。

在實施例中，提供一種診斷套組，其包含單株抗體或抗原結合部分。

在實施例中，提供進一步包含一或多種額外消炎劑或免疫調節劑之醫藥組成物。在實施例中，該一或多種額外消炎劑或免疫調節劑係選自由以下組成之群：皮質類固醇、胺基柳酸鹽、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、環孢素、FK506、IL-10、GM-CSF、雷帕黴素、抗TNFα劑、及黏附分子拮抗劑。

在實施例中，提供一種疫苗，其包含有效量的人類抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑。在實施例中，疫苗為黏膜疫苗。

在實施例中，提供一種偵測抑制性抗MAdCAM抗體或其抗原結合部分之投與對受試者之作用之方法，其包含以下步驟：(a)向受試者投與特異性結合MAdCAM之人類單株抗體；及(b)確定循環表現α₄β₇之白血球之水準是否增加。在實施例中，該等白血球為淋巴球。在實施例中，循環表現α₄β₇之白血球之水準之該增加係藉由FACS分析來確定。

在實施例中，提供一種結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：150之輕鏈之可變區及SEQ ID NO：148之重鏈之可變區。

在實施例中，提供一種結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合片段，其包含由核苷酸SEQ ID NO：149編碼之重鏈可變區及由核苷酸SEQ ID NO：35編碼之輕鏈可變區。

圖1為12種人類抗MAdCAM單株抗體之重鏈及κ輕鏈可變區之預測胺基酸序列與對應人類基因之生殖系胺基酸序列之比對。

圖1A顯示抗體1.7.2及1.8.2之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH3-15基因產物之比對。

圖1B顯示抗體6.14.2之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 3-23基因產物之比對。

圖1C顯示抗體6.22.2之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 3-33基因產物之比對。

圖1D顯示抗體6.34.2之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 3-30基因產物之比對。

圖1E顯示抗體6.67.1之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 4-4基因產物之比對。

圖1F顯示抗體6.73.2之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 3-23基因產物之比對。

圖1G顯示抗體6.77.1之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 3-21基因產物之比對。

圖1H顯示抗體7.16.6及7.26.4之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 1-18基因產物之比對。

圖1I顯示抗體7.20.5之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 4-4基因產物之比對。

圖1J顯示抗體9.8.2之重鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類VH 3-33基因產物之比對。

圖1K顯示抗體1.7.2及1.8.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類A3基因產物之比對。

圖1L顯示抗體6.14.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類O12基因產物之比對。

圖1M顯示抗體6.22.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類A26基因產物之比對。

圖1N顯示抗體6.34.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類O12基因產物之比對。

圖1O顯示抗體6.67.1之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類B3基因產物之比對。

圖1P顯示抗體6.73.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類O12基因產物之比對。

圖1Q顯示抗體6.77.1之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類A2基因產物之比對。

圖1R顯示抗體7.16.6及7.26.4之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類A2基因產物之比對。

圖1S顯示抗體7.20.5之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類A3基因產物之比對。

圖1T顯示抗體9.8.2之κ輕鏈之預測胺基酸序列與生殖系人類O18基因產物之比對。

圖2為人類抗MAdCAM抗體之預測重鏈及κ輕鏈胺基酸序列之CLUSTAL比對。

圖2A為預測κ輕鏈胺基酸序列之CLUSTAL比對及輻射樹(radial tree)，其顯示抗MAdCAM抗體κ輕鏈之間的類似程度。

圖2B為預測重鏈胺基酸序列之CLUSTAL比對及輻射樹，其顯示抗MAdCAM抗體重鏈之間的類似程度。

圖3為食蟹獼猴及人類MAdCAM之形成α₄β₇結合結構域之2個N端結構域之胺基酸序列CLUSTAL比對。根據Tan等人，Structure(1998)6：793-801來比對β股。

圖4為表示經純化之生物素化1.7.2及7.16.6對人類末梢血淋巴球黏附至表現MAdCAM之冷凍人類肝臟內皮切片之劑量效應之圖。

圖5顯示基於擷取於表7中的抗MAdCAM抗體1.7.2、6.22.2、6.34.2、 6.67.1、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2結合之MAdCAM表位之多樣性資料之二維圖形表示。相同圈內之抗MAdCAM抗體顯示相同的反應性模式，屬相同的表位倉(bin)且很可能識別MAdCAM上相同的表位。在重疊圈內之抗MAdCAM抗體殖株不能同時結合且因此很可能識別MAdCAM上重疊的表位。非整合之圈表示具有不同空間表位分離之抗MAdCAM抗體殖株。

圖6顯示在抗MAdCAM抗體1.7.2及Alexa 488標記之7.16.6之情況下的三明治法ELISA數據，其顯示能夠偵測MAdCAM上不同表位的兩種抗體可用於出於診斷目的偵測可溶性MAdCAM。

圖7在食蟹獼猴模型中使用抗MAdCAM mAb 7.16.6，顯示抑制性抗MAdCAM抗體(1mg/kg)對末梢α₄β₇ ⁺淋巴球數之影響，其表示為優於對照IgG2a mAb或媒劑的倍數增加。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2017年7月14日申請之U.S.S.N.62/532,809之權益及優先權，該案之內容整體併入本文。

序列表之引用併入

於2017年7月14日創建且大小為197KB之文本文件名稱「SHR-1258A_ST25.txt」之內容據此整體以引用之方式併入。

定義及通用技術

除非本文另外定義，否則結合本揭露使用之科學及技術術語將具有由一般技藝人士通常所理解之含義。此外，除非另外為上下文所需，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。一般而言，結合本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白及核酸化學及雜交所使用之命名法，以及該等領域之技術係此項技術中所熟知且通常使用的。除非 另有指明，否則本揭露之方法及技術通常係根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般性及更具體參考文獻中所述來進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；及Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Hatbor,N.Y.(1990)，其以引用方式併入本文。根據製造商之說明書，如此項技術中通常所達成或如本文所述來執行酶反應及純化技術。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製及傳遞、以及對患者進行治療。

除非另外指示，否則以下術語應理解成具有以下含義：術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白、蛋白片段、及蛋白序列之多肽類似物。多肽可為單體多肽或聚合多肽。

術語「單離蛋白」或「單離多肽」為蛋白或多肽，該蛋白或多肽由於其來源或衍生源而(1)不與在其天然態(native state)中伴隨其之天然締合組分締合，(2)沒有來自相同物種之其他蛋白，(3)由來自不同物種的細胞表現，或(4)不在自然界中存在。因此，化學合成或在不同於其天然來源細胞的細胞體系中合成之多肽將與其天然締合組分「單離」。亦可使用此項技術中熟知的蛋白純化技術，藉由單離使蛋白實質上不含天然締合組分。

當至少約60至75%的樣本表現出單一種多肽時，蛋白或多肽為「實質上純的」、「實質上同質的」、或「實質上經純化」。多肽或蛋白可為單體多肽或蛋白或者聚合多肽或蛋白。實質上純的多肽或蛋白應通常佔蛋白樣本之約50%、60%、70%、80%、或90% W/W，更通常約95%，且較佳應高於99%純。蛋白純度或同質性可藉由許多此項技術中熟知之手段指明，諸如將蛋白樣本進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，接著在用此項技術中熟知之染料將凝膠染色時使 單個多肽條帶可視化。出於某些目的，可藉由使用純化技術中熟知之HPLC或其他手段提供更高解析度。

如本文所用之術語「多肽片段」係指具有胺基端及/或羧基端缺失，但其中其餘胺基酸序列與天然存在之序列中之對應位置一致的多肽。在一些實施例中，片段為至少5、6、8、或10個胺基酸長。在其他實施例中，片段為至少14個胺基酸長，更佳為至少20個胺基酸長，通常為至少50個胺基酸長，甚至更佳為至少70、80、90、100、150、或200個胺基酸長。

如本文所用之術語「多肽類似物」係指包含至少25個胺基酸、與胺基酸序列之一部分具有實質的一致性且具有以下性質之至少一者的片段的多肽：(1)在合適的結合條件下特異性結合MAdCAM，(2)能夠抑制α₄β₇整合素及/或L-選擇素結合MAdCAM，或(3)能夠減少體外或體內MAdCAM細胞表面表現。通常，多肽類似物包含相對於天然存在之序列之保守胺基酸取代(或插入或缺失)。類似物通常為至少20個胺基酸長，較佳為至少50、60、70、80、90、100、150、或200個胺基酸長或更長，且可經常與全長天然存在之多肽一樣長。

較佳胺基酸取代為：(1)減少對蛋白水解的易感性，(2)減少對氧化的易感性，(3)改變形成蛋白複合物之結合親和性，(4)改變結合親和力，或(5)賦予或修改此類類似物之其他物理化學性質或功能性質的胺基酸取代。類似物可包括除天然存在之肽序列之外的序列之各種突變蛋白。例如，單個或多個胺基酸取代(較佳保守胺基酸取代)可在天然存在之序列(較佳在形成分子間接觸的(一或多個)結構域之外的多肽部分)中進行。保守胺基酸取代應不顯著改變親本序列之結構特徵(例如，置換胺基酸應不傾向於打破親本序列中存在之螺旋，或破壞表徵親本序列之其他類型的二級結構)。此項技術認可之多肽二級結構及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編，W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C. Branden及J.Tooze編，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；及Thornton等人，Nature,354：105(1991)，該等文獻各自以引用方式併入本文。

非肽類似物通常在製藥工業中用作藥物，其具有與模板肽之性質類似的性質。此等類型的非肽化合物稱為「肽模擬物」或「擬肽物」。Fauchere,J.Adv.Drug Res.,15：29(1986)；Veber及Freidinger,TINS,p.392(1985)；及Evans等人，J.Med.Chem.,30：1229(1987)，其以引用方式併入本文。此類化合物常常藉助於電腦化分子建模來開發。結構上類似於治療上實用之肽的肽模擬物可用於產生等效的治療或防治效果。通常，擬肽物在結構上類似於模範多肽(paradigm polypeptide)(即，具有所要的生物化學性質或藥理學活性之多肽)，諸如人類抗體，但具有一或多個視情況藉由此項技術中熟知之方法由諸如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH=CH-(順式及反式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-、及-CH₂SO-之鍵聯置換的肽鍵。用相同類型之D-胺基酸系統地取代共通序列之一或多個胺基酸(例如，D-離胺酸代替L-離胺酸)亦可用於產生更穩定的肽。此外，包含共通序列或實質上一致的共通序列變異之拘束肽(constrained peptide)可藉由此項技術中已知之方法(Rizo及Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，其以引用方式併入本文)生產；例如，藉由添加能夠形成分子內雙硫鍵使肽環化的內部半胱胺酸殘基。

「免疫球蛋白」為四聚體分子。在天然存在之免疫球蛋白中，各四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，各對具有一條「輕」鏈(約25kDa)及一條「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括具有約100至110個或更多個胺基酸之主要負責抗原識別的可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。將人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。將重鏈分類為μ、δ、γ、α、或ε，且將抗體之同型分別界定為IgM、IgD、IgG、IgA、及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區藉由約12或更多個胺基酸之「J」區接合，重鏈亦包括約10或更多個 胺基酸之「D」區。一般而言參見，Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.編，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))(出於所有目的，其以全文引用之方式併入)。各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整的免疫球蛋白具有兩個結合位點。

免疫球蛋白鏈表現出由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合之相對保守的架構區(FR)之相同一般結構。各對之兩條鏈之CDR藉由架構區比對以形成表位特異性結合位點。從N端至C端，輕鏈及重鏈兩者均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。根據Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987及1991))，或Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature,342：878-883(1989)之定義將胺基酸分配至各結構域，該等參考文獻之各者以全文引用之方式併入本文。

「抗體」係指完整的免疫球蛋白或其抗原結合部分，該抗原結合部分與完整抗體競爭特異性結合。在一些實施例中，抗體為其抗原結合部分。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由對完整抗體進行酶或化學切割來產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv、dAb及互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙價抗體(diabody)、及含有足以使多肽特異性結合抗原的至少一部分免疫球蛋白的多肽。Fab片段為由VL、VH、CL、及CH1結構域組成之單價片段；F(ab)₂片段為包含兩個在鉸鏈區由雙硫鍵鍵聯之Fab片段之二價片段；Fd片段由VH及CH1結構域組成；Fv片段由抗體單臂之VL及VH結構域組成；且dAb片段(Ward等人，Nature,341：544-546(1989))由VH結構域組成。

如本文所用，稱為例如1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.34.2、6.67.1、6.77.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、或X481.2之抗體為由相同名稱之融合瘤產生之 單株抗體。例如，抗體1.7.2由融合瘤1.7.2產生。稱為6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、7.26.4-mod、或X481.2之抗體為其序列已藉由定點誘變自其對應親本經修飾的單株抗體。

單鏈抗體(scFv)為VL及VH區經由能夠使其呈單蛋白鏈製備之合成接頭成對以形成單價分子的抗體(Bird等人，Science,242：423-426(1988)及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85：5879-5883(1988))。雙價抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL結構域於單一多肽鏈上表現，但使用太短而使相同鏈上之兩個結構域之間不能成對的接頭，從而迫使結構域與另一條鏈之互補結構域成對並產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)及Poljak,R.J.等人，Structure,2：1121-1123(1994))。來自本揭露之抗體之一或多個CDR可共價或非共價地併入至分子中以使其成為特異性結合MAdCAM之免疫黏附素。免疫黏附素可併入(一或多個)CDR作為較大多肽鏈之一部分，可將(一或多個)CDR共價連接至另一多肽鏈，或可非共價地併入(一或多個)CDR。CDR使免疫黏附素特異性結合特定目標抗原。

抗體可具有一或多個結合位點。若存在多於一個結合位點，則結合位點可彼此相同或可不同。例如，天然存在之免疫球蛋白具有兩個相同的結合位點，單鏈抗體或Fab片段具有一個結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體(雙價抗體)具有兩個不同的結合位點。

「單離抗體」為這樣的抗體，其(1)不與在其天然態下伴隨其之天然締合組分(包括其他天然締合之抗體)締合，(2)沒有來自相同物種之其他蛋白，(3)由來自不同物種的細胞表現，或(4)不在自然界中存在。單離抗體之實例包括使用MAdCAM親和純化之抗MAdCAM抗體、藉由融合瘤或其他細胞株體外產生之抗MAdCAM抗體、及衍生自基因轉殖哺乳動物或植物之人類抗MAdCAM抗體。

如本文所用，術語「人類抗體」意謂其中可變區及恆定區序列為人類序列之抗體。該術語涵蓋具有衍生自人類基因，但經改變成例如降低可能的免疫原性、增加親和力、消除可能引起不合需要之折疊的半胱胺酸或糖基化位點的序列之抗體。該術語涵蓋在非人類細胞中重組產生之此類抗體，非人類細胞可賦予人類細胞非典型的糖基化。該術語亦涵蓋在包含一些或所有人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之基因轉殖小鼠中產生之抗體。

在一個態樣中，本揭露提供一種人源化抗體。在一些實施例中，人源化抗體為衍生自非人類物種之抗體，其中在重鏈及輕鏈之架構結構域及恆定結構域中之某些胺基酸已經突變以避免或取消在人類中之免疫反應。在一些實施例中，人源化抗體可藉由將來自人類抗體之恆定結構域融合至非人類物種之可變結構域來生產。如何製備人源化抗體之實例可見於美國專利第6,054,297號、第5,886,152號、及第5,877,293號中。在一些實施例中，本揭露之人源化抗MAdCAM抗體包含本揭露之一或多種人類抗MAdCAM抗體之一或多個架構區之胺基酸序列。

在另一態樣中，本揭露提供一種「嵌合抗體」。在一些實施例中，嵌合抗體係指含有來自一種抗體之一或多個區及來自一或多種其他抗體之一或多個區的抗體。在一較佳實施例中，CDR之一或多者衍生自本揭露之人類抗MAdCAM抗體。在一更佳實施例中，全部CDR均衍生自本揭露之人類抗MAdCAM抗體。在另一較佳實施例中，來自多於一種本揭露之人類抗MAdCAM抗體之CDR在嵌合抗體中經混合且匹配。例如，嵌合抗體可包含來自第一人類抗MAdCAM抗體之輕鏈之CDR1，其可與來自第二人類抗MAdCAM抗體之輕鏈之CDR2及CDR3組合，且來自重鏈之CDR可衍生自第三MAdCAM抗體。此外，架構區可衍生自相同的抗MAdCAM抗體之一，衍生自一或多種不同的抗體(諸如人類抗體)，或衍生自人源化抗體。

「中和抗體」、「抑制性抗體」、或拮抗性抗體為抑制α₄β₇或表現α₄β₇之細胞、或任何其他同源配位體(cognate ligand)或表現同源配位體之細胞與MAdCAM之結合達至少約20%的抗體。在一較佳實施例中，抗體減少及/或抑制α₄β₇整合素或表現α₄β₇之細胞與MAdCAM之結合達至少40%，更佳60%，甚至更佳80%、85%、90%、95%、或100%。結合減少可藉由一般熟習此項技術者已知之任何手段測量，例如，如在體外競爭性結合檢定中所測量。測量表現α₄β₇之細胞與MAdCAM之結合之減少之實例呈現於實例I中。

一般熟習此項技術者可根據本說明書之教示容易地製備抗體之片段或類似物。較佳片段或類似物之胺基端及羧基端存在於功能結構域之邊界附近。結構及功能結構域可藉由將核苷酸及/或胺基酸序列資料與公開或專屬序列資料庫相比較來識別。較佳的是，使用電腦化比較法識別存在於具有已知結構及/或功能之其他蛋白中的序列基序或預測蛋白構形結構域。識別折疊成已知三維結構的蛋白序列的方法為已知的(Bowie等人，Science,253：164(1991))。

如本文所用，術語「表面電漿子共振」係指一種光學現象，其允許藉由偵測生物感測器基質內之蛋白濃度之改變來分析即時生物特異性相互作用，例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。對於進一步描述，參見Jonsson,U.等人，Ann.Biol.Clin.,51：19-26(1993)；Jonsson,U.等人，Biotechniques,11：620-627(1991)；Johnsson,B.等人，J.Mol.Recognit.,8：125-131(1995)；及Johnnson,B.等人，Anal.Biochem.,198：268-277(1991)。

術語「k_off」係指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率(off rate)常數。

術語「K_d」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數。當解離常數1μM，較佳100nM，且最佳10nM時，稱抗體結合抗原。

術語「表位」包括能夠特異性結合免疫球蛋白或T細胞受體或以其他方式與分子相互作用的任何蛋白決定子。表位決定子通常由分子之化學活性表面分組諸如胺基酸或碳水化合物側鏈組成且通常具有具體的三維結構特徵以及具體的電荷特徵。表位可為「線性的」或「構形的」。在線性表位中，蛋白與相互作用(諸如抗體)之間的所有相互作用點線性地沿該蛋白之一級胺基酸序列存在。在構形表位中，相互作用點跨越蛋白上彼此分離的胺基酸殘基存在。

如本文所用，20種習知胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren編，Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用方式併入本文。20種習知胺基酸、非天然胺基酸(諸如，α-,α-二取代胺基酸)、N-烷基胺基酸、乳酸、及其他非習知胺基酸之立體異構物(例如，D-胺基酸)亦可為本揭露之多肽之合適組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、s-N-甲基精胺酸、及其他類似胺基酸及亞胺酸(例如，4-羥基脯胺酸)。根據標準用法及慣例，在本文所用之多肽記號中，左手方向為胺基端方向，且右手方向為羧基端方向。

如本文提及之術語「多核苷酸」意謂長度至少10個鹼基的核苷酸(核糖核苷酸或去氧核苷酸、或任一類型核苷酸之修飾形式)之聚合形式。該術語包括單股及雙股形式的DNA。

如本文所用之術語「單離多核苷酸」應意謂基因體、cDNA、或合成來源之多核苷酸或其一些組合，該「單離多核苷酸」由於其來源而(1)不與在自然界中存在「單離多核苷酸」的全部或一部分多核苷酸締合，(2)可操作地連接在自然界中不與其連接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作為較大序列之一部分存在。

本文提及之術語「寡核苷酸」包括天然存在之核苷酸以及由天然存在及非天然存在之寡核苷酸鍵聯連接在一起的修飾核苷酸。寡核苷酸為一般包含長度200個鹼基或更少鹼基的多核苷酸子集。較佳的是，寡核苷酸之長度為10至60個鹼基，且較佳長度為12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40個鹼基。寡核苷酸通常為單股的，例如用於探針；但是寡核苷酸可為雙股的，例如用於基因突變體之構築。本揭露之寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。

本文提及之術語「天然存在之核苷酸」包括去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。本文提及之術語「修飾核苷酸」包括具有經修飾或取代之糖基及其類似者之核苷酸。本文提及之術語「寡核苷酸鍵聯」包括諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(磷光體oselenoate)、二硒代磷酸酯(磷光體odiselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(磷光體oanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)、胺基磷酸酯(磷光體oamidate)、及其類似者之寡核苷酸鍵聯。參見例如LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等人，Nucl.Acids Res.,16：3209(1988)；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design 6：539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，第87-108頁(F.Eckstein編，Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stec等人，美國專利第5,151,510號；Uhlmann及Peyman,Chemical Reviews,90：543(1990)，其揭露以引用方式併入本文。需要時，寡核苷酸可包括用於偵測之標記。

「可操作地連接之」序列包括鄰接目的基因之表現控制序列及以反式作用或在一距離處控制目的基因的表現控制序列。如本文所用之術語「表現控制序列」係指實現其所接合之編碼序列之表現及加工所必需的多核苷酸序列。表現控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子、及增強子序列；有效的RNA加工信號，諸如剪接及多腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；增 強轉譯效率的序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白穩定性的序列；及當需要時，增強蛋白分泌的序列。此類控制序列之性質取決於宿主生物而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點、及轉錄終止序列；在真核生物中，一般而言，此類控制序列包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括(在最小程度上)其存在為表現及加工所必需的所有組分，且亦可包括其存在為有利的額外組分，例如前導序列(leader sequence)及融合配偶體序列(fusion partner sequence)。

如本文所用之術語「載體」意欲指代核酸分子，其能夠運輸其已連接的另一核酸。一種類型的載體為「質體」，其係指內部可接合額外DNA區段的圓形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中額外DNA區段可接合病毒基因體。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞(例如，具有細菌複製起點之細菌載體，及附加型哺乳動物載體)中自體複製。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因體中，且因此連同宿主基因體一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因之表現。此類載體在本文稱為「重組表現載體」(或簡單地稱為「表現載體」)。一般而言，表現載體在重組DNA技術中之效用經常呈質體形式。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用，因為質體為最常用的載體形式。然而，本揭露意欲包括表現載體之此類其他形式，諸如病毒載體(例如，複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒)，其提供等效功能。

如本文所用，術語「重組宿主細胞」(或簡單地稱為「宿主細胞」)意欲指代已引入重組表現載體的細胞。應理解此類術語意欲不僅指特定受試者細胞，而且指此一細胞之子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而出現於隨後的繼代中，所以此子代實際上可不與親本細胞相同，但仍包括在如本文所用之術語「宿主細胞」之範疇內。

本文提及之術語「選擇性雜交」意謂可偵測地且特異性地結合。根據本揭露之多核苷酸、寡核苷酸、及其片段在使可偵測之與非特異性核酸結合之可感知量最小的雜交及洗滌條件下選擇性地與核酸股雜交。「高嚴格性」或「高度嚴格」條件可用於達成如此項技術中已知且本文討論之選擇性雜交條件。「高嚴格性」或「高度嚴格」條件之實例為以下方法，即在42℃之雜交溫度下，於6X SSPE或SSC、50%甲醯胺、5X丹哈特氏試劑(Denhardt's reagent)、0.5% SDS、100μg/ml變性分段的鮭魚精DNA之雜交緩衝液中將多核苷酸與另一核苷酸一起孵育12-16小時，其中一種核苷酸可固定於諸如膜之固體表面上，接著在55℃下使用1X SSC、0.5%SDS之洗滌緩衝液洗滌兩次。亦參見Sambrook等人，同上，第9.50-9.55頁。

核苷酸序列之上下文中之術語「百分比序列一致性」係指當針對最大對應進行比對時，兩條序列中相同的殘基。序列一致性比較之長度可超過至少約9個核苷酸、通常至少約18個核苷酸、更通常至少約24個核苷酸、通常至少約28個核苷酸、更通常至少約32個核苷酸，且較佳至少約36、48、或更多個核苷酸的一段序列。此項技術中已知有許多不同的可用於測量核苷酸序列一致性的演算法。例如，可使用FASTA、Gap、或Bestfit比較多核苷酸序列，其為Wisconsin程式包10.3版，Accelrys,San Diego,CA中之程式。FASTA(其包括例如程式FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與搜索序列之間的最佳重疊區之比對及百分比序列一致性(Pearson,Methods Enzymol.,183：63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.,132：185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.,266：227-258(1996)；Pearson,J.Mol.Biol.,276：71-84(1998)；其以引用方式併入本文)。除非另外指定，否則使用特定程式或演算法之預設參數。例如，核苷酸序列之間的百分比序列一致性可如Wisconsin程式包10.3版所提供使用FASTA以其預設參數(字長為6且NOPAM因子用於評分矩陣)或使用Gap以其預設參數來確定，其 以引用方式併入本文。

除非另外指明，否則對核苷酸序列的提及涵蓋其補體。因此，對具有特定序列之核酸分子之提及應該理解成涵蓋其互補鏈，具有其互補序列。

在分子生物學技術中，研究者可互換使用術語「百分比序列一致性」、「百分比序列類似性」、及「百分比序列同源性」。本申請案中，此等術語應該僅相對於核苷酸序列具有相同含義。

當指代核酸或其片段時，術語「實質類似性」或「實質序列類似性」指示，當在適當核苷酸插入或缺失之情況下與另一核酸(或其互補股)最佳地比對時，在至少約85%、較佳至少約90%、且更佳至少約95%、96%、97%、98%、或99%的核苷酸鹼基中有核苷酸序列一致性，如藉由任何熟知的序列一致性演算法所測量，諸如FASTA、BLAST、或Gap，如上文所討論。

當應用於多肽時，術語「實質一致性」意謂兩個肽序列當諸如藉由使用預設空隙加權值(gap weight)之程式GAP或BESTFIT經最佳比對時，具有至少75%或80%序列一致性，較佳至少90%或95%序列一致性，甚至更佳至少98%或99%序列一致性。較佳的是，不一致的殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」為其中胺基酸殘基由具有化學性質(例如，電荷或疏水性)類似的側鏈(R基)的另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白之功能性質。在二或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同的情況下，可上調百分比序列一致性或類似性程度以校正取代之保守性質。用於進行此調整之手段為熟習此項技術者所熟知。參見例如Pearson,Methods Mol.Biol.,24：307-31(1994)，其以引用方式併入本文。具有化學性質類似的側鏈之胺基酸之基團之實例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸、及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺 酸、及組胺酸；及6)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代基係：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸鹽-天冬胺酸鹽、及天冬醯胺-麩醯胺。

替代地，保守置換為在Gonnet等人，Science,256：1443-45(1992)中所揭示之PAM250對數可能性矩陣中具有正值的任何變化，該參考文獻以引用方式併入本文。「中等保守」置換為在PAM250對數可能性矩陣中據歐非負值的任何變化。

多肽之序列類似性通常使用序列分析軟體測量。蛋白質分析軟體使用分配至各種取代、缺失、及其他修飾(包括保守胺基酸取代)之類似性量度來匹配類似序列。例如，GCG含有諸如「Gap」及「Bestfit」之程式，其可以預設參數用於確定緊密相關多肽(諸如來自不同物種生物或野生型蛋白與其突變蛋白之間的同源多肽)之間的序列同源性或序列一致性。參見例如Wisconsin程式包10.3版。多肽序列亦可使用Wisconsin程式包10.3版中之程式FASTA比較，其使用預設或建議參數。FASTA(例如，FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與搜索序列之間的最佳重疊區之比對及百分比序列一致性(Pearson(1990)；Pearson(2000))。當將本揭露之序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比較時，另一較佳演算法為使用預設參數之電腦程式BLAST，特別是blastp或tblastn。參見例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)；其以引用方式併入本文。

比較同源性之多肽序列之長度應一般為至少約16個胺基酸殘基，通常至少約20個殘基，更通常至少約24個殘基，通常至少約28個殘基，且較佳多於約35個殘基。當搜索含有來自大量不同生物之序列之資料庫時，較佳比較胺基酸序列。

如本文所用，術語「標記」或「經標記」係指將另一分子併入抗體 中。在一個實施例中，標記為可偵測標誌物，例如，併入經放射標記之胺基酸或連接可藉由經標誌之卵白素(例如，含有可藉由光學或比色法偵測之螢光標誌物或酶活性之鏈親和素)偵測之生物素部分之多肽。在另一實施例中，標記或標誌物可為治療性的，例如，藥物綴合物或毒素。標記多肽及醣蛋白之各種方法為此項技術中己知的且可使用。多肽之標記之實例包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核種(例如，³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)、螢光標記(例如，FITC、玫瑰紅、鑭系磷光體)、酶標記(例如，山葵過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標誌物、生物素基、由二級報導分子識別之預定多肽表位(例如，白胺酸拉鍊對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)、磁性試劑(諸如釓螯合物)、毒素(諸如百日咳毒素)、紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌素D、溴化乙錠、吐根素、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙素、阿黴素、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米拉黴素(mithramycin)、放線菌素D、l-去氫睪固酮、糖皮質素、普羅卡因、四卡因、利多卡因、普萘洛爾(propranolol)、及嘌呤黴素以及其類似物或同源物。在一些實施例中，標記由各種長度的間隔臂連接以減少可能的位阻。

術語「試劑」在本文用於表示化合物、化合物之混合物、生物學巨分子、或由生物學材料製成之提取物。如本文所用之術語「藥品試劑或藥物」係指當向患者正確投與時能夠誘導所要治療效果的化合物或組成物。本文其他化學術語係根據此項技術中之習知用法使用，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.編，McGraw-Hill,San Francisco(1985))所例示，其以引用方式併入本文。

術語「消炎」劑或「免疫調節」劑在本文用於指代具有抑制受試者(包 括人類)之發炎(包括發炎性疾病)之功能性質的試劑。在本揭露之各種實施例中，發炎性疾病可為單不限於胃腸道之發炎性疾病，其包括克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、憩室病、胃炎、肝病、原發性膽道硬化、硬化性膽管炎。發炎性疾病亦包括但不限於腹部疾病(包括腹膜炎、闌尾炎、膽道疾病)、急性橫貫性脊髓炎、過敏性皮膚炎(包括過敏性皮膚、過敏性濕疹、皮膚特異反應、異位性濕疹、異位性皮膚炎、皮膚發炎、發炎性濕疹、發炎性皮膚炎、跳蚤皮膚、粟粒皮膚炎、粟粒濕疹、家塵蟎皮膚)、黏連性脊椎炎(萊特氏症候群(Reiters syndrome))、氣喘、氣道發炎、動脈粥樣硬化、動脈硬化、膽道閉鎖(biliary atresia)、膀胱發炎、乳癌、心血管發炎(包括血管炎、類風濕性甲摺梗塞(rheumatoid nail-fold infarct)、腿潰瘍、多發性肌炎、慢性血管發炎、心包炎、慢性阻塞性肺病)、慢性胰臟炎、神經周圍發炎、結腸炎(包括阿米巴性結腸炎、感染性結腸炎、細菌性結腸炎、克羅恩氏結腸炎、缺血性結腸炎、潰瘍性結腸炎、特發性直腸結腸炎、發炎性腸病、假膜性結腸炎)、膠原血管病症(類風溼性關節炎、SLE、進行性全身性硬化症、混合型結締組織病、糖尿病)、克羅恩氏病(局部性腸炎、肉芽腫性迴腸炎、迴結腸炎、消化系統發炎)、髓鞘脫失病(包括脊髓炎、多發性硬化症、彌漫性硬化症、急性彌漫性腦脊髓炎、靜脈周圍髓鞘脫失、維生素B12缺乏、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、MS相關反轉錄病毒)、皮肌炎、憩室炎、滲出性腹瀉、胃炎、肉芽腫性肝炎、肉芽腫性發炎、膽囊炎、胰島素依賴性糖尿病、肝臟發炎性疾病(肝纖維化原發性膽汁性肝硬化、肝炎、硬化性膽管炎)、肺部發炎(特發性肺纖維化、肺部嗜酸性球性肉芽腫、肺組織細胞增生症X、細支氣管周發炎、急性支氣管炎)、性病性淋巴肉芽腫、惡性黑色素瘤、口/牙疾病(包括牙齦炎、牙周病)、黏膜炎、肌肉骨骼系統發炎(肌炎)、非酒精性脂肪肝(非酒精性脂肪肝病)、眼及眶發炎(包括眼色素層炎、視神經炎、末梢類風濕性潰瘍、末梢角膜發炎)、骨關節炎、骨髓炎、咽部發炎、多發性關節炎、 直腸炎、牛皮癬、輻射傷害、類肉瘤病、鐮狀細胞necropathy、淺表血栓性靜脈炎、全身發炎性反應症候群、甲狀腺炎、全身性紅斑性狼瘡、移植物抗宿主病、急性燒傷、畢賽氏症候群(Behçet's syndrome)、修格連氏症候群(Sjögren's syndrome)。

術語患者及受試者包括人類及獸醫受試者。

人類抗MAdCAM抗體及其表徵

在一個實施例中，本揭露提供包含人類CDR序列之抗MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，本揭露提供人類抗MAdCAM抗體。在一些實施例中，藉由免疫非人類基因轉殖動物(例如，齧齒動物)來產生人類抗MAdCAM抗體，該等非人類基因轉殖動物之基因體包含人類免疫球蛋白基因，使得該基因轉殖動物產生人類抗體。在一些實施例中，本揭露提供一種不結合補體之抗MAdCAM抗體。

在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，抗MAdCAM包含輕鏈，其包含選自SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、或150(有或無信號序列)之胺基酸序列或該等胺基酸序列之任一者之可變區、或此等胺基酸序列之一或多個CDR。在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體包含重鏈，其包含選自SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、或148(有或無信號序列)之胺基酸序列、或該等胺基酸序列之可變區或一或多個CDR之胺基酸序列。本揭露中亦包括包含上文提及之序列之任一者之自CDR1開始至CDR3結束之胺基酸序列之人類抗MAdCAM抗體。本揭露進一步提供一種包含上文提及之序列之任一者之一或多個FR區之抗MAdCAM抗體。

本揭露進一步提供一種包含前文提及之胺基酸序列之抗MAdCAM抗體，該等胺基酸序列中已進行一或多個修飾。在一些實施例中，將抗體中可具有化學反應性的半胱胺酸經另一殘基取代，諸如但不限於丙胺酸或絲胺酸。在一個實施例中，取代為非經典(non-canonical)半胱胺酸。取代可在抗體之可變結構域之CDR或架構區中或在恆定結構域中進行。在一些實施例中，半胱胺酸為經典的。

在一些實施例中，進行胺基酸取代以消去抗體中可能的蛋白水解位點。此類位點可存在於抗體之可變結構域之CDR或架構區中或恆定結構域中。取代半胱胺酸殘基並移除蛋白水解位點可減少抗體產品中之異質性。在一些實施例中，形成可能的去醯胺位點的天冬醯胺-甘胺酸對可藉由改變該等殘基之一或兩者來消去。在一些實施例中，進行胺基酸取代以增加或移除本揭露之抗體之可變區中可能的糖基化位點。

在一些實施例中，本揭露之抗MAdCAM抗體之重鏈之C端離胺酸經切割。在本揭露之各種實施例中，抗MAdCAM抗體之重鏈及輕鏈可視情況包括信號序列。

在一個態樣中，本揭露提供12種抑制性人類抗MAdCAM單株抗體及產生該等單株抗體之融合瘤細胞株。表1列舉編碼全長重鏈及輕鏈(包括信號序列)之核酸及對應全長推斷胺基酸序列之序列識別符(SEQ ID NO：)。

在另一態樣中，本揭露提供某些上文識別之人類抗MAdCAM單株抗體之經修飾型式。表2列舉經修飾抗體之DNA及蛋白序列之序列識別符。

抗MAdCAM抗體之類別及亞類

抗體可為IgG、IgM、IgE、IgA、或IgD分子。在一較佳實施例中，抗體為IgG類且為IgG₁、IgG₂、IgG₃、或IgG₄亞類。在一更佳實施例中，抗MAdCAM抗體為亞類IgG2或IgG₄.在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為與抗體1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod相同類別及亞類，為IgG₂；或與抗體6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、或9.8.2相同類別及亞類，為IgG₄。

抗MAdCAM抗體之類別及亞類可藉由此項技術已知的任何方法確定。一般而言，抗體之類別及亞類可使用特異於特定類別及亞類抗體的抗體來確定。此類抗體可商購獲得。ELISA、西方墨點法、以及其他技術可確定類別及亞類。替代地，類別及亞類可藉由以下來確定：測序抗體重鏈及/或輕鏈之所有或部分恆定結構域，將其胺基酸序列與各種類別及亞類免疫球蛋白之已知胺基酸序列進行比較，及確定抗體之類別和亞類為顯示最高序列一致性的類別。

物種及分子選擇性

在本揭露之另一態樣中，抗MAdCAM抗體顯示物種及分子選擇性。在一個實施例中，抗MAdCAM抗體結合人類、食蟹獼猴、或狗MAdCAM。在一些實施例中，抗MAdCAM抗體不結合新世界猴物種，諸如絨猿。根據本說明書之教示，可以使用此項技術中熟知的方法確定抗MAdCAM抗體之物種選擇性。例如，可使用西方墨點法、FACS、ELISA、或免疫組織化學來確定物種選擇性。在一較佳實施例中，可使用免疫組織化學來確定物種選擇性。

在一些實施例中，特異性結合MAdCAM之抗MAdCAM抗體對MAdCAM的選擇性優於對VCAM、纖連蛋白、或任何其他抗原的選擇性至少10倍、較佳至少20、30、40、50、60、70、80、或90倍，更佳至少100倍。在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體不表現出任何可感知的與VCAM、纖連蛋白、或除MAdCAM之外的任何其他抗原之結合。可根據本說明書之教示，使用此項技術中熟知的方法確定抗MAdCAM抗體對MAdCAM之選擇性。例如，可使用西方墨點法、FACS、ELISA、或免疫組織化學來確定選擇性。

抗MAdCAM抗體對MAdCAM之結合親和力

在本揭露之另一態樣中，抗MAdCAM抗體以高親和力特異性結合MAdCAM。在一個實施例中，抗MAdCAM抗體以3×10^-8M或更小之K_d特異性結合MAdCAM，如藉由表面電漿子共振諸如BIAcore所測量。在更佳實施例 中，抗體以1×10^-8或更小或1×10^-9M或更小之K_d特異性結合MAdCAM。在一甚至更佳實施例中，抗體以1×10^-10M或更小之K_d特異性結合MAdCAM。在其他較佳實施例中，本揭露之抗體以2.66×10^-10M或更小、2.35×10^-11M或更小、或9×10^-12M或更小之K_d特異性結合MAdCAM。在另一較佳實施例中，抗體以1×10^-11M或更小之K_d特異性結合MAdCAM。在另一較佳實施例中，抗體以與選自以下之抗體實質上相同的K_d特異性結合MAdCAM：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。與相同實驗中參考抗體之K_d比較，具有與參考抗體「實質上相同的K_d」之抗體之K_d為±100pM，較佳±50pM，更佳±20pM，依然更佳±10pM、±5pM、或±2pM。在另一較佳實施例中，抗體以與包含來自選自以下之抗體之一或多個可變結構域或一或多個CDR之抗體實質上相同的K_d結合MAdCAM：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，抗體以與包含選自以下之胺基酸序列之一或其可變結構域之抗體實質上相同的K_d結合MAdCAM：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148、或450(有或無信號序列)。在另一較佳實施例中，抗體以與包含來自包含選自以下之胺基酸序列之抗體之一或多個CDR之抗體實質上相同的K_d結合MAdCAM：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148、或450。

抗MAdCAM抗體與MAdCAM之結合親和力可藉由此項技術中已知的任何方法確定。在一個實施例中，結合親和力可藉由競爭性ELISA、RIA、或 表面電漿子共振諸如BIAcore來測量。在一更佳實施例中，藉由表面電漿子共振測量結合親和力。在一甚至更佳實施例中，使用BIAcore測量結合親和力及解離速率。確定結合親和力之實例描述於以下實例II中。

抗MAdCAM抗體之半衰期

根據本揭露之目標，抗MAdCAM抗體在體內或體外之半衰期為至少一天。在一較佳實施例中，抗體或其部分之半衰期為至少三天。在一更佳實施例中，抗體或其部分之半衰期為四天或更長時間。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為八天或更長時間。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾，使得其半衰期更長，如下文所討論。在另一較佳實施例中，抗體可含有增加血清半衰期之點突變，諸如2000年2月24日公佈之WO 00/09560所述。

抗體半衰期可藉由一般熟習此項技術者已知的任何手段測量。例如，抗體半衰期可藉由西方墨點法、ELISA、或RIA歷經適當的時間段來測量。可在任何適當動物諸如靈長類動物例如食蟹獼猴或人類中測量抗體半衰期。

抗MAdCAM抗體識別之MAdCAM表位之識別

本揭露亦提供結合與本文所提供之人類抗MAdCAM抗體相同的抗原或表位的人類抗MAdCAM抗體。此外，本揭露提供與人類抗MAdCAM抗體競爭或交叉競爭的人類抗MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，人類抗MAdCAM抗體為1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，人類抗MAdCAM抗體包含來自選自以下之抗體之一或多個可變結構域或一或多個CDR：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，人 類抗MAdCAM抗體包含選自以下之胺基酸序列之一或其可變結構域：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148、或150(有或無信號序列)。在另一較佳實施例中，人類抗MAdCAM抗體包含來自包含選自以下之胺基酸序列之一的抗體之一或多個CDR：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148、或150。在一高度較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為另一人類抗體。

可使用多種此項技術中已知的方法確定抗MAdCAM抗體是否結合與另一抗MAdCAM抗體相同的抗原。例如，可使用已知的抗MAdCAM抗體捕獲抗原，將抗原自抗MAdCAM抗體溶離，然後確定測試抗體是否將結合溶離之抗原。可藉由在飽和條件下使抗MAdCAM抗體結合MAdCAM，然後測量測試抗體結合MAdCAM之能力來確定抗體是否與抗MAdCAM抗體競爭。若測試抗體能夠在與抗MAdCAM抗體相同的時間結合MAdCAM，則測試抗體結合與抗MAdCAM抗體不同的表位。然而，若測試抗體不能在相同的時間結合MAdCAM，則測試抗體與人類抗MAdCAM抗體競爭。此實驗可使用ELISA或表面電漿子共振或較佳BIAcore進行。為測試抗MAdCAM抗體是否與另一抗MAdCAM抗體交叉競爭，可在兩個方向上使用上文所述之競爭方法，即確定已知抗體是否阻斷測試抗體，且反之亦然。

輕鏈及重鏈基因用法

本揭露亦提供包含由人類κ基因編碼之輕鏈可變區之抗MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，輕鏈可變區由人類Vκ A2、A3、A26、B3、O12、或O18基因家族編碼。在各種實施例中，輕鏈包含不多於11個、不多於6個、或不多於3個從生殖系人類Vκ A2、A3、A26、B3、O12、或O18序列的胺基酸取 代。在一較佳實施例中，胺基酸取代為保守取代。

SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、及150提供13種抗MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2及X481.2之全長κ輕鏈之胺基酸序列。圖1K-1T為12種抗MAdCAM抗體之輕鏈可變結構域之胺基酸序列與其從中衍生之生殖系序列之比對。圖2A顯示12種抗MAdCAM抗體之κ輕鏈之輕鏈可變結構域之胺基酸序列彼此之間的比對。根據本說明書之教示，一般熟習此項技術者可確定額外抗MAdCAM抗體之生殖系序列與抗體序列之間的差異。SEQ ID NO：54、58、62、66、或68提供5種額外抗MAdCAM抗體6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod之全長κ輕鏈之胺基酸序列，該等抗體分別由其親本抗MAdCAM抗體6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、或7.26.4藉由胺基酸取代來修飾。

在一較佳實施例中，相對於生殖系胺基酸序列，抗MAdCAM抗體之VL含有與以下抗體之VL之任何一或多者相同的突變：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。本揭露包括利用與例示抗體相同的人類Vκ及人類Jk基因的抗MAdCAM抗體。在一些實施例中，抗體包含一或多個與一或多種例示抗體相同的自生殖系的突變。在一些實施例中，抗體在與一或多種例示抗體相同的一或多個位置包含不同的取代。例如，抗MAdCAM抗體之VL可含有一或多個與抗體7.16.6中存在之胺基酸取代相同的胺基酸取代，及另一與抗體7.26.4相同的胺基酸取代。以此方式，可混合且匹配抗體結合之不同特徵以改變例如抗體對MAdCAM之親和力或其自抗原之解離速率。在另一實施例中，突變係在與抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、 6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之VL之任何一或多者中發現之位置相同的位置中進行，但進行保守胺基酸取代而不是使用相同胺基酸。例如，若與生殖系相比，抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之一中的胺基酸取代為麩胺酸，則可保守地取代天冬胺酸。類似地，若胺基酸取代為絲胺酸，則可保守地取代蘇胺酸。

在另一較佳實施例中，輕鏈包含與1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之VL之胺基酸序列相同的胺基酸序列。在另一高度較佳實施例中，輕鏈包含與1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之輕鏈之CDR區相同的胺基酸序列。在另一較佳實施例中，輕鏈包含具有1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之輕鏈之至少一個CDR區之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，輕鏈包含具有來自利用相同V_K及J_K基因之不同輕鏈的CDR的胺基酸序列。在一更佳實施例中，來自不同輕鏈之CDR係獲自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，輕鏈包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、64、66、68、或150，有或無信號序列。在另一實施例中，輕鏈包含由以下編碼之胺基酸序列：選自SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65、或67(有或無信號序列)之核苷酸序列；或編碼與其相比具有1-11個胺 基酸插入、缺失、或取代之胺基酸序列的核苷酸序列。較佳的是，胺基酸取代為保守胺基酸取代。在另一實施例中，抗體或其部分包含λ輕鏈。

本揭露亦提供包含人類VH基因序列或衍生自人類VH基因之序列的抗MAdCAM抗體或其部分。在一個實施例中，重鏈胺基酸序列衍生自人類VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33、或4-4基因家族。在各種實施例中，重鏈包含不多於15個、不多於6個、或不多於3個自生殖系人類VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33、或4-4基因序列的胺基酸變化。

SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、及148提供13種抗MAdCAM抗體之全長重鏈之胺基酸序列。圖1A-1J為12種抗MAdCAM抗體之重鏈可變區之胺基酸序列與其從中衍生之生殖系序列之比對。圖2B顯示12種抗MAdCAM抗體之重鏈可變區之胺基酸序列彼此之間的比對。根據本說明書之教示及本揭露之核苷酸序列，一般熟習此項技術者可確定12種抗MAdCAM重鏈及生殖系重鏈之編碼胺基酸序列，且確定生殖系序列與抗體序列之間的差異。SEQ ID NO：52、56、60、或64提供抗MAdCAM抗體6.22.2-mod、6.34.2-mod、及6.67.1-mod之全長重鏈之胺基酸序列，該等抗體分別由其親本抗MAdCAM抗體6.22.2、6.34.2、及6.67.1藉由胺基酸取代來修飾。另一種經修飾抗MAdCAM抗體7.26.4-mod具有SEQ ID NO：42之全長重鏈胺基酸序列。

在一較佳實施例中，相對於生殖系胺基酸序列，抗MAdCAM抗體之VH含有與以下抗體之VH之任何一或多者相同的突變：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。與上文所討論者類似，抗體包含一或多個與一或多種例示抗體相同的自生殖系的突變。在一些實施例中，抗體在與一或多種例示抗體相同的一或多個位置包含不同的取 代。例如，抗MAdCAM抗體之VH可含有一或多個與抗體7.16.6中存在之胺基酸取代相同的胺基酸取代，及另一與抗體7.26.4相同的胺基酸取代。以此方式，可混合且匹配抗體結合之不同特徵以改變例如抗體對MAdCAM之親和力或其自抗原之解離速率。在另一實施例中，與生殖系相比，胺基酸取代係在與參考抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之VH之任何一或多者中發現的自生殖系之取代相同的位置進行，但該位置係用不同殘基取代，其與參考抗體相比為保守取代。

在另一較佳實施例中，重鏈包含與1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之VH之胺基酸序列相同的胺基酸序列。在另一高度較佳實施例中，重鏈包含與1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之重鏈之CDR區相同的胺基酸序列。在另一較佳實施例中，重鏈包含來自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.4、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之重鏈之至少一個CDR區之胺基酸序列。在另一較佳實施例中，重鏈包含具有來自不同重鏈之CDR之胺基酸序列。在一更佳實施例中，來自不同重鏈之CDR係獲自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod。在另一較佳實施例中，重鏈包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、或148，有或無信號序列。在另一實施例中，重鏈包含由以下編碼之胺基酸序列：選自SEQ ID NO：1、5、9、 13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、或149之核苷酸序列；或編碼與其相比具有1-15個胺基酸插入、缺失、或取代之胺基酸序列的核苷酸序列。在另一實施例中，取代為保守胺基酸取代。

產生抗體及產生抗體之細胞株之方法 免疫

在本揭露之一個實施例中，藉由用MAdCAM抗原免疫包含一些或全部人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之非人類動物來產生人類抗體。在一較佳實施例中，非人類動物為XENOMOUSE^TM動物，其為包含人類免疫球蛋白基因座之大片段且在小鼠抗體產生方面有缺陷的經工程改造之小鼠品系。參見例如Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)以及美國專利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、及6,130,364。亦參見WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096及WO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 0009560、及WO 00/037504。XENOMOUSE ^TM動物產生類似成人的完全人類抗體之人類所有組成成分且產生抗原特異性人類mAb。第二代XENOMOUSE ^TM動物透過引入百萬鹼基(megabase)大小的人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之生殖系構型YAC片段而含有約80%人類抗體V基因所有組成成分。在其他實施例中，XENOMOUSE ^TM小鼠含有約全部人類重鏈及λ輕鏈基因座。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)，Green及Jakobovits,J.Exp.Mea.188：483-495(1998)，其揭露據此以引用方式併入。

本揭露亦提供用於藉由免疫包含人類免疫球蛋白基因座之非人類基因轉殖動物而從非人類、非小鼠動物製成抗MAdCAM抗體之方法。可使用上文剛剛描述之方法產生此類動物。此等文件中揭示之方法可如美國專利5,994,619(”‘619專利”)中所述進行修改，該案以引用方式併入本文。‘619專利描述用於產 生新穎培養內細胞團(CICM)細胞及細胞株(其衍生自豬及奶牛)，以及異源DNA已經插入其中的基因轉殖CICM細胞之方法。CICM基因轉殖細胞可用於產生選殖基因轉殖胚胎、胎兒、及後代。‘619專利亦描述產生能夠傳遞異源DNA至其子代的基因轉殖動物的方法。在一較佳實施例中，非人類動物可為大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、或馬。

在另一實施例中，包含人類免疫球蛋白基因座之非人類動物為具有人類免疫球蛋白之「微小基因座(minilocus)」的動物。在微小基因座方法中，透過納入來自Ig基因座的個別基因來模擬外源Ig基因座。因此，將一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、(一或多個)μ恆定結構域、及(一或多個)第二恆定結構域(較佳(一或多個)γ恆定結構域)形成為構築體用於插入至動物中。此方法尤其描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,591,669號、第5,612,205號、第5,721,367號、第5,789,215號、及第5,643,763號，其據此以引用方式併入。

微小基因座方法之優勢為迅速，包括Ig基因座部分之構築體可迅速產生並引入至動物中。然而，微小基因座方法之一潛在缺點為可能沒有足夠的免疫球蛋白多樣性支持完全B細胞發育，使得抗體產生可能較低。

為了產生人類抗MAdCAM抗體，用MAdCAM抗原免疫包含一些或全部人類免疫球蛋白基因座之非人類動物並從動物中單離出抗體或產生抗體之細胞。MAdCAM抗原可為經單離及/或純化之MAdCAM且較佳為人類MAdCAM。在另一實施例中，MAdCAM抗原為MAdCAM片段，較佳為MAdCAM之細胞外結構域。在另一實施例中，MAdCAM抗原為包含至少一個MAdCAM表位之片段。在另一實施例中，MAdCAM抗原為在其細胞表面表現MAdCAM之細胞，較佳為在其細胞表面過量表現MAdCAM之細胞。

免疫動物可藉由此項技術中已知的任何方法進行。參見例如Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor Press(1990)。用於免疫非人類動物諸如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、及馬之方法為此項技術中熟知的。參見例如Harlow及Lane以及美國專利5,994,619。在一較佳實施例中，將MAdCAM抗原與佐劑一起投與以刺激免疫反應。此類佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、RIBI(胞壁醯二肽)、或ISCOM(免疫刺激複合物)。此類佐劑可藉由於局部沉積中隔離多肽來保護多肽免於迅速分散，或其可含有刺激宿主分泌對巨噬細胞及免疫系統之其他組分具有趨化性的因子的物質。較佳的是，若投與多肽，則免疫排程將涉及二或多次多肽之投與，在數週內展開。

實例I提供用於在磷酸鹽水中用全長人類MAdCAM免疫XENOMOUSE ^TM動物之方案。

抗體及產生抗體之細胞株之產生

用MAdCAM抗原免疫動物之後，可自該動物獲得抗體及/或產生抗體之細胞。藉由將動物放血後殺死來從動物獲得含有抗MAdCAM抗體之血清。血清可如其自動物獲得那樣使用，可自血清獲得免疫球蛋白部分，或可自血清純化抗MAdCAM抗體。

在另一實施例中，可自經免疫動物製備產生抗體之永生化細胞株。免疫之後，將動物殺死且使用此項技術中熟知的方法將B細胞永生化。將細胞永生化之方法包括但不限於：將其用致癌基因轉染；將其用致癌性病毒感染且將其在選擇永生化細胞之條件下培養；使其經歷誘癌或突變化合物；將其與永生化細胞例如骨髓瘤細胞融合；及使腫瘤抑制基因失活。參見例如Harlow及Lane，同上。在涉及骨髓瘤細胞之實施例中，骨髓瘤細胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌細胞株)。永生化及抗生素選擇之後，使用MAdCAM、其一部分、或表 現MAdCAM之細胞篩選出永生化細胞或其培養上清液。在一較佳實施例中，初次篩選係使用酶聯免疫分析法(ELISA)或放射免疫分析法(RIA)進行，較佳使用ELISA進行。ELISA篩選之實例提供於PCT公開案第WO 00/37504號中，其以引用方式併入本文。

在另一實施例中，可自患有自體免疫病症及表現抗MAdCAM抗體之人類製備產生抗體之細胞。表現抗MAdCAM抗體之細胞可藉由單離出白血球並使其經歷螢光活化細胞分選(FACS)或藉由在塗佈有MAdCAM或其部分之平板上淘洗來單離。可將此等細胞與人類非分泌骨髓瘤融合以產生表現人類抗MAdCAM抗體之人類融合瘤。一般而言，此為一次較佳實施例，因為有可能抗MAdCAM抗體對MAdCAM具有低親和力。

對產生抗MAdCAM抗體之細胞例如融合瘤進行選擇、選殖、並進一步篩選出合乎需要的特徵，包括穩健的細胞生長、高的抗體產生、及合乎需要的抗體特徵，如下文所進一步討論。融合瘤可在同系動物體內、在缺乏免疫系統之動物例如裸鼠中、或體外在細胞培養中培養及擴充。選擇、選殖、及擴充融合瘤之方法為一般熟習此項技術者熟知的。

較佳的是，經免疫動物為表現人類免疫球蛋白基因之非人類動物，且將脾B細胞融合至衍生自與該非人類動物相同物種的骨髓瘤。更佳的是，經免疫動物為XENOMOUSE^TM動物，且骨髓瘤細胞株為非分泌小鼠骨髓瘤，諸如骨髓瘤細胞株為P3-X63-AG8-653(ATCC)。參見例如實例I。

因此，在一個實施例中，本揭露提供用於產生能產生關於MAdCAM之人類單株抗體或其片段的細胞株的方法，其包含(a)用MAdCAM、MAdCAM之一部分、或表現MAdCAM之細胞或組織免疫本文所述之非人類基因轉殖動物；(b)使該基因轉殖動物發動對MAdCAM之免疫反應；(c)自基因轉殖動物單離出產生抗體之細胞；(d)使產生抗體之細胞永生化；(e)建立經永生化之產生抗 體之細胞之個別單株群體；及(f)篩選出經永生化之產生抗體之細胞或其培養上清液以識別針對關於MAdCAM之抗體。

在一個態樣中，本揭露提供產生人類抗MAdCAM抗體之融合瘤。在一較佳實施例中，融合瘤為小鼠融合瘤，如上文所述。在另一實施例中，融合瘤產生於非人類、非小鼠物種，諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、或馬。在另一實施例中，融合瘤為人類融合瘤，其中人類非分泌骨髓瘤與表現抗MAdCAM抗體之人類細胞融合。

核酸、載體、宿主細胞、及製備抗體之重組方法 核酸

提供編碼本揭露之抗MAdCAM抗體之核酸分子。在一個實施例中，核酸分子編碼抗MAdCAM免疫球蛋白之重鏈及/或輕鏈。在一較佳實施例中，單個核酸分子編碼抗MAdCAM免疫球蛋白之重鏈，且另一核酸分子編碼抗MAdCAM免疫球蛋白之輕鏈。在一更佳實施例中，經編碼之免疫球蛋白為人類免疫球蛋白，較佳為人類IgG。經編碼之輕鏈可為λ鏈或κ鏈，較佳為κ鏈。

在較佳實施例中，編碼輕鏈之可變區之核酸分子包含人類Vκ A2、A3、A26、B3、O12、或O18基因之生殖系序列或該序列之變異體。在一較佳實施例中，編碼輕鏈之核酸分子包含衍生自人類Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、或Jκ5基因之序列。在一較佳實施例中，編碼輕鏈之核酸分子編碼不多於11個自生殖系A2、A3、A26、B3、O12、或O18 Vκ基因之胺基酸變化，較佳不多於6個胺基酸變化，且甚至更佳不多於3個胺基酸變化。在一更佳實施例中，編碼輕鏈之核酸為生殖系序列。

本揭露提供編碼與生殖系序列相比含有至多11個胺基酸變化的輕鏈可變區(VL)的核酸分子，其中胺基酸變化與抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、 6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之一之VL自生殖系序列的胺基酸變化一致。本揭露亦提供包含編碼1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之輕鏈可變區之胺基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。本揭露亦提供包含編碼1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之任一輕鏈之一或多個CDR之胺基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。在一較佳實施例中，核酸分子包含編碼1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之任一輕鏈之全部CDR之胺基酸序列的核苷酸序列。在另一實施例中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150之一之胺基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65、或67之一之核苷酸序列。在另一較佳實施例中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150之任一者之一或多個CDR之胺基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65、或67之任一者之一或多個CDR之核苷酸序列。在一更佳實施例中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150之任一者之全部CDR之胺基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65、或67之任一者之全部CDR之核苷酸序列。

本揭露亦提供編碼VL之胺基酸序列的核酸分子，該VL具有與上文 所述之VL，特別是與包含SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、或150之一之胺基酸序列的VL，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%一致的胺基酸序列。本揭露亦提供與SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65、或67之一之核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%一致的核苷酸序列。

在另一實施例中，本揭露提供在高度嚴格條件下與編碼如上文所述之VL之核酸分子，特別是包含編碼SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150之胺基酸序列的核苷酸序列的核酸，分子雜交的核酸分子。本揭露亦提供在高度嚴格條件下與包含SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65、或67之一之核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸分子。

本揭露亦提供編碼利用人類VH1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33、或4-4VH基因的重鏈可變區(VH)的核酸分子。在一些實施例中，編碼VH基因之核酸分子進一步利用人類JH4或JH6家族基因。在一些實施例中，編碼VH基因之核酸分子利用人類JH4b或JH6b基因。在另一實施例中，核酸分子包含衍生自人類D3-10、4-23、5-5、6-6、或6-19基因之序列。在一甚至更佳實施例中，編碼VH之核酸分子含有不多於15個自生殖系VH1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33、或4-4基因之胺基酸變化，較佳不多於6個胺基酸變化，且甚至更佳不多於3個胺基酸變化。在一高度較佳實施例中，與生殖系序列相比，編碼VH之核酸分子含有至少一個胺基酸變化，其中胺基酸變化與抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之一之重鏈自生殖系序列的胺基酸變化一致。在一甚至更佳實施例中，VH與生殖系 相比含有不多於15個胺基酸變化，其中該等變化與抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之一之VH自生殖系序列的變化一致。

在一個實施例中，核酸分子包含編碼1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之VH之胺基酸序列的核苷酸序列。在另一實施例中，核酸分子包含編碼1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之重鏈之一或多個CDR之胺基酸序列的核苷酸序列。在一較佳實施例中，核酸分子包含編碼1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之重鏈之全部CDR之胺基酸序列的核苷酸序列。在另一較佳實施例中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、或148之一之胺基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、或149之一之核苷酸序列的核苷酸序列。在另一較佳實施例中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、或148之任一者之一或多個CDR之胺基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、或149之任一者之一或多個CDR之核苷酸序列。在一較佳實施例中，核酸分子包含編碼SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、148之任一者之全部CDR之胺基酸序列的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：1、5、9、 13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、或149之任一者之全部CDR之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸分子包含編碼任何上文體提及之抗MAdCAM抗體之重鏈或輕鏈自CDR1開始至CDR3結束的連續區的核苷酸序列。

在另一實施例中，核酸分子編碼VH之胺基酸序列，該VH與如上文剛剛描述之編碼VH之胺基酸序列之一，特別是與包含SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、或64之一的胺基酸序列之VH，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%一致。本揭露亦提供與SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、或149之一之核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%一致的核苷酸序列。

在另一實施例中，編碼VH之核酸分子為在高度嚴格條件下與如上文所述之編碼VH之核苷酸序列雜交的核酸分子，特別是與包含SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、或148之一的胺基酸序列的VH雜交的核酸分子。本揭露亦提供在高度嚴格條件下與包含SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、149之一之核苷酸序列的核酸分子雜交的編碼VH的核苷酸序列。

編碼抗MAdCAM抗體之全部重鏈及輕鏈之一或兩者或其可變區的核苷酸序列可從產生抗MAdCAM抗體之任何來源獲得。單離出編碼抗體之mRNA之方法為此項技術中熟知的。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。mRNA可用於產生cDNA以用於聚合酶鏈式反應(PCR)或cDNA選殖抗體基因。在本揭露之一個實施例中，核酸分子可獲自如上文所述之表現抗MAdCAM抗體之融合瘤，較佳具有作為其融合配偶體之一的表現人類免 疫球蛋白基因的基因轉殖動物細胞的融合瘤，基因轉殖動物諸如XENOMOUSE^TM動物、非人類小鼠基因轉殖動物、或非人類非小鼠基因轉殖動物。在另一實施例中，融合瘤衍生自非人類非基因轉殖動物，其可用於例如人源化抗體。

編碼抗MAdCAM抗體之完整重鏈之核酸分子可藉由將編碼重鏈完整可變結構域或其抗原結合結構域之核酸分子與重鏈恆定結構域融合來構築。類似地，編碼抗MAdCAM抗體之輕鏈之核酸分子可藉由將編碼輕鏈可變結構域或其抗原結合結構域之核酸分子與輕鏈恆定結構域融合來構築。編碼VH及VL區之核酸分子可藉由將其插入至分別已經編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區的表現載體，使得VH片段可操作地連接載體內的(一或多個)重鏈恆定區(CH)片段且VL片段可操作地連接載體內的輕鏈恆定區(CL)片段來轉化為全長抗體基因。替代地，藉由使用標準分子生物學技術將編碼VH鏈之核酸分子連接(例如，接合)編碼CH鏈之核酸分子來將編碼VH或VL鏈之核酸分子轉化成全長抗體基因。使用編碼VL及CL鏈之核酸分子可達成相同結果。人類重鏈及輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的。參見例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版號91-3242(1991)。編碼全長重鏈及/或輕鏈之核酸分子可隨後自已引入該等核酸分子之細胞表現，且單離出抗MAdCAM抗體。

在一較佳實施例中，編碼重鏈可變區之核酸編碼SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、或148之胺基酸序列之可變區，且編碼輕鏈可變區之核酸分子編碼SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、或150之胺基酸序列之可變區。

在一個實施例中，編碼抗MAdCAM抗體重鏈或其抗原結合部分或者抗MAdCAM抗體輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子可自表現人類免疫球蛋 白基因且用MAdCAM抗原免疫之非人類非小鼠動物單離。在其他實施例中，核酸分子可自衍生自非基因轉殖動物或衍生自產生抗MAdCAM抗體之人類患者的產生抗MAdCAM抗體之細胞單離。來自產生MAdCAM抗體之細胞之mRNA可藉由標準技術單離，使用PCR及文庫構築技術進行選殖及/或擴增，且使用標準方案篩選以獲得編碼抗MAdCAM重鏈及輕鏈之核酸分子。

如下文所述，核酸分子可用於重組表現大量抗MAdCAM抗體。核酸分子亦可用於產生嵌合抗體、單鏈抗體、免疫黏附素、雙價抗體、突變抗體、及抗體衍生物，如下文進一步所述。若核酸分子衍生自非人類非基因轉殖動物，則核酸分子可用於抗體人源化，亦如下文所述。

在另一實施例中，本揭露之核酸分子可用作具體抗體序列之探針或PCR引物。例如，核酸分子探針可用於診斷方法，或核酸分子PCR引物可用於擴增DNA區，該DNA區尤其可用於單離用於產生抗MAdCAM抗體可變結構域之核苷酸序列。在一較佳實施例中，核酸分子為寡核苷酸。在一更佳實施例中，寡核苷酸來自目標抗體之重鏈及輕鏈高變區。在一甚至更佳實施例中，寡核苷酸編碼一或多個CDR之全部或部分。

載體

本揭露提供包含編碼重鏈或其抗原結合部分之本揭露之核酸分子的載體。本揭露亦提供包含編碼輕鏈或其抗原結合部分之本揭露之核酸分子的載體。本揭露亦提供包含編碼融合蛋白、經修飾抗體、抗體片段、及其探針之核酸分子的載體。

為表現本揭露之抗體或抗體部分，將如上文所述獲得之編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入之表現載體中，使得基因可操作地連接轉錄及轉譯控制序列。表現載體包括質體、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、植物病毒諸如花椰菜鑲嵌病毒、菸草鑲嵌病毒、黏接質體、YAC、EBV衍生游離基 因體、及其類似者。將抗體基因接合至載體中，使得載體內的轉錄及轉譯控制序列發揮其預期之調節抗體基因之轉錄及轉移的功能。選擇表現載體及表現控制序列以與所用之表現宿主細胞相容。抗體輕鏈基因抗體重鏈基因可插入至單獨的載體中。在一較佳實施例中，兩種基因均插入至相同表現載體中。藉由標準方法(例如，接合抗體基因片段及載體上之互補限制位點，或如果不存在限制位點則進行鈍端接合)將抗體基因插入至表現載體中。

便利的載體為編碼功能完全的人類CH或CL免疫球蛋白序列的載體，利用經工程改造之適當的限制位點使得任何VH或VL序列可容易地插入且表現，如上文所述。在此類載體中，剪接通常發生在插入之J區之剪接供體位點與人類C區之前的剪接受體位點之間，且亦發生在人類CH外顯子內存在的剪接區。多腺苷酸化及轉錄終止發生在編碼區下游的天然染色體位點。重組表現載體亦可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌的信號肽。抗體鏈基因可選殖至載體中，使得信號肽以符合讀框之方式連接抗體鏈基因之胺基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的信號肽)。

除抗體鏈基因之外，本揭露之重組表現載體攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現的調節序列。熟習此項技術者應瞭解，表現載體照顧設計，包括對調節序列的選擇，可取決於諸如欲轉化之宿主細胞的選擇、所要的蛋白表現水準等因素。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調節序列包括指導哺乳動物細胞中高水準蛋白表現的病毒元件，諸如衍生自反轉錄病毒LTR、巨細胞病毒(CMV)(諸如CMV啟動子/增強子)、猴病毒40(SV40)(諸如SV40動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤及強哺乳動物啟動子諸如天然免疫球蛋白及肌動蛋白啟動子之啟動子及/或增強子。對於進一步描述病毒調節元件及其序列，參見例如美國專利第5,168,062號、第4,510,245號、及第4,968,615號，其各自據此以引用方式併入。用於在植物中表現抗體之方法，包 括對啟動子及載體之描述，以及植物之轉化為此項技術中已知的。參見例如美國專利6,517,529。在細菌細胞或真菌細胞例如酵母細胞中表現多肽之方法亦為此項技術中熟知的。

除抗體鏈基因及調節序列之外，本揭露之重組表現載體可攜帶額外的序列，諸如調節載體在宿主細胞中複製的序列(例如，複製起點)及可選擇之標誌基因。可選擇之標誌基因促進已引入載體之宿主細胞的選擇(參見例如，美國專利第4,399,216號、第4,634,665號、及第5,179,017號)。例如，通常可選擇之標誌基因賦予已引入載體之宿主細胞對藥物諸如G418、潮黴素、或胺甲喋呤之抗性。較佳可選擇之標誌基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(其以胺甲喋呤選擇/擴增用於dhfr^-宿主細胞)及neo基因(其用於G418選擇)、及麩胺酸合成酶基因。

非融合瘤宿主細胞及重組產生蛋白之方法

編碼抗MAdCAM抗體之重鏈或其抗原結合部分及/或輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子、及包含此等核酸分子之載體可用於轉化合適的哺乳動物、植物、細菌、或酵母宿主細胞。轉化可藉由任何已知之用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之方法進行。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中為熟知的且包括葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、將(一或多種)聚核苷酸囊封於脂質體中、基因槍注射、及將DNA直接顯微注射至核中。此外，核酸分子可由病毒載體引入至哺乳動物細胞中。轉化細胞之方法為此項技術中熟知的。參見例如，美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號、及第4,959,455號(該等專利據此以引用方式併入本文)。轉化植物細胞之方法為此項技術中熟知的，包括例如，土壤桿菌介導之轉化、基因槍栓化、直接注射、電穿孔、及病毒轉化。轉化細菌及酵母細胞之方法亦為此項技術中熟知的。

可供用於表現之宿主之哺乳動物細胞株為此項技術中熟知的且包括可購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)之許多永生化細胞株。此等尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如，Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、及許多其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、狗、猴、豬、山羊、牛、馬、及倉鼠細胞。經由確定何種細胞株具有高表現水準來選擇具有特定偏好之細胞株。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞、及真菌細胞。當將編碼重鏈或其抗原結合部分、輕鏈、及/或其抗原結合部分之重組表現載體引入至哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養該等宿主細胞持續足以使該抗體在宿主細胞中表現或更佳將抗體分泌至其中宿主細胞生長之培養基中的一段時間來產生抗體。可使用標準蛋白純化方法自培養基回收抗體。植物宿主細胞包括例如煙草、阿拉伯芥、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等。細菌宿主細胞包括大腸桿菌(E.coli)及鏈黴屬(Streptomyces)物種。酵母宿主細胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、及畢赤酵母(Pichia pastoris)。

此外，來自生產細胞株之本揭露抗體之表現可使用許多已知技術增強。例如，麩醯胺合成酶基因表現系統(GS系統)為用於在某些條件下增強表現之常見方法。GS系統完全地或部分地與歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號、第0 338 841號、及第0 323 997號聯合論述。

有可能不同細胞株所表現或在基因轉殖動物中表現之抗體將具有彼此不同的糖基化。然而，由本文所提供之核酸分子編碼或包含本文所提供之胺基酸序列的所有抗體為本揭露之一部分，無需考慮該等抗體之糖基化。

基因轉殖動物及植物

本揭露亦提供包含一或多個可用於產生本揭露之抗體的本揭露之核酸分子的基因轉殖非人類動物及基因轉殖植物。抗體可在山羊、奶牛、馬、豬、大鼠、小鼠、兔、倉鼠、或其他哺乳動物之組織或體液諸如奶、血液、或尿中產生及回收。參見例如美國專利第5,827,690號、第5,756,687號、第5,750,172號、及第5,741,957號。如上文所述，可用MAdCAM或其部分免疫包含人類免疫球蛋白基因座的非人類基因轉殖動物。用於在植物中產生抗體之方法描述於例如美國專利6,046,037及5,959,177中，其以引用方式併入本文。

在另一實施例中，藉由標準基因轉殖技術將一或多個本揭露之核酸分子引入至動物或植物中來產生非人類基因轉殖動物及基因轉殖植物。參見Hogan，同上。用於生產基因轉殖動物的基因轉殖細胞可為胚胎幹細胞、體細胞、或受精卵細胞。基因轉殖非人類生物可為嵌合、非嵌合異型合子及非嵌合同型合子。參見例如Hogan等人，,Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Press(1999)；Jackson等人，Mouse Genetics and Transgenics：A Practical Approach,Oxford University Press(2000)；及Pinkert,Transgenic Animal Technology：A Laboratory Handbook,Academic Press(1999)。在另一實施例中，基因轉殖非人類生物可具有編碼目標重鏈及/或輕鏈之靶向破壞及置換。在一較佳實施例中，基因轉殖動物或植物包含且表現編碼重鏈及輕鏈之核酸分子，該等重鏈及輕鏈組合以特異性結合MAdCAM，較佳人類MAdCAM。在另一實施例中，基因轉殖動物或植物包含編碼經修飾抗體諸如單鏈抗體、嵌合抗體、或人源化抗體的核酸分子。抗MAdCAM抗體可在任何基因轉殖動物中生產。在一較佳實施例中，非人類動物為小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、或馬。非人類基因轉殖動物於血液、奶、尿、唾液、眼淚、黏液、及其他體液中表現該等經編碼多肽。

噬菌體顯示文庫

本揭露提供一種用於產生抗MAdCAM抗體或其抗原結合部分的方法，該方法包含以下步驟：在噬菌體上合成人類抗體文庫；用MAdCAM或其部分篩選文庫；單離出結合MAdCAM的噬菌體；及自噬菌體獲得抗體。一種製備抗體文庫之方法包含以下步驟：用MAdCAM或其抗原性部分免疫包含人類免疫球蛋白基因座的非人類宿主動物以產生免疫反應；自宿主動物提取出負責產生抗體的細胞；自提取之細胞中單離出RNA；反轉錄該RNA以產生cDNA；使用引物擴增cDNA；及將cDNA插入至噬菌體展示載體中使得抗體在噬菌體上表現。本揭露之重組抗MAdCAM抗體可以此方式獲得。

除本文所揭示之抗MAdCAM抗體之外，本揭露之重組抗MAdCAM人類抗體可藉由篩選重組組合抗體文庫，較佳scFv噬菌體顯示文庫來單離，該文庫可使用由單離自人類淋巴球之mRNA製備之人類VL及VH cDNA製備。用於製備及篩選此類文庫之方法為此項技術中已知的。用於產生噬菌體顯示文庫的套組可商購獲得例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAP^TM噬菌體顯示套組，目錄號240612)。亦存在可用於產生及篩選抗體顯示文庫的其他方法及試劑(參見例如，美國專利第5,223,409號；PCT公開案第WO 92/18619號；PCT公開案第WO 91/17271號；PCT公開案第WO 92/20791號；PCT公開案第WO 92/15679號；PCT公開案第WO 93/01288號；PCT公開案第WO 92/01047號；PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人，(1991),Biotechnology,9：1369-1372；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas,3：81-85(1992)；Huse等人，Science,246：1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature,348：552-554(1990)；Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.,226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：3576-3580(1992)；Garrad等人，Biotechnology,9：1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nuc Acid Res,19：4133-4137(1991)；及 Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：7978-7982(1991)。

在一較佳實施例中，為單離具有所要特徵的人類抗MAdCAM抗體，使用Hoogenboom等人，PCT公開案第WO 93/06213號中所述之表位印記方法，首先使用如本文所述之人類抗MAdCAM抗體選擇對MAdCAM具有類似結合活性的人類重鏈及輕鏈序列。此方法中所用之抗體文庫較佳為如McCafferty等人，PCT公開案第WO 92/01047號；McCafferty等人，Nature,348：552-554(1990)；及Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)中所述製備及篩選的scFv文庫。scFv抗體文庫較佳使用人類MAdCAM作為抗原進行篩選。

一旦初始人類VL及VH片段經選擇，便進行「混合及匹配」實驗以選擇較佳VL/VH對組合，在混合及匹配實驗中針對MAdCAM結合篩選不同的初始選擇之VL及VH片段對。此外，為進一步改善抗體品質，可在類似於在天然免疫反應期間負責抗體之親和力成熟的體內體細胞突變過程的過程中，使較佳(一或多個)VL/VH對之VL及VH片段較佳在VH及/或VL之CDR3區內隨機突變。此體外親和力成熟可藉由使用分別與VH CDR3或VL CDR3互補之PCR引物擴增VH及VL區來完成，該等引物已經在某些位置「摻有」四種核苷酸鹼基之隨機混合物，使得所得PCR產物編碼隨機突變已經引入至VH及/或VL CDR3區中的VH及VL片段。此等隨機突變之VH及VL片段可針對與MAdCAM之結合經再次篩選。

自重組免疫球蛋白顯示文庫篩選及單離本揭露之抗MAdCAM抗體之後，可自顯示包(例如，自噬菌體基因體)回收編碼經選擇抗體的核酸並藉由標準重組DNA技術將其亞選殖至其他表現載體中。需要時，可進一步操縱該核酸以產生本揭露之其他抗體形式，如下文所述。為表現藉由篩選組合庫所單離之重組人類抗體，將編碼抗體之DNA選殖至重組表現載體中並引入至哺乳動物宿主細胞中，如上文所述。

類型轉換

本揭露之另一態樣為提供一種使抗MAdCAM抗體之類型與另一種類型轉換的機制。在本揭露之一個態樣中，使用此項技術中熟知的方法單離編碼VL或VH之核酸分子，使得其不包括任何編碼CL或CH的核苷酸序列。隨後將編碼VL或VH之核酸分子可操作地連接編碼來自不同類型的免疫球蛋白分子的CL或CH的核苷酸序列。這可使用包含編碼CL或CH之序列的載體或核酸分子達成，如上文所述。例如，最初為IgM之抗MAdCAM抗體可類型轉換成IgG。此外，類型轉換可用於將一種IgG亞類轉換成另一亞類，例如自IgG₄轉換成IgG₂。一種用於產生包含所要同型或抗體亞類的本揭露之抗體的較佳方法包含以下步驟：單離編碼抗MAdCAM抗體重鏈的核酸及編碼抗MAdCAM抗體輕鏈的核酸；獲得重鏈可變區；將該重鏈可變區與所要同型之重鏈恆定結構域接合；在細胞中表現輕鏈及接合之重鏈；及收集具有所要同型之抗MAdCAM抗體。

抗體衍生物

使用一般熟習此項技術者已知的技術及方法，可使用上文所述之核酸分子產生抗體衍生物。

人源化抗體

使用人源化技術，有可能採用使用適當文庫之顯示技術，可將非人類抗體之免疫原性減小至某一程度。應瞭解，鼠類抗體或來自其他物種之抗體可使用此項技術中熟知的技術來人源化或靈長類化。參見例如，Winter及Harris,Immunol Today,14：43-46(1993)以及Wright等人，Crit.Reviews in Immunol.,12125-168(1992)。目標抗體可藉由重組DNA技術經工程改造以用對應人類序列取代C_H1、C_H2、C_H3、鉸鏈結構域、及/或架構結構域(參見WO 92/02190以及美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,792號、第 5,714,350號、及第5,777,085號)。在另一實施例中，可藉由用對應的本揭露之抗MAdCAM抗體之人類序列取代C_H1、鉸鏈結構域、C_H2、C_H3、及/或架構結構域使非人類抗MAdCAM抗體人源化。

突變抗體

在另一實施例中，核酸分子、載體、及宿主細胞可用於產生突變抗MAdCAM抗體。抗體可在重鏈及/或輕鏈可變結構域中突變以改變抗體之結合性質。例如，在一或多個CDR區產生中突變以增加或減少抗體對MAdCAM的K_d。定點誘變之技術為此項技術中熟知的。參見例如，Sambrook等人及Ausubel等人，同上。在一較佳實施例中，突變在已知與生殖系相比在抗MAdCAM抗體可變區中經改變的胺基酸殘基處產生。在一更佳實施例中，一或多個突變在已知與生殖系相比在抗MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之一的可變區或CDR區中經改變的胺基酸殘基處產生。在另一實施例中，一或多個突變在已知與生殖系相比在其胺基酸序列呈現於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148、或150，或其核苷酸序列呈現於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67、或149的可變區或CDR區中經改變的胺基酸殘基處產生。在另一實施例中，核酸分子在一或多個架構區中突變。突變可在架構區或恆定結構域中產生以增加抗MAdCAM抗體之半衰期。參見例如，2000年2月24日公佈之WO 00/09560，其以引用方式併入本文。在一個實施例中，可能有1、3、或5、或10個點突變且不多於15個點突變。亦可在架構區或恆定結構域中產生突變以改變抗體之免疫原性，提供共價或非共價結合另 一分子的位點，或改變諸如補體固定的性質。在單個經突變抗體中，突變可在架構區、恆定結構域、及可變區之各者中產生。替代地，在單個經突變抗體中，突變可僅在架構區、可變區、或恆定結構域之一中產生。

在一個實施例中，與突變前的抗MAdCAM抗體相比，經突變抗MAdCAM抗體之VH或VL區中存在不多於15個胺基酸變化。在一更佳實施例中，在經突變抗MAdCAM抗體之VH或VL區中有不多於10個胺基酸變化，更佳不多於5個胺基酸變化，或甚至更佳不多於3個胺基酸變化。在另一實施例中，在恆定結構域中有不多於15個胺基酸變化，更佳不多於10個胺基酸變化，甚至更佳不多於5個胺基酸變化。

經修飾抗體

在另一實施例中，可產生包含連接另一多肽之全部或部分抗MAdCAM抗體的融合抗體或免疫黏附素。在一較佳實施例中，僅抗MAdCAM抗體之可變區連接多肽。在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體之VH結構域連接第一多肽，而抗MAdCAM抗體之VL結構域連接第二多肽，第二多肽與第一多肽以其中VH及VL結構域可彼此相互作用以形成抗體結合位點的方式締合。在另一較佳實施例中，VH結構域藉由接頭來與VL結構域分離，使得VH及VL結構域可彼此相互作用(參見下文單鏈抗體)。隨後將VH-接頭-VL抗體連接目標多肽。融合抗體實用於引導多肽至表現MAdCAM之細胞或組織。多肽可為治療劑，諸如毒素、生長因子、或其他調節蛋白，或可為診斷劑，諸如可容易顯現的酶，諸如山葵過氧化酶。此外，可產生其中兩種(或多種)單鏈抗體彼此聯接的融合抗體。若想要在單條多肽鏈中產生二價或多價抗體，或若想要產生雙特異性抗體，則這為實用的。

為產生單鏈抗體(scFv)，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接另一編碼撓性連接序列例如編碼胺基酸序列(Gly₄-Ser)₃之片段，使得VH及 VL序列可表現為連續的單鏈蛋白，VL及VH區藉由撓性接頭連接(參見例如，Bird等人，Science,242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85：5879-5883(1988)；McCafferty等人，Nature,348：552-554(1990))。若僅使用單個VH及VL，單鏈抗體可為單價的，若使用兩個VH及VL，則為二價，或若使用多於兩個VH及VL，則為多價。

在另一實施例中，其他經修飾抗體可使用編碼抗MAdCAM抗體之核酸分子製備。例如，「κ抗體」(Ill等人，Protein Eng,10：949-57(1997))、「微型抗體」(Martin等人，EMBO J,13：5303-9(1994))、「雙價抗體」(Holliger等人，PNAS USA,90：6444-6448(1993))、或「Janusins」(Traunecker等人，EMBO J,10：3655-3659(1991)及Traunecker等人，「Janusin：new molecular design for bispecitic reagents,」Int J Cancer增刊,7：51-52(1992))可遵循本說明書教示使用標準分子生物學技術製備。

在另一態樣中，可產生嵌合抗體及雙特異性抗體。可產生包含來自不同抗體之CDR及架構區之嵌合抗體。在一較佳實施例中，嵌合抗體之CDR包含人類抗MAdCAM抗體之輕鏈或重鏈可變區之所有CDR，而架構區衍生自一或多種不同的抗體。在一更佳實施例中，嵌合抗體之CDR包含人類抗MAdCAM抗體之輕鏈及重鏈可變區之所有CDR。架構區可衍生自另一物種，且在一較佳實施例中可經人源化。替代地，架構區可來自另一人類抗體。

可產生透過一個結合結構域特異性結合MAdCAM並透過第二結合結構域結合第二分子的雙特異性抗體。雙特異性抗體可透過重組分子生物學技術產生，或可以物理方式綴合在在一起。此外，可產生特異性結合MAdCAM及另一分子的含有多於一個VH及VL的單鏈抗體。此類雙特異性抗體可使用熟知技術產生，例如關於(i)及(ii)，參見例如Fanger等人，Immunol Methods 4：72-81(1994)以及Wright及Harris，同上，且關於(iii)，參見例如Traunecker等人，Int.J. Cancer(增刊)7：51-52(1992)。在一較佳實施例中，雙特異性抗體結合MAdCAM及另一在內皮細胞上高水準表現的分子。在一更佳實施例中，另一分子為VCAM、ICAM、或L-選擇素。

在各種實施例中，上文所述之經修飾抗體係使用來自選自1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、或7.26.4-mod之抗體之一的一或多個可變區或一或多個CDR區來製備。在另一實施例中，經修飾抗體係使用一或多個可變區或一或多個CDR區製備，可變區及CDR區之胺基酸序列呈現於SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148、或150中，或其核苷酸序列呈現於SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67、或149中。

衍生及標記之抗體

本揭露之抗體或抗體部分可經衍生或連接另一分子(例如，另一肽或蛋白)。一般而言，抗體或其部分經衍生，使得MAdCAM結合不受衍生或標記之不良影響。據此，本揭露之抗體及抗體部分意欲包括本文所述之人類抗MAdCAM抗體之完整形式及經修飾形式。例如，本揭露之抗體或抗體部分可功能性連接(藉由化學偶合、基因融合、非共價締合、或其他方式)一或多種可介導抗體或抗體部分與另一分子(諸如鏈親和素核心區或多組胺酸標籤)締合之其他分子實體，諸如另一抗體(例如，雙特異性抗體或雙價抗體)、偵測劑、細胞毒性劑、藥品試劑、及/或蛋白或肽。

一種類型的衍生抗體係藉由交聯二或更多種抗體(相同類型或不相同類型，例如，用以產生雙特異性抗體)來產生。合適之交聯劑包括具有兩個由 適當間隔區分開的不同反應性基團的異雙功能(例如，間-順丁烯二醯亞胺苯甲醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯)或同雙功能(例如，二琥珀醯亞胺醯辛二酸脂)的交聯劑。此類交聯劑可購自Pierce Chemical Company,Rockford,Ill。

另一類衍生抗體為經標記抗體。本揭露之抗體或抗體部分可藉以衍生的實用偵測劑包括螢光化合物，其包括螢光素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、5-二甲胺-1-萘磺醯氯、藻紅素、鑭系磷光體、及其類似者。抗體亦可用實用於偵測之酶標記，諸如山葵過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、及其類似者。當用可偵測之酶標記抗體時，藉由添加額外的該酶用以產生可分辨的反應產物的試劑來偵測。例如，當存在山葵過氧化酶試劑時，添加過氧化氫及二胺基聯苯產生可偵測之有色反應產物。抗體亦可用生物素標記，且透過間接測量卵白素或鏈親和素結合來偵測。抗體可用於磁性試劑如釓標記。抗體亦可用由二級報導分子識別之預定多肽表位(例如，白胺酸拉鍊對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、表位標籤)標記。在一些實施例中，標記由各種長度的間隔臂連接以減少可能的位阻。

抗MAdCAM抗體亦可用放射性標記之胺基酸標記。放射性標記可用於診斷及治療目的。例如，放射性標記可用於藉由X射線或其他診斷技術來偵測表現MAdCAM之組織。此外，放射性標記可在治療上用作患病組織或表現MAdCAM之腫瘤之毒素。多肽之標記之實例包括但不限於以下放射性同位素或放射性核種：³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I。

抗MAdCAM抗體亦可用化學基團諸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或醣基衍生。此等基團可實用於改善抗體之生物學特徵，例如，增加血清半衰期或增加組織結合。此方法亦可應用於抗MAdCAM抗體之任何抗原結合片段或型式。

醫藥組成物及套組

在另一態樣中，本揭露提供包含抑制性人類抗MAdCAM抗體之組成物及用此類組成物治療受試者之方法。在一些實施例中，治療之受試者為人類。在其他實施例中，受試者為獸醫受試者。在一些實施例中，獸醫受試者為狗或非人類靈長類動物。

治療可涉及將一或多種本揭露之抑制性抗MAdCAM單株抗體或其抗原結合片段單獨或與醫藥上可接受之載劑一起投與。本揭露之抑制性抗MAdCAM抗體及包含其之組成物可與一或多種其他治療劑、診斷劑、或防治劑組合投與。額外治療劑包括消炎劑或免疫調節劑。此等試劑包括但不限於：局部及口服皮質類固醇，諸如普賴蘇濃(prednisolone)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、NCX-1015、或布地奈德(budesonide)；胺基柳酸鹽，諸如美沙拉嗪(mesalazine)、奧沙拉嗪(olsalazine)、巴柳氮(balsalazide)、或NCX-456；免疫調節劑類，諸如硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、胺甲喋呤、環孢靈(cyclosporin)、FK506、IL-10(Ilodecakin)、IL-11(Oprelevkin)、IL-12、MIF/CD74拮抗劑、CD40拮抗劑(諸如TNX-100/5-D12)、OX40L拮抗劑、GM-CSF、匹美莫司(pimecrolimus)、或雷帕黴素；抗TNFα劑類，諸如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、CDP-870、奧那西普(onercept)、依那西普(etanercept)；消炎劑類，諸如PDE-4抑制劑(羅氟司特(roflumilast)等)、TACE抑制劑(DPC-333、RDP-58等)、及ICE抑制劑(VX-740等)、以及IL-2受體拮抗劑，諸如達利珠單抗(daclizumab)；選擇性黏附分子拮抗劑類，諸如那他珠單抗(natalizumab)、MLN-02、或alicaforsen；止痛劑類，諸如但不限於COX-2抑制劑，諸如羅非昔布(rofecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、塞來昔布(celecoxib)、P/Q型電位敏感離子通道(α2δ)調節劑(諸如加巴噴丁(gabapentin)及普瑞巴林(pregabalin))、NK-1受體拮抗劑、大麻受體調節劑、及δ類鴉片受體促效劑、以及抗贅瘤、抗腫瘤、抗血管生成、或化療劑。此類額外試劑可包括於相同組成 物中或分開投與。在一些實施例中，本發揭露之一或多種抑制性抗MAdCAM抗體可用作疫苗或用作疫苗之佐劑。特別地，因為MAdCAM在淋巴組織中表現，所以藉由將抗原與本揭露之抗MAdCAM抗體綴合可使疫苗抗原有利地靶向淋巴組織。

如本文所用，「醫藥上可接受之載劑」意謂生理學上可相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收增強或延遲劑、及其類似物。醫藥上可接受之載劑之一些實例為水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、具有氯化鈉之乙酸鹽緩衝液、右旋糖、甘油、聚乙二醇、乙醇、及其類似物、以及其組合。在許多狀況下，組成物中較佳包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨糖醇)、或氯化鈉。醫藥上可接受之物質之額外實例為界面活性劑、濕潤劑、或少量輔助物質諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑、或緩衝劑，其可增強抗體之庫存壽命或有效性。

本揭露之組成物可為多種形式，例如液體、半固體、及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射及可輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、錠劑、丸劑、凍乾餅、乾粉、脂質體、及栓劑。較佳形式取決於意欲之投與模式及治療應用。典型較佳組成物為可注射或可輸注溶液之形式，諸如類似於那些用於人類之被動免疫的組成物。較佳投與模式為腸胃外投與(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、皮內投與)。在一較佳實施例中，藉由靜脈內輸注或注射來投與抗體。在另一較佳實施例中，藉由肌內、皮內、或皮下注射來投與抗體。

治療性組成物通常須在製造及儲存條件下為無菌且穩定的。組成物可調配成溶液、凍乾餅、乾粉、微乳液、分散液、脂質體、或適於高藥物濃度之其他有序結構。可藉由將抗MAdCAM抗體以所需量在必要時與上文列舉之一種成分或成分之組合一起併入適當溶劑中，接著進行滅菌來製備無菌可注射溶液。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末之情況下，較佳製備方法為真空乾 燥及冷凍乾燥，其產生活性成分加上來自其先前無菌溶液之任何另外的所需成分的粉末。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該媒劑含有鹼性分散介質及來自上文列舉彼等成分的所需其他成分。溶液之所要特徵可例如藉由使用界面活性劑來維持，並且在分散液之情況下，所需的粒子大小藉由使用界面活性劑、磷脂、及聚合物來維持。延長可注射組成物之吸收可藉由在組成物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鹽、聚合材料、油、及明膠)來達成。

儘管對於許多治療應用，較佳投與途徑/模式為皮下、肌內、皮內、或靜脈內輸注，但是本揭露之抗體可藉由此項技術中已知的多種方法投與。熟練技術人員應瞭解，投與之途徑及/或模式將取決於所要結果而變化。

在某些實施例中，抗體組成物可用防止抗體迅速釋放的載劑製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、透皮貼劑、及微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解之生物相容性聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯(polyorthoesters)、及聚乳酸。多種用於製備此類調配物之方法已申請專利或通常為熟習此項技術者已知。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York(1978))。

在某些實施例中，本揭露之抗MAdCAM抗體可口服投與，例如用惰性稀釋劑或可吸收食用載劑。化合物(需要時，及其他成分)亦可密封於硬殼或軟殼明膠膠囊中、壓製成錠劑、或直接併入受試者飲食中。對於口服治療性投與，抗MAdCAM抗體可與賦形劑結合且以可攝取錠劑、經頰錠劑、口含錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、或扁片、及其類似物之形式使用。為藉由除腸胃外投與之外之方式投與本揭露之化合物，可能有必要將化合物用防止其失活之物質塗佈或將化合物與防止其失活之物質共同投與。

本揭露之組成物可包括「治療有效量」或「防治有效量」的本揭露之抗體或抗原結合部分。「治療有效量」係指在各種劑量下且持續必要時間段，有效達成所要治療結果之量。抗體或抗體部分之治療有效量可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及抗體或抗體部分在個體中引發所要反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為治療有益作用超過抗體或抗體部分之任何毒性或有害作用之量。「防治有效量」係指在各種劑量下且持續必要時間段，有效達成所要防治結果之量。通常，因為防治劑量係在疾病之前或早期用於受試者中，所以防治有效量將小於治療有效量。

可調整劑量方案以提供最佳的所要反應(例如，治療反應或防治反應)。例如，可投與單次推注，可隨時間推移投與幾次分開劑量，或者可按照治療情形之緊張程度所指示，按比例減少或增加劑量。尤其，宜以便於投與及劑量一致性之劑量單位形式調配腸胃外組成物。如本文所用，劑量單位形式係指對於欲治療之哺乳動物受試者適合作為單位劑量之物理離散單位；各單位含有經計算產生所要治療效應之預定量活性化合物以及所需醫藥載劑。本揭露之劑量單位形式之規格由以下規定且直接取決於以下：(a)抗MAdCAM抗體或其部分之獨特特徵及欲達成之特定治療或防治效果，及(b)混配此一抗體以用於治療個體之敏感性之技術中固有之限制。

本揭露之抗體或抗體部分之治療或防治有效量之示範性非限制性範圍為0.025至50mg/kg，更佳為0.1至50mg/kg，更佳為0.1-25、0.1至10、或0.1至3mg/kg。在一些實施例中，調配物在20mM乙酸鈉(pH 5.5)、140mM NaCl、及0.2mg/mL聚山梨醇酯80之緩衝液中含有5mg/mL抗體。應注意，劑量值可隨著欲減輕的病況之類型及嚴重性而變化。應進一步理解對於任何特定受試者，具體劑量方案應根據個體需求及投與或監督投與該等組成物之人的專業判斷隨時間加以調節，且本文所陳述之劑量範圍僅為示範性的且不意欲限制所主 張之組成物的範疇或實踐。

本揭露之另一態樣提供包含本揭露之抗MAdCAM抗體或抗體部分或包含此一抗體之組成物之套組。除抗體或組成物之外，套組亦可包括診斷劑或治療劑。套組亦可包括用於診斷或治療方法中的使用說明書。在一較佳實施例中，套組包括抗體或包含該抗體之組成物及可用於下文所述之方法的診斷劑。在另一較佳實施例中，套組包括抗體或包含該抗體之組成物及一或多種可用於下文所述之方法的治療劑。

基因療法

本揭露之核酸分子可經由基因療法向有需要之患者投與。該療法可為體內或離體療法。在一較佳實施例中，可將編碼重鏈及輕鏈兩者之核酸分子向患者投與。在一更佳實施例中，投與該等核酸分子使得其穩定地整合至B細胞之染色體中，因為此等細胞專用於生產抗體。在一較佳實施例中，將前驅B細胞離體轉染或感染且再移植至有需要之患者中。在另一實施例中，使用已知感染目標細胞類型之重組病毒體內感染前驅B細胞或其他細胞。用於基因療法之典型載體包括脂質體、質體、及病毒載體。示範性病毒載體為反轉錄病毒、腺病毒、及腺相關病毒。體內或離體感染之後，可藉由自經治療患者取樣並使用此項技術中已知或本文所討論之任何免疫檢定法監測抗體表現水準。

在一較佳實施例中，基因療法方法包含以下步驟：投與經單離之編碼抗MAdCAM抗體重鏈或其抗原結合部分的核酸分子並表現該核酸分子。在另一實施例中，基因療法方法包含以下步驟：投與經單離之編碼抗MAdCAM抗體輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子並表現該核酸分子。在一更佳方法中，基因療法方法包含以下步驟：投與經單離之編碼本揭露之抗MAdCAM抗體重鏈或其抗原結合部分的核酸分子及經單離之編碼本揭露之抗MAdCAM抗體輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子並表現該等核酸分子。基因療法方法亦可包含投與另 一消炎劑或免疫調節劑之步驟。

診斷性使用方法

抗MAdCAM抗體可用於體外或體內偵測在生物樣本中之MAdCAM。抗MAdCAM抗體可用於習知免疫檢定法中，其包括但不限於ELISA、RIA、FACS、組織免疫組織化學、西方墨點法、或免疫沉澱法。本揭露之抗MAdCAM抗體可用於偵測人類之MAdCAM。在另一實施例中，抗MAdCAM抗體可用於偵測舊世界靈長類諸如蟹獼猴及恆河猴、黑猩猩、及人猿之MAdCAM。本揭露提供一種用於偵測生物樣本中MAdCAM之方法，其包含將生物樣本與本揭露之抗MAdCAM抗體接觸並偵測結合MAdCAM之抗體。在一個實施例中，抗MAdCAM抗體用可偵測之標記直接衍生。在另一實施例中，抗MAdCAM抗體(第一抗體)未經標記，且可結合抗MAdCAM抗體之第二抗體或其他分子經標記。如熟習此項技術者所熟知，選擇能夠特異性結合具體物種及類別的第一抗體的第二抗體。例如，若抗MAdCAM抗體為人類IgG，則二級抗體可為抗人類IgG。可結合抗體之其他分子包括但不限於蛋白A及蛋白G，其兩者均可例如自Pierce Chemical Co商購獲得。

抗體或二級抗體之合適標記已經在上文揭示，且包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、磁性劑、及放射性材料。合適之酶之實例包括山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶；合適之輔基複合物之實例包括鏈親和素/生物素及卵白素/生物素；合適之螢光材料之實例包括繖酮、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯、或藻紅素；發光材料之實例包括流明諾；磁性劑之實例包括釓；且合適放射性材料之實例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、或³H。

在一替代性實施例中，利用用可偵測之物質標記之MAdCAM標準物及未經標記之抗MAdCAM抗體，藉由競爭免疫檢定法可檢定生物樣本中之 MAdCAM。在此檢定法中，將生物樣本、經標記之MAdCAM標準物、及抗MAdCAM抗體組合併確定結合未經標記之抗體的經標記MAdCAM標準物之量。生物樣本中MAdCAM之量與結合抗MAdCAM抗體的經標記MAdCAM標準物之量成反比。

可出於許多目的使用上文揭示之免疫檢定法。在一個實施例中，抗MAdCAM抗體可用於偵測細胞培養物中細胞中之MAdCAM。在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體可用於確定在用各種化合物處理細胞之後細胞表面MAdCAM表現之水準。此方法可用於測試可用於活化或抑制MAdCAM的化合物。在此方法中，一種細胞樣本用測試驗化合物處理一段時間，而另一樣本未經處理，隨後可藉由流動式細胞測量術、免疫組織化學法、西方墨點法、ELISA、或RIA確定細胞表面表現。此外，可擴大免疫檢定法的規模以用於高通量篩選，以測試大量化合物對MAdCAM之活化或抑制。

本揭露之抗MAdCAM抗體亦可用於確定組織上或衍生自組織之細胞中的MAdCAM水準。在一較佳實施例中，組織為患病組織。在一更佳實施例中，組織為發炎胃腸道或其或其生物檢體。在該方法之一較佳實施例中，自患者切除組織或其生物檢體。隨後將組織或生物檢體用於免疫檢定法以藉由上文所討論之方法確定例如MAdCAM水準、細胞表面MAdCAM水準、或MAdCAM之定位。該方法可用於確定發炎組織是否以高水準表現MAdCAM。

上文所述之診斷方法可用於確定組織是否表現高水準的MAdCAM，表現高水準的MAdCAM可指示組織將對用抗MAdCAM抗體之治療反應良好。此外，診斷方法亦可用於確定用抗MAdCAM抗體治療(參見下文)是否引起組織表現較低水準的MAdCAM並因此可用於確定治療是否成功。

本揭露之抗體亦可體內用於定位表現MAdCAM之組織及器官。在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體可用於定位發炎組織。本揭露之抗MAdCAM 抗體之優勢為其不會在投與之後產生免疫反應。該方法包含以下步驟：需要此一診斷試驗之患者投與抗MAdCAM抗體或其醫藥組成物及使該患者經歷成像分析以確定表現MAdCAM之組織之定位。成像分析為醫學技術中熟知的，且包括但不限於X射線分析、γ閃爍檢查、磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層攝影術、或電腦斷層攝影(CT)。在該方法之另一實施例中，自患者獲得生物檢體以確定目標組織是否表現MAdCAM而不使患者接受成像分析。在一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體可用可在患者中成像之可偵測試劑標記。例如，抗體可用可用於X射線分析之對比劑諸如鋇，或可用於MRI或CT的磁性對比劑諸如釓螯合物標記。其他標記試劑包括但不限於放射性同位素諸如⁹⁹Tc。在另一實施例中，抗MAdCAM抗體未經標記且可藉由投與可偵測且可結合抗MAdCAM抗體之第二抗體或其他分子來成像。

本揭露之抗MAdCAM抗體亦可用於確定供體血液、血清、血漿、或其他生物流體包括但不限於糞便、尿、痰、或生物檢體樣本中存在之可溶性MAdCAM之水準。在一較佳實施例中，生物流體為血漿。隨後將生物流體用於免疫檢定法以確定可溶性MAdCAM水準。可溶性MAdCAM可為進行中的胃腸發炎的代用標記物，且偵測方法可用作測量疾病嚴重性的診斷標記物。

上文所述之診斷方法可用於確定個體是否表現高水準的可溶性MAdCAM，表現高水準的可溶性MAdCAM可指示個體將對用抗MAdCAM抗體之治療反應良好。此外，診斷方法亦可用於確定用抗MAdCAM抗體(參見下文)或其他藥品試劑治療疾病是否引起個體表現較低水準的MAdCAM並因此可用於確定治療是否成功。

抗MAdCAM抗體對α ₄β ₇/MAdCAM依賴性黏附的抑制：

在另一實施例中，本揭露提供結合MAdCAM且抑制帶有α₄β₇整合素之細胞與MAdCAM或其他綴合配位體諸如L-選擇素與MAdCAM之結合及黏 附的抗MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，MAdCAM為人類MAdCAM，且為可溶形式，或於細胞表面上表現。在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為人類抗體。在另一實施例中，抗體或其部分以不大於50nM的IC₅₀值抑制α4β7與MAdCAM之間的結合。在一較佳實施例中，IC₅₀值不大於5nM。在一更佳實施例中，IC₅₀值小於5nM。在一更佳實施例中，IC₅₀值小於0.05μg/mL、0.04μg/mL、或0.03μg/mL。在另一較佳實施例中，IC₅₀值小於0.5μg/mL、0.4μg/mL、或0.3μg/mL 。IC₅₀值可藉由此項技術中已知的任何方法測量。通常，IC₅₀值可藉由ELISA或黏附檢定測量。在一較佳實施例中，IC₅₀值係使用天然表現MAdCAM之細胞或組織或者已經工程改造成表現MAdCAM之細胞或組織，藉由黏附檢定法測量。

抗MAdCAM抗體對淋巴球向腸相關淋巴組織中募集的抑制

在另一實施例中，本揭露提供結合天然表現之MAdCAM且抑制淋巴球結合專門胃腸淋巴組織的抗MAdCAM抗體。在一較佳實施例中，天然表現之MAdCAM為人類或靈長類MAdCAM，且為可溶形式，或於細胞表面上表現。在另一較佳實施例中，抗MAdCAM抗體為人類抗體。在另一實施例中，抗體或其部分以不大於5mg/kg之IC₅₀值抑制腸營養型(gut-trophic)α₄β₇ ⁺淋巴球向表現MAdCAM之組織中募集。在一較佳實施例中，IC₅₀值不大於1mg/kg。在一更佳實施例中，IC₅₀值小於0.1mg/kg。在一個實施例中，使用γ閃爍檢查或單光子發射電腦斷層攝影，藉由測量鎝標記之末梢血淋巴球向胃腸道中募集之劑量效應關係來測定IC₅₀值。在另一實施例中，IC₅₀值可使用流動式細胞測量術，藉由測量末梢循環中腸營養型α₄β₇ ⁺淋巴球諸如但不限於CD4⁺α₄β₇ ⁺記憶T細胞的增加，隨抗MAdCAM抗體之劑量而變動來確定。

為了使本揭露更容易理解，闡述以下實例。此等實例僅出於說明目的而不能理解為以任何方式限制本揭露之範疇。

實例1： 產生抗MAdCAM抗體之融合瘤之產生

根據本實例製備、檢定、及選擇本揭露之抗體

主要免疫原製備：

製備兩種免疫原以用於XenoMouse^TM小鼠之免疫：(i)MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白，及(ii)自用MAdCAM穩定轉染之細胞製備之細胞膜。

(i)MAdCAM-IgG ₁ Fc融合蛋白 表現載體構築：

將編碼MAdCAM之成熟細胞外免疫球蛋白樣結構域的EcoRI/BglIIcDNA片段自pINCY Incyte殖株(3279276)切除並選殖至pIG1載體之EcoRI/BamHI位點(Simmons,D.L.(1993)Cellular Interactions in Development：A Practical Approach,Hartley,D.A.編(Oxford Univ.Press,Oxford)，第93-127頁))以產生符合讀框之IgG₁ Fc融合。將所得插入序列用EcoRI/NotI切除並選殖至pCDNA3.1+(Invitrogen)中。將載體中的MAdCAM-IgG₁ Fc cDNA測序確認。 MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白之胺基酸序列顯示如下： MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白： (SEQ ID NO：107)

加下劃線：信號肽

粗體：MAdCAM細胞外結構域

重組蛋白表現/純化：

將CHO-DHFR細胞用含有MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白cDNA之pCDNA3.1+載體轉染並在含有600μg/mL G418及100ng/mL胺甲喋呤之Iscove氏培養基中選擇表現MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白的穩定殖株。對於蛋白表現，在中空纖維生物反應器中接種在含有10%低IgG胎牛血清(Gibco)、非必需胺基酸(Gibco)、2mM麩醯胺(Gibco)、丙酮酸鈉(Gibco)、100μg/mL G418、及100ng/mL胺甲喋呤之Iscove氏培養基中穩定表現MAdCAM-IgG₁ Fc的CHO細胞，且用於產生濃縮培養基上清液。藉由親和力層析法自採集之上清液純化MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白。簡言之，將上清液施加於HiTrap蛋白G Sepharose(5mL,Pharmacia)管柱上(2mL/min)，用25mM Tris pH 8、150mM NaCl(5管柱體積)洗滌，並用100mM甘胺酸pH 2.5(1mL/min)溶離，立即用1M TrispH 8中和流份至pH 7.5。將含有MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白之流份藉由SDS-PAGE識別，彙集在一起，且施加於Sephacryl S100管柱(Pharmacia)上，用35mM BisTris pH 6.5、150mM NaCl預平衡。以0.35mL/min進行凝膠過濾，在約3×5mL流份中收集MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白峰。將此等樣本彙集並施加於Resource Q(6mL,Pharmacia)管柱上，於35mM BisTris pH6.5中預平衡。用5管柱體積35mM Bis Tris pH 6.5、150mM NaCl(6mL/min)洗滌管柱，並用35mM Bis Tris pH 6.5、400mM NaCl將MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白溶離至4-6mL流份中。在此階段，該蛋白為90%純且藉由SDS-PAGE呈約68kD的單一條帶遷移。為了用作免疫原及全部後續檢定，將材料緩衝液交換成25mM HEPES pH 7.5、1mM EDTA、1mM DTT、100mM NaCl、50%甘油並在-80℃下呈等分試樣儲存。

(ii)穩定表現MAdCAM之細胞膜

將包含公佈之MAdCAM序列(Shyjan AM等人，J Immunol.,156,2851-7(1996))之核苷酸645-1222之SacI/NotI片段自結腸cDNA文庫PCR擴增 並將其選殖至pIND-Hygro載體(Invitrogen)之SacI/NotI位點。將包含額外5'編碼序列之SacI片段自pCDNA3.1 MAdCAM-IgG₁ Fc亞選殖至此構築體中以產生全長MAdCAM cDNA。隨後將含有MAdCAM cDNA之KpnI/NotI片段選殖至pEF5FRTV5GWCAT載體(Invitrogen)中的對應位點中且置換CAT編碼序列。根據製造商之說明書，將cDNA插入序列進行序列驗證且藉由Flp重組酶技術用於轉染以在FlpIn NIH 3T3細胞(Invitrogen)中產生單個穩定表現的殖株。藉由其支持α₄β₇ ⁺JY人類B類淋巴細胞細胞株之結合之能力(ChanBM等人，J.Biol.Chem.,267：8366-70(1992))選擇穩定表現殖株，概述於下文。使用FlpIn CHO細胞(Invitrogen)，以相同方式製備表現MAdCAM之CHO細胞之穩定殖株。

將表現MAdCAM之FlpIn NIH-3T3細胞在含有2mM L-麩醯胺、10%供體小牛血清(Gibco)、及200μg/mL潮黴素B(Invitrogen)之杜爾貝寇氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagles Medium)(Gibco)中生長，並在滾瓶中擴充。將表現MAdCAM之FlpIn CHO細胞在含有2mM L-麩醯胺、10%供體小牛血清(Gibco)、及350μg/mL潮黴素B(Invitrogen)之漢姆氏F12/杜爾貝寇氏改良伊格爾氏培養基(Gibco)中生長，並在滾瓶中擴充。藉由使用非酶細胞解離溶液(Sigma)並刮削來收穫細胞，於磷酸鹽緩衝鹽水中藉由離心進行洗滌。藉由兩輪在25mM Bis Tris pH 8、10mM MgCl₂、0.015%(w/v)抑肽酶、100U/mL枯草菌素中進行polytron均化並離心來自細胞團塊製備細胞膜。將最終團塊重懸浮於相同緩衝液中，且將50×10⁶個細胞等效物等分至厚壁eppendorf中並以>100,000g旋轉而產生用於XenoMouse小鼠免疫的細胞膜團塊。將上清液傾析並將細胞膜在-80℃下儲存於eppendorf中直至需要。藉由SDS-PAGE及使用對抗MAdCAM之N端殘基([C]-KPLQVEPPEP)而產生之兔抗肽抗體的西方墨點法確定蛋白在細胞膜中的表現。

免疫及融合瘤產生：

將8至10週齡XENOMOUSE^TM小鼠用經純化重組MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白(10μg/劑量/小鼠)或自穩定表現MAdCAM之CHO或NIH 3T3細胞(10×10⁶個細胞/劑量/小鼠)製備之細胞膜經腹膜內或在其後足墊中免疫。在3至8週內將此劑量重複5至7次。在融合之前4天，將小鼠最後一次注射於PBS中之人類MAdCAM之細胞外結構域。將來自經免疫小鼠之脾及淋巴結淋巴球與非分泌骨髓瘤P3-X63-Ag8.653細胞株融合且如先前所述(Galfre及Milstein,Methods Enzymol.73：3-46(1981))使其經歷HAT選擇。回收一系列全部分泌MAdCAM特異性人類IgG₂κ及IgG₄κ抗體之融合瘤並進行亞選殖。將產生特異於MAdCAM之單株抗體的12個融合瘤亞殖株1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2回收且用下文所述之檢定偵測。衍生亞殖株融合瘤株系1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2之親本株系1.7、1.8、6.14、6.22、6.34、6.67、6.73、6.77、7.16、7.20、7.26、及9.8經衍生，全部均具有抗MAdCAM活性。

X481.2

將選擇之殖株進一步工程改造以移除最終蛋白中的無意剪接事件。無意剪接事件導致產生延伸蛋白。發現延伸由引起無意剪接事件的通讀導致。不希望受理論束縛，咸信無意剪接事件將重鏈末端與下游4244bp區結合在一起(在SV40衍生之序列區中)。設計新的載體以消除此觀察到之延伸。重鏈區經工程改造以在重鏈3'端置換核苷酸(自T變成A)，導致剪接供體情形之移除。得自此經工程改造之殖株之MAdCAM抗體為X481.2。

ELISA檢定：

使用MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白捕獲抗體，藉由如所述之ELISA(Coligan等人，Unit 2.1「Enzyme-linked immunosorbent assays,」Current ProtocolsIinImmunology(1994))來確定小鼠血清及融合瘤上清液中抗原特異性抗體之偵測。對於用MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白免疫之動物，藉由流動式細胞測量術篩選出針對人類IgG₁無特異性反應性且能夠結合FlpIn CHO MAdCAM細胞之抗體。

在較佳ELISA檢定中，使用以下技術：在4℃下，在含有緩衝液(100mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝液，pH 9.6)之盤中用100μL/孔MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白(4.5μg/mL)塗佈ELISA盤隔夜。孵育之後，除去塗佈緩衝液並用200μL/孔封閉緩衝液(於磷酸鹽緩衝鹽水中之5% BSA、0.1% Tween 20)封閉盤並在室溫下孵育1小時。移除封閉緩衝液並在室溫下添加50μL/孔融合瘤上清液或其他血清或上清液(例如，陽性對照)達2小時。孵育之後，將盤用PBS(3×100μL/孔)洗滌並用稀釋於PBS中之HRP綴合之二級抗體(即，1：1000針對IgG₂抗體之小鼠抗人類IgG₂-HRP(SB目錄號9060-05)或1：1000針對IgG₄抗體之小鼠抗人類IgG₄-HRP(Zymed目錄號3840))偵測融合瘤mAb之結合。將盤在室溫下孵育1小時，於PBS(3×100μL/孔)中洗滌並最終用100μL OPD(鄰苯二胺(DAKO S2405)+5μL 30% H₂O₂/12mL)顯影。使盤顯影10-20min，用100μL 2M H₂SO₄停止反應。在490nm下讀取盤。

黏附檢定：

用α₄β₇ ⁺ JY細胞及(i)MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白或(ii)MAdCAM-CHO細胞在黏附檢定中評估藉由ELISA說明結合MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白之抗體之拮抗活性。

(i)MAdCAM-IgG ₁ Fc融合蛋白檢定

在4℃下將100μL 4.5μg/mL經純化MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白之杜爾貝寇氏PBS溶液吸附至96孔黑色Microfluor「B」u型底(Dynex #7805)盤隔夜。隨後將MAdCAM塗佈之盤倒置並吸去過量液體，之後在37℃下於10% BSA/ PBS中封閉至少1小時。在此期間，將培養之JY細胞使用台盼藍排除法計數(應該為約8×10⁵個細胞/mL)並將20×10⁶個細胞/偵測盤吸取至50mL離心管中。將JY細胞於含有2mM L-麩醯胺及10%熱滅活胎牛血清(Life Technologies #10108-165)之RPMI1640培養基(Gibco)中培養，並且每2-3天以1-2×10⁵/mL接種以防止培養物分化。藉由離心(240g)用含有2mM L-麩醯胺(Gibco)之RPMI 1640培養基(Gibco)洗滌細胞兩次，以2×10⁶個細胞/mL將最終細胞團塊重懸浮於RPMI 1640中以供鈣黃綠素AM加載。將鈣黃綠素AM(Molecular Probes #C-3099)呈1：200 DMSO稀釋液(約最終濃度為5μM)添加至細胞中，且在孵育時程期間(37℃下30min)將細胞避光保護。在此細胞孵育步驟期間，將欲測試之抗體進行如下稀釋：對於單劑量測試，在0.1mg/mL於PBS中之BSA(Sigma#A3059)中將抗體補足至3μg/mL(1μg/mL最終濃度)；對於完全IC₅₀曲線，將抗體稀釋於0.1mg/mL BSA/PBS中，以3μg/mL(1μg/mL最終濃度)為最高濃度，隨後跨版加倍稀釋(1：2比率)。列最後的孔用於確定總結合，所以使用0.1mg/ml於PBS中之BSA。

封閉之後，將盤內容物彈去，並將50μL抗體/對照添加至各孔中，且在37℃下將盤孵育20min。在此期間，將負載鈣黃綠素之JY細胞藉由離心用含有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基洗滌一次並用1mg/mL BSA/PBS洗滌一次，在1mg/mL BSA/PBS中將最終細胞團塊重懸浮至1×10⁶/mL。將100μL細胞添加至U型底盤之各孔中，將盤密封，簡單離心(1000rpm達2min)，隨後在37℃下將盤孵育45min。此時間結束時，將盤用Skatron盤式洗滌機洗滌，並使用Wallac Victor² 1420多標記讀取儀測量螢光(激發λ 485nm，發射λ 535nm，從盤之頂端、距底部8mm計數，以正常的發射孔徑達0.1sec)。對於各抗體濃度，將百分比黏附表示為在任何抗體不存在下的最大螢光反應減去與非特異性結合相關的螢光之百分率。IC₅₀值定義為在該濃度下黏附反應降低至抗 MAdCAM抗體不存在時的反應之50%的抗MAdCAM抗體濃度。將能夠以<0.1μg/mL之IC₅₀值抑制JY細胞與MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白結合的抗體視為具有有效的拮抗活性，且進行MAdCAM-CHO黏附檢定。所有12種測試之Ab均顯示有效的拮抗活性(表3)。單株抗體1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、及7.26.4衍生自IgG₂κ譜系，且單株抗體6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、及9.8.2衍生自IgG₄κ譜系。

(ii)MAdCAM-CHO細胞黏附檢定。

如上文培養JY細胞。用pEF5FRT MAdCAM cDNA構築體且使用如上文所述之Flp重組酶技術(Invitrogen)產生表現MAdCAM之CHO細胞。表現MAdCAM之CHO細胞之單個穩定殖株係基於其支持JY細胞之黏附及兔抗肽抗體之結合(藉由流動式細胞測量術)的能力進行選擇，該兔抗肽抗體係抗MAdCAM之N端並在上文經描述。將表現MAdCAM之CHO細胞在含有2mM L-麩醯胺、10%胎牛血清(Gibco)、及350μg/mL潮黴素B(Invitrogen)之DMEM/F12培養基(Gibco # 21331-020)中培養，每2/3天將其以1：5分盤。對於黏附檢定，將表現MAdCAM之CHO細胞在200μL培養基中以4×10⁴個細胞/孔接種於96孔黑色盤-透明底部(Costar # 3904)中，並在37℃/5% CO₂條件下孵育隔夜。

第二天，將融合瘤上清液或經純化單株抗體自30μg/mL(等效於10μg/mL之最終濃度)之起始濃度於1mg/mL BSA/PBS中稀釋，如上文所述。對於MAdCAM CHO盤，將盤內容物彈去，並將50μL抗體/對照添加至各孔中，且在37℃下將盤孵育20min。列最後的孔用於確定總結合，所以使用0.1mg/mL於PBS中之BSA。如上文製備負載鈣黃綠素AM之JY細胞(於1mg/mL BSA/PBS中至1×10⁶/mL之最終濃度)，隨後在與抗體之20min孵育期之後將100μL添加至盤中。隨後將盤在37℃下孵育45min，隨後於Tecan盤式洗滌機(PW 384)上洗滌，且使用Wallac盤讀取儀如上文所述進行螢光測量。對於各抗體濃度，將 百分比黏附表示為在任何抗體不存在下的最大螢光反應減去與非特異性結合相關的螢光之百分率。將能夠以<1μg/mL之IC₅₀值抑制JY細胞與MAdCAM CHO細胞結合的抗體視為具有有效的拮抗活性。如前所述，IC₅₀值定義為在該濃度下黏附反應降低至抗MAdCAM抗體不存在時的反應之50%的抗MAdCAM抗體濃度。此檢定中1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2之IC₅₀效力描述於以下表3中。

為了在基於流動之檢定中測量抗MAdCAM mAb之拮抗效力，在經設計以模擬適於腸相關淋巴組織的高內皮小靜脈上的微血管環境的剪應力條件下，將表現MAdCAM之CHO細胞鋪板於顯微鏡載玻片(50×4mm)上且使其黏附以形成匯合單層(約2.5×10⁵個細胞)。隨後將細胞與在一系列濃度(0.1-10μg/mL)內的經親和純化之mAb在37℃下孵育20min，之後連接至流動偵測系統。將同型匹配之IgG₂或IgG₄ mAb(10μg/mL)用作陰性對照。在0.05Pa之恆定剪應力下，將正常供體末梢血淋巴球(PBL)灌注至細胞單層上方。攝錄實驗並計 算淋巴球之總黏附(滾動+牢固黏附)。在所述之條件下，所有測試之單株抗體均顯示為有效拮抗劑。

(iii)Stamper-Woodruff檢定

為了可視化MAdCAM⁺血管，根據製造商之說明書，使用在磷酸鹽緩衝鹽水中20莫耳過量的生物素-NHS(Pierce)，在1-2mg經親和純化之蛋白上產生經生物素化之抗MAdCAM mAb。使反應在室溫下靜置(30min)，並用PD-10(Pharmacia)管柱脫鹽且確定蛋白濃度。

將正常肝淋巴結自供體器官移除，於液氮中速凍並在-70℃下儲存直至使用。切割10μm恆冷切片，在聚-L離胺酸塗佈之載玻片上空氣乾燥，且在檢定之前於丙酮中固定。使用卵白素-生物素封閉系統(DAKO)封閉切片，隨後在室溫下在一系列濃度(1-50μg/mL)內的經生物素化之抗MAdCAM mAb孵育(2h)。將同型匹配之IgG₂或IgG₄ mAb(50μg/mL)用作陰性對照，且將封閉抗β₇抗體(50μg/mL)用作陽性對照。

將取自正常供體之末梢血淋巴球用小鼠抗人類CD2 mAb(DAKO)標記以實現隨後可視化黏附細胞。將5×10⁵個PBL添加至各淋巴結切片中並孵育30min，之後溫柔地淋洗以避免黏附細胞脫落。隨後將切片於丙酮中再固定，並用經生物素化之抗MAdCAM mAb(10μg/mL)再孵育，接著用經生物素化之山羊抗小鼠mAb再孵育(以識別CD2標記之PBL及未染色之MAdCAM⁺血管)，隨後用streptABcomplex/HRP(DAKO)再孵育。最後藉由將DAB受質(DAKO)添加至切片來將MAdCAM⁺血管及CD2標記之PBL可視化，其中棕色反應產物顯示陽性染色之區域。藉由計數黏附至肝門束、靜脈、或竇狀隙之50個MAdCAM-1⁺血管之淋巴球之數目來定量淋巴球黏附。隨後使用不存在任何抗體時PBL之黏附取為100%，將表示為平均值之數據正規化為百分比黏附。基於n=3個不同PBL供體並對於不同肝臟淋巴結供體編輯數據。與封閉抗β₇抗體對照相比，將經生 物素化之純化單株抗體1.7.2及7.16.6的代表性數據描繪於圖4中。

選擇性檢定：

VCAM及纖連蛋白與MAdCAM結構相近且序列同源。藉由確定其阻斷α₄β₁ ⁺/α₅β₁ ⁺Jurkat T細胞(ATCC)與其綴合細胞黏附分子結合的能力來評估經親和純化之抗MAdCAM mAb之MAdCAM特異性。在4℃下，將100μL 4.5μg/mL纖連蛋白細胞結合片段(110 Kd，Europa Bioproducts Ltd，目錄號UBF4215-18)或VCAM(Panvera)於杜爾貝寇氏PBS中之溶液吸附至96孔黑色Microfluor「B」u型底(Dynex #7805)盤隔夜。隨後將塗佈之盤倒置並吸去過量液體，之後在37℃下於10% BSA/PBS中封閉至少1小時。在此期間，將培養之Jurkat T細胞使用台盼藍排除法計數且如先前上文針對JY細胞所述用鈣黃綠素AM染料負載。將欲測試之抗體在0.1mg/ml於PBS中的BSA中從10μg/mL之最高濃度稀釋。列最後的孔用於確定總結合，所以使用0.1mg/ml於PBS中之BSA。將在PBS中製備之鋸鱗血抑肽(Bachem，目錄號H-9010)以100nM之最高濃度用於封閉α₅β₁/纖連蛋白相互作用。將抗CD106 mAb(殖株51-10C9，BD Pharmingen目錄號555645)以1μg/mL之最高濃度用於封閉α₄β₁/VCAM相互作用。

封閉之後，將盤內容物彈去，並將50μL抗體/對照添加至各孔中，且在37℃下將盤孵育20min。將鈣黃綠素負載之Jurkat T細胞如前所述洗滌一次，將最終細胞團塊於1mg/mL BSA/PBS中重懸至1×10⁶/mL。將100μL細胞添加至U型底盤之各孔中，將盤密封，簡單離心(1000rpm達2min)，隨後在37℃下將盤孵育45min。此時間結束時，將盤用Skatron盤式洗滌機洗滌，並使用Wallac Victor² 1420多標記讀取儀測量螢光(激發λ 485nm，發射λ 535nm，從盤之頂端、距底部8mm計數，以正常的發射孔徑達0.1sec)。對於各抗體，抑制程度如下文在表4中圖示(-可忽略的黏附抑制，***完全黏附抑制)。所有例示之mAb均為有效且選擇性抗MAdCAM拮抗劑，說明對MAdCAM之選擇性優於對 VCAM及纖連蛋白之選擇性實質上大於100倍。

融合瘤於2003年9月9日寄存於歐洲細胞培養保藏中心(European Collection of Cell Cultures；ECACC)，H.P.A at CAMR,Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 0JG，具有以下寄存號：

實例II： 藉由BIAcore確定完全人類抗MAdCAM單株抗體之親和力常數(K _d)

根據製造商之方案，使用BIAcore 3000儀器藉由表面電漿子共振進行經純化抗體之親和力測量。

方案1

為了進行動態分析，使用常規的胺偶合在CM5 BIAcore感測器晶片上製備高密度小鼠抗人類(IgG₂及IgG₄)抗體表面。將融合瘤上清液10、5、2倍稀釋於含有100μg/mL BSA及10mg/mL羧甲基葡聚糖之HBS-P(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.005%界面活性劑P20)運行緩衝液中或使用純品。使用1min接觸時間將各mAb捕獲至單獨的表面上，並使用5min洗滌以用於穩定mAB基線。隨後將MAdCAM-IgG₁ Fc(141nM)融合蛋白注射於全部表面上達一分鐘，接著解離3min。使用BIAcore提供之BIAevaluation軟體上可供使用之基線漂移模型，將數據針對各表面上捕獲之抗體量正規化並用朗格繆爾1：1全域擬合評估。

方案2

使用胺偶合將經親和純化之mAb固定至CM5生物感測器晶片上之葡聚糖層上。使用pH 4.5乙酸鹽緩衝液作為固定緩衝液製備晶片且達成2.5-5.5 kRU蛋白密度。運行緩衝液中MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白之樣本以範圍為0.2-55nM之濃度製備(包括僅包含運行緩衝液之0nM溶液作為零參考)。隨機化樣本，並使用HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%界 面活性劑P20)作為運行緩衝液，跨4個流動池一式兩份地注射各3min。使用100μL/min的流速最小化大量轉運限制(mass transport limitation)。監測MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白之解離180min，藉由6sev注射25mM H₃PO₄(50μL/min)或10mM(6.22.2)、20mM(6.67.1、6.73.2、6.77.1)至25mM(6.34.2)及45mM NaOH(6.14.2)來再生表面，且使用BIAevaluation(v3.1)軟體包分析數據。

表5列出本揭露之代表性抗MAdCAM抗體之親和力測量值：

動態分析指示根據本揭露製備之抗體對MAdCAM之細胞外結構域具有高親和力及強結合常數。

實例III： 抗MAdCAM mAb之表位選擇性及物種交叉反應性之識別

抗體將抗原上表面暴露之表位識別為線性(主要)序列或結構(次要)序列之區域。將Luminex表位框併法(binning)、BIAcore框併法、及物種免疫組 織化學分析一起使用，以界定抗MAdCAM抗體之功能性表位概貌。

基於Luminex之表位框併法：

將綴合MxhlgG 2,3.4之珠粒(Calbiochem Ml 1427)偶合至主要未知抗MAdCAM抗體。將150μL主要未知抗體稀釋物(0.1μg/mL稀釋於融合瘤培養基中)添加至96孔組織培養盤之孔中。將珠粒儲液溫柔地渦旋並稀釋於上清液中至0.5×10⁵個珠粒/mL之濃度。在4℃下將珠粒於上清液中在搖動器上於黑暗中隔夜。

藉由添加200μL洗滌緩衝液(含有0.05% Tween20之PBS)預濕潤96孔微量滴定濾盤(Millipore # MABVN1250)之各孔並藉由抽吸移除。接著，將50μL/孔0.5×10⁵個珠粒/mL儲液添加至濾盤中，且用洗滌緩衝液(2×100μL/孔)洗滌各孔。添加60μL/孔稀釋於融合瘤培養基(0.1μg/mL)中之MAdCAM-IgG₁ Fc抗原。將盤覆蓋並在室溫下在輕輕搖動之情況下孵育一小時。藉由添加100μL/孔洗滌緩衝液接著抽吸來洗滌各孔兩次。接著，添加60μL/孔稀釋於融合瘤培養基(0.1μg/mL)中之次要未知抗MAdCAM抗體。黑暗中在室溫下搖動盤兩小時。接著，藉由添加100μL/孔洗滌緩衝液接著抽吸來洗滌各孔兩次。接著，添加60μL/孔經生物素化之MxhIgG 2,3,4(0.5μg/mL)。黑暗中在室溫下搖動盤一小時。藉由添加100μL/孔洗滌緩衝液接著抽吸來洗滌各孔兩次。向各孔中添加60μL 1μg/mL稀釋於融合瘤培養基中之MxhIgG 2,3,4鏈親和素-PE(Pharmacia #554061)。黑暗中在室溫下搖動盤二十分鐘。藉由添加100μL/孔洗滌緩衝液接著抽吸來洗滌各孔兩次。接著，將各孔重懸於80μL封閉緩衝液(具有0.5%牛血清白蛋白、0.1% TWEEN、及0.01%硫柳汞之PBS)中，小心地上下吸取以重懸浮珠粒。

使用Luminex 100及其隨附軟體(Luminex® Corporation)讀取盤以確定發光讀數。基於針對各種測試之抗MAdCAM抗體所獲得之發光數據，根據其 結合特異性將抗MAdCAM抗體分組。進行測試之抗MAdCAM抗體分成一系列的表位倉(epitope bin)，如表8中所示。

BIAcore框併法：

以與上問所述類似之方法，BIAcore亦可用於確定本揭露所例示之抗MAdCAM抗體之表位專有性。使用胺偶合將9種抗MAdCAM抗體殖株6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、7.20.5、9.8.2、1.7.2、7.26.4、及7.16.6固定至CM5感測器晶片之獨立流動池之葡聚糖層上。固定緩衝液為10mM乙酸鹽緩衝液pH 4.5(克殖株6.22.2、6.34.2、7.20.5、9.8.2、1.7.2、7.26.4、及7.16.6)或10mM乙酸鹽緩衝液pH 5.5(殖株6.67.1及6.77.1)。在全部情況下達成約3750 RU之蛋白密度。使用1M鹽酸乙醇胺pH 8.5進行未反應N-羥基琥珀醯亞胺酯之失活。

將MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白於HBS-EP運行緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%聚山梨酯20)中稀釋至1.5μg/mL(約25nM)之濃度。隨後將其在5μL/min之速率下以50μL之體積跨第一流動池注射。注射完成之後，將第一抗體探針添加至相同的流動池中。將全部測試抗體於HBS-EP中稀釋至約20μg/mL之濃度，且亦將其在5μL/min之流速下以50μL之體積注射。當觀察不到測試抗體之結合時，之後立即注射下一測試殖株。當出現結合時，再生感測器表面以除去MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白及測試抗體。取決於存在之經固定之抗體及測試抗體，使用多種再生溶液。所用之再生條件之概述描繪於表6中。

(在全部再生程序期間流速為50μL/min)

再生之後，再次結合MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白且注射另外的測試抗體。進行此等步驟直至全部殖株均注射於結合MAdCAM-IgG₁ Fc融合蛋白之經固定之抗體之表面上。隨後將具有不同經固定之抗體及經結合之MAdCAM之新流動池用於用此9種測試殖株探測。基於其重鏈及κ輕鏈之接近的一級胺基酸序列同源性，分別為SEQ ID NO：2、4、6、8，預期抗MAdCAM抗體1.7.2及1.8.2識別相同的MAdCAM表位。據此，僅透過BIAcore反應矩陣評估1.7.2。自此分析省略抗體6.14.2及6.73.2，但全部其他抗MAdCAM抗體對組合均以此方式測試。選擇隨意的100 RU水準作為結合/非結合之間的閾值，並且基於是否觀察到結合來產生反應矩陣(表7)。

全部抗體對組合之反應矩陣。-指示無抗體探針之結合，x指示觀察到結合(超過100 RU之所選閾值水準)。

表7中之矩陣對角線(灰色陰影)代表相同探針對之結合數據。在所有實例中，除兩種殖株7.16.6及9.8.2之外，抗體均為自我封閉的。抗體7.16.6及9.8.2不交叉競爭。自我封閉之缺乏可歸因於融合蛋白中mAb誘導之構形變化，該構形變化允許mAb與MAdCAM-IgFc上之第二位點之額外結合。顯示相同反應性模式之殖株之分組產生至少6種不同的表位倉，如圖式所示(圖5)。

抗MAdCAM抗體與之相互作用的MAdCAM表位序列之進一步精確識別可藉由許多方法中之任一者確定，該等方法包括但不限於，斑點肽文庫陣列之西分析(Reineke等人，Curr.Topics in Microbiol.and Immunol 243：23-36(1999),M.Famulok,E-L Winnacker,C-H Wong eds.,Springer-Verlag,Berlin)、噬菌體或細菌鞭毛蛋白/fliC表現文庫顯示、或有限蛋白水解之後經結合之蛋白片段之簡單MALDI-TOF分析。

免疫組織化學檢定：

將OCT或蔗糖包埋之回腸(派亞氏淋巴叢)、腸系膜淋巴結、脾、胃、十二指腸、空腸、及結腸之冷凍組織標本用作抗MAdCAM mAb之陽性染色對照。為了用類IgG₂ mAb將類切片染色，產生抗MAdCAM mAb之經生物素化之 衍生物。切割10μm冷凍之組織切片至聚L-離胺酸塗佈之載玻片上，直接放入4℃ 100%丙酮中(10min)，隨後放入於甲醇中之3%過氧化氫中(10min)，在步驟之間用PBS洗滌。用生物素封閉系統(DAKO目錄號X0590)封閉載玻片，之後於PBS中與一級抗體(1：100-1：1000)一起孵育(1h)，用PBS-Tween 20(0.05%)洗滌，隨後用HRP-鏈親和素(BD Bioscience目錄號550946，30min)及DAB受質(Sigma目錄號D5905)結合顯影。對於IgG₄ mAb，使用HRP綴合之小鼠抗人類IgG₄(Zymed目錄號3840)二級抗體。用邁爾氏蘇木精明礬染劑(Mayer，s Haemalum)複染載玻片(1min)，洗滌，隨後安裝於DPX中。

比較對許多物種(小鼠、大鼠、兔、狗、豬、食蟹獼猴、及人類組織)的結合親和力。藉由免疫組織化學法，抗MAdCAM抗體對大鼠、兔、及豬組織沒有反應性，並且當藉由ELISA分析時，抗MAdCAM抗體對重組小鼠MAdCAM沒有交叉反應性。對人類、食蟹獼猴、及狗組織之數據以表格形式表示，如下表8：

根據注釋，抗MAdCAM抗體結合專門內皮結構及淋巴組織由陰影 指示。各抗體之基於Luminex表位分析之表位倉及MAdCAM交叉反應性模式經指示。與1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2(粗體)之數據相比，抗MAdCAM抗體6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.3、及6.77.1(斜體)之Luminex表位框併法數據衍生自單獨實驗，如藉由字體特徵之差異所表示。

所有測試之抗MAdCAM抗體具有識別在胃腸道血管內皮區室上表現之人類MAdCAM表位之能力。除1.7.2及1.8.2，所有其他測試之抗MAdCAM抗體能夠特異性結合食蟹獼猴胃腸道之血管內皮區室。某些其他抗MAdCAM抗體，即6.14.2及6.67.1亦具有特異性識別狗MAdCAM直系同源物以及食蟹獼猴MAdCAM之能力。

表現功能活性嵌合食蟹獼猴/人類MAdCAM之CHO細胞株之產生：

某些抗MAdCAM抗體對人類及食蟹獼猴MAdCAM之結合親和力之差異使吾等確定是否可得出針對此觀察結果之結構基礎。

基於公佈之食蟹獼猴MAdCAM之胺基酸序列(Shyjan AM等人，J Immunol.,156,2851-7(1996))，設計引物以PCR擴增食蟹獼猴MAdCAM α₄β₇結合結構域序列。根據製造商之說明書，使用Trizol法(Invitrogen)由冷凍的切除之食蟹獼猴腸系膜淋巴結(約200mg)製備總RNA。將1-2μg用寡-dT作為引物並用AMV反轉錄酶(Promega)反轉錄。將一部分反轉錄產物經受在於1M GC melt(Clontech)中之GC-2聚合酶中且退火溫度為62℃之PCR，其中正向引物為5'-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3'(SEQ ID NO：67)且反向引物為5'-GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3'(SEQ ID NO：68)。切除適當大小的RT-PCR產物，並在電泳之後自1%瓊脂糖凝膠純化，隨後選殖之TOPO-TA(Invitrogen)在pCR2.1之EcoRI位點之間。通過測序確認插入序列。核苷酸及預測轉譯之胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO 49及50。

當比對(圖3提供此序列比對)時，針對α₄β₇結合結構域之預測人類及 食蟹獼猴MAdCAM胺基酸序列顯示高程度的序列一致性(90.8%)。為了產生表現功能活性食蟹獼猴MAdCAM之細胞株，其模擬表8中呈現之抗MAdCAM結合模式，將pCR2.1載體中對應於食蟹獼猴α₄β₇結合結構域序列之SacI片段直接亞選殖至C端人類MAdCAM pIND-Hygro構築體中，該構築體含有羧基端黏蛋白莖(mucin stalk)及跨膜結構域，如上文所述。根據製造商之說明書，驗證序列和定向，隨後將KpnI/NotI片段選殖至pEF5FRTV5GWCAT載體(Invitrogen)，置換CAT編碼序列且用於轉染以在Flp In CHO細胞(Invitrogen)中產生單個穩定表現之殖株。

抗MAdCAM抗體殖株與表現食蟹獼猴/人類MAdCAM嵌合體之CHO細胞之結合係藉由流動式細胞測量術來評估，且使用與上文所述非常類似的JY細胞黏附檢定法確定抗MAdCAM抗體之功能活性。抗MAdCAM抗體之結合及功能活性表現於表9中。

總的來說，給定抗MAdCAM抗體與人類或食蟹獼猴MAdCAM之結合(如藉由免疫組織化學法以基於重組細胞之結合所偵測(表8))與功能活性(表9)之間有良好的關聯。例如，抗MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2、及6.73.2說明一致缺乏與表現嵌合食蟹獼猴/人類MAdCAM蛋白之食蟹獼猴組織及細胞的結合。抗-MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2、及6.73.2在食蟹獼猴/人類MAdCAM/JY黏附檢定法中亦不具有偵測功能性阻斷活性之能力。

相似方法可用於界定識別狗MAdCAM之抗MAdCAM抗體6.14.2及6.67.1之表位。

實例IV： 抗MAdCAM mAb在偵測循環可溶性MAdCAM作為疾病診斷方法中的用途

抗MAdCAM抗體可用於偵測循環可溶性MAdCAM(sMAdCAM)。對在臨床血漿、血清樣本、或其他生物流體諸如但不限於糞便、尿、痰中sMAdCAM之偵測可能為對潛在疾病包括但不限於發炎性腸病的實用代用疾病生物標誌物。

基於表位框併法數據(表7及8)，抗MAdCAM抗體1.7.2及7.16.6顯示識別人類MAdCAM上之不同表位。在4℃下，用100μL/孔50μg/mL於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之1.7.2溶液塗佈ELISA盤隔夜。孵育之後，將盤用含有10%牛奶之PBS封閉緩衝液(200μL/孔)封閉1.5小時。孵育之後，將盤用PBS(2×100μL/孔)洗滌，且將最終體積為100μL之MAdCAM-IgG1-Fc融合蛋白之系列稀釋液(自於PBS中50μg/mL之最高濃度至約5ng/mL)添加至盤中以供在室溫下孵育2小時。以相似的方法，可將MAdCAM-IgG1-Fc蛋白於血漿或血清或一些其他此類相關生物看流體中稀釋並用於確定臨床樣本中可溶性MAdCAM之表現，如下文所述。作為陰性對照，僅將緩衝液添加至含有一級抗MAdCAM抗體之孔中。之後，將盤用PBS(3×100μL/孔)洗滌，隨後將盤與Alexa488標記之7.16.6 (100μL，5μg/mL)一起於黑暗中孵育。根據製造商之方案，使用可商購獲得之套組(Molecular Probes,A-20181)產生Alexa488標記之7.16.6。

將盤用含有0.05% Tween-20之PBS洗滌，且藉由測量螢光來確定經標記之7.16.6與捕獲之可溶性MAdCAM之結合(Wallac Victor² 1420多標記讀取儀，激發λ 485nm，發射λ 535nm，從盤之頂端、距底部3mm計數，以正常的發射孔徑達0.1sec)。當隨MAdCAM-IgG1-Fc融合蛋白濃度變化對螢光作圖(圖6)時，其指示1.7.2及經標記之7.16.6可出於診斷目的用於確定生物流體或臨床樣本中表現之循環可溶性MAdCAM之水準。此三明治ELISA方法不限於使用1.7.2及7.16.6，而是可使用識別MAdCAM上之不同表位的抗MAdCAM抗體之任何組合，如表7及圖5之數據及解釋所概述。類似策略可應用於用所述之其他抗MAdCAM抗體，使用不同配偶體、變異體、標記等開發類似檢定，例如免疫組織化學及西方墨點法。

實例V： 根據本揭露製備之抗MAdCAM mAb之胺基酸結構

在以下討論中，提供與根據本揭露製備之抗MAdCAM mAb相關的結構資訊。

為了分析根據本揭露產生之mAb之結構，吾等對來自具體融合瘤殖株之編碼重鏈及輕鏈片段之基因進行選殖。基因選殖及測序係如下完成：使用Fast-Track套組(Invitrogen)自衍生自經免疫之XenoMouse小鼠之約2×10⁵個融合瘤細胞單離出聚(A)+mRNA。用隨機引物產生cDNA，之後進行PCR。將人類VH或Vκ家族特異性引物(Marks等人，『Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes』；Eur.J.Immunol.,21,985-991(1991))或通用人類VH引物MG-30(5'-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEQ ID NO：108)結合特異於人類Cγ2之引物MG40-d(5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3(SEQ ID NO：109)、或特異於Cγ4恆定區之引物MG-40d(5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T-3(SEQ ID NO：110))、或特異於Cκ恆定區之引物(hκP2；如先前Green等人，1994中所述)使用。來自融合瘤之人類mAb衍生之重鏈及κ鏈轉錄本之序列係藉由直接測序使用上文所述之引物由聚(A+)RNA產生之PCR產物獲來得。使用TOPO-TA選殖套組(Invitrogen)將PCR產物選殖至pCR2.1中，並使用Prism染料終止測序套組及ABI 377測序儀對兩條股測序。藉由與『V BASE序列目錄』(Tomlinson等人，J.Mol.Biol.,227,776-798(1992)；Hum.Mol.Genet.,3,853-860(1994)；EMBO J.,14,4628-4638(1995))比對來分析全部序列。

進一步，使各抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod經歷全長DNA測序。為此，使用RNeasy套組(Qiagen)，自約3-6×10⁶個融合瘤細胞單離出總RNA。使用寡-dT及基於AMV之反轉錄酶系統(Promega)來反轉錄mRNA。對於如表10中所描繪之具體重鏈及κ鏈，將VBASE用於設計5'特異性擴增引物，其含有最佳Kozak序列及ATG起始密碼子(下劃線)，以及3'反向引物。

表10：用於自顯現抗MAdCAM mAb之融合瘤擴增cDNA的PCR引物對及用於構築抗MAdCAM抗體之經修飾之變異體的引物。

使用Expand高保真Taq聚合酶(Roche)將引物對用於擴增cDNA，且 將PCR產物選殖至pCR2.1 TOPO-TA(Invitrogen)以供後續測序。隨後分別使用XbaI/EcoRI及HindIII/EcoRI位點將經驗證重鏈及κ輕鏈序列之殖株選殖至pEE6.1及pEE12.1載體(LONZA)中。

基因利用分析

表11：重鏈及κ輕鏈基因利用 序列分析

為了進一步檢查抗體結構，自獲自殖株之cDNA獲得抗體之預測胺基酸序列。

序列識別號(SEQ ID NO：)1-48及51-68提供抗MAdCAM抗體1.7.2(SEQ ID NO 1-4)、1.8.2(SEQ ID NO 5-8)、6.14.2(SEQ ID NO 9-12)、6.22.2(SEQ ID NO 13-16)、6.34.2(SEQ ID NO 17-20)、6.67.1(SEQ ID NO 21-24)、6.73.2(SEQ ID NO 25-28)、6.77.1(SEQ ID NO 29-32)、7.16.6(SEQ ID NO 33-36)、7.20.5(SEQ ID NO 37-40)、7.26.4(SEQ ID NO 41-44)、9.8.2(SEQ ID NOS 45-48)及經修飾抗MAdCAM抗體6.22.2-mod(SEQ ID NO 51-54)、6.34.2-mod(SEQ ID NO 55-58)、6.67.1-mod(SEQ ID NO 59-62)、及6.77.1-mod(SEQ ID NO 63-66)、及7.26.4-mod(SEQ ID NO 41-42,67-68)之核苷酸及重鏈與κ輕鏈胺基酸序列。對於選殖之各 抗MAdCAM抗體序列，將信號肽序列(或編碼該序列之鹼基)之序列以小寫及下劃線指示。

圖1A-1J提供抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2之預測重鏈胺基酸序列與相應生殖系基因產物之胺基酸序列之間的序列比對。抗體之CDR1、CDR2、及CDR3序列之位置以下劃線表示，經表現之序列與對應生殖系序列之間的差異以粗體指示，且相較於生殖系序列在表現之序列中有添加的地方，將其在生殖系序列中呈(-)指示。

圖1K-1T提供抗體1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、及9.8.2之預測的κ輕鏈胺基酸序列與相應生殖系基因產物之胺基酸序列之間的序列比對。抗體之CDR1、CDR2、及CDR3序列之位置以下劃線表示，經表現之序列與對應生殖系序列之間的差異以粗體指示，且較於生殖系序列在經表現之序列中有添加的地方，將其在生殖系序列中呈(-)指示。

轉譯後修飾：糖基化及脫醯胺之存在：

較於衍生之生殖系序列，在經表現之抗MAdCAM抗體序列中之一些改變的效應為引入可能可經歷N連接的糖基化(Asn-X-Ser/Thr)及脫醯胺(Asn-Gly)之殘基(參見表12)。編碼抗MAdCAM抗體6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4、及9.8.2之κ輕鏈可變結構域之胺基酸序列(SEQ ID NO：16、20、24、28、32、44、及48)及抗體6.14.2之重鏈可變結構域(SEQ ID NO：10)之核酸序列預測N-連接糖基化之存在。使用SDS-PAGE及Pro-Q® Emerald 488醣蛋白(Molecular Probes)染色之組合，用mAb 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4及9.8.2研究此轉譯後修飾之存在。

簡言之，使用MOPS緩衝液將約2μg還原抗MAdCAM抗體負載至 4--12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上。電泳之後，將凝膠在50% MeOH、5%乙酸中固定並在3%乙酸中洗滌。隨後用高碘酸氧化凝膠上之任何醣並使用Pro-Q® Emerald 488醣蛋白染色套組(Molecular Probes)染色。在最後的洗滌步驟之後，使用設定成波長473nm之螢光掃描儀可視化醣蛋白染色。

醣蛋白染色之後，使用SYPRO Ruby蛋白凝膠染料對凝膠進行總蛋白染色並使用設定成波長473nm之螢光掃描儀分析。抗MAdCAM抗體6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4、及9.8.2之κ輕鏈全部經陽性染色，代表糖基化之存在。作為額外確認，將抗MAdCAM抗體7.26.4經歷胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶消化，LC-MS/MS分析確認經修飾之胰蛋白酶肽之存在並額外確認κ輕鏈糖基化。

抗MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2、6.22.2、及7.20.5之CDR1區中之具體Asn-Gly序列使得此等區域對脫醯胺敏感。在中性pH下的脫醯胺引入一個負電荷且亦可導致β-異構化，其可影響抗體之性質。對於抗-MAdCAM抗體1.7.2、1.8.2、及7.20.5，脫醯胺之Asn-異天冬胺酸殘基之存在藉由在用MeOH俘獲異天冬胺酸側鏈之後用質譜法評估。

簡言之，對於抗MAdCAM抗體1.7.2，選擇胰蛋白酶/Asp-N肽SSQSLLQSNGYNYL(SEQ ID NO：69)(1573.7Da)之狀態以供LC-MS/MS監測。將抗MAdCAM抗體1.7.2在10mM DTT中還原，在5mM碘乙酸鈉中烷化，隨後經緩衝液交換成胰蛋白酶消化緩衝液(50mM Tris-HCl、1mM CaCl₂，pH 7.6)。隨後將抗體以1：20之蛋白酶：蛋白比與測序級經修飾之胰蛋白(Promega)混合。將蛋白在30℃下於胰蛋白酶中消化15小時，且使用Ettan LC系統上之C-18 RPC藉由HPLC分離所得肽。從管柱收集含有³³Asn之肽(4032Da)並稀釋於Asp-N消化緩衝液(50mM磷酸鈉緩衝液，pH 8.0)中。隨後以約10：1之肽：酶比添加內蛋白酶Asp-N(Roche)。

將乙醯氯(100μL)添加至甲醇樣本(1mL，-20℃)中，將混合物升溫至室溫。在Speed-Vac中乾燥胰蛋白酶+Asp-N消化物，隨後添加5μL甲醇/乙醯氯(45min，室溫)，隨後於Speed-Vac中再次乾燥。將所得殘餘物於0.1% TFA中重構，且將肽於Voyager-DE STR MALDI-TOF質譜儀上使用硝化纖維素薄層樣本製備法，或使用C18 ZipTips(Millipore)隨後與α-腈基基質液滴混合之反相純化進行初始分析。亦在如上文之Deca XP Plus Ion Trap質譜儀上使用LC-MS/MS分析甲基化之肽混合物。將溶離物直接投入至Ion Trap MS中，隨後藉由MS及MS/MS分析肽。MS經設定以分析在300與2000Da之間的全部離子。隨後將任何特定掃描中之最強離子經歷MS/MS分析。

誘變研究：

本揭露中例示之抗MAdCAM抗體之一級胺基酸序列可藉由定點誘變來修飾，以移除轉譯後修飾(例如，糖基化、脫醯胺)之潛在位點或改變同型背景，或工程改造可改善治療效用之其他改變。例如，使用PCR以工程改造抗MAdCAM抗體6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、及7.26.4之改變以將某些架構序 列恢復至生殖系，移除潛在糖基化位點，及/或將同型背景改變成人類IgG₂。將pCR2.1 TOPO-TA選殖之cDNA(100ng)(其對應於重鏈核苷酸SEQ ID NO：13、17、21、及29)及κ輕鏈核苷酸(SEQ ID NO：15、19、23、31、及43)在使用重疊-延伸及表10中所述之一組引物組的一系列PCR中用作模板。

6.22.2重鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：13表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組6.22.2_VH_F1及6.22.2VH_CS*(1)及VH3-33及6.22.2_VH_R1(2)用於產生單獨的PCR產物(1)及(2)。純化產物(1)及(2)並在第三PCR步驟中將其(各約50ng)與VH3-33及VK6.22.2_CS*引物組合，以產生經修飾之6.22.2重鏈V-結構域。此經修飾之型式在FR1中含有His/Phe突變且引入XbaI限制位點以實現符合讀框地選殖至pEE6.1衍生載體(稱為pEE6.1CH)中，該載體含有對應的人類IgG₂恆定結構域。將最終PCR片段選殖至pEE6.1CH之XbaI位點中，檢查其定向並驗證插入的全長序列。經修飾之6.22.2重鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：51中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：52中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.22.2 κ輕鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：15表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組6.22.2_VK_F1及revκ(1)及A26及6.22.2_VK_R1(2)用於產生單獨的PCR產物(1)及(2)。純化產物(1)及(2)並在第三PCR步驟中將其(各約50ng)與A26及revκ引物組合，以產生經修飾之6.22.2 κ輕鏈V-結構域。此經修飾之型式含有對FR3序列之Asn/Asp及Gly/Ser改變。使用HindIII/EcoR1位點將所得PCR產物選殖至pEE12.1中並充分驗證序列。經修飾之6.22.2 κ輕鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：53中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：54中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.34.2重鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：17表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組6.34.2_VH_F1及6.22.2VH_CS*(1)及VH3-30及6.34.2_VH_R1(2)用於產生單獨的PCR產物(1)及(2)。純化產物(1)及(2)並在第三PCR步驟中將其(各約50ng)與VH3-30及VK6.22.2_CS*引物組合，以產生經修飾之6.34.2重鏈V-結構域。此經修飾之型式在FR3中含有Ser/Arg突變且引入XbaI限制位點以實現符合讀框地選殖至pEE6.1衍生載體(稱為pEE6.1CH)中，該載體含有對應的人類IgG2恆定結構域。將最終PCR片段選殖至pEE6.1CH之XbaI位點中，檢查其定向並驗證插入的全長序列。經修飾之6.34.2重鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：55中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：56中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.34.2 κ輕鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：19表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組O12及6.34.2_VK_R1(1)、6.34.2_VK_F1及6.34.2_VK_R2(2)、以及6.34.2_VK_F2及revκ(3)用於產生單獨的PCR產物(1)、(2)、及(3)。純化產物(1)、(2)、及(3)並在第三PCR步驟中將(1)及(2)(各約50ng)與O12及6.34.2_VK_R2引物組合，以產生PCR產物(4)。在第四PCR步驟中將PCR產物(2)及(3)(各約50ng)與6.34.2_VK_F1及revκ組合，以產生PCR產物(5)。純化PCR產物(4)及(5)，並將其(各約50ng)與引物O12及revκ組合以產生經修飾之6.34.2 κ輕鏈V-結構域。此經修飾之型式含有CDR1中之Asn/Ser改變、FR2中之Phe/Tyr改變、及FR3序列之Arg-Thr/Ser-Ser、Asp/Glu、及Ser/Tyr改變。使用HindIII/EcoR1位點將所得PCR產物選殖至pEE12.1中並充分驗證序列。經修飾之6.34.2 κ輕鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：57中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：58中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.67.1重鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：21表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組6.67.1_VH_F1及6.67.1VH_CS*(1)及VH4-4及6.67.1_VH_R1(2)用於產生單獨的PCR產物(1)及(2)。純化產物(1)及(2)並在第三PCR步驟中將其(各約50ng)與VH4-4及VK6.67.1_CS*引物組合，以產生經修飾之6.67.1重鏈V-結構域。此經修飾之型式在FR3中含有Ile-Leu-Ala/Met-Ser-Val轉變且引入XbaI限制位點以實現符合讀框地選殖至pEE6.1衍生載體(稱為pEE6.1CH)中，該載體含有對應的人類IgG2恆定結構域。將最終PCR片段選殖至pEE6.1CH之XbaI位點中，檢查其定向並驗證插入的全長序列。經修飾之6.67.1重鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：59中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：60中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.67.1 κ輕鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：23表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組6.67.1_VK_F1及revκ(1)及B3及6.67.1_VK_R1(2)用於產生單獨的PCR產物(1)及(2)。純化產物(1)及(2)並在第三PCR步驟中將其(各約50ng)與B3及revκ引物組合，以產生經修飾之6.67.1 κ輕鏈V-結構域。此經修飾之型式包含CDR1中之Thr/Asn改變及FR2中之Arg/Gly改變。使用HindIII/EcoR1位點將所得PCR產物選殖至pEE12.1中並充分驗證序列。經修飾之6.67.1 κ輕鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：61中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：62中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.77.1重鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：29表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組VH 3-21及6.22.2VH_CS*用於產生單一PCR產物。將PCR產物用XbaI消化，凝膠純化，且選殖至pEE6.1CH之XbaI位點，檢查取向。將插入序列進行充分的序列驗證。 經修飾之6.77.1重鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：63中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：64中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.77.1 κ輕鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：31表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組A2及6.77.1_VK_R1(1)、6.77.1_VK_VK_F1及6.77.1_R2(2)、以及6.77.1_VK_F2及revκ(3)用於產生單獨的PCR產物(1)、(2)、及(3)。純化產物(1)、(2)、及(3)並在第三PCR步驟中將(1)及(2)(各約50ng)與A2及6.77.1_VK_R2引物組合，以產生PCR產物(4)。在第四PCR步驟中將PCR產物(2)及(3)(各約50ng)與6.77.1_VK_F1及revκ引物組合，以產生PCR產物(5)。純化PCR產物(4)及(5)，並將其(各約50ng)與引物A2及JK2組合以產生經修飾之6.77.1 κ輕鏈V-結構域。此經修飾之型式包含CDR1中之Asn/Lys改變、FR3中之Ser/Tyr改變、及CDR3序列中之Cys/Ser殘基改變。使用HindIII/EcoR1位點將所得PCR產物選殖至pEE12.1中並充分驗證序列。經修飾之6.77.1κ輕鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：65中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：66中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

7.26.4 κ輕鏈：使用Expand Taq聚合酶及核苷酸序列SEQ ID NO：43表示之pCR2.1 TOPO-TA cDNA模板(100ng)，將PCR引物組7.26.4_VK_F1及revκ(1)及A2及7.26.4_VK_R1(2)用於產生單獨的PCR產物(1)及(2)。純化產物(1)及(2)並在第三PCR步驟中將其(各約50ng)與A2及revκ引物組合，以產生經修飾之7.26.4 κ輕鏈V-結構域。此經修飾之形式包含CDR1中之Asn/Ser變化。使用HindIII/EcoR1位點將所得PCR產物選殖至pEE12.1中並充分驗證序列。經修飾之7.26.4 κ輕鏈之核苷酸序列存在於SEQ ID NO：67中，且對應胺基酸序列訊在於SEQ ID NO：68中。核苷酸序列及胺基酸序列中較於親本之變化經指示。

6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、及7.26.4之經修飾之型式稱為 6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod，並且其重鏈核苷酸序列分別表示為SEQ ID NO：51、55、59、63、及41，對應胺基酸序列為SEQ ID NO：52、56、60、64、及42，以及κ輕鏈核苷酸序列為SEQ ID NO：53、57、61、65、及67，對應胺基酸序列為SEQ ID NO：54、58、62、66、及68，用於其中各變型之功能性真核生物表現載體係如下組裝：用NotI/SalI自pEE6.1CH載體切除對應於6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、及6.77.1-mod之重鏈cDNA插入序列，用NotI/SalI自pEE6.1載體上切除7.26.4重鏈之親本型式，且將經純化之片段選殖至對應的含有6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod之κ輕鏈序列之經修飾之型式的pEE12.1載體中相同的位點中。確認載體之序列，並將經純化之量的載體用於短暫轉染HEK 293T細胞。簡言之，將9×10⁶個HEK 293T細胞(在轉染前一天接種於T165燒瓶並洗滌至Optimem中)根據製造商之說明書使用Lipofectamine PLUS(Invitrogen)用對應於6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod之載體cDNA(40μg)短暫轉染。將細胞孵育3h，隨後用含有10%超低IgG胎牛血清(Invitrogen 16250-078)及L-麩醯胺(50mL)之DMEM(Invitrogen 21969-035)培養基置換轉染培養基。5天後收穫培養上清液，過濾滅菌，且以與上文所述類似之方式將抗MAdCAM抗體使用蛋白G瓊脂糖親和力層析法純化。藉由Bradford檢定法定量回收之抗體之量(20-100μg)。

將對應於6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod之親和純化之抗體之抗MAdCAM活性如先前所述於MAdCAM-IgG1-Fc融合檢定中評估。此等抗MADCAM抗體與其所衍生之親本抗MAdCAM抗體相比之IC₅₀值呈現於表13中。上文所述之胺基酸取代對經修飾之抗MAdCAM抗體之活性的影響與其親本相比很小。該等抗體亦保持其與表現重組人類MAdCAM或食蟹獼猴/人類MAdCAM嵌合體之CHO細胞的結合。

實例VI 藉由阻斷抗MAdCAM抗體之末梢循環中β ₇ ⁺淋巴球之增加

開發識別且關聯抗MAdCAM抗體之機制效應及其在血液中之循環水準之檢定法。抑制性抗MAdCAM抗體應該具有抑制表現α₄β₇整合素之白血球向胃腸道募集之效應。攜帶α₄β₇整合素之白血球之類別因而應該限於末梢循環。

這在食蟹獼猴中用完全人類抗人類MAdCAM mAb 7.16.6說明。

將經純化之抗人類MAdCAM mAb 7.16.6(1mg/kg)或媒劑(20mM乙酸鈉、0.2mg/mL聚山梨酯80、45mg/mL甘露醇、及0.02mg/mL EDTA，pH 5.5)經由隱靜脈藉由靜脈內投與至兩組食蟹獼猴(n=4/組)以類似方式評估。給藥後3天藉由股靜脈穿刺將血液樣本收集於EDTA管中。與食蟹獼猴α₄β₇整合素交叉反應的LPAM特異性抗體不可商購獲得，所以用抗β₇抗體(識別α₄β₇及α_Eβ₇整合素)代替。根據下表(表15)，將抗體(30μL)添加至含有100μL食蟹獼猴血液的管中，藉由輕輕渦旋來混合，且在4℃下孵育20-30min。

向各管中添加1mL 1：10 FACSlyse溶液(BD # 349202)，藉由輕輕渦旋來混合，且在室溫下於黑暗中孵育約12分鐘直至紅血球完全溶解。隨後將2mLBD染色緩衝液(#554656)添加至各管種，混合且在室溫下以250 x g離心6-7min。傾析出上清液並將團塊重懸浮於3mL染色緩衝液中，再次混合，且在室溫下以250 x g離心6-7min。將含有w/v多聚甲醛(100μL)之Cytofix緩衝液(BD # 554655)添加至來自猴末梢血液之細胞團塊中且藉由低速/中速渦旋器充分混合。將樣本在黑暗中在4℃下保存直至於FACSCalibur上獲得。就在獲取之前，將PBS(100μL)添加至所有管中，之後進行獲取。通過適當的閘控(gating)及象限分析獲得CD4⁺β₇ ⁺CD95loCD28⁺(純真細胞)、CD4⁺β₇ ⁺CD95hiCD28⁺(中央記憶細胞)、CD4⁺β₇-CD95hiCD28⁺(中央記憶細胞)、CD4⁺β₇ ⁺CD95hiCD28^-(效應記憶細胞)之絕對細胞數。其他T細胞亞組，例如CD8⁺T中央記憶細胞(β₇ ⁺CD8⁺CD28⁺CD95⁺)及攜帶MAdCAM配位體之任何其他白血球亦可藉由此方法用適當的抗體進行分析。載體對照相比，抗MAdCAM mAb 7.16.6引起循環CD4⁺β₇ ⁺CD95hiCD28⁺中央記憶T細胞水準增加約3倍，如圖7中所示。對循環CD4⁺β₇-CD95hiCD28⁺中央記憶T細胞群沒有影響，指示抗MAdCAM mAb 7.16.6之效應特異於腸歸巢T細胞。抗MAdCAM mAb 7.16.6(食蟹獼猴中)對循環(α₄)β₇ ⁺淋巴球群的影響指示此為機制生物標誌物之一穩健的代用證據，特別是在臨床背景中的實際應用方面。

序列

SEQ ID NO：1-48、51-68、及148-150提供13種人類抗MAdCAM抗體之重鏈及κ輕鏈之核苷酸序列及胺基酸序列、食蟹獼猴MAdCAM α₄β₇結合結構域序列之核苷酸及胺基酸序列、以及5種經修飾之人類抗MAdCAM抗體之核苷酸及胺基酸序列。

SEQ ID NO：1-48及148-150提供13種人類單株抗MAdCAM抗體之重鏈及κ輕鏈之核苷酸序列及胺基酸序列：1.7.2(SEQ ID NO：1-4)、1.8.2(SEQ ID NO：5-8)、6.14.2(SEQ ID NO：9-12)、6.22.2(SEQ ID NO：13-16)、6.34.2(SEQ ID NO：17-20)、6.67.1(SEQ ID NO：21-24)、6.73.2(SEQ ID NO：25-28)、6.77.1(SEQ ID NO：29-32)、7.16.6(SEQ ID NO：33-36)、7.20.5(SEQ ID NO：37-40)、7.26.4(SEQ ID NO：41-44)、9.8.2(SEQ ID NO：45-48)、X481.2(SEQ ID NO：35,148-150)。

SEQ ID NO：49-50提供食蟹獼猴MAdCAM α₄β₇結合結構域之核苷酸及胺基酸序列。

SEQ ID NO：51-68提供經修飾之單株抗MAdCAM抗體之重鏈及κ輕鏈核苷酸序列及胺基酸序列：6.22.2(SEQ ID NO：51-54)、經修飾之6.34.2(SEQ ID NO：55-58)、經修飾之6.67.1(SEQ ID NO：59-62)、經修飾之6.77.1(SEQ ID NO：63-66)；以及經修飾之單株抗MAdCAM抗體之κ輕鏈核苷酸序列及胺基酸序列：經修飾之7.26.4(SEQ ID NO：67-68)。

SEQ ID NO：70-106及108-110提供各種引物序列。

說明：

信號序列：加下劃線之小寫字母

經修飾之抗MAdCAM抗體序列中相較於親本之胺基酸變化：加下劃線之大寫字母

SEQ ID NO.1

1.7.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.2

1.7.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.3

1.7.2 κ轻链核苷酸序列

SEQ ID NO.4

1.7.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.5

1.8.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.6

1.8.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.7

1.8.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.8

1.8.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.9

6.14.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.10

6.14.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.11

6.14.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.12

6.14.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.13

6.2.2.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.14

6.22.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.15

6.22.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.16

6.22.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.17

6.34.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.18

6.34.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.19

6.34.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.20

6.34.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.21

6.67.1重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.22

6.67.1預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.23

6.67.1 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.24

6.67.1預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.25

6.73.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.26

6.73.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.27

6.73.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.28

6.73.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.29

6.77.1重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.30

6.77.1預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.31

6.77.1 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.32

6.77.1預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.33

7.16.6重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.34

7.16.6預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.35

7.16.6 κ輕鏈核苷酸序列及X481.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.36

7.16.6 κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.37

7.20.5重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.38

7.20.5預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.39

7.20.5 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.40

7.20.5預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.41

7.26.4重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.42

7.26.4預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.43

7.26.4 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.44

7.26.4預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.45

9.8.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.46

9.8.2預測重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.47

9.8.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.48

9.8.2預測κ輕鏈蛋白序列

SEQ ID NO.49

食蟹獼猴MAdCAM α₄β₇結合結構域之核苷酸序列

SEQ ID NO.50

食蟹獼猴MAdCAM α₄β₇結合結構域之胺基酸序列

SEQ ID NO.51

經修飾6.22.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.52

經修飾6.22.2重鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.53

經修飾6.22.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.54

經修飾6.22.2 κ輕鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.55

經修飾6.34.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.56

經修飾6.34.2重鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.57

經修飾6.34.2 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.58

經修飾6.34.2 κ輕鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.59

經修飾6.67.1重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.60

經修飾6.67.1重鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.61

經修飾6.67.1 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.62

經修飾6.67.1 κ輕鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.63

經修飾6.77.1重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.64

經修飾之6.77.1重鏈蛋白序列

SEQ ID NO.65

經修飾6.77.1 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.66

經修飾6.77.1 κ輕鏈胺基酸序列

SEQ ID NO.67

經修飾7.26.4 κ輕鏈核苷酸序列

SEQ ID NO.68

經修飾7.26.4 κ輕鏈胺基酸序列

SEQ ID NO：148

X481.2重鏈胺基酸序列

SEQ ID NO：149

X481.2重鏈核苷酸序列

SEQ ID NO：150

X481.2輕鏈胺基酸序列

<110> PFIZER INC.

<120> MAdCAM抗體

<140> 107124340

<141> 2018-07-13

<160> 150

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1392

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 463

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 1392

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 463

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 1404

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

<210> 10

<211> 467

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

<210> 11

<211> 711

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

<210> 12

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

<210> 13

<211> 1398

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

<210> 14

<211> 465

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

<210> 15

<211> 705

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

<210> 16

<211> 233

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

<210> 17

<211> 1410

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

<210> 18

<211> 469

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

<210> 19

<211> 714

<212> DNA

<213> 智人

<400> 19

<210> 20

<211> 236

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

<210> 21

<211> 1413

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

<210> 22

<211> 470

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 729

<212> DNA

<213> 智人

<400> 23

<210> 24

<211> 241

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

<210> 25

<211> 1419

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

<210> 26

<211> 471

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

<210> 27

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 27

<210> 28

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

<210> 29

<211> 1434

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

<210> 30

<211> 472

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 723

<212> DNA

<213> 智人

<400> 31

<210> 32

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

<210> 33

<211> 1410

<212> DNA

<213> 智人

<400> 33

<210> 34

<211> 469

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

<210> 35

<211> 723

<212> DNA

<213> 智人

<400> 35

<210> 36

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

<210> 37

<211> 1416

<212> DNA

<213> 智人

<400> 37

<210> 38

<211> 471

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

<210> 39

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 39

<210> 40

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人

<400> 40

<210> 41

<211> 1410

<212> DNA

<213> 智人

<400> 41

<210> 42

<211> 469

<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

<210> 43

<211> 723

<212> DNA

<213> 智人

<400> 43

<210> 44

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

<210> 45

<211> 1389

<212> DNA

<213> 智人

<400> 45

<210> 46

<211> 462

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

<210> 47

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 47

<210> 48

<211> 238

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

<210> 49

<211> 681

<212> DNA

<213> 食蟹猴

<400> 49

<210> 50

<211> 227

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 50

<210> 51

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈核苷酸序列

<400> 51

<210> 52

<211> 464

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈胺基酸序列

<400> 52

<210> 53

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈核苷酸序列

<400> 53

<210> 54

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈胺基酸序列

<400> 54

<210> 55

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈核苷酸序列

<400> 55

<210> 56

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈胺基酸序列

<400> 56

<210> 57

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈核苷酸序列

<400> 57

<210> 58

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈胺基酸序列

<400> 58

<210> 59

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈核苷酸序列

<400> 59

<210> 60

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈胺基酸序列

<400> 60

<210> 61

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈核苷酸序列

<400> 61

<210> 62

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈胺基酸序列

<400> 62

<210> 63

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈核苷酸序列

<400> 63

<210> 64

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體重鏈胺基酸序列

<400> 64

<210> 65

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈核苷酸序列

<400> 65

<210> 66

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈胺基酸序列

<400> 66

<210> 67

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈核苷酸序列

<400> 67

<210> 68

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：經修飾人類單株抗體輕鏈胺基酸序列

<400> 68

<210> 69

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成肽

<400> 69

<210> 70

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 70

<210> 71

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 71

<210> 72

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 72

<210> 73

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 73

<210> 74

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 74

<210> 75

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 75

<210> 76

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 76

<210> 77

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 77

<210> 78

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 78

<210> 79

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 79

<210> 80

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 80

<210> 81

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 81

<210> 82

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 82

<210> 83

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 83

<210> 84

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 84

<210> 85

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 85

<210> 86

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 86

<210> 87

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 87

<210> 88

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 88

<210> 89

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 89

<210> 90

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 90

<210> 91

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 91

<210> 92

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 92

<210> 93

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 93

<210> 94

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 94

<210> 95

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 95

<210> 96

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 96

<210> 97

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 97

<210> 98

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 98

<210> 99

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 99

<210> 100

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 100

<210> 101

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 101

<210> 102

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 102

<210> 103

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 103

<210> 104

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 104

<210> 105

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 105

<210> 106

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 106

<210> 107

<211> 543

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 107

<210> 108

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<220>

<221> modified_base

<222> (21)..(21)

<223> 肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n為a、c、g、或t

<400> 108

<210> 109

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 109

<210> 110

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 110

<210> 111

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 111

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成引物

<400> 112

<210> 113

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 113

<210> 114

<211> 116

<212> PRT

<213> 智人

<400> 114

<210> 115

<211> 117

<212> PRT

<213> 智人

<400> 115

<210> 116

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人

<400> 116

<210> 117

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

<400> 117

<210> 118

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 118

<210> 119

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人

<400> 119

<210> 120

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 120

<210> 121

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人

<400> 121

<210> 122

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 122

<210> 123

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 123

<210> 124

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 124

<210> 125

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<400> 125

<210> 126

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 126

<210> 127

<211> 114

<212> PRT

<213> 智人

<400> 127

<210> 128

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<400> 128

<210> 129

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 129

<210> 130

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人

<400> 130

<210> 131

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 131

<210> 132

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 132

<210> 133

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人

<400> 133

<210> 134

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成多肽

<400> 134

<210> 135

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 135

<210> 136

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 136

<210> 137

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 137

<210> 138

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 138

<210> 139

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 139

<210> 140

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 140

<210> 141

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 141

<210> 142

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 142

<210> 143

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 143

<210> 144

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 144

<210> 145

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 145

<210> 146

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 146

<210> 147

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成接頭肽

<400> 147

<210> 148

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 148

<210> 149

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 149

<210> 150

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 150

Claims (68)

1. 一種特異性結合黏膜地址素細胞黏附分子(MAdCAM)之人類單株抗體或其抗原結合部分。
2. 如申請專利範圍第1項之人類單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分具有以下性質之至少一者：(a)結合人類細胞；(b)對MAdCAM之選擇性優於對VCAM或纖連蛋白之選擇性至少100倍；(c)以3×10 ^-10M或更小的K _d結合人類MAdCAM；或(d)抑制表現α ₄β ₇之細胞與人類MAdCAM之結合。 (e)抑制淋巴球向胃腸淋巴組織之募集。
3. 如申請專利範圍第2項之人類單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分以3×10 ^-10M或更小的K _d結合人類MAdCAM且抑制α ₄β ₇結合人類MAdCAM。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人類單株抗體，其中重鏈包含與SEQ ID NO：148至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列。
5. 如申請專利範圍第4項之人類單株抗體，其中重鏈包含與SEQ ID NO：148一致之胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第4項之人類單株抗體，其中重鏈包含與SEQ ID NO：148相比1與25之間個胺基酸取代。
7. 如申請專利範圍第6項之人類單株抗體，其中重鏈包含與SEQ ID NO：148相比1與10之間個胺基酸取代。
8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之人類單株抗體，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：150至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列。
9. 如申請專利範圍第8項之人類單株抗體，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：150一致之胺基酸序列。
10. 如申請專利範圍第8項之人類單株抗體，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：150相比1與25之間個胺基酸取代。
11. 如申請專利範圍第10項之人類單株抗體，其中輕鏈包含與SEQ ID NO：150相比1與10之間個胺基酸取代。
12. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之人類單株抗體，其中重鏈包含與SEQ ID NO：149至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列，且輕鏈包含與SEQ ID NO：150至少80%、85%、或90%一致之胺基酸序列。
13. 如申請專利範圍第12項之人類單株抗體，其中重鏈包含與SEQ ID NO：149一致之胺基酸序列，且輕鏈包含與SEQ ID NO：150一致之胺基酸序列。
14. 一種編碼如申請專利範圍第4項至第13項中任一項之胺基酸序列之核酸序列。
15. 一種產生如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之人類單株抗體之細胞。
16. 一種包含如申請專利範圍第14項之核酸序列之細胞。
17. 一種產生如申請專利範圍第1項之人類單株抗體之融合瘤細胞株，其中該融合瘤係選自由以下組成之群：1.7.2(ECACC登錄號03090901)、1.8.2(ECACC登錄號03090902)、6.14.2(ECACC登錄號03090903)、6.22.2(ECACC登錄號03090904)、6.34.2(ECACC登錄號03090905)、6.67.1(ECACC登錄號03090906)、6.73.2(ECACC登錄號03090907)、6.77.1(ECACC登錄號03090908)、7.16.6(ECACC登錄號03090909)、7.20.5(ECACC登錄號03090910)、7.26.4(ECACC登錄號03090911)、及9.8.2(ECACC登錄號 03090912)。
18. 一種由如申請專利範圍第17項之融合瘤細胞株產生之人類單株抗體或該單株抗體之抗原結合部分。
19. 如申請專利範圍第18項之人類單株抗體，其中重鏈C端離胺酸經切割。
20. 如申請專利範圍第1項或第18項之人類單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或抗原結合部分抑制人類MAdCAM與α ₄β ₇之結合，且其中該抗體或其部分具有以下性質之至少一者：(a)與參考抗體交叉競爭結合MAdCAM；(b)與參考抗體競爭結合MAdCAM；(c)結合與參考抗體相同的MAdCAM之表位；(d)以與參考抗體實質上相同的K _d結合MAdCAM；(e)以與參考抗體實質上相同的解離速率結合MAdCAM；其中該參考抗體係選自由以下組成之群：單株抗體1.7.2、單株抗體1.8.2、單株抗體6.14.2、單株抗體6.22.2、單株抗體6.34.2、單株抗體6.67.1、單株抗體6.73.2、單株抗體6.77.1、單株抗體7.16.6、單株抗體7.20.5、單株抗體7.26.4、單株抗體9.8.2、X481.2單株抗體、單株抗體6.22.2-mod、單株抗體6.34.2-mod、單株抗體6.67.1-mod、單株抗體6.77.1-mod、及單株抗體7.26.4-mod。
21. 一種特異性結合MAdCAM之單株抗體，其中該抗體係選自由以下組成之群：(a)包含SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：4中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(b)包含SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8中所闡明之胺基酸序列之抗體， 無信號序列；(c)包含SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：12中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(d)包含SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：16中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(e)包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(f)包含SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：24中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(g)包含SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：28中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(h)包含SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：32中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(i)包含SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：36中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(j)包含SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：40中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(k)包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：44中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(l)包含SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(m)包含SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：54中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(n)包含SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：58中所闡明之胺基酸序列之抗 體，無信號序列；(o)包含SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；(p)包含SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：66中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列；及(q)包含SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：68中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列。 (r)包含SEQ ID NO：148及SEQ ID NO：150中所闡明之胺基酸序列之抗體，無信號序列。
22. 一種單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其部分之重鏈包含選自由以下組成之群之單株抗體之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3，或其中輕鏈包含該單株抗體之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod。
23. 如申請專利範圍第22項之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分包含利用人類VH 1-18基因、人類VH 3-15基因、人類VH 3-21基因、人類VH 3-23基因、人類VH 3-30基因、人類VH 3-33基因、或人類VH 4-4基因之重鏈。
24. 如申請專利範圍第23項之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或部分包含利用人類V _K A2基因、人類V _K A3基因、人類V _K A26基因、人類V _K B3基因、人類V _K O12基因、或人類V _K O18基因之輕鏈。
25. 如申請專利範圍第1項之人類單株抗體或抗原結合部分，其中重鏈可變區、輕鏈可變區、或兩者之胺基酸序列與選自由以下組成之群之單株抗體之一或多個對應區至少90%一致：單株抗體1.7.2、單株抗體1.8.2、單 株抗體6.14.2、單株抗體6.22.2、單株抗體6.34.2、單株抗體6.67.1、單株抗體6.73.2、單株抗體6.77.1、單株抗體7.16.6、單株抗體7.20.5、單株抗體7.26.4、單株抗體9.8.2、單株抗體X481.2、單株抗體6.22.2-mod、單株抗體6.34.2-mod、單株抗體6.67.1-mod、單株抗體6.77.1-mod、及單株抗體7.26.4-mod。
26. 一種特異性結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合部分，其中：(a)重鏈包含選自由以下組成之群之參考抗體之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod(b)輕鏈包含選自由以下組成之群之參考抗體之輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3胺基酸序列：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod(c)該抗體包含(a)之重鏈及(b)之輕鏈；且(d)(c)之抗體，其中重鏈及輕鏈CDR胺基酸序列係選自相同的參考抗體。
27. 如申請專利範圍第26項之單株抗體或抗原結合部分，其中重鏈、輕鏈、或兩者包含該參考抗體之分別重鏈、輕鏈、或兩者之自CDR1開始至CDR3結束之胺基酸序列。
28. 如申請專利範圍第26項之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體包含：(a)重鏈，其包含選自由以下組成之群之抗體之重鏈可變區胺基酸序 列：1.7.2(SEQ ID NO：2)、1.8.2(SEQ ID NO：6)、6.14.2(SEQ ID NO：10)、6.22.2(SEQ ID NO：14)、6.34.2(SEQ ID NO：18)、6.67.1(SEQ ID NO：22)、6.73.2(SEQ ID NO：26)、6.77.1(SEQ ID NO：30)、7.16.6(SEQ ID NO：34)、7.20.5(SEQ ID NO：38)、7.26.4(SEQ ID NO：42)、及9.8.2(SEQ ID NO：46)、X481.2(SEQ ID NO：148)、6.22.2-mod(SEQ ID NO：52)、6.34.2-mod(SEQ ID NO：56)、6.67.1-mod(SEQ ID NO：60)、6.77.1-mod(SEQ ID NO：64)、及7.26.4-mod(SEQ ID NO：42)；(b)輕鏈，其包含選自由以下組成之群之抗體之輕鏈可變區胺基酸序列：1.7.2(SEQ ID NO：4)；1.8.2(SEQ ID NO：8)；6.14.2(SEQ ID NO：12)、6.22.2(SEQ ID NO：16)、6.34.2(SEQ ID NO：20)、6.67.1(SEQ ID NO：24)、6.73.2(SEQ ID NO：28)、6.77.1(SEQ ID NO：32)、7.16.6(SEQ ID NO：36)、7.20.5(SEQ ID NO：40)、7.26.4(SEQ ID NO：44)、及9.8.2(SEQ ID NO：48)、X481.2(SEQ ID NO：150)、6.22.2-mod(SEQ ID NO：54)、6.34.2-mod(SEQ ID NO：58)、6.67.1-mod(SEQ ID NO：62)、6.77.1-mod(SEQ ID NO：66)、及7.26.4-mod(SEQ ID NO：68)；或(c)(a)之重鏈及(b)之輕鏈。
29. 如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第28項中任一項之單株抗體，其為免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、及IgA或IgD分子、人源化抗體、嵌合抗體、或雙特異性抗體。
30. 如申請專利範圍第1項至第13項、第18項至第20項、及第22項至第29項中任一項之抗原結合部分，其為Fab片段、F(ab') ₂片段、F _V片段、或單鏈抗體。
31. 一種醫藥組成物，其包含有效量的如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分及醫藥上可 接受之載劑。
32. 一種治療有需要之受試者之發炎性疾病之方法，其包含向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分之步驟，其中該抗體或抗原結合部分抑制MAdCAM與α ₄β ₇之結合。
33. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該發炎性疾病為胃腸道之發炎性疾病。
34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該胃腸道之發炎性疾病係選自由以下組成之群：發炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、憩室病、胃炎、肝病、原發性膽道硬化、及硬化性膽管炎。
35. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該發炎性腸病為克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、或兩者。
36. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該發炎性疾病為胰島素依賴性糖尿病及移植物抗宿主病。
37. 一種單離細胞株，其產生如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或抗原結合部分或者該抗體或該其部分之重鏈或輕鏈。
38. 如申請專利範圍第17項或第37項之細胞株，其產生選自由1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、及X481.2組成之群之抗體或包含該等抗體之一的胺基酸序列之抗體。
39. 如申請專利範圍第38項之細胞株，其產生選自由6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、7.26.4-mod、及X481.2組成之群之單株抗體或包含該等抗體之一的胺基酸序列之抗體。
40. 一種單離核酸分子，其包含編碼如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之抗體之重鏈或其抗原結合部分或者輕鏈或其抗原結合部分之核苷酸序列。
41. 一種包含如申請專利範圍第40項之核酸分子之載體，其中該載體視情況包含可操作地連接該核酸分子之表現控制序列。
42. 一種包含如申請專利範圍第41項之載體或如申請專利範圍第40項之核酸分子之宿主細胞。
43. 如申請專利範圍第42項之宿主細胞，其包含編碼如申請專利範圍第1項至第3項及第5項至第17項中任一項之抗體或其抗原結合部分之重鏈或其抗原結合部分的核酸分子及編碼該抗體或其抗原結合部分之輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子。
44. 一種用於產生特異性結合MAdCAM之人類單株抗體或其抗原結合部分之方法，其包含在合適條件下培養如申請專利範圍第42項或第43項之宿主細胞或如申請專利範圍第15項至第17項中任一項或第38項之細胞株及回收該抗體或抗原結合部分。
45. 一種非人類基因轉殖動物或基因轉殖植物，其包含(a)編碼如申請專利範圍第1項至第13項或第18項至第30項中任一項之抗體之重鏈或其抗原結合部分的核酸分子；(b)編碼該抗體之輕鏈或其抗原結合部分的核酸分子；或(c)(a)及(b)兩者，其中該非人類基因轉殖動物或基因轉殖植物表現該重鏈或輕鏈或兩者。
46. 一種單離出特異性結合MAdCAM之抗體或其抗原結合部分之方法，其包含自如申請專利範圍第45項之非人類基因轉殖動物或基因轉殖植物單離出該抗體之步驟。
47. 一種用特異性結合MAdCAM且抑制與α ₄β ₇結合之人類抗體或其 抗原結合部分治療有需要之受試者之方法，其包含以下步驟：(a)投與有效量的編碼重鏈或其抗原結合部分之單離核酸分子、編碼輕鏈或其抗原結合部分之單離核酸分子、或編碼輕鏈及重鏈或其抗原結合部分之核酸分子；及(b)表現該核酸分子。
48. 一種用於產生特異性結合MAdCAM之人類單株抗體之方法，其包含以下步驟：(a)用MAdCAM、用MAdCAM之免疫性部分、或用表現MAdCAM之細胞或組織免疫能夠產生人類抗體之非人類基因轉殖動物；及(b)使該基因轉殖動物發動對MAdCAM之免疫反應。
49. 一種藉由如申請專利範圍第48項之方法產生之人類單株抗體。
50. 一種抑制α ₄β ₇結合表現人類MAdCAM之細胞之方法，其包含使該等細胞與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分接觸。
51. 一種用於抑制MAdCAM介導之白血球-內皮細胞黏附之方法，其包含使該等內皮細胞與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分接觸。
52. 一種用於抑制MAdCAM介導之白血球黏附、遷移、及向組織中浸潤之方法，其包含使該等內皮細胞與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分接觸之步驟。
53. 一種用於抑制α ₄β ₇/MAdCAM依賴性細胞黏附之方法，其包含使表現人類MAdCAM之細胞與如申請專利範圍第1項至第13項或第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分接觸之步驟。
54. 一種用於抑制MAdCAM介導之淋巴球向胃腸淋巴組織募集之 方法，其包含使表現人類MAdCAM之細胞與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或其抗原結合部分接觸之步驟。
55. 一種特異性結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其部分包含選自由以下組成之群之人類單株抗體之FR1、FR2、FR3、或FR4胺基酸序列之一或多者：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod。
56. 如申請專利範圍第1項之人類單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體包含：(a)重鏈胺基酸序列，其與選自由以下組成之群之單株抗體之重鏈胺基酸序列至少90%一致：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod；(b)輕鏈胺基酸序列，其與選自由以下組成之群之單株抗體之輕鏈胺基酸序列至少90%一致：1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、及7.26.4-mod；(c)(a)及(b)兩者；或(d)(a)、(b)、或(c)，有或無信號序列。
57. 一種用於診斷特徵在於循環可溶性人類MAdCAM之病症之方法，其包含以下步驟：(1)使生物樣本與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或抗原結合部分接觸，及(2)偵測結合。
58. 一種用於偵測受試者之發炎之方法，其包含以下步驟：(1)向該受試者投與如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項 之單株抗體或抗原結合部分，其中該抗體或其部分經可偵測地標記，及(2)偵測結合。
59. 一種診斷套組，其包含如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之單株抗體或抗原結合部分。
60. 如申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其進一步包含一或多種額外消炎劑或免疫調節劑。
61. 如申請專利範圍第60項之醫藥組成物，其中該一或多種額外消炎劑或免疫調節劑係選自由以下組成之群：皮質類固醇、胺基柳酸鹽、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、環孢素、FK506、IL-10、GM-CSF、雷帕黴素、抗TNFα劑、及黏附分子拮抗劑。
62. 一種疫苗，其包含有效量的如申請專利範圍第1項至第13項及第18項至第30項中任一項之人類抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受之載劑。
63. 如申請專利範圍第62項之疫苗，其中該疫苗為黏膜疫苗。
64. 一種偵測抑制性抗MAdCAM抗體或其抗原結合部分之投與對受試者之作用之方法，其包含以下步驟：(a)向受試者投與特異性結合MAdCAM之人類單株抗體；及(b)確定循環表現α ₄β ₇之白血球之水準是否增加。
65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該等白血球為淋巴球。
66. 如申請專利範圍第64項之方法，其中循環表現α ₄β ₇之白血球之水準之該增加係藉由FACS分析來確定。
67. 一種結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合部分，其包含SEQ ID NO：150之輕鏈之可變區及SEQ ID NO：148之重鏈之可變區。
68. 一種結合MAdCAM之單株抗體或其抗原結合片段，其包含由核 苷酸SEQ ID NO：149編碼之重鏈可變區及由核苷酸SEQ ID NO：35編碼之輕鏈可變區。