CN101193917A - 抗-MAdCAM抗体组合物 - Google Patents
抗-MAdCAM抗体组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101193917A CN101193917A CNA2006800136236A CN200680013623A CN101193917A CN 101193917 A CN101193917 A CN 101193917A CN A2006800136236 A CNA2006800136236 A CN A2006800136236A CN 200680013623 A CN200680013623 A CN 200680013623A CN 101193917 A CN101193917 A CN 101193917A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- composition
- antibody
- madcam
- sequestrant
- approximately
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明涉及包含螯合剂的抗－MAdCAM抗体组合物，以及治疗受试者中的炎性疾病的方法。
Description
对相关专利和专利申请的交叉参考
本申请要求2005年3月8日提交的美国临时专利申请系列号60/752,712；2006年1月26日提交的美国临时专利申请系列号60/762,456；2005年3月8日提交的美国临时专利申请系列号60/659,766；2005年10月19日提交的美国临时专利申请号60/728,165的权益，其全部在此以其全文引用作为参考。
发明背景
本发明涉及抗体组合物和稳定抗体的方法，以及涉及包含抗-MAdCAM抗体的药学上可接受的组合物和减少抗-MAdCAM抗体的不稳定性的方法。
粘膜地址素细胞粘着分子(mucosal addressin cell adhesionmolecule)(MAdCAM)是细胞粘着受体的免疫球蛋白超家族的成员。尽管MAdCAM在肠免疫监督中起着生理作用，但其似乎在慢性胃肠道炎症的情况下在炎性肠病中促进过量淋巴细胞外渗。已显示，抑制α4β7 +淋巴细胞与MAdCAM结合的抗体在动物模型中减少淋巴细胞募集、组织外渗、炎症和疾病严重度。
在文献中已报导了结合MAdCAM并抑制其活性的抗体。例如，国际专利申请PCT/US 2005/000370报导了几种针对MAdCAM的人单克隆抗体，包括具有抗体7.16.6的重链和轻链氨基酸序列的抗体。产生抗7.16.6的杂交瘤细胞系于2003年9月9日保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，H.P.A.，CAMR，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，保藏号为03090909。
施用此类MAdCAM抗体的一种可能的方式是肠胃外施用。抗-MAdCAM组合物，和所有蛋白质组合物一样，需要关注组合物中的抗体随着时间的化学和物理降解。一般地，抗-MAdCAM抗体组合物必须在预期的贮存和使用条件范围内展示出可接受的化学和物理稳定性，即抗-MAdCAM抗体组合物必须具有足够的保存期并仍保持具有生物学活性。本申请公开了新的抗-MAdCAM抗体组合物，其展示出相对于以前在文献中公开的抗-MAdCAM组合物而言提高了的化学和/或物理稳定性。
发明概述
在一个方面，本发明提供了包含至少一种抗体和螯合剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一性氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM。
本发明还提供了制备稳定的液体药物组合物的方法，其包括将至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体与减少所述抗体的不稳定性的量的药学上可接受的螯合剂相混合，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约26周时，所述包含单克隆抗-MAdCAM抗体和螯合剂的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积(aggragate chromatogrampeak area)与在大约40℃的温度下贮存大约26周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2％。
本发明还提供了稳定液体药物组合物中的至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体的方法，其包括形成包含至少一种抗体和药学上可接受的螯合剂的液体组合物，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约26周时，所述包含至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体和螯合剂的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约26周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2％。
本发明还提供了治疗受试者中的炎性疾病的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：治疗有效量的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6和药学上可接受的螯合剂。
本发明还提供了用于制备经稳定的抗体的液体组合物的试剂盒，其包括：装有至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6溶液的第一容器，和装有药学上可接受的螯合剂的第二容器。
本发明还提供了制品，其包括装有至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6和药学上可接受的螯合剂的混合物的容器。
本发明还提供了包含至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围之内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围之内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450的范围之内。
本发明还提供了包含至少一种人单克隆抗-MAdCAM抗体和螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体结合人MAdCAM。
本发明还提供了包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，其中所述组合物包含浓度为至少大约10mg/ml的抗体。
附图简述
图1是图解说明在40℃下贮存长达26周后通过大小排阻层析(SEC)测得的在mAb浓度方面不同的各种受试组合物的聚集百分比(percent aggragation)的图；
图2是图解说明在40℃下贮存长达26周后通过SEC测得的在EDTA浓度方面不同的各种受试组合物的聚集百分比的图；
图3是图解说明在40℃下贮存长达26周后通过SEC测得的在PS80浓度方面不同的各种受试组合物的聚集百分比的图；
图4是图解说明在40℃下贮存长达26周后通过SEC测得的在缓冲剂种类方面不同的各种受试组合物的聚集百分比的图；
图5是图解说明在40℃下贮存长达26周后通过SEC测得的在稳定剂/张度剂种类方面不同的各种受试组合物的聚集百分比的图；
图6是图解说明在40℃下贮存长达26周后通过SEC测得的在表面活性剂种类方面不同的各种受试组合物的聚集百分比的图。
发明详述
除非另外指明，通常按照本领域内熟知的和在整个本说明书中引用和讨论的各种普通及更专业的参考文献中所描述的常规方法来进行本发明的方法和技术。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992)；和Harlow和Lane Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)。如本领域所通常施行的或如此处所描述的，按照厂商说明书进行酶促反应和纯化技术。此处描述的涉及分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的术语以及实验室程序和技术是本领域内熟知且常用的。将标准的技术用于化学合成，化学分析，药物的制备、配制和递送，以及受试者的治疗。
定义：
为了帮助读者理解下列详细的描述，提供下列定义：
如此处所用的，术语“组合物”，当其涉及抗-MAdCAM抗体时，是希望描述与包括螯合剂在内的药学上可接受的赋形剂相组合的所述抗体。例如，本发明的组合物与本领域公认的包含抗-MAdCAM抗体的组合物相比具有提高的保存期和/或稳定性。
如此处所用的，术语“抗体”是指完整的抗体或与完整的抗体竞争进行特异性结合的抗原结合部分。一般参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体和多肽，所述多肽包含足以将特异性抗原结合赋予该多肽的至少部分抗体。从N-末端至C-末端，成熟的轻链和重链可变结构域均包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))，Chothia & Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，或者Chothia等人，Nature 342：878-883(1989)的定义，将氨基酸分配给每个结构域。
如此处所用的，以号码标示的抗体具有与从具有相同号码的杂交瘤获得的单克隆抗体相同的重链和轻链氨基酸序列。例如单克隆抗体7.16.6具有与获自杂交瘤7.16.6的单克隆抗体相同的重链和轻链氨基酸序列。因此，提及抗体7.16.6时包括具有SEQ ID NO.2和4中所示的重链和轻链氨基酸序列的抗体。其还包括在重链上缺少末端赖氨酸的抗体，因为该氨基酸通常在生产过程中在部分抗体中丢失。
如此处所用的，术语“多肽”包括天然的或人工的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或多聚体。
如此处所用的，Fd片段是指由VH和CH 1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))由VH结构域组成。
术语“或其抗原结合部分”，当与术语“抗体”一起使用时，是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失但其中剩余的氨基酸序列与天然发生的序列中的相应位置相同的多肽。在一些实施方案中，片段长度至少为5、6、8或10个氨基酸。在其他实施方案中，所述片段的长度为至少14、至少20、至少50、或至少70、80、90、100、150或200个氨基酸。
如此处所用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上均质的抗体即单一抗体的群体的抗体，所述群体包括除了可少量存在的可能天然发生的突变或缺少C-末端赖氨酸之外完全相同的群体。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。此外，与常规(多克隆)抗体制剂(其通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指明了获自基本上均质的抗体群体的抗体的特征，但其不被解释为需要通过任何特定的方法来产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过最早由Kohler，等人，Nature 256：495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法(参见，例如美国专利4,816,567)来制备。例如还可使用在Clackson，等人，Nature 352：624-628(1991)和Marks，等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
如此处所用的，术语“分离的抗体”或“纯化的抗体”是指根据其起源或来历具有下列的1至4个方面的抗体：(1)不与在其天然状态下与其相伴的天然结合组分结合，(2)不含来自相同物种的其他蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不是天然发生的。因此，化学合成的或在与其所天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的抗体是与其天然结合组分相分离和纯化的。也可使用本领域熟知的蛋白纯化技术，通过分离和纯化使抗体基本上不含天然结合组分。分离的/纯化的抗体的实例包括使用MAdCAM经亲和纯化的抗-MAdCAM抗体、在体外通过杂交瘤或其他细胞系合成的抗-MAdCAM抗体和来源于转基因小鼠的人抗-MAdCAM抗体。
当至少大约60至75％的样品展示出单一种类的抗体时，抗体是“基本上纯的”、“基本上均质的”或“基本上纯化的”。所述抗体可以是单体或多聚体。基本上纯的抗体通常包含大约50％、60％、70％、80％或90％w/w的抗体样品，更通常地大约95％，和优选地超过99％的纯度。可通过许多本领域内熟知的方法来指明抗体的纯度或均质性，例如通过抗体样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在用本领域内熟知的染料对凝胶染色后显现单个多肽条带。对于某些目的，可通过使用HPLC或本领域内熟知的用于纯化的其他方法来获得更高的分辨率。
如此处所用的，术语“人抗体”希望包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可在例如CDR(特别是CDR3)中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，术语“人抗体”，如此处所用的，不希望包括这样的抗体，即其中已将来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列接枝到人构架序列上。
如此处所用的，术语“重组人抗体”希望包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染入宿主细胞的重组表达载体所表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，从对于人免疫球蛋白基因来说为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见，例如，Taylor，L.D.，等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过牵涉将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，使这样的重组人抗体经历体外诱变(或，当使用对于人Ig序列来说为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，即该序列尽管来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能不是天然地存在于人抗体种系储库内。
如此处所用的，术语“多核苷酸”是指长度为至少10个碱基的核苷酸的多聚体形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的经修饰的形式。该术语包括单链和双链形式。
如此处所用的，术语“分离的多核苷酸”是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或者其一些组合，根据其起源或来历，“分离的多核苷酸”具有下列的1至3个方面：(1)不与天然地与所述“分离的多核苷酸”一起存在的多核苷酸的全部或部分相结合，(2)有效连接至不与其天然连接的多核苷酸，或(3)不作为更大序列的部分天然发生。
如此处所用的，术语“天然发生的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”，如此处所用的，包括具有修饰的或取代的糖基团等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”在此处包括诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)等的寡核苷酸键。参见例如，LaPlanche等人，Nucl.Acids Res.14：9081(1986)；Stec等人，J.Am.Chem.Soc.106：6077(1984)；Stein等人，Nucl.Acids Res.16：3209(1988)；Zon等人，Anti-Cancer Drug Design6：539(1991)；Zon等人，Oligonucleotides and Analogues：APractical Approach，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.，OxfordUniversity Press，Oxford England(1991))；美国专利5,151,510；Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews 90：543(1990)，它们的公开内容在此引用作为参考。如果需要，寡核苷酸可包含用于检测的标记。
“有效连接的”序列包括与目的基因相邻的表达控制序列和以反式或在远距离作用以控制目的基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”，如此处所用的，是指实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当想要时，增加蛋白分泌的序列。此类序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”希望包括(最低限度)其的存在对于表达和加工来说是必需的所有组件，还可包括其的存在是有利的额外组件，例如，前导序列和融合伙伴序列。
如此处所用的，术语“载体”是指能够转运已与其相连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒，即可将额外的DNA区段连接入其中的环状双链DNA环。在一些实施方案，载体是病毒载体，其中可将额外的DNA区段连接入病毒基因组中。在一些实施方案中，载体能够在其中导入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在其他实施方案中，在导入宿主细胞后，载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可被整合入所述宿主细胞的基因组中，从而所述载体可随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。这样的载体在此处称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
如此处所用的，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指已将重组表达载体导入其中的细胞。应当题解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响的原因，某些修饰可在连续世代中发生，因此这样的后代实际上可能不与亲本细胞完全相同，但仍然包括在此处所用的术语“宿主细胞”的范围之内。
如此处所用的，术语“能够特异性地结合”是指当抗体以≤1μM，优选地≤1nM，和最优选地≤10pM的解离常数与抗原结合时。
如此处所用的，术语“选择性地杂交”是指可检测地和特异性地结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在杂交和洗涤条件下选择性地与核酸链杂交，所述条件使对非特异性核酸的可检测结合的可测得的量减少至最低。“高严紧度”或“高度严紧的”条件可用于获得本领域内已知的和此处讨论的选择性杂交条件。“高严紧度”或“高度严紧的”条件的一个实例是在42℃的杂交温度下在6X SSPE或SSC、50％甲酰胺、5X Denhardt’s试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA的杂交缓冲液中将多核苷酸和另一种多核苷酸一起温育12至16小时(其中可将一个多核苷酸固定至固体表面例如膜上)，然后使用1X SSC，0.5％SDS的洗涤缓冲液在55℃下洗涤2次。还可参见Sambrook等人，同上，pp.9.50-9.55。
术语“序列同一性百分比”在核酸序列情况下是指当就最大对应将第一个连续序列与第二个连续序列进行比较和比对时，对应残基的百分比。序列同一性比较的长度可以是至少大约9个核苷酸，通常至少大约18个核苷酸，更常见地至少大约24个核苷酸，典型地至少大约28个核苷酸，更典型地至少大约32个核苷酸，和优选地至少大约36、48或更多个核苷酸的整个一段序列。存在许多可用于测量核苷酸序列同一性的本领域内已知的不同算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其为Wisconsin Package Version 10.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，Wisconsin中的程序)来比较多核苷酸序列。包括例如程序FASTA2和FASTA 3的FASTA提供了查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson，Methods Enzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000)；Pearson，Methods Enzymol.266：227-258(1996)；Pearson，J.Mol.Biol.276：71-84(1998)；此处引用作为参考)。除非另外指明，使用特定程序或算法的缺省参数。例如，可使用FASTA以其缺省参数(字长为6，和用于评分矩阵的NOPAM因子)，或使用Gap以其缺省参数(如在GCG Version 6.1(此处引用作为参考)中所提供的)，来测定核酸序列之间的序列同一性百分比。
除非另外明确指出，否则当提及“多核苷酸”或“核酸”序列时，包括其互补序列。因此，当提及具有特定序列的核酸时，应当理解为包括具有其互补序列的其互补链。
术语“基本上的相似性”或“基本上的序列相似性”，当涉及核酸或其片段时，是指当使用合适的核苷酸插入或缺失与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，在至少大约85％，优选地至少大约90％，和更优选地至少大约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，这是通过任何熟知的序列同一性算法例如上述的FASTA、BLAST或Gap所测量的。
当应用于多肽时，术语“基本上的同一性”、“同一性百分比”或“％同一的”是指，两个肽序列，当最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT并使用缺省缺口权重(随程序一起提供的)进行比对时，共有至少70％、75％或80％的序列同一性，优选地至少90％或95％的序列同一性，和更优选地至少96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些实施方案中，不同一的残基位置的差异在于保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有有着相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的氨基酸残基替代的置换。一般地，保守性氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列相互之间的差异在于保守性置换的情况下，可向上调整序列同一性百分比以对于置换的保守性质进行校正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如，Pearson，Methods Mol.Biol.243：307-31(1994)。具有有着相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)包含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给各种置换、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸置换)的相似性的量度来匹配序列。例如，GCG包含诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，可以以缺省参数(如所述程序所指定的缺省参数)使用所述程序来确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间或者野生型蛋白质和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG Version 6.1。也可使用FASTA并采用缺省或推荐的参数来比较多肽序列，参见GCG Version 6.1。(University of Wisconsin WI)FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。(Pearson，MethodsEnzymol.183：63-98(1990)；Pearson，Methods Mol.Biol.132：185-219(2000))。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，尤其是blastp或tblastn，其使用缺省参数，如随所述程序一起提供的缺省参数。参见，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-402(1997)。就同源性进行比较的多肽序列的长度通常为至少大约16个氨基酸残基，通常至少大约20个残基，更通常地至少大约24个残基，典型地至少大约28个残基，和优选地超过大约35个残基。当搜索包含来自许多不同生物的序列的数据库时，优选地比较氨基酸序列。
“治疗有效量”是指在按剂量给药和经过必需的时间段时对于获得想要的治疗结果(其包括炎性疾病的治疗或预防)来说有效的量。要注意，剂量值可随要被减轻的病状的严重度而变化。还要理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人的专业判断，随着时间而调整特定的按剂量给药方案，以及要理解，此处所示的剂量范围仅仅是示例性的而不希望限定所要求保护的组合物的范围或实施。同样地，抗体或抗体部分的治疗有效量可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，抗体或抗体部分在个体中引起想要的反应的能力，以及想要的所述抗体组合物的施用途径而变化。治疗有效量还是这样的量，其中所述抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超过。
如此处所用的，术语“糖”是指作为多元醇的衍生物的分子类型。
如此处所用的，对于治疗目的，术语“受试者”包括任何受试者，优选地是需要治疗炎性疾病的受试者。对于预防目的，所述受试者是任何受试者，优选地是处于形成炎性疾病的风险中或易于形成炎性疾病的受试者。术语“受试者”希望包括活的生物体，例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明的特定实施方案中，所述受试者是人。
如此处所用的，术语“治疗”是指治疗性处理和预防性或防护性措施，其中目的是预防或减缓(减少)被靶向的病理性疾病或病状。需要治疗的受试者包括已患有所述疾病的受试者以及倾向于患有所述疾病的受试者或要在其中预防所述疾病的受试者。
当介绍本发明的元素或其优选的实施方案时，冠词“a”、“an”、“the”和“所述的”是希望指存在一个或多个所述元素。术语“包含”、“包括”、“含有”、“包含有”和“具有”是希望指被包括在内，并且表示除了所列出的元素外还存在其他元素。
抗-MAdCAM抗体：
根据本发明，已发现某些此处描述的单克隆抗-MAdCAM抗体的稳定性可通过在溶液中混合所述抗-MAdCAM抗体与药学上可接受的螯合剂例如乙二胺四乙酸(“EDTA”)来得到提高。
尽管不希望受理论束缚，但据信在本发明的组合物中螯合剂的存在通过减少下面的一种或多种情况的发生而有助于提高所述抗体多肽的稳定性：抗-MAdCAM抗体的聚集、片段化、氧化、冷冻/解冻不稳定性、变色和/或脱酰胺作用。本发明包括具有与以前公开的抗体组合物相比而言提高的化学和/或物理稳定性的抗-MAdCAM抗体组合物。
因此，在某些方面，本发明提供了包含药学上可接受的螯合剂例如EDTA和至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体或其抗原结合部分的液体药物组合物。在其他方面，前述包含螯合剂的液体抗-MAdCAM抗体组合物可包含其他药学上可接受赋形剂，包括但不限于一种或多种选自缓冲剂、张度剂、表面活性剂及其混合物的赋形剂。
本发明提供了包含抗-MAdCAM抗体的新型组合物。如此处所用的，短语“抗-MAdCAM抗体”是指能够结合MAdCAM多肽的任何部分的任何抗体或其任何部分，所述MAdCAM多肽可存在于任何动物内或从其分离。在某些实施方案中，所述MAdCAM多肽是人MAdCAM多肽。
用于本发明的合适的抗-MAdCAM抗体可选自多克隆抗体或单克隆抗体。在某些方面，单克隆抗-MAdCAM抗体可以是鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在其他实施方案中，单克隆抗-MAdCAM抗体是人单克隆抗-MAdCAM抗体。
在某些实施方案中，适合用于本发明的抗-MAdCAM抗体包括在2005年1月7日提交和2005年7月28日公布的国际申请号PCT/US 2005/000370中描述的那些抗-MAdCAM抗体以及用于制备它们的方法。在其他实施方案中，适合用于本发明的抗-MAdCAM抗体包括具有在国际申请号PCT/US2005/000370中命名为7.16.6的抗体的重链和轻链氨基酸序列的那些抗-MAdCAM单克隆抗体。
此外，可基于它们的重链恒定区中的氨基酸序列的差异来选择此类抗-MAdCAM抗体。例如，抗-MAdCAM抗体可选自具有“γ”类型重链的I gG类别。可通过本领域内已知的任何方法来确定抗-MAdCAM抗体的类和亚类。一般地，可使用对于特定类或亚类的抗体来说特异的抗体来确定抗体的类和亚类。此类抗体是商购可获得的。可通过ELISA或Western印迹法以及其他技术来确定类和亚类。备选地，可通过下列方式来确定类和亚类：对抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的全部或部分进行测序，将其氨基酸序列与各种类和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，从而确定所述抗体的类和亚类。
抗-MAdCAM抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他实施方案中，所述抗MAdCAM抗体是IgG，和是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。然而，正如将会意识到的，通常不希望杀死表达MAdCAM的细胞。相反地，人们通常只是想要抑制MAdCAM与其配体结合从而减缓T细胞下调。抗体杀死细胞的一个主要机制是通过补体结合和参与CDC。抗体的恒定区在抗体结合补体和参与CDC的能力方面起着重要作用。因此，人们通常选择抗体的同种型以提供补体结合的能力或不提供该能力。在本发明的情况下，一般地，如上所述，使用杀死细胞的抗体通常不是优选的。存在许多能够进行补体结合和CDC的抗体的同种型，包括但不限于下列：鼠类IgM、鼠类IgG2a、鼠类IgG2b、鼠类IgG3、人IgM、人IgG1和人IgG3。相反地，优选的不能进行补体结合和CDC的同种型包括，但不限于，人IgG2和人IgG4。除了重链序列相异外，IgG抗体在其亚类中的差异在于二硫键的数目和铰链区的长度。例如，IgG2亚类具有几个与其他亚类截然不同的差异。已知IgG2和IgG4亚类在其铰链区内具有4个二硫键，而IgG1具有2个二硫键，和IgG3具有11个二硫键。IgG2抗体的其他差异包括其减少的穿过胎盘的能力，和IgG2抗体不能结合淋巴细胞Fc受体。因此，在某些实施方案中，抗-MAdCAM抗体是亚类IgG2或IgG4。在另一个优选的实施方案中，抗-MAdCAM抗体是亚类IgG2。
在一些实施方案中，抗体是单链抗体(scFv)，其中VL和VH结构域通过合成连接体而配对形成单价分子，所述合成连接体使得它们能够以单个蛋白质链的形式产生。(Bird等人，Science 242：423-426(1988)；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。在一些实施方案中，抗体是双抗体，即，是二价抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，但使用太短而不能允许在同一条链上进行两个结构域之间的配对，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点的连接体。(参见例如，Holliger P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人，Structure 2：1121-1123(1994))。在一些实施方案中，可将来自本发明的抗体的一个或多个CDR共价或非共价地整合入分子中以使其成为特异性地结合MAdCAM的免疫粘附素。在此类实施方案中，可将所述CDR整合为更大多肽链的部分，可将其共价地连接至另一条多肽链，或可非共价地整合其。
在另一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体具有对于MAdCAM的选择性(或特异性)，所述选择性比其对于任何其他多肽的选择性至少大100倍。在一些实施方案中，抗-MAdCAM抗体不展示任何可测得的对除了MAdCAM以外的任何其他蛋白质的特异性结合。根据本说明书的教导，可使用本领域内熟知的方法来测定抗-MAdCAM抗体对于MAdCAM的选择性。例如，可使用Western印迹法、FACS、ELISA或RIA来测定选择性。因此，在一些实施方案中，单克隆抗-MAdCAM抗体能够特异性地结合MAdCAM。
在一些实施方案中，本发明的抗-MAdCAM抗体的重链的C-末端赖氨酸不存在。在本发明的各种实施方案中，抗-MAdCAM抗体的重链和轻链任选地可包含信号序列。
表2列出了编码抗-MAdCAM单克隆抗体7.16.6的重链和轻链的核酸以及对应的所预测的氨基酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。尽管编码信号多肽的DNA序列显示在序列标识符(SEQ ID NO)中，但所述抗体通常不包含信号多肽，因为该信号多肽一般在翻译后修饰过程中被除去。在本发明的各种实施方案中，抗-MAdCAM抗体的重链和轻链中的一个或两者包含信号序列(或信号序列的部分)。在本发明的其他实施方案中，抗-MAdCAM抗体的重链和轻链都不包含信号序列。
表1：
在一些实施方案中，所述核酸分子包含编码单克隆抗体7.16.6的VL氨基酸序列(SEQ ID NO：4)或其部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述部分包含至少CDR 3区。在一些实施方案中，所述核酸编码所述抗体的轻链CDR的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述部分是包含CDR1-CDR3的连续部分。
在其他实施方案中，所述核酸分子编码与抗体7.16.6的VL氨基酸序列或SEQ ID NO：4的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的VL氨基酸序列。本发明的核酸分子包括在高度严紧的条件(例如上面描述的那些)下与编码SEQ ID NO：4的轻链氨基酸序列的核酸序列杂交的核酸。
在其他实施方案中，所述核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码7.16.6的VH氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或具有保守性氨基酸突变和/或总共3个或更少的非保守性氨基酸置换的所述序列的至少部分。在各种实施方案中，所述序列编码一个或多个CDR区，优选地CDR 3区，所有3个CDR区，包含CDR1-CDR3的连续部分，或完整的VH区。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码与SEQ ID NO：2的VH氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的VH氨基酸序列。本发明的核酸分子包括在高度严紧的条件(例如上面描述的那些)下与编码SEQ ID NO：2的重链氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核酸。
在其他方面，本发明提供了包含至少一种纯化的结合MAdCAM的人抗体的液体药物组合物，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：4具有至少95％的序列同一性的轻链氨基酸序列。在其他方面，所述抗体包含与SEQ IDNO：2具有至少99％的序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：4具有至少99％的序列同一性的轻链氨基酸序列。在其他方面，所述抗体包含含有SEQ ID NO：2的可变区的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：4的可变区的轻链氨基酸序列。在其他方面，所述抗体包含含有SEQ IDNO：2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：4的轻链氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，抗-MAdCAM抗体特异性地结合人MAdCAM上的构象表位。
单克隆抗-MAdCAM抗体组合物的制备：
通常将抗-MAdCAM抗体配制为用于给受试者肠胃外施用的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物是液体组合物。在另一个实施方案中，所述药物组合物是液体组合物。
在另一个实施方案，本发明涉及包含至少一种抗-MAdCAM抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种抗-MAdCAM抗体和EDTA的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂和药学上可接受的缓冲剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含至少一种抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、EDTA和组氨酸的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、DTPA和组氨酸的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂和药学上可接受的张度剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂和海藻糖的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、EDTA和海藻糖的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、DTPA和海藻糖的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂和药学上可接受的表面活性剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、EDTA和药学上可接受的表面活性剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、DTPA和药学上可接受的表面活性剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、选自EDTA和DTPA的药学上可接受的螯合剂和聚山梨酯80的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的表面活性剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、组氨酸和药学上可接受的表面活性剂的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、组氨酸和聚山梨酯80的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的表面活性剂的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的张度剂的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体、药学上可接受的螯合剂、药学上可接受的缓冲剂、药学上可接受的表面活性剂和药学上可接受的张度剂的液体药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体和组氨酸的液体药物组合物。
术语“药物组合物”是指以例如允许活性成分的生物学活性发挥功效的形式存在的制剂。“药学上可接受的赋形剂”(媒介物、添加剂)是可适度地(即，安全地)给受试者施用以提供所使用的活性成分的有效剂量的那些赋形剂。术语“赋形剂”或“载体”在此处用于指惰性物质，其通常用作药物的稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂。如此处所用的，术语“稀释剂”是指药学上可接受的(对于给人施用是安全和无毒性的)溶剂，且可用于制备此处的液体组合物。示例性的稀释剂包括，但不限于，无菌水和抑菌性注射用水(BWFI)。
存在于液体药物组合物中的抗-MAdCAM抗体可以是在本申请书中前面描述的抗体。在一个实施方案中，所述液体药物组合物包含抗-MAdCAM抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO：4中所示的VL氨基酸序列90％、95％或99％同一的VL氨基酸序列，还包含与SEQ ID NO：2中所示的VH氨基酸序列90％、95％或99％同一的VH氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含为单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6的抗-MAdCAM抗体。
本发明的液体药物组合物中抗-MAdCAM抗体的浓度通常是至少大约0.1毫克/毫升(mg/ml)或更高、至少大约1.0mg/ml或更高、至少大约10mg/ml或更高、至少大约50mg/ml或更高、至少大约75mg/ml或更高、至少大约100mg/ml或更高或者至少大约200mg/ml或更高。在某些实施方案中，抗-MAdCAM抗体的浓度通常在大约1mg/ml至大约200mg/ml、大约2mg/ml至大约100mg/ml、大约5mg/ml至大约90mg/ml、大约10mg/ml至大约80mg/ml、大约50mg/ml至大约90mg/ml、大约60mg/ml至大约80mg/ml、大约65mg/ml至大约85mg/ml的范围内，或者为大约75mg/ml。在一个实施方案中，液体药物组合物中抗-MAdCAM4抗体的浓度在大约50mg/ml至大约100mg/ml的范围内。
如此处所用的，术语“螯合剂”通常是指可与金属离子形成至少一个键(例如，共价键、离子键或其他类型的键)的赋形剂。螯合剂通常是多齿配位体，其可在所选择的液体组合物中用作与可能促进不稳定性的物质种类相复合的稳定剂。通常，可用作螯合剂的化合物具有富含电子的官能团。合适的富含电子的官能团包括羧酸基团、羟基和氨基。这些基团在氨基多元羧酸、羟基多元羧酸、羟基氨基羧酸等中的排列导致形成具有结合金属的能力的部分。
然而，本发明希望不限于主要通过螯合剂与金属离子形成键的能力来增强抗体稳定性的螯合剂。因此，本发明希望不受特定机制(通过所述机制，螯合剂稳定本发明的组合物)的限定，并且此处称为螯合剂的赋形剂可主要通过与所述螯合剂和金属离子形成键的能力完全无关的机制来实现其增强抗体稳定性的特性。
适合用于本发明的螯合剂包括，但不限于，氨基多元羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代的甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、去铁胺(DEF)、柠檬酸、烟酰胺和脱氧胆酸盐。合适的氨基多元羧酸的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸5(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、二(氨乙基)乙二醇醚、N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、谷氨酸和天冬氨酸。合适的羟基氨基羧酸的实例包括N-羟乙基亚氨基二乙酸(HIMDA)、N，N-二-羟乙基甘氨酸(bicine)和N-(三羟甲基甲基)10甘氨酸(tricine)。合适的N-取代的甘氨酸的实例是甘氨酰甘氨酸。合适的脱氧胆酸盐的实例是脱氧胆酸钠。
用于本发明的螯合剂可以作为该化合物的游离酸或游离碱形式(例如，此处可互换使用的“EDTA”或“依地酸”)或作为对应的盐形式(例如，对应的酸加成盐或碱加成盐，例如依地酸二钠)存在。合适的酸加成盐例如包括碱金属盐(例如，钠或钾盐)、碱土金属盐(例如，钙盐)，且可使用其他弱结合金属离子来制备盐。如在本领域内已知的，盐的性质和待被中和的电荷数目依赖于存在的羧基数目和提供稳定性螯合剂时所处的pH。如在本领域内还已知的，螯合剂具有可变的与特定靶离子的结合强度。作为进一步的举例说明，EDTA的合适的盐包括依地酸二钾、依地酸二钠、依地酸钙二钠、依地酸钠、依地酸三钠和依地酸钾；以及合适的去铁胺(DEF)的盐是甲磺酸去铁胺(DFM)。
用于本发明的螯合剂可以以该化合物或相应盐的无水的、溶剂化的或水合的形式存在。当螯合剂以溶剂化的或水合的形式存在时，其可以溶剂化或水合的多种状态(包括，例如，无水、水合、二水合和三水合的形式)存在。作为进一步的举例说明，EDTA的合适水合物是EDTA二钠二水合物；以及柠檬酸的合适形式包括无水柠檬酸、柠檬酸一水合物和柠檬酸三钠二水合物。
用于本发明的抗体组合物的合适的螯合剂还包括，例如，在溶液中结合金属离子以使其不能与可获得的O2反应从而最小化或防止羟基自由基产生的那些螯合剂，所述羟基自由基是游离的从而与所述抗体反应并降解所述抗体。其他螯合剂例如DFM可降低还原型氧种类的形成，减少酸种类(例如，脱酰胺作用)的形成，和/或减少抗体片段化。在其他实施方案中，所述螯合剂可减少或防止在此处描述的组合物中的抗体聚集。此类螯合剂可减少或防止在无螯合剂保护的情况下配制的抗体的降解。
当提到螯合剂的浓度时，希望所述浓度代表所述螯合剂的游离酸或游离碱形式的摩尔浓度。例如，某些液体药物组合物中的螯合剂的浓度通常在大约0.3μM至大约50mM、大约3.0μM至大约10.0mM、大约30μM至大约5.0mM、大约0.1mM至大约1mM的范围内。在特定的实施方案中，液体药物组合物中螯合剂的浓度可以是大约3μM、大约13μM、大约27μM、大约0.27mM、大约1mM或大约2.7mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度是大约0.27mM。除非另外指出，此处所列的浓度是在环境条件(即，25℃和大气压)下的浓度。
在一个实施方案中，所述螯合剂选自EDTA、DTPA、DFM及其混合物。在另一个实施方案中，所述螯合剂是DFM。在另一个实施方案中，所述螯合剂是EDTA。在另一个实施方案中，所述螯合剂是DTPA。在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含EDTA，其量在大约0.3μM至大约50mM的范围内，和在一些实施方案中在大约0.1mM至大约1.0mM的范围内。在另一个实施方案中，所述液体组合物以大约0.27mM的量包含EDTA。
如上面所指出的，除了螯合剂以外，本发明的液体药物组合物任选地还可包含药学上可接受的缓冲剂。如此处所用的，术语“缓冲剂”是指允许液体抗体组合物能够抵抗pH的变化的所加入的组合物。在某些实施方案中，所加入的缓冲剂通过其酸-碱共轭组分的作用而允许液体抗体组合物能够抵抗pH的变化。
合适的缓冲剂的实例包括，但不限于，乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂，包括但不限于诸如氨基酸(例如，组氨酸)、乙酸、磷酸和磷酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸、马来酸、甘氨酸、乳酸盐、乳酸、抗坏血酸、咪唑类、碳酸和碳酸氢盐、琥珀酸、苯甲酸钠和苯甲酸盐、葡萄糖酸盐、依地酸盐(EDTA)、乙酸盐、苹果酸盐、咪唑、tris、磷酸盐及其混合物的缓冲剂。
在一个实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸。用于制备本发明的液体药物组合物的组氨酸起始材料可以以不同的形式存在。例如，所述组氨酸可以是组氨酸的对映体(例如，L-或D-对映体)或外消旋形式、组氨酸的游离酸或游离碱形式、组氨酸的盐形式(例如，单盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或乙酸盐)、组氨酸的溶剂化形式、组氨酸的水合形式(例如，一水合物)或组氨酸的无水形式。用于制备液体药物组合物的组氨酸碱和/或盐的纯度一般可以是至少大约98％、至少大约99％或至少大约99.5％。如此处所用的，在组氨酸的情况下，术语“纯度”是指组氨酸的化学纯度，这是本领域中所理解的，例如TheMerck Index，第13版，O′Neil等人ed.(Merck & Co.，2001)中所描述的。
当提到缓冲剂的浓度时，希望所述浓度代表所述缓冲剂的游离酸或游离碱形式的摩尔浓度。例如，当存在于某些液体药物组合物中时，缓冲剂的浓度可在大约0.1mM至大约100mM的范围内。在一个实施方案中，缓冲剂的浓度是大约1mM至大约50mM。在另一个实施方案中，缓冲剂的浓度是大约5mM至大约20mM。在多种实施方案中，缓冲剂的浓度是大约1mM、大约5mM、大约10mM、大约15mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约35mM、大约40mM、大约45mM、大约50mM、大约55mM、大约60mM、大约65mM、大约70mM、大约75mM、大约80mM、大约85mM、大约90mM、大约95mM或大约100mM。在一个实施方案中，药物组合物中组氨酸的浓度是大约10mM。在一个实施方案中，所述药物组合物包含大约10mM的L组氨酸(以碱形式存在)。
一般地，使用缓冲剂以在液体药物组合物中保持可接受的pH水平(所述pH水平可影响抗体的稳定性)。液体药物组合物通常被缓冲至使pH保持在大约4至8、大约4.5至大约7或大约5.2至大约5.8的范围内。上述pH的范围间隔也被认为是本发明的部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。在一个实施方案中，液体药物组合物被缓冲至使pH保持在大约5.5。
如上面所指出的，除了螯合剂以外，本发明的液体药物组合物可选地还可包含药学上可接受的张度剂。如此处所用的，术语“张度剂”是指可调节液体抗体组合物的渗透压的赋形剂。在某些实施方案中，张度剂可将液体抗体组合物的渗透压调节至等渗状态，这样所述抗体组合物与受试者的身体组织的细胞在生理上相容。在其他实施方案中，“张度剂”可有助于此处描述的任何抗-MAdCAM抗体的稳定性的提高。“等渗”组合物是具有与人血液基本上相同的渗透压的组合物。等渗组合物通常具有大约250至350m0sm的渗透压。术语“低渗”描述了所具有的渗透压低于人血的渗透压的组合物。相应地，术语“高渗”用于描述所具有的渗透压高于人血的渗透压的组合物。可使用例如蒸汽压或冰冻型渗透压计(ice-freezing type osmometer)来测量等渗性。
用于制备本发明的液体药物组合物的张度剂可以以不同形式存在。例如，张度剂可以以下列形式存在：对映体形式(例如，L-或D-对映体)或外消旋形式；异构体例如α或β，包括α，α或β，β，或α，β或β，α；游离酸或游离碱形式；水合物形式(例如，一水合物)；或无水形式。
在一个实施方案中，张度剂是糖。糖类通常称为碳水化合物，并可包含不同量的糖(糖类)单元，例如，单糖、二糖和多糖。适合在本发明中用作张度剂的糖类包括，但不限于，选自果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、出芽短梗霉聚糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉、水溶性葡聚糖和其混合物的糖。在一个实施方案中，张度剂是蔗糖。
在另一个实施方案中，张度剂是多元醇。如此处所用的，术语“多元醇”是指具有多个羟基的赋形剂，并且包括糖(还原性和非还原性糖)、糖醇和糖酸。在一个实施方案中，所述多元醇具有低于大约600kD(例如，在大约120至大约400kD的范围内)的分子量。“还原性糖”是包含可还原金属离子或与蛋白中的赖氨酸或其他氨基酸共价反应的半缩醛基团的糖，而“非还原性糖”是不具有还原性糖的这些性质的糖。适合在本发明中用作张度剂的多元醇包括，但不限于，选自甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、赤藓糖醇、isomalt、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、甘油、拉克替醇、丙二醇、聚乙二醇、肌醇和其混合物的多元醇。在一个实施方案中，张度剂是选自蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖和其混合物的非还原性糖。在另一个实施方案中，张度剂是选自海藻糖和蔗糖以及其混合物的非还原性糖。在另一个实施方案中，张度剂是甘露醇。在另一个实施方案中，张度剂是D-甘露醇。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖。在另一个实施方案中，张度剂是αα-海藻糖二水合物。在另一个实施方案中，张度剂是盐，例如氯化钠。
当存在于液体药物组合物中时，张度剂的浓度可在大约1.0mM至大约600mM、大约10mM至大约400mM或大约100mM至大约300mM的范围内。在一个实施方案中，张度剂的浓度在大约200mM至大约250mM的范围内。在另一个实施方案中，液体药物组合物中的张度剂的浓度是大约222mM、大约238mM或大约247mM。
在另一个实施方案中，张度剂是甘露醇，并且以247mM的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖，并且以222mM的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖，并且以238mM的浓度存在于液体药物组合物中。
如上面所指出的，除了螯合剂以外，本发明的液体药物组合物可选地还可包含药学上可接受的表面活性剂。如此处所用的，术语“表面活性剂”是指可改变液体抗体组合物的表面张力的赋形剂。在某些实施方案中，所述表面活性剂减少液体抗体组合物的表面张力。在其他实施方案中，“表面活性剂”可有助于此处描述的任何抗-MAdCAM抗体的稳定性的提高。例如，表面活性剂可减少配制的抗体的聚集和/或最小化组合物中的颗粒的形成和/或减少吸附。表面活性剂还可在冷冻/解冻循环期间和之后提高抗体的稳定性。
合适的表面活性剂包括聚山梨酯表面活性剂、泊洛沙姆18、triton表面活性剂例如Triton
聚山梨酯表面活性剂例如Tween
和Tween 十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、辛基糖苷钠(sodium octyl glycoside)、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基(linoleyl)-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺丙基-甜菜碱、椰油酰胺丙基-甜菜碱、亚油酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜碱、palmidopropyl-甜菜碱、异硬脂酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-二甲胺、palmidopropyl-二甲胺、异硬脂酰胺丙基-二甲胺、甲基椰油基牛磺酸钠、甲基油基牛磺酸二钠、氯化二羟丙基peg5 linoleammonium、聚乙二醇、聚丙二醇和其混合物。
在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯表面活性剂，所述聚山梨酯表面活性剂包括至少一种选自聚山梨酯20、聚山梨酯21、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯61、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、聚山梨酯85和其混合物的赋形剂。在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含聚山梨酯80。
当存在于液体药物组合物中时，表面活性剂的浓度可在大约0.005mM至大约10mM、大约0.007mM至大约5.0mM或大约0.01mM至大约1.0mM的范围内。在另一个实施方案中，表面活性剂的浓度是大约0.05mM至大约1.0mM。在另一个实施方案中，液体药物组合物包含大约0.30mM的聚山梨酯80。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和螯合剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和螯合剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，并且其中所述组合物基本上不含氯离子或乙酸根离子或两者。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种人单克隆抗-MAdCAM抗体和螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体结合人MAdCAM。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种人单克隆抗-MAdCAM抗体和螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体结合人MAdCAM，并且其中所述组合物基本上不含氯离子或乙酸根离子或两者。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度为至少大约50mg/ml、至少大约60mg/ml、至少大约70mg/ml、至少大约80mg/ml、至少大约90mg/ml或至少大约100mg/ml的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度在大约10mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度在大约15mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度在大约20mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度在大约50mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度在大约100mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度在大约65mg/ml至大约85mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM，和其中所述组合物包含浓度为大约75mg/ml的抗体。
在一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.01mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约0.3μM至大约50mM的螯合剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约30μM至大约5.0mM的螯合剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约0.27mM的螯合剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约0.3μM至大约50mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约30μM至大约10.0mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约0.1mM至大约1.0mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约0.27mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约30μM至大约5.0mM的DTPA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约30μM至大约5.0mM的去铁胺。
在一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.01mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，和大约1mM至大约100mM的组氨酸。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的螯合剂，和大约1mM至大约100mM的组氨酸。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的螯合剂，和大约10mM至大约400mM的海藻糖。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的螯合剂，大约10mM至大约400mM的海藻糖，和大约1mM至大约100mM的组氨酸。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的螯合剂，大约10mM至大约400mM的海藻糖，大约1mM至大约100mM的组氨酸，和大约0.005mM至大约10mM的聚山梨酯80。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的EDTA，大约10mM至大约400mM的张度剂，大约1mM至大约100mM的缓冲剂，和大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的EDTA，大约10mM至大约400mM的张度剂，大约1mM至大约100mM的组氨酸，和大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约30μM至大约5.0mM的EDTA，大约10mM至大约400mM的海藻糖，大约1mM至大约100mM的组氨酸，和大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂。
在本发明的某些方面，所述液体抗-MAdCAM抗体组合物包含大约10mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约1mM至大约100mM的组氨酸，大约0.005mM至大约10mM的聚山梨酯80，大约30μM至大约5.0mM的EDTA，和大约10mM至大约400mM的海藻糖。
在本发明的其他方面，所述液体抗-MAdCAM抗体组合物包含大约50mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约5mM至大约30mM的组氨酸，大约0.01mM至大约1.0mM的聚山梨酯80，大约30μM至大约5.0mM的EDTA，和大约100mM至大约300mM的海藻糖。
在本发明的其他方面，所述液体抗-MAdCAM抗体组合物包含大约65mg/ml至大约85mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约5mM至大约15mM的组氨酸，大约0.05mM至大约0.5mM的聚山梨酯80，大约0.1mM至大约1mM的EDTA，和大约200mM至大约250mM的海藻糖。
在本发明的其他方面，所述液体抗-MAdCAM抗体组合物包含大约75mg/ml的单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6，大约20mM的组氨酸，大约0.3mM的聚山梨酯80，大约0.27mM的EDTA，和大约238mM的海藻糖。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体和药学上可接受的螯合剂的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450、大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约3的范围之内，或为大约1.9。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体7.16.6和药学上可接受的螯合剂的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450、大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约3的范围之内，或为大约1.9。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体7.16.6、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约1mM至大约100mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450、大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体7.16.6、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约5mM至大约30mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约3的范围之内，或为大约1.9。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体7.16.6、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约5mM至大约20mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约3的范围之内，或为大约1.9。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体7.16.6、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约5mM至大约20mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约3的范围之内，或为大约1.9。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗-MAdCAM抗体7.16.6、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度为大约20mM，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约3的范围之内，或为大约1.9。
产生抗-MAdCAM抗体的方法和抗体生成细胞系：
可通过使用转基因小鼠来制备本发明的抗体，所述转基因小鼠具有插入的产生人抗体的基因组的基本部分，但所述小鼠被使得在产生内源性鼠类抗体方面是缺陷的。因此，这样的小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，且在产生鼠类免疫球蛋白分子和抗体方面是缺陷的。下面描述用于获得这样的小鼠的技术。
可能产生转基因动物(例如，小鼠)，其能够在免疫接种后在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的完全储库(repertoire)。然而，特别地，在国际申请号PCT/US 2005/000370中公开了转基因产生小鼠和来源于其的抗体的一个实施方案。通过使用该技术，可制备结合MAdCAM的抗体和产生此类抗体的杂交瘤。
人抗体避免了某些与具有鼠类或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的问题。此类鼠类或大鼠来源的蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致接受了此类抗体的施用的受试者产生针对所述抗体的免疫应答。
例如，已描述了，嵌合和种系突变型小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列(array)转移入这样的种系突变型小鼠中将导致在抗原(例如，MAdCAM)攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等人，Nature 355：258(1992)。人抗体还可来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，J.MoL Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech 14：309(1996))。
在一些实施方案中，可通过免疫接种非人转基因动物例如XENOMOUSETM小鼠来产生人抗-MAdCAM抗体，所述小鼠的基因组包含人免疫球蛋白基因，这样所述重组小鼠能够产生人抗体。XENOMOUSETM小鼠是经工程改造的小鼠品系，其包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大片段，并且在小鼠抗体产生方面是缺陷的。XENOMOUSETM小鼠产生完全人的抗体的成人样(adult-like)人储库，和产生抗原特异性人抗体。在一些实施方案中，所述的XENOMOUSETM小鼠通过导入人重链基因座和κ轻链基因座的百万碱基大小的种系构型(germlineconfiguration)酵母人工染色体(YAC)片段而包含大约80％的人抗体V基因储库。在其他实施方案中，XENOMOUSETM小鼠还包含大约所有的λ轻链基因座。参见，例如，Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。还可参见WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、WO96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00/09560和WO 00/037504。
在一些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人动物是具有人免疫球蛋白“微小基因座(minliocus)”的动物。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的单独基因来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定结构域和第二恒定结构域(优选地，γ恒定结构域)形成入用于插入动物的构建体中。除了其他以外，在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中描述了该方法。
因此，在一些实施方案中，可通过用MAdCAM抗原免疫接种非人动物来产生人抗体，所述非人动物在其基因组中包含一些或所有人免疫球蛋白重链和轻链基因座。
在一些实施方案中，所述MAdCAM抗原是分离的和/或纯化的MAdCAM。在优选实施方案中，所述MAdCAM抗原是人MAdCAM。在一些实施方案中，所述MAdCAM抗原是MAdCAM的片段。在一些实施方案中，所述MAdCAM片段包含MAdCAM的至少一个表位。在其他实施方案中，所述MAdCAM抗原是在其表面上表达或过表达MAdCAM或其免疫原性片段的细胞。在其他实施方案中，所述MAdCAM抗原是MAdCAM融合蛋白。可使用已知的技术从天然来源纯化MAdCAM。此外，可商购获得重组MAdCAM蛋白。
在优选实施方案中，所述非人动物是XENOMOUSETM动物(AbgenixInc.，Fremont，CA)。可使用的另一种非人动物是由Medarex(Medarex，Inc.，Princeton，NJ)生产的转基因小鼠。
可通过本领域已知的任何方法来免疫接种动物。参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，New York：ColdSpring Harbor Press，1990。用于免疫接种非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Harlow和Lane(同上)，和美国专利5,994,619。在优选实施方案中，将MAdCAM抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答。示例性的佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此类佐剂可通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护其免于快速分散，或者它们可包含刺激宿主分泌因子的物质，所述因子是巨噬细胞和免疫系统的其他组分的趋化剂。优选地，如果正在施用多肽，那么免疫接种方案可在数周的时期内包括两次或更多次所述多肽的施用。
在用MAdCAM抗原免疫接种动物后，可从所述动物获得抗体和/或抗体产生细胞。在一些实施方案中，通过放血或处死动物而从动物获得包含抗-MAdCAM抗体的血清。因为其获自所述动物，所以可使用该血清，可从该血清获得免疫球蛋白级分，或可从该血清纯化出抗-MAdCAM抗体。
在一些实施方案中，从分离自经免疫接种的动物的细胞制备抗体产生性永生化细胞系。在免疫接种后，处死动物，然后使淋巴节和/或脾B细胞永生化。使细胞永生化的方法包括，但不限于，用癌基因转染细胞，用致癌病毒感染细胞，在选择永生化细胞的条件下培养细胞，使细胞接受致癌或致突变化合物，将细胞与永生化细胞例如骨骼瘤细胞融合，和使肿瘤抑制基因失活。参见，例如，Harlow和Lane(同上)。在优选实施方案中，经免疫接种的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，并将脾B细胞融合至来自与该非人动物相同的物种的骨髓瘤细胞系。在更优选的实施方案中，所述经免疫接种的动物是XENOMOUSETM动物，和所述骨髓瘤细胞系是非分泌型小鼠骨髓瘤。如果采用与骨髓瘤细胞融合，那么所述骨髓瘤细胞优选地不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型细胞系)。使用MAdCAM、其部分或表达MAdCAM的细胞来筛选永生化细胞。在优选实施方案，使用酶联免疫测定法(ELISA)或放射免疫测定法进行初步筛选。在WO 00/37504中提供了ELISA筛选的实例。
选择、克隆抗-MAdCAM抗体产生细胞例如杂交瘤，并就想要的特征(包括强势生长、高抗体产量和想要的抗体特征，如下面进一步讨论的)来进一步进行筛选。可在同系动物中，在缺少免疫系统的动物例如裸鼠中于体内扩增杂交瘤，或者在细胞培养中于体外扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法对于本领域普通技术人员来说是熟知的。
如将会意识到的，可在除了杂交瘤细胞系以外的细胞系中重组表达本发明的抗体。可将编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的核酸序列用于转化合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。
本发明还包括编码抗-MAdCAM抗体的核酸分子。在一些实施方案中，不同的核酸分子编码抗-MAdCAM免疫球蛋白的重链和轻链。在其他实施方案中，同一个核酸分子编码抗-MAdCAM免疫球蛋白的重链和轻链。在一个实施方案中，所述核酸编码本发明的抗-MAdCAM抗体。
可从产生抗-MAdCAM抗体的任何来源分离编码该抗体的重链或完整轻链或者其部分的核酸分子。在各种不同的实施方案中，从分离自用抗-MAdCAM免疫接种的动物的B细胞中或从来源于此类表达抗-MAdCAM抗体的B细胞的永生化细胞中分离出所述核酸分子。分离编码抗体的mRNA的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Sambrook，等人，Molecular Cloning，第3版，第3卷(1989)。所述mRNA可用于产生在抗体基因的聚合酶链式反应(PCR)或cDNA克隆中使用的cDNA。在优选实施方案中，从杂交瘤中分离所述核酸分子，所述杂交瘤具有来自非人转基因动物的人免疫球蛋白产生细胞作为其融合伙伴之一。在更加优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白产生细胞分离自XENOMOUSETM动物。在另一个实施方案中，所述人免疫球蛋白产生细胞来自上述的非人、非小鼠转基因动物。在另一个实施方案中，所述核酸分离自非人、非转基因动物。可将分离自非人动物的所述核酸分子用于例如人源化抗体。
在一些实施方案中，编码本发明的抗-MAdCAM抗体的重链的核酸可包含编码本发明的VH结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列按阅读框架连接至编码来自任何来源的重链恒定结构域的核苷酸序列。类似地，编码本发明的抗-MAdCAM抗体的轻链的核酸分子可包含编码本发明的VL结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列按阅读框架连接至编码来自任何来源的轻链恒定结构域的核苷酸序列。
在本发明的进一步方面，将编码重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的核酸分子“转变”成全长抗体基因。在一个实施方案中，通过下述方式来将编码VH或VL结构域的核酸分子转变成全长抗体基因：将编码VH或VL结构域的核酸分子插入已分别编码重链恒定结构域(CH)或轻链恒定结构域(CL)的表达载体中，从而VH区段有效连接至载体内的CH区段，和VL区段有效连接至载体内的CL区段。在另一个实施方案中，通过下述方式来将编码VH和/或VL结构域的核酸分子转变成全长抗体基因：使用标准的分子生物学技术将编码VH和/或VL结构域的核酸分子连接例如连结至编码CH和/或CL结构域的核酸分子。人重链和轻链免疫球蛋白恒定结构域基因的核酸序列在本领域内是已知的。参见，例如，Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publ.No.91-3242，1991。然后，可从已导入了编码全长重链和/或轻链的核酸分子的细胞中表达所述编码全长重链和/或轻链的核酸，并分离抗-MAdCAM抗体。
本发明还提供了包含编码本发明抗-MAdCAM抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子的载体。本发明还提供了包含编码此类抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子的载体。本发明进一步提供了包含编码融合蛋白、经修饰的抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。
在一些实施方案中，通过下列方式来表达本发明的抗-MAdCAM抗体或抗原结合部分：将如上获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中以使所述基因有效连接至必需的表达控制序列，例如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒，逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，植物病毒例如花椰菜花叶病毒，烟草花叶病毒，粘粒，YAC，EBV来源的附加体等。将所述抗体基因连接入载体，以使载体内的转录和翻译控制序列发挥所想要的其调节所述抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入至分开的载体中。在优选实施方案中，将两个基因都插入同一个的表达载体中。通过标准的方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点，或如果没有限制性位点存在则进行平端连接)将抗体基因插入表达载体中。
方便的载体是编码在功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有经改造的合适的限制性位点，从而使任何VH或VL序列可容易地插入和表达，正如上面所述的。在此类载体中，通常在插入的J区域中的剪接供体位点和位于人C结构域之前的剪接接纳体位点之间发生剪接，并且剪接还可在位于人CH外显示子内的剪接区域处发生。多腺苷酸化和转录终止在所述编码区下游的天然染色体位置处发生。所述重组表达载体还可编码有助于抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆入载体中，以使信号肽按阅读框架连接至免疫球蛋白的氨基末端。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了所述抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带在宿主细胞中控制所述抗体链基因表达的调控序列。本领域技术人员将意识到，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可依赖于例如下列因素：待转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白质的表达水平等。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括，指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒(例如逆转录病毒LTR)、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))的启动子和/或增强子，多瘤和强的哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白的启动子。关于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参见例如，美国专利5,168,062、美国专利4,510,245和美国专利4,968,615。用于在植物中表达抗体的方法，包括启动子和载体以及植物转化的描述，在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利6,517,529，此处引用作为参考。在细菌细胞或真菌细胞例如酵母细胞中表达多肽的方法在本领域内也是熟知的。
除了所述抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可携带额外的序列，例如在宿主细胞中调控载体的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。所述选择标记基因有助于选择出其中已导入了所述载体的宿主细胞(参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因为其中已导入了所述载体的宿主细胞提供对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于使用氨甲蝶呤的dhfr-宿主细胞选择/扩增)、新霉素抗性基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。
可使用编码抗-MAdCAM抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体来转化合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。可通过下列方式采用转基因方法来产生本发明的抗体：产生对于目的免疫球蛋白重链和轻链序列来说为转基因的哺乳动物或植物，并从中以可回收的形式产生抗体。
可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法(包括，例如将多核苷酸包装入病毒(或包装入病毒载体)，并用病毒(或载体)转导宿主细胞)或通过本领域内已知的转染方法(如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455中例举的方法)来进行转化。使用的转化方法依赖于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法在本领域内是熟知的，并且包括，但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、将多核苷酸包囊到脂质体中、肽辍合物、树枝状聚合物和直接将DNA显微注射入细胞核中。
可获得作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的，其包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)，和许多其他细胞系。非哺乳动物细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和植物，它们也可用于表达重组抗体。为了防止由于非人糖基化而导致的免疫原性、药物代谢动力学和/或效应器功能的改变，对抗体的CH2结构域进行位点定向诱变以除去糖基化可能是优选的。通过确定哪种系统产生最高表达水平和产生具有组成型MAdCAM结合特性的抗体来选择表达方法。
此外，可使用许多已知的技术来增强从生产细胞系中表达本发明的抗体(或来源于其的其他部分)。例如，谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是用于在某些条件下增强表达的常用方法。可使用常规技术例如限度稀释克隆法和微滴技术来鉴定高表达性细胞克隆。在欧洲专利0216846、0256055和0323997以及欧洲专利申请89303964.4中完整或部分地讨论了谷氨酰胺合成酶系统。
关于在哺乳动物中的转基因产生，还可以在山羊、牛或其他哺乳动物中产生抗体，并从它们的奶中回收抗体。参见，例如，美国专利5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
可从相关的细胞材料中纯化和/或分离在上述细胞中表达的抗-MAdCAM抗体。抗体可存在于完整的细胞中、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。为了除去其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞的核酸或蛋白质，通过标准技术进行纯化，所述标准技术包括碱/SDS处理、柱层析和本领域内熟知的其他方法。参见Ausubel，F.，等人，ed.Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
在本发明中，由不同细胞系或在转基因动物中表达的本发明的抗-MAdCAM抗体可能相互之间将会具有不同的糖基化模式。然而，所有由此处提供的核酸和氨基酸所编码的抗-MAdCAM抗体被认为是本发明的一部分，无论其糖基化模式或者其修饰或缺失如何。
如此处所用的，术语“糖基化”是指共价附着至抗体的糖单元的模式。当说道此处的抗-MAdCAM抗体具有特定的糖基化模式时，这是表示大部分所提及的抗-MAdCAM抗体具有该特定的糖基化模式。在其他方面，当说道此处的抗-MAdCAM抗体具有特定的糖基化模式时，这是表示大于或等于50％、75％、90％、95％、99％或100％的所提及的抗-MAdCAM抗体具有该特定的糖基化模式。
本发明的抗-MAdCAM抗体还包括其糖基化变体(例如，通过缺失、插入或置换合适的氨基酸残基来插入糖基化位点或删除任何糖基化位点而产生的)。为了本发明的目的，抗-MAdCAM抗体可是糖基化的或非糖基化的。当抗-MAdCAM抗体是糖基化的时候，其可具有任何可能的糖基化模式。此外，一个抗体内的每条重链可具有相同的糖基化模式或两条重链可具有不同的糖基化模式。
施用途径和按剂量给药：
本发明的组合物可以以液体溶液形式(例如，可注射的和可输注的溶液)存在。优选形式依赖于所希望的施用方式和治疗性应用。通常的优选的组合物以可注射的或可输注的溶液形式存在，例如与用于人的被动免疫接种的组合物相似的组合物。优选的施用方式是以无菌注射液或油质(olagenous)悬浮液的形式经肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、腹膜内、肌内和胸骨内)施用或通过输注技术施用。正如本领域技术人员将会认识到的，施用的途径和/或方式将依赖于想要的结果而变化。在优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一个优选实施方案中，通过肌内、皮下或皮内注射施用所述抗体。
治疗性组合物在生产和贮存的条件下通常是无菌的和稳定的。
可将组合物配制为溶液、微乳液、分散体或脂质体。可通过将抗-MAdCAM抗体以需要的量与上面例举的成分中的一种或其组合一起(如果需要)掺入合适的稀释剂中，然后进行灭菌(例如，过滤灭菌)，来制备可注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物包含基础分散介质和所需要的来自上面例举的那些的其他成分。可按照已知的技术使用那些合适的分散剂、湿润剂和悬浮剂或其他可接受的试剂来配制此类悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(例如1，3-丁二醇)中的无菌可注射溶液或悬浮液。其中，可使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，n-3多不饱和脂肪酸可用于制备可注射液。
在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述干燥方法从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外的想要的成分的粉末。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需颗粒大小，和通过使用表面活性剂，来保持液体的适当的流动性。
可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，或者通过将所述组合物配制成延长吸收形式例如贮库制剂(depots)、脂质体、聚合物微球、聚合物凝胶和植入物，来产生可注射组合物的延长吸收。
用于施用此处描述的抗体的其他方法包括直接将药物释放入受试者皮肤的皮肤贴剂。此类贴剂可包含在可选地经缓冲的液体溶液中的、溶解和/或分散在粘合剂中的、或分散在聚合物中的本发明的抗体。
施用此处描述的抗体的其他方法包括用于眼睛的滴眼液。
可施用所述抗体一次，但更优选地施用多次。例如，可从每天一次至每6个月或更长时间一次施用所述抗体。可按方案例如每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天1次、每周1次、每2周1次、每1个月1次、每2个月1次、每3个月1次和每6个月1次来进行施用。
还可通过微型泵连续施用所述抗体。可施用所述抗体1次、至少2次，或施用至少一段时间直至疾病被治疗、减轻或治愈。通常将抗体作为上面描述的药物组合物的一部分进行施用。
本发明的组合物可包含治疗有效量或预防有效量的本发明的抗体或抗原结合部分。在制备所述组合物中，可通过例如考虑想要的剂量体积和施用方式，待治疗的病状的性质和严重度，以及受试者的年龄和身材大小，来确定存在于组合物中的抗-MAdCAM抗体的治疗有效量。
给受试者施用的本发明的药物组合物的示例性、非限定性剂量范围为大约0.01mg/kg至大约200mg/kg(以每千克(kg)受试者体重所施用的抗-MAdCAM抗体的毫克(mg)数表示)、大约0.1mg/kg至大约100mg/kg、大约1.0mg/kg至大约50mg/kg、大约5.0mg/kg至大约20mg/kg、或大约15mg/kg。为了本发明的目的，平均人受试者体重为大约70kg。
对于此处所述的任何浓度的范围区间，例如，大约6-94mg/kg，也被希望是本发明的部分。例如，意欲将使用任何所述值的组合作为上限和/或下限的值的范围包括在本发明中。
还可通过在一段时间内给受试者施用几个分剂量来调整按剂量给药方案从而提供最佳的想要的应答(例如，治疗性或预防性应答)，或者可根据治疗状况的紧迫性按比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量统一，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的。
此处所用的剂量单位形式是指适合用作待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上分开的单位；每个单位包含经计算而产生想要的治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规范由下列因素规定并直接依赖于下列因素：(a)抗-MAdCAM抗体或部分的独特特征和要获得的特定治疗或预防效果，和(b)在配制这样的用于治疗个体敏感性的抗体的领域中固有的限制。
可将本发明的液体组合物配制为单位剂型。例如，每瓶单位剂量可包含1至1000毫升(ml)的不同浓度的抗-MAdCAM抗体。在其他实施方案中，每瓶单位剂量可包含大约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml或100ml的不同浓度的抗-MAdCAM抗体。如果需要，可通过向每个瓶中加入无菌稀释剂来将这些制剂调整至想要的浓度。稳定性评估：
本发明包括包含此处描述的抗-MAdCAM抗体和药学上可接受的螯合剂的稳定的液体药物组合物。期望稳定的组合物保持例如产品的外观和完整性或抵抗它们的变化(包括可能导致生物学活性减少的物理或化学降解)。在文献中报导了用于测量蛋白稳定性的各种分析技术和指示剂，在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，VincentLee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中概述了许多这些技术和指示剂。一般地，本发明的液体药物组合物，当在一段时间内经历低的贮存温度和/或当经历一个或多个冷冻/解冻循环时展现出提高的稳定性。
在一个实施方案中，所述组合物，当在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物，当在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物，当在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
如此处所用的，术语“冷冻/解冻循环”是指在冷冻贮存后使用液体抗体样品的技术，其中将样品的温度降低至0℃或更低的温度以冷冻该液体样品，然后让样品经历使其恢复液体状态的温度，并进行足够的时间以允许使用样品，然后将其返回冷冻贮存，优选地在0℃或更低的温度下贮存。如此处所用的，术语“冷冻贮存”是指在0℃或更低的温度下，优选地在-20℃或更低的温度下，冷冻和保持先前液态的抗体样品。
在一个实施方案中，所述组合物，当进行至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环时，比经历相同的冷冻/解冻条件的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物满足下列条件中的两个或更多个：
(a)所述组合物，当在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定；
(b)所述组合物，当在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定；
(c)所述组合物，当在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定；或
(d)所述组合物，当进行至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环时，比经历相同的冷冻/解冻条件的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物满足上面刚刚讨论的条件中的三个或更多个。
为了本发明的目的，抗体聚集、抗体片段化和/或组合物变色例如可用作组合物的稳定性指标。一般地，本发明的液体药物组合物，当经历一种或多种上述贮存或冷冻/解冻条件时，相对于经历相同条件的缺少螯合剂的相同组合物而言，展示出更低水平的抗体聚集、抗体片段化和组合物变色中的至少一种。
可通过本领域内已知的各种方法来测量液体组合物中的蛋白质聚集。这些方法包括基于其分子量来分离蛋白质的凝胶过滤层析。“凝胶”是水和聚合物例如琼脂糖或聚丙烯酰胺的混合物。本发明还包括使用凝胶过滤HPLC(高效液相色谱)。其他公认的测量聚集的方法包括阳离子交换层析，该方法是使用阴离子柱的离子交换层析的一般液相层析技术。在本发明中交换的阳离子来自蛋白质分子。因为多价蛋白质聚集体可具有多个抗原结合蛋白单体的净电荷，从而聚集体可获得更强的保留，并可与单体分子相分离。优选的阳离子交换剂是聚天冬氨酸柱。因此，可容易地区分单体蛋白和聚集体。然而，本领域技术人员将认识到，本发明的聚集测定法不限于任何特定的层析柱类型，只要其能够分离两种形式的蛋白质分子。
可通过本领域内已知的各种方法来测量液体药物组合物中的蛋白质片段化。这些方法包括，例如，大小排阻层析、紫外线检测(例如，在214纳米处)、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)。可通过例如离子交换层析或等电聚焦(IEF)来评估导致电荷改变(例如，由于脱酰胺作用而发生)的蛋白质片段化。
一般地，可通过组合物本身的目测观察来测量组合物的变色。一般地，包含螯合剂的本液体药物组合物，相对于不包含所述螯合剂的相同的组合物而言，减少了组合物的变色(例如，粉红色或黄色)和/或保持了组合物的清澈度(例如浊度、浑浊度和/或颗粒形成)。为了本发明的目的，术语“变色”是指颜色的改变(例如，从清澈和无色至粉红色或黄色)以及清澈度的改变(例如从清澈和无色至混浊、浑浊和/或具有颗粒)。一般地，可使用其他技术例如通过在214纳米处进行紫外线检测、在其他波长例如在可见光/近紫外范围内进行检测，和/或通过对具有和不具有所述螯合剂的组合物的色标进行目测比较，来测量组合物的变色。参见PhEur 5.0，2005Monograph 2.2.2。
在一个实施方案中，在所述组合物经历下列条件中的至少一个后测定抗体聚集：
(a)将所述组合物在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月；
(b)将所述组合物在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月；
(c)将所述组合物在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月；或
(d)使所述组合物经历至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环。然后通过层析法(例如使用HPLC)将抗体聚集体与单体分离，并根据所得的色谱图来确定聚集的程度。本发明的稳定的液体药物组合物所具有的在色谱图上的聚集体峰面积通常低于大约6％、低于大约5％、低于大约4％、低于大约3％、低于大约2％或低于大约1.5％的在所述色谱图上的总峰面积。在用于测量聚集的该技术的一个具体的实例中，将所述组合物在40℃下贮存24周，然后使用SE-HPLC进行层析分离并在214纳米处进行紫外线检测。
一般地，本发明的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积和经历相同条件的缺少所述螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的差异为至少大约2％、至少大约3％、至少大约4％或至少大约4.5％。
在另一个实施方案中，在所述组合物经历下列条件中的至少一个后测定抗体片段化：
(a)将所述组合物在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月；
(b)将所述组合物在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月；
(c)将所述组合物在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月；或
(d)使所述组合物经历至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环。然后通过电泳(例如，SDS-PAGE)将抗体片段与所述组合物分离，并根据所得的电泳图谱或凝胶图像来确定片段化的程度。本发明的稳定的液体药物组合物所具有的在SDS-PAGE凝胶上的片段条带体积通常为低于大约9％、低于大约8％、低于大约7％、低于大约6％、低于大约5％或低于大约4.5％的在所述凝胶上的总条带体积。在用于测量片段化的该技术的一个具体实例中，将所述组合物在40℃下贮存24周，然后使用还原型SDS-PAGE(rSDS-PAGE)进行分析，其中通过使用Molecular Dynamics PersonalDensitometer PDQC-90或Bio-Rad GS 800Imaging Densitometer进行扫描来测定条带体积。
一般地，本发明的稳定的液体药物组合物的片段条带体积和经历相同条件的缺少所述螯合剂的相同组合物的片段条带体积之间的差异为至少大约2％、至少大约3％、至少大约4％或至少大约5％。
预防/治疗的方法：
可在治疗上使用此处描述的任何类型的抗体。在优选实施方案中，所述抗-MAdCAM抗体是人抗体。在另一个优选实施方案中，所述MAdCAM是人的，且所述受试者是人受试者。在另一个优选实施方案中，所述抗-MAdCAM抗体是人IgG2抗体。备选地，所述受试者可以是表达与所述抗-MAdCAM抗体交叉反应的MAdCAM蛋白的哺乳动物。可以将所述抗体施用给表达与所述抗体交叉反应的非人哺乳动物(即，灵长类动物)，以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。此类动物模型可用于评估本发明的抗体的治疗功效。
本发明提供了用于治疗受试者中的炎性疾病的方法，其包括给所述受试者施用包含抗-MAdCAM抗体和螯合剂(单独的或与选自缓冲剂、张度剂或表面活性剂及其混合物的其他赋形剂相组合的)的液体药物组合物。在其他实施方案中，上述受试者是需要预防或治疗炎性疾病的受试者。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者中的炎性疾病状况的方法，其包括给受试者施用包含抗-MAdCAM抗体7.16.6和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述药学上可接受的赋形剂包含螯合剂(单独的或与选自缓冲剂、张度剂或表面活性剂及其混合物的其他赋形剂相组合的)。
在本发明的多种实施方案中，所述炎性疾病可以是，但不限于，胃肠道的炎性疾病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、憩室病、胃炎、肝病、原发性胆管硬化、硬化性胆管炎。炎性疾病还包括但不限于腹部疾病(包括腹膜炎、阑尾炎、胆道疾病)、急性横贯性脊髓炎、过敏性皮炎(包括过敏性皮肤、过敏性湿疹、皮肤特应性(skin atopy)、特应性湿疹、特应性皮炎、皮肤炎症、炎性湿疹、炎性皮炎、跳蚤皮肤(flea skin)、军团皮炎(military dermatitis)、军团湿疹(military eczema)、房尘螨皮肤(house dust mite skin))、强直性脊柱炎(莱特尔综合征)、哮喘、气道炎症、动脉粥样硬化、动脉硬化、胆道闭锁、膀胱炎症、乳腺癌、心血管炎症(包括血管炎、类风湿性甲襞梗塞、小腿溃疡、多发性肌炎、慢性血管炎症、心包炎、慢性阻塞性肺病)、慢性胰腺炎、神经周围炎症(perineuralinflammation)、结肠炎(包括阿米巴性结肠炎、感染性结肠炎、细菌性结肠炎、克罗恩结肠炎、缺血性结肠炎、溃疡性结肠炎、特发性直肠结肠炎、炎性肠病、假膜性结肠炎)、胶原血管病(类风湿性关节炎、SLE、进行性全身性硬化症、混合型结缔组织病、糖尿病)、克罗恩病(局限性肠炎、肉芽肿性回肠炎(granulomatous ileitis)、回肠结肠炎、消化系统炎症)、脱髓鞘病(包括脊髓炎、多发性硬化、播散性硬化、急性播散性脑脊髓炎、静脉周围脱髓鞘(perivenousdemyelination)、维生素B12缺乏、格-巴综合征、MS相关逆转录病毒)、皮肌炎、憩室炎、渗出性腹泻、胃炎、肉芽肿性肝炎、肉芽肿性炎症、胆囊炎、胰岛素依赖性糖尿病、肝脏炎性疾病(肝纤维化、原发性胆汁性肝硬化、肝炎、硬化性胆管炎)、肺炎(特发性肺纤维化、肺的嗜酸细胞性肉芽肿，肺组织细胞增多病X、细支气管周围炎、急性支气管炎)、性病性淋巴结肉芽肿、恶性黑色素瘤、口/牙齿疾病(包括龈炎、牙周疾病)、粘膜炎、肌骨骼系统炎症(肌炎)、非酒精性脂肪性肝炎(非酒精性脂肪肝病)、眼及眼眶炎症(包括葡萄膜炎、视神经炎、外周类风湿性溃疡(peripheral rheumatoidulceration)、外周角膜炎症(peripheral corneal inflammation))、骨关节炎、骨髓炎、咽炎、多关节炎、直肠炎、牛皮癣、辐射损伤、肉样瘤病、镰刀形细胞神经病(sickle cell neuropathy)、血栓性浅静脉炎、全身性炎症应答综合征、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、移植物抗宿主病、急性烧伤、贝切特综合征、斯耶格伦综合征。
在更优选的实施方案中，给患有结肠炎的受试者施用所述抗-MAdCAM抗体。
制品：
在本发明的另一个实施方案中，提供了包括容器的制品，所述容器装载有液体药物组合物和任选地提供了其使用说明书，所述液体药物组合物在包含单独的或与其他药学上可接受赋形剂相组合的螯合剂的组合物中包含至少一种本发明的单克隆抗-MAdCAM抗体。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、袋子和注射器。可从多种材料例如玻璃或塑料制造所述容器。示例性的容器是3-20cc的单次使用的玻璃管形瓶。备选地，对于多剂量组合物，所述容器可以是3-100cc的玻璃管形瓶。所述容器装载所述组合物，并且所述容器上或与其结合的标签可标明使用说明。制品还可包括从商业和用户角度来说想要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器，和具有使用说明、禁忌症和/或潜在副作用列表的包装插页。
本发明还提供了用于制备经稳定的抗体的液体组合物的试剂盒，所述试剂盒包含装有单克隆抗-MAdCAM抗体7.16.6溶液的第一个容器，和装有在溶液中的足以稳定所述抗体的量的螯合剂(单独的或与其他赋形剂相组合的)的第二个容器。
下列实施例描述了本发明的实施方案。根据此处公开的本发明的说明或实践，此处权利要求书范围内的其他实施方案对于本领域技术人员来说是显然的。希望说明书和实施例只是被认为是示例性的，本发明的范围和精神由实施例后面的权利要求书来指明。在所述实施例中，除非另外指出，所有百分比均基于重量给出。本领域技术人员将认识到，使用本领域公认的所述成分的分子量可将实施例中所述的重量和/或重量-体积比转换成摩尔数和/或体积摩尔浓度。此处例举的重量(例如，克)是对于所述体积(例如，缓冲液、抗体组合物等的体积)来说的。本领域技术人员将认识到，当想要不同的组合物体积时可按比例调整重量。
实施例1
抗-MAdCAM产生性杂交瘤的产生
根据本实施例来制备本发明的抗体。
参考PCT/US2005/000370。
主要免疫原的制备：
制备两种用于免疫接种XenoMouseTM小鼠的免疫原：(i)MAdCAM-IgG1Fc整合蛋白，和(ii)从用MAdCAM稳定转染的细胞制备的细胞膜。
(i)MAdCAM-IgG 1 Fc融合蛋白
表达载体的构建：
从pINCY Incyte克隆(3279276)中切出编码MAdCAM的成熟的细胞外免疫球蛋白样结构域的EcoRI/Bg1II cDNA片段，并将其克隆入pIG1载体(Simmons，D.L.(1993)in Cellular Interactions inDevelopment：A Practical Approach，ed.Hartley，D.A.(OxfordUniv.Press，Oxford)，pp.93-127))的EcoRI/BamHI位点中，从而产生符合阅读框的IgG1 Fc融合蛋白。用EcoRI/NotI切出所得的插入物，并将其克隆入pCDNA 3.1+(Invitrogen)中。对载体中的MAdCAM-IgG1 Fc cDNA进行序列验证。下面显示了MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白的氨基酸序列：
MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白：
MDFGLALLLAGLLGLLLG
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：5)
下划线：信号肽
粗体：MAdCAM细胞外结构域
重组蛋白质的表达/纯化：
用包含MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白cDNA的pCDNA3.1+载体转染CHO-DHFR细胞，并在含有600μg/mL G418和100ng/mL氨甲蝶呤的Iscove’s培养基中选择表达MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白的稳定克隆。对于蛋白质表达，使用在包含10％低IgG胎牛血清(Gibco)、非必需氨基酸(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、丙酮酸钠(Gibco)，100μg/mL G418和100ng/mL氨甲蝶呤的Iscove’s培养基中稳定表达MAdCAM-IgG1Fc的CHO细胞接种中空纤维生物反应器，并将其用于产生浓缩的培养基上清液。通过亲和层析从收获的上清液中纯化出MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白。简而言之，将上清液施加至HiTrap ProteinG Sepharose(5mL，Pharmacia)柱上(2mL/分钟)，用25mM TrispH8，150mM NaCl(5倍柱体积)洗涤，然后用100mM甘氨酸pH 2.5洗脱(1mL/分钟)，立即用1M Tris pH 8中和级分至pH 7.5。通过SDS-PAGE来鉴定包含MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白的级分，将其合并在一起，并施加至Sephacryl S100柱(Pharmacia)上，用35mM BisTrispH 6.5、150mM NaCl进行预平衡。以0.35mL/分钟进行凝胶过滤，将MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白的峰收集在大约3×5mL的级分中。合并这些样品，并施加至Resource Q(6mL，Pharmacia)柱上，在35mMBisTris pH6.5中预平衡。用5倍柱体积的35mM Bis Tris pH 6.5，150mM NaCl洗涤柱(6mL/分钟)，然后用35mM Bis Tris pH 6.5，400mM NaCl将MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白洗脱4-6mL的级分中。在该阶段，蛋白纯度为90％，并且在SDS-PAGE中以大约68kD的单一条带迁移。对于用作免疫原和进行所有随后的测定法，将所述材料的缓冲液更换为25mM HEPES pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，100mM NaCl，50％甘油，并在-80℃下以等分试样进行贮存。
(ii)稳定表达MAdCAM的细胞膜
从结肠cDNA文库中PCR扩增出包含公开的MAdCAM序列(Shyjan AM，等人，J Immunol.，156，2851-7(1996))的核苷酸645-1222的SacI/NotI片段，并将其克隆入pIND-Hygro载体(Invitrogen)的SacI/NotI位点中。将包含另外的5′编码序列的SacI片段亚克隆入来自pCDNA3.1MAdCAM-IgG1 Fc的该构建体中，从而产生全长MAdCAMcDNA。然后将包含MAdCAM cDNA的KpnI/No tI片段克隆入pEF5FRTV5GWCAT载体(Invitrogen)中相应的位点中，并替代CAT编码序列。对所述cDNA插入物进行序列验证，并按照厂商说明书使用Flp重组酶技术将其用于转染，从而在FlpIn NIH 3T3细胞(Invitrogen)中产生单个的稳定表达的克隆。就它们支持α4β7 +JY人B淋巴母细胞样细胞系的结合的能力来选择稳定表达的克隆(ChanBM，等人，J.Biol.Chem.，267：8366-70(1992))，在下面概述。以相同的方法，使用FlpIn CHO细胞(Invitrogen)来制备表达MAdCAM的CHO细胞的稳定克隆。
将表达MAdCAM的FlpIn NIH-3T3细胞培养在包含2mM L-谷氨酰胺、10％供体小牛血清(Gibco)和200μg/mL潮霉素B(Invitrogen)的Dulbecco’s改良Eagles培养基(Gibco)中，并在滚瓶中进行扩增。将表达MAdCAM的FlpIn CHO细胞培养在含有2mM L-谷氨酰胺、10％供体小牛血清(Gibco)和350μg/mL潮霉素B(Invitrogen)的Ham’sF12/Dulbecco’s改良Eagles培养基(Gibco)中，并在滚瓶中进行扩增。通过下列方式来收获细胞：使用非酶促细胞解离溶液(Sigma)和刮术，通过离心在磷酸盐缓冲盐水中洗涤。通过两轮在25mM Bis TrispH 8、10mM MgCl2、0.015％(w/v)抑酶肽、100U/mL杆菌肽中的polytron匀浆和离心从细胞沉淀中制备细胞膜。将最终的沉淀重悬浮于相同的缓冲液中，并将50×106个细胞的相等物等分至厚壁eppendorf管中，以＞100,000g离心，从而产生用于XenoMouse小鼠免疫接种的细胞膜沉淀。倾去上清液，并将膜在-80℃下贮存在eppendorf管中直至使用。通过SDS-PAGE和Western印迹法来验证在所述细胞膜中的蛋白质表达，使用针对MAdCAM的N-末端残基([C]-KPLQVEPPEP)而产生的兔抗肽抗体。
免疫接种和杂交瘤的产生：
用纯化的重组MAdCAM-IgG1Fc融合蛋白(10μg/剂/小鼠)，或者用从稳定表达MAdCAM的CHO或NIH 3T3细胞制备的细胞膜(10×106个细胞/剂/小鼠)经腹膜内或在其后脚垫中免疫接种8至10周龄的XENOMOUSETM小鼠。在3至8周的时间内重复5至7次该剂量。在融合前4天，小鼠最后一次注射在PBS中的人MAdCAM的细胞外结构域。将来自经免疫接种的小鼠的脾和淋巴节淋巴细胞与非分泌型黑色素瘤P3-X63-Ag 8.653细胞系融合，并使其经历HAT选择，如先前所描述的(Galfre和Milstein，Methods Enzymol.73：3-46(1981))。回收一组分泌MAdCAM特异性人IgG2κ的杂交瘤，并进行亚克隆。
在2003年9月9日将如下命名的下列产生抗-MAdCAM抗体的杂交瘤保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of cellCultures)(ECACC)，H.P.A.at CAMR，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4OJG：杂交瘤7.16.6，保藏号03090909。
实施例2
抗体组合物
在随后的实施例中涉及下列组合物：
表2
| 组合物ID | mAb 7.16.6mg/ml | 缓冲剂mM；pH | 张度剂mg/ml | 表面活性剂mg/ml | 螯合剂Mg/ml | 其他赋形剂 |
| 1 | 10±1 | 乙酸盐，20mM，pH 5.5 | ||||
| 2 | 10±1 | 乙酸盐，7mM柠檬酸盐，7mM磷酸盐，7mM，pH 5.5 | ||||
| 3 | 10±1 | EDTA，20mM pH 5.5 | ||||
| 4 | 8±1 | 乙酸钠，20mM，pH5.5 | NaCl，140mM | |||
| 5 | 8±1 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | |||
| 6 | 8±1 | 乙酸钠，10mM，pH 5.5 | ||||
| 7 | 8±1 | EDTA钠，10mM，pH 5.5 | ||||
| 8 | 8±1 | EDTA钠，10mM，pH 5.5 | NaCl，140mM | |||
| 9 | 8±1 | EDTA钠，10mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml |
| 10 | 8±2 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | ||
| 11 | 8±2 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 12 | 8±2 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | NaCl，8.2mg/ml | PS80，0.2mg/ml | ||
| 13 | 8±2 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | CaCl2.2H2O，0.3mg/ml | |
| 14 | 30±6 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.4mg/ml | ||
| 15 | 30±6 | 乙酸钠2mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 16 | 30±6 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | NaCl，8.2mg/ml | PS80，0.4mg/ml | ||
| 17 | 30±6 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.4mg/ml | CaCl2.2H2O，0.3mg/ml | |
| 18 | 50±6 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 19 | 10±2 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 20 | 10±2 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 21 | 10±2 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 22 | 50±6 | 乙酸钠20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 23 | 50±6 | 组氨酸，10mM，pH 6.0 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 24 | 150±6 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/ml | |
| 25 | 50±5 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 26 | 75±5 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 27 | 100±7 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 28 | 150±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 29 | 190±2 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 30 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA，2H2O，0.02mg/ml | |
| 31 | 80±10 | 组氨酸,10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.10mg/ml | |
| 32 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 33 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，1.0mg/ml | Na2EDEA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 34 | 85±15 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.10mg/ml |
| 35 | 85±15 | 组氨酸，10mM，pHm 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.10mg/ml | |
| 36 | 85±15 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，1.0mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.10mg/ml | |
| 37 | 80±10 | 柠檬酸盐，5mM，pH5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 38 | 80±10 | 琥珀酸盐，5mM pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 39 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 蔗糖，85mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 40 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 山梨糖醇45mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 41 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 木糖醇35mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 42 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PEG3350，10mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 43 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | NOF PS800.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 44 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | 泊洛沙姆407，1.0mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 45 | 80±10 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | 泊洛沙姆1881.0mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 46 | 50±5 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 47 | 50±5 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 48 | 75±15 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 49 | 75±15 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 50 | 75±15 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 蔗糖，85mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 51 | 75±5 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.2mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.05mg/ml | |
| 52 | 75±5 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 海藻糖，90mg/ml | PS80，0.4mg/ml | Na2EDTA.2H2O，0.10mg/ml |
实施例3
进行用于评估几种不同缓冲剂对于抗-MAdCAM抗体7.16.6聚集的影响的研究。
缓冲液溶液的制备：
通过首先将一定量的缓冲剂种类溶解在水中(大约90％的靶)来制备缓冲液。然后通过加入足够量的酸或碱溶液将各缓冲液的pH调整至5.5。在调整pH后，加入额外量的水以提供20mM的最终缓冲剂浓度。选择20mM的缓冲剂浓度以确保在所选择的pH 5.5处的适当的pH稳定性。然后将缓冲液通过无菌过滤器(0.22微米的孔径)过滤入灭菌的容器中以备随后使用。
抗体组合物的制备：
如下制备抗体组合物。在20mM乙酸钠缓冲液pH 5.5+140mM氯化钠中以10.5mg/ml获得抗体本体溶液。通过使用分子量截止膜(例如30kD)在4500xg下离心来将该本体溶液进行缓冲液交换而进入组合物溶液中。进行大约8倍体积的交换，制备浓度为大约10mg/ml的最终抗体溶液。在280nm处使用1.56(mg/ml)-1 cm-1的消光系数通过紫外-可见光谱法(UV-Vis)来确定抗体的浓度。然后通过无菌0.22微米膜滤器对具有所有成分的所述组合物进行过滤灭菌。然后将过滤的组合物注入经洗涤和高压灭菌的管形瓶中，所述管形瓶用经
包被的塞子密闭，压褶(crimp)密封，并置于稳定性测试箱中。
特别地，制备三种液体组合物，其包含抗-MAdCAM抗体7.16.6，并用乙酸盐、EDTA或乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐的组合进行缓冲。然后将所述组合物在40℃下贮存6周，并进行聚集测量。
表3：
| 组合物ID | 7.16.6mAbmg/mL | 描述 | ％聚集 | ％聚集的相对增加* |
| 1 | 10±1 | 20mM乙酸盐pH 5.5 | 0.8 | 70 |
| 2 | 10±1 | 组合，pH 5.5(乙酸盐7mM，柠檬酸盐7mM，磷酸盐6mM) | 0.7 | 60 |
| 3 | 10±1 | 20mM EDTA，pH 5.5 | 0.5 | 40 |
*通过下式来计算％聚集的相对增加：
[{(6周/40℃时的％聚集)-(初始时的％聚集)}*100]/[初始时的％聚集]
聚集分析：
将抗体组合物贮存于40℃。在第6周时，使用大小排阻层析(SEC)就聚集来分析每种组合物。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，0.2M磷酸钠(pH 7)流动相，采用0.7mL/分钟的流速和214nm处的UV检测来进行大小排阻层析。如此来计算聚集水平，即将每种组合物的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比。如表3中所示，经EDTA缓冲的组合物显示了最低的聚集水平和最低的相对的聚集增加。
实施例4
进行用于评估缓冲剂浓度和其他赋形剂的存在/不存在对于抗-MAdCAM抗体7.16.6片段化的影响的研究。
通过实施例2中描述的方法来制备表4中所示的组合物，并通过实施例3中的方法来进行评估。
表4：
| 组合物ID | 7.16.6mAbmg/mL | 缓冲剂 | 赋形剂 | ％片段化 |
| 4 | 8±1 | 20mM乙酸钠，pH 5.5 | NaCl，140mM | 0.9 |
| 5 | 8±1 | 20mM乙酸钠，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | 0.6 |
| 6 | 8±1 | 10mM乙酸钠，pH 5.5 | - | 0.5 |
| 7 | 8±1 | 10mM EDTA钠，pH 5.5 | - | 0 |
| 8 | 8±1 | 10mM EDTA钠，pH 5.5 | NaCl，140mM | 0 |
| 9 | 8±1 | 10mM EDTA钠，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/ml | 0 |
如表4中所示，液体组合物中EDTA的存在导致比在未包含EDTA的组合物中产生更少的LMM形成。
实施例5
进行用于评估在液体抗-MAdCAM抗体组合物中EDTA对于聚集和片段化的影响的研究。
通过实施例3中描述的方法来制备缓冲液。如下制备抗体组合物。在20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中以9.6mg/ml获得抗体本体溶液。通过使用分子量截止膜(例如30kD)在5000xg下离心来将该本体溶液进行缓冲液交换而进入组合物溶液中。进行大约8倍体积的交换，制备蛋白质浓度为大约8mg/ml或大约30mg/ml的最终抗体溶液。在280nm处使用1.56(mg/ml)-1cm-1的消光系数通过紫外-可见光谱法(UV-Vis)来确定抗体的浓度。通过使用合适的缓冲液稀释和溶解PS80来制备聚山梨酯80(PS80)的浓缩溶液(通常为20mg/ml)。然后，将PS80浓缩液加入至抗体溶液中，从而所述的最终组合物。然后通过经无菌0.22微米膜滤器过滤来对具有所有成分的组合物进行灭菌。然后将过滤的组合物注入经洗涤和高压灭菌的管形瓶中。所述管形瓶用经包被的塞子密闭，压褶(crimp)密封，并置于稳定性测试箱中。
将表5中的组合物在40℃下贮存26周，并通过实施例3中描述的SEC方法对进行评估。
表5
| 组合物ID | 7.16.6mAbmg/mL | 缓冲剂(pH5.5) | 赋形剂 | PS-80，mg/mL | 其他赋形剂 | ％聚集 | ％片段化 |
| 10 | 8±2 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | - | 6.9 | 0.6 |
| 11 | 8±2 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/mL | 3.7 | 0 |
| 12 | 8±2 | 乙酸钠，钠，20mM，pH 5.5 | NaCl，8.2mg/mL | 0.2 | - | 6.0 | 0.5 |
| 13 | 8±2 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | CaCl2.2H2O，0.3mg/mL | 6.8 | 0.8 |
| 14 | 30±6 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | - | 7.2 | 0.2 |
| 15 | 30±6 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/mL | 3.7 | 0 |
| 16 | 30±6 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | NaCl，8.2mg/mL | 0.4 | - | 7.7 | 0.4 |
| 17 | 30±6 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | CaCl2.2H2O，0.3mg/mL | 9.8 | 0.7 |
将表6中的组合物在25℃下贮存26周，并通过实施例3中描述的SEC方法对进行评估。
表6
| 组合物ID | 7.16.6mAb，mg/mL | 缓冲剂 | 赋形剂 | PS-80，mg/mL | 其他赋形剂 | ％聚集 |
| 14 | 30±6 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | - | 1.6 |
| 15 | 30±6 | 乙酸钠，20mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | Na2EDTA.2H2O，0.02mg/mL | 0.7 |
| 18 | 50±6 | 组氨酸，10mM，pH 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | Na2EDTA.2H 2O，0.02mg/mL | 0.5 |
该实施例显示，液体组合物中EDTA的存在导致较少的聚集和较少的LMM种类形成。
实施例6
进行用于比较乙酸盐和组氨酸缓冲液对于抗-MAdCAM抗体7.16.6的聚集和片段化的影响的研究。通过实施例5中描述的方法来制备表7和8中的组合物。将表7中的组合物在40℃下贮存26周，并通过实施例3中描述的SEC方法进行分析。
表7：
| 组合物ID | 7.16.6mAbmg/mL | 缓冲剂 | pH | 赋形剂 | PS-80，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | ％聚集 | ％片段化 |
| 19 | 10±2 | 乙酸钠，20mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 3.8 | 0 |
| 20 | 10±2 | 组氨酸，10mM | 6.0 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 1.2 | 0 |
| 21 | 10±2 | 组氨酸，10mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 1.5 | 0 |
| 22 | 50±6 | 乙酸钠，20mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | 0.02 | 5.2 | 0 |
| 23 | 50±6 | 组氨酸，10mM | 6.0 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 2.3 | 0 |
| 18 | 50±6 | 组氨酸，10mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 2.8 | 0.1 |
将表8中的组合物在25℃下贮存52周，并通过实施例3中描述的SEC方法进行分析。
表8：
| 组合物ID | 7.16.6mAbmg/mL | 缓冲剂 | pH | 赋形剂 | PS-80，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | ％聚集 | ％片段化 |
| 19 | 10±2 | 乙酸钠，20mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 0.9 | 0 |
| 20 | 10±2 | 组氨酸，10mM | 6.0 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 0.4 | 0 |
| 21 | 10±2 | 组氨酸，10mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 0.3 | 0 |
| 22 | 50±6 | 乙酸钠，20mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.4 | 0.02 | 1.3 | 0 |
| 23 | 50±6 | 组氨酸，10mM | 6.0 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 0.8 | 0 |
| 18 | 50±6 | 组氨酸，10mM | 5.5 | 甘露醇，45mg/mL | 0.2 | 0.02 | 0.9 | 0 |
本实施例显示，使用组氨酸作为缓冲剂的组合物在相同pH下具有比使用乙酸盐的组合物更少的聚集体形成。
实施例7
进行用于评估在各种不同的抗体浓度下组合物中抗-MAdCAM抗体7.16.6的聚集倾向性的研究。在该研究中通过实施例5中描述的方法来制备表9中的组合物。将表9中的组合物在5℃、25℃或40℃下贮存26周，然后通过实施例3中描述的SEC方法进行分析。
表9
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | mAb7.16.6，mg/mL | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 在5℃下的％聚集 | 在25℃下的％聚集 | 在40℃下的％聚集 |
| 25 | His，10 | 5.5 | 47 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.3 | 0.6 | 2.7 |
| 26 | His，10 | 5.5 | 75 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.4 | 0.7 | 3.6 |
| 27 | His，10 | 5.5 | 99 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.5 | 0.8 | 4.4 |
| 28 | His，10 | 5.5 | 145 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.7 | 1.2 | 6.0 |
| 29 | His，10 | 5.5 | 183 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.6 | 1.3 | 7.5 |
如表9中所示，对于聚集的倾向性随抗体浓度的增加而增加。然而，在贮存26周后，通过加速的条件数据(在25℃和40℃下贮存)证明了表9中显示的组合物的稳定效应，所述数据显示高浓度组合物具有相对较低的聚集水平。
实施例8
进行用于评估在具有各种EDTA水平的组合物中抗-MAdCAM抗体7.16.6的聚集倾向性的研究。如上面实施例5中所述来制备组合物，除了将最终抗体浓度调整至80±10mg/ml外。将表10中的组合物在5℃或26℃下贮存26周，然后如上所述通过SEC进行分析。
表10
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 在5℃下的％聚集 | 在25℃下的％聚集 |
| 30 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.02 | 0.2 | 0.6 | 0.9 |
| 26 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.4 | 0.7 |
| 31 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.10 | 0.2 | 0.5 | 0.8 |
如所显示的，相对于0.02mg/mL EDTA，在0.05mg/ml和0.10mg/mL处具有改善，且在各情况下，在5℃下贮存26周后，在EDTA存在的情况下聚集较低。
实施例9
进行用于评估具有各种不同水平的聚山梨酯80的抗-MAdCAM抗体7.16.6组合物的稳定性的研究。如上所述制备组合物，除了将最终抗体浓度调整至80±mg/ml外。将表11中的组合物在25℃或40℃下贮存26周，然后如上所述通过SEC进行分析。
表11
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 在25℃下的％聚集 | 在40℃下的％聚集 |
| 26 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.7 | 3.6 |
| 32 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.4 | 0.8 | 4.2 |
| 33 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 1.0 | 1.0 | 4.8 |
将表12中的组合物在环境温度下接受振荡应力(shaking stress)24小时，所述振荡应力是以300rpm通过轨道振荡来施加的。如上所述制备组合物，但将最终抗体浓度调整至85±mg/ml。
表12
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 外观 |
| 34 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.10 | 0.2 | 存在少量颗粒 |
| 35 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.10 | 0.4 | 无颗粒 |
| 36 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.10 | 1.0 | 无颗粒 |
尽管上述贮存稳定性研究显示可溶性聚集水平随聚山梨酯-80的水平增加而轻微地增加，但振荡应力研究显示0.4mg/mL的聚山梨酯-80水平提供了足够的抗振荡应力的保护作用。
实施例10
进行用于评估在具有各种不同缓冲剂的组合物中抗-MAdCAM抗体7.16.6的聚集倾向性的研究。如上所述制备组合物，并调整至80±10mg/ml的最终抗体浓度。将表13中的组合物在25℃或40℃下贮存26周。
表13
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 在25℃下的％聚集 | 在40℃下的％聚集 |
| 26 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.7 | 3.6 |
| 37 | 柠檬酸盐，5 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 1.7 | 6.0 |
| 38 | 琥珀酸盐，5 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 1.0 | 4.9 |
在具有组氨酸缓冲剂的组合物中聚集水平最低。
实施例11
进行用于评估在具有各种不同糖和多元醇的组合物中抗-MAdCAM抗体7.16.6的聚集倾向性的研究。如上所述制备组合物，并调整至80±10mg/ml的最终抗体浓度。将表14中的组合物在40℃下贮存26周。
表14
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 糖/多元醇，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 在40℃下的％聚集 |
| 26 | Hi s，10 | 5.5 | 海藻糖.2H2O，90 | 0.05 | 0.2 | 3.6 |
| 39 | H i s，10 | 5.5 | 蔗糖，85 | 0.05 | 0.2 | 4.8 |
| 40 | Hi s，10 | 5.5 | 山梨糖醇，45 | 0.05 | 0.2 | 4.8 |
| 41 | Hi s，10 | 5.5 | 木糖醇，35 | 0.05 | 0.2 | 4.6 |
包含海藻糖的组合物具有较低的聚集水平。
实施例12
进行用于评估在具有各种不同表面活性剂和PEG的组合物中抗-MAdCAM抗体7.16.6的抗体聚集倾向性的研究。如上所述制备组合物，并调整至80±10mg/ml的最终抗体浓度。通过加入合适量的表面活性剂或PEG浓缩储液来获得抗体组合物中表面活性剂或PEG的终浓度。将表15中的组合物在40℃下贮存26周。
表15
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H 2O，mg/mL | Na 2EDTA.2H 2O，mg/mL | 表面活性剂或PEG，mg/mL | 在40℃下的％聚集 |
| 26 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | PS80，0.2 | 3.6 |
| 42 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | PEG3350，10 | 3.9 |
| 43 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | NOF PS80，0.2 | 3.9 |
| 44 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 泊洛沙姆407，1.0 | 3.4 |
| 45 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 泊洛沙姆188，1.0 | 4.1 |
包含PS80和泊洛沙姆407的组合物比其他表面活性剂和两亲物表现稍微好些。
实施例13
进行用于评估具有海藻糖或蔗糖的组合物中Met256氧化的研究。如上所述制备组合物，并调整至80±10mg/ml的最终抗体浓度。将表16中的组合物在5℃或40℃下贮存26周。通过下列方式来测量甲硫氨酸的氧化：使用赖氨酰内切蛋白酶酶促消化蛋白质，然后通过反向HPLC来分离所得的肽片段(采用214nm吸光度检测)。监控包含甲硫氨酸或其氧化形式的肽片段。通过将氧化的甲硫氨酸的峰面积除以亲本甲硫氨酸的峰面积来计算氧化百分比。
表16
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 糖，mg/mL | Na2EDTA.2H 2O，mg/mL | PS80，mg/mL | 在5℃下的％Met256的氧化 | 在40℃下的％Met 256的氧化 |
| 26 | His，10 | 5.5 | 海藻糖.2H2O，90 | 0.05 | 0.2 | 3.3 | 7.2 |
| 32 | His，10 | 5.5 | 海藻糖.2H 2O，90 | 0.05 | 0.4 | 3.2 | 7.3 |
| 39 | His，10 | 5.5 | 蔗糖，85 | 0.05 | 0.2 | 3.2 | 9.0 |
包含海藻糖的组合物显示出相对于包含蔗糖的组合物而言更低的甲硫氨酸氧化的倾向性。
实施例14
进行用于评估高抗体浓度组合物的化学稳定性表现的研究。如上所述制备表17和18中的组合物，并调整至80±10mg/ml的最终抗体浓度。将表17中的组合物在5℃下贮存26周。通过iCE来评估化学稳定性。通过将具有pI标记物、甲基纤维素和pharmalytes的蛋白质混合物配制为大约0.22μg//μL的最终蛋白质浓度来进行测量。在3000伏下使用6分钟的聚焦时间来进行电泳，然后在280nm处检测吸光度。通过其各自的峰下面积来测定各种带电荷的种类的相对百分比。
表17
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | ％通过iCE显示的主要条带(初始) | ％通过iCE显示的主要条带(26周) |
| 26 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 66.5 | 67.9 |
| 32 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.4 | 66.6 | 67.3 |
| 31 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.10 | 0.2 | 65.7 | 65.5 |
表17中的组合物显示良好的化学稳定性，因为在主要种类中以及在总的酸性种类和总的碱性种类中没有显著的改变。
将表18中的组合物在5℃下贮存26周，并通过还原型SDS-PAGE进行测定以确定纯度。使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，并用胶体蓝(考马斯蓝)染色。对于还原型凝胶，通过Nu-PAGE还原剂进行还原。按照％纯度＝(％重链+％轻链)，采用光密度分析法来估计还原型凝胶中的纯度百分比。
表18
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na 2EDTA.2H 2O，mg/mL | PS80，mg/mL | ％通过还原型SDS-PAGE显示的纯度(初始) | ％通过还原型SDS-PAGE显示的纯度(26周) |
| 26 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 99.7 | 98.8 |
| 32 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.4 | 99.7 | 98.8 |
| 31 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.10 | 0.2 | 99.7 | 98.8 |
在5℃下贮存26周后，表18中的组合物未显示纯度的显著改变，这表明良好的化学稳定性。
实施例15
进行用于评估高浓度组合物抗冷冻-解冻逆境的表现的研究。
如上所述制备表19中的组合物，并调整至50±10mg/ml的最终抗体浓度。将表19中的组合物在-70℃/5℃或-20℃/5℃下经历3个冷冻-解冻循环。在具有1ml填充物的2ml玻璃瓶中进行所述研究。使用0.2M磷酸钠(pH 7)的流动相、TSK gel G3000SWXL柱，以0.7ml/分钟的流速，经214nm处的检测来进行SE_HPLC测量。通过将在抗体单体之前洗脱的抗体相关峰求和来确定聚集体量。
表19
| 组合物ID | 组合物描述 | 冷冻-解冻循环 | 在3次冷冻-解冻循环后的外观 | 在3次冷冻-解冻循环后％可溶性聚集的变化 |
| 46 | 50mg/mL mAb 7.16.6，10mM组氨酸，pH 5.5，90mg/mL海藻糖二水合物，0.05mg/mL EDTA二钠二水合物，0.2mg/mL聚山梨酯80 | -70℃/5℃ | 清澈；无颗粒 | 0.0 |
| 47 | 50mg/mL mAb 7.16.6，10mM组氨酸，pH 5.5，90mg/mL海藻糖二水合物，0.05mg/mLEDTA二钠二水合物，0.2mg/mL聚山梨酯80 | -20℃/5℃ | 清澈；无颗粒 | 0.0 |
在-70℃/5℃或-20℃/5℃下进行3个冷冻-解冻循环后，表19中的组合物未显示聚集的增加。
如上所述制备表20中的组合物，并调整至75±15mg/ml的最终抗体浓度。将表20中的组合物在-20℃/5℃下进行4个冷冻-解冻循环。在具有10ml填充物的10ml玻璃瓶中进行这些冷冻-解冻研究。如本
实施例上面所描述的来进行SEC测量。
表20
| 组合物ID | 组合物描述 | 冷冻-解冻循环 | 在4次冷冻-解冻循环后的外观 | 在4次冷冻-解冻循环后％可溶性聚集的变化 |
| 48 | 75mg/mL mAb 7.16.6，10mM组氨酸，pH 5.5，90mg/mL海藻糖二水合物，0.05mg/mL EDTA二钠二水合物，0.4mg/mL聚山梨酯80 | -20℃/5℃ | 清澈；无颗粒 | 0.0 |
| 49 | 75mg/mL mAb 7.16.6，10mM组氨酸，pH 5.5，90mg/mL海藻糖二水合物，0.05mg/mL EDTA二钠二水合物，0.2mg/mL聚山梨酯80 | -20℃/5℃ | 清澈；无颗粒 | 0.0 |
| 50 | 75mg/mL mAb 7.16.6，10mM组氨酸，pH 5.5，85mg/mL蔗糖，0.05mg/mL EDTA二钠二水合物，0.4mg/mL聚山梨酯80 | -20℃/5℃ | 清澈；无颗粒 | 0.0 |
在-20℃/5℃下进行4个冷冻-解冻循环后，表20中的组合物未显示聚集的增加。
实施例16
进行用于评估在冷冻保存期间高浓度组合物的稳定性的研究。如上所述制备表21中的组合物，并将最终抗体浓度调整至大约75mg/ml。将表21中的组合物在-20℃下贮存13周，并如实施例15中所述的来评估聚集。
表21
| 组合物ID | 缓冲剂，mM | pH | 海藻糖.2H2O，mg/mL | Na2EDTA.2H2O，mg/mL | PS80，mg/mL | ％在-20℃下聚集的增加 |
| 51 | His，10 | 5.5 | 90 | 0.05 | 0.2 | 0.0 |
在-20℃下贮存13周后，高浓度(75mg/ml抗体)组合物未显示聚集的增加。
实施例17
进行用于评估高浓度组合物的粘度的研究。如上所述制备表22中的组合物，并将最终抗体浓度调整至大约75mg/ml。通过对置于流变仪板(rheometer plate)上的组合物施加300s-1的平均剪切率来进行粘度测量。
| 组合物52： | mAb 7.16.6，mg/mL | 5℃下的粘度，cP |
| 10mM组氨酸，pH 5.5，90mg/mL海藻糖二水合物，0.10mg/mL EDTA二钠二水合物，0.4mg/mL聚山梨酯80 | 75 | 5.7 |
所述组合物显示出适合于皮下施用的粘度。
序列
信号序列：下划线
SEQ ID NO.1
7.16.6的重链核苷酸序列
1 atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc
51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG
101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC
151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT
201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC
251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG
301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG
351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG
401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG
451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC
501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT
551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA
601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG
651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA
701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA
751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC
801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG
851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA
951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG
1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC
1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA
1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC
1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC
1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG
1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC
1401 GGGTAAATGA
SEQ ID NO.2
7.16.6的预测的重链蛋白质序列
1 mdwtwsilfl vaaatgahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS
51 YGINWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKVQGRVTMT ADTSTSTAYM
101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS
151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP
251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY
301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL
351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA
401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM
451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
SEQ ID NO.3
7.16.6的κ轻链核苷酸序列
1 atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg
51 atccagtgca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA
101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG
151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA
201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC
251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC
301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT
351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA
401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG
451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG
501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT
551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC
601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA
651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA
SEQ ID NO.4
7.16.6的κ轻链蛋白质序列
1 mrlpagllgl lmlwipgssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL
51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI
101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL
151 KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL
201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
SEQ ID NO.5
MAdCAM-IgG1 Fc融合蛋白
MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPVVAVALGASRQLTCR
LACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGSCGG
RTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALSFSLLV
GGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPVPPALYCQA
TMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPDTTSQEPPDTTSQE
PPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSPGSTRTRRPEIQPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSPGK
序列表
<110>Pharmacia and Upjohn Company，LLC
Das，Tapan
Nema，Sandeep
Singh，Satish
Ganser，Scott
Allen，Corey
Zeng，David
<120>抗-MAdCAM抗体组合物
<130>PC 33248
<150>60/659,766
<151>2005-03-08
<150>60/728,165
<151>2005-10-19
<150>60/752,712
<151>2005-12-20
<150>60/762,456
<151>2005-01-26
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1410
<212>DNA
<213>智人
<400>1
atggactgga cctggagcat ccttttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccactcccag 60
gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120
tgcaaggctt ctggttacac ctttaccagc tatggtatca actgggtgcg acaggcccct 180
ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc agcgtttaca gtggtaacac aaactatgca 240
cagaaggtcc agggcagagt caccatgacc gcagacacat ccacgagcac agcctacatg 300
gacctgagga gcctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagggtagc 360
agctcgtccg gagactacta ttacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480
acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540
acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 600
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc 660
acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 720
gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 960
acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1410
<210>2
<211>469
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Val Tyr Set Gly Asn Thr Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Val Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Set Thr Set
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Set Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Set Set Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Set Set Ala
130 135 140
Set Thr Lys Gly Pro Set Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Set Arg Set
145 150 155 160
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr
225 230 235 240
Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305 310 315 320
Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Set Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Ash Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Met Leu Asp Set Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Set Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>3
<211>723
<212>DNA
<213>智人
<400>3
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg atccagtgca 60
gatattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 120
atctcctgca agtctagtca gagcctcctg catactgatg gaacgaccta tttgtattgg 180
tacctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaagtttc caaccggttc 240
tctggagtgc cagataggtt cagtggcagc gggtcaggga cagatttcac actgaaaatc 300
agccgggtgg aggctgagga tgttgggatt tattactgca tgcaaaatat acagcttccg 360
tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720
tga 723
<210>4
<211>239
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser
20 25 30
Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu His Thr Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln Asn Ile Gln Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
115 120 125
Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>5
<211>543
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Met Asp Phe Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gln Ser Leu Gln Val Lys Pro Leu Gln Val Glu Pro Pro Glu
20 25 30
Pro Val Val Ala Val Ala Leu Gly Ala Ser Arg Gln Leu Thr Cys Arg
35 40 45
Leu Ala Cys Ala Asp Arg Gly Ala Ser Val Gln Trp Arg Gly Leu Asp
50 55 60
Thr Ser Leu Gly Ala Val Gln Ser Asp Thr Gly Arg Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Arg Asn Ala Ser Leu Ser Ala Ala Gly Thr Arg Val Cys Val Gly
85 90 95
Ser Cys Gly Gly Arg Thr Phe Gln Hi s Thr Val Gln Leu Leu Val Tyr
100 105 110
Ala Phe Pro Asp Gln Leu Thr Val Ser Pro Ala Ala Leu Val Pro Gly
115 120 125
Asp Pro Glu Val Ala Cys Thr Ala Hi s Lys Val Thr Pro Val Asp Pro
130 135 140
Asn Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Val Gly Gly Gln Glu Leu Glu Gly
145 150 155 160
Ala Gln Ala Leu Gly Pro Glu Val Gln Glu Glu Glu Glu Glu Pro Gln
165 170 175
Gly Asp Glu Asp Val Leu Phe Arg Val Thr Glu Arg Trp Arg Leu Pro
180 185 190
Pro Leu Gly Thr Pro Val Pro Pro Ala Leu Tyr Cys Gln Ala Thr Met
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Leu Glu Leu Ser His Arg Gln Ala Ile Pro Val Leu
210 215 220
His Ser Pro Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser
225 230 235 240
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Ser Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro
245 250 255
Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Gln Glu Pro
260 265 270
Pro Asp Thr Thr Ser Pro Glu Pro Pro Asp Lys Thr Ser Pro Glu Pro
275 280 285
Ala Pro Gln Gln Gly Ser Thr His Thr Pro Arg Ser Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Arg Thr Arg Arg Pro Glu Ile Gln Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
305 310 315 320
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
325 330 335
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
340 345 350
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
355 360 365
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
370 375 380
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
385 390 395 400
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
405 410 415
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
420 425 430
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
435 440 445
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
450 455 460
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
465 470 475 480
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
485 490 495
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
500 505 5l0
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
515 520 525
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535 540
Claims (24)
1.组合物，其包含：
至少一种螯合剂；和
至少一种抗体，其包含：
与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；和
与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；
其中所述抗体结合人MAdCAM。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物是液体组合物，和所述抗体是人IgG2抗体且所述抗体不包含信号序列。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：2具有至少99％序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO：4具有至少99％序列同一性的轻链氨基酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO：4的轻链氨基酸序列。
5.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种为EDTA的螯合剂。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂。
7.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种为EDTA的螯合剂，且还包含组氨酸。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂和表面活性剂。
9.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含缓冲剂、表面活性剂和张度剂。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种为EDTA的螯合剂，且还包含缓冲剂、表面活性剂和张度剂。
11.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种为EDTA的螯合剂，且还包含组氨酸、表面活性剂和张度剂。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种为EDTA的螯合剂，且还包含组氨酸、聚山梨酯80和张度剂。
13.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少一种为EDTA的螯合剂，且还包含组氨酸、聚山梨酯80和海藻糖。
14.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约5.0mM的螯合剂；和
大约1mM至大约100mM的组氨酸。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01 mM至大约5.0mM的EDTA；和
大约1mM至大约100mM的组氨酸。
16.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约5.0mM的螯合剂；
大约1mM至大约100mM的缓冲剂；
大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂；和
大约100mM至大约400mM的张度剂。
17.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约5.0mM的EDTA；
大约1mM至大约100mM的组氨酸；
大约0.005mM至大约10mM的聚山梨酯80；和
大约100mM至大约400mM的张度剂。
18.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约5.0mM的EDTA；
大约1mM至大约100mM的组氨酸；
大约0.005mM至大约10mM的聚山梨酯80；和
大约100mM至大约400mM的海藻糖。
19.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的抗体；
大约0.001mg/ml至大约1.0mg/ml的EDTA；
大约1mM至大约50mM的组氨酸；
大约0.01mg/ml至大约10mg/ml的聚山梨酯80；和
大约10mg/ml至大约100mg/ml的海藻糖。
20.稳定的组合物，其包含至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体和螯合剂，其中所述组合物包含一定量的螯合剂，所述量足以当组合物在大约40℃的温度下保持至少大约26周的时间时使所述组合物稳定。
21.液体药物组合物，其包含至少一种单克隆抗-MAdCAM抗体和药学上可接受的螯合剂，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和所述螯合剂的浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450的范围内。
22.液体药物组合物，其包含：
至少一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人MAdCAM；
和药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物包含浓度为至少大约50mg/ml的抗体。
23.制备液体药物组合物的方法，其包括将至少一种抗-MAdCAM抗体与至少一种螯合剂在溶液中混合，所述抗体具有SEQ ID NO：2的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：4的轻链氨基酸序列。
24.用于治疗受试者中的炎性疾病的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：
a)治疗有效量的至少一种抗-MAdCAM抗体；和
b)药学上可接受的螯合剂。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65976605P | 2005-03-08 | 2005-03-08 | |
| US60/659,766 | 2005-03-08 | ||
| US60/728,165 | 2005-10-19 | ||
| US60/752,712 | 2005-12-20 | ||
| US60/762,456 | 2006-01-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101193917A true CN101193917A (zh) | 2008-06-04 |
Family
ID=39488251
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200680015670.4A Active CN101325968B (zh) | 2005-03-08 | 2006-03-02 | 抗ctla-4抗体组合物 |
| CNA2006800136236A Pending CN101193917A (zh) | 2005-03-08 | 2006-03-02 | 抗-MAdCAM抗体组合物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200680015670.4A Active CN101325968B (zh) | 2005-03-08 | 2006-03-02 | 抗ctla-4抗体组合物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN101325968B (zh) |
| AR (1) | AR099084A2 (zh) |
| ZA (2) | ZA200707194B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104398471A (zh) * | 2008-11-28 | 2015-03-11 | Abbvie公司 | 稳定的抗体组合物和用于稳定其的方法 |
| CN111032694A (zh) * | 2017-07-14 | 2020-04-17 | 辉瑞大药厂 | 针对madcam的抗体 |
| WO2022116858A1 (zh) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种抗tslp抗体药物组合物及其用途 |
| CN115282281A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-11-04 | 智泽童康(广州)生物科技有限公司 | 铁死亡抑制剂在制备防治胆道疾病的药物中的应用 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3053572A1 (en) * | 2015-02-06 | 2016-08-10 | Ares Trading S.A. | Liquid pharmaceutical composition |
| LT3283107T (lt) * | 2015-04-17 | 2020-09-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Kompozicija apimanti ipilimumabo ir nivolumabo kombinaciją |
| CN106620691B (zh) * | 2015-11-04 | 2020-08-21 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 一种重组全人源抗ctla-4单克隆抗体制剂及其应用 |
| CN106913869B (zh) * | 2017-03-17 | 2020-07-28 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 一种抗ctla-4单克隆抗体制剂及其应用 |
| CN114793422A (zh) * | 2019-12-25 | 2022-07-26 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 抗ctla-4单克隆抗体及其制备方法与应用 |
| CN111410688A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-14 | 苏州智享众创孵化管理有限公司 | 一种提高双特异性抗体纯度的分离纯化方法 |
| CN112569183B (zh) * | 2020-12-11 | 2022-12-09 | 上海赛金生物医药有限公司 | 一种抗ctla-4抗体及融合蛋白的制剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002351353A1 (en) * | 2001-12-19 | 2003-09-02 | Genentech, Inc. | Stabilizing polypeptides which have been exposed to urea |
-
2006
- 2006-03-02 CN CN200680015670.4A patent/CN101325968B/zh active Active
- 2006-03-02 CN CNA2006800136236A patent/CN101193917A/zh active Pending
-
2007
- 2007-08-24 ZA ZA200707194A patent/ZA200707194B/en unknown
- 2007-08-28 ZA ZA200707293A patent/ZA200707293B/xx unknown
-
2015
- 2015-01-13 AR ARP150100081A patent/AR099084A2/es unknown
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104398471A (zh) * | 2008-11-28 | 2015-03-11 | Abbvie公司 | 稳定的抗体组合物和用于稳定其的方法 |
| CN111032694A (zh) * | 2017-07-14 | 2020-04-17 | 辉瑞大药厂 | 针对madcam的抗体 |
| CN111032694B (zh) * | 2017-07-14 | 2024-03-08 | 辉瑞大药厂 | 针对madcam的抗体 |
| WO2022116858A1 (zh) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种抗tslp抗体药物组合物及其用途 |
| CN115282281A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-11-04 | 智泽童康(广州)生物科技有限公司 | 铁死亡抑制剂在制备防治胆道疾病的药物中的应用 |
| CN115282281B (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-13 | 智泽童康(广州)生物科技有限公司 | 铁死亡抑制剂在制备防治胆道疾病的药物中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101325968A (zh) | 2008-12-17 |
| AR099084A2 (es) | 2016-06-29 |
| CN101325968B (zh) | 2014-04-23 |
| ZA200707293B (en) | 2009-04-29 |
| ZA200707194B (en) | 2008-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101193917A (zh) | 抗-MAdCAM抗体组合物 | |
| KR100996801B1 (ko) | 항-ＭＡｄＣＡＭ 항체 조성물 | |
| US11612659B2 (en) | Anti-CD40 antibody formulation delivery device | |
| US10899841B2 (en) | Anti-BAFFR antibody formulations and methods of use thereof | |
| JP4679035B2 (ja) | 併用療法 | |
| CN105263514B (zh) | 抗铁调素抗体及其用途 | |
| JP2021531826A (ja) | 栄養膜細胞表面抗原２（ｔｒｏｐ２）に対する特異的な抗体 | |
| KR20180133198A (ko) | T-조절 세포의 증식을 위한 인터류킨-2 뮤테인 | |
| JP7097293B2 (ja) | ヒトＦｃ受容体に結合する融合タンパク質 | |
| CN109311992B (zh) | 用于治疗t细胞介导疾病的新型抗cd6抗体 | |
| TW200916478A (en) | Anti-CD37 antibodies | |
| CN106659785A (zh) | 包含gm‑csf中和化合物的液体制剂 | |
| CN110461359A (zh) | 用于预防和治疗心脏病的方法 | |
| CN115916335A (zh) | 抗glp1r拮抗剂抗体及其使用方法 | |
| CN114026119A (zh) | 结合pdgf-b和pdgf-d的抗原结合分子及其用途 | |
| JP6320040B2 (ja) | 抗ｐｒｏｋ１抗体及び抗ｖｅｇｆ抗体併用による大腸癌の治療 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1117844 Country of ref document: HK |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20080604 |
|
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1117844 Country of ref document: HK |