BR112020000698A2

BR112020000698A2 - anticorpos contra madcam

Info

Publication number: BR112020000698A2
Application number: BR112020000698-0A
Authority: BR
Inventors: Karin Anderson
Original assignee: Pfizer Inc.
Priority date: 2017-07-14
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2020-07-14
Also published as: CO2020000352A2; CU20200002A7; CL2020000102A1; TW201920266A; ECSP20011317A; JP7160491B2; EA202090286A1; WO2019014572A1; SG11202000298VA; US11802156B2; PH12020500100A1; NI202000004A; CR20200076A; KR20200028006A; DOP2020000005A; CA3069914A1; US20220119521A1; US20190169291A1; EP3652211A1; CN111032694B

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos, incluindo anticorpos humanos e porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à MAdCAM, preferivelmente MAdCAM humana e que têm como função inibir MAdCAM. A invenção também refere-se a anticorpos humanos anti-MAdCAM e porções de ligação ao antígeno dos mesmos. A invenção também refere-se a anticorpos que são quiméricos, biespecíficos, derivados, anticorpos de cadeia única ou partes de proteínas de fusão. A invenção também refere-se a imunoglobulinas isoladas de cadeia pesada e leve, derivadas de anticorpos humanos anti-MAdCAM e moléculas de ácido nucleico que codificam tais imunoglobulinas. A presente invenção também diz respeito a métodos de produção de anticorpos humanos anti-MAdCAM, composições que compreendem esses anticorpos e a métodos que fazem uso dos anticorpos e composições para diagnóstico e tratamento. A invenção também provê métodos de terapia gênica utilizando moléculas de ácido nucleico que codificam as moléculas de imunoglobulinas pesadas e/ou leves que compreendem os anticorpos humanos anti-MAdCAM. A invenção também diz respeito a animais ou plantas transgênicas compreendendo moléculas de ácido nucleico da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS CONTRA MAdCAM". Referência cruzada a pedidos de patente correlatos

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício e prioridade deste ao U.S.S.N. 62/532 809, depositado em 14 de julho de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade. Incorporação por referência da listagem de sequências

[0002] O conteúdo do arquivo de texto denominado "SHR- 1258A ST25.txt", que foi criado em 14 de julho de 2017 e com tamanho de 197 KB, é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Antecedentes da invenção

[0003] A molécula de adesão celular de adressina da mucosa (MAdCAM) faz parte da superfamília de imunoglobulinas de receptores de adesão celular. A seletividade do retorno (homing) de linfócitos ao tecido linfoide especializado e a sítios na mucosa do trato gastrointestinal é determinada pela expressão endotelial de MAGCAM (Berlin, C. et al., Cell, 80:413- 422(1994); Berlin, C., et al., Cell, 74:185- 195 (1993); e Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)). MAdCAM é expressa unicamente na superfície celular de vênulas endoteliais altas do tecido linfoide intestinal organizado, tal como placas de Peyer e linfonodos mesentéricos (Streeter et al., Nature, 331:41-6 (1988); Nakache et a/l., Nature, 337:179-81 (1989); Briskin et al., Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)), mas também em outros órgãos linfoides, como pâncreas, vesícula biliar e vênulas esplênicas e seios marginais da polpa branca esplênica (Briskin et al (1997), supra; Kraal et al., Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)).

[0004] Embora desempenhe um papel fisiológico na fiscalização imune do intestino, a MAdCAM parece facilitar o extravasamento excessivo de linfócitos na doença inflamatória intestinal sob condições de inflamação crônica do trato gastrointestinal.

TNFa e outras citocinas pró-inflamatórias aumentam a expressão endotelial de MAdCAM e, em espécimes de biópsia retirados de pacientes com doença de Crohn e colite ulcerativa, há um aumento focal de 2-3 vezes aproximadamente na expressão de MAdCAM em sítios de inflamação (Briskin et a/. (1997), Souza et al., Gut, 45:856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52:367-74 (2002)). Padrões semelhantes de expressão elevada foram observados em modelos experimentais de colite (Hesterberg et al, Gastroenterology, 111:1373-1380 (1997); Picarella et al., J.

Immunol., 158: 2099-2106 (1997); Connor et al., J Leukoc Biol., 65:349-55 (1999); Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295:183-9 (2000); Hokari et a/l., Clin Exp Immunol., 26:259-65 (2001); Shigematsu et al, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 281:61309-15 (2001)). Em outros modelos pré-clínicos de condições inflamatórias, tais como diabetes insulino- dependente (Yang et al.

Diabetes, 46:1542-7 (1997); Hânninen et a/., J Immunol., 160:6018-25 (1998)), doença do enxerto contra hospedeiro (Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol., 38:437-42 (2003), Murai et al, Nat Immunol., 4:154-60 (2003)), doença hepática crônica (Hillan et al, Liver, 19:509-18 (1999); Grant et al., Hepatology, 33:1065-72 (2001)), encefalopatia inflamatória (Stalder et al., Am J Pathol., 153:767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol Cell Biol., 78:641-5 (2000)) e gastrite (Barrett et al., J Leukoc Biol., 67:169-73 (2000); Hatanaka et al., Clin Exp Immunol., 130:183-9 (2002)), existe também novo despertar da expressão de MAdCAM fetal de a participação de linfócitos a4B7* ativados na patogênese da doença.

Nesses modelos inflamatórios bem como modelos de colite mediada por hapteno (por exemplo, TNBS, DSS, etc) ou transferência adotiva (CD4+CD45Rb?*"=) em camundongos, o anticorpo monoclonal (mAb) de rato anti-MAdCAM de camundongo, MECA-367, que bloqueia a ligação de linfócitos a4B7* a MAdCAM, reduz o recrutamento de linfócitos, o extravasamento para tecidos, a inflamação e a gravidade da doença. Anticorpos monoclonais (mAbs) de camundongos contra MAdCAM humana foram também relatados (ver, por exemplo, WO 96/24673 e WO 99/58573).

[0005] Dado o papel de MAdCAM na doença inflamatória intestinal (DI!) e outras doenças inflamatórias associadas com o trato gastrointestinal ou outros tecidos, é desejável um meio para inibir a ligação de a4B;7 e o recrutamento de leucócitos mediado por MAdCAM. Seria ainda desejável dispor de tais meios terapêuticos com propriedades vantajosas incluindo, entre outros, a ausência de interações indesejadas com outros medicamentos em pacientes e propriedades físico-químicas favoráveis, tais como valores pK/pD em seres humanos, solubilidade, estabilidade, prazo de validade e meia- vida in vivo. Uma proteína terapêutica, tal como um anticorpo, estaria vantajosamente livre de modificações pós-traducionais indesejadas ou formação de agregados. Consequentemente, existe uma necessidade crítica de anticorpos anti-MAdCAM terapêuticos. Sumário da invenção

[0006] A presente invenção provê um anticorpo isolado que se liga especificamente a MAdCAM, em que pelo menos as sequências de CDR do dito anticorpo são sequências de CDR humanas, ou uma porção de ligação ao antígeno do dito anticorpo. Em modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, preferivelmente um anticorpo que atua como um antagonista de MAdCAM. São também providas composições que compreendem os ditos anticorpos ou porções.

[0007] A invenção também provê uma composição compreendendo a cadeia pesada e/ou leve do dito anticorpo antagonista anti-MAdCAM ou a região variável ou outra porção de ligação ao antígeno deste ou moléculas de ácido nucleico que qualquer um dos anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições da invenção podem compreender ainda outro componente, tal como um agente terapêutico ou um agente diagnóstico. Métodos diagnósticos e terapêuticos são também providos pela invenção.

[0008] A invenção provê ainda uma linhagem celular isolada, que produz o dito anticorpo anti-MAdCAM ou a porção de ligação ao antígeno deste.

[0009] A invenção também provê moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada e/ou leve do dito anticorpo anti-MAdCAM ou a região variável ou a porção de ligação ao antígeno deste.

[0010] A invenção provê vetores e células hospedeiras compreendendo as ditas moléculas de ácido nucleico, bem como métodos para produção por recombinação dos polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico.

[0011] Animais não humanos ou plantas transgênicas que expressam a cadeia pesada e/ou leve do dito anticorpo anti-MAdCAM, ou a porção de ligação ao antígeno deste, são providos também.

[0012] Em modalidades, um anticorpo monoclonal humano ou uma porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a uma molécula de adesão celular de adressina da mucosa (MAdCAM).

[0013] Em modalidades, o anticorpo monoclonal humano ou a porção de ligação ao antígeno, possui pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) liga-se a células humanas; (b) tem pelo menos 100 vezes mais seletividade por MAGCAM do que por VCAM ou fibronectina; (c) liga-se a MAdCAM humana com K, igual ou inferior a 3 x 10º M; ou (d) inibe a ligação de células que expressam a.B; à MAGCAM humana. (e) inibe o recrutamento de linfócitos para o tecido linfoide gastrointestinal.

[0014] Em modalidades, o anticorpo monoclonal humano, ou porção de ligação ao antígeno, liga-se à MAdCAM humana com Kd igual ou inferior a 3 x 10º e inibe a ligação de a.B; à MAdCAM humana,

[0015] Em modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica a SEQ ID NO: 148.

[0016] Em modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos idêntica a SEQ ID NO: 148.

[0017] Em modalidades, a cadeia pesada compreende entre 1 e 25 substituições de aminoácidos quando comparada a SEQ ID NO: 148.

[0018] Em modalidades, a cadeia pesada compreende entre 1 e 10 substituições de aminoácidos quando comparada a SEQ ID NO: 148.

[0019] Em modalidades, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica a SEQ ID NO:

150.

[0020] Em modalidades, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos idêntica a SEQ ID NO: 150.

[0021] Em modalidades, a cadeia leve compreende entre 1 e 25 substituições de aminoácidos quando comparada a SEQ ID NO: 150.

[0022] Em modalidades, a cadeia leve compreende entre 1 e 10 substituições de aminoácidos quando comparada a SEQ | DNO: 150.

[0023] Em modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica a SEQ ID NO: 148, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica a SEQ ID NO: 150.

[0024] Em modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos idêntica a SEQ ID NO: 148, e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos idêntica a SEQ ID NO:

150.

[0025] Em modalidades, é provida uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos de um anticorpo contra MAdCAM.

[0026] Em modalidades, é provida uma célula produtora de um anticorpo monoclonal humano que se liga a MAdCAM.

[0027] Em modalidades, é provida uma célula que compreende uma sequência de ácido nucleico codificador de um anticorpo contra MAdCAM.

[0028] Em modalidades, é provida uma linhagem celular de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal humano contra MAdCAM a. Em modalidades, o hibridoma é selecionado a partir do grupo que consiste em 1.7.2 (Nº de Acesso ECACC 03090901), 1.8.2 (Nº de Acesso ECACC 03090902), 6.14.2 (Nº de Acesso ECACC 03090903), 6.22.2 (Nº de Acesso ECACC 03090904), 6.34.2 (Nº de Acesso ECACC 03090905), 6.67.1 (Nº de Acesso ECACC 03090906),

6.73.2 (Nº de Acesso ECACC 03090907), 6.77.1 (Nº de Acesso ECACC 03090908), 7.16.6 (Nº de Acesso ECACC 03090909), 7.20.5 (Nº de Acesso ECACC 03090910), 7.26.4 (Nº de Acesso ECACC 03090911) e

9.8.2 (No de Acesso ECACC 03090912).

[0029] Em modalidades, é provido o anticorpo monoclonal humano produzido pela linhagem celular de hibridoma ou uma porção de ligação ao antígeno do dito anticorpo monoclional.

[0030] Em modalidades, a lisina C-terminal da cadeia pesada é clivada.

[0031] Em modalidades, o dito anticorpo ou porção de ligação ao antígeno inibe a ligação de MAdCAM humana a c4B;, em que Oo anticorpo ou sua porção possui pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) compete de modo cruzado com um anticorpo de referência pela ligação a MAJdCAM; (b) compete com um anticorpo de referência pela ligação a MAdCAM; (c) liga-se ao mesmo epítopo de MAdJdCAM que um anticorpo de referência; (d) liga-se a MAdCAM com substancialmente a mesma K,1 que um anticorpo de referência; (e) liga- se a MAdCAM com substancialmente a mesma taxa de dissociação (off rate) que um anticorpo de referência; em que o anticorpo de referência é selecionado a partir do grupo que consiste em: anticorpo monoclional

1.7.2, anticorpo monoclonal 1.8.2, anticorpo monoclional 6.14.2, anticorpo monoclonal 6.22.2, anticorpo monoclional 6.34.2, anticorpo monoclonal 6.67.1, anticorpo monoclonal 6.73.2, anticorpo monoclonal

6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo monocional 7.20.5, anticorpo monocional 7.26.4, anticorpo monocional 9.8.2, X481.2 anticorpo monoclional, anticorpo monocilonal 6.22.2-mod, anticorpo monoclonal 6.34.2-mod, anticorpo monoclonal 6.67.1-mod, anticorpo monoclional 6.77 .1-mod e anticorpo monoclional 7.26.4-mod.

[0032] Em modalidades, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, sem as sequências sinal; (b) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, sem as sequências sinal; (c) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, sem as sequências sinal; (d) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16, sem as sequências sinal; (e) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 18 e SEQID NO: 20, sem as sequências sinal; (f) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, sem as sequências sinal; (g) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 26 e SEQID NO: 28, sem as sequências sinal; (h) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32, sem as sequências sinal; (i) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36, sem as sequências sinal; ()) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, sem as sequências sinal; (k) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 42 e SEQID NO: 44, sem as sequências sinal; (I) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48, sem as sequências sinal; (m) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 52 e SEQID NO: 54, sem as sequências sinal; (n) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 58, sem as sequências sinal; (o) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 62, sem as sequências sinal; (p) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66, sem as sequências sinal; e (q) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 68, sem as sequências sinal (r) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 148 e SEQ ID NO: 150, sem a sequência sinal.

[0033] Em modalidades, a cadeia pesada do dito anticorpo, ou sua porção, compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada, ou em que a cadeia leve compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6,

7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,

6.77.1-mod e 7.26.4-mod.

[0034] Em modalidades, o dito anticorpo ou porção compreende uma cadeia pesada que utiliza um gene VH 1-18 humano, um gene VH 3-15 humano, um gene VH 3-21, um gene VH 3-23 humano, um gene VH 3-30 humano, um gene VH 3-33 humano ou um gene VH 4-4 humano.

[0035] Em modalidades, o dito anticorpo ou porção compreende uma cadeia leve que utiliza um gene Vx A2 humano, um gene Vx A3 humano, um gene Vx A26 humano, um gene Vx B3 humano, um gene Vx 012 humano ou um gene Vx 018 humano.

[0036] Em modalidades, a região variável da cadeia pesada, a região variável da cadeia leve ou ambas são pelo menos 90% idênticas, em termos da sequência de aminoácidos, à região ou regiões correspondentes de um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em: anticorpo monoclonal 1.7.2, anticorpo monoclonal 1.8.2, anticorpo monocional 6.14.2, anticorpo monoclonal

6.22.2, anticorpo monocional 6.34.2, anticorpo monocional 6.67.1, anticorpo monocional 6.73.2, anticorpo monoclonal 6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo monoclonal 7.20.5, anticorpo monoclonal

7.26.4, anticorpo monocilonal 9.8.2, anticorpo monocilonal X481.2, anticorpo monoclonal 6.22.2-mod, anticorpo monocilonal 6.34.2-mod, anticorpo monoclional 6.67.1-mod, anticorpo monoclional 6.77.1-mod e anticorpo monoclonal 7.26.4-mod.

[0037] Em modalidades, é provido um anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, em que: (a) a cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em:

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod e 7.264-mod (b) a cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67 .1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod (c) o anticorpo compreende uma cadeia pesada de (a) e uma cadeia leve de (b); e (d) o anticorpo de (c), em que as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve são selecionadas dentre o mesmo anticorpo de referência.

[0038] Em modalidades, a cadeia pesada, a cadeia leve ou ambas compreendem a sequência de aminoácidos desde o início da CDR1 até o final da CDR3 da cadeia pesada, da cadeia leve ou de ambas, respectivamente, do anticorpo de referência.

[0039] Em modalidades, o dito anticorpo compreende: (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ ID NO: 2); 1.8.2 (SEQ ID NO: 6); 6.14.2 (SEQ ID NO: 10); 6.22.2 (SEQ ID NO: 14); 6.34.2 (SEQ ID NO: 18);

6.67.1 (SEQ ID NO: 22); 6.73.2 (SEQ ID NO: 26); 6.77.1 (SEQ ID NO: 30); 7.16.6 (SEQ ID NO: 34); 7.20.5 (SEQ ID NO: 38); 7.26.4 (SEQ ID NO: 42); e 9.8.2 (SEQ ID NO: 46); X481.2 (SEQ ID NO: 148), 6.22.2- mod (SEQ ID NO: 52); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 56); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 60); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 64); e 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 42); (Db) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ ID NO: 4); 1.8.2 (SEQ ID NO: 8);

6.14.2 (SEQ ID NO: 12); 6.22.2 (SEQ ID NO: 16); 6.34.2 (SEQ ID NO: 20); 6.67.1 (SEQ ID NO: 24); 6.73.2 (SEQ ID NO: 28); 6.77.1 (SEQ ID NO: 32); 7.16.6 (SEQ ID NO: 36); 7.20.5 (SEQ ID NO: 40); 7.26.4 (SEQ ID NO: 44); e 9.8.2 (SEQ ID NO: 48); X481.2 (SEQ ID NO: 150), 6.22.2- mod (SEQ ID NO: 54); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 58); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 62); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 66); e 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 68); ou (c) a cadeia pesada de (a) e a cadeia leve de (b).

[0040] Em modalidades, o anticorpo monoclonal é uma imunoglobulina G (IgG), IGM, IgE e IgA ou uma molécula de IgD, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo biespecífico.

[0041] Em modalidades, a porção de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, um fragmento F(ab'), um fragmento Fy fragmento ou um anticorpo de cadeia única.

[0042] Em modalidades, é provida uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo monocilonal ou porção de ligação ao antígeno deste e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0043] Em modalidades, é provido um método para o tratamento de doença inflamatória em um indivíduo que o necessita, o qual compreende a etapa de administrar ao dito indivíduo o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno deste, em que o dito anticorpo ou porção de ligação ao antígeno inibe a ligação de MAdCAM a daB7.

[0044] Em modalidades, a doença inflamatória é doença inflamatória do trato gastrointestinal.

[0045] Em modalidades, a doença inflamatória do trato gastrointestinal é selecionada a partir do grupo que consiste em doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença diverticular, gastrite, doença hepática, esclerose biliar primária e colangite esclerosante.

[0046] Em modalidades, a doença inflamatória intestinal é doença de Crohn, colite ulcerativa ou ambas.

[0047] Em modalidades, as doenças inflamatórias são diabetes insulino-dependente e doença do enxerto contra hospedeiro.

[0048] Em modalidades, é provida uma linhagem celular isolada que produz o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno OU a cadeia pesada ou cadeia leve do dito anticorpo ou da dita porção deste. Em modalidades, a linhagem celular produz um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2 e X481.2 ou um anticorpo que compreende as sequências de aminoácidos de um dos ditos anticorpos. Em modalidades, a linhagem celular produz um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em: 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod,

7.26.4-mod e X481.2 ou um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos de um dos ditos anticorpos.

[0049] Em modalidades, é provida uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta ou a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta de um anticorpo.

[0050] Em modalidades, é provido um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico, em que o vetor compreende opcionalmente uma sequência de controle da expressão operacionalmente ligada à molécula de ácido nucleico. Em modalidades, é provida uma célula hospedeira que compreende o vetor ou a molécula de ácido nucleico.

[0051] Em modalidades, é provida uma célula hospedeira que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta, e uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno.

[0052] Em modalidades, é provido um método para produzir um anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, o qual compreende cultivar a célula hospedeira ou a linhagem celular sob condições adequadas e recuperar o dito anticorpo ou porção de ligação ao antígeno.

[0053] Em modalidades, é provido um animal não humano transgênico ou planta transgênica que compreende (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta; (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta; ou

(c) ambas (a) e (b) de um anticorpo, em que o animal não humano transgênico ou planta transgênica expressa a dita cadeia pesada ou cadeia leve ou ambas.

[0054] Em modalidades, é provido um método de isolamento de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, o qual compreende a etapa de isolar o anticorpo do animal não humano transgênico ou da planta transgênica.

[0055] Em modalidades, é provido um método de tratamento de um indivíduo que o necessita com um anticorpo humano ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM e inibe a ligação a a4B7, o qual compreende as etapas de: (a) administrar uma quantidade eficaz de uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta, uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta, ou moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada ou porções de ligação ao antígeno das mesmas; e (b) expressar a molécula de ácido nucleico.

[0056] Em modalidades, é provido um método para produzir um anticorpo monoclonal humano que se liga especificamente a MAdCAM, o qual compreende as etapas de: (a) imunizar um animal não humano transgênico que seja capaz de produzir anticorpos humanos com MAdCAM, com uma porção imunogênica de MAdCAM ou com uma célula ou tecido expressando MAdCAM; e (b) permitir que o animal transgênico desenvolva uma resposta imune a MAdCAM.

[0057] Em modalidades, um anticorpo monoclonal humano é produzido como acima.

[0058] Em modalidades, é provido um método de inibição da ligação de a4B7 a células expressando MADdCAM humana, o qual compreende colocar as células em contato com o anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

[0059] Em modalidades, é provido um método para inibir a adesão de leucócitos em células endoteliais, mediada por MAdCAM, o qual compreende colocar as células endoteliais em contato com o anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

[0060] Em modalidades, é provido um método para inibir a adesão, migração e infiltração leucocitária em tecidos, mediadas por MAGCAM, o qual compreende a etapa de colocar as células endoteliais em contato com o anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno deste.

[0061] Em modalidades, é provido um método for para inibir a adesão celular dependente de axB; /MAdCAM, o qual compreende a etapa de colocar as células expressando MAdCAM em contato com o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno deste.

[0062] Em modalidades, é provido um método para inibir o recrutamento de linfócitos, mediado por MAdCAM, para o tecido linfoide gastrointestinal, o qual compreende a etapa de colocar as células expressando MAdCAM em contato com o anticorpo monocional ou porção de ligação ao antígeno deste.

[0063] Em modalidades, é provido um anticorpo monoclonal ou uma porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, em que o dito anticorpo ou sua porção compreende um ou mais dentre uma sequência de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 ou FR4 de um anticorpo monoclonal humano selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod.

[0064] Em modalidades, o anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno compreende: (a) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de cadeia pesada de um anticorpo monoclional selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4- mod; (b) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em:

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2,6.77.1,7.16.6, 7.205,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod; (c) ambos (a) e (b); ou (d) qualquer (a), (b) ou (c), com ou sem a sequência sinal.

[0065] Em modalidades, é provido um método para diagnosticar um transtorno caracterizado por MAGdCAM humana solúvel circulante, o qual compreende as etapas de: (1) colocar uma amostra biológica em contato com o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno e (2) detectar a ligação.

[0066] Em modalidades, é provido um método para detectar inflamação em um indivíduo, o qual compreende as etapas de: (1) administrar ao dito indivíduo o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno, em que o dito anticorpo ou sua porção está marcado para detecção e (2) detectar a ligação.

[0067] Em modalidades, é provido um kit diagnóstico que compreende o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno.

[0068] Em modalidades, a composição farmacêutica provida compreende ainda um ou mais agentes anti-inflamatórios ou imunomoduladores adicionais. Em modalidades, um ou mais dos agentes anti-inflamatórios ou imunomoduladores adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em: corticosteroides, aminossalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti-TNFa e antagonistas de moléculas de adesão.

[0069] Em modalidades, é provida uma vacina que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo humano ou de sua porção de ligação ao antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades, a vacina é por via mucosa.

[0070] Em modalidades, é provido um método de detecção do efeito da administração de um anticorpo anti-MAdCAM inibidor ou porção de ligação ao antígeno deste a um indivíduo, o qual compreende as etapas de: (a) administrar a um indivíduo um anticorpo monoclonal humano que se liga especificamente a MAdCAM; e (b) determinar se há um aumento nos níveis de leucócitos circulantes expressando a1B7. Em modalidades, os ditos leucócitos são linfócitos. Em modalidades, o dito aumento nos níveis de leucócitos circulantes expressando a4B; é determinado por análise FACS.

[0071] Em modalidades, é provido um anticorpo monocional, ou porção de ligação ao antígeno deste, que se liga à MAdCAM e compreende a região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 150 e a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 148.

[0072] Em modalidades, é provido um anticorpo monocional, ou fragmento de ligação ao antígeno deste, que se liga à MAdCAM e compreende uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 149 de nucleotídeos, e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 35 de nucleotídeos. Breve descrição dos desenhos

[0073] A Figura 1 (isto é, Figura 1A - Figura 1T) é um alinhamento das sequências preditas de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e da leve kappa de doze anticorpos monoclionais humanos anti-MAdCAM com as sequências de aminoácidos da linhagem germinativa dos genes humanos correspondentes.

[0074] A Figura 1A mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para os anticorpos 1.7.2 e 1.8.2, com o produto do gene VH 3-15 humano da linhagem germinativa.

[0075] A Figura 1B mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 6.14.2, com o produto do gene VH 3-23 humano da linhagem germinativa.

[0076] A Figura 1C mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 6.22.2, com o produto do gene VH 3-33 humano da linhagem germinativa.

[0077] A Figura 1D mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 6.34.2, com o produto do gene VH 3-30 humano da linhagem germinativa.

[0078] A Figura 1E mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 6.67.1, com o produto do gene VH 4-4 humano da linhagem germinativa.

[0079] A Figura 1F mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 6.73.2, com o produto do gene VH 3-23 humano da linhagem germinativa.

[0080] A Figura 1G mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 6.77.1, com o produto do gene VH 3-21 humano da linhagem germinativa.

[0081] A Figura 1H mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para os anticorpos 7.16.6 e

7.264, com o produto do gene VH 1-18 humano da linhagem germinativa.

[0082] A Figura 1l mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 7.20.5, com o produto do gene VH 4-4 humano da linhagem germinativa.

[0083] A Figura 1) mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, predita para o anticorpo 9.8.2, com o produto do gene VH 3-33 humano da linhagem germinativa.

[0084] A Figura 1K mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para os anticorpos 1.7.2 e

1.8.2, com o produto do gene A3 humano da linhagem germinativa.

[0085] A Figura 1L mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 6.14.2, com o produto do gene O12 humano da linhagem germinativa.

[0086] A Figura IM mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 6.22.2, com o produto do gene A26 humano da linhagem germinativa.

[0087] A Figura IN mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 6.34.2, com o produto do gene 012 humano da linhagem germinativa.

[0088] A Figura 10 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 6.67.1, com o produto do gene B3 humano da linhagem germinativa.

[0089] A Figura 1P. mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 6.73.2, com o produto do gene O12 humano da linhagem germinativa.

[0090] A Figura 1Q mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 6.77.1, com o produto do gene A2 humano da linhagem germinativa.

[0091] A Figura IR mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para os anticorpos 7.16.6 e

7.26.4, com o produto do gene A2 humano da linhagem germinativa.

[0092] A Figura 1S mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 7.20.5, com o produto do gene A3 humano da linhagem germinativa.

[0093] A Figura 1T mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa, predita para o anticorpo 9.8.2, com o produto do gene 018 humano da linhagem germinativa.

[0094] A Figura 2 (isto é, Figura 2A e Figura 2B) apresenta alinhamentos CLUSTAL das sequências de aminoácidos da cadeias pesada e leve kappa, preditas para anticorpos humanos anti-MAdCAM.

[0095] A Figura 2A é um alinhamento CLUSTAL e árvore radial das sequências de aminoácidos, preditas para cadeia leve kappa, mostrando o grau de similaridade entre as cadeias leves kappa de anticorpos anti-MAdCAM.

[0096] A Figura 2B é um alinhamento CLUSTAL e árvore radial das sequências de aminoácidos, preditas para cadeia pesada, mostrando o grau de similaridade entre as cadeias pesadas de anticorpos anti- MAdCAM.

[0097] A Figura 3 é um alinhamento CLUSTAL da sequência de aminoácidos dos 2 domínios N-terminal de MAdCAM de cynomolgus e humana que formam o domínio de ligação a asB7. As fitas É estão alinhadas de acordo com Tan et a/., Estrutura (1998) 6:793-801.

[0098] A Figura 4 é um gráfico representando os efeitos da dose de

1.7.2 e 7.16.6 biotinilados purificados sobre a adesão de linfócitos humanos do sangue periférico a seções de endotélio hepático congelado com expressão de MAdCAM.

[0099] A Figura 5 mostra uma representação gráfica bidimensional com base nos dados capturados na Tabela 7 da diversidade de epítopos de MAdCAM aos quais os anticorpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2 se ligam. Os anticorpos anti-MAdCAM dentro do mesmo círculo mostram o mesmo padrão de reatividade, pertencem ao mesmo intervalo (bin) de epítopo e provavelmente reconhecem o mesmo epítopo em MAdCAM. Os clones de anticorpo anti-MAdCAM dentro dos círculos sobrepostos são incapazes de se ligar simultaneamente e, portanto, provavelmente reconhecem um epítopo sobreposto em MAdCAM. Os círculos não integrantes representam clones de anticorpo anti-MAdCAM com separação epitópica distinta.

[0100] A Figura 6 mostra dados de ELISA intercalados com anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2 e um 7.16.6 marcado com Alexa 488, mostrando que dois anticorpos que são capazes de detectar epítopos diferentes em MAdCAM poderiam ser usados para detectar MAdCAM solúvel para fins diagnósticos.

[0101] A Figura 7 mostra o efeito de um anticorpo anti-MAdCAM inibidor (1 mg/kg) sobre o número de linfócitos a4B;* periféricos circulantes, expressos em aumento relativo acima de mAb IgG2a controle ou veículo, usando mAb anti-MAdCAM mAb 7.16.6 em um modelo de macaco cynomolgus. Descrição detalhada da invenção Definições e técnicas gerais

[0102] A menos que definido de outro modo no presente, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção terão os mesmos significados que são habitualmente entendidos pelos técnicos no assunto. Além disso, a menos que requerido de outro modo pelo contexto, os termos no singular incluirão pluralidades e os termos no plural incluirão o singular. Em geral, as nomenclaturas usadas em conexão com e em técnicas de cultura de célula e tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética, química de proteínas e de ácidos nucleicos e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são em geral realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas por todo o relatório descritivo a menos que indicado o contrário. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al., Current Protocolos in Molecular Biology, Greene

Publishing Associates (1992), e Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que são aqui incorporados por referência. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como habitualmente realizadas na técnica ou como descritas no presente. Técnicas padrão são empregadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e liberação farmacêutica e para o tratamento de pacientes.

[0103] Os termos a seguir, a menos que indicado de outro modo, serão entendidos com os seguintes significados:

[0104] O termo "polipeptídeo" abrange proteínas nativas ou artificiais, fragmentos proteicos e análogos de polipeptídeo de uma sequência proteica. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico.

[0105] O termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isolado" é uma proteína ou polipeptídeo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação (1) não está associado com os componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo, (2) são livres de outras proteínas da mesma espécie (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Assim, um polipeptídeo que é sintetizado quimicamente ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula da qual se origina naturalmente será "isolado" de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína pode também ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados por isolamento, utilizando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica.

[0106] Uma proteína ou polipeptídeo é "substancialmente puro", "substancialmente homogêneo" ou "substancialmente purificado" quando pelo menos cerca de 60 a 75% de uma amostra exibe uma única espécie de polipeptídeo. O polipeptídeo ou proteína pode ser monomérico ou multimérico. Um polipeptideo ou proteína substancialmente puro compreenderá tipicamente cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% P/P de uma amostra de proteína, mais habitualmente próximo de 95% e de preferência será acima de 99% puro. A pureza ou homogeneidade da proteína pode ser indicada por vários meios bem conhecidos na técnica, tal como eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguido pela visualização de uma única faixa de polipeptídeo na tingimento do gel com um corante bem conhecido na técnica. Para certas finalidades, pode-se ter resolução mais alta com HPLC ou outros meios bem conhecidos na técnica para purificação.

[0107] O termo "fragmento de polipeptídeo", neste relatório descritivo, refere-se a um polipeptídeo que tem uma deleção no terminal amino e/ou terminal carboxi, mas em que a sequência de aminoácidos restante é idêntica às posições correspondentes na sequência natural. Em algumas modalidades, os fragmentos têm pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos no comprimento. Em outras modalidades, os fragmentos têm pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, usualmente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, ainda mais preferivelmente pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento.

[0108] O termo "análogo de polipeptídeo", neste relatório descritivo, refere-se a um polipeptídeo compreendendo um segmento de pelo menos 25 aminoácidos que exibe identidade substancial com uma porção de uma sequência de aminoácidos e que possui pelo menos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica a MAdCAM sob condições adequadas para ligação, (2) capacidade para inibir a ligação da integrina o4B; e/ou L-selectina com MAdCAM ou (3) capacidade para reduz a expressão de MAdCAM na superfície celular in vitro ou in vivo. Tipicamente, os análogos de polipeptídeos compreendem uma a substituição conservadora de aminoácido (ou inserção ou deleção) em relação à sequência natural. Os Análogos tipicamente têm pelo menos aminoácidos de comprimento, preferivelmente pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento ou são mais longos, e podem frequentemente ser tão longos quanto um polipeptídeo completo natural.

[0109] As substituições preferidas de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação ou (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Os análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência diferente da sequência peptídica natural. Por exemplo, podem ser feitas substituições únicas ou múltiplas de aminoácidos (de preferência, substituições conservadoras de aminoácidos) na sequência natural (de preferência, na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam contatos intermoleculares. Uma substituição conservadora de aminoácido não deve mudar substancialmente as características estruturais da sequência precursora (por exemplo, um aminoácido substituído não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na sequência precursora, ou romper outros tipos da estrutura secundário que caracteriza sequência precursora) Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos, reconhecidas na técnica, são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et a/., Nature, 354:105 (1991), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

[0110] Análogos não peptídicos são habitualmente usados na indústria farmacêutica como fármacos com propriedades análogas àquelas do peptídeo modelo. Esses tipos de composto não peptídico são denominados "miméticos de peptídeos" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber e Freidinger, TINS, p.392(1985); e Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229(1987), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com a ajuda da modelagem molecular computadorizada. Os miméticos de peptídeos que são estruturalmente semelhantes a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Em geral, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipeptídeo paradigma (isto é, um polipeptídeo que possui uma propriedade bioquímica ou atividade farmacológica desejada), tal como um anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação como: -CHaNH-, —-CH2S-, —CH2-CH2, -CH=CH- (cis e trans), -COCH2—, -CH(OH)CH,— e — CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consenso por um D-aminoácido do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina no lugar de L-lisina) pode também ser usada para gerar peptídeos mais estáveis. Além disso, podem ser gerados peptídeos de conformação restrita que compreendem uma sequência consenso ou uma variação substancialmente idêntica à sequência consenso por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), aqui incorporado por referência); por exemplo, adicionando resíduos internos de cisteína capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares que tornam o peptídeo cíclico.

[0111] Uma "imunoglobulina" é uma molécula tetramérica. Em uma imunoglobulina natural, cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (aproximadamente 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (aproximadamente

50-70 kDa). A porção amino terminal de cada cadeia inclui uma região variável com cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, responsáveis primariamente pelo reconhecimento do antígeno. O terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves K e À. As cadeias pesadas são classificadas como yu, ô, y, a ou e, e define o isotipo do anticorpo como IgM, 1gD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variável e constante são unidas por uma região "J" de aproximadamente 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de aproximadamente 10 ou mais aminoácidos. Ver, em geral, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2º ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporado, em sua totalidade, por referência para todos os efeitos). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo de tal modo que uma imunoglobulina intacta possui dois sítios de ligação.

[0112] As cadeias de imunoglobulinas exibem a mesma estrutura geral de regiões framework (FR) (arcabouço) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões framework e formam um sítio de ligação específico de epítopo. Do N- terminal ao C-terminal, as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FRA. A designação dos aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987); Chothia et al., Nature, 342:878- 883(1989), cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência.

[0113] Um "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta ou a uma porção de ligação ao antígeno desta que compete com o anticorpo intacto pela ligação específica. Em algumas modalidades, um anticorpo é uma porção de ligação ao antígeno deste. As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por técnicas do DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. As porções de ligação ao antígeno incluem, entre outros, os fragmentos Fab, Fab”, F(ab')», Fv, dAb e de regiões determinantes de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, diabodies e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é suficiente para conferir ligação específica ao antígeno ao polipeptídeo. Um fragmento Fab é um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab), é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab unidos por uma ponte dissulfeto na região hinge (dobradiça); um fragmento Fd consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al., Nature, 341:544-546(1989)) consiste em um domínio VH.

[0114] Neste relatório descritivo, um anticorpo que é referido como, por exemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.2, 7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2 ou X481.2 é um anticorpo monocional produzido pelo hibridoma do mesmo nome. Por exemplo, o anticorpo 1.7.2 é produzido pelo hibridoma 1.7.2. Um anticorpo que é referido como 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod, 7.26.4-mod ou X481.2 é um anticorpo monoclonal cuja sequência foi modificada a partir de seu precursor correspondente por mutagênese sítio-dirigida.

[0115] Um anticorpo de cadeia única (scFv) é um anticorpo no qual as regiões VL e VH são emparelhadas para formar uma molécula monovalente por intermédio de um /inker (ligador) sintético que lhes permite ser produzidas como uma única cadeia proteica (Bird et al., Science, 242:423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 — (1988)) Diabodies são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, mas usando um /inker curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, assim, os domínios a formarem par com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) e Poljak, R. J,, et al., Estrutura, 2:1121-1123 (1994)). Uma ou mais CDRs de um anticorpo da invenção podem ser incorporadas em uma molécula covalente ou não covalentemente para torná-la uma imunoadesina que se liga especificamente a MAdCAM. Uma imunoadesina pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia polipeptídica maior, podem ligar covalentemente a(s) CDR(s) à outra cadeia polipeptídica ou podem incorporar a(s) CDR(s) não covalentemente. As CDRs permitem que a imunoadesina se ligue especificamente a um antígeno particular de interesse.

[0116] Um anticorpo pode ter um ou mais sítios de ligação. Se houver mais de um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina natural possui dois sítios de ligação idênticos, um anticorpo de cadeia única ou fragmento Fab possui um sítio de ligação, enquanto um anticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" (diabody) possui dois sítios de ligação diferentes.

[0117] Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) não está associado com componentes naturalmente associados, incluindo outros anticorpos naturalmente associados, que o acompanham em seu estado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Os exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo anti-MAdCAM que foi purificado por afinidade utilizando MADdCAM, um anticorpo anti-MAdCAM que foi produzido por um hibridoma ou outra linhagem celular in vitro e um anticorpo humano anti-MAdCAM derivado de um mamífero ou planta transgênico.

[0118] Neste relatório descritivo, o termo "anticorpo humano" significa um anticorpo no qual as sequências das regiões variáveis e constantes são sequências humanas. O termo abrange anticorpos com sequências derivadas de genes humanos, mas que foram mudadas, por exemplo, para diminuir possível imunogenicidade, aumentar a afinidade, eliminar cisteínas ou sítios de glicosilação que poderiam causar um dobramento indesejável, etc. O termo abrange tais anticorpos produzidos por recombinação em células não humanas que poderiam transmitir glicosilação não típica de células humanas. O termo também abrange anticorpos que foram criados em um camundongo transgênico que compreende alguns ou todos os /oci da cadeia pesada e leve de imunoglobulinas humanas.

[0119] Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado é um anticorpo que é derivado de uma espécie não humana, no qual certos aminoácidos nos domínios framework e constantes das cadeias pesada e leve sofreram mutação de modo a evitar ou anular uma resposta imune em seres humanos. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado pode ser produzido pela fusão dos domínios constantes de um anticorpo humano com os domínios variáveis de uma espécie não humana. Exemplos de como produzir anticorpos humanizados podem ser encontrados nas Patentes dos Estados Unidos Nº 6 054 297, 5 886 152 e 5877 293. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado anti- MAdCAM da invenção compreende a sequência de aminoácidos de um ou mais regiões framework de um ou mais anticorpos humanos anti-

MAdCAM da invenção.

[0120] Em outro aspecto, a invenção provê um "anticorpo quimérico". Em algumas modalidades, o anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos. Em uma modalidade preferida, uma ou mais das CDRs são derivadas de um anticorpo humano anti-MAdCAM da invenção. Em uma modalidade mais preferida, todas as CDRs são derivadas de um anticorpo humano anti- MAdCAM da invenção. Em outra modalidade preferida, as CDRs de mais de um anticorpo humano anti-MAdCAM da invenção são misturadas e combinadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode compreender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo humano anti-MAdCAM e ser combinada com a CDR?2 e CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo humano anti- MAdCAM, e as CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas de um terceiro anticorpo anti-MAdCAM. Além disso, as regiões framework podem ser derivadas de um dos mesmos anticorpos anti-MAdCAM, de um ou mais anticorpos diferentes, tais como um anticorpo humano, ou de um anticorpo humanizado.

[0121] Um "anticorpo neutralizante"”, "anticorpo inibidor" ou anticorpo antagonista é um anticorpo que inibe a ligação de a4B; ou de células que expressam a4B7, ou de qualquer outro ligante cognato ou células que expressam o ligante cognato a MAGdCAM em pelo menos cerca de 20%. Em uma modalidade preferida, o anticorpo reduz e/ou inibe a ligação da integrina dB; ou de células que expressam dB; a MAdCAM em pelo menos 40%, mais preferivelmente em 60%, ainda mais preferivelmente em 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. A redução na ligação pode ser medida por qualquer meio conhecido por qualquer técnico no assunto, por exemplo, como medida em um ensaio de ligação competitiva in vitro. Um exemplo de medição da redução na ligação de células que expressam axB7 a MAdCAM é apresentado no Exemplo |.

[0122] Fragmentos ou análogos de anticorpos podem ser facilmente preparados por quaisquer técnicos no assunto seguindo os ensinamentos desse relatório descritivo. Terminações amino e carbóxi preferidas de fragmentos ou análogos ocorrem perto dos limites de domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados de sequências de nucleotídeos e/ou aminoácidos com bases de dados de sequências públicas ou de propriedade exclusiva. De preferência, usam-se métodos de comparação computorizada para identificar motivos de sequência ou domínios proteicos de conformação predita que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. Já se conhecem métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida (Bowie et a/., Science, 253:164 (1991)).

[0123] O termo "ressonância plasmônica de superfície", neste relatório descritivo, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise em tempo real de interações bioespecíficas pela detecção de alterações em concentração da proteína dentro de uma matriz biossensora, por exemplo, utilizando o sistema BlAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.). Para descrições mais detalhadas, ver Jonsson, U., et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson, U., et al. Biotechniques, 11:620-627 (1991); Johnsson, B., et al., J. Mol. Recognit., 8:125-131 (1995); e Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198:268-277 (1991).

[0124] O termo "ko." refere-se à constante da off rate (taxa de dissociação) para dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.

[0125] O termo "K," refere-se à constante de dissociação de uma determinada interação anticorpo-antígeno. Diz-se que um anticorpo se liga a um antígeno quando a constante de dissociação é € 1 UM, preferivelmente < 100 nM e mais preferivelmente < 10 nM.

[0126] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante proteico capaz de ligação específica com uma imunoglobulina ou receptor de células T- ou de outro modo interagir com uma molécula. Os determinantes epitópicos consistem em agrupamentos quimicamente ativos na superfície de moléculas, tais como cadeias laterais de aminoácidos ou carboidratos e habitualmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características específicas de carga. Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional". Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula interagente (como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência primária de aminoácidos da proteína. Em um epítopo conformacional, os pontos de interação ocorrem em resíduos de aminoácidos na proteína que estão separados um do outro.

[0127] Neste relatório descritivo, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2º edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Os estereoisômeros (por exemplo, D- aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais como a-, a-aminoácidos dissubstituídos, aminoácidos N- alquila, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para os polipeptídeos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e-N,N N-trimetil-lisina, e- N-acetillisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil- histidina, S5-hidroxilisina, s-N-metilarginina e outros aminoácidos semelhantes e iminoácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação para polipeptídeos utilizada no presente, o sentido para a esquerda é o sentido amino terminal e o sentido para a direita é o sentido carbóxi terminal, de acordo com o uso padrão e a convenção.

[0128] O termo "polinucleotídeo", neste relatório descritivo, significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases no comprimento, quer ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas fita simples ou fita dupla de DNA.

[0129] O termo "polinucleotídeo isolado", neste relatório descritivo, significará um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética ou alguma combinação destes, que, em virtude de sua origem, o "polinucleotídeo isolado" (1) não está associado com todo ou com parte de um polinucleotídeo no qual o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo com o qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

[0130] O termo "oligonucleotídeo", neste relatório descritivo, inclui nucleotídeos — naturais e modificados unidos por ligações oligonucleotídicas naturais e modificadas. Os oligonucleotídeos são um subconjunto de polinucleotídeos que em geral compreendem 200 bases ou menos em comprimento. De preferência, os oligonucleotídeos têm a 60 bases de comprimento e, mais preferivelmente, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleotídeos são habitualmente de fita simples, por exemplo, para sondas; embora os oligonucleotídeos possam ser de fita dupla, por exemplo, para uso na construção de um mutante gênico. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser oligonucleotídeos sense ou antisense.

[0131] O termo "nucleotídeos naturais", neste relatório descritivo, inclui — desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos — modificados", neste relatório descritivo, inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e outros. O termo "ligações oligonucleotídicas", neste relatório descritivo, inclui ligações entre oligonucleotidecos como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato e outras. Vide, por exemplo, LaPlanche et a/., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res., 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxfordm, Inglaterra(1991)); Stec et al., U.S. Patent No. 5,151,510; Uhimann e Peyman, Chemical Reviews, 90:543(1990), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Um oligonucleotídeo pode incluir uma marcação para detecção, se desejado.

[0132] Sequências "operacionalmente ligadas" incluem tanto sequências de controle da expressão que são contíguas com o gene de interesse e sequências de controle da expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. O termo "sequência de controle da expressão", neste relatório descritivo, refere- se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento de sequências de codificação com as quais estão ligadas. As sequências de controle da expressão incluem sequências adequadas de iniciação, terminação, promotora e reforçadora da transcrição; sinais de processamento de RNA eficiente tais como sinais de splicing e poliadenilação; sequências que estabiizam o mRNA citoplasmático; sequências que realçam a eficiência de tradução (isto é, sequência consenso de Kozak); sequências que realçam a estabilidade da proteína; e quando desejado, sequências que realçam a secreção da proteína. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controle geralmente incluem sequência de promotor, sítio de ligação de ribossomo e de terminação da transcrição; em eucariotas, em geral, tais sequências de controle incluem promotores e sequência de terminação da transcrição. O termo "sequência de controle" destina-se a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento, e pode incluir também componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líderes e sequências parceiras de fusão.

[0133] O termo "vetor", neste relatório descritivo, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", o qual se refere a uma alça circular de DNA fita dupla no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos contendo uma origem de replicação bacteriana de vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais são ligados operativamente. Tais vetores são referidos neste relatório descritivo como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas do DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente, visto que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção destina-se a incluir tais outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados com defeito de replicação), que servem funções equivalentes.

[0134] O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), neste relatório descritivo, destina-se a referir-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve-se entender que tais termos se destinam a referir-se não só à célula objeto em particular, mas também à progênie de tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas que se devem à mutação ou a influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célula precursora, mas é ainda assim abrangida pelo termo "célula hospedeira" neste relatório descritivo.

[0135] O termo "hibridiza seletivamente", neste relatório descritivo, significa ligar-se de modo detectável e especificamente. Polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos destes de acordo com a invenção hibridizam seletivamente com fitas de ácido nucleico sob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. Podem ser usadas condições de "alto rigor" ou "altamente rigorosas" para alcançar condições de hibridização seletiva como conhecido na técnica e discutido no presente. Um exemplo de condições de "alto rigor" ou "altamente rigorosas" é um método de incubação de um polinucleotídeo com outro polinucleotídeo, em que um polinucleotídeo pode ser fixado a uma superfície sólida, tal como uma membrana, em um tampão de hibridização composto por 6X SSPE ou SSC, formamida 50%, 5X reagente de Denhardt, SDS 0,5%, DNA de esperma de salmão desnaturado, fragmentado 100 upgml a uma temperatura de hibridização de 42 ºC por 12-16 horas, seguido por lavagem duas vezes a 55 ºC com um tampão de lavagem composto por 1X SSC, SDS 0,5%. Ver também Sambrook et a/., supra, pp. 9.50-9.55.

[0136] O termo "porcentagem de identidade de sequência", no contexto de sequências de nucleotídeos, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima. A extensão da comparação de identidade de sequência pode ser em relação a um trecho de pelo menos aproximadamente nove nucleotídeos, habitualmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais habitualmente pelo menos 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo menos 32 nucleotídeos e, de preferência, pelo menos 36, 48 ou mais nucleotídeos. Existem vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser empregados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos. Por exemplo, as sequências de polinucleotídeos podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit, que são programas no Wisconsin Package Versão 10.3, Accelrys, San Diego, CA. O FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2 e FASTAS3, fornece alinhamentos e a porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de entrada (query) e de busca (search) (Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998); aqui incorporados por referência). A menos que especificado de outra forma, usam-se os parâmetros padrão de um programa ou algoritmo em particular. Por exemplo, a porcentagem de identidade de sequência entre sequências de nucleotídeos pode ser determinada utilizando FASTA com seus parâmetros padrão (tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de pontuação) ou usando Gap com os seus parâmetros padrão fornecidos no Wisconsin Package Versão 10.3, aqui incorporado por referência.

[0137] Uma referência a uma sequência de nucleotídeos abrange seu complemento a menos que especificado o contrário. Assim, deve- se entender que uma referência a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência em particular abrange sua fita complementar, com sua sequência complementar.

[0138] Na técnica da biologia molecular, os pesquisadores usam os termos "porcentagem de identidade de sequência", "porcentagem de similaridade de sequência" e "porcentagem de homologia de sequência" alternadamente. Neste pedido de patente, esses termos terão o mesmo significado no que diz respeito a sequências de nucleotídeos somente.

[0139] O termo "similaridade substancial" ou "similaridade de sequência substancial", quando em referência a um ácido nucleico ou seu fragmento, indica que, quando alinhado otimamente com outro ácido nucleico (ou com sua fita complementar), tendo as inserções ou deleções adequadas de nucleotídeos, existe identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos aproximadamente 85%, preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases dos nucleotídeos, como medida por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tais como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido acima.

[0140] Como aplicado a polipeptídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando alinhadas otimamente, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando os valores para intervalo de default, compartilham pelo menos 75% ou 80% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. De preferência, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservadoras de aminoácidos. Uma "substituição conservadora de aminoácido" é aquela na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido contendo uma cadeia lateral (grupo R)

com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade).. Em geral, uma substituição conservadora de aminoácido não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem uma da outra por substituições conservadoras, a porcentagem de identidade de sequência ou o grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Os recursos para efetuar tal ajuste são conhecidos pelos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994), aqui incorporado por referência. Os exemplos de grupos de aminoácidos que contêm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas com hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; e 6) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Os grupos de aminoácidos preferidos para substituição conservadora são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato- aspartato e asparagina-glutamina.

[0141] Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança tendo valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 divulgada em Gonnet et al, Science, 256: 1443-45 (1992), aqui incorporado por referência, Uma substituição "moderadamente conservadora" é qualquer mudança tendo valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.

[0142] A similaridade de sequência para polipeptídeos é medida tipicamente usando um software de análise de sequências. O software de análise de proteínas equipara sequências semelhantes utilizando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, os programas como "Gap" e "Bestfit" contém GCG que pode ser utilizado como parâmetro padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos, ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína desta. Ver, por exemplo, o pacote Wisconsin versão 10.3. Sequências polipeptídicas também ser comparadas utilizando o FASTA com parâmetros padrão ou recomendados, um programa no pacote Wisconsin versão 10.3. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de entrada e de busca (Pearson (1990); Pearson (2000)). Outro algoritmo preferido quando da comparação de uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, utilizando parâmetros padrão. Ver, por exemplo, Altschul et a/., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997); aqui incorporado por referência.

[0143] O comprimento das sequências polipeptídicas comparadas quanto à homologia será geralmente de pelo menos aproximadamente 16 resíduos de aminoácidos, habitualmente pelo menos 20 resíduos, mais habitualmente de pelo menos 24 resíduos, tipicamente de pelo menos 28 resíduos e preferivelmente acima de aproximadamente 35 resíduos. Quando da busca em um banco de dados contendo sequências de um número grande de organismos diferentes, é preferível comparar sequências de aminoácidos.

[0144] Neste relatório descritivo, os termos "marcação" ou "marcado" referem-se à incorporação de outra molécula no anticorpo.

Em uma modalidade, a marcação é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido radiomarcado ou a ligação de porções biotiniladas a um polipeptídeo que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em outra modalidade, a marcação ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo, um conjugado medicamentoso ou toxina. Vários métodos para marcação de polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados. Os exemplos de marcações para polipeptídeos incluem, entre outros, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 1ºC, *SN, Ss, *Y, Tc, Min, 1261, 1), marcações fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforo-lantanídeo), marcações enzimáticas (por exemplo, peroxidase do rábano, B- galactosidase, luciferase, fosfatase —* alcalina), marcadores quimioluminescentes, grupos biotinilados, epítopos predeterminados de polipeptídeos reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, tags (etiquetas) de epítopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas como toxina da coqueluche, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi- antracinadiona, mitoxantrona, — mitramicina, actinomicina D, 1- dehidrotestosterona, glicocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolo| e puromicina e análogos ou homólogos destes. Em algumas modalidades, as marcações são anexadas por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

[0145] O termo "agente" é usado no presente para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológicos. O termo "agente farmacêutico ou fármaco", neste relatório descritivo, refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando devidamente administrado a um paciente. Outros termos de química no presente são usados de acordo com o uso convencional na técnica, como exemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw- Hill, San Francisco (1985)), aqui incorporado por referência).

[0146] O termo agente "anti-inflamatório" ou "imunomodulador" é usado no presente para referir-se a agentes que têm a propriedade funcional de inibir inflamação, incluindo doença inflamatória em um indivíduo, incluindo em um ser humano. Em várias modalidades desta invenção, a doença inflamatória pode ser, entre outras, doenças inflamatórias do trato gastrointestinal incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa, doença diverticular, gastrite, doença hepática, esclerose biliar primária, colangite esclerosante. As doenças inflamatórias também incluem, entre outras, doenças abdominais (incluindo peritonite, apendicite, doença do sistema biliar), mielite transversa aguda, dermatite alérgica (incluindo alergia cutânea, eczema alérgico, atopia de pele, eczema atópico, dermatite atópica, inflamação cutânea, eczema inflamatório, dermatite inflamatória, infecção cutânea por pulga, dermatite miliar, eczema miliar, infecção cutânea por ácaro doméstico), espondilite anquilosante (síndrome de Reiters), asma, inflamação das vias aéreas, aterosclerose, arteriosclerose, atresia biliar, inflamação da bexiga, câncer de mama, inflamação cardiovascular (incluindo vasculite, infartos reumatoides das dobras ungueais, úlceras na perna, polimiosite, inflamação vascular crônica, pericardite, doença pulmonar obstrutiva crônica), pancreatite crônica, perineural inflamação perineural, colite (incluindo colite amebiana, colite infecciosa, colite bacteriana, colite de Crohn, colite isquêmica, colite ulcerativa,

proctocolite — idiopática, “doença inflamatória intestinal, colite pseudomembranosa), transtornos vasculares de colágeno (artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica progressiva, doença mista do tecido conjuntivo, diabetes mellitus), doença de Crohn (enterite regional, ileíte granulomatosa, inflamação do sistema digestivo), doença desmielinizante (incluindo mielite, esclerose múltipla, esclerose disseminada, encefalomielite aguda disseminada, desmielinização perivenosa, deficiência de vitamina B12, síndrome de Guillain-Barré, infecção por retrovírus associada à esclerose múltipla), dermatomiosite, diverticulite, diarreia exsudativa, gastrite, hepatite granulomatosa, inflamação granulomatosa, colecistite, diabetes mellitus insulino-dependente, doenças hepáticas inflamatórias (fibrose hepática, cirrose biliar primária, hepatite, colangite esclerosante), inflamação pulmonar (fibrose pulmonar idiopática, granuloma eosinofílico do pulmão, histiocitose pulmonar X, inflamação peribronquiolar, bronquite aguda), linfogranuloma venéreo, melanoma maligno, doença bucal/dental (incluindo gengivite, doença periodontal), mucosite, inflamação do sistema musculoesquelético (miosite), esteato-hepatite não alcoólica (doença hepática gordurosa não hepática), inflamação ocular e orbital (incluindo uveite, neurite óptica, ulceração reumatoide periférica, inflamação periférica da córnea), osteoartrite, osteomielite, inflamação faríngea, poliartrite, proctite, psoríase, lesão por radiação, sarcoidose, necropatia da célula falciforme, tromboflebite superficial, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, tireoidite, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto contra hospedeiro, lesão aguda por queimadura, síndrome de Behçet, síndrome de Sjôgren.

[0147] Os termos paciente e indivíduo incluem pacientes humanos e veterinários. Anticorpos humanos anti-MAdCAM e sua caracterização

[0148] Em uma modalidade, a invenção provê anticorpos anti-

MAdCAM que compreendem sequências de CDRs humanas. Em uma modalidade preferida, a invenção provê anticorpos humanos anti- MAdCAM. Em algumas modalidades, os anticorpos humanos anti- MAdCAM são produzidos por imunizar um animal não humano transgênico, por exemplo, um roedor, cujo genoma compreende genes de imunoglobulina humana de modo que o animal transgênico produz anticorpos humanos. Em algumas modalidades, a invenção provê um anticorpo anti-MAdCAM que não liga complemento.

[0149] Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti- MAdCAM compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 4, 8, 12,16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 ou 150 (com ou sem a sequência sinal) ou a região variável de qualquer uma das ditas sequências de aminoácidos, ou uma ou mais CDRs dessas sequências de aminoácidos. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti- MAJdCAM compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64 ou 148 (com ou sem a sequência sinal) ou a sequência de aminoácidos da região variável, ou de uma ou mais CDRs das ditas sequências de aminoácidos. À invenção inclui também anticorpos humanos anti-MAdCAM que compreende a sequência de aminoácidos desde o início da CDR1 até o final da CDR3 de qualquer uma das sequências mencionadas acima. À invenção provê ainda um anticorpo anti-MAdCAM que compreende uma ou mais regiões FR de qualquer uma das sequências mencionadas acima.

[0150] A invenção provê ainda um anticorpo anti-MAdCAM que compreende uma das sequências de aminoácidos mencionadas antes, nas quais uma ou mais modificações tenham sido feitas. Em algumas modalidades, cisteínas no anticorpo, que podem ser quimicamente reativas, são substituídas por outro resíduo, tais como, sem limitação, alanina ou serina. Em uma modalidade, a substituição é em uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma CDR ou região framework de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica.

[0151] Em algumas modalidades, é feita uma substituição de aminoácido para eliminar sítios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em uma CDR ou na região framework de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. À substituição de resíduos de cisteína e a remoção de sítios proteolíticos pode diminuir a heterogeneidade no anticorpo produzido. Em algumas modalidades, pares asparagina-glicina, que formam sítios potenciais de desamidação, são eliminados alterando um ou ambos os resíduos. Em algumas modalidades, é feita uma substituição de aminoácido para adicionar ou remover sítios potenciais de glicosilação na região variável de um anticorpo da invenção.

[0152] Em algumas modalidades, a lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-MAdCAM da invenção é clivada. Em várias modalidades da invenção, as cadeias pesadas eleves dos anticorpos anti-MAdCAM pode incluir opcionalmente uma sequência sinal.

[0153] Em um aspecto, a invenção provê doze anticorpos monoclonais humanos anti-MAdCAM inibidores e as linhagens celulares de hibridomas que os produzem. A Tabela 1 lista os identificadores de sequência (SEQ ID NO:) dos ácidos nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves completas (incluindo sequência sinal), e as sequências completas deduzidas correspondentes de aminoácidos. Tabela 1

(SEQ ID NO:) Anticorpo monocional [mo a

NE E NC E A ez [a [Ie RO) [622 Te Tn 36 [6 [62 [| e e [| 2% o [1 e e | a

[0154] Em outro aspecto, a invenção provê uma versão modificada de certos anticorpos monoclonais humanos anti-MAdCAM identificados acima. A Tabela 2 lista os identificadores de sequência das sequências de DNA e proteica dos anticorpos modificados. Tabela 2 Anticorpo (SEQ ID NO) monoclonal modificado [estimo | se [ 6 [6 [se

Anticorpo (SEQID NO) monoclonal modificado El [Comme | 6 | & [6 | e | [rBAmo | mn | e [6 | e | Classe e subclasse de anticorpos anti-MAdCAM

[0155] O anticorpo pode ser uma molécula de IgG, IgM, IgE, IgA ou de IgD. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é da classe IgG e é de uma subclasse IgG, IgG>2, IgG3 ou IgG. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é de uma subclasse IgG, ou IgGa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é da mesma classe e subclasse que o anticorpo 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4- mod que é IgG>2, ou 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 ou

9.8.2, que é IgGa..

[0156] A classe e subclasse de anticorpos anti-MAdCAM podem ser determinadas por qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas utilizando anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse em particular de anticorpo. Tais anticorpos estão disponíveis comercialmente. ELISA, Western Blot além de outras técnicas podem determinar a classe e subclasse. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas por sequenciamento de todos ou de uma porção dos domínios constantes da cadeia pesada e/ou leve dos anticorpos, comparação de suas sequências de aminoácidos com sequências conhecidas de aminoácidos de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinação da classe e subclasse dos anticorpos como a classe que mostra a identidade de sequência mais alta. Seletividade por espécie e molécula

[0157] Em outro aspecto da invenção, o anticorpo anti-MAdCAM demonstra seletividade por espécie e molécula. Em uma modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM liga-se à MAdCAM humana, de cynomolgus e canina. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MAdCAM não se liga a uma espécie de macaco do Novo Mundo, como sagui. Seguindo os ensinamentos do relatório descritivo, é possível determinar a seletividade por espécie do anticorpo anti-MAdCAM por meio de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, é possível a seletividade por espécie por meio de Western blot, FACS, ELISA ou imuno-histoquímica. Em uma modalidade preferida, é possível a seletividade por espécie utilizando imuno-histoquímica.

[0158] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-MAdCAM que se liga especificamente a MAdCAM tem seletividade por MAdCAM em relação a VCAM, fibronectina ou qualquer outro antígeno que é pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM não exibe qualquer ligação apreciável a VCAM, fibronectina ou qualquer outro antígeno além de MAdCAM. A seletividade do anticorpo anti-MAdCAM por MAdCAM pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos na técnica e seguindo os ensinamentos do relatório descritivo. Por exemplo, é possível determinar a seletividade utilizando Western blot, FACS, ELISA ou imuno-histoquímica. Afinidade de ligação a MAdCAM de anticorpos anti-MAGdCAM

[0159] Em outro aspecto da invenção, os anticorpos anti-MAdCAM ligam-se especificamente a MAdCAM com alta afinidade. Em uma modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM liga-se especificamente a

MAdCAM com Ka igual ou inferior a 3 x 10º M, como medida por ressonância plasmônica de superfície, tal como BlAcore. Em modalidades mais preferidas, o anticorpo liga-se especificamente a MAdCAM com Ka igual ou inferior a 1 x 108 ou igual ou inferior a 1 x 10 º M. Em uma modalidade ainda mais preferida, o anticorpo liga-se especificamente a MAdCAM com Ka igual ou inferior a 1 x 10º M. Em outras modalidades preferidas, um anticorpo da invenção liga-se especificamente a MAGdCAM com Ka igual ou inferior a 2,66 x 10º M, igual ou inferior a 2,35 x 10º M ou igual ou inferior a 9 x 10º M. Em outra modalidade preferida, o anticorpo liga-se especificamente a MAdCAM com Ka igual ou inferior a 1 x 10º M. Em outra modalidade preferida, o anticorpo liga-se especificamente a MAdCAM com substancialmente a mesma Ka que um anticorpo selecionado dentre

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Um anticorpo com "substancialmente a mesma Ka" que um anticorpo de referência tem uma Ka que é + 100 pM, preferivelmente + 50 pM, mais preferivelmente + 20 pM, ainda mais preferivelmente + 10 PM, + 5 pM ou + 2 pM, quando comparada à Ka do anticorpo de referência no mesmo experimento. Em outra modalidade preferida, o anticorpo liga-se a MAMdCAM com substancialmente a mesma Ka que um anticorpo que compreende um ou mais domínios variáveis ou uma ou mais CDRs de um anticorpo selecionado dentre 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4- mod. Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo liga-se a MAdDdCAM com substancialmente a mesma Ka que um anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 148 ou 450

(com ou sem a sequência sinal), ou o domínio variável destas. Em outra modalidade preferida, o anticorpo ligasse a MAdCAM com substancialmente a mesma Ka que um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs de um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOS: 2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 148 ou 450.

[0160] A afinidade de um anticorpo anti-MAdCAM a MAdCAM pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade, a afinidade de ligação pode ser medida por ELISAs de competição, RIAs ou ressonância plasmônica de superfície, tal como BlAcore. Em uma modalidade mais preferida, a afinidade de ligação é medida por ressonância plasmônica de superfície. Em uma modalidade ainda mais preferida, a afinidade de ligação e a taxa de dissociação são medidas usando um BlAcore. Um exemplo de determinação da afinidade de ligação é descrito abaixo no Exemplo |l. Meia-vida de anticorpos anti-MAdCAM

[0161] De acordo com outro objeto da invenção, o anticorpo anti- MAdCAM possui uma meia-vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo. Em uma modalidade preferida, o anticorpo ou sua porção possui uma meia-vida de pelo menos três dias. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo ou sua porção possui uma meia-vida de quatro dias ou mais longa. Em outra modalidade, o anticorpo ou sua porção possui uma meia-vida de oito dias ou mais longa. Em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste é derivado ou modificado tal que tenha uma meia-vida mais longa, como discutido abaixo. Em outra modalidade preferida, o anticorpo pode conter mutações pontuais para aumentar a meia-vida no soro, tal como descrito em WO 00/09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000.

[0162] A meia-vida do anticorpo pode ser medida por qualquer meio conhecido por qualquer técnico no assunto. Por exemplo, a meia-vida do anticorpo pode ser medida por Western blot, ELISA ou RIA ao longo de um período de tempo adequado. A meia-vida do anticorpo pode ser medida por em qualquer animal adequado, como um primata, por exemplo, macaco cynomolgus, ou um ser humano.

Identificação de epítopos de MAdCAM reconhecidos pelo anticorpo Anti-MAdCAM

[0163] A invenção também provê um anticorpo humano anti- MAdCAM que se liga ao mesmo antígeno ou epítopo que um anticorpo humano anti-MAdCAM aqui provido. Além disso, a invenção provê um anticorpo humano anti-MAdCAM que competes ou compete de modo cruzado com um anticorpo humano anti-MAdCAM. Em uma modalidade preferida, o anticorpo humano anti-MAdCAM é 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4- mod. Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano anti- MAGdCAM compreende um ou mais domínios variáveis ou uma ou mais CDRs de um anticorpo selecionado dentre 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo humano anti-MAdCAM compreende uma das sequências de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOS: 2,4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 148 ou 150 (com ou sem a sequência sinal), ou um domínio variável destas. Em outra modalidade preferida, o anticorpo humano anti-MAdCAM compreende uma ou mais CDRs de um anticorpo que compreende uma das sequências de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOS: 2, 4,6,8,10,12,14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 148 ou 150. Em uma modalidade altamente preferida,

o anticorpo anti-MAdCAM é outro anticorpo humano.

[0164] Pode-se determinar se um anticorpo anti-MAdCAM liga-se ao mesmo antígeno que outro anticorpo anti-MAdCAM utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, pode-se usar um anticorpo anti-MAdCAM conhecido para capturar o antígeno, eluir o antígeno do anticorpo anti-MAdCAM e, a seguir, determinar se o anticorpo em teste vai se ligar ao antígeno eluído. Pode-se determinar se um anticorpo compete com um anticorpo anti-MAdCAM pela ligação do anticorpo anti-MAdCAM a MAdCAM sob condições saturantes e, a seguir, medir a capacidade do anticorpo em teste para ligar-se a MAdCAM. Se o anticorpo em teste for capaz de ligar-se à MAdCAM ao mesmo tempo que o anticorpo anti-MAdCAM, então o anticorpo em teste liga-se a um epítopo diferente do ligado pelo anticorpo anti- MAdCAM. No entanto, se o anticorpo em teste não for capaz de se ligar à MAdCAM ao mesmo tempo, então o anticorpo em teste compete com o anticorpo humano anti-MAdCAM. Esse experimento pode ser realizado por meio de ELISA, ressonância plasmônica de superfície ou, preferivelmente, BlAcore. Para testar se um anticorpo anti-MAdCAM compete de modo cruzado com outro anticorpo anti-MAdCAM, pode-se usar o método de competição descrito acima em duas direções, isto é, determinar se o anticorpo conhecido bloqueia o anticorpo em teste e vice-versa. Uso de genes da cadeia leve e pesada

[0165] A invenção também provê um anticorpo anti-MAdCAM que compreende uma região variável da cadeia leve codificada por um gene K humano. Em uma modalidade preferida, a região variável da cadeia leve é codificada por uma família de genes VK A2, A3, A26, B3, 012 ou O18 humanos. Em várias modalidades, a cadeia leve não compreende mais do que onze, mais do que seis ou mais do que três substituições de aminoácidos da sequência da linhagem germinativa de VK A2, A3,

A2Z6, B3, O12 ou 018 humanos. Em uma modalidade preferida, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras.

[0166] As SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 e 150 fornecem as sequências de aminoácidos das cadeias leves kappa completas de treze anticorpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264 e 9.8.2 e X481.2. As Figuras 1K-1T são alinhamentos das sequências de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia leve de doze anticorpos anti-MAdCAM com as sequências da linhagem germinativa das quais eles derivam. A Figura 2A mostra um alinhamento das sequências de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia leve das cadeias leves kappa de doze anticorpos anti-MAdCAM umas com as outras. Seguindo os ensinamentos deste relatório descritivo, qualquer técnico no assunto poderia determinar as diferenças entre as sequências da linhagem germinativa e as sequências dos anticorpos de anticorpos anti- MAdCAM adicionais. As SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 ou 68 fornecem as sequências de aminoácidos das cadeias leves kappa completas de cinco anticorpos anti-MAdCAM adicionais, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,

6.67. 1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod, modificados por substituição de aminoácido em seus anticorpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.77.1 ou 7.26.4 precursores, respectivamente.

[0167] Em uma modalidade preferida, a VL do anticorpo anti- MAdCAM contém as mesmas mutações, em relação à sequência de aminoácidos da linhagem germinativa, que qualquer uma ou mais das VL dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,

6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,

6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod ou 7.26.4-mod. A invenção inclui um anticorpo anti-MAdCAM que utiliza os mesmos genes humanos Vk e Jk que um anticorpo exemplificado. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma ou mais das mesmas mutações na linhagem germinativa que um ou mais anticorpos exemplificados. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende substituições diferentes em uma ou mais das mesmas posições que um ou mais dos anticorpos exemplificados. Por exemplo, a VL do anticorpo anti-MAdCAM pode conter um ou mais substituições de aminoácidos que são iguais àquelas presentes no anticorpo 7.16.6, e outra substituição de aminoácido que é a mesma que no anticorpo 7.26.4. Desse modo, é possível misturar e combinar características diferentes de ligação do anticorpo a fim de alterar, por exemplo, a afinidade do anticorpo por MAdCAM ou sua taxa de dissociação do antígeno. Em outra modalidade, as mutações são efetuadas na mesma posição que aquelas encontradas em qualquer uma ou mais das VL dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1,6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod, mas são feitas substituições conservadoras de aminoácidos em vez de usar o mesmo aminoácido. Por exemplo, se a substituição de aminoácido, em comparação à linhagem germinativa, em um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2,

6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264,

9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou

7.26.4-mod é glutamato, pode-se substituir conservadoramente o aspartato. Do mesmo modo, se a substituição de aminoácido é serina, pode-se substituir conservadoramente a treonina.

[0168] Em outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é igual à sequência de aminoácidos da VL de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade altamente preferida, a cadeia leve compreende sequências de aminoácidos que são iguais às regiões CDR da cadeia leve of 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2,

6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos uma região CDR da cadeia leve de

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2,6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67 .1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende sequências de aminoácidos com CDRs de diferentes cadeias leves que utiizam os mesmos genes VK e JK. Em uma modalidade mais preferida, as CDRs de diferentes cadeias leves são obtidas de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 64, 66, 68, ou 150 com ou sem a sequência sinal. Em outra modalidade, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67 (com ou sem a sequência sinal), ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contendo 1-11 inserções, deleções ou substituições de aminoácidos da mesma. De preferência, as substituições de aminoácidos são substituições conservadoras de aminoácidos. Em outra modalidade, o anticorpo ou sua porção compreende uma cadeia leve lambda.

[0169] A presente invenção também provê um anticorpo anti- MAdCAM, ou sua porção, que compreende uma sequência do gene VH humano ou uma sequência derivada de um gene VH humano. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de cadeia pesada é derivada de uma família de genes VH 1-18, 3- 15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ou 4-4 humanos. Em várias modalidades, a cadeia pesada não compreende mais do que quinze, mais do que seis ou mais do que três alterações de mudanças em aminoácidos na sequência dos genes VH 1-18, 3-15, 3- 21, 3-23, 3-30, 3-33 ou 4-4 humanos da linhagem germinativa.

[0170] As SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, e 148 fornecem as sequências de aminoácidos de cadeias pesadas completas de treze anticorpos anti-MAdCAM. As Figuras 1A-1J são alinhamentos das sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesadas de doze anticorpos anti-MAdCAM com as sequências da linhagem germinativa das quais estas derivam. A Figura 2B mostra os alinhamentos das sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesadas de doze anticorpos anti-MAdCAM umas com as outras. Seguindo os ensinamentos deste relatório descritivo e as sequências de nucleotídeos da invenção, qualquer técnico no assunto poderia determinar a sequência de aminoácidos codificada das doze cadeias pesadas anti-MAdCAM e das cadeias pesadas da linhagem germinativa e determinar as diferenças entre as sequências da linhagem germinativa e as sequências dos anticorpos. As SEQ ID NOS: 52, 56, 60 e 64 fornecem as sequências de aminoácidos das cadeias pesadas completas dos anticorpos anti-MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod e

6.67.1-mod, modificadas por substituição de aminoácido nos seus anticorpos anti-MAdCAM precursores, 6.22.2, 6.342 e 6.671 respectivamente. Um anticorpo antic-MAdCAM modificado adicional,

7.26.4-mod, possui uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada completa que é a SEQ ID NO: 42.

[0171] Em uma modalidade preferida, a VH do anticorpo anti- MAdJdCAM contém as mesmas mutações, em relação à sequência de aminoácidos da linhagem germinativa, que qualquer uma ou mais das VH dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,

6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,

6.67. 1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Semelhantemente ao que foi discutido acima, o anticorpo compreende uma ou mais das mesmas mutações na linhagem germinativa que um ou mais anticorpos exemplificados. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende substituições diferentes em uma ou mais das mesmas posições que um ou mais dos anticorpos exemplificados. Por exemplo, a VH do anticorpo anti-MAdCAM pode conter uma ou mais substituições de aminoácidos que são iguais àquelas presentes no anticorpo 7.16.6, e outra substituição de aminoácido que é igual àquela no anticorpo 7.26.4. Dessa maneira, é possível misturar e combinar características de diferentes de ligação de anticorpo para alterar, por exemplo, a afinidade do anticorpo por MAdCAM ou sua taxa de dissociação do antígeno. Em outra modalidade, é feita uma substituição de aminoácido, em comparação à linhagem germinativa, na mesma posição que uma substituição na linhagem germinativa como encontrada em qualquer uma ou mais das VH do anticorpo de referência 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4- mod, mas a posição é substituída com um resíduo diferente, que é uma substituição conservadora em comparação ao anticorpo de referência.

[0172] Em outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é igual à sequência de aminoácidos da VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.671,

6.73.2,6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34 .2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade altamente preferida, a cadeia pesada compreende sequências de aminoácidos que são iguais às regiões CDR da cadeia pesada de 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos de pelo menos uma região

CDR da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.671,

6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.4, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende sequências de aminoácidos com CDRs de diferentes cadeias pesadas. Em uma modalidade mais preferida, as CDRs de diferentes cadeias pesadas são obtidas de 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67 .1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64 ou 148 com ou sem a sequência sinal. Em outra modalidade, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre SEQ ID NOS: 1,5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59, 63 ou 149 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contendo 1-15 inserções, deleções ou substituições de aminoácido na mesma. Em outra modalidade, as substituições são substituições conservadoras de aminoácidos. Métodos de produção de anticorpos e de linhagens de células produtoras dos anticorpos Imunização

[0173] Em uma modalidade da presente invenção, são produzidos anticorpos humanos para imunizar um animal não humano, os quais compreendem alguns ou todos os /oci de cadeia pesada e leve de imunoglobulinas humanas com um antígeno de MAdCAM. Em uma modalidade preferida, o animal não humano é um animal XENOMOUSEY, o qual é uma linhagem modificada de camundongos que compreende fragmentos grandes dos /oci de imunoglobulinas humanas e que é deficiente na produção de anticorpos de camundongos. Ver, por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) e Patentes dos Estados Unidos 5 916 771, 5939 598, 5 985615, 998 209, 6 075 181, 6 091 001, 6 114 598 e 6 130 364. Ver também WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 e WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560 e WO 00/037504. O animal XENOMOUSE'Y produz um repertório do tipo adulto humano de anticorpos completamente humanos e gera mAbs humanos antígeno-específicos. Uma segunda geração do animal XENOMOUSEY contém aproximadamente 80% do repertório do gene V de anticorpo humano através da introdução de fragmentos YAC de configuração da linhagem germinativa de tamanho megabase dos /oci de cadeia pesada e /oci de cadeia leve K humanas. Em outras modalidades, os camundongos XENOMOUSE'Y contêm aproximadamente todos os loci da cadeia pesada e cadeia leve À humanas. Ver Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

[0174] A invenção também provê um método para produzir anticorpos anti-MAdCAM a partir de animais não humanos não camundongos, imunizando-se animais não humanos transgênicos que compreendem /loci de imunoglobulinas humanas. É possível produzir tais animais utilizando os métodos descritos imediatamente acima. Os métodos revelados nesses documentos podem ser modificados como descrito na Patente U.S. 5 994 619 (a "patente 619"), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. A patente 619 descreve métodos para produzir novas células de massa celular interna cultivada (CICM) e linhagens celulares, derivadas de porcos e vacas, células CICM transgênicas nas quais DNA heterólogo foi inserido. As células CICM transgênicas podem ser utilizadas para produzir embriões, fetos e descendentes transgênicos clonados. A patente 619 também descreve métodos para produzir animais transgênicos que são capazes de transmitir o DNA heterólogo para a sua progênie. Em uma modalidade preferida, os animais não humanos podem ser ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos.

[0175] Em outra modalidade, o animal não humano que compreende /oci de imunoglobulina humana são animais que possuem um "minilocus" de imunoglobulinas humanas. Na abordagem de minilocus, um lócus exógeno de lg é imitado através da inclusão de genes individuais do lócus de Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, domínio(s) constante(s) py e segundo(s) domínio(s) constante(s) (de preferência, domínio(s) constante(s) gama) são formados em uma construção para inserção em um animal. Essa abordagem é descrita, inter alia, na Patente U.S. Nº 5 545 807, 5 545 806, 5 625 126, 5633 425, 5 661 016, 5770 429, 5789 650, 5 814 318, 5 591 669, 5 612 205, 5 721 367, 5789 215 e 5 643 763, aqui incorporadas por referência.

[0176] Uma vantagem da abordagem de minilocus é a rapidez com que construções incluindo porções do lócus de Ig podem ser geradas e introduzidas em animais. No entanto, uma desvantagem potencial da abordagem de minilocus e que pode não haver diversidade suficiente de imunoglobulinas para apoiar o desenvolvimento completo de células B, tal que pode haver menor produção de anticorpos.

[0177] Para produzir um anticorpo humano anti-MAdCAM, um animal não humano compreendendo alguns ou todos os /oci de imunoglobulina humana é imunizado com um antígeno de MAdCAM e um anticorpo, ou uma célula produtora do anticorpo, é isolado do animal. O antígeno de MAGdCAM pode ser MAdCAM isolada e/ou purifica e é preferivelmente uma MAdCAM humana. Em outra modalidade, o antígeno de MAdCAM é um fragmento de MAdCAM, preferivelmente o domínio extracelular de MAGdCAM. Em outra modalidade, o antígeno de

MAdCAM é um fragmento que compreende pelo menos um epítopo de MAdCAM. Em outra modalidade, o antígeno de MAdCAM é uma célula que expressa MAdCAM em sua superfície celular, preferivelmente uma célula que superexpressa MAdCAM em sua superfície celular.

[0178] A imunização dos animais pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1990). Métodos para imunizar animais não humanos tais como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, gado e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane e a Patente dos Estados Unidos 5 994 619. Em uma modalidade preferida, o antígeno de MAdCAM é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Tais adjuvantes incluem adjuvante completo ou incompleto de Freund, RIBI (dipeptídeos de muramila) ou ISCOM (complexos imunoestimuladores). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptídeo da dispersão rápida sequestrando-o em um depósito local, ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. De preferência, se um polipeptídeo está sendo administrado, o esquema de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, distribuídas em várias semanas.

[0179] O Exemplo | fornece um protocolo para imunização de um animal XENOMOUSETY com MAdCAM humana completa em solução salina com tampão fosfato. Produção de anticorpos e linhagens de células produtoras de anticorpos

[0180] Depois da imunização de um animal com um antígeno de MAdCAM, anticorpos e/ou células produtoras de anticorpos podem ser obtidos do animal. É obtido um soro contendo anticorpo anti-MAdCAM do animal por sangria ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado como é obtido do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida do soro ou os anticorpos anti-MAdCAM podem ser purificados do soro.

[0181] Em outra modalidade, linhagens de células imortalizadas produtoras do anticorpo podem ser preparadas a partir do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e células B são imortalizadas por meio de métodos bem conhecidos na técnica. Os métodos para imortalizar células incluem, entre outros, transfecção com oncogenes, infecção com um vírus oncogênico e cultura das células sob condições que selecionam as células imortalizadas, submetendo-as a compostos carcinogênicos ou que induzem mutações, fusão das mesmas com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma, e inativação de um gene supressor do tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Em modalidades envolvendo as células de mieloma, as células de mieloma não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem celular não secretora). Depois da imortalização e seleção antibiótica, as células imortalizadas, ou sobrenadantes da cultura destas, são rastreadas utilizando MADdCAM, uma porção desta ou uma célula que expressa MAdCAM. Em uma modalidade preferida, o rastreamento inicial é realizado utilizando um ensaio imunoenzimático (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferivelmente ELISA. Um exemplo de ELISA é fornecido na Publicação PCT Nº WO 00/37504, aqui incorporada por referência.

[0182] Em outra modalidade, as células que produzem anticorpos podem ser preparadas a partir de um ser humano portador de um transtorno autoimune e que expressa anticorpos anti-MAdCAM. Células expressando os anticorpos anti-MAdCAM podem ser isoladas, isolando e submetendo leucócitos à classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou por panning em placas revestidas com MAdCAM ou uma porção desta. Essas células podem ser fundidas com um mieloma não secretor humano para produzir hibridomas humanos que expressam anticorpos humanos anti-MAdCAM. Em geral, essa é uma modalidade menos preferida porque é provável que os anticorpos anti-MAdCAM venham a ter baixa afinidade por MAJCAM.

[0183] As células produtoras de anticorpos Anti-MAdCAM, por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e rastreadas mais para características desejáveis, incluindo crescimento celular robusto, alta produção de anticorpos e características desejáveis do anticorpo, como discutido mais detalhadamente abaixo. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singênicos, em animais desprovidos de um sistema imune, por exemplo, camundongos nude, ou em cultura celular in vitro. Os métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0184] De preferência, o animal imunizado é um animal não humano que expressa genes de imunoglobulinas humanas, e as células B esplênicas são fundidas a um mieloma derivado da mesma espécie que o animal não humano. Mais preferivelmente, o animal imunizado é um animal XENOMOUSEY e a linhagem celular de mieloma é de mieloma de camundongo não secretor, como a linhagem celular de mieloma P3- X63-AG8-653 (ATCC). Ver, por exemplo, Exemplo |.

[0185] Assim, em uma modalidade, a invenção provê métodos para produção de uma linhagem celular que produz um anticorpo monoclonal humano ou um fragmento deste direcionado contra MAdCAM, os quais compreendem (a) imunizar um animal não humano transgênico aqui descrito com MAdCAM, uma porção de MAdCAM ou uma célula ou tecido expressando MAdCAM; (b) permitir que o animal transgênico desenvolva uma resposta imune a MAdCAM; (c) isolar células produtoras do anticorpo do animal transgênico; (d) imortalizar células produtoras do anticorpo; (e) criar populações monocionais individuais das células imortalizadas que produzem anticorpos; e (f) rastrear as células imortalizadas que produzem anticorpos, ou sobrenadantes da cultura destas, para identificar um anticorpo direcionado contra MAdJdCAM.

[0186] Em um aspecto, a invenção provê hibridomas que produzem anticorpos humanos anti-MAdCAM. Em uma modalidade preferida, os hibridomas são hibridomas de camundongos, como descrito acima. Em outra modalidade, os hibridomas são produzidos em uma espécie não humana não de camundongo, tais como ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. Em outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos, em que um mieloma não secretor humano é fundido com uma célula humana expressando um anticorpo anti-MAdCAM. Ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e métodos de produção de anticorpos recombinantes Ácidos nucleicos

[0187] São fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-MAdCAM da invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico codifica a cadeia pesada e/ou leve de uma imunoglobulina anti-MAdCAM. Em uma modalidade preferida, uma única molécula de ácido nucleico codifica uma cadeia pesada de uma imunoglobulina antic-MAdCAM e outra molécula de ácido nucleico codifica a cadeia leve de uma imunoglobulina anti-MAdCAM. Em uma modalidade mais preferida, a imunoglobulina codificada é uma imunoglobulina humana, preferivelmente uma IgG humana. A cadeia leve codificada pode ser uma cadeia À ou uma cadeia K, preferivelmente uma cadeia K.

[0188] Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve compreende a sequência da linhagem germinativa de um gene VK A2, A3, A26, B3, 012 ou 018 humano, ou uma variante da dita sequência. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve compreende uma sequência derivada de um gene JK1, JK2, JK3, JK4 ou

JK5 humano. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve não codifica mais que onze mudanças em aminoácidos do gene A2, A3, A26, B3, O12 ou O18 VK da linhagem germinativa, preferivelmente não mais de seis mudanças em aminoácidos e, ainda mais preferivelmente, não mais de três mudanças em aminoácidos. Em uma modalidade mais preferida, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve é a sequência da linhagem germinativa.

[0189] A invenção provê uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia leve (VL) contendo até onze mudanças em aminoácidos quando comparada à sequência da linhagem germinativa, em que as mudanças em aminoácidos são idênticas às mudanças em aminoácidos da sequência da linhagem germinativa da VL de um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2,

6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. À invenção também provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 1.7.2,

1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod ou 7.26.4-mod. A invenção também provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma ou mais das CDRs de qualquer uma das cadeias leves de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67 1,

6.73.2,6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34 .2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de todas as CDRs de qualquer uma das cadeias leves de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2,

6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma dentre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68, 150 ou compreende uma sequência de nucleotídeos de uma dentre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67. Em outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma ou mais das CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68, 150 ou compreende uma sequência de nucleotídeos de uma ou mais das CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 3, 7, 11,15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, ou 67. Em uma modalidade mais preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de todas as CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68, 150 ou compreende a sequência de nucleotídeos de todas as CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65, ou 67.

[0190] A invenção também provê uma molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos de uma VL que possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma VL descrita acima, especialmente a uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos de uma dentre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 ou 150. A invenção também provê uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de uma dentre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67.

[0191] Em outra modalidade, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico que hibrida sob condições altamente rigorosas com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma VL como descrita acima, especialmente uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos dentre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68, 150. A invenção também provê uma molécula de ácido nucleico que hibrida sob condições altamente rigorosas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos de uma dentre SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 57, 61, 65 ou 67.

[0192] A invenção também provê uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável da cadeia pesada (VH) que utiliza um gene VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ou 4-4 VH humano. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o gene VH utiliza um gene da família JH4 ou JH6. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica o gene VH utilizada o gene JH4b ou JH6b humano. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência derivada de um gene D 3-10, 4- 23, 5-5, 6-6 ou 6-19 humano. Em uma modalidade ainda mais preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a VH não contém mais de quinze mudanças em aminoácido dos genes VH 1-18, 3-15, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33 ou 4-4 da linhagem germinativa, preferivelmente não mais de seis mudanças em aminoácidos e, ainda mais preferivelmente, não mais de três mudanças em aminoácidos. Em uma modalidade altamente preferida, a molécula de ácido nucleico que codifica a VH contém pelo menos uma mudança em aminoácido quando comparada à sequência da linhagem germinativa, em que a mudança em aminoácido é idêntica a uma mudança em aminoácido da sequência da linhagem germinativa da cadeia pesada de um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2,

6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma modalidade ainda mais preferida, a VH contém não contém mais de quinze mudanças em aminoácidos quando comparada às sequências da linhagem germinativa, em que as mudanças são idênticas àquelas mudanças da sequência da linhagem germinativa da VH de um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.671,

6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67. 1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod.

[0193] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da VH de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,

6.73.2,6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34 .2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma ou mais das CDRs da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1,6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod,

6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico compreende sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de todas as CDRs da cadeia pesada de 1.7.2, 1.8.2,

6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264,

9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou

7.26.4-mod. Em outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma dentre SEQ ID NOS: 2,6,10,14,18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64 ou 148 ou que compreende uma sequência de nucleotídeos de uma dentre SEQ ID NOS: 1, 5,9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59, 63, ou 149. Em outra modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de uma ou mais das CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 2,6,10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64 ou 148 ou compreende uma sequência de nucleotídeos de uma ou mais das CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59,63 ou 149. Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica as sequências de aminoácidos de todas as CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64, 148 ou compreende uma sequência de nucleotídeos de todas as CDRs de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41 45, 51, 55, 59, 63 ou 149. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma região contígua desde o início da CDR1 até o final da CDR3 de uma cadeia pesada ou leve de qualquer um dos anticorpos anti-MAdCAM mencionados acima.

[0194] Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos de uma VH que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma das sequências de aminoácidos que codificam uma VH como descrita imediatamente acima, especialmente a uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos de uma dentre SEQ ID NOS: 2,6,10,14,18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60 ou 64. A invenção também provê uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de uma dentre SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59, 63 ou 149.

[0195] Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico que codifica uma VH é aquela que hibridiza sob condições altamente rigorosas com uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VH como descrita acima, especialmente a uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos de uma dentre SEQ ID NOS: 2,6,10,14,18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64 ou 148. A invenção também provê uma sequência de nucleotídeos que codifica uma VH que hibridiza sob condições altamente rigorosas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos de uma dentre SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59, 63, 149.

[0196] A sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma ou ambas as cadeias pesadas e leves inteiras de um anticorpo anti- MAdCAM ou as regiões variáveis destas pode ser obtida de quaisquer fontes que produza um anticorpo anti-MAdCAM. Métodos para isolamento do mMRNA que codifica um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). O MRNA pode ser utilizado na produção de CDNA para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR) ou clonagem do cDNA de genes de anticorpos. Em uma modalidade da invenção, as moléculas de ácido nucleico podem ser obtidas de um hibridoma que expressa um anticorpo anti-MAdCAM, como descrito acima, preferivelmente um hibridoma que possui, como um de seus parceiros de fusão, uma célula de animal transgênico que expressa genes de imunoglobulinas humanas, tal como um animal XENOMOUSETY, um animal camundongo não humano transgênico ou um animal transgênico não humano não camundongo. Em outra modalidade, o hibridoma é derivado de um animal não humano não transgênico, o qual pode ser utilizado, por exemplo, para os anticorpos humanizados.

[0197] Uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada inteira de um anticorpo anti-MAdCAM pode ser construída fundindo-se uma molécula de ácido nucleico que codifica o domínio variável inteiro de uma cadeia pesada ou um domínio de ligação ao antígeno desta com um domínio constante de uma cadeia pesada.

Do mesmo modo, uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve de um anticorpo anti-MAdCAM pode ser construída fundindo-se uma molécula de ácido nucleico que codifica o domínio variável de uma cadeia leve ou um domínio de ligação ao antígeno desta com um domínio constante de uma cadeia leve.

Moléculas de ácido nucleico que codificam as regiões VH e VL podem ser convertidas em genes de anticorpos completos pela inserção das moléculas em vetores de expressão que já codificam regiões constantes da cadeia pesada e constantes da cadeia leve, respectivamente, tal que o segmento VH seja ligado operativamente a segmento(s) da região constante da cadeia pesada (CH) dentro do vetor e o segmento VL é ligado operativamente ao segmento da região constante da cadeia (CL) dentro do vetor.

Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias VH ou VL são convertidas em genes do anticorpo completo unindo, por exemplo, ligando a molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia VH a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cadeia CH por meio de técnicas padrão de biologia molecular.

O mesmo pode ser conseguido utilizando moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias VL e CL.

As sequências de genes da região constante da cadeia pesada e leve humanas são conhecidas na técnica.

Ver, por exemplo, Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed., NIH Publ.

No. 91-3242 (1991). As moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e/ou leve completas podem então ser expressas a partir de uma célula na qual elas foram introduzidas e o anticorpo anti-MAdCAM isolado.

[0198] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico codificador da região variável da cadeia pesada codifica a região variável das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 52, 56, 60, 64 ou 148, e a molécula do ácido nucleico codificador da região variável das cadeias leves codifica a região variável da sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24,28, 32, 36, 40, 44, 48, 54, 58, 62, 66, 68 ou 150.

[0199] Em uma modalidade, uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM ou uma porção de ligação ao antígeno deste, ou a cadeia leve de um anticorpo anti- MAdCAM ou uma porção de ligação ao antígeno deste pode ser isolada de um animal não humano não camundongo que expresse genes de imunoglobulina humana e que tenha sido imunizado com um antígeno de MAdCAM. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico pode ser isolada de uma célula produtora de anticorpo anti-MAdCAM, derivada de um animal não transgênico ou de um paciente humano que produz anticorpos anti-MAdCAM. O mRNA de células produtoras do anticorpo anti-MAdCAM pode ser isolado por técnicas padrão, clonado e/ou amplificado utilizando PCR e técnicas de construção de bibliotecas, e rastreado empregando protocolos padrão para obter moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesadas e leves anti-MAdCAM.

[0200] As moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para expressar de modo recombinante grandes quantidades de anticorpos anti-MAdCAM, como descrito abaixo. As moléculas de ácido nucleico podem também ser utilizadas para produzir quiméricos anticorpos, anticorpos de cadeia única, imunoadesinas, diabodies, anticorpos com mutação e derivados de anticorpos, como descrito mais detalhadamente abaixo. Se as moléculas de ácido nucleico forem derivadas de um animal não humano não transgênico, as moléculas de ácido nucleico podem ser utilizadas para humanização do anticorpo,

igualmente como descrito abaixo.

[0201] Em outra modalidade, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser utilizadas como sondas ou primers (iniciadores) de PCR para sequências específicas de anticorpo. Por exemplo, uma sonda de molécula de ácido nucleico pode ser utilizada em métodos diagnósticos ou um primer de PCR de molécula de ácido nucleico pode ser utilizado para amplificar regiões do DNA que poderiam ser usadas, inter alia, para isolar sequências de nucleotídeos para uso na produção de domínios variáveis de anticorpos anticMAdCAM. Em uma modalidade preferida, as moléculas de ácido nucleico são oligonucleotídeos. Em uma modalidade mais preferiday os oligonucleotídeos são de regiões altamente variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo de interesse. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos codificam toda ou parte de uma ou mais das CDRs. Vetores

[0202] A invenção provê vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico da invenção que codificam a cadeia pesada ou a porção de ligação ao antígeno desta. A invenção também provê vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico da invenção que codificam a cadeia leve ou a porção de ligação ao antígeno desta. À invenção também provê vetores compreendendo moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos e sondas dos mesmos.

[0203] Para expressar os anticorpos, ou porções dos anticorpos da invenção, DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou completas, obtidas como descrito acima, são inseridos em vetores de expressão de modo que os genes sejam ligados operativamente a sequências de controle da transcrição e da tradução. Os vetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados (AAV), vírus vegetais como o vírus mosaico da couve- flor, o vírus mosaico do tabaco, cosmídeos, YACSs, epissomos derivados do EBV e outros. O gene de anticorpo é ligado em um vetor de modo que as sequências transcricionais e traducionais de controle dentro do vetor sirvam a sua função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as sequências de controle da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira utilizada para expressão. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em uma modalidade preferida, os dois genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação com extremidade abrupta (blunt end) se nenhum sítio de restrição estiver presente).

[0204] Um vetor conveniente é aquele que que codifica uma sequência CH ou CL funcionalmente completa de imunoglobulina humana, com sítios de restrição adequados, modificados de modo que qualquer sequência VH ou VL possa ser facilmente inserida e expressa, como descrito acima. Em tais vetores, o splicing ocorre habitualmente entre o sítio doador de splicing na região J inserida e o sítio aceitador de splicing anterior à região C humana, e também nas regiões de splicing que ocorrem dentro dos exons CH humanos. A poliadenilação e terminação da transcrição ocorrem em sítios cromossômicos nativos a jusante das regiões codificadoras. O vetor de expressão recombinante pode também codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo por uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de tal modo que o peptídeo sinal seja ligado in frame (na orientação correta de clonagem) à terminação amino do gene da cadeia de anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína diferente de imunoglobulina).

[0205] Além dos genes de cadeias de anticorpo, os vetores de expressão recombinante da invenção carregam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeias de anticorpo em uma célula hospedeira. Será avaliado pelos técnicos no assunto que o delineamento do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. As sequências reguladoras preferidas para expressão em uma célula hospedeira de mamíferos incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão proteica em células de mamíferos, como promotores e/ou reforçadores derivados de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/reforçador do CMV), vírus 40 dos símios (SV40) (tal como o promotor/reforçador do SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal do adenovírus (AdMLP)), promotores do polioma e fortes de mamíferos com promotores nativos de imunoglobulinas e actina. Para uma descrição mais detalhada de elementos virais reguladores, e de suas sequências, ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nº* 5 168 062, 4 510 245 e 4 968 615, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores, bem como a transformação de plantas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos 6 517 529. Métodos para expressar polipeptídeos em células bacterianas ou de fungos, por exemplo, células de levedura, são igualmente bem conhecidos na técnica.

[0206] Além dos genes de cadeias de anticorpo e das sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinante da invenção podem carregar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nº* 4 399 216, 4 634 665 e 5 179 017). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, a uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr" para seleção com metotrexato/amplificação), o gene neo (para seleção com G418) e o gene da glutamato sintetase.

Células hospedeiras não de hibridomas e métodos de produção recombinante de proteínas

[0207] Moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta e/ou a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta de um anticorpo anti-MAdCAM e vetores compreendendo essas moléculas de ácido nucleico podem ser utilizados para transformação de uma célula hospedeira adequada de mamífero, vegetal, bacteriana ou de levedura. A transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediana por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediana por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas, injeção biobalística e microinjeção direta do DNA nos núcleos além disso, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas em células de mamíferos por vetores virais. Métodos para transformar células são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nº 4 399 216, 4 912 040, 4 740 461 e 4 959 455 (cujos conteúdos são aqui incorporados por referência). Métodos para transformar células vegetais são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação biobalística, injeção direta, eletroporação e transformação viral. Métodos para transformar células bacterianas e de fungos são igualmente bem conhecidos na técnica.

[0208] Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiras para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponibilizadas pela American Type Culture Collection (ATCC). Essas incluem, inter alia, células do ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, células HeLa, células renais de hamster recém-nascido (BHK), células renais de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células 3T3 e várias outras linhagens celulares. As células hospedeiras de mamíferos incluem células humanas, de camundongo, rato, cão, macaco, porco, cabra, bovino, cavalo e hamster. As linhagens celulares de preferência particular são selecionadas pela determinação de quais linhagens celulares possuem altos níveis de expressão. Outras linhagens celulares que podem ser utilizadas são linhagens celulares de insetos, como células Sf9, células de anfíbios, células bacterianas, células vegetais e células de fungos. Quando os vetores de expressão recombinante que codificam a cadeia pesada ou porção de ligação ao antígeno desta, a cadeia leve e/ou porção de ligação ao antígeno desta são introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos cultivando as células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura por métodos padrão de purificação de proteínas. As células hospedeiras vegetais incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentilha d'água, milho, trigo batata, etc. As células hospedeiras bacterianas incluem E. coli e de espécies de Streptomyces. As células hospedeiras de leveduras incluem Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.

[0209] Além disso, a expressão de anticorpos da invenção (ou de outras porções destes) a partir das linhagens celulares de produção pode ser realçada utilizando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, o sistema de expressão do gene glutamina sintetase (o sistema GS) é uma abordagem comum para realçar a expressão sob certas condições. O sistema GS system é discutido no todo ou parte em conexão com as Patentes Europeias Nº* O 216 846, O 256 055, O 338 841 e O 323 997.

[0210] É provável que anticorpos expressos por linhagens celulares diferentes ou em animais transgênicos venham a apresentar glicosilação diferente uns dos outros. No entanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácido nucleico aqui providas, ou compreendendo as sequências de aminoácidos aqui providas integram a presente invenção, independentemente da glicosilação dos anticorpos. Animais e plantas transgênicas

[0211] A invenção também provê animais não humanos transgênicos e plantas transgênicas compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico da invenção que podem ser utilizados para produzir os anticorpos da invenção. Os anticorpos podem ser produzidos em tecidos ou líquidos corporais, tais como leite, sangue ou urina, e dali recuperados de cabras, vacas, cavalos, porcos, ratos, camundongos, coelhos, hamsters ou outros mamíferos. Ver, por exemplo, Patente U.S. Nº* 5 827 690, 5 756 687, 5750 172 e 5741 957. Como descrito acima, animais não humanos transgênicos que compreendem loci de imunoglobulina humana podem ser imunizados com MAdCAM ou uma porção desta. Métodos para produção de anticorpos em plantas são descritos, por exemplo, in nas Patentes U.S. 6 046 037 e 5 959 177, aqui incorporadas por referência.

[0212] Em outra modalidade, animais não humanos transgênicos e plantas transgênicas são produzidos introduzindo uma ou mais moléculas de ácido nucleico da invenção no animal ou na planta por técnicas transgênicas padrão. Ver Hogan, supra. As células transgênicas usadas para produzir o animal transgênico podem ser células-tronco embrionárias, células somáticas ou células de ovo fertilizado. Os organismos não humanos transgênicos podem ser quiméricos, heterozigotos não quiméricos e homozigotos não quiméricos. Ver, por exemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2º ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). Em outra modalidade, os organismos não humanos transgênicos podem ter uma ruptura e substituição direcionadas que codificam uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve de interesse. Em uma modalidade preferida, os animais ou as plantas transgênicas compreendem e expressam moléculas de ácido nucleico que codificam cadeias pesadas e leves que se combinam para ligarem-se especificamente a MAdCAM, preferivelmente à MAGCAM humana. Em outra modalidade, os animais ou as plantas transgênicas compreendem moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo modificado, tal como um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser produzidos em qualquer animal transgênico. Em uma modalidade preferida, os animais não humanos são camundongos, ratos, ovelhas, porcos, cabras, gado ou cavalos. O animal não humano transgênico expressa os ditos polipeptídeos codificados no sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros líquidos corporais. Bibliotecas de expressão em fagos

[0213] A invenção provê um método para produzir um anticorpo anti-MAdCAM, ou porção de ligação ao antígeno deste, que compreende as etapas de sintetizar uma biblioteca anticorpos humanos em fagos, rastrear a biblioteca com uma MAdCAM, ou uma porção desta, isolar o fago que se liga à MAJCAM e obter o anticorpo do fago. Um método para preparar a biblioteca de anticorpos compreende as etapas de imunizar um animal hospedeiro não humano que compreenda um lócus de imunoglobulina humana com MAdDdCAM, ou com uma porção antigênica desta, para criar uma resposta imune, extrair células do animal hospedeiro que sejam as células responsáveis pela produção de anticorpos; isolar o RNA das células extraídas, transcrever o RNA de modo reverso para produzir cDNA, amplificar o CDNA usando um primer e inserir o CDNA no vetor de expressão em fagos (phage display) de tal modo que os anticorpos sejam expressos no fago. Anticorpos anti- MAJdCAM recombinantes da invenção podem ser obtidos dessa maneira.

[0214] Os anticorpos humanos anti-MAdCAM recombinantes da invenção, além dos anticorpos anti-MAdCAM aqui revelados, podem ser isolados por rastreamento de uma biblioteca combinatória de anticorpos recombinantes, preferivelmente uma biblioteca de scFv de expressão em fagos, preparada usando cDNAs de VL e VH humanas, preparados a partir de mMRNA isolado de linfócitos humanos. Metodologias para preparação e rastreamento de tais bibliotecas são conhecidos na técnica. Existem kits disponíveis comercialmente para gerar bibliotecas de expressão em fagos (por exemplo, o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nº de catálogo 27-9400-01; e o kit de expressão em fagos Stratagene SurfZAPTY“, nº de catálogo 240612). Há também outros métodos e reagentes que podem ser usados para gerar e rastrear bibliotecas de expressão de anticorpos (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº 5 223 409; Publicação PCT Nº WO 92/18619; Publicação PCT Nº WO 91/17271; Publicação PCT Nº WO 92/20791; Publicação PCT Nº WO 92/15679; Publicação PCT Nº WO 93/01288; Publicação PCT Nº WO 92/01047; Publicação PCT Nº WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9:1369-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad et a/l., Biotechnology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res, 19:4133-4137 (1991); e Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991).

[0215] Em uma modalidade preferida, para isolar anticorpos humanos anti-MAdCAM com as características desejadas, um anticorpo humano anti-MAdCAM, como aqui descrito, é primeiramente usado para selecionar sequências de cadeia pesada e leve humanas tendo atividade de ligação semelhante para MAdCAM, utilizando os métodos de marcação de epítopos descritos em Hoogenboom et a/., Publicação PCT Nº WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos utilizadas nesse método são preferivelmente bibliotecas de scFv, preparadas e rastreadas como descrito em McCafferty et al., Publicação PCT Nº WO 92/01047, McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); e Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993). As bibliotecas de anticorpos scFv são preferivelmente rastreadas usando MAGdCAM humana como o antígeno.

[0216] Uma vez selecionados os segmentos VL e VH humanos iniciais, são realizados "experimentos de misturar e combinar", nos quais pares diferentes dos segmentos VL e VH inicialmente selecionados são rastreados quanto à ligação à MAdCAM, para selecionar combinações de pares VL/VH preferidos. Adicionalmente, para melhorar mais a qualidade do anticorpo, os segmentos VL e VH do(s) par(es) VL/VH preferido(s) podem modificados por mutações aleatórias, de preferência dentro da região CDR3 de VH e/ou VL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação por afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Essa maturação por afinidade in vitro pode ser realizada amplificando regiões VH e VL usando primers de PCR complementares à CDR3 de VH CDR3 ou à CDR3 de VL, respectivamente, primers estes que foram "reforçados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeos em certas posições, de tal modo que os produtos resultantes da PCR codificam segmentos VH e VL nos quais mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões CDR3 de VH e/ou VL. Esses segmentos VH e VL com mutações aleatórias podem voltar a ser rastreados quanto à ligação à MAJdCAM.

[0217] Após o rastreamento e isolamento de um anticorpo anti- MAdCAM da invenção, a partir de uma biblioteca de expressão de imunoglobulinas recombinantes, o ácido nucleico que codifica o anticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de expressão (por exemplo, a partir do genoma de fago) e subclonado em outros vetores de expressão por técnicas padrão de DNA recombinante. Se desejado, o ácido nucleico pode ser ainda manipulado para criar outras formas de anticorpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado por rastreamento de uma biblioteca combinatória, o DNA que codifica o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras de mamíferos, como descrito acima. Mudança de classe

[0218] Outro aspecto da presente invenção é prover um mecanismo pelo qual a classe of um anticorpo anti-MAdCAM possa ser mudada para outra. Em um aspecto da invenção, uma molécula de ácido nucleico que codifica VL ou VH é isolada usando métodos bem conhecidos na técnica, de tal modo que não inclua quaisquer sequências de nucleotídeos que codifiquem CL ou CH. A molécula de ácido nucleico que codifica VL ou VH é então ligada operativamente a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma CL ou CH de uma classe diferente de molécula de imunoglobulina. Isso pode ser realizado utilizando um vetor ou molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência codificadora de CL ou CH, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo anti-MAdCAM que era originalmente IgM pode ser mudado de classe para IgG. Além disso, a mudança de classe pode ser utilizada para converter uma subclasse de IgG em outra, por exemplo, de IgG« para IgG2. Um método preferido para produzir um anticorpo da invenção, compreendendo um isotipo ou uma subclasse desejada de anticorpo, compreende as etapas de isolar um ácido nucleico codificador da cadeia pesada de um anticorpo anti-MAdCAM e um ácido nucleico codificador da cadeia leve de um anticorpo anti- MAdCAM, obter a região variável da cadeia pesada, ligar a região variável da cadeia pesada com o domínio constante de uma cadeia pesada do isotipo desejado, expressar a cadeia leve e a cadeia pesada ligadas em uma célula e coletar o anticorpo anti-MAdCAM com o isotipo desejado. Derivados de anticorpo

[0219] É possível utilizar as moléculas de ácido nucleico descritas acima para gerar derivados de anticorpo por técnicas e métodos conhecidos por qualquer técnico no assunto. Anticorpos humanizados

[0220] A imunogenicidade de anticorpos não humanos pode ser reduzida em alguma medida usando técnicas de humanização,

empregando potencialmente técnicas de expressão em bibliotecas adequadas. Será apreciado que anticorpos murinos ou anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados utilizando técnicas bem conhecidos no assunto. Ver, por exemplo, Winter and Harris, Immunol Today, 14:43-46 (1993) e Wright et a/., Crit. Reviews in Immunol., 12125-168 (1992). O anticorpo de interesse pode ser modificado por técnicas de DNA recombinante para que os domínios CrH1, Ch2, CH3, hinge e/ou o domínio framework sejam substituídos pela sequência humana correspondente (ver WO 92/02190 e Patente U.S. Nº* 5 530 101, 5 585 089, 5 693 761, 5693 792, 5714 350 e 5777 085). Em outra modalidade, um anticorpo anti-MAdCAM não humano pode ser humanizado substituindo a Ch1, domínio hinge, ChH2, CH3 e/ou os domínios framework pela sequência humana correspondente de um anticorpo anti-MAdCAM da invenção.

Anticorpos com mutação

[0221] Em outra modalidade, as moléculas de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras podem ser utilizados para produzir anticorpos anti-MAdCAM com mutação. Os anticorpos podem sofrer mutação nos domínios variáveis das cadeias pesada e/ou leve para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, pode ser criada uma mutação em uma ou mais das regiões CDR para aumentar ou diminuir a Ka do anticorpo contra MAdCAM. Técnicas de mutagênese sitio-diridida são bem conhecidas no assunto. Ver, por exemplo, Sambrook et a/l., e Ausubel et al., supra. Em uma modalidade preferida, são criadas mutações em um resíduo de aminoácido, conhecido por estar mudado em comparação à linhagem germinativa, em uma região variável de um anticorpo anti-MAdCAM. Em uma modalidade mais preferida, uma ou mais mutações são criadas em um resíduo de aminoácido, conhecido por estar mudado em comparação à linhagem germinativa, em uma região variável ou região CDR de um dos anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.671,

6.73.2,6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2- mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade, uma ou mais mutações são criadas em um resíduo de aminoácido, conhecido por estar mudado em comparação à linhagem germinativa, em uma região variável ou região CDR cuja sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68 148 ou 150 ou cuja sequência de nucleotídeos é apresentada em SEQ ID NOS: 1,3, 5,7, 9,11,13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47, 51,53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 ou 149. Em outra modalidade, as moléculas de ácido nucleico soffem mutação em uma ou mais das regiões framework. Pode-se criar uma mutação em uma região framework ou domínio constante para aumentar a meia-vida do anticorpo anti-MAdCAM. Ver, por exemplo, WO 00/09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000, aqui incorporado por referência. Em uma modalidade, pode haver uma, três ou cinco ou dez mutações pontuais e não mais de quinze mutações pontuais. Pode-se criar uma mutação em uma região framework ou domínio constante para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio de ligação covalente ou não covalente a outra molécula ou para alterar tais propriedades como fixação do complemento. Podem ser criadas mutações em cada uma das regiões framework, o domínio constante e as regiões variáveis em um único anticorpo com mutação. Alternativamente, podem ser criadas mutações em apenas um dentre as regiões framework, as regiões variáveis ou o domínio constante em um único anticorpo com mutação.

[0222] Em uma modalidade, não há mais de quinze mudanças em aminoácidos nas regiõês VH ou VL do anticorpo anti-MAdCAM com mutação, em comparação ao anticorpo anti-MAdCAM antes da mutação. Em uma modalidade mais preferida, não há mais de dez mudanças em aminoácidos nas regiões VH ou VL do anticorpo anti- MAdCAM com mutação, mais preferivelmente não mais de cinco mudanças em aminoácidos ou, ainda mais preferivelmente, não mais de três mudanças em aminoácidos. Em outra modalidade, não há mais de quinze mudanças em aminoácidos nos domínios constantes, mais preferivelmente, não mais de dez mudanças em aminoácidos, ainda mais preferivelmente, não mais de cinco mudanças em aminoácidos. Anticorpos modificados

[0223] Em outra modalidade, pode ser produzido um anticorpo de fusão ou imunoadesina que compreende todo ou uma porção de um anticorpo anti-MAdCAM ligado a outro polipeptídeo. Em uma modalidade preferida, somente as regiões variáveis do anticorpo anti- MAdCAM são ligadas ao polipeptídeo. Em outra modalidade preferida, o domínio VH de um anticorpo anti-MAdCAM é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto o domínio VL de um anticorpo anti-MAdCAM é ligado a um segundo polipeptídeo que se associa com o primeiro polipeptídeo de maneira que os domínios VH e VL possam interagir um com outro para formar sítio de ligação de anticorpo. Em outra modalidade preferida, o domínio VH é separado do domínio VL por um linker de tal modo que os domínios VH e VL possam interagir um com o outro (ver abaixo em Anticorpos de cadeia única). O anticorpo VH-linker- VL é então ligado ao polipeptídeo de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídeo para uma célula ou tecido que expressa MAdCAM. O polipeptídeo pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, fator de crescimento ou outra proteína reguladora, ou pode ser um agente diagnóstico, tal como uma enzima que possa ser facilmente visualizada, tal como peroxidase do rábano. Além disso, podem ser criados anticorpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia única são ligados um ao outro. Isso é útil caso se deseje criar um anticorpo bivalente ou polivalente em uma única cadeia polipeptídica, ou caso se deseje criar um anticorpo biespecífico.

[0224] Para criar um anticorpo de cadeia única, (scFv), os fragmentos de DNA que codificam VH e VL são ligados operativamente a outro fragmento codificador de um /inker flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal modo que as sequências de VH e VL possam ser expressas como um proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo /linker flexível (ver, por exemplo, Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); Huston et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma única VH e VL são usadas, bivalente, caso duas VH e VL sejam usadas ou polivalente, caso mais de duas VH e VL sejam usadas.

[0225] Em outra modalidade, outros anticorpos modificados podem ser preparados utilizando moléculas de ácido nucleico que codificam anti-MAdCAM. Por exemplo, "Kappa bodies" (Ill et al., Protein Eng, 10: 949-57(1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9(1994)), "Diabodies" (Holliger et al, PNAS USA, 90: 6444-6448(1993)), ou "Janusinas" (Traunecker et al, EMBO J, 10:3655-3659 (1991) e Traunecker et al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents", Int J Cancer Suppl, 7:51-52 (1992)) podem ser preparados, utilizando técnicas padrão de biologia molecular e seguindo os ensinamentos do relatório descritivo.

[0226] Em outro aspecto, podem ser gerados anticorpos quiméricos e biespecíficos. Pode ser criado um anticorpo quimérico que compreende CDRs e regiões framework de anticorpos diferentes. Em uma modalidade preferida, as CDRs do anticorpo quimérico compreendem todas as CDRs da região variável de uma cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo humano anti-MAdCAM, enquanto as regiões framework são derivadas de um ou mais anticorpos diferentes. Em uma modalidade mais preferida, as CDRs do anticorpo quimérico compreendem todas as CDRs das regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada de um anticorpo humano anti-MAdCAM. As regiões framework podem ser de outra espécie e podem, em uma modalidade preferida, ser humanizadas. Alternativamente, as regiões framework podem ser de outro anticorpo humano.

[0227] Pode ser gerado um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a MAdCAM através de um domínio de ligação e uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. O anticorpo biespecífico pode ser produzido através de técnicas de biologia molecular recombinante, ou pode ser fisicamente conjugado junto. Além disso, pode ser gerado um anticorpo de cadeia única contendo mais de uma VH e VL que se liga especificamente a MAdCAM e a outra molécula. Tais anticorpos biespecíficos podem ser gerados utilizando técnicas bem conhecidas, por exemplo, em conexão com (i) e (ii) ver, por exemplo, Fanger et al., Inmunol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright and Harris, supra, e em conexão com (iii) ver, por exemplo, Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992). Em uma modalidade preferida, o anticorpo biespecífico liga-se a MAdCAM e a outra molécula expressa em alto nível em células endoteliais. Em uma modalidade mais preferida, a outra molécula é VCAM, ICAM ou L- selectina.

[0228] Em várias modalidades, os anticorpos modificados descritos acima são preparados utilizando uma ou mais das regiões variáveis ou uma ou mais regiões CDR de um dos anticorpos selecionado dentre

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67 .1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Em outra modalidade, os anticorpos modificados são preparados utilizando uma ou mais das regiões variáveis ou uma ou mais regiões CDR cuja sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 148 ou 150 ou cuja sequência de nucleotídeos é apresentada em SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67 ou 149. Anticorpos derivados e marcados

[0229] Um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção pode ser derivado ou ligado a outra molécula (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Em geral, os anticorpos ou suas porções são derivados de tal modo que a ligação a MAdCAM não seja afetada adversamente pela derivação ou marcação. Deste modo, os anticorpos e porções dos anticorpos da invenção destinam-se a incluir tanto formas intactas como modificadas dos anticorpos humanos anti-MAdCAM aqui descritos. Por exemplo, um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diabody), um agente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que possa mediar a associação do anticorpo ou porção do anticorpo com outra molécula (tal como a região do núcleo de estreptavidina ou uma etiqueta (tag) poli-histidina).

[0230] Um tipo de anticorpo derivado é produzido pela reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os reticulantes adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos, separados por um espaçador adequado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais linkers são disponibilizados pela Pierce Chemical Company, Rockford, W.

[0231] Outro tipo de anticorpo derivado é um anticorpo marcado. Os agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção pode ser derivado incluem compostos fluorescentes, entre os quais, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeritrina, fósforo-lantanídeo e outros. Um anticorpo pode também ser marcado com enzimas que são úteis para detecção, tais como peroxidase do rábano, B-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e outras. Quando um anticorpo é marcado com uma enzima detectável, ele é detectado pela adição de outros reagentes que a enzima usa para produzir um produto de reação que pode ser percebido. Por exemplo, quando o agente peroxidase do rábano está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo pode também ser marcado com biotina, e detectado através da medição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo pode ser marcado com um agente magnético, como gadolínio. Um anticorpo pode também ser marcado com um epítopo predeterminado do polipeptídeo reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, tags de epítopo). Em algumas modalidades, as marcações são anexadas por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

[0232] Um anticorpo anti-MAdCAM pode também ser marcado com um aminoácido radiomarcado. A radiomarcação pode ser utilizada para fins diagnósticos e terapêuticos. Por exemplo, a radiomarcação pode ser utilizada para detectar tecidos com expressão de MAdCAM por radiografia ou outras técnicas diagnósticas. Além disso, a radiomarcação pode ser utilizada terapeuticamente como uma toxina para tecido doente ou tumores que expressam MAdCAM. Os exemplos de marcações para polipeptídeos incluem, entre outros, os radioisótopos ou radionuclídeos seguintes: 3H, 14C, SN, *S, ºY, “Toc, In, 125, 131,

[0233] Um anticorpo anti-MAdCAM pode também ser derivado com um grupo químico como polietilenoglico! (PEG), um grupo metila ou etila ou um grupo carboidrato. Esses grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, aumentar a meia-vida sérica ou aumentar a ligação em tecidos. Essa metodologia se aplicaria também a quaisquer fragmentos de ligação ao antígeno ou versões de anticorpos anti-MAdCAM. Composições farmacêuticas e kits

[0234] Em um aspecto adicional, a invenção provê composições que compreendem um anticorpo humano anti-MAdCAM inibidor e métodos para tratar pacientes com tais composições. Em algumas modalidades, o paciente é de tratamento é humano. Em outras modalidades, o paciente é um paciente veterinário. Em algumas modalidades, o paciente veterinário é um cão ou um primata não humano.

[0235] O tratamento pode envolver a administração de um ou mais anticorpos monoclonais anti-MAdCAM inibidores da invenção, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, isoladamente ou com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os anticorpos anti-MAdCAM inibidores da invenção e composições os compreendendo podem ser administrados em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, diagnósticos ou profiláticos. Os agentes terapêuticos adicionais incluem agentes anti-inflamatórios ou imunomoduladores. Esses agentes incluem, entre outros, os corticosteroides tópicos e orais, tais como prednisolona, metilprednisolona, NCX-1015 ou budesonida; os aminossalicilatos como mesalazina, olsalazina, balsalazida ou NOX- 456; a classe de imunomoduladores tais como azatioprina, 6- mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-10 (Ilodecakin), IL-11 (Oprelevkin), I1L-12, antagonistas de MIF/CD74, antagonistas de CDA40, tais como TNX-100/5-D12, antagonistas de OX40L, GM-CSF, pimecrolimo ou rapamicina; a classe de agentes anti-TNFa como infliximabe, adalimumabe, CDP-870, onercept, etanercept; a classe de agentes anti-inflamatórios, tais como inibidores de PDE-4 (roflumilaste, etc), inibidores de TACE (DPC-333, RDP-58, etc.) e inibidores de ICE (VX-740, etc.), bem como antagonistas do receptor de IL-2, tais como daclizumabe, a classe de antagonistas seletivos de moléculas de adesão, tais como natalizumabe, MLN-O02 ou alicaforsen, classes de agentes analgésicos como, entre outros, inibidores de COX-2, tais como rofecoxibe, valdecoxibe, celecoxibe, moduladores de sensores do canal de voltagem tipo P/Q (a2B), como gabapentina e pregabalina, antagonistas do receptor de NK-1, moduladores do receptores canabinoide e agonistas do receptor de opioide delta, bem como agentes — antineoplásicos, — antitumorais, — antiangiogênicos — ou quimioterápicos Tais agentes adicionais podem ser incluídos na mesma composição ou administrados separadamente. Em algumas modalidades, um ou mais anticorpos anti-MAdCAM inibidores da invenção podem ser utilizados como uma vacina ou como adjuvantes a uma vacina. Em particular, como a MAdCAM é expressa em tecido linfoide, antígenos vacinais podem ser vantajosamente direcionados para o tecido linfoide pela conjugação do antígeno a um anticorpo anti- MAdCAM da invenção.

[0236] Neste relatório descritivo, "veículo farmaceuticamente aceitável" significa todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimento, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e reforçadores ou retardadores da absorção e outros que sejam fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina com tampão fosfato, tampão acetato com cloreto de sódio, dextrose, glicerol, polietilenoglicol, etanol e outros, bem como combinações destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são tensoativos, agentes umectantes ou quantidades mínimas de substâncias auxiliares como agentes umectantes e emulsificantes, conservantes ou tampões, os quais melhoram o prazo de validade ou a eficácia do anticorpo.

[0237] As composições desta invenção podem estar em uma variedade de formas, por exemplo, formas farmacêuticas líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, bolo liofiizado, pós secos, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições típicas preferidas estão na forma de solução injetáveis ou par infusão, tais como composições semelhantes àquelas usadas para imunização passiva de seres humanos. O modo de administração preferido é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular, intradérmica ou subcutânea.

[0238] As composições terapêuticas tipicamente precisam ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, bolo liofilizado,

pó seco, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura organizada adequada para concentração alta de fármaco. As soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas incorporando o anticorpo anti- MAdCAM na quantidade requerida, em um solvente adequado, com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente estéril deste. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio básico de dispersão e os outros ingredientes requeridos dentre aqueles enumerados acima. As características desejadas de uma solução podem ser mantidas, por exemplo, pelo uso de tensoativos e o tamanho de partícula requerido, no caso de dispersão, pelo uso de tensoativos, fosfolipídios e polímeros. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser ocasionada incluindo-se na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato, materiais poliméricos, óleos e gelatina.

[0239] Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo de administração "preferido é infusão subcutânea, intramuscular, intradérmica ou intravenosa. Tal qual será apreciado pelo técnico no assunto, a via e/ou o modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados.

[0240] Em certas modalidades, as composições do anticorpo podem ser preparadas com um veículo que o protegerá contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada,

incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulada. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para preparar tais formulações são patenteados ou em geral conhecidos pelos técnicos no assunto. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978)).

[0241] Em certas modalidades, um anticorpo anti-MAdCAM da invenção pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser encerrado em uma cápsula gelatinosa de casca dura ou mole, prensado em comprimidos ou incorporado diretamente na dieta do paciente. Para administração terapêutica oral, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers e outros. Para administrar um composto da invenção por outra administração além da parenteral, pode ser necessário revestir o composto ou coadministrar o composto com um material para impedir a sua inativação.

[0242] As composições da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção do anticorpo pode variar de acordo com fatores, tais como o estado de doença, a idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou porção do anticorpo para suscitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção do anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, visto que a dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio inicial de doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menos do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[0243] Os esquemas posológicos podem ser ajustados para proporcionar a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bólus pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumentada proporcionalmente como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dose unitária para facilidade de administração e uniformidade da dose. Forma de dose unitária, neste relatório descritivo, refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas como doses unitárias para os pacientes mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas de dose unitária da invenção são ditadas e diretamente dependentes de (a) as características únicas do anticorpo anti-MAdCAM ou sua porção e o efeito terapêutico ou profilático em particular a ser alcançado e (b) as limitações inerentes na técnica de composição, tais como um anticorpo, para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[0244] Uma faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção é 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1-25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Em algumas modalidades, uma formulação contém 5 mg/mL de anticorpo em um tampão de acetato de sódio 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM e polissorbato 80 0,2 mg/mL. Cabe ressaltar que os valores das doses podem variar com o tipo e a gravidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda entendido que, para qualquer indivíduo em particular, esquemas posológicos específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o juízo profissional da pessoa que administrta ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dose aqui apresentadas são exemplares somente e não se destinam a restringir o âmbito ou a prática da composição reivindicada.

[0245] Outro aspecto da presente invenção provê kits que compreendem um anticorpo anti-MAdCAM ou porção do anticorpo da invenção ou uma composição compreendendo tal anticorpo. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição, agentes diagnósticos ou terapêuticos. Um kit pode igualmente incluir instruções para uso em um método diagnóstico ou terapêutico. Em uma modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição o compreendendo e um agente diagnóstico que pode ser utilizado em um método descrito abaixo. Em outra modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição o compreendendo e um ou mais agentes terapêuticos que podem ser utilizados em um método descrito abaixo. Terapia gênica

[0246] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem ser administradas a um paciente que o necessita por intermédio de terapia gênica. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade preferida, as moléculas de ácido nucleico que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve são administradas a um paciente. Em uma modalidade mais preferida, as moléculas de ácido nucleico são administradas de tal modo que sejam integradas estavelmente nos cromossomos de células B, pois essas células são especializadas em produzir anticorpos. Em uma modalidade preferida, células B precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e retransplantadas em um paciente que o necessita. Em outra modalidade, células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo usando um vírus recombinante conhecido por infectar o tipo celular de interesse. Os vetores típicos utilizados para terapia gênica incluem lipossomas, plasmídeos e vetores virais. Os vetores virais exemplares são retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados. Depois da infecção in vivo ou ex vivo, os níveis de expressão do anticorpo podem ser monitorados por uma amostra retirada do paciente tratado e utilizando qualquer imunoensaio conhecido na técnica ou discutido no presente.

[0247] Em uma modalidade preferida, o método de terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada, ou uma porção de ligação ao antígeno desta, de um anticorpo anti-MAdCAM e expressar a molécula de ácido nucleico. Em outra modalidade, o método de terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia leve, ou uma porção de ligação ao antígeno desta, de um anticorpo anti-MAdCAM e expressar a molécula de ácido nucleico. Em um método mais preferido, o método de terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada, ou uma porção de ligação ao antígeno desta, e uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia leve, ou a porção de ligação ao antígeno desta, de um anticorpo anti-MAdCAM da invenção e expressar as moléculas de ácido nucleico. O método de terapia gênica pode também compreender a etapa de administrar outro agente anti-inflamatório ou imunomodulador.

Uso de métodos diagnósticos

[0248] Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser utilizados para detectar MAdCAM em uma amostra biológica in vitro ou in vivo. Os anticorpos anti-MAdCAM podem ser utilizados em um imunoensaio convencional, incluindo, entre outros, ELISA, RIA, FACS, imuno- histoquímica de tecido, Western blot ou imunoprecipitação. Os anticorpos anti-MAdCAM da invenção podem ser utilizados para MAdCAM de seres humanos. Em outra modalidade, os anticorpos anti- MAdCAM podem ser utilizados para detectar MAJdCAM de primatas do Velho Mundo como macacos cynomolgus e rhesus, chimpanzés e gorilas. A invenção provê um método para detectar MAdCAM em uma amostra biológica, o qual compreende colocar uma amostra biológica em contato com um anticorpo anti-MAdCAM da invenção e detectar o anticorpo ligado à MAdCAM. Em uma modalidade, o anticorpo anti- MAdCAM é diretamente derivado com uma marcação detectável. Em outra modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM (o primeiro anticorpo) não é marcado e um segundo anticorpo ou outra molécula que possa se ligar ao anticorpo anti-MAdCAM é marcado. Como é bem conhecido pelo técnico no assunto, escolhe-se um segundo anticorpo que seja capaz de se ligar especificamente à espécie e classe específicas do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-MAdCAM for uma IgG humana, então o anticorpo secundário pode ser anti-lgG humana. Outras moléculas que podem ser ligar aos anticorpos incluem, sem limitação, a Proteína A e a Proteína G, ambas disponibilizadas, por exemplo, pela Pierce Chemical Co.

[0249] As marcações adequadas para o anticorpo ou o secundário foram descritas supra, e incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais, luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase do rábano, fosfatase alcalinay B-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de material luminescente inclui lumino|; um exemplo de agente magnético inclui gadolínio; e exemplos de material radioativo adequado incluem 12861, 1311, 3858 ou 3H.

[0250] Em uma modalidade alternativa, MAdCAM pode ser analisada em uma amostra biológica por um imunoensaio de competição, utilizando padrões de MAdCAM marcados com uma substância detectável e um anticorpo antic-MAdCAM não marcado. Nesse ensaio, a amostra biológica, os padrões de MAMCAM marcados e o anticorpo anti-MAdCAM são combinados e a quantidade de padrão de MAdCAM marcado ligado ao anticorpo não marcado é determinada. A quantidade de MAdCAM na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão de MAGCAM marcado ligado ao anticorpo anti-MAdCAM.

[0251] É possível usar os imunoensaios descritos acima para várias finalidades. Em uma modalidade, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser utilizados para detectar MAdCAM em células em cultura celular. Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser utilizados para determinar o nível de expressão de MAdCAM na superfície celular depois do tratamento das células com vários compostos. Esse método pode ser usado para testar compostos que podem ser utilizados para ativar ou inibir MAdCAM. Nesse método, uma amostra de células é tratada com um composto em teste por um período de tempo enquanto outra amostra é deixada sem tratamento, e a expressão na superfície celular pode então ser determinada por citometria de fluxo, imuno-histoquímica, Western blot, ELISA ou RIA.

Além disso, os imunoensaios podem ser dimensionados para rastreamento de alto rendimento a fim de testar um grande número de compostos quanto à ativação ou inibição de MAdCAM.

[0252] Os anticorpos anti-MAdCAM da invenção podem também ser usados para determinar os níveis de MAGdCAM em um tecido ou em células derivadas do tecido. Em uma modalidade preferida, o tecido é um tecido doente. Em uma modalidade mais preferida, o tecido é trato gastrointestinal inflamado ou uma biópsia deste. Em uma modalidade preferida do método, um tecido ou uma biópsia deste é obtido de um paciente por excisão. O tecido ou a biópsia é então utilizada em um imunoensaio para determinar, por exemplo, níveis de MAdCAM, níveis de MAdCAM na superfície celular ou a localização de MAdCAM pelos métodos discutidos acima. O método pode ser empregado para determinar se um tecido inflamado expressa MAdCAM em nível elevado.

[0253] O método diagnóstico descrito acima pode ser utilizado para determinar se um tecido expressa níveis elevados de MAdCAM, o que pode ser indicativo de que o tecido responderá bem ao tratamento com o anticorpo anti-MAdCAM. Além disso, o método diagnóstico pode também ser usado para determinar se o tratamento com o anticorpo anti-MAdCAM (ver abaixo) está fazendo com que um tecido expresse níveis menores de MAdCAM e pode, assim, ser usado para determinar se o tratamento é bem-sucedido.

[0254] Os anticorpos da presente invenção podem também ser usados in vivo para localizar tecidos e órgãos que expressam MAdCAM. Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser utilizados para localizar tecido inflamado. A vantagem dos anticorpos anti-MAdCAM da presente invenção é que eles não irão gerar uma resposta imune quando da administração. O método compreende as etapas de administrar um anticorpo anti-MAdCAM ou uma composição farmacêutica deste a um paciente que necessita tal teste diagnóstico e submeter o paciente à análise de imagens para determinar a localização dos tecidos com expressão de MAdCAM. A análise de imagens é bem conhecida na técnica médica e inclui, entre outras, radiografia, cintilografia por raios gama, imagem por ressonância magnética (IRM), tomografia por emissão de pósitrons ou tomografia computadorizada (TC). Em outra modalidade do método, é obtida uma biópsia do paciente para determinar se o tecido de interesse expressa MAJCAM em vez de submeter o paciente à análise de imagem. Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-MAdCAM podem ser marcados com um agente detectável que possa ser visualizado em um paciente. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um agente de contraste, como bário, que pode ser utilizado para análise de raios-X, ou um agente de contraste magnético, como quelato de gadolínio, que pode ser usado para IRM ou TC. Outros agentes de marcação incluem, sem limitação, radioisótopos, tais como **Tc. Em outra modalidade, o anticorpo anti-MAdCAM não será marcado e será visualizado pela administração de um segundo anticorpo ou outra molécula que seja detectável e possa ligar-se ao anticorpo anti-MAdCAM.

[0255] Os anticorpos anti-MAdCAM da invenção podem também ser usados para determinar os níveis de MAdCAM solúvel presente no sangue, soro, plasma ou líquido biológico de doadores, incluindo, entre outros, amostra de fezes, urina, escarro ou de biópsia. Em uma modalidade preferida, o líquido biológico é plasma. O líquido biológico é então usado em um imunoensaio para determinar os níveis de MAdCAM solúvel. MAdCAM solúvel poderia ser um marcador substituto de inflamação gastrointestinal em andamento, e o método de detecção poderia ser utilizado como um marcador diagnóstico para medir a gravidade da doença.

[0256] O método diagnóstico descrito acima pode ser utilizado para determinar se um indivíduo expressa níveis elevados de MAdCAM solúvel, o que pode ser indicativo de que o indivíduo responderá ao tratamento com um anticorpo anti-MAdCAM. Além disso, o método diagnóstico pode também ser usado para determinar se o tratamento da doença com o anticorpo anti-MAdCAM (ver abaixo) ou outro agente farmacêutico está fazendo com que um indivíduo expresse níveis menores de MAdCAM e pode, assim, ser usado para determinar se o tratamento é bem-sucedido. Inibição da adesão dependente de ca4B7/MAdCAM por anticorpo anti- MAdAdCAM

[0257] Em outra modalidade, a invenção provê um anticorpo anti- MAdCAM que se liga à MAdCAM e inibe a ligação e adesão de células que carregam au; integrina a MAdCAM ou outros ligantes cognatos, tais como L-selectina, a MAdCAM. Em uma modalidade preferida, a MAdJdCAM é humana e está em forma solúvel ou expressa na superfície de uma célula. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti- MAdCAM é um anticorpo humano. Em outra modalidade, o anticorpo ou sua porção inibe a ligação entre axB; e MAGCAM com valor de IC5o não superior a 50 nM. Em uma modalidade preferida, o valor de ICs5o não é superior a 5 nM. Em uma modalidade mais preferida, o valor de ICs5o é inferior a 5 nM. Em uma modalidade mais preferida, o valor de ICs5o é inferior a 0,05 ug/mL, 0,04 pg/mL ou 0,03 ug/mL. Em outra modalidade preferida, o valor de ICso é inferior a 0,5 ug/mL, 0,4 ug/mL ou 0,3 pug/mL. O valor de ICso pode ser medido por qualquer método conhecido na técnica. Tipicamente, um valor de ICso pode ser medido por ELISA ou ensaio de adesão. Em uma modalidade preferida, o valor de IC5o é medido por ensaio de adesão utilizando células ou tecido que expressam nativamente MAdCAM ou células ou tecido que foram modificadas para expressar MACCAM. Inibição do recrutamento de linfócitos para tecido linfoide associado ao intestino por anticorpos anti-MAdCAM

[0258] Em outra modalidade, a invenção provê um anticorpo anti- MAdCAM que se liga nativamente à MAdCAM expressa e inibe a ligação de linfócitos ao tecido linfoide gastrointestinal especializado. Em uma modalidade preferida, a MAdCAM expressa nativamente é humana ou MAdCAM de primata e está em forma solúvel ou expressa na superfície de uma célula. Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti- MAdCAM é um anticorpo humano. Em outra modalidade, o anticorpo ou sua porção inibe o recrutamento de linfócitos a4B;* com trofismo intestinal para tecidos que expressam MAdCAM com um valor de ICs5so não superior a 5 mg/kg. Em uma modalidade preferida, o valor de ICso não é superior a 1 mg/kg. Em uma modalidade mais preferida, o valor de IC5o é inferior a 0,1 mg/kg. Em uma modalidade, o valor de ICso pode ser determinado medindo-se a relação dose-efeito do recrutamento de linfócitos do sangue periférico, marcados com tecnécio, para o trato gastrointestinal — utilizando —cintilografia gama ou tomografia computadorizada com emissão de fóton único. Em outra modalidade, o valor de ICso pode ser determinado medindo-se o aumento em linfócitos a4B7* com trofismo intestinal, tais como, entre outros, células T CD4* aB7* de memória, na circulação periférica, utilizando citometria de fluxo em função da dose do anticorpo anti-MAdCAM.

[0259] Para que esta invenção possa ser entendida melhor, são apresentados os exemplos a seguir. Esses exemplos são para fins de ilustração somente e não deverão ser interpretados como uma limitação ao âmbito da invenção de maneira alguma. Exemplo 1 Geração de hibridomas produtores de anti-MAdCAM

[0260] Anticorpos da invenção foram preparados, analisados e selecionados de acordo com o presente Exemplo. Preparação de imunógenos primários

[0261] Foram preparados dois imunógenos para imunização dos camundongos XenoMouseY: (i) uma proteína de fusão MACCAM-IgG1 Fc e (ii) membranas celulares preparadas a partir de células estavelmente transfectadas com MAdCAM. (1) Proteína de fusão MAGCAM-IgG Fc Construção do vetor de expressão

[0262] Um fragmento de cDNA EcoRiI/Bglll que codifica o domínio maduro extracelular, equivalente à imunoglobulina de MAdCAM foi retirado por excisão de um clone p!INCY Incyte (3279276) e clonado nos sítios EcoRI/BamHI do vetor plG1 (Simmons, D. L. (1993) em Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127.)) para gerar uma fusão de Fc IgG: in frame. O inserto resultante foi retirado por excisão com EcoRlI/Not! e clonado em pCDNA3.1+ (Invitrogen). O MAGdCAM-IgG, Fc no vetor teve a sequência confirmada. A sequência de aminoácidos da proteína de fusão MADdCAM-IgG: Fc é mostrada abaixo: Proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc:

MDEGLALLLAGLLGLL LGQOSLQOVKPLQOVEPPE PVVAVALGASROLTCRLACADRGASVQOWRG LDTSLGAVQOSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGGRTFQHTVOLLVYAFPDQLTVSPAA LVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLVGGQE LEGAQALGPEVQEEEEE POGDEDVLFRVT ERWRLPPLGTPVPPALYCQOATMRLPGLELSHROAI PVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPES PDTTSQE PPDTTSQE PPDTTSQE PPDTTSPE PPDKTSPE PAPOQGS THTPRSPGSTRTRRPE IQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVWVDVSHEDPEVKEN WYVDGVEVHNAKTKPREEQOYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK (SEQ ID NO: Sublinhado: peptídeo sinal Negrito: domínio extracelular de MAdCAM Expressão/purificação da proteína recombinante

[0263] Células CHO-DHFR foram transfectadas com o vetor pCDNAS3.1+, contendo o cDNA da proteína de fusão MADdCAM-IgG: Fc, e clones estáveis expressando a proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc selecionada em meio de Iscove contendo G418 600 pg/ml e metotrexato 100 ng/mL. Para expressão da proteína, um biorreator de fibra oca foi semeado com células CHO expressando estavelmente MAdJdCAM-IgG, Fc em meio de Iscove, contendo soro fetal bovino com baixo teor de IgG 10% (Gibco), aminoácidos não essenciais (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piruvato de sódio (Gibco), G418 600 pug/mL e metotrexato 100 ng/mL, este foi usado para gerar sobrenadante concentrado do meio. A proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc foi purificada do sobrenadante colhido por cromatografia de afinidade. Resumidamente, o sobrenadante foi aplicado a uma coluna HiTrap Protein G Sepharose (5 mL, Pharmacia) (2 mL/min.), lavado com Tris mM, pH 8, NaCl 150 mM (5 volumes da coluna) e eluído com glicina 100 mM, pH 2,5 (1 mL/min.), neutralizando imediatamente as frações para pH 7,5 com Tris 1M, pH 8. As frações contendo a proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc foram identificadas por SDS-PAGE, agrupadas e aplicadas a uma coluna Sephacryl S100 (Pharmacia), previamente equilibrada com BisTris 35 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM. A filtração em gel foi realizada a 0,35 mL/min, coletando um pico da proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc em aproximadamente 3 x frações de 5 mL. Essas amostras foram agrupadas e aplicadas a uma coluna Resource Q (6 mL, Pharmacia), previamente equilibrada com BisTris 35 mM, pH 6,5. À coluna foi lavada com 5 volumes da coluna de BisTris 35 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM (6 mL/min.) e a proteína de fusão MADdCAM-IgG1 Fc eluiu em uma fração de 4-6 mL com Bis Tris 35 mM, pH 6,5, NaCl 400 mM. Nesse estágio, a proteína era 90% pura e migrando como uma faixa única em aproximadamente 68 kD por SDS-PAGE. Para uso como imunógeno e em todos os ensaios subsequentes, o material teve o tampão trocado para HEPES 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 MM, DTT 1 mM, NaCl 100 mM, glicerol 50% e armazenado em alíquotas a -80ºC.

(ii) Membranas celulares expressando estavelmente MAGCAM

[0264] Um fragmento Sacil/Notl, compreendendo os nucleotídeos 645-1222 da sequência publicada de MAdCAM (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)), foi amplificado por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA de cólon e clonado nos sítios Sacl/Notl sites do vetor PpIND-Hygro (Invitrogen). Um fragmento Sacl, compreendendo a sequência codificadora 5' adicional, foi subclonado nessa construção de pCDNA3.1 MAdCAM-IgGG, Fc, para gerar o cDNA completo de MAdCAM. Um fragmento Kpnl/Notl, contendo o cDNA de MAdCAM, foi então clonado nos sítios correspondentes em um vetor pEFSFRTVSGWCAT (Invitrogen) e substituindo a sequência CAT codificadora. O inserto de cDNA teve a sequência verificada e foi usado em transfecções para gerar clones únicos expressando estavelmente em células Fliblin NIH 373 (Invitrogen) pela tecnologia da Flp recombinase, de acordo com as instruções do fabricante. Clones com expressão estável foram selecionados por sua capacidade para suportar a ligação de uma linhagem celular de linfoblastoide B axB7r* JY (Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267:8366-70 (1992)), resumido abaixo. Clones estáveis de células CHO expressando MAdCAM foram preparados da mesma maneira, usando células FIpln CHO (Invitrogen).

[0265] Células Flblh NIH-3T3 expressando MAdCAM foram cultivadas em meio de Eagles modificado por Dulbecco (Gibco), contendo L-glutamina 2 mM, soro fetal bovino Doador 10% (Gibco) e higromicina B 200 ug/mL (Invitrogen), e expandidas em frascos rolantes. Células Flpbln CHO expressando MAdCAM foram cultivadas em meio de Ham F12/Eagles modificado por Dulbecco (Gibco), contendo L- glutamina 2 mM, soro fetal bovino Doador 10% (Gibco) e higromicina B 350 ug/mL (Invitrogen), e expandidas em frascos rolantes. As células foram colhidas usando uma solução de dissociação celular não enzimática (Sigma), raspando e lavando em solução salina com tampão fosfato por centrifugação. As membranas celulares foram preparadas a partir do pellet celular por dois ciclos de homogeneização utilizando um Polytron em Bis Tris 25 mM, Tris pH 8, MgCl2 10 mM, aprotinina 0,015% (m/v), bacitracina 100 U/mL e centrifugação. O pellet final foi ressuspenso no mesmo tampão, e alíquotas de 50x10º equivalentes celulares foram introduzidas em tubos Eppendorf de parede espessa e girados a >100.000 g para gerar pellets de membranas celulares para imunizações de camundongos XenoMouse. O sobrenadante foi decantado e as membranas foram armazenadas em tubos Eppendorf a -80ºC até que necessário. A confirmação da expressão da proteína nas membranas celulares foi determinada por SDS-PAGE e Western blotting com um anticorpo de coelho anti-peptídeo desenvolvido contra os resíduos N-terminais de MADdCAM ([C]-K<PLQVEPPEP).

Imunização e geração de hibridoma

[0266] Camundongos XENOMOUSEY de oito a dez semanas de idade foram imunizados por via intraperitoneal ou nas almofadas de suas patas traseiras com a proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc recombinante purificada (10 pug/dose/camundongo) ou as membranas celulares preparadas a partir de células CHO-MAdCAM ou NIH 3T3 expressando estavelmente (10x10º células/dose/camundongo). Essa dose foi repetida cinco a sete vezes ao longo de um período de três a oito semanas. Quatro antes da fusão, os camundongos receberam uma injeção final do domínio extracelular de MAGdCAM humana em PBS. Linfócitos do baço e linfonodos dos camundongos imunizados foram fundidos com a linhagem celular P3-X63-Ag8.653 de mieloma não secreta e foram submetidos à seleção com HAT com descrito anteriormente (Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). Um painel de hibridomas, todos secretando anticorpos I9G2K e IgGak humana específicos contra MAdCAM, foi recuperado e subclonado. Doze subclones dos hibridomas, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264 e 9.8.2, produzindo anticorpos — monoclonais — específicos — contrca MAdAdCAM, foram recuperados e detectados com os ensaios descritos abaixo. As linhagens precursoras 1.7, 1.8, 6.14, 6.22, 6.34, 6.67, 6.73, 6.77, 7.16,

7.20, 7.26 e 9.8, a partir das quais as linhagens subclones de hibridomas, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2, foram derivadas tinham todas atividade anti-MAdCAM. X481.2

[0267] Um clone selecionado foi modificado mais para remover um evento inadvertido de splicing na proteína final. O evento inadvertido de splicing resultou na produção de uma proteína prolongada. Foi descoberto que a extensão era resultante de uma transleitura (read through) que levou ao evento inadvertido de splicing. Sem a intenção de estar vinculado à teoria, acredita-se que o evento inadvertido de splicing reuniu a extremidade da cadeia pesada com uma 4244bp a jusante (na Região da Sequência Derivada de SV40). Um novo vetor foi delineado para eliminar essa extensão observada. A região da cadeia pesada foi modificada para substituir um nucleotídeo na extremidade 3' da cadeia pesada (uma mudança de T para A) resultando na remoção do sítio de splice doador. O anticorpo contra MAdCAM, resultante do clone novamente modicado, é X481.2. Ensaios ELISA

[0268] A detecção de anticorpos antígeno-específicos no soro de camundongos e no sobrenadante do hibridoma foi determinada por ELISA como descrito (Coligan et al. Unit 21 "Enzyme-linked immunosorbent assays", em Current Protocols in Immunology (1994)), usando a proteína de fusão MAdCAM-IGG: Fc para capturar os anticorpos. Para animais que foram imunizados com a proteína de fusão MAdJdCAM-IgG: Fc, os anticorpos foram rastreados quanto à reatividade não específica contra IgG; humana e quanto à capacidade para se ligar a células Flblhn CHO MAdCAM por citometria de fluxo.

[0269] Em um ensaio ELISA preferido, foram utilizadas as técnicas a seguir:

[0270] Placas ELISA foram revestidas durante a noite a 4 ºC com a fusão MAdCAM-IGG, Fc, 100 uLl/cavidade (4,5 ug/ml) em placa contendo tampão (tampão carbonato/bicarbonato de sódio 100 mM, pH 9,6). Depois da incubação, o tampão de revestimento foi removido e a placa bloqueada com tampão de bloqueio 200 ul/cavidade (BSA 5%, Tween 20 0,1% em solução salina com tampão fosfato) e incubada à temperatura ambiente por 1 hora. O tampão de bloqueio foi removido e o sobrenadante do hibridoma ou outro soro ou sobrenadante (por exemplo, controle positivo), 50 ul/cavidade, adicionado por 2 horas à temperatura ambiente. Depois da incubação, a placa foi lavada com PBS (3 x 100 uL/cavidade) e a ligação do mAb do hibridoma detectada com anticorpos secundários conjugados com HRP (isto é, anti-lgG2 humana-HRP de camundongo, 1:1000 (SB, Nº de cat. 9060-05), para anticorpos I9G2, ou anti-lgGa humana-HRP de camundongo, 1:1000 (Zymed, Nº de cat. 3840) para anticorpos IgG) diluídos em PBS. As placas foram incubadas à temperatura ambiente for 1 hora, lavadas em PBS (3 x 100 ul/cavidade) e finalmente desenvolvidas com 100 uL de OPD (o-fenilenodiamina (DAKO S2405) + 5 ul de H202 30%/12 mL). As placas foram deixadas desenvolver por 10-20 minutos, interrompendo a reação com 100 ul de H2SO.. As placas foram lidas a 490 nm. Ensaios de adesão

[0271] Os anticorpos que demonstraram se ligarem à proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc por ELISA foram avaliados quanto à atividade antagonista em ensaios de adesão com células o4B7* JY e (i) Proteína de fusão MAGCAM-IgG'* Fc ou (ii) células MAdCAM-CHO. () Ensaio com a fusão MAGCAM-IgG, Fc

[0272] 100 ul de uma solução 4,5 ug/mL de proteína de fusão

MAdCAM-IgG: Fc purifica em PBS com Dulbecco foram adsorvidos em placas Black Microfluor "B" com fundo em u de 96 cavidades (Dynex nº 7805) placas durante a noite a 4ºC. As placas revestidas com MAdCAM foram então invertidas, e o excesso de líquido foi absorvido em mata- borrão, antes do bloqueio a 37ºC por pelo menos 1 hora em BSA 10%/PBS. Durante esse tempo, as células JY cultivadas foram contadas usando exclusão em azul de triptano (devem ser aproximadamente 8x105º células/mL) e 20x10º células/placa de ensaio adicionadas com pipeta em um tubo de centrífuga de 50 mL. As células JY foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco), contendo L-glutamina 2 MM e soro fetal bovino inativado pelo calor 10% (Life Technologies nº 10108- 165) e semeadas a 1-2x10º/mL a cada 2-3 dias para impedir a cultura de se diferenciar. As células foram lavadas duas vezes com meio RPMI 1640 (Gibco) contendo L-glutamina 2 mM (Gibco) por centrifugação (240 g), ressuspendendo o pellet celular final a 2x106 células/ml. em RPMI 1640 para a carga de calceína AM. Calceína AM (Molecular Probes nº C-3099) foi adicionada às células com diluição 1:200 em DMSO (concentração final: aproximadamente 5 UM) e as células protegidas da luz no decorrer da incubação (37 ºC por 30 minutos). Durante essa etapa de incubação das células, os anticorpos a serem testados foram diluídos como segue: para testes de dose única, os anticorpos foram completados até 3 ug/mL (1 ug/mL final) com BSA 0,1 mg/mL (Sigma nº AS0O59) em PBS; para completas de ICso, os anticorpos foram diluídos em BSA 0,1 mg/ml/ PBS, com 3 pg/mL (1 upg/mL final) sendo a concentração máxima, depois dobrando as diluições (razão 1:2) na placa. A cavidade final da fileira foi usada para determinar a ligação total, assim usou-se BSA 0,1 mg/mL em PBS.

[0273] Depois do bloqueio, o conteúdo da placa foi sacudido, e 50 uL de anticorpos/controles foram adicionados a cada cavidade e a placa incubada a 37ºC por 20 minutos. Durante esse tempo, as células JY carregadas com calceína foram lavadas uma vez com meio RPM! 1640 contendo soro fetal bovino 10% e uma vez com BSA 1 mg/mL/PBS por centrifugação, ressuspendendo o pellet celular final até 1x10º%/mL em BSA 1 mg/ml/PBS. 100 ul de células foram adicionados a cada cavidade da placa de fundo em U, a placa foi fechada, centrifugada brevemente (1000 rpm por 2 minutos) e, a seguir, incubada a 37 ºC por 45 minutos. No final desse prazo, as placas foram lavadas com um lavador de placa Skatron e a fluorescência medida utilizando um leitor Wallac Victor?1420 Multilabel Reader (excitação A 485 nm, emissão À 535 nm, contagem desde o topo, 8 mm desde o fundo da placa, por 0,1 segundo com abertura de emissão normal). Para cada concentração do anticorpo, a adesão percentual foi expressa em porcentagem da resposta máxima de fluorescência na ausência de qualquer anticorpo menos a fluorescência associada com ligação não específica. O valor de ICso é definido como a concentração do anticorpo anti-MAdCAM na qual a resposta de adesão é diminuída para 50% da resposta na ausência de anticorpo anti-MAdCAM. Os anticorpos capazes de inibir a ligação de células JY à fusão MADdCAM-IgG1 Fc com valor de 1Cs5o <0,1 uvg/mL foram considerados ter atividade agonista potente e foram progredidos para o ensaio de adesão MAGdCAM-CHO. Todos os doze dos Abs testados mostraram atividade agonista potente (Tabela 3). Os anticorpos monoclonais 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5 e 7.26.4 foram derivados de linhagens de IgG2K, e os anticorpos monoclonais 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1 e 9.8.2 foram derivados de linhagens de IgGak.

(ii) Ensaio de adesão celular de MAdCAM-CHO

[0274] Células JY foram cultivadas como acima. Foram geradas células CHO expressando MAdCAM com a construção de cDNA PpEFSFRT MAdJdCAM e utilizando a tecnologia da Flp recombinase (Invitrogen) como descrita acima. Clones estáveis únicos de células

CHO expressando MAdCAM foram selecionados com base na sua capacidade para suportar a adesão de células JY e a ligação, por citometria de fluxo, do anticorpo de coelho anti-peptídeo, desenvolvido contra o N-terminal de MAGdCAM como descrito acima. Células CHO expressando MAdCAM células foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Gibco nº 21331-020) contendo L-glutamina 2 mM, soro fetal bovino 10% (Gibco) e higromicina B 350 ug/mL (Invitrogen), dividindo-se 1:5 a cada 2/3 dias. Para o ensaio de adesão, as células CHO expressando MAdCAM foram semeadas a 4x10º células/cavidade em placas pretas de fundo transparente de 96 cavidades (Costar nº 3904), em 200 uL de meio de cultura, e cultivadas durante a noite a 37 ºC/CO>2 5%.

[0275] No dia seguinte, o sobrenadante do hibridoma ou do anticorpo monoclonal purificado foi diluído a partir de uma concentração inicial de 30 ug/mL (equivalente a uma concentração final de 10 ug/mL) em BSA 1 mg/mlL/PBS, como descrito acima. Para as placas com MAdCAM-CHO, o conteúdo da placa foi sacudido e 50 ul de anticorpos/controles foram adicionados a cada cavidade e a placa incubada a 37 ºC por 20 minutos. A cavidade final da fileira foi utilizada para determinar a ligação total, assim, usou-se BSA 0,1 mg/mL em PBS. Células JY carregadas com calceína AM, até uma concentração final de 1x106/mL em BSA 1 mg/mL/BSA, foram preparadas como acima, então 100 uL adicionados às placas depois do período de 20 minutos de incubação com o anticorpo. A placa foi incubada, a seguir, a 37 ºC por 45 minutos, depois lavada em lavador de placa Tecan (PW 384) e a fluorescência medida pelo leitor de placa Wallac como descrito acima. Para cada concentração do anticorpo, a adesão percentual foi expressa em porcentagem da resposta máxima de fluorescência na ausência de qualquer anticorpo menos a fluorescência associada com ligação não específica. Foi considerado que os anticorpos capazes de inibir a ligação de células JY a células MAdCAM-CHO com valor de ICso <1 vg/mL tinham atividade antagonista potente. Como antes, o valor de IC5o é definido como a concentração do anticorpo anti-MAdCAM na qual a resposta de adesão diminuiu para 50% da resposta na ausência de anticorpo anti-MAdCAM. As potências de ICso para 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264 e 9.8.2 nesse ensaio são descritas abaixo na Tabela 3. Tabela 3. Valores de IC50 de anticorpos anti-MAdCAM exemplificados [me Jeremntama Sm e Clone ICso média (pvug/mL) n ICso média (pvg/mL) n

1.7.2 0,030 + 0,011 6 0,502 + 0,280 9

1.8.2 0,027+ 0,011 4 0,424 + 0,107 8

7.16.6 0,019+ 0,009 7 0,389 + 0,093 16

7.20.5 0,025+ 0,027 7 0,387 + 0,202 9

7.26.4 0,021+ 0,040 4 0,574 + 0,099 15

6.14.2 0,011+ 0,005 4 0,291 + 0,096 6

6.22.2 0,018+ 0,011 4 0,573 + 0,168 7

6.34.2 0,013+ 0,008 4 0,285 + 0,073 7

6.67.1 0,013+ 0,070 4 0,298 + 0,115 8

6.73.2 0,020+ 0,010 4 0,369 + 0,103 8

6.771 0,022+ 0,004 4 0,520 + 0,100 4

[0276] Para medir a potência antagonista de mAbs anti-MAdCAM em ensaios com base em fluxo, sob condições de tensão de cisalhamento que são planejados para simular o ambiente microvascular nas vênulas endoteliais altas que servem o tecido linfoide associado ao intestino, células CHO expressando MAdCAM foram colocadas em microlâminas de vidro (50 x 4 mm) e deixadas aderir para formar uma monocamada confluente (aproximadamente 2,5 x 10º células). As células foram então incubadas com mAb purificado por afinidade ao longo de uma faixa de concentrações (0,1-10 ug/mL) por minutos a 37 ºC, antes de serem conectadas ao sistema de ensaio de fluxo. Um mAb de isotipo equiparável IgG2 ou IgGa4 (10 pg/mL) foi usado como controle negativo. Linfócitos do sangue periférico (PBLs) de doador normal foram perfundidos na monocamada celular com uma tensão de cisalhamento constante de 0,05 Pa. Os experimentos foram gravados em vídeo e a adesão total dos linfócitos (adesão rolante + firme) foi calculada. Todos os anticorpos monocionais testados demonstraram ser antagonistas potentes sob as condições descritas. (iii) Ensaios de Stamper-Woodruff

[0277] Para visualizar vasos MAdCAM*, foi gerado um mAb anti- MAdCAM biotinilado em 1-2 mg de proteína purificada por afinidade, com excesso de 20 molares de biotina-NHS (Pierce) em solução salina com tampão fosfato, de acordo com as instruções do fabricante. À reação foi deixada depositar à temperatura ambiente (30 minutos) e dessalinizada com uma coluna PD-10 (Pharmacia), e a concentração de proteína foi determinada.

[0278] Um linfonodo hepático normal foi removido de um órgão doador, instantaneamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -70 ºC até o uso. Cortes cryostat de 10 um foram obtidos, secos ao dar em lâminas revestidas com poli-L-lisina e fixados em acetona antes do ensaio. Os cortes foram bloqueados com um sistema de bloqueio avidina-biotina (DAKO) e, a seguir, incubados com mAb anti-MAdCAM biotinilado em uma faixa de concentrações (1-50 ug/mL) à temperatura ambiente (2 horas). Um mAb de isotipo equiparável IgG, ou IgGa (50 pg/mL) foi usado como controle negativo e um anticorpo anti-B; bloqueador (50 ug/mL) como controle positivo.

[0279] Linfócitos do sangue periférico, retirados de doadores normais, foram marcados com um mMAb de camundongo anti-CD2 humano (DAKO) para permitir a visualização subsequente de células aderentes. 5x10º PBLs foram adicionados a cada corte do linfonodo e incubados por 30 minutos antes de serem gentilmente enxaguados para evitar o descolamento das células aderentes. Os cortes foram então novamente fixados em acetona e voltaram a ser incubados com mAb anti-MAdCAM biotinilado (10 ug/mL), seguido por anti-mAb de cabra anti-camundongo biotinilado (para reconhecer PBLs marcados com CD?2 e vasos MAdCAM* não corados) e, a seguir, streptABcomplex/HRP (DAKO). Finalmente, os vasos MAdCAM* e os PBLs marcados com CD?2 foram visualizados pela adição do substrato DAB (DAKO) aos cortes, com um produto de reação marrom mostrando áreas de coloração positiva. A adesão de linfócitos foi quantificada pela contagem do número de linfócitos aderindo a 50 vasos MAdCAM-1* do sistema porta, veias ou sinusoides. Os dados, expressos em valores médios, foram então normalizados para adesão percentual, utilizando a adesão de PBLs na ausência de qualquer anticorpo como 100%. Os dados foram compilados com base de n=3 diferentes doadores de PBL e para diferentes doadores de linfonodos hepáticos. Dados representativos para os anticorpos monoclonais 1.7.2 e 7.16.6 biotinilados purificados são representados na Figura 4 em comparação com um controle pelo anticorpo anti-B; bloqueador.

Ensaios de seletividade

[0280] VCAM e fibronectina são homólogos estruturais e de sequências próximos a MADdCAM. mAbs anti-MAdCAM purificados por afinidade foram avaliados quanto à especificidade por MAdCAM determinando-se a sua capacidade para bloquear a ligação de células T Jurkat a4B1*/asB1+ (ATCC) à sua molécula de adesão celular cognata. 100 uL de uma solução 4,5 ug/mL de fragmento de ligação celular a Fibronectina (110 Kd, Europa Bioproducts Ltd, Nº de cat. UBF4215-18) ou VCAM (Panvera) em PBS com Dulbecco foram adsorvidos em placas

Black Microfluor "B" com fundo em u de 96 cavidades (Dynex nº 7805) durante a noite a 4ºC. As placas revestidas foram então invertidas, e o excesso de líquido foi absorvido com mata-borrão, antes do bloqueio a 37 ºC por pelo menos 1 hora em BSA 10%/ PBS. Durante esse tempo, as células T Jurkat cultivadas foram contadas utilizando exclusão em azul de triptano e carregadas com o corante calceíina AM como anteriormente descrito para células JY acima. Os anticorpos a serem testados foram diluídos desde uma concentração máxima de 10 ug/mL em BSA 0,1 mg/mL em PBS. A cavidade final da fileira foi usada para determinar a ligação total, assim, usou-se BSA 0,1 mg/ml em PBS. Equistatina (Bachem, Nº de cat. H-9010) preparada em PBS foi usada em uma concentração máxima de 100 nM para bloquear a interação asBiFibronectina. Um mAb anti-CD106 (Clone 51-10C9, BD Pharmingen Nº de cat. 555645) em uma concentração máxima de 1 vpg/mL foi usado para bloquear a interação aBv/VCAM.

[0281] Depois do bloqueio, o conteúdo da placa foi sacudido e 50 uL de anticorpos/controles foram adicionados a cada cavidade e a placa incubada a 37ºC por 20 minutos. As células T Jurkat carregadas com calceína foram lavadas uma vez como antes, ressuspendendo o pellet celular final para 1x10º/mL em BSA 1 mg/mL/PBS. 100 uL de células foram adicionados a cada cavidade da placa de fundo em U, a placa foi fechada, brevemente centrifugada (1000 rpm por 2 minutos) e, a seguir, incubada a 37 ºC por 45 minutos. No final desse prazo, as placas foram lavadas com um lavador de placas Skatron e a fluorescência medida utilizando um leitor Wallac Victor? 1420 Multilabel Reader (excitação À 485nm, emissão À 535nm, contagem desde o topo, 8 mm desde o fundo da placa, para 0,1 segundo com abertura de emissão normal). Para cada anticorpo, o grau de inibição é expresso abaixo ilustrativamente, na Tabela 4 (“inibição mínima da adesão, *** inibição completa da adesão). Todos os mAbs exemplificados são antagonistas anti-

MAdCAM seletivros e potentes, demonstrando seletividade substancialmente mais que 100 vezes por MAdCAM do que por VCAM e fibronectina. Tabela 4. Seletividade comparativa de anticorpo anti-MAdCAM por MAJdCAM em relação a outras moléculas de adesão celular, Fibronectina e VCAM com asBi/fibronectina | com axB/VCAM | com axB”//MAdCAM (10 ug/mL) (10 puo/mL) (0,1 ug/mL) [ara ds e = || [aB2 | e = | ms e [7208 |. p= | = || [7 DO E BAR a 5222] EC E Lessa | Às = | Bm E Lema | e = | Lema e = |

LB DOC E

[0282] Os hibridomas foram depositados na Coleção Europeia de Culturas de Células (European Collection of Cell Cultures, ECACC), H.P.A em CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG no dia 09 de setembro de 2003 com os seguintes números de depósito: Hibridoma Nº do depósito

1.7.2 03090901

1.8.2 03090902

6.14.2 03090903

6.22.2 03090904

6.34.2 03090905

6.67.1 03090906

6.73.2 03090907

6.77.1 03090908

7.16.6 03090909

7.20.5 03090910

7.26.4 03090911

9.8.2 03090912 Exemplo || Determinação de constantes de afinidade (Ka) de anticorpos monoclonais anti-MAdCAM inteiramente humanos por BlAcore

[0283] Foram realizadas medidas de afinidade de anticorpos purificados por ressonância plasmônica de superfície, utilizando o instrumento BlAcore 3000, seguindo os protocolos do fabricante. Protocolo 1

[0284] Para realizar análises cinéticas, uma superfície de anticorpo anti-humano de camundongo de alta densidade (I9G2 e I9G4) em um chip sensor CM5 BlAcore foi preparada usando o acoplamento com amina de rotina. Sobrenadantes de hibridomas foram diluídos 10, 5, 2 vezes em tampão de corrida HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tensoativo P20 0,005%) contendo BSA 100 ugmLl e carboximetildextrano 10 mg/mL ou usado puro. Cada mAb foi capturado em uma superfície separada com tempo de contato de 1 minuto e lavagem de 5 minutos para estabilização do mAb basal. A proteína de fusão MAdCAM-IgG, Fc (141 nM) foi então injetada sobre todas as superfícies por um minuto, seguido por 3 minutos de dissociação. Os dados foram normalizados para a quantidade de anticorpo capturado em cada superfície e avaliados com ajuste global Langmuir 1:1, usando modelos de desvios basais disponíveis no software BlAevaluation fornecido pela BlAcore.

Protocolo 2

[0285] mAbs purificados por afinidade foram imobilizados sobre a camada de dextrano de um chip biosensor CM5 usando acoplamento com amina. Os chips foram preparados com tampão acetato pH 4,5 como o tampão de imobilização, e densidades de proteína de 2,5-5,5 KRU foram conseguidas. Amostras da proteína de fusão MAGdCAM-IgG1 Fc em tampão de corrida foram preparadas em concentrações variando de 0,2-55 nM (uma solução O nM compreendendo apenas tampão de corrida foi incluída como referência zero) As amostras foram randomizadas e injetadas em duplicata por 3 minutos cada através de 4 células do fluxo usando HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,005%) como tampão de corrida. Usou- se uma vazão de 100 ul/minuto para minimizar as limitações de transporte em massa. A dissociação da proteína de fusão MAGCAM- IgG: Fc foi monitorada por 180 minutos, a superfície regenerada por uma injeção de 6 segundos de H3PO, 25 mM (50 uL/min), ou 10 mM (6.22.2), 20 mM (6.67.1, 6.73.2, 6.77.1) a 25 mM (6.34.2) e NaOH 45 mM (6.14.2) e os dados analisados utilizando o pacote do software BlAevaluation (v3.1).

[0286] A Tabela 5 lista as medições de afinidade para os anticorpos anti-MAdCAM representativos da presente invenção: Tabela 5. Determinação da constante de afinidade, Ka, por ressonância plasmônica de superfície (BlAcore)

1.7.2 2,4 x 10º 1x10* 42 5,5x 10º [| 1,3x107 | 23,6

1.8.2 2,9x 10º 1x10* 35 1,8 x 10º [| 2,3x105 | 128

7.16.6 1,5x 106º |2,2x108º| 1,5 | 2,9x105 | 1,4x108 | 4,8

7.20.5 4,5x 10º |1,9x10º | 42,2 | 1,6x 105 | 1,2x105| 75

7.26.4 9,6 x10º [26x10º| 271 1,5x 10º | 1,2x10º | 80

6.14.2 1,3 x 105º 1x10* 77 5x105 |<5x1086|<10

6.22.2 1,5x 106º [1,4x10º| 9,3 | 2,3x105 |8,7x107| 3,8

6.34.2 1,2x106º |1,9x10º | 15,8 | 3,3x 105 |<5x108 | <15

6.671 5,9 x 105º 1x10* 7 2,4x10º |<5x106 | <20

6.73.2 1,4x10º [1,3x10º| 93

6.771 1,5x10º | 1x10º | 6,7

9.8.2 2,3x10º [2,3x10º| 100 | 4,4x105 [1,4x10* | 32,5

[0287] As análises cinéticas indicam que os anticorpos preparados de acordo com a invenção possuem altas afinidades e constantes de ligação fortes para o domínio extracelular de MAJCAM. Exemplo Ill Identificação da seletividade por epítopos e reatividade cruzada entre espécies de mAbs anti-MAdCAM

[0288] Os anticorpos reconhecem epítopos expostos nas superfícies de antígenos como regiões de sequência linear (primária) ou sequência estrutural (secundária). Binning (criação de intervalos) de epítopos com Luminex, binning com BlAcore e análise imuno- histoquímica entre espécies foram usados em combinação a fim de definir o panorama de epítopos funcionais dos anticorpos anti- MAdJdCAM. Binning de epítopos com base em Luminex:

[0289] Microesferas conjugadas com MxhlgG 2,3.4 (Calbiochem MI 1427) foram acopladas ao anticorpo anticMAdCAM primário desconhecido. 150 uL da diluição do anticorpo primário desconhecido (0,1 ug/mL diluídos em meio de hibridoma) foram adicionados à cavidade de uma placa de cultura de tecido com 96 cavidades. O estoque de microesferas foi gentilmente turbilhonado e diluído no sobrenadante até uma concentração de 0,5 x 10º microesferas/mL. As microesferas foram incubadas no sobrenadante em um agitador durante a noite no escuro a 4ºC.

[0290] Cada cavidade de uma placa filtrante de microtitulação com 96 cavidades (Millipore nº MABVN1250) foi previamente umedecida adicionando 200 uL de tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 0,05%) e removidos por aspiração. Em seguida, 50 ul/cavidade do estoque de 0,5 x 10º microesferas/ml foram adicionados à placa filtrante, e as cavidades foram lavadas com tampão de lavagem (2 x100 ul/cavidade). 60 uL/cavidade de antígeno MADGCAM-IgG1 Fc diluído em meio de hibridoma (0,1 ug/mL) foram adicionados. As placas foram cobertas e incubadas à temperatura ambiente com leve agitação por uma hora. As cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 ul/cavidade de tampão de lavagem seguido por aspiração. Em seguida, foram adicionados 60 yul/cavidade de anticorpo anti-MAdCAM secundário desconhecido, diluído em meio de hibridoma (0,1 ug/mL). As placas foram agitadas à temperatura ambiente no escuro por duas horas. Em seguida, as cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 uL/cavidade de tampão de lavagem, seguido por aspiração. Em seguida, 60 ulL/cavidade de MxhlgG 2,3,4 biotinilado (0.5 ug/mL) foram adicionados. As placas foram agitadas à temperatura ambiente no escuro por uma hora. As cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 ul/cavidade de tampão de lavagem, seguido por aspiração. A cada cavidade, foram adicionados 60 ul de MxhlgG 2,3,4 Estreptavidina-PE 1 ug/mL (Pharmacia nº 554061), diluído em meio de hibridoma. As placas foram agitadas à temperatura ambiente no escuro por vinte minutos. As cavidades foram lavadas duas vezes pela adição de 100 uL/cavidade de tampão de lavagem, seguido por aspiração. Em seguida, cada cavidade foi ressuspensa em 80 ul tampão de bloqueio (PBS com albumina sérica bovina 0,5%, Tween 0,1% e timerosal 0,01%) cuidadosamente pipetada para cima e para baixo para ressuspender as microesferas.

[0291] Usando Luminex 100 e seu software anexo (LuminexO

Corporation), as placas foram lidas para determinar a luminescência. Com base nos dados da luminescência, obtidos para os vários anticorpos anti-MAdCAM testados, os anticorpos anti-MAdCAM foram agrupados de acordo com as suas especificidades de ligação. Os anticorpos anti-MAdCAM que foram testados enquadraram-se em uma série de bins de epítopos, representados na Tabela 8.

Binning com BlAcore:

[0292] Em um método semelhante àquele descrito acima, a tecnologia BlAcore pode igualmente ser utilizada para determinar a exclusividade de epítopos dos anticorpos anti-MAdCAM exemplificados por esta invenção. Nove clones dos anticorpos anti-MAdCAM, 6.22.2,

6.34.2, 6.67.1, 6.77.1, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.264 e 7.166, foram imobilizados sobre a camada de dextrano de um fluxo separado de células de um chip biosensor CMB5 utilizando acoplamento com amina. O tampão de imobilização tampão acetato 10 mM, pH 4,5 (clones

6.22.2, 6.34.2, 7.20.5, 9.8.2, 1.7.2, 7.26.4 e 7.16.6) ou 1 tampão acetato mM, pH 5,5 (clones 6.67.1 e 6.77.1). Uma densidade de proteína de aproximadamente 3750 RU foi alcançada em todos os casos. À desativação de ésteres de N-hidroxissuccinimida não reagidos foi realizada com cloridrato de etanolamina 1 M, pH 8,5.

[0293] A proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc foi diluída até uma concentração de 1,5 ug/mL (aproximadamente 25 nM) em tampão de corrida HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,45 M, EDTA 3 mM, Polissorbato 20 0,05% 0). Foi injetada, a seguir, na primeira célula do fluxo, em um volume de 50 yL e vazão de 5 uL/min. Depois de concluída a injeção, a primeira sonda de anticorpo foi adicionada à mesma célula do fluxo. Todos os anticorpos em teste foram diluídos até uma concentração de aproximadamente 20 ug/mL em HBS-EP e igualmente injetados em um volume de 50 yL e vazão de 5 ul/min. Quando nenhuma ligação do anticorpo em teste era observada, o próximo clone em teste era injetado imediatamente depois.

Quando não ocorria ligação, a superfície do sensor era regenerada para remover a proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc e o anticorpo em teste.

Uma variedade de soluções de regeneração foi usada, dependendo do anticorpo imobilizado e do anticorpo em teste presente.

Um resumo das condições usadas para regeneração está representado na Tabela 6. Tabela 6. Resumo das condições usadas para regeneração no mapeamento de epítopos por BlAcore

Anticorpo Sonda de Solução de regeneração Volume de imobilizado anticorpo a ser injeção mes E O o insano 5 OO o sara 5

Anticorpo Sonda de Solução de regeneração Volume de imobilizado anticorpo a ser injeção se CE o o iesesssmr sã (A vazão era 50 uL/minuto durante todos os procedimentos de regeneração)

[0294] Depois da regeneração, a proteína de fusão MAdCAM-IgG1 Fc foi ligada novamente e anticorpos em teste adicionais foram injetados. Esses procedimentos foram realizados até que todo o painel de clones tivesse sido injetado sobre a superfície do anticorpo imobilizado, com a proteína de fusão MAdCAM-IgG: Fc ligada. Uma nova célula do fluxo com um anticorpo imobilizado diferente e MAdCAM ligada foi então utilizada para sondagem com os nove clones em teste. Esperava-se que os anticorpos anticMAdCAM 1.7.2 e 1.8.2 reconhecessem o mesmo epítopo de MAdCAM, tendo por base a homologia de sequência de aminoácidos próxima de suas cadeias pesadas e leves kappa, SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 respectivamente. Consequentemente, apenas 1.7.2 foi avaliada através da matriz de resposta BlAcore. Os anticorpos 6.14.2 e 6.73.2 foram omitidos dessa análise, mas todas as outras combinações de pares de anticorpo anti- MAdCAM foram testadas dessa maneira. Um nível arbitrário de 100 RU foi escolhido como o limite entre ligação/não ligação, e uma matriz de resposta (Tabela 7) foi criada com base em se a ligação fosse observada. Tabela 7. Matriz de resposta para binning de epítopos por BlAcore | aa o x | ssa a x x x | | ser a x e sr a x x | | ras o x x x | | Ba a a a a a x | a a a a a x

ECSRSEINRMRENERAIRIRER | 7166 x da Ps e e x | Matriz de resposta para todas as combinações de pares de anticorpos — indica que não há ligação da sonda de anticorpo; x indica que foi observada ligação (acima de um nível limiar escolhido de 100 RU).

[0295] A diagonal da matriz na Tabela 7 (sombreado cinza) contém os dados de ligação para pares idênticos de sondas. Em todos os casos, exceto para os dois clones 7.16.6 e 9.8.2, os anticorpos foram autobloqueantes. Os anticorpos 7.16.6 e 9.8.2 não competem de modo cruzado. A falta de autobloqueio pode ser devida a uma mudança na conformação induzida pelo mAb na proteína de fusão que permite ligação adicional do mMAb a um segundo sítio em MAdCAM-IgFc. O agrupamento dos clones que revelam o mesmo padrão de reatividade dá origem a pelo menos seis bins de epítopos diferentes, como mostrado na representação gráfica, Figura 5).

[0296] A identificação mais precisa das sequências de epítopos de MAdCAM com os quais um anticorpo anti-MAdCAM interage pode ser determinada por qualquer um de vários métodos, incluindo, entre outros, análise Western de arranjos de bibliotecas do peptídeo localizado (Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. and Immunol 243: 23-36

(1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag , Berlim), exibição em bibliotecas de expressão em fagos ou de bacteriana flagelina/fliC bacteriana ou análise simples MALDI-TOF de fragmentos proteicos ligados após proteólise limitada.

Ensaios imuno-histoquímicos

[0297] OCT ou amostras de tecido congelado embutido em sacarose do íleo (Placas de Peyer), linfonodo mesentérico, baço, estômago, duodeno, jejuno e cólon foram usados como controles positivos para coloração dos mAbs anti-MAdCAM mAbs. Para coloração de seções humanas com mAbs IgG2 humano, foram gerados derivados biotinilados dos mAbs anti-MAdCAM. Seções de tecido congelado de um foram cortadas em lâminas revestidas com poli-L-lisina, colocadas diretamente em acetona 100% 4ºC (10 minutos), depois peróxido de hidrogênio 3% em metanol (10 minutos), lavagem entre as etapas com PBS. As lâminas foram bloqueadas com o sistema Biotin Blocking System (DAKO, Nº de cat. X0590), antes da incubação com o anticorpo primário (1:100-1:1000) em PBS (1 hora), lavadas com PBS- Tween 20 (0,05%) e, em seguida, a ligação foi desenvolvida com HRP- Streptavidin (BD Bioscience, Nº de cat.550946, 30 minutos) e substrato DAB (Sigma, Nº de cat. D5905). Para mAbs IgG, foi usado um anticorpo secundário de camundongo anti-lgG, humana conjugada com HRP (Zymed No de cat. 3840). As lâminas foram contrastadas com Haemalum de Mayer (1 minuto), lavadas e, a seguir, montadas em DPX.

[0298] A afinidade de ligação foi comparada para várias espécies (tecido de camundongo, rato, coelho, cão, porco, cynomolgus e humano). Não houve reatividade para tecido de rato, coelho e porco por imuno-histoquímica e nenhuma reatividade cruzada dos anticorpos anti- MAdJdCAM para MAGdCAM de camundongo recombinante, na análise por ELISA. Os dados para tecido humano, de cynomolgus e cão são apresentados em forma de tabela na Tabela 8 abaixo:

Tabela 8. Padrão de reatividade cruzada de anticorpos anti-MAdCAM contra espécies ortólogas de MACCAM LL Fere [ES SS eo

17.2 3a

7.16.6 3b

7.20.5 2b n.d.

7.264 3b n.d.

6.14.2 2 n.d.

6.22.2 2 n.d.

6.34.2 6 n.d. |

6.67.1 5 n.d.

6.73.2 3 | ndo | n.d.

6.771 1 n.d. pes n.d.: não determinado

[0299] A ligação antr-MAdCAM a estruturas endoteliais especializadas e tecido linfoide é indicada pelo sombreamento, de acordo com a legenda. O bin de epítopos tendo por base a análise de epítopos com Luminex e o padrão de reatividade cruzada de MAGCAM são indicados para cada anticorpo. Os dados de binning de epítopos por Luminex epítopo dos anticorpos anti-MAdCAM 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1, 6.73.3 e 6.77.1 (itálico) foram derivados de experimentos separados daquele para 1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2 (em negrito), conforme indicado pela diferença no caráter da fonte.

[0300] Todos os anticorpos antic-MAdCAM testados tinham a capacidade para reconhecer um epítopo de MAJCAM humana expresso em compartimentos endoteliais vasculares do trato gastrointestinal. Excluindo 1.7.2 e 1.8.2, todos os outros anticorpos anti-MAdCAM testados foram capazes de se ligar especificamente a compartimentos endoteliais vasculares do trato gastrointestinal de cynomolgus. Alguns outros anticorpos anti-MAdCAM, a saber, 6.14.2 e 6.67.1, também eram dotados da capacidade para reconhecer especificamente o ortólogo de MAdCAM de cão, bem como a MAdCAM de cynomolgus. Geração de uma linhagem de células CHO expressando MAdCAM de cynomolgus/humana quimérica funcionalmente ativa

[0301] As diferenças em afinidade de ligação de certos anticorpos anti-MAdCAM para MAdCAM humana e de cynomolgus levou à determinação se uma base estrutural para essa observação poderia ser feita.

[0302] Com base na sequência de aminoácidos publicada para MAJdCAM de macaco (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)), foram criados primers para amplificação por PCR da sequência do domínio de ligação de a4B7 e MAdCAM de cynomolgus. RNA total foi preparado a partir de linfonodo mesentério de cynomolgus, obtido por excisão (ca. 200 mg), utilizando o método de Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 1-2 ug de oligo-dT foram iniciados e transcritos de modo reverso com a reverse transcriptase do AMV (Promega). Uma proporção do produto transcrito reverso foi submetida à PCR com o primer forward 5-AGC ATG GAT CGG GGC CTG GCC-3' (SEQ ID NO: 67) e o reverse 5-GTG CAG GAC CGG GAT GGC CTG-3' (SEQ ID NO: 68) e a GC-2 polimerase em GC 1M fundido (Clontech) e a uma temperatura de anelamento de 62 ºC. Um produto de RT-PCR do tamanho adequado foi excisado e purificado de um gel de agarose 1% após a eletroforese, então clonado em TOPO-TA (Invitrogen) entre os sítios EcoRI de pCR2.1. O inserto teve a sequência confirmada. As sequências de nucleotídeos e traduzida predita de aminoácidos são mostradas em SEQ ID NOS 49 e 50, respectivamente.

[0303] As sequências preditas de aminoácidos de MAdCAM humana e de cynomolgus para o domínio de ligação de axB7 mostram algo grau de identidade de sequência (90,8%) quando alinhadas (a Figura 3 fornece esse alinhamento de sequências). Para gerar uma linhagem celular expressando MAGdCAM de cynomolgus funcionalmente ativa, que simulasse o padrão de ligação anti-MAdCAM representado pela Tabela 8, um fragmento Sacl, correspondente à sequência do domínio de ligação de axB; de cynomolgus em pCR2.1, foi subclonado diretamente na construção MAdCAM humana-pIND-Hygro C-terminal, contendo suporte e domínio transmembrana de mucina na terminação carboxila, descrito acima. A sequência e orientação foram verificadas, então, um fragmento Kpnl/Notl foi clonado no vetor PEFSFRTVSGWCAT (Invitrogen), substituindo a sequência CAT codificadora e usada em transfecções para gerar clones únicos expressando estavelmente em células Flp In CHO (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.

[0304] A ligação de clones do anticorpo anti-MAdCAM às células CHO expressando a quimera MAdCAM de cynomolgus/humana foi avaliada por citometria de fluxo, e a atividade funcional dos anticorpos anti-MAdCAM foi determinada utilizando um ensaio de adesão de células JY muito semelhante àquele descrito acima. A ligação e a atividade funcional e anticorpos anticMAdCAM são apresentadas na Tabela 9.

[0305] Tabela 9. Correlação entre a atividade funcional no ensaio de adesão de MAdCAM-CHO/JY cynomolgus/humana e a ligação de células CHO a MAdCAM de cynomolgus/humana, conforme medida por FACS, para uma faixa de anticorpos anti-MAdCAM.

; Ligação por FACS CLONE Funcional ICso

1.8.2 Inativo

7.16.6 0,72

7.20.5 0,62

7.26.4 0,96

6.14.2 0,53

6.22.2 0,83

6.34.2 0,47

6.67.1 0,75

6.73.2 Inativo

6.77.1 0,64

9.8.2 0,83 Nenhuma ligação

[0306] Em conjunto, há uma boa correlação entre a capacidade de um dado anticorpo anti-MAdCAM para se ligar à MAdCAM humana ou de cynomolgus, como detectada por imuno-histoquímica (Tabela 8), com ligação baseada em célula recombinante e atividade funcional (Tabela 9). Os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 e 6.73.2, por exemplo, demonstraram uma falta consistente de ligação ao tecido de cynomolgus e células expressando uma proteína quimérica MAAdCAM de cynomolgus/humana. Os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 e

6.73.2 também não tiveram a capacidade para detectar a atividade bloqueadora funcional no ensaio de adesão de MAdCAM de cynomolgus/humana/JY.

[0307] Abordagens semelhantes poderiam ser utilizadas para definir o epítopo dos anticorpos anti-MAdCAM 6.14.2 e 6.671 que reconhecem a MAdCAM do cão. Exemplo IV Uso de mAbs anti-MAdCAM na detecção de MADdCAM solúvel circulante como método de diagnóstico de doenças

[0308] Anticorpos anti-MAdCAM podem ser usados para a detecção de MAdCAM solúvel circulante (SMAdCAM). A detecção e SMAdCAM em amostras clínicas de plasma, soro ou de outro líquido biológico, tal como, entre outros, de fezes, urina, escarro, é provavelmente um biomarcador substituto de doença, útil para doença subjacente, incluindo, entre outras, doença inflamatória intestinal.

[0309] Com base nos dados de binning de epítopos (Tabelas 7 e 8), os anticorpos antic-MAdCAM 1.7.2 e 7.16.6 parecem reconhecer epítopos diferentes na MAdCAM humana. Placas de ELISA foram revestidas durante a noite a 4 ºC com 100 uL/cavidade de uma solução 50 pg/mL de 1.7.2 em solução salina com tampão fosfato (PBS). Depois da incubação, a placa foi bloqueada por 1,5 hora com um tampão de bloqueio de PBS contendo leite 10% (200 ul/cavidade). Depois da incubação, a placa foi lavada com PBS (2 x 100 uL/cavidade) e diluições seriadas da proteína de fusão MAJddCAM-IlgG1-Fc, desde uma concentração máxima de 50 ug/mL descendo até aproximadamente 5 ng/mL em PBS, para um volume final de 100 yuL, foram adicionadas à placa para incubação de 2 horas à temperatura ambiente. Em uma abordagem semelhante, a proteína MAdCAM-IgG1-Fc pode ser diluída em plasma ou soro, ou em outro líquido biológico relevante, e usada para determinar a expressão de MAdCAM solúvel em uma amostra clínica, como descrito abaixo. Como controle negativo, somente tampão foi adicionado às cavidades contendo o anticorpo antic-MAdCAM primário. Depois desse período, a placa foi lavada com PBS (3 x 100 ul/cavidade) e, a seguir, incubada no escuro com 7.16.6 marcado com Alexa488 (100 ul, 5 Og/mlL). O 7.16.6 marcado com Alexa488 foi gerado usando um kit disponível comercialmente (Molecular Probes, A- 20181), seguindo protocolos do fabricante.

[0310] A placa foi lavada com PBS, contendo Tween-200 0,05%, e a ligação de 7.16.6 marcado para capturar MAdCAM solúvel foi determinada medindo-se a fluorescência (Wallac Victor? 1420 Multilabel Reader, excitação À 485nm, emissão À 535nm, contagem desde o topo, 3 mm desde o fundo da placa, por 0,1 segundo com abertura de emissão normal). Quando traçada em função da concentração da proteína de fusão MAdCAM-IgG1-Fc, Figura 6, a fluorescência indica que 1.7.2 e um 7.16.6 marcado podem ser usados com fins diagnósticos para determinar o nível de MAdCAM solúvel circulante, expressa em um líquido biológico ou amostra clínica. A abordagem de ELISA intercalo (sandwich) não se restringe ao uso de 1.7.2 e 7.16.6, mas qualquer combinação de anticorpos anti-MAdCAM que reconheçam epítopos diferentes em MAdCAM, como delineado pelos dados e a interpretação da Tabela 7 e Figura 5. Estratégias semelhantes poderiam ser aplicadas ao desenvolvimento de ensaios similares, tais como imuno-histoquímica e Western Blot, com os outros anticorpos anti-MAdCAM descritos, usando diferentes parceiros, variantes, marcações, etc. Exemplo V Estrutura de aminoácidos de mAbs anti-MAdCAM preparados de acordo com a invenção

[0311] Na discussão a seguir, são fornecidas informações estruturais relativas aos mAbs anti-MAdCAM preparados de acordo com a invenção.

[0312] Para analisar as estruturas de mAbs produzidos de acordo com a invenção, clonaram-se os genes que codificam os fragmentos da cadeia pesada e leve do clone do hibridoma específico. A clonagem e sequenciamento dos genes foram realizadas como segue:

[0313] MRNA poli(A)* foi isolado de aproximadamente 2x10º células dohibridoma derivado de camundongos XenoMouse imunizados usando o kit Fast-Track (Invitrogen). A geração de cDNA com primers aleatórios foi seguida por PCR. Primers específicos da família de VH ou VK humanas (Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes", Eur. J. Immunol., 21, 985-991 (1991)) ou um primer universal de VH humana, MG-30 (5-CAG GTG CAG CTG GAG CAG TCI GG-3 (SEQ ID NO: 108) foi usado em conjunto com primers específicos para a região constante Cy2, MG40- d (5-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3 (SEQ ID NO: 109) ou Cy4 humana, MG-40d (5'GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG T -3 (SEQ ID NO: 110), ou a região constante CK (hkP2; como previamente descrito em Green et al/., 1994). As sequências dos transcritos da cadeia pesada e kappa derivada de mAb humano de hibridomas foram obtidas por sequenciamento direto de produtos de PCR gerados a partir de poli(A+) RNA, usando os primers descritos acima. Os produtos de PCR foram clonados em pCR2.1, usando um kit de clonagem em TOPO-TA (lInvitrogen), e as duas fitas foram sequenciadas com kits de sequenciamento Prism dye terminator e uma máquina de sequenciamento ABI 377. Todas as sequências foram analisadas por alinhamentos com ao "diretório de sequências V BASE" (Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 7776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995)).

[0314] Além disso, cada um dos anticorpos, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2,

6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod, foi submetido ao sequenciamento do DNA completo. Para isso, RNA total foi isolado de aproximadamente 3-6x106 células do hibridoma, usando um kit RNeasy (Qiagen). O mRNA foi transcrito reverso utilizando oligo- dT e um sistema de transcriptase reversa baseada no AMV (Promega). V BASE foi usado para criar primers 5' específicos de amplificação, contendo uma sequência ótima de Kozak e um códon de partida ATG (sublinhado) e primers reverse 3' para as cadeias especificadas pesada e kappa como apresentadas na Tabela 10.

Tabela 10: Pares de primers de PCR para amplificação de cDNA a partir de hibridomas expressando mAb anti-MAdCAM e primers usados na construção de versões modificadas de anticorpos anti-MAdCAM | Sequência oligo VH1I-18 5

ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATCC T 3' (SEQ ID NO: 70) H3-15 '

ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGA T3' (SEQID NO: 71) VH3-21 5 'ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTEGGGE T 3' (SEQ ID NO: 72) VvH3-23— 5

ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGC T3' (SEQ ID NO: 73) VvH3-30 — 5

ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG T 3' (SEQ ID NO: 74) H3:33 b

ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGG T 3' (SEQ ID NO: 75) VH4-4 '

ATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCT |C 3' (SEQ ID NO: 76) |A2/A3 5

ATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCC G 3' (SEQ ID NO: 77) |A26 5'

ATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGTTGCCATCACAACTCATTGG IG 3' (SEQ ID NO: 78) B3 5

ATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGTGTTGCAGACCCAGGTCT C 3' (SEQ ID NO: 79) 012 5

ATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTC AG 3' (SEQ ID NO: 80)

E

ATCTAAGCTTCTAGACCCGGGCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCTGCTC AG 3' (SEQ ID NO: 81) RevigG2 —5' TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG 3' (SEQ ID NO: 82) RevligG4 — 5 TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC 3' (SEQ ID NO: 83) RevKappa |5' TICTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCAGAGACAGGGAGAG 3' (SEQ ID NO: 84)

16.22.2VK F 5-GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC AAT AGC CTG GAA GC- 1 B'(SEQID NO:85)

| Sequência oligo

16.22.2VK R5'-GCT TCC AGG CTA TTG ATG GTG AGG GTG AAA TCT GTC CCA GAT CC- 1 B'(SEQID NO:86)

16.22.2VH F 5-GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC-3'(SEQ ID NO: 87) 1

16.22.2VH R5'-GCT ACT GAA GGT GAA TCC AGA CGC TGC-3'(SEQ ID NO: 88) 1

16.22.2VH CB5-CGG AGG TGC TTC TAG AGC AGG GCG-3'(SEQ ID NO: 89) ls*

16.34.2VK F 5-GCA AGT CAG AGT ATT AGT AGC TAT TTA AAT TGG TAT CAG AAA CC- 1 B'(SEQ ID NO: 90)

16.34.2VK R5-GGT TTC TGC TGA TAC CAA TTT AAA TAG CTA ATA CTC TGA CTT GC- 1 B'(SEQ ID NO: 91) I6.34.2VK F 5-CCA TCA GTT CTC TGC AAC CTG AGG ATT TTG CAA CTT ACT GTC ACC- PR '(SEQ ID NO: 92)

16.34.2VK R5-GGT GAC AGT AAG TTG CAA AAT CCT CAG GTT GCA GAG AAC TGA B GG-3'(SEQ ID NO: 93)

16.34.2VH F 5-GCA AAT GAA CAG CCT GCG CGC TGA GGA CAC G-3'(SEQ ID NO: 94)

16.34.2VH 5-CGT GTC CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT TTG C-3'(SEQ ID NO: 95) R1 I6.67.1VK F 5-CAA TAA GAA CTA CTT AGC TTG GTA CCA ACA GAA ACC AGG ACA 1 GCC- '(SEQ ID NO: 96)

6.67.1VK R5-GGC TGT CCT GGT TTC TGT TGG TAC CAA GCT AAG TAG TTC TTATTG- 1 B'(SEQ ID NO: 97)

6.67.1VH F5-CCC TCA GGG GTC GAG TCA CCA TGT CAG TAG ACA CGT CCA AGA 1 ACC-3'(SEQ ID NO: 98)

6.67.1VH R5-GGT TCT TGG ACG TGT CTA CTG ACA TGG TGA CTC GAC CCC TGA 1 GGG-3'(SEQ ID NO: 99)

6.67. 1VH CB-ATT CTA GAG CAG GGC GCC AGG-3'(SEQ ID NO: 100) 5º I6.77.1VK F 5-CCA TCT CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3'(SEQ ID NO: 101) 1 l6.77.1VK R5-GGA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG AGA TGG-3'(SEQ ID NO: 102) 1 l6.77.1VK F 5-GGC CAA AAC TGG ACA TAA GCT GTA TAC TTT GCA TGC AGT AAT AMA PR ICC -3'(SEQ ID NO: 103)

6.77.1VK R5-GGT TTA CTG CAT GCA AAG TAT ACA GCT TAT GTC CAG TTT TGG CC - PR B'(SEQ ID NO: 104)

17.26.4K F2 5-CCT GCA AGT CTA GTC AGA GCC TCC-3'(SEQ ID NO: 105)

17.26.4K R1 5--GCA GGC TCT GAC TAG ACT TGC AGG-3'(SEQ ID NO: 106)

[0315] Os pares de primers foram usados para amplificar os cDNAs por meio da Expand High Fidelity Taq polymerase (Roche), e os produtos de PCR clonados em pCR2.1 TOPO-TA (Invitrogen) para sequenciamento subsequente. Clones que tiveram a sequência da cadeia pesada e da leve kappa foram então clonados nos vetores pEE6.1 e pEE1I2.1 (LONZA) usando os sítios Xbal/EcoRI e HindllI/EcoRl|, respectivamente. Análise da utilização de genes

[0316] A Tabela 11 exibe a utilização de genes da cadeia pesada e da leve kappa para cada hibridoma delineado na invenção. ETs IA e

1.7.2 VvH3-15 D6-19 JH4b A3 JK5

1.8.2 VvH3-15 D6-19 JH4b A3 JK5

7.16.6 VvH1-18 D6-6 JH6b A2 JK1

17.20.5 VH4-4 D3-10 JH6b A3 JK4

7.26.4 VvH1-18 D6-6 JH6b A2 JK1

6.14.2 VvH3-23 D5-5 JH4b o12 JK5

6.22.2 VvH3-33 D5-12 JH6b A2Z6 JK4

6.34.2 VH3-30 D4-23 JH6b o12 JK3

6.67.1 vH4-4 D3-10 JH4b B3 JK4

6.73.2 VvH3-23 D6-19 JH6b o12 JK2

6.77.1 vH3-21 D6-19 JH6b A2 JK2 Tabela 11: Utilização de genes da cadeia leve kappa e pesada Análise de sequências

[0317] Para examinar mais detalhadamente a estrutura do anticorpo, foram obtidas sequências de aminoácidos preditas para os anticorpos dos cDNAs obtidos dos clones.

[0318] Os números identificadores das sequências (SEQ ID NO:) 1- 48 e 51-68 fornecem as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada e da leve kappa dos anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2

(SEQ ID NOS 1-4), 1.8.2 (SEQID NOS 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NOS 9-12),

6.22.2 (SEQ ID NOS 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NOS 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NOS 21-24), 6.73.2 (SEQ ID NOS 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NOS 29- 32), 7.16.6 (SEQ ID NOS 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NOS 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NOS 41-44), 9.8.2 (SEQ ID NOS 45-48) e dos anticorpos modificados anti-MAdCAM 6.22.2-mod (SEQ ID NOS 51-54), 6.34.2- mod (SEQ ID NOS 55-58), 6.67. 1-mod (SEQ ID NOS 59-62) e 6.77.1- mod (SEQ ID NOS 63-66) e 7.26.4-mod (SEQ ID NOS 41-42, 67-68). Para cada sequência de anticorpo anti-MAdCAM clonado, as sequências do peptídeo sinal (ou as bases que codificam as mesmas) são indicadas em letras minúsculas e sublinhadas.

[0319] As Figuras 1A-1J fornecem alinhamentos de sequências entre as sequências de aminoácidos de cadeia pesadas preditas dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

7.16.6, 7.20.5, 7.264 e 98.2 e a sequência de aminoácidos dos respectivos produtos gênicos da linhagem germinativa. As posições das sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos estão sublinhadas, as diferenças entre a sequência expressa e a sequência correspondente da linhagem germinativa são indicadas em negrito e onde há adições na sequência expressa, em comparação à linhagem germinativa, essas são indicadas como (-) na sequência da linhagem germinativa.

[0320] As Figuras 1K-1T fornecem alinhamentos de sequências entre as sequências preditas de aminoácidos de cadeia leve kappa dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

7.16.6, 7.20.5, 7.264 e 9.8.2 e a sequência de aminoácidos dos respectivos produtos gênicos da linhagem germinativa. As posições das sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 dos anticorpos são sublinhadas, as diferenças entre a sequência expressa e a sequência correspondente da linhagem germinativa são indicadas em negrito e onde há adições na sequência expressa, em comparação à linhagem germinativa, essas são indicadas como (-) na sequência da linhagem germinativa. Presença de modificação pós-traducional: glicosilação e desamidação

[0321] O efeito de algumas das mudanças na sequência expressa do anticorpo anti-MAdCAM, quando comparada com a sequência derivada da linhagem germinativay é introduzir resíduos que potencialmente poderiam ser objeto de glicosilação N-ligada (Asn-X- Ser/Thr) e/ou desamidação (Asn-Gly) (ver a Tabela 12). As sequências de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis da cadeia leve kappa dos anticorpos anti-MAdCAM

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 e 9.8.2, (SEQ ID NOS: 16, 20, 24, 28, 32, 44 e 48) e o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo 6.14.2, (SEQ ID NO: 10) predizem a presença de glicosilação N-ligada. A presença dessa modificação pós-traducional foi investigada usando uma combinação de SDS-PAGE e coloração com Pro-QO Emerald 488 Glycoprotein (Molecular Probes) dos mAbs 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,7.26.4 e 9.8.2.

[0322] Resumidamente, 2 ug de anticorpo anti-MAdCAM reduzido foram carregados em um gel de SDS-poliacrilamida 4-12% SDS- utilizando um tampão MOPS. Após a eletroforese, o gel foi fixado com MeOH 50%, ácido acético 5% e lavado em ácido acético 3%. Quaisquer carboidratos no gel foram então oxidados com ácido periódico e corados usando o kit Pro-QE Emerald 488 Glycoprotein Stain (Molecular Probes). Depois de uma etapa final de lavagem, a coloração com a glicoproteína foi visualizada com um scanner de fluorescência definido em um comprimento de onda de 473 nm.

[0323] Depois da coloração da glicoproteína, o gel foi corado para proteína total, utilizando o corante de proteínas SYPRO Ruby, e analisado com um scanner de fluorescência definido em um comprimento de onda de 473 nm. As cadeias leves kappa dos anticorpos anti-MAdCAM, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.26.4 e 9.8.2, coraram todas positivamente para a presença de glicosilação. Como uma confirmação adicional, o anticorpo anti-MAdCAM 7.26.4 foi submetido à digestão tríptica/quimiotríptica, a análise por LC-MS/MS confirmou a presença de um peptídeo tríptico modificado e forneceu confirmação adicional de glicosilação da cadeia leve kappa.

[0324] Sequências Asn-Gly específicas nas regiões CDR1 dos anticorpos anti-MAdCAM, 1.7.2, 1.8.2, 6.22.2 e 7.20.5, tornam essas regiões sensíveis à desamidação. A desamidação em pH neutro introduz uma carga negativa e pode também levar à B-isomerização, o que poderia afetar as propriedades de um anticorpo. Para os anticorpos anti-MAdCAM 1.7.2, 1.8.2 e 7.20.5, a presença de resíduos de Asn- isoaspartato desaminados foi avaliada por espectroscopia de massa após aprisionamento da cadeia lateral de isoaspartato com MeOH.

[0325] Resumidamente, para o anticorpo anti-MAdCAM 1.7.2, a situação do peptídeo tríptico/Asp-N SSOSLLOSNGYNYL (SEQ ID NO: 69) (1573.7 Da) foi selecionada para monitorização por LC-MS/MS. O anticorpo anti-MAdCAM 1.7.2 foi reduzido em DTT 10 mM, alquilado com Na iodoacetato 5 mM e subsequentemente teve o tampão trocado para tampão de digestão com tripsina (Tris-HCI 50mM, CaCl2 1mM, pH 7,6). O anticorpo foi então misturado com tripsina modificada grau sequenciamento (Promega) em razão protease:proteína de 1:20. À proteína foi digerida com tripsina por 15 horas a 30 ºC, e os peptídeos resultantes separados por HPLC utilizando uma C-18 RPC em um sistema Ettan LC. O peptídeo contendo 3?Asn (4032 Da) foi coletado da coluna e diluído em tampão de digestão de Asp-N (tampão fosfato de sódio 50 MM, pH 8,0). Endoproteinase Asp-N (Roche) foi então adicionada em uma razão aproximada peptídeo:enzima de 10:1.

[0326] Cloreto de acetila (100 uL) foi adicionado a uma amostra de metanol (1 mL, -20 ºC) e a mistura aquecida para a temperatura ambiente. O digerido tríptico+Asp-N foi seco em um Speed-Vac e, a seguir, 5 ul do metanol/cloreto de acetila foram adicionados (45 minutos, temperatura ambiente), então secos novamente em um Speed-Vac. O resíduo resultante foi reconstituído em TFA 0,1%, e os peptídeos foram analisados inicialmente no espectrômetro de massa Voyager-DE STR MALDI-TOF, empregando o método de preparação de amostras em camada fina de nitrocelulose, ou purificação em fase reversa com C18 ZipTips (Millipore) seguida pela mistura de gotículas com a matriz a-ciano. A mistura de peptídeos metilados foi também analisada por LC-MS/MS em um espectrômetro de massa Deca XP Plus lon Trap como acima. A eluição foi avaliada direto no lon Trap MS e os peptídeos foram subsequentemente analisados por MS e MS/MS. A MS foi configurada para analisar todos os íons entre 300 e 2000 Da. O íon mais forte em qualquer varredura em particular foi submetido à análise por MS/MS. Tabela 12. Modificação pós-traducional de anticorpos anti-MAdCAM Cadeia leve kappa Glico- Con- silação Confir- | Glicosilação | Confirma | Desamida- fir- Clone (NXS/T) mado (NXS/T) do ção mado rg E rosNneyN | vs | [182 TE ese ss rs TO resenv | vs | [rag exsnostiy | Ms/pAGE [Bel TANSAmE| oco po q = Le2z22] | | SGTNFTLTI | PAGE

Estudos de mutagênese

[0327] A sequência primária de aminoácidos dos anticorpos anti- MAdCAM exemplificados nesta invenção pode ser modificada, por mutagênese sítio-dirigida, para remover sítios potenciais de modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação, desamidação) ou para alterar o fundo isotípico ou para criar outras alterações que possam melhorar a utilidade terapêutica. Como um exemplo, PCR foi utilizada para criar mudanças nos anticorpos anti-MAdCAM 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1, 6.77.1 e 7.264, reverter certas sequências framework para linhagem germinativa, remover sítios de glicosilação potenciais e/ou mudar o fundo isotípico para uma IgG2 humana. cDNAs clonados em pCR2.1 TOPO-TA (100 ng), correspondendo às SEQ ID NOS: 13, 17, 21 e 29 de nucleotídeos da cadeia pesada e às SEQ ID NOS: 15, 19, 23,31 e 43 de nucleotídeos da cadeia leve kappa, foram utilizados como molde em uma série de PCRs usando sobreposição-extensão e um painel de conjuntos de primers descritos na Tabela 10.

[0328] 6.22.2 Cadeia pesada: Os conjuntos de primers de PCR

6.22.2 VH F1 e 6.22.2VH CS*(1)eVH3-33 e 6.222 VH R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 13. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers VH3-33 e VK6.22.2 CS*, para gerar o domínio V da cadeia pesada modificada de

6.22.2. Essa versão modificada contém uma mutação His/Phe em FR1 e introduz um sítio de restrição Xbal para possibilitar a clonagem in frame em um vetor derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1CH, o qual contém o domínio constante correspondente da IgG2> humana. O fragmento final da PCR foi clonado no sítio Xbal de pEE6.1CH, averiguado quanto à orientação, e o inserto teve toda a sequência verificada. A sequência de nucleotídeos para a cadeia pesada modificada de 6.22.2 é encontrada em SEQ ID NO: 51 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 52. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0329] 6.22.2 cadeia leve kappa: Os conjuntos de primers de PCR

6.22.2 VK F1 e revKappa (1) e A26 e 6.22.2 VK R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 15. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers A26 e revKappa, para gerar o domínio V da cadeia leve kappa modificada de 6.22.2 cadeia leve kappa. Essa versão modificada contém as mudanças Asn/Asp e Gly/Ser na sequência de FR3. O produto resultante da PCR foi clonado em pEE12.1 usando os sítios Hindlll/EcoR1 e teve a sequência totalmente verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada de 6.22.2 é encontrada em SEQ ID NO: 53 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 54. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0330] 6.34.2 Cadeia pesada: Os conjuntos de primers de PCR

6.34.2 VH F1e6.22.2VH CS* (1) eVH3-30 e 6.34.2 VH R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 17. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers VH3-30 e VK6.22.2 CS*, para gerar o domínio V da cadeia pesada modificada de

6.34.2. Essa versão modificada contém uma mutação Ser/Arg em FR3 e introduz um sítio de restrição Xbal para possibilitar a clonagem in frame em um vetor derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1CH, o qual contém o domínio constante correspondente da IgG2 humana. O fragmento final da PCR foi clonado no sítio Xbal de pEE6.1CH, averiguado quanto à orientação, e o inserto teve toda a sequência verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada de 6.342 é encontrada em SEQ ID NO: 55 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 56. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0331] 6.34.2 cadeia leve kappa: Os conjuntos de primers de PCR 012 e 6.34.2 VK R1 (1), 6.34.2 VK F1 e 6.34.2 VK R2 (2), bem como 6.34.2 VK F2 e revKappa (3) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1), (2) e (3), utiizando uma Expand Taq polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 19. Os produtos (1), (2) e (3) foram purificados e (1) e (2) foram combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada), junto com 012 e

6.34.2 VK R2, para gerar o produto da PCR (4). Os produtos da PCR (2) e (3) foram combinados em uma quarta etapa de PCR (ca. 50 ng cada), junto com 6.34.2 VK F1 e revKappa, para gerar o produto da PCR (5). Os produtos da PCR (4) e (5) foram purificados e combinados junto (ca.50 ng cada) com os primers 012 e revKappa para gerar o domínio V da cadeia leve kappa modificada de 6.34.2. Essa versão modificada contém uma mudança Asn/Ser em CDR1, uma mudança Phe/Tyr em FR2 e as mudanças Arg-Thr/Ser-Ser, Asp/Glu e Ser/Tyr na sequência de FR3. O produto resultante da PCR foi clonado em pEE12.1 usando os sítios HindllV/EcoR1 e teve a sequência totalmente verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada de 6.34.2 é encontrada em SEQ ID NO: 57 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 58. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0332] 6.67.1 Cadeia pesada: Os conjuntos de primers de PCR

6.67.1 VH F1 e 6.67.1VH CS* (1) e VH4-4 e 6.67.1 VH R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 21. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers VH4-4 e VK6.67.1 CS*, para gerar o domínio V da cadeia pesada modificada de

6.67.1. Essa versão modificada contém uma conversão lle-Leu-Ala/Met- Ser-Val em FR3 e introduz um sítio de restrição Xbal para possibilitar a clonagem in frame em um vetor derivado de pEE6.1, denominado pEE6.1CH, o qual contém o domínio constante correspondente da IgG? humana. O fragmento final da PCR foi clonado no sítio Xbal de pEE6.1CH, averiguado quanto à orientação, e o inserto teve toda a sequência verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada de 6.67.1 é encontrada em SEQ ID NO: 59 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 60. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0333] 6.67 .1 cadeia leve kappa: Os conjuntos de primers de PCR

6.67.1 VK F1 e revKappa (1), e B3 e 6.67.1 VK R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 23. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers B3 e revKappa, para gerar o domínio V da cadeia leve kappa modificada de 6.67.1. Essa versão modificada contém uma mudança Thr/Asn em CDR1 e uma mudança Arg/Gly em FR2. O produto resultante da PCR foi clonado em pEE12.1 usando os sítios HindlIV/EcoR1 e teve a sequência totalmente verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada de 6.67.1 é encontrada em SEQ ID NO: 61 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 62. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0334] 6.77.1 Cadeia pesada: Os conjuntos de primers de PCR VH 3-21 e 6.22.2VH CS* foram usados para gerar um único produto da PCR, utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 29. Os produtos da PCR foram digeridos com Xbal, purificados em gel e clonados no sítio Xbal de pEE6.1CH, averiguados quanto à orientação. O inserto teve a sequência totalmente verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada de 6.77.1 é encontrada em SEQ ID NO: 63 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 64. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0335] 6.77.1 cadeia leve kappa: Os conjuntos de primers de PCR A2 e 6.77.1 VK R1(1), 6.77.1 VK VK F1 e 6.77.1 R2 (2), bem como

6.77.1 VK F2 e revKappa (3) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1), (2) e (3), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 31. Os produtos (1), (2) e (3) foram purificados e (1) e (2) foram combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada), junto com os primers A2 e 6.77.1 VK R2, para gerar o produto da PCR (4). Os produtos da PCR (2) e (3) foram combinados em uma quarta etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers 6.77.1 VK F1 e revKappa, para gerar o produto da PCR (5). Os produtos da PCR (4) e (5) foram purificados e combinados junto (ca.50 ng cada) com os primers A2 e JK2 para gerar o domínio V da cadeia leve kappa modificada de 6.77.1. Essa versão modificada contém uma mudança Asn/Lys em CDR1, uma mudança Ser/Tyr em FR3 e uma mudança de resíduo Cys/Ser na sequência de CDR3. O produto resultante da PCR foi clonado em pEE12.1 usando os sítios Hindlll/EcoR1 e teve a sequência totalmente verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada de 6.77.1 é encontrada em SEQ ID NO: 65 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 66. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0336] 7.26.4 cadeia leve kappa: Os conjuntos de primers de PCR

7.26.4 VK F1 e revKappa (1), e A2 e 7.264 VK R1 (2) foram usados para gerar os produtos de PCR separados (1) e (2), utilizando uma Expand Tag polimerase e um molde de cDNA pCR2.1 TOPO-TA (100 ng) representado pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 43. Os produtos (1) e (2) foram purificados e combinados em uma terceira etapa de PCR (ca. 50 ng cada) junto com os primers A2 e revKappa, para gerar o domínio V da cadeia leve kappa modificada de 7.26.4. Essa versão modificada contém uma mudança Asn/Ser em CDR1. O produto resultante da PCR foi clonado em pEE12.1 usando os sítios Hindlll/EcoR1 e teve a sequência totalmente verificada. A sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada de 7.26.4 é encontrada em SEQ ID NO: 67 e a sequência correspondente de aminoácidos em SEQ ID NO: 68. As mudanças nas sequências de nucleotídeos e de aminoácidos, em comparação coma precursora, estão indicadas.

[0337] Um vetor de expressão eucariótica funcional para cada uma das versões modificadas de 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.77.1 e 7.264, referidas como 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e

7.26.4-mod, e representando respectivamente a sequência de nucleotídeos da cadeia pesadas SEQ ID NOS: 51, 55, 59, 63 e 41, e as sequências de aminoácidos correspondentes SEQ ID NOS: 52, 56, 60, 64 e 42, bem como as sequências de nucleotídeos da cadeia leve kappa SEQ ID NOS: 53, 57, 61, 65 e 67, e as sequências de aminoácidos correspondentes SEQ ID NOS: 54, 58, 62, 66 e 68 foram montados como segue: Os insertos de cDNA das cadeias pesadas, correspondentes a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. .1-mod e 6.77.1-mod, foram retirados do vetor pEE6.1CH com Notl/Sall, a versão precursora das cadeias pesadas de 7 .26.4, retiradas do vetor pEE6.1 com Noti/Sall, e os fragmentos purificados foram clonados em sítios idênticos no vetor correspondente pEE12.1 contendo as versões modificadas das sequências de cadeia kappa sequências de 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,

6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod. As sequências dos vetores foram confirmadas, e quantidades purificadas usadas em transfecções transitórias com células HEK 293T. Resumidamente, 9x10º células HEK 293T, semeadas em um frasco T165 um dia antes da transfecção e lavadas com Optimem, foram transfectadas transitoriamente com os CDNAs no vetor correspondentes de 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1- mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod (40 ug), utilizando Lipofectamine PLUS (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas por 2 horas, então, o meio de transfecção foi substituído por meio DMEM (Invitrogen 21969-035) contendo soro fetal bovino com teor ultrabaixo de IgG 10% (Invitrogen 16250-078) e L-Glutamina (50 mL). O sobrenadante do meio foi colhido 5 dias mais tarde, filtrado esterilizado e o anticorpo anti-MAdCAM purificado por cromatografia de afinidade com sefarose proteína G, de maneira semelhante àquela descrita acima. A quantidade de anticorpo recuperado (20-100 ug) foi determinada por um ensaio de Bradford.

[0338] A atividade anti-MAdCAM do anticorpo purificado por afinidade correspondente a 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,

6.77.1-mod e 7.26.4-mod foi avaliada no ensaio da fusão MAdCAM- IgG1-Fc como descrito previamente. Os valores de ICso desses anticorpos anti-MAdCAM, quando comparados com os anticorpos anti- MAdCAM precursores dos quais foram derivados, são apresentados na Tabela 13. O efeito das substituições de aminoácidos descritas acima sobre a atividade dos anticorpos anti-MAdCAM modificados quando comparados com seus precursores, foi mínimo. Os anticorpos também mantiveram a sua ligação com células CHO células expressando MAdCAM humana recombinante ou a quimera MAdCAM de cynomolgus/humana. Tabela 13. Atividade de versões modificadas dos anticorpos anti- MAdCAM, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4- mod em comparação com seus precursores oe LESSA | IC5o média (vg/mL)

CLONE

6.34.2 0,013 0,049

6.67.1 0,013 0,037

6.771 0,022 0,077

7.26.4 0,021 0,033 Exemplo VI Aumento em linfócitos B;* na circulação periférica pelo bloqueio de anticorpos anti-MAdCAM

[0339] Foi desenvolvido um ensaio para identificar e correlacionar um efeito mecanicista de um anticorpo anti-MAdCAM e o seu nível circulante no sangue. Um anticorpo anti-MAdCAM inibidor deve ter o efeito de inibir o recrutamento de leucócitos que expressam a integrina a4B7 para o trato the gastrointestinal. As classes de leucócitos que carregam integrina c.B; devem, portanto, ser restritas à circulação periférica.

[0340] Isso foi demonstrado com um mAb anti-MAdCAM humana totalmente humano, 7.16.6, em cynomolgus.

[0341] mMAb anti-MAdCAM humana purificado 7.16.6 (1 mg/kg) ou veículo (Na acetato 20 mM, polissorbato 80 0,2 mg/mL, manitol 45 mg/mL e EDTA 0,02 mg/ml em pH 5,5 ) foi avaliado de maneira semelhante, por administração intravenosa através da veia safena, a dois grupos de macacos cynomolgus (n=4/grupo). No 3º dia após a administração, foram coletadas amostras de sangue em tubos com EDTA por venopunção femoral. Anticorpos específicos contra LPAM, que reagem de modo cruzada com a integrina a4B7 de cynomolgus, não estão disponíveis comercialmente, assim, um anticorpo anti-B; (reconhecendo a integrina a4B7 e azB7) foi usado no lugar. Os anticorpos (30 UuL), de acordo com a tabela seguinte, Tabela 15, foram adicionados a tubos contendo 100 yl de sangue cynomolgus, misturados por turbilhonamento suave e incubados por 20-30 minutos a 4ºC. Tabela 15. Anticorpos (BD Pharmingen) usados na imunotipagem de sangue de cynomologus

[0342] A cada tubo, 1 mL de solução 1:10 FACSIyse (BD nº 349202) foi adicionado, misturado por turbilhonamento suave e incubado à temperatura ambiente por aproximadamente 12 minutos no até que a lise das hemácias estivesse completa. Em seguida, 2 mL de tampão de coloração BD (nº 554656) foram adicionados a cada tubo, misturados e centrifugados a 250 x g por 6-7 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi decantado e o pellet ressuspenso em 3 mL de tampão de coloração, misturado novamente e centrifugado a 250 x g por 6-7 minutos à temperatura ambiente. O tampão Cytofix (BD nº 554655), contendo paraformaldeído m/v (100 uL), foi adicionado aos pellets de células do sangue periférico de macaco e misturado cuidadamente por velocidade baixa/moderada do turbilhonador. As amostras foram mantidas a 4 ºC no escuro até que adquirissem o FACSCAalibur. Um pouco antes da captura, PBS (100 uL) foi adicionado a todos os tubos imediatamente antes da captura. Os números absolutos de células CD4*B7*CD95/0CD28* (virgem), CD4'Br'CD95hicD28* (memória central), CD4*B; CD95hicD28* (memória central), CD4+BbB;*CD9I5hicD28: (memória efetora) capturados pelas análises de gating e quadrantes adequados. Outros subconjuntos de células T, por exemplo, células T CD8* de memória central (B;r'CD8*CD28*CD95*) e quaisquer outros leucócitos carregando um ligante de MAGCAM, podem também ser analisados por esse método com os anticorpos adequados. Em comparação ao veículo controle, o mAb anti-MAdCAM 7.16.6 causou um aumento aproximado de 3 vezes nos níveis de células T CD4*B7*CD95hicD28: circulantes de memória central, como mostrado na Figura 7. Não houve efeitos sobre a população de células T CD4"B; CD95hiCcD28* circulantes de memória central, indicando que o efeito do mMAb anti-MAdCAM 7 .16.6 é específico para células T que retornam ao intestino. O efeitos do mAb anti-MAdCAM 7 .16.6, em cynomolgus, sobre populações de linfócitos (as)B7* indica que é uma prova substituta robusta de mecanismo biomarcador, especialmente no contexto de aplicação prática em um cenário clínico.

Sequências

[0343] As SEQ ID NO: 1-48,51-68 e 148-150 fornecem as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada e da leve kappa de treze anticorpos humanos anti-MAdCAM, as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos do domínio de ligação a ab; de MAJdCAM de cynomolgus e as sequências de nucleotídeo e de aminoácidos de cinco anticorpos humanos anti-MAdCAM modificados.

[0344] As SEQ ID NO: 1-48 e 148-150 fornecem as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada e da leve de treze anticorpos monoclonais humanos anti-MAdCAM: 1.7.2 (SEQ ID NO: 1- 4), 1.8.2 (SEQ ID NO: 5-8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 9-12), 6.22.2 (SEQ ID NO: 13-16), 6.34.2 (SEQ ID NO: 17-20), 6.67.1 (SEQ ID NO: 21-24),

6.73.2 (SEQ ID NO: 25-28), 6.77.1 (SEQ ID NO: 29-32), 7.16.6 (SEQ ID NO: 33-36), 7.20.5 (SEQ ID NO: 37-40), 7.26.4 (SEQ ID NO: 41-44),

9.8.2 (SEQ ID NO: 45-48), X481.2 (SEQ ID NO: 35, 148-150).

[0345] As SEQ ID NO: 49-50 fornecem as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos de um domínio de ligação a cb; de MAdCAM de cynomolgus.

[0346] As SEQ ID NO: 51-68 fornecem as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada e da leve kappa dos anticorpos monoclonais modificados anti-MAdCAM: 6.22.2 (SEQ ID NO: 51-54), 6.34.2 modificado (SEQ ID NO: 55-58), 6.67.1 modificado (SEQ ID NO: 59-62), 6.77.1 modificado (SEQ ID NO: 63-66) e as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia leve kappa do anticorpo monocional modificado anti-MAdCAM: 7.26.4 modificado (SEQ ID NO: 67-68).

[0347] As SEQ ID NOS: 70-106 e 108-110 fornecem várias sequências de primers (iniciadores). Legenda: Sequência sinal: letra minúscula sublinhada Aminoácidos mudados em sequências modificadas de anticorpos anti-

MAdCAM em comparação à precursora: letra maiúscula sublinhada SEQ ID NO. 1

1.7.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagagttta gactgageta gattttectt gctactattt taaaagatat 51 cceagtgtGAG GTGCAGCTGG —TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTGAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC —TGTGTAGCCT CTGGATICAC TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGET 201 TGGCCGTATT AAAMAGGAMAA — CTGATGGTGG GACAACAGAC TACGCTGCAC 251 CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 301 “TATCTGCAMA — TGAACAGCCT .GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 —CCGTCTCCTC —AGCCTCCACC —AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCECCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA 501 “GGACTACTTIC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTTC —CCAGCTGTCC TACAGTCCTCE AGGACTCTAC 601 “TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC — AGCAACTTCG GCACCCAGAC 651 “CTACACCTGC —AACGTAGATC — ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA 701 CAGTIGAGCG CAAATGTTGT GTCGAGTGCC CACCGTGCCC AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTICCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 —“CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC 851 “ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG 901 —CATAATGCCA .AGACAAAGCC . ACGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG — CAAGGTCTCC —AACAMAGGCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA 1051 ACCATCTCCA —AAACCAMAGG .GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT 1101 — GCCCCCATCC CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC —CTGACCTGCC 1151 TGGTCAMAGG —CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA —CAAGACCACA CCTCCCATGC TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG É AGCAGGTGGC 1301 AGCAGGGGAA — CGTCTTCTCA —TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC 1351 CACTACACGC .AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAAAT GA SEQ ID NO. 2

1.7.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswifl aailkgvacE VQOLVESGGGL VKPGGSLRLS —CVASGFTFTN 51 AWMIWVRQAP — GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL 101 YLQMNSLKTE DTAVYYCTTG GVAEDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP 151 CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLOSSGLY 201 SLSSVVTIVPS — SNFGTQTYTC NVDHKPSNTK — VDKTVERKCC VECPPCPAPP 251 VAGPSVFLFP — PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ — FNWYVDGVEV

301 — HNAKTKPREE OQFNSTFRVVS VLTVVHODWL — NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK 351 — TISKTKGOPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS — LTCLVKGFYP — SDIAVEWESN 401 — GQOPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK — SRWQOQOGNVFS “CSVMHEALHN 451 HYTQKSLSLS PGK SEQ ID NO. 3

1.7.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgagactec ctacteaget cetaggacta ctaatactct aggatctetag 51 — atccagtagg GATATTGIGA — TGACTCAGTC —TCCACTCTCC — CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA — GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CAAAGTAATG GATACAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA — AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT —ATTTGGGTTC —TAATCGGGCC TCCGGGGETCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTITAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 ACAMACTATC — ACCTTCGGCC —AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 —TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 —TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAMAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGIGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA —AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG —GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 —ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 4

1.7.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mripaqligl Imlwvsassa DIVMTOSPLS — LPVTPGEPAS ISCRSSOSLL 51 QSNGYNYLDW — YLOKPGOSPQ LLIVLGSNRA — SGVPDRFSGS — GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMOALOTI TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV — QWKVDNALOS —GNSQESVIEQ — DSKDSTYSLS 202 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQOGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 5

1.8.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagaagttta gactgagcta gattttectt actactattt taaaagatat 51 — ccagtatGAG GTGCAGCTGG —TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG —GTGAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT TAGACTCTCC —TGTGTAGICT CTGGATICAC — TTTCACTAAC 151 GCCTGGATGA TCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC —TGGAGTGGGT 201 TGGCCGTATT AAAAGGAMMA — CTGATGGTGG GACAACAGAC .— TACGCTGCAC 251 CCGTGAMAGG CAGATICACC ATCTCAAGAG ATGATICAMA — AAACACGCTG

301 TATCTGCAMA — TGAACAGCCT — GAAAACCGAG GACACAGCCG —TGTATTACTG 351 TACCACAGGG GGAGTGGCTG AGGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA 401 CCGTCTCCTE —AGCCTCCACC —AAGGGCCCAT CGGTCTICCC — CCTGGCGCCC 451 TGCTCCAGGA GCACCTCCGA GAGCACAGCG GCCCTGGGCT — GCCTGGTCAA 501 GGACTACTIC — CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA — GGCGCTCTGA 551 CCAGCGGCGT GCACACCTIC CCAGCTGICC TACAGTCCTCE — AGGACTCTAC 601 TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAACTTICG — GCACCCAGAC 651 CTACACCTGC —AACGTAGATC — ACAAGCCCAG .CAACACCAAG .— GTGGACAAGA 701 CAGTTIGAGCG CAAATGITGT — GTCGAGTGCC CACCGTGCCC — AGCACCACCT 751 GTGGCAGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT 801 CATGATCTCC —CGGACCCCTG AGGTCACGTG CGTGGTGGTG —GACGTGAGCC 851 ACGAAGACCC CGAGGTCCAG TTCAACTGGT —ACGTGGACGG —CGTGGAGGTG 901 “CATAATGCCA — AGACAMAGCC — ACGGGAGGAG CAGTTCAACA — GCACGTTCCG 951 TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TTGTGCACCA GGACTGGCTG — AACGGCAAGG 1001 AGTACAAGTG .—CAAGGTCTCC —AACAMAGGCC . TCCCAGCCCC — CATCGAGAAA 1051 ACCATCTCCA — AAMACCAMAGG .— GCAGCCCCGA GAACCACAGG — TGTACACCCT 1101 GCCCCCATCC —CGGGAGGAGA TGACCAAGAA — CCAGGTCAGC — CTGACCTGCC 1151 TGGTCAMAGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG — GGAGAGCAAT 1201 GGGCAGCCGG AGAACAACTA —CAAGACCACA CCTCCCATGC — TGGACTCCGA 1251 CGGCTCCTIC TTCCTCTACA — GCAAGCTCAC CGTGGACAAG — AGCAGGTGGC 1301 AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC — TCTGCACAAC 1351 CACTACACGC .AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT CCGGGTAMAT — GA SEQ ID NO. 6

1.8.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswifl aailkgvgcE VOLVESGGGL — VKPGGSLRLS — CVVSGFTFTN 51 —AWMIWVROAP .— GKGLEWVGRI KRKTDGGTTD — YAAPVKGRFT — ISRDDSKNTL 101 YLOMNSLKTE DTAVYYCTTG — GVAEDYWGOG TLVIVSSAST — KGPSVFPLAP 151 —CSRSTSESTA ALGCLVKDYF — PEPVTVSWNS — GALTSGVHTF — PAVLOSSGLY 201 —SLSSVWTVPS SNFGTAIYTC — NVDHKPSNTK — VDKTVERKCC — VECPPCPAPP 251 —VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ — FNWYVDGVEV 301 HNAKTKPREE QFNSTFRVWVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS NKGLPAPIEK 351 TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN 401 GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQOQGNVFS CSVMHEALHN 451 HYTOKSLSLS PGK SEQ ID NO. 7

1.8.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgagactec ctactcaget cetaggacta ctaatactct gagtctetag

51 atccagtaga GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA 101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC — ATCTCCTGCA — GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CAAAGTAATG GATTCAACTA TTTGGATTGG TACCTGCAGA — AGCCAGGGCA 201 GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC — TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGIT CAGTGGCAGT GGGTCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 —ACAAACTATC ACCTTCGGCC AAGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC — ATCTTCCCGC —CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 —AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA — AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG — GCCTGAGCTC —GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 8

1.8.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mripagllal Imlwvsassa DIVMTOSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQOSLL 51 QSNGFNYLDW —YLOKPGOSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS — GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMOALOT! TFGOGTRLEI KRTVAAPSVF — IFPPSDEOLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALOS GNSQESVTEQ SGTASVVCLL 202 STLTLSKADY — EKHKVYACEV THOGLSSPVT — KSFNRGEC SEQ ID NO. 9

6.14.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagagttta gactgageta gotttttett gtagctattt taaaagatat 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG 101 —GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGACTCAC CTTTAACAAT 151 TCTGCCATGA CCTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 CTCAACTACT —AGTGGAAGTG GTGGTACCAC ATACTACGCA GACTCCGTGA 251 —AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACTCTC CCAAGAACAC GCTCTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCCGTATATT ACTGTGCGGC 351 —CCGTGGATAC AGCTATGGTA CGACCCCCTA TGAGTACTGG GGCCAGGGAA 401 — CCCTGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GTTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG 501 —CCTGGTCAAG GACTACTICC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 —GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTICC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 — GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACE GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG 651 — CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 — TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ATCATGCCCA 751 —GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAMMACC

801 CAAGGACACT CTCATGATCT —“CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG 851 — TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT 901 —GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAMAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA 951 CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC 1001 — TGAACGGCAA — GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC 1051 — TCCATCGAGA — AAACCATCTC — CAMAGCCAMA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA 1101 GGTGTACACC CTGCCCCCAT —CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA 1151 —GCCTGACCTG CCTGGTCAMA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG 1201 —TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT 1251 GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTICCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA 1301 — AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCITCT CATGCTCCGT GATGCATGAG 1351 — GCTCTGCACA — ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTAA 1401 ATGA SEQ ID NO. 10

6.14.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswlfl vailkgvugcE — VOLLESGGGL VOPGGSLRLS —CAASGLTFNN 51 SAMTWVRQAP — GKGLEWVSTT SGSGGTTYYA DSVKGRFTIS RDSPKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCAARGY SYGTTPYEYW GOGTLVIVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVIVS WNSGALTSGV HTFPAVLOSS 201 GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPSCP 251 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT —CVVVDVSQED PEVOQFNWYVD 301 GVEVHNAKTK — PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK —“CKVSNKGLPS 351 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK — NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 401 “WESNGOPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 451 ALHNHYTOKS — LSLSLGK SEQ ID NO. 11

6.14.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atggacatga gggtceccege tcagctecta ggactectae tactctagct 51 cegaggggce agatat6ACA — TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCGGAGC 151 — ATTAGCAGCTATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 AGTCCTGATC TITITTGTGT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 — CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAATT ACATTCCCCC 351 — TATTACCTTCGGCCAGGGGA CACGACTGGA GATCAGACGA ACTGTGGCTG 401 — CACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 — ACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 — AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 — GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC

601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 — AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAMAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA G SEQ ID NO. 12

6.14.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mamrvpagll — glilwirga rcDIQMTASP — SSLSASVGDR VTITCRASRS 51 ISSYLNWYQAQ KPGKAPKVLI FFVSSLOSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQNYIPPITF GOGTRLEIRR — TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASVWVCLLNN —FYPREAKVOW KVDNALOSGN SQOESVTEQDS KDSTYSLSST 202 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 13

6.22.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagaagttta gactgagcta gattttecte attactettt taagagatat 51 ccagtatcCAG — GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 —GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGACACAC CTTCAGTAGC 151 —GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 —GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA 251 —AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 — CAMATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG 351 —AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG 401 — TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCCTEGGCG 451 —CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCCGCCCTGE GCTGCCTEGT 501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC 551 TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTCE CTCAGGACTC 601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACGAA 651 — GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA 701 —AGAGAGTTGA GTCCAAATAT GGTCCCCCAT GCCCATCATG CCCAGCACCT 751 —GAGTTCCTGG GGGGACCATC AGTCTTCCTG TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 — CACTCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG 851 — TGAGCCAGGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGATGGCGTG 901 — GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAMAGCCGCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC 951 — GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 1001 GCAAGGAGTA —CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC GTCCTCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAGC CACAGGTGTA 1101 —CACCCTGCCC CCATCCCAGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCGCGCCTC CCGTGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAG GCTAACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGGA GGGGAATGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACACAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCTGG — GTAAATGA

SEQ ID NO. 14

6.22.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswvfl valiravgcQ VOLVESGGGV VOPGRSLRLS CAASGHTFSS 51 DGMHWVROAP — GKGLEWVAI! WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT — AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVIVSSAS TKGPSVFPLA 151 PCSRSTSEST — AALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLOSSGL 201 YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT — KVDKRVESKY GPPCPSCPAP 251 EFLGGPSVFL — FPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR — EEQFNSTYRVVSVLTVLHOD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI 351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TAPPVLDSDG SFFLYSRLTV “DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTOKSLS — LSLGK SEQ ID NO. 15

6.22.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atattaccat cacaactcat tagatttcta ctactctaga tteccagcette 51 —caggggtGAA — ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 101 CAAAAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGGCCAGTCAGAG AATTGGTAGT 151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 —“CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGGETTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAAATTTC ACCCTCACCA TCAATGGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT 351 —“CGGCGGAGGG ACCAAGGTGGAGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG 401 TCTTCATCTT —CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTACAGTG 501 —GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGCACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 601 — AGCAAMAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA 651 —TCAGGGCCTG AGCTCGCCCGTCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701 AGTGA SEQ ID NO. 16

6.22.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mipsqligfl llwvpasrgE IVLTOAOSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS 51 SLHWYQQOKPD —QSPKLLIKYA SOSFSGVPSR —FSGSGSGTNF TLTINGLEAE 101 DAATYYCHOS GRLPLTFGGG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS 151 VVCLLNNFYP REAKVOWKVD NALQOSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 201 SKADYEKHKVY YACEVTHOGL SSPVTIKSFNR GEC

SEQ ID NO. 17

6.34.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagagttta gactgagecta gattttecte gttactettt taagagatat s1 ccagtgtCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC —ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGET 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA —GCCTGAGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC 401 AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTCE CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG 651 CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCATCA 751 TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC 801 AAMAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC —ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA —CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCGTCCTCCA TCGAGAAMMAC CATCTCCAAMA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 GCCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG ACAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC 1251 TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT 1401 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 18

6.34.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswvfl valiravacQ VOLVESGGGV VOPGRSLRLS —CAASGFTFSS 51 YGMHWVRQAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS —RDNSKNTLYL 101 QMNSLSAEDT AVYYCARDST — AITYYYYGMD VWGQGTTVIV —SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLOQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT KTYTCNVDHK —“PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS 251 CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK — DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVOFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS — TYRVVSVLTV LHODWLNGKE YKCKVSNKGL

351 PSSIEKTISK AKGQPREPQV — YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL — VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPVL —“DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSLGK SEQ ID NO. 19

6.34.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atggacatga gggtcccege tceagetecta ggactectae tactctagget 51 — ccgaggtgco agatatGACA TCCAGATGAC —CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGTCGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAT 151 ATTAGTAGCTATITAMATTG — GTTTICAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATCTATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGGACTCTG 301 —“CAACCTGATGATTTTGCAAC TTACTCCTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 351 ATTCACTTTCGGCCCTGGGA CCAAAGTGGA TATCAMACGA ACTGTGGCTG 401 —“CACCATCTGTCTTCATCTTC .CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTGTTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA — GAGAGGCCAA 501 —"AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 —“CTGACGCTGAGCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 —AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA GTGA SEQ ID NO. 20

6.34.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mdmrvpaq!l glilwirga reDlIQMTASP — SSLSASVGDR — VTITORASQN 51 ISSYLNWFOA — KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTIRTL 101 —QPDDFATYSC GPGTKVDIKR GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 — TASVWCLLNN FYPREAKVOW KVDNALOSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 —LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 21

6.67.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atgaaacacc tatagttett cetectacta gtggcagcte ccagatagat 51 cetatecCAG — GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTCE CATCAGTAGT 151 —AACTATTIGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG 251 GTCGAGTCAC CATTITAGCA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA 301 “CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTICC ATCCTTCTIT GACTACTGGG

401 GCCAGGGAAC —CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTICCACCAA —GGGCCCATCC 451 GTCTTICCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCCGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTICCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG —“CGCCCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA 601 “CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 “CAGCTTGGGC ACGAAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT —GGACAAGAGA GTTGAGTCCA AATATGGTCC CCCATGCCCA 751 TCATGCCCAG CACCTGAGTT CCTGGGGGGA CCATCAGTCT TCCTGTTCCC 801 —CCCAAMACCC AAGGACACTC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT 851 GCGTGGTGET GGACGTGAGC CAGGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG 901 “TACGTGGATG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAMAGC CGCGGGAGGA 951 “GCAGTTCAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC 1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC 1051 CTCCCGTCCT CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG 1101 AGAGCCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCAGGAGGAG ATGACCAAGA 1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAMAG GCTTCTACCC CAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC 1251 GCCTCCCGTG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAGGCTAA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGGAGGGGA ATGTCTTCTC ATGCTCCGTG 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACA CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC 1401 TCTGGGTAAA TGA SEQ ID NO. 22

6.67.1 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mkhlwffll vaapravisQ VOLQESGPGL — VKPSETLSLT — CTVSGDSISS 51 NYWSWIRQPA GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTILA DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCARDRIT IRGLIPSFF DYWGQGTLVT VSSASTKGPS 151 —VFPLAPCSRSTSESTAALGC .— LVKDYFPEPV — TVSWNSGALT — SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP 251 SCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVOQFNW 301 “YVDGVEVHNAKTKPREEQFN — STYRVVSVLT — VLHODWLNGK EYKCKVSNKG 351 LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV 451 MHEALHNHYT QKSLSLSLGK SEQ ID NO. 23

6.67.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgaagtattac agacccagat cttcatttct ctattactct ggatctetag 51 tacetacagg — GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTTA 151 TACAGCTCCA —ACAATAAGAC CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAAG

201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATIT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA 351 TTATAGTATT CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTICA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAMAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAMA GCAGACTACG AGAAACACAA 651 AGTCTACGCC —TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA 701 AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG TGTTAGTGA SEQ ID NO. 24

6.67.1 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 muvlgtavfis lllwisgaya DIVMTOSPDS LAVSLGERAT —INCKSSOSVL 51 YSSNNKTYLA WYQOKPROPP KLLIMWASIR — EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 ISSLOAEDVA VYFCQOYYS! PPLTFGGGTK VEIKRIVASP — SVFIFPPSDE 151 QLKSGTASWV CLLNNFYPRE AKVOWKVDNA LQSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA CEVTHOGLSS PVTKSFNRGE C SEQ ID NO. 25

6.73.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagagttta gactgageta gotttttett gtagctattt taaaagatat 51 ceagtatGAG GTGCAGCTGT TGGAGTCTGG GGGAGACTTG GTCCAGCCTG 101 —“GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTTAGAAGT 151 TATGCCATGA ACTGGGTCCG ACAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 —CTCAGTTATT AGTGGTCGTG GTGGTACTAC ATACTACGCA GACTCCGTGA 251 —AGGGCCGGTT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACGCG GCCGTATATT ACTGTGCGAA 351 GATAGCAGTG GCTGGAGAGG GGCTCTACTA CTACTACGGT ATGGACGTCT 401 —GGGGCCAAGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT CAGCTTCCAC CAAGGGCCCA 451 TCCGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAACACAGC 501 —CGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 551 —CGTGGAACTC — AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCGGCTETC 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC 651 — TAGCAGCTTG GGCACGAAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA 701 — GCAACACCAA — GGTGGACAAG AGAGTTGAGT CCAAATATGG TCCCCCATGC 751 —CCATCATGCC CAGCACCTGA GTTCCTGGGG GGACCATCAG TCTTCCTGTT 801 — CCCCCCAMMAA —CCCAAGGACA CTCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA 851 —CGTGCGTGET GGTGGACGTG AGCCAGGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 —TGGTACGTGG ATGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA

951 —GGAGCAGTTC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC 1001 —ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCGT CCTCCATCGA GAAAMACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC 1101 —“CCGAGAGCCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCAGGAG GAGATGACCA 1151 —AGAACCAGGT . CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 —ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 —CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAGGC 1301 —TAACCGTGGA .CAAGAGCAGG TGGCAGGAGG GGAATGTCTT CTCATGCTCC 1351 —GTGATGCATG —AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACACAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCTGGGT — AAATGATAG SEQ ID NO. 26

6.73.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswIfl vailkgvgcE VOLLESGGDL VOPGGSLRLS —CAASGFTFRS 51 YAMNWVRQAP GKGLEWVSVI— SGRGGTTYYA DSVKGRFTIS — RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDA AVYYCAKIAV — AGEGLYYYYG MDVWGOGTTV TVSSASTKGP 151 SVFPLAPCSR STSENTAALG — CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 201 LOSSGLYSLS SVVTVPSSSL — GTKTYTCNVD HKPSNTKVDK RVESKYGPPC 251 PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV —SQEDPEVOFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF — NSTYRVVSVL TVLHODWLNG — KEYKCKVSNK 351 GLPSSIEKT! SKAKGQPREP QVYTLPPSOE EMTKNQVSLT — CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP — VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TOKSLSLSLG K SEQ ID NO. 27

6.73.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atggacatga gagtcccege tceagetecta ggactectage tactctaget 51 cegaggtace agatat GACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGTGACAGA GTCACCTTCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAAC 151 ATTACCAACT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AGGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGCTGCGT CCAGTTTGCC AAGAGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCCGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGAGTT ACAGTAATCC 351 TCCGGAGTGC GGTTITGGCC — AGGGGACCAC GCTGGATATC AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG — TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG — GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA — —AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG — GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA

SEQ ID NO. 28

6.73.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mdmrvpaqll glilwirga rcDIQMTASP — SSLSASVGDR VTFTCRASQON E ITNYLNWYQQA — KPGKAPKLLI YAASSLPRGV PSRFRGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQOSYSNPPEC GFGQGTTLDI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALOS GNSQESVIEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THOGLSSPVT — KSFNRGEC SEQ ID NO. 29

6.77.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atggaactag gactcecegeta gattttectt gttactattt tagaagatat 51 ccagtatGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTCAAGCCTG 101 — GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 — TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 — CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 — AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 — CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 —AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 — TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 — CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 — AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG 551 — TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCGGCT 601 — GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 — CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 — CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG AGTCCAAATA TGGTCCCCCA 751 — TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG GGGGGACCAT CAGTCTTCCT 801 — GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG 851 — TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG AAGACCCCGA GGTCCAGTTC 901 — AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG 951 — GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC 1001 — TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 1051 — AMAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAMACC ATCTCCAMAG . CCAAAGGGCA 1101 — GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCAG GAGGAGATGA 1151 — CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAMAGGCTT CTACCCCAGC 1201 — GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA 1251 — GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTIC — CTCTACAGCA 1301 — GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG AGGGGAATGT CTTTTCACGC 1351 —TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACACAGA AGAGCCTCTC 1401 —CCTGTCTCTG GGTAMATGAT AGGAATTCTG ATGA

SEQ ID NO. 30

6.77.1 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 melginwvfl vailegvgcE VOLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTFSS 51 YSMNWVRQAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY — SSGWSYYYYY GMDVWGQGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL — GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLOSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTKTYTCNV — DHKPSNTKVD — KRVESKYGPP 251 CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP — KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSQEDPEVQF 301 NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ — FNSTYRVVSV LTVLHODWLN GKEYKCKVSN 351 KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ —EEMTKNOQVSL TCLVKGFYPS 401 DIAVEWESNG QPENNYKTTP — PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSR 451 SVMHEALHNH YTOKSLSLSL GK SEQ ID NO. 31

6.77.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgagactec ctacteaget cetaggacta ctaatactct Qggatacctag 51 atccagtgca GATATTGTGA — TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CTCCTGGACA — GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA ACTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CTTAGIGATG — GAAAGACCTA TTTGAATTGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTCCTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTATG — TGCAGTITTG GCCAGGGGACCAAGCTGGAG ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT —TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAMA —GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG “CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 “AGCAGCACCC .TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA — GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 32

6.77.1 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mripaqligl Imlwipgssa DIVMTQTPLS — LSVTPGOPAS ISCNSSQSLL 51 LSDGKTYLNW YLOKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS — GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YSCMOQSIQLM CSFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASVWVCL — LNNFYPREAK —VOWKVDNALO SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQOGLSSPV TKSFNRGEC

SEQ ID NO. 33

7.16.6 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atggactaga cectggagcat cettttetta gtggcagcag caacagatgc 51 ceacteeCAG — GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 — GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 — GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC 251 — AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 — GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 — AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG 401 — GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 — CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 — GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC —ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 — CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG —GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 — TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 — GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC —ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 — ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 — CCAGCCCCCA TCGAGAMAMAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 — ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 —AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 —GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 —TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 — TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 —CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 — GGGTAMATGA SEQ ID NO. 34

7.16.6 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mdwtwsilfl vaaatgahsQ VOLVOSGAEV — KKPGASVKVS CKASGYTFTS 51 YGINWVRQAP GQOGLEWMGWI — SVYSGNTNYA — QKVOGRVTMT ADTSTSTAYM 101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS — SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTANLGC — LVKDYFPEPV — TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG — TQTYTCNVDH — KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK — DTLMISRTPE — VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS — TFRVVSVLTV — VHODWLNGKE YKCKVSNKGL

351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML — DSDGSFFLYS — KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTOQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 35

7.16.6 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa e X481.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgagactec ctacteaget cetaggacta ctaatactct ggatacctag 51 atccagtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA — GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA —AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG — CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT — CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTICAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT 351 ACAGCTTCCG — TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA —TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAMA — GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG — TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC — TGACGCTGAG CAAMAGCAGAC TACGAGAMAC .ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA — GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 36

7.16.6 Sequência proteica da cadeia leve kappa 1 mripagilgl Imlwipassa — DIVMTQTPLS LSVTPGOPAS ISCKSSQOSLL 51 HTDGTTYLYW YLOKPGQPPQ LLIVEVSNRF —SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGI YYCMONIQLP WTFGOGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASVWVCL LNNFYPREAK VOWKVDNALO SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD —YEKHKVYACE VTHOGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 37

7.20.5 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atgaaacacc tataattctt cetectacta agtagcagete ccagatagat 51 cetgtecCAG — GTGCAGCTGC —AGGAGTCGGG CCCAGGACTG — GTGAAGCCTT 101 CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTAGCTC CATCAGTAGT 151 — TACCACTGGA ACTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC . TGGAGTGGAT 201 —TGGGCGTATC TATACCAGTG GGAGCACCAA CTACAACCCC — TCCCTCAAGA 251 GTCGAGTCAC CATGTCACTA GACACGTCCA —AGAACCAGTT CTCCCTGAAG

301 CTGAGCTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 GGGGGTCAGG TATTACTATG CTTCGGGGAG TTATTACTAC GGTCTGGACG 401 — TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCCTE — CACCAAGGGC 451 CCATCGGTCT TCCCCCTGGC —GCCCTGCTCCE —AGGAGCACCT CCGAGAGCAC 501 — AGCGGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA — CCGGTGACGG 551 —TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC 651 — CTCCAGCAAC TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA — GATCACAAGC 701 — CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG —TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 — CCCCCCAMAMA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC — CCTGAGGTCA 851 —CGTGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 — TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA — AGCCACGGGA 951 — GGAGCAGTTC AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC —ACCGTTGTGC 1001 — ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT — CTCCAACAAA 1051 —GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAMACCATC — TCCAMMACCA — AAGGGCAGCC 1101 — CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 — AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA — CCCCAGCGAC 1201 — ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 — CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTICCTC — TACAGCAAGC 1301 — TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1351 —GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 —GTCTCCGGGT — AAATGA SEQ ID NO. 38

7.20.5 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mkhlwfflll vaaprwvIsQ VOLQESGPGL —VKPSETLSLT CTVSGSSISS 51 YHWNWIROPA GKGLEWIGRI — YTSGSTNYNP — SLKSRVTMSL DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA VYYCAREGVR YYYASGSYYY GLDVWGQOGTT VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 — VLOSSGLYSLSSVWIVPSSN — FGTOTYTCNV — DHKPSNTKVD KTVERKCCVE 251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF — NSTFRVVSVL TVVHQODWLNG KEYKCKVSNK 351 GLPAPIEKTI SKTKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TQOKSLSLSPG K SEQ ID NO. 39

7.20.5 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgaggctcc ctactcaget cetaggacta ctaatactct gagtctetag 51 atccagtagg GATATTGIGA —TGACTCAGTC TCCACTCTCC — CTGCCCGTCA

101 CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 —CATGGTAATG GATACAACTA TITGGATTGG TACCTGCAGA — AGCCAGGGCA 201 — GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTIGGGTTC TAATCGGGCC — TCCGGGGTCC 251 CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 301 — AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT 351 — ACAAMACTCTC ACTTTCGGCG GAGGGACCAA GGTGGAGATC — AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 — TCTGGAACTG CCTCTGTTIGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA 501 — GGCCAMAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG .— GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 — AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA — AAGTCTACGC 651 — CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA — AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 40

7.20.5 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mripagilgl Imlwvsassa DIVMTOSPLS — LPVTPGEPAS ISCRSSOSLL 51 HGNGYNYLDW YLOKPGOSPQ LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS —“GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV —YYCMOALOTL TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK 151 SGTASVWVCLL — NNFYPREAKV QWKVDNALOS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV —THOGLSSPVT KSFNRGEC SEQ ID NO. 41

7.26.4 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atggactaga cetagagcat cettttetta gtggcageag caacaggatgc 51 ccactecCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCGAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCG —ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC — AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGCTCC 251 AGGGCAGAGT —CACCATGTCC ACAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA —GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGGTAGC —AGCTCGTCCG GAGACTACTA CTACGGTATG GACGTCTGGG 401 GCCAAGGGAC —“CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC — TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC —CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG — CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG —GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC — ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT — GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCCE TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG — GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG

851 TGGTGGTGGA —“CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC — ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA — CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TTGAGAAMMAC CATCTCCAMA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG —TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT —GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCIT CCTCTACAGC — AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC — TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1402 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 42

7.26.4 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mdwtwsilfl vaaatgahsO — VOLVOSGAEV KKPGASVKVS CEASGYTFTS 51 YGIDWVROAP — GQOGLEWMGWI SVYSGNTNYA OQKLOGRVTIMS TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT —AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGOQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS — TSESTAALGC — LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 OSSGLYSLSS — VVTVPSSNFG TOTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH — EDPEVQFNWY 301 — VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHODWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQOPE —NNYKTTPPML DSDGSFFLYS —KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTA — KSLSLSPGK SEQ ID NO. 43

7.26.4 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atgagactec ctactceaget cetaggacta ctaatactct ggatacctag 51 atccagtgcg GATATTGIGA —“TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAATCA GAGCCTCCTG 151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTTIGTTTTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTICCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC —ACCATCTGIC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT —TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAMA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 “CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 “AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAMAC ACAAAGTCTA

651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC —AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 44

7.26.4 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mripaqligl Imlwipgssa DIVMTQOTPLS LSVTPGQOPAS —ISCKSNOSLL 51 YSDGKTYLFW YLOKPGQOPPQ LLIVEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMOSIALP WTFGOGTKVE IKRTVAAPSV —FIFPPSDEQL 151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VOWKVDNALO SGNSQESVTE OQDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD —YEKHKVYACE VTHOGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 45

9.8.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 atagagttta gactgagcta gattttecte gttactettt taagagatat 51 ceagtatcCAG — GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATICAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC — ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TGGTATGATG GAAGTAATGA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 AGGGCCGATT —CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 GGGGGCGTAC CACTTTGCCT ACTGGGGCCA GGGAACCCTG GTCACCGTCT 401 CCTCAGCTTC — CACCAAGGGC CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC 451 AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCCGCCCTG GGCTGCCTGG TCAAGGACTA 501 CTTCCCCGAA — CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCC CTGACCAGCG 551 GCGTGCACAC —CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC 601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACGA AGACCTACAC 651 CTGCAACGTA — GATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGAGAGTTG 701 AGTCCAMATA — TGGTCCCCCA TGCCCATCAT GCCCAGCACC TGAGTTCCTG 751 GGGGGACCAT CAGTCTTCCT GTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACTCTCAT 801 GATCTCCCGG —ACCCCTGAGG TCACGTGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCAGG 851 AAGACCCCGA — GGTCCAGTTC AACTGGTACG TGGATGGCGT GGAGGTGCAT 901 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CGTACCGTGT 951 GGTCAGCGTC —CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGCAAGGAGT 1001 — ACAAGTGCAA — GGTCTCCAAC AAAGGCCTCC CGTCCTCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAG CCACAGGTGT ACACCCTGCC 1101 — CCCATCCCAG GAGGAGATGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG 1151 TCAMAGGCTT — CTACCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 1201 — CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGCTGG ACTCCGACGG 1251 CTCCTTCTIC — CTCTACAGCA GGCTAACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGG 1301 — AGGGGAATGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC 1351 — TACACACAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCTG GGTAAATGA

SEQ ID NO. 46

9.8.2 Sequência proteica da cadeia pesada predita 1 mefalswvfl valiavgeQ — VOLVESGGGV VOPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 YGMHWVROAP —GKGLEWVAVI WYDGSNEYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARGAY HFAYWGOGTL VIVSSASTKG PSVFPLAPCS 151 RSTSESTAAL — GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLOSSGLYSL 201 SSVVTVPSSS LGTKTYTCNY — DHKPSNTKVD — KRVESKYGPP CPSCPAPEFL 251 GGPSVFLFPP — KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSQEDPEVOF NWYVDGVEVH 301 NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHODWLN GKEYKCKVSN — KGLPSSIEKT 351 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ —EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG 401 QPENNYKTTP — PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWOQEGNVFSC SVMHEALHNH 451 YTOKSLSLSL GK SEQ ID NO. 47

9.8.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa 1 atagacatga gaagtecetae tcagetecta Qggactectae tactctaget 51 — ctcagtegea gataccagat gIGACATCCA — GATGACCCAG TCTCCATCCT 101 CCCTGTCTGC ATCTGTAGGA —“GACAGAGTCA CCATCACTTG CCAGGCGAGT 151 CAGGACATTA GCAACTATTT —AAATTGGTAT CAGCAGAAMAC É CAGGGAAAGC 201 CCCTAAGCTC — CTGATCTACG ATGCATCCAA TTTGGAMACA GGGGTCCCAT 251 CAAGGTTCAG TGGAAGTGGA TCTGGGACAG ATTTTACTIT CACCATCAGC 301 —AGCCTGCAGC CTGAAGATAT TGCAACATAT TCCTGTCAAC ACTCTGATAA 351 TCTCTCGATE — ACCTTCGGCC AGGGGACACG ACTGGAGATT AAACGAACTG 401 TGGCTGCACC ATCTGTCTTC —ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA 451 TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT — ACCCCAGAGA 501 GGCCAMAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC 551 AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC 601 AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC 651 CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA 701 ACAGGGGAGA GTGTTAGTGA SEQ ID NO. 48

9.8.2 Sequência proteica da cadeia leve kappa predita 1 mdmrvpadll glllwisva garcolQMTAQ — SPSSLSASVG DRVTITCOAS 51 QDISNYLNWY — QQAKPGKAPKL LIYDASNLET GVPSRFSGSG SGTDFTFTIS 101 SLQPEDIATY — SCQHSDNLS|!| TFGQGTRLEI KRTVAAPSVF —IFPPSDEQLK 151 SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALOS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 201 STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC

SEQ ID NO. 49 Sequência de nucleotídeos do domínio de ligação a cxB; de MAGCAM cynomolgus 1 ATGGATCGGG — GCCTGGCCCT CCTGCTGGCE GEGCTTCTGE GGCTCCTCCA s1 GCCGEGCTGC —GGCCAGTCCC TCCAGGTGAA GCCCCTGCAG GTGGAGCCCC 101 — CGGAGCCGGT GGTGGCCGTG GCCCTGGGCG CCTCTCGCCA GCTCACCTGC 151 — CGCCTGGACT GCGCGGACGG CGGGGCCACG GTGCAGTGGC GEGECCTGGA 201 — CACCAGCCTG GGCGCGGTGC AGTCGGACGC GGGCCGCAGC GTCCTCACCG 251 — TGCGCAACGC —CTCGCTGTCG GCGGCCGGGA CCCGTGTGTG CGTGGGCTCC 301 — TGCGGGGGCC GCACCTTCCA GCACACCGTG CGGCTCCTTG TGTACGCCTT 351 — CCCGGACCAG CTGACCATCT CCCCGGCAGC CCTGGTGCCT GGTGACCCGEG 401 — AGGTGGCCTG TACGGCTCAC AAAGTCACGC CTGTGGACCC CAATGCGCTC 451 TCCTICTCCCE — TGCTCCTGGG GGACCAGGAA CTGGAGGGGG CCCAGGCTCT 501 —GGGCCCGGAG GTGGAGGAGG AGGAGGAGCC CCAGGAGGAG GAGGACGTGC 551 — TGITCAGGGT GACAGAGCGC TGGCGGCTGC CGACCCTGGC AACCCCTGTC 601 — CTGCCCGCGC —TCTACTGCCA GGCCACGATG AGGCTGCCTG GCTTGGAGCT 651 — CAGCCACCGC CAGGCCATCC CGGTCCTGCA c SEQ ID NO. 50 Sequência de aminoácidos do domínio de ligação a axB7 de MAGCAM de cynomolgus 1 MDRGLALLLA GLLGLLOPGC —GQOSLQVKPLO VEPPEPVWVAV ALGASRQOLTC 51 RLDCADGGAT — VOWRGLDTSL GAVOSDAGRS VLTVRNASLS AAGTRVCVGS 101 —“CGGRTFOHTV RLLVYAFPDO LTISPAALVP — GDPEVACTAH KVTPVDPNAL 151 SFSLLLGDQE LEGAQALGPE —VEEEEEPOQEE EDVLFRVTIER WRLPTLATPV 201 LPALYCOATM — RLPGLELSHR — QAIPVLH SEQ ID NO. 51

6.22.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada 1 atggagttta gactaagcta gattttecto gttactettt taagagatat 51 ccagtatcCAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GEGAGECGTG GTCCAGCCTG 101 — GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCGT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 GATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGECAAGGGGC TGEGAGTGGGT 201 GGCAATTATA TGGTATGATG GAAGTAATAA ATATTATGCA GACTCCGTGA 251 — AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAGAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTATATT ACTGTGCGAG 351 — AGATCCCGGC TACTATTACG GTATGGACGT CTGGGGCCAA GGGACCACGG 401 — TCACCGTCTC CTCAGCTTCC ACCAAGGGCC CATCCGTCTT CCCCETGGCG 451 CCCTGCTCTA GAAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG GCTGCCTGGT

501 CAAGGACTAC TICCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCTC 551 — TGACCAGCGG CGTGCACACC TICCCAGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC 601 — TACTCCCTCAGCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAACT TOGGCACCCA 651 GACCTACACC TGCAACGTAG ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA 701 — AGACAGTTGA GCGCAAATGT TGTGTCGAGT GCCCACCGTG CCCAGCACCA 751 — CCTGTGGCAG GACCGTCAGT CTICCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC 801 CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC GTGCGTGGTE GTGGACGTGA 851 — GCCACGAAGA CCCCGAGGTC CAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCETEGAG 901 — GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCACGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACGTT 951 CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTTGTGCA CCAGGACTGG CTGAACGGCA 1001 — AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG GCCTCCCAGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC 1101 — CCTGCCCCCA TCCCGGGAGGE AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT 1151 — GCCTGGTCAA AGGCTTCTAC CCCAGCGACA TEGCCGTGGA GTGGGAGAGC 1201 AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACACCTCCCA TGCTGGACTC 1251 — CGACGGCTCC TICTICCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT 1301 — GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 1351 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AATGATAG SEQ ID NO. 52

6.22.2 Sequência de aminoácidos de cadeia pesada modificada 1 mefalswvfl valiavgcA — VOLVESGGGV VOPGRSLRLS CAASGFTFSS 51 DGMHWVROAP — GKGLEWVAII WYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDPG YYYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA 151 PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVIVSWN —SGALTSGVHT FPAVLOSSGL 201 YSLSSVVTVP SSNFGTOTYT — CNVDHKPSNT KVDKTVERKC CVECPPCPAP 251 PVAGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV —QFNWYVDGVE 301 “VHNAKTKPRE EQFNSTFRVWV SVLTVVHODW —LNGKEYKCKV — SNKGLPAPIE 351 KTISKTKGQP REPQVYTLPP — SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES 401 NGQPENNYKT —TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF —SCSVMHEALH 451 —NHYTOKSLSL SPGK SEQ ID NO. 53

6.22.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada 1 atgattaccat cacaactcat tagatttcta ctactcetaga ttccagoette 51 — cagggatGAA —ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC 101 —“CAAMMAGAGAA AGTCACCATC ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG AATTGGTAGT 151 AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT CAGTCTCCAA AACTCCTCAT 201 “CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG TTCAGTGGCA 251 GTGGATCTGG GACAGATITTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA 301 GATGCTGCAA CTTATTACTG TCATCAGAGT GGTCGTTTAC CGCTCACTTT

351 CGGCGGAGGG ACCAAGGTGG AGATCAAACG AACTGTGGCT GCACCATCTG 401 —TCTTCATCIT CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT 451 GTTGTGTGCC TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG 501 GAAGGTGGAT AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG 551 AGCAGGACAG CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG 601 “AGCAAMAGCAG ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA 651 TCAGGGCCTG AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGTT 701 AGTGA SEQ ID NO. 54

6.22.2 Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa modificada 1 mlipsqligfl llwvpasrgE IVLTASPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQRIGS 51 SLHWYQOKPD QSPKLLIKYA SOSFSGVPSR FSGSGSGTDF — TLTINSLEAE 101 DAATYYCHOS GRLPLTFGGG TKVEIKRIVA — APSVFIFPPS — DEQLKSGTAS 151 VVCLLNNFYP —NALOSGNSQE NALQOSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL 201 SKADYEKHKV YACEVTHOGL SSPVTKSFNR GEC SEQ ID NO. 55

6.34.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada 1 atagagttta gactgageta gattttecte gttactettt taagagatat 51 ccagtatCAG —GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCGTG GTCCAGCCTG 101 — GGAGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTICAC CTTCAGTAGC 151 TATGGCATGC ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGCAAGGGGC TGGAGTGGGT 201 GGCAGTTATA TCAAATGATG GAAATAATAA ATACTATGCA GACTCCGTGA 251 — AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATT CCAAAAACAC GCTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGCGCGC TGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 — AGATAGTACG GCGATAACCT ACTACTACTA CGGAATGGAC GTCTGGGGCC 401 — AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCTT CCACCAAGGG CCCATCCGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC —TAGAAGCACC TCOCGAGAGCA CAGCGGCCCT 501 — GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 — ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTICCCAGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT —“CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA 651 — CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGTAGATCACAAG CCCAGCAACA 701 — CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GITGTGTCGA GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA 801 — ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 — TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTICAA CTGGTACGTG 901 — GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT 951 — CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 — GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAMAACCAT CTCCAAMAACC AMRAGGGCAGC CCCGAGAACCE

1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC ANAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGETG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC 1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGEG 1401 TAAATGATAG SEQ ID NO. 56

6.34.2 Sequência de aminoácidos de cadeia pesada modificada 1 mefalswvfl valiravgcQ VOLVESGGGV VOPGRSLRLS mefalswvfl 51 YGMHWVROAP GKGLEWVAVI SNDGNNKYYA DSVKGRFTIS —RDNSKNTLYL 101 QMNSLRAEDT —AVYYCARDST AITYYYYGMD VWGQOGTTVTIV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLO 201 SSGLYSLSSV VIVPSSNFGT —QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV 301 —“DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV —HQODWLNGKEY KCKVSNKGLP 351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH 451 —EALHNHYTOK —SLSLSPGK SEQ ID NO. 57

6.34.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada 1 atggacatga gggtcccege tcagctecta ggagctectae tactctggct 51 cegaggtace agatatGACA — TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 — CTGCATCTGT CGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGAGT 151 ATTAGTAGCT ATTTAMATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 201 — GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCGGTTTGAA GCGTGGGGTC CCATCACGGT 251 TCAGTGGTAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGTTCTCTG 301 CAACCTGAGG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CACCAGAGTT ACAGTCTCCC 351 — ATTCACTTTC GGCCCTGGGA CCAAMAGTGGA TATCAMACGA ACTGTGGCTG 401 — CACCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 — ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 — AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 — GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 — CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAMA CACAAMAGTCT ACGCCTGCGA 651 — AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAMAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGTTA GTGA

SEQ ID NO. 58

6.34.2 Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa modificada 1 mdmrvpaqll glllwirga rcDIQMTASP — SSLSASVGDR — VTITCRASOS 51 ISSYLNWYAQA — KPGKAPKLLI YAASGLKRGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC HOSYSLPFTF GPGTKVDIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 —TASWCLLNN — FYPREAKVOW KVDNALOSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 —LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC SEQ ID NO. 59

6.67.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada 1 atgaaacacc tatagttctt cetectacta gtagcagete ccagatagat 51 cetgtecCAG GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT 101 — CGGAGACCCT GTCCCTCACC TGCACTGTCT CTGGTGACTC CATCAGTAGT 151 — AACTATTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCGCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT 201 — TGGGCGTATC TATACCAGTG GGGGCACCAA CTCCAACCCC TCCCTCAGGG 251 — GTCGAGTCAC CATGTICAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCTCTGAAA 301 — CTGAGTTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA 351 — TCGTATTACT ATAATTCGGG GACTTATTCC ATCCTTCTTT GACTACTGGG 401 — GCCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCC 451 — GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCTAGAAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 — CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTETCGT 551 — GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 — CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 — CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 — ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 — CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 — AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 — IGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 — GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 — GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 — ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAMAGGCCTC 1051 — CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 — ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 — AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 — GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 — TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 — TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 — CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 — GGGTAAATGA TAG

SEQ ID NO. 60

6.67.1 Sequência de aminoácidos de cadeia pesada modificada 1 mkhiwffll vaapnvvisQ — VOLOESGPGL VKPSETLSLT CTVSGDSISS 51 NYWSWIRQOPA —GKGLEWIGRI YTSGGTNSNP SLRGRVTMSV DTSKNQFSLK 101 LSSVTAADTA WVYYCARDRIT IIRGLIPSFEF DYWGOGTLVT VSSASTKGPS 151 —VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 OSSGLYSLSS —VVIVPSSNFG TOQOTYICNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 —PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VITCVVVDVSH EDPEVOFNWY 301 “VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQOPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 “VEWESNGOPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 —HEALHNHYTO — KSLSLSPGK SEQ ID NO. 61

6.67.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada 1 atgagtattac agacccagat cttcatttct ctattactct ggatctetag 51 tacetacagg — GACATCGTGA TGACCCAGTC TCCAGACTCC CTGGCTGTGT 101 CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGTCCAGCCA GAGTGTTTITA 151 TACAGCTCCA —ACAATAAGAA CTACTTAGCT TGGTACCAAC AGAAACCAGG 201 ACAGCCTCCT AAATTGCTCA TTTACTGGGC ATCTATACGG GAATATGGGG 251 TCCCTGACCG ATTCAGTGGC AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC 301 ATCAGCAGCC —TGCAGGCTGA AGATGTGGCA GTTTATTTCT GTCAACAATA 351 TTATAGTATT —CCTCCCCTCA CTTTCGGCGG AGGGACCAAG GTGGAGATCA 401 AACGAACTGT —GGCTGCACCA TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG 451 CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA ATAACTTCTA 501 TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC CTCCAATCGG 551 GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC 601 AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA 651 AGTCTACGCC —TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA 701 AGAGCTTCAA —CAGGGGAGAG TGTTAGTGA SEQ ID NO. 62

6.67.1 Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa modificada 1 mvigtavfis Ilwisgayg DIVMTOSPDS “LAVSLGERAT — INCKSSQOSVL 51 YSSNNKNYLA WYQQKPGQPP KLLIYWASIR EYGVPDRFSG SGSGTDFTLT 101 ISSLQOAEDVA VYFCQQYYSI PPLTFGGGTK VEIKRTVAAP SVFIFPPSDE 151 —QLKSGTASW CLLNNFYPRE AKVOWKVDNA LOSGNSQESV TEQDSKDSTY 201 SLSSTLTLSK ADYEKHKVYA — CEVTHOGLSS PVTKSFNRGE Cc

SEQ ID NO. 63

6.77.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada modificada 1 atagaactgg gactccacta gattttcctt gttactattt tagaagatat 51 ccagtgtGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GEGAGGCCTG GTCAAGCCTG 101 GGGGGTCCCT GAGACTCTCC TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC 151 TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGAAGGGGC TGEGAGTEGGET 201 CTCATCCATT AGTAGTAGTA GTAGTTACAT ATACTACGCA GACTCAGTGA 251 AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAACG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 301 CAAATGAACA GCCTGAGAGC CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGATGGGTAT AGCAGTGGCT GGTCCTACTA CTACTACTAC GGTATGGACG 401 TCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAGCTTC CACCAAGGGC 451 CCATCCGTCT TCCCCCTGGC GCCCTGCTCT AGAAGCACCT CCGAGAGCAC 501 AGCGGCCCTG GECTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACEG 551 TGTCGTGGAA CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT 601 GTCCTACAGT CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTECC 651 CTCCAGCAAC TICGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC 701 CCAGCAACAC CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG 751 TGCCCACCGT GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT 801 CCCCCCAMAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGETCA 851 CETECETGGT GETEGACGETG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC 901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA 951 GGAGCAGTTC ARNCAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC 1001 ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA 1051 GGCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC 1101 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA 1151 AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC 1201 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC 1251 CACACCTCCC ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC 1301 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC 1351 GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 1401 GTCTCCGGGT AMATGATAG SEQ ID NO. 64

6.77.1 Sequência proteica da cadeia pesada modificada 1 melginvvfl vailegvgcE VOLVESGGGL —VKPGGSLRLS CAASGFTFSS 51 YSMNWVROAP GKGLEWVSSI SSSSSYIYYA DSVKGRFTIS —RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARDGY SSGWSYYYYY GMDVWGOGTT VTVSSASTKG 151 —PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVIVSWNSGA LTSGVHTFPA 201 VLOSSGLYSL SSVVIVPSSN FGTOTYICNy DHKPSNTKVD KTVERKCCVE 251 CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK PKDTLMSRT PEVTCVVVDV —SHEDPEVOQFN 301 WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTFRVVSVL TVVHODWLNG KEYKCKVSNK

351 —GLPAPIEEKTI SKIKGOPREP OQVYILPPSRE EMITKNOVSLT CLVKGFYPSD 401 IAVEWESNGQ PENNYKTTPP MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS 451 VMHEALHNHY TOKSLSLSPG K SEQ ID NO. 65

6.77.1 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada 1 atgaggctec ctgctcaget cetaggacta ctaatactct ggatacctag 51 atccagtgca GATATTGIGA “TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 — CTCCTGGACA — GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 —CTTAGIGATG — GAAAGACCTA TITGAATTIGG TACCTGCAGA AGCCCGGCCA 201 —GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 —CAGACAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 — AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 —ACAGCTTATG TGCAGTITIG GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAACGAA 401 —CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTICC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 —AAATCTGGAA — CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 — AGAGGCCAMA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 — CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 — AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 — CGCCTGCGAA —GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 — TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 66

6.77.1 Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa modificada 1 mripaglig! Imlwipgssa DIVMTQTPLS — LSVTPGOPAS ISCKSSQSLL 51 LSDGKTYLNW. — YLOKPGQPPQ LLIVEVSNRF — SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 —SRVEAEDVGV —YSCMOSIALM SSFGQOGTKLE IKRTVAAPSV — FIFPPSDEQL 151 —KSGTASWCL .—LNNFYPREAK VOWKVDNALO SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 — SSTLTLSKAD YEKHKVYACE —VTHOGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 67

7.26.4 Sequência de nucleotídeos da cadeia leve kappa modificada 1 atgaggctcc ctgcteaget cetagageta ctaatgactct ggatacctag 51 atccagtgeg — GATATTGIGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 TATAGTGATG GAAAGACCTA TTITGITITTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGATTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAAGTAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA

401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC —CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAMATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAMA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAMAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAMAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 68

7.26.4 Sequência de aminoácidos da cadeia leve kappa modificada 1 mripaqilgl Imbwipgssa DIVMTOTPLS — LSVTPGOPAS ISCKSSOSLL 51 YSDGKTYLFW — YLOKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS — GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGV YYCMOSIALP WTFGOGTKVE IKRTVAAPSV —FIFPPSDEQL 151 —KSGTASWCL LNNFYPREAK VOWKVDNALO SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE — VTHOGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO: 148 X481.2 Sequência de aminoácidos de cadeia pesada 1 QVOLVOSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYGINWVROA PGQOGLEWMGW 51 ISVYYSGNTNY —AQKVOGRVTM TADTSTSTAY MDLRSLRSDD TAVYYCAREG 101 SSSSGDYYYG MDVWGQOGTTV TVSSASTKGP SVFPLAPCSR STSESTAALG 151 CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LOSSGLYSLS — SVVTVPSSNF 201 GTOTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCCVEC PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP 251 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS ——HEDPEVOFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN 300 STFRVSVLT VVHODWLNGK EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS — KTKGQPREPQ 351 WYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI —AVEWESNGOP . ENNYKTTPPM 401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW —.QAGNVFSCSV MHEALHNHYT — OKSLSLSPGK SEQ ID NO: 149 X481.2 Sequência de nucleotídeos da cadeia pesada 1 ATGGACTGGA CCTGGAGCAT CCTTITCITG GTGGCAGCAG CAACAGGTGC 51 —CCACTCCCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 “GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 —“AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG 401 —“GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC

501 CCTGGGCTGC —CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 —GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 —CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 —ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTIGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 —“TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 —“GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA —CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAMAAC CATCTCCAAMA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCIT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 —“TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 — GGGAAAATGA TAG SEQ ID NO: 150 X481.2 Sequência de aminoácidos de cadeia leve

1 DIVMTOTPLS — LSVTPGQPAS ISCKSSOSLL HTDGTTYLYW YLOKPGQPPQ

51 LLVEVSNRF —SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGI YYCMQNIOLP

101 WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK

151 VOWKVDNALA SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE

201 VTHOGLSSPV TKSFNRGEC

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a uma molécula de adesão celular de adressina da mucosa (MAdCAM).

2. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção possui pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) ligar-se a células humanas; (b) ter seletividade por MAJdCAM em relação a VCAM ou fibronectina de pelo menos 100 vezes mais; (c) ligar-se à MAdCAM humana com Ka igual ou inferior a 3 x 10º M;ou (d) inibir a ligação de células que expressam a1B; à MAGCAM humana.

(e) inibir o recrutamento de linfócitos para o tecido linfoide gastrointestinal.

3. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção liga-se à MAdCAM humana com K, igual ou inferior a 3 x 10º M e inibe a ligação de aB; à MAdCAM humana.

4. Anticorpo monoclonal humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica à SEQ ID NO: 148.

5. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO:

148.

6. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende entre 1 e 25 substituições de aminoácidos quando comparada à SEQ ID NO: 148.

7. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende entre 1 e 10 substituições de aminoácidos quando comparada à SEQ ID NO: 148.

8. Anticorpo monoclonal humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, ou 90% idêntica à SEQ ID NO: 150.

9. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO:

150.

10. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende entre 1 e 25 substituições de aminoácidos quando comparada à SEQ ID NO: 150.

11. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende entre 1 e 10 substituições de aminoácidos quando comparada à SEQ ID NO: 150.

12. Anticorpo monoclonal humano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica à SEQ ID NO: 148 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85% ou 90% idêntica à SEQ ID NO: 150.

13. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO: 148 e a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO: 150.

14. Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica a sequência de aminoácidos como definidos em qualquer uma das reivindicações 4 a 13.

15. Célula, caracterizada pelo fato de que produz o anticorpo monoclonal humano como definido em qualquer uma das reivindicações 1a14.

16. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 14.

17. Linhagem celular de hibridoma, caracterizada pelo fato de que produz o anticorpo monoclonal humano como definido na reivindicação 1, em que o hibridoma é selecionado a partir do grupo que consiste em 1.7.2 (Nº de Acesso ECACC 03090901), 1.8.2 (Nº de Acesso ECACC 03090902), 6.14.2 (Nº de Acesso ECACC 03090903),

6.22.2 (Nº de Acesso ECACC 03090904), 6.34.2 (Nº de Acesso ECACC 03090905), 6.67.1 (Nº de Acesso ECACC 03090906), 6.73.2 (Nº de Acesso ECACC 03090907), 6.77.1 (Nº de Acesso ECACC 03090908),

7.16.6 (Nº de Acesso ECACC 03090909), 7.20.5 (Nº de Acesso ECACC 03090910), 7.26.4 (Nº de Acesso ECACC 03090911) e 9.8.2 (Nº de Acesso ECACC 03090912).

18. Anticorpo monoclonal humano, caracterizado pelo fato de que é produzido pela linhagem celular de hibridoma como definida na reivindicação 17, ou porção de ligação ao antígeno do dito anticorpo monoclonal.

19. Anticorpo monoclonal humano de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a lisina C-terminal da cadeia pesada é clivada.

20. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1 ou 18, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção de ligação ao antígeno inibe a ligação de MAdCAM humana a ob; e em que o anticorpo ou porção deste possui pelo menos uma das seguintes propriedades: (a) competir de modo cruzado com um anticorpo de referência pela ligação à MAdCAM; (b) competir com um anticorpo de referência pela ligação à MAdJdCAM; (c) ligar-se ao mesmo epítopo de MAdCAM que um anticorpo de referência; (d) ligar-se à MAdCAM com substancialmente a mesma Ka que um anticorpo de referência; (e) ligar-se a MAdCAM com substancialmente a mesma taxa de dissociação que um anticorpo de referência; em que o anticorpo de referência é selecionado a partir do grupo que consiste em: anticorpo monoclonal 1.7.2, anticorpo monoclonal 1.8.2, anticorpo monoclional 6.14.2, anticorpo monoclional

7.26.4, anticorpo monocilonal 9.8.2, X481.2 anticorpo monocional, anticorpo monoclonal 6.22.2-mod, anticorpo monocional 6.34.2-mod, anticorpo monocional 6.67.1-mod, anticorpo monoclional 6.77.1-mod e anticorpo monoclonal 7.26.4-mod.

21. Anticorpo monoclonal que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, sem as sequências sinal;

(b) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, sem as sequências sinal;

(c) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, sem as sequências sinal;

(d) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16, sem as sequências sinal;

(e) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20, sem as sequências sinal;

(f) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, sem as sequências sinal;

(g) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28, sem as sequências sinal;

(h) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32, sem as sequências sinal;

(i) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36, sem as sequências sinal;

()) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, sem as sequências sinal;

(k) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44, sem as sequências sinal; (1) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48, sem as sequências sinal; (m) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 54, sem as sequências sinal; (n) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 58, sem as sequências sinal; (o) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 62, sem as sequências sinal; (pb) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66, sem as sequências sinal; e (a) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 68, sem as sequências sinal.

(r) um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 148 e SEQ ID NO: 150, sem a sequência sinal.

22. Anticorpo monoclional ou porção de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada do dito anticorpo ou a porção deste compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada ou em que cadeia leve compreende a CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,

6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,

6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod e 7.26.4-mod.

23. Anticorpo monoclional ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção compreende uma cadeia pesada que utiliza um gene VH 1-18 humano, um gene VH 3-15 humano, um gene VH 3-21 humano, um gene VH 3-23, um gene VH 3-30 humano, um gene VH 3- 33 humano ou um gene VH 4-4 humano.

24. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno deste de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou porção compreende uma cadeia leve que utiliza um gene VK A2 humano, um gene VK A3 humano, um gene VK A26 humano, um gene VK B3 humano, um gene VK 012 humano ou um gene VK O18 humano.

25. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada, a região variável da cadeia leve ou ambas são pelo menos 90% idênticas na sequência de aminoácidos à região ou regiões correspondentes de um anticorpo monocional selecionado a partir do grupo que consiste em: anticorpo monoclional

1.7.2, anticorpo monocilonal 1.8.2, anticorpo monoclional 6.14.2, anticorpo monocilonal 6.22.2, anticorpo monoclional 6.34.2, anticorpo monoclonal 6.67.1, anticorpo monoclonal 6.73.2, anticorpo monoclonal

6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo monocional 7.20.5, anticorpo monoclonal 7.26.4, anticorpo monocional 9.8.2, anticorpo monoclonal X481.2, anticorpo monocional 6.22.2-mod, anticorpo monoclonal 6.34.2-mod, anticorpo monocional 6.67.1-mod, anticorpo monoclonal 6.77 .1-mod e anticorpo monoclional 7.26.4-mod.

26. Anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que: (a) a cadeia pesada compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada de um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em:

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod e 7.26.4-mod (b) a cadeia leve compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,

6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.264, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77. 1-mod e 7.26.4-mod (c) o anticorpo compreende uma cadeia pesada de (a) e uma cadeia leve de (b); e (d) o anticorpo de (c) em que as sequências de aminoácidos das CDRs da cadeia pesada e da cadeia leve são selecionadas a partir do mesmo anticorpo de referência.

27. Anticorpo monoclional ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada, a cadeia leve ou ambas compreendem a sequência de aminoácidos desde o início da CDR1 até o final da CDR3 da cadeia pesada, a cadeia leve ou ambas, respectivamente, do anticorpo de referência.

28. Anticorpo monoclional ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende: (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ ID NO: 2);

1.8.2 (SEQ ID NO: 6); 6.14.2 (SEQ ID NO: 10); 6.22.2 (SEQ ID NO: 14);

6.34.2 (SEQ ID NO: 18); 6.67.1 (SEQ ID NO: 22); 6.73.2 (SEQ ID NO: 26); 6.77.1 (SEQ ID NO: 30); 7.16.6 (SEQ ID NO: 34); 7.20.5 (SEQ ID

NO: 38); 7.26.4 (SEQ ID NO: 42); e 9.8.2 (SEQ ID NO: 46); X481.2 (SEQ ID NO: 148), 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 52); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 56); 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 60); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 64); e

7.26.4-mod (SEQ ID NO: 42); (b) uma cadeia leve compreendendo a região variável da sequência de aminoácidos de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ ID NO: 4); 1.8.2 (SEQ ID NO: 8); 6.14.2 (SEQ ID NO: 12); 6.22.2 (SEQ ID NO: 16); 6.34.2 (SEQ ID NO: 20); 6.67.1 (SEQ ID NO: 24); 6.73.2 (SEQ ID NO: 28); 6.771 (SEQ ID NO: 32); 7.16.6 (SEQ ID NO: 36); 7.20.5 (SEQ ID NO: 40);

7.26.4 (SEQ ID NO: 44); e 9.8.2 (SEQ ID NO: 48); X481.2 (SEQ ID NO: 150), 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 54); 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 58);

6.67. 1-mod (SEQ ID NO: 62); 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 66); e 7.26.4- mod (SEQ ID NO: 68); ou (c) a cadeia pesada de (a) e a cadeia leve de (b).

29. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 28, caracterizado pelo fato de que é uma imunoglobulina G (IgG), uma IgM, uma IgE e uma IgA ou uma molécula de I|gD, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo biespeciífico.

30. Porção de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, 18 a 20 e 22 a 29, caracterizado pelo fato de que é um fragmento Fab, um fragmento F(ab'), um fragmento FV ou um anticorpo de cadeia única.

31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo monocilonal ou porção de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

32. Método para o tratamento de doença inflamatória em um indivíduo que o necessita, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar ao dito indivíduo o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30, em que o dito anticorpo ou porção de ligação ao antígeno inibe a ligação de MAdCAM a abr.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é doença inflamatória do trato gastrointestinal.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória do trato gastrointestinal é selecionada a partir do grupo que consiste em doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença diverticular, gastrite, doença hepática, esclerose biliar primária e colangite esclerosante.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória intestinal é doença de Crohn, colite ulcerativa ou ambas.

36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que as doenças inflamatórias são diabetes insulino- dependente e doença do enxerto contra hospedeiro.

37. Linhagem celular isolada, caracterizada pelo fato de que produz o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 oua cadeia pesada ou cadeia leve do dito anticorpo ou da dita porção deste.

38. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 17 ou 37, caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,

6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, e X481.2 ou um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos de um dos ditos anticorpos.

39. Linhagem celular de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que produz um anticorpo monoclional selecionado a partir do grupo que consiste em: 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,

6.67.1-mod, 6.77.1-mod, 7.26.4-mod, e X481.2 ou um anticorpo compreendendo as sequências de aminoácidos de um dos ditos anticorpos.

40. Molécula isolada de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia pesada, ou uma porção de ligação ao antígeno desta, ou a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 13 e 18 a 30.

41. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 40, em que o vetor compreende opcionalmente uma sequência de controle da expressão operacionalmente ligada à molécula de ácido nucleico.

42. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 41 ou a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 40.

43. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada, ou uma porção de ligação ao antígeno deste, e a molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve, ou uma porção de ligação ao antígeno desta, de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 5a17.

44. Método para produção de um anticorpo monocional humano ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação

42 ou 43 ou a linhagem celular como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 17 ou 38 sob condições adequadas e recuperar o dito anticorpo ou porção de ligação ao antígeno.

45. Animal não humano transgênico ou planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta; (b) uma molécula de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta; ou (c) ambos (a) e (b) de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 18 a 30, em que o animal não humano transgênico ou planta transgênica expressa a dita cadeia pesada ou cadeia leve ou ambas.

46. Método para isolamento de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de isolar o anticorpo do animal não humano transgênico ou planta transgênica como definido na reivindicação 45.

47. Método para o tratamento de um indivíduo que o necessita com um anticorpo humano ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente à MAdCAM e inibe a ligação a abr, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) administrar uma quantidade eficaz de uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação ao antígeno desta, uma molécula isolada de ácido nucleico que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação ao antígeno desta, ou moléculas de ácido nucleico que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada ou porções de ligação ao antígeno destas; e (b) expressar a molécula de ácido nucleico.

48. Método para produção de um anticorpo monoclional humano que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um animal não humano transgênico que seja capaz de produzir anticorpos humanos com MAdCAM, com uma porção imunogênica de MADdCAM ou com uma célula ou tecido expressando MAdCAM; e (b) permitir que o animal transgênico desenvolva uma resposta imune à MAGdCAM.

49. Anticorpo monoclonal humano, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método como definido na reivindicação 48.

50. Método para inibição da ligação de a4B; a células expressando MAdCAM humana, caracterizado pelo fato de que compreende colocar as células em contato com o anticorpo monoclional como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 ou com uma porção de ligação ao antígeno deste.

51. Método para inibição da adesão de leucócitos em células endoteliais mediada por MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende colocar as células endoteliais em contato com o anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 ou com uma porção de ligação ao antígeno deste.

52. Método para inibição da adesão, migração e infiltração de leucócitos em tecidos, mediadas por MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar as células endoteliais em contato com o anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 ou com uma porção de ligação ao antígeno deste.

53. Método para inibição da adesão celular dependente de Aa4B7/MAdCAM, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar as células expressando MAdCAM em contato com o anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e18a 30 ou com uma porção de ligação ao antígeno deste.

54. Método para inibição do recrutamento de linfócitos, mediado por MAdCAM, para o tecido linfoide gastrointestinal, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de colocar as células expressando MAdCAM em contato com o anticorpo monoclional como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e pp [sic] ou com uma porção de ligação ao antígeno deste.

55. Anticorpo monoclional ou porção de ligação ao antígeno deste que se liga especificamente a MAdCAM, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou sua porção compreende uma ou mais dentre uma sequência de aminoácidos de FR1, FR2, FR3 ou FR4 de um anticorpo monoclonal humano selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.771,

56. Anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de cadeia pesada de um anticorpo monoclional selecionado a partir do grupo que consiste em: 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6,

7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod,

6.77.1-mod e 7.26.4-mod; (b) uma sequência de aminoácidos de cadeia leve que é pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de cadeia leve de um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que consiste em:

1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1,6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5,

7.26.4, 9.8.2, X481.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67. 1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod; (c) ambos (a) e (b); ou

(d) qualquer um (a), (b) ou (c), com ou sem a sequência de sinal.

57. Método para diagnosticar um transtorno caracterizado por MAGdCAM humana solúvel circulante, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) colocar uma amostra biológica em contato com o anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 ou porção de ligação ao antígeno e (2) detectar a ligação.

58. Método para detectar inflamação em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (1) administrar ao dito indivíduo o anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno definido em qualquer uma das reivindicações 1a 13e 18 a 30, em que o dito anticorpo ou sua porção está marcado para detecção e (2) detectar a ligação.

59. Kit diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 ou porção de ligação ao antígeno.

60. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes anti-inflamatórios ou imunomoduladores adicionais.

61. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos agentes anti- inflamatórios ou imunomoduladores adicionais são selecionados a partir do grupo que consiste em: corticosteroides, aminossalicilatos, azatioprina, metotrexato, ciclosporinay FK506, IL-10, GM-CSF, rapamicina, agentes anti-TNFa e antagonistas de moléculas de adesão.

62. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do anticorpo humano como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 18 a 30 ou porção de ligação ao antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável.

63. Vacina de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a vacina é por via mucosa.

64. Método para detecção do efeito da administração de um anticorpo anti-MAdCAM inibidor ou porção de ligação ao antígeno deste a um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) administrar a um indivíduo um anticorpo monoclional humano que se liga à MAdCAM; e (d) determinar se há um aumento nos níveis de leucócitos circulantes expressando a4B7.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que os ditos leucócitos são linfócitos.

66. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o dito aumento nos níveis de leucócitos circulantes expressando a4B7 é determinado por análise FACS.

67. Anticorpo monoclional ou porção de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que se liga à MAdCAM compreendendo a região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 150 e a região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 148.

68. Anticorpo monocilonal ou fragmento de ligação ao antígeno deste, caracterizado pelo fato de que se liga à MAdCAM compreendendo uma região variável da cadeia pesada codificada pela SEQ ID NO: 149 de nucleotídeos e uma região variável da cadeia leve codificada pela SEQ ID NO: 35 de nucleotídeos.