CN102007144B - 衍生自重组酵母的具有止血活性的微泡及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有促凝活性的携带组织因子的酵母来源的微泡，其包含酵母膜和组织因子蛋白或其片段，或者与另一肽融合为融合蛋白的组织因子蛋白或其片段。所述产物在治疗个体出血中能够被用作促凝剂。

Description

衍生自重组酵母的具有止血活性的微泡及其用途

发明领域

本发明一般涉及用促凝剂治疗个体出血。更具体地，本发明涉及具有促凝活性的携带组织因子的酵母来源的微泡，其包含酵母膜和组织因子蛋白或其片段，或者与另一肽融合为融合蛋白的组织因子蛋白或其片段，以及涉及它作为促凝剂用于治疗个体出血以及用于促进血管生成和细胞迁移的应用。本发明还涉及用于制备所述携带组织因子的酵母来源的微泡的方法。 

发明背景 

止血是生物体对出血作出应答的机制，其涉及在损伤后立即起作用且长时间保持活性的两个过程的参与。第一个过程被称为原发性止血，其特征在于在血管损伤部位发生血管收缩并形成血小板聚集。第二个过程称为继发性止血，在此阶段由于不同凝血级联(coagulationcascade)蛋白水解酶的作用，形成纤维蛋白凝块。 

多种辅因子及蛋白水解酶参与凝血过程的第二阶段，它们皆称为凝血因子，且这一阶段又由几个阶段组成，以由于凝血酶的作用由纤维蛋白原水解形成纤维蛋白作为结束。凝血酶预先由脱辅基酶，凝血酶原进行蛋白水解形成。此蛋白水解作用是由与活化的血小板的表面结合的活化的凝血因子X(FXa)完成的，且只有当其辅因子，活化的凝血因子V(FVa)及钙离子存在时，此活化的凝血因子X(FXa)才能够水解凝血酶原。凝血因子X(FX)能够由两种单独的途径活化，即内源途径及外源途径。 

内源途径包括一系列反应，其中各个酶原被水解，产生其活性蛋白酶形式。在各步骤中，新形成的蛋白水解酶催化下一酶原的活化以相继产生活性形式。 

在血液凝固的外源途径中，在损伤部位的血管外膜细胞上暴露的 组织因子(TF)结合循环凝血因子VII/活化的凝血因子VII(FVII/FVIIa)，以形成TF::FVIIa复合物，并且当钙离子存在时以用作使FX活化的基质。外源途径目前被认为在血液凝固中是最相关的途径，公认如果发生由血管损伤导致的出血，则由涉及TF与其配体FVII/FVIIa的相互作用的外源途径活化启动凝血。 

TF由蛋白质组分(先前被称为组织因子脱辅基蛋白-III)和磷脂组成。TF特异性地与FVII/FVIIa结合，并在血液凝固外源途径中起重要作用。TF的生理作用是公知的；一方面它是FVIIa特异性的受体，一旦形成TF::FVIIa复合物，它便作为发生FX活化的基质。事实上在血管损伤后，通常隐蔽在血管外围的外膜细胞表面上的TF与其配体，存在于血液中的FVII接触并相互作用，形成TF::FVII复合物。一旦形成该复合物，便发生FVII自体活化，产生其活化形式FVIIa。 

糖基化作用是酶指导的位点特异性过程，通过所述过程将糖类附加于脂质和蛋白质。该过程被认为涉及稳定性、折叠和转运；虽然没有描述糖基化作用对于TF的实际功能的证据。 

已经广泛公认TF是负责快速启动凝血的主要成分。为了开始凝血，绝对需要活化FX并引发凝血酶原水解。FXa的来源主要来自FVIIa与其受体TF的相互作用。 

已经报导了来自各种组织的TF的纯化，所述各种组织例如：人脑、牛脑，人胎盘，绵羊脑以及肺。普遍公认虽然物种间TF蛋白的结构存在差别，但是如体外凝血测定所测量的那样无功能性差别。 

普遍公认为了证实生物活性，TF在体外必须与磷脂结合。已经显示出例如通过使用磷脂酶除去TF的磷脂组分导致其体外生物活性损失。再脂化作用能够恢复体外TF活性。 

虽然已经可以利用从各种组织获得的某些“纯化的”TF蛋白，但是，血液和组织中的TF蛋白的低浓度以及纯化来自组织的该蛋白在经济和精力两方面的高成本使这成为稀缺材料。因此，亟需寻找TF蛋白的替代来源，有利的是脂化的TF蛋白。 

已经使用克隆的人cDNA使TF蛋白在各种系统中表达。因此，已经报导了TF蛋白在大肠杆菌(E.coli)中的过量表达(Paborsky et al.， Biochemistry 28，8072(1989))。此外，第6,261,803号美国专利公开了用于在原核宿主生物中制备功能性重组TF的方法。在大肠杆菌中实现了完整的TF蛋白的高表达量。 

虽然蛋白质在大肠杆菌中的异源表达存在某些优势，但是由于细菌缺乏它们自己的糖基化系统，真核蛋白在所述细菌中的表达伴随着许多问题，主要是当待表达的蛋白质是糖基化的真核蛋白时。 

因此，替代策略在于表达缺失跨膜区的突变的TF蛋白。这种所谓的“可溶”TF(或“截短”TF)在细菌细胞的细胞质中蓄积，并且能够较大量表达。然而，在该系统中，这样表达的TF蛋白通常以所谓包含体的形式以准晶态存在于大肠杆菌中。当在这种情况下，必须通过使用非常大量的促溶剂来溶解包含体，然后使已经以这种方式形成单体的蛋白质再一次被折叠成有活性的复性构型，这需要付出大量努力而通常只有低产率。此外，原则上，可溶性TF由于其缺乏与磷脂相互作用的结构域而不适合用于凝血酶原时间试剂。 

用于过量表达TF蛋白的另一方法在于使用大量已知并成功应用的表达系统，其编码基因融合的产物(例如与β-半乳糖苷酶、MalE、谷胱甘肽转移酶、His-标签等融合)。然而，这些系统不适合表达生物活性TF。虽然当使用所述系统时，能够检测表达产物并且还能够增加表达水平，但是这样获得的表达产物有时伴随有功能完全丧失，这即使使用精细的复性方法也不能恢复。 

能够通过将TF蛋白在真核系统中进行表达来避免TF蛋白在大肠杆菌中过量表达的问题。因此，原则上在酵母细胞中，在使用杆状病毒作为载体的昆虫细胞培养物中，或者在诸如仓鼠卵巢细胞的培养的哺乳动物细胞中，或者在人细胞系中的表达是合适的。然而，这些系统具有紧要的缺点，其中当与重组大肠杆菌产物比较时重组蛋白产率低得多。 

酵母菌株结合上述不同宿主系统的优势。一方面它们比大肠杆菌更接近地模拟真核蛋白的天然生理机能，且另一方面它们易于处理、易于培养，生长快得多并经济得多。然而还是存在若干因素影响蛋白质在酵母中的表达。这些因素包括但不限于： 

-基因调控序列的选择，所述基因调控序列例如启动子，其控制异源蛋白的表达；用来控制异源表达的启动子序列通常应该是“强的”，即它们应该导致非常高的蛋白质表达并且是适当可控的，由此所述表达可以首先被有效地抑制直到达到培养物的最佳生物量，然后被迅速启动以实现蛋白质表达；以及 

-表达的异源蛋白的有效分泌；表达的蛋白质(胞外表达)的分泌通常优于胞内表达，因为后者首先需要裂解细胞从而使整个细胞内容物流出，然后从细胞材料和碎片的混合池(cesspool)中分离出所需蛋白质。而蛋白质的有效分泌也取决于若干因素，包括：(i)信号序列-肽序列的选择，所述信号序列-肽序列通常为天然分泌的蛋白质的N-末端区域，并指导蛋白质进入细胞分泌途径，以及(ii)分泌途径的特异性成分，其与信号序列相互作用并影响所连接的蛋白质的分泌。 

Stone M.J.等人(Biochem.J.(1995)310，605-614)描述了TF(截短TF)的表面结构域在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达。为了进行TF纯化，将培养物加载于与抗TF抗体偶联的免疫亲和柱上，并且将蛋白质洗脱并透析。该测定法允许使用毫克量的截短TF。 

Brucato C.L.等人(Protein Expression and Purification(蛋白表达和纯化)26(2002)，386-393)描述了成熟的全长重组兔TF蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达。通过固定的金属离子亲和色谱来纯化TF蛋白。 

迄今为止，还没有以高产率从酵母制备大量生物活性的重组TF的已知方法。有利的是，所述重组TF应该在高水平活性下获得，优选在适于治疗用途的活性水平下获得。因此，本发明的目的在于使用重组技术产生有用的大量的脂化TF蛋白。有利的是，重组TF蛋白应该用于治疗应用。 

发明概述 

本发明第一方面涉及携带组织因子(TF)的酵母来源的微泡，其包含(i)酵母膜，以及(ii)具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其变异体，其中所述具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其片段的一部分被整合 到所述膜中。 

另一方面，本发明涉及包含携带TF的酵母来源的微泡的组合物、涉及作为药物的携带TF的酵母来源的微泡、涉及包含携带TF的酵母来源的微泡的药物组合物、涉及用于治疗个体出血的携带TF的酵母来源的微泡以及涉及用于治疗需要促进个体细胞迁移和/或血管生成的疾病的携带TF的酵母来源的微泡。 

另一方面，本发明涉及用于制备本发明的具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的方法，其包括以下步骤： 

a)将表达具有促凝活性的TF蛋白或其变异体的重组酵母细胞的培养物在允许所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段表达的条件下发酵； 

b)沉淀由步骤a)的发酵所得的产物，以提供发酵产物； 

c)将从步骤b)获得的所述发酵产物匀浆，以提供发酵匀浆液； 

d)将步骤c)获得的所述发酵匀浆液分离，以提供沉淀和包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的澄清酵母提取物(CYE)； 

e)收集包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取物(CYE)；以及，任选地， 

f)如果需要，将具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。 

另一方面，本发明涉及用于制备包含来自真核宿主细胞的感兴趣膜蛋白的微泡的方法，其包括以下步骤： 

a)使所述真核宿主细胞的培养物在允许所述感兴趣膜蛋白表达的条件下生长； 

b)将a)的培养物的细胞部分匀浆； 

c)将从步骤b)获得的匀浆液分离，以提供沉淀和包含所述含有目的膜蛋白的细胞来源的微泡的澄清细胞提取物；以及 

d)通过尺寸分配(size partitioning)纯化所述细胞来源的微泡。 

另一方面，本发明涉及修饰的组织因子(TF)脂化蛋白，其选自： 

(i)具有促凝活性的截短组织因子(TF)，其缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域， 

(ii)具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的，以及 

(iii)具有促凝活性的TF蛋白突变体，其携带至少一个非功能性N-糖基化位点。 

另一方面，本发明涉及用作药物的本发明的修饰的TF脂化蛋白，涉及包含修饰的TF脂化蛋白和药物可接受的介质的药物组合物，涉及用于治疗个体出血和用于治疗个体需要促进细胞迁移和/或血管生成的疾病的修饰的TF脂化蛋白。 

另一方面，本发明涉及多核苷酸序列，其编码具有促凝活性的截短组织因子(TF)，所述截短组织因子缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域；编码具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的；以及编码携带至少一个非功能性N-糖基化位点的具有促凝活性的TF蛋白突变体。 

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸序列的载体，涉及包含本发明的多核苷酸或本发明载体的宿主细胞，以及涉及与本发明的修饰的TF蛋白特异性结合的抗体。 

附图简述 

图1显示用于产生pTT10301的克隆策略。图1A显示pTT10301质粒的图谱。将包含GPD启动子(pGPD)、唯一BamH1位点和PGK终止子(PGKt)的1,050bp DNA片段用HindIII和XbaI DNA限制酶消化后从质粒pG1中切除。通过琼脂糖凝胶电泳分离出DNA片段，并用DNA提取试剂盒(Qiagen)纯化并克隆至预先用HindIII和XbaI消化的Yep352质粒中。使得到的质粒pTT10301质粒在大肠杆菌中生长，并用商购的DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。图1B显示所产生的pTT10301质粒的限制性内切核酸酶分析。 

图2显示人TF蛋白的亲水性图。该图显示了蛋白质的四个结构域(前导序列结构域、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域)。 

图3显示人TF蛋白的cDNA序列(基因库#BC011029)。加外框于可读框(ORF)以及起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。cDNA序列包含人TF蛋白(hTF)的四个结构域(信号肽、胞外结构域、跨膜区和胞质尾区)。箭头显示引物A[上游引物，编码缺失信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸，并包含在具有TF ORF的框内的起始密码子ATG]的退火位置和引物B[下游引物，粗体为终止密码子]的退火位置，两者均包含限制性BamHI位点(下划线)。

图4显示用于产生pTT10302质粒的克隆策略的图示(图4A)。将从PCR反应获得的DNA片段用BamHI消化并克隆至预先用BamHI消化和去磷酸化的pTT10301质粒中。使所得质粒(pTT10302)在大肠杆菌中生长并用商购的DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。图4B显示所产生的pTT10302质粒的限制酶切分析。 

图5显示rTF在不同重组酵母克隆中的表达。通过使用纯化的小鼠抗人CD142单克隆抗体(BID Biosciences Pharmingen)进行酵母提取物的Western印迹分析，所述酵母用空质粒pTT10301(C-)和用包含重组成熟hTF蛋白的表达载体，pTT10302(泳道1-8)转化。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。 

图6显示在用内切糖基化酶(endoglycosylase)处理yTT10301提取物后的Western印迹结果。因此，按照制造商的说明，在37℃下将来自表达rTF的酵母(yTT10301)的提取物用500单位内切糖基化酶H(Endo H)(泳道2)或N-糖苷酶F(PNGase F)(泳道3)处理1小时。使用抗人TF mAb通过Western印迹分析这些样品和未处理的提取物(泳道1)。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。 

图7是显示rTF通过yTT10301重组酵母的表达的激光共聚焦显微镜照片。将来自表达rTF的重组酵母的原生质球(Spheroplasts)用4％多聚甲醛固定，并用抗酵母ATPase mAb(图7A)或抗人mAb(图7B)孵育。在用与荧光素偶联(fluorescein-conjugated)的山羊抗小鼠二抗孵育后，通过共聚焦显微镜(1、3、5和7)或通过相差显微镜(2、4、6和8)来观察细胞。图像取自BIO-RAD Radiance 2000激光共聚焦显微镜。 

图8是显示rTF通过重组酵母的表达取决于pTT10302质粒存在的激光共聚焦显微镜照片。将来自携带空表达质粒pTT10301的重组酵母(yTT10300)的原生质球用4％多聚甲醛固定，并用抗酵母ATPase的mAb(图8A)或用抗人TF mAb(图8B)孵育。在用荧光素偶联的山羊抗小鼠二抗孵育后，通过共聚焦显微镜(1和3)或通过相差显微镜(2和4)来观察细胞。图像取自BIO-RAD Radiance 2000共聚焦激光显微镜。 

图9显示rTF与酵母膜结合。将来自yTT10301的提取物用TritonX114处理，并且在离心后分离水相和去垢剂沉淀。再次用Triton X114(1％终浓度)处理水相，并且如前所述分离两相。将第二去垢剂沉淀与第一去垢剂沉淀混合。用SDS-PAGE和考马斯蓝染色(图9A)或通过与抗人TF的mAb反应的Western印迹(图9B)来分析完整提取物(泳道1)、第一(泳道2)水相、第二(泳道3)水相和去垢剂相(泳道4)。 

图10是显示在整个发酵过程中主要参数演化的图。作为唯一不受控制的参数的氧分压(PO₂)的变化反映了细胞在该过程中需氧量的变化。当PO₂达到稳定状态(18小时)时停止发酵。 

图11是表示用于制备CYE-TF的发酵过程的总体方案的图。 

图12显示Western印迹分析结果以确定TF是否存在于由第一发酵试验获得的制剂中。每一泳道对应于5μl通过图11中所述的操作获得的上清液(sn)或沉淀(pp)。使用抗人TF的特异性mAb通过Western印迹来分析蛋白样品。阳性对照(rTF)是商购的在大肠杆菌中产生的重组TF(10ng)(American Diagnostica，Inc.)。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。 

图13显示CYE-TF样品的电子显微镜图像。CYE-TF产物被吸附至预先通过辉光放电(glow discharge)处理的碳包被的铜网。在用抗hTF的特异性mAb或用无关抗体孵育前，用包含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS孵育该网1小时。用PBS彻底洗涤网，并用金偶联的兔抗小鼠IgG二抗孵育。洗涤网并通过用1％乙酸铀处理来负染样品。由JEOL1200 EXII电子显微镜获得图像。箭头表示胶态金颗粒的位置。 

图14显示通过切向流过滤(Tangential Flow Filration)的CYE-TF的澄清程序图解。A)使CYE-TF在错流过滤系统(Sartorius sartoflowSlice 200 Benchtop)中进行切向流过滤(TFF)。将CYE-TF通过0.45μm、0.2μm和0.1μm膜(Sartorius，聚砜)连续过滤。预先用磷酸盐缓冲液(20 mM磷酸钠，pH为7.4，500mM NaCl)平衡该膜。回收在通过0.2μm膜过滤后和在0.10μm膜过滤前仍然保留的物质，并将其用作用于接下来的纯化步骤的起始物质。B)使用动态光散射(Dinamic lightscatering)来测定微泡的粒径分布。 

图15显示在Sephacryl S-500柱中进行的CYE-TF产物的尺寸排阻色谱图。于4℃在1mL/min流速下用磷酸盐缓冲液进行洗脱并收集4mL组分。通过测量280nm处的光密度来监测蛋白洗脱。 

图16显示Western印迹测定法以检测rTF。将15μL各组分在12.5％-SDS-PAGE Tris-甘氨酸凝胶上进行电泳。电泳后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。然后将膜用抗TF商购的小鼠单克隆抗体(AmericanDiagnostica)孵育1小时。然后将膜用兔抗小鼠IgG抗体孵育，随后用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG抗体孵育。使用ECL高级Western印迹试剂盒(GE Healthcare)通过化学发光法来检测免疫反应性蛋白。 

图17显示包含由尺寸排阻色谱法纯化的rTF的不同批次(lot)微泡的蛋白图谱(protein profile)。A)将来自包含rTF的四个不同批次的纯化微泡的蛋白(如图上方所示)通过SDS-PAGE分级，并将凝胶用考马斯蓝染色。分子量标记示于图的左侧。B)在将染色的凝胶扫描后，将各批次中的不同蛋白条带进行密度测定分析。 

图18显示薄层色谱法(TLC)分析。PA：磷脂酸(Sigma)，PS：磷脂酰丝氨酸(Fluka)，PG：磷脂酰甘油(Sigma)，CAR：心磷脂(Sigma)，ERG：麦角固醇(Fluka)，PE：磷脂酰乙醇胺(Sigma)，PI：磷脂酰肌醇(Sigma)，PC：磷脂酰胆碱(Sigma)，TAG：三酰甘油(Sigma)。 

图19显示人TF蛋白的cDNA序列(基因库#BC011029)。加外框于可读框(ORF)以及起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。cDNA序列包含人TF(hTF)蛋白的四个结构域(信号肽、胞外结构域、跨膜区和胞质尾区)。箭头显示引物A[上游引物，编码缺失信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸，并包含带有TF ORF的框内的起始密码子ATG]的退火位置和引物E[下游引物，粗体为编码组氨酸的核苷酸]的退火位置，两者均包含限制性BamHI位点(下划线)。 

图20显示产生pTT10303的克隆策略。图20A显示将从PCR反应获得的DNA片段用BamHI消化并克隆至预先用BamHI消化并去磷酸化的pTT10301质粒中。使所得质粒pTT10303在大肠杆菌中生长并用商购DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。图20B显示所产生的pTT10303的限制酶切分析。 

图21显示rTF-his-标签的表达的Western印迹分析结果。对来自重组酵母yTT10302(泳道1-4，对应于克隆2至5)的培养物的提取物和在大肠杆菌(C+)中产生的rTF进行Western印迹分析。将印迹与纯化的小鼠抗人CD142单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)反应。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。 

图22也显示了rTF-his-标签的表达的结果。图22A显示来自酵母yTT10300(泳道1)、表达rTF的yTT10301(泳道2)或表达rTF-his-标签的yTT10302(克隆#5)(泳道3)的SDS-PAGE和考马斯蓝染色。阳性对照对应于在大肠杆菌中产生的5ng的rTF(泳道4)。图22B是使用纯化的小鼠抗人CD142单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)对与图17A所示样品相同的样品进行Western印迹分析。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。 

图23示意性地显示6HT-TF的纯化过程。 

图24显示通过亲和色谱法纯化6HT-TF的结果。CYE-6HT-TF用作起始物质。通过切向过滤将提取物通过0.2μm孔径过滤器过滤，并将其应用至5ml商购金属螯合亲和色谱柱( 

PharmaciaBiotech)。将该柱分别用不含咪唑、含10mM咪唑和含100mM咪唑的起始缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl，pH 7.4)连续洗涤三次。将6HT-TF用含有1M咪唑的相同缓冲液洗脱。收集2.5ml洗脱组分(泳道4至7，分别对应于组分#1、#2、#3和#4)，并对20mM磷酸盐缓冲液、50mM NaCl、pH 7.4进行透析。通过SDS-PAGE和Western印迹(图24A)或者银染法(图24B)分析起始过滤的酵母提取物(泳道1)、未结合的物质(泳道2)、用含有100mM咪唑的起始缓冲液进行的末次洗涤液和前四个洗脱组分。以kDa标记的分子量标记示于图的左侧。 

图25显示用内切糖基化酶处理后纯化的6HT-TF的Western印迹分析的结果。按照制造商的说明书，将6HT-TF的纯化组分用500单位PNGase F(泳道2)或Endo H(泳道3)处理。用抗人TF mAb通过Western印迹分析这些样品和未处理的洗脱液(泳道1)。以kDa表示的分子量标记示于图的左侧。 

图26显示通过亲和色谱法纯化的6HT-TF的免疫电子显微镜检查的结果。将第一洗脱组分吸附至胶体包被的铜网。该网用抗TF单克隆抗体处理用于免疫金标记。 

图27是本发明的携带TF的酵母来源的微泡的图示。图22A显示本发明的携带TF的酵母来源的微泡的示意图，所述微泡包含酵母来源的膜(1)和整合到所述酵母来源的膜(1)中的TF蛋白(2)(或其具有促凝活性的片段)。显示了内微泡空隙(3)(intra-microvesicle space)和外微泡空隙(4)(extra-microvesicle space)。图22B和22C显示本发明的携带TF的酵母来源的微泡的基本结构。酵母来源的膜脂双层的脂质是两亲性的；它们具有指向外微泡空隙(4)的亲水极性头(5)和指向内微泡空隙(3)的两个疏水烃尾。在图22B所示的实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白(2)或其片段的N-末端结构域朝向外微泡空隙(4)。在图22C所示的实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白(2)或其片段的N-末端结构域朝向内微泡空隙(3)。 

图28显示人TF蛋白的cDNA序列(基因库#BC011029)。加外框于可读框(ORF)以及起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)。cDNA序列包含人TF(hTF)蛋白的四个结构域(信号肽、胞外结构域、跨膜区和胞质尾区)。箭头显示引物F[上游引物，编码缺失信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸，并包含具有TF ORF的框内的始密码子ATG]的退火位置和引物E[下游引物，粗体为编码组氨酸的核苷酸]的退火位置，两者均包含限制性BamHI位点(下划线)。 

图29.产生pTT10304的克隆策略。A)将从PCR反应获得的DNA片段用BamHI消化并克隆至预先用BamHI消化并去磷酸化的pTT10301质粒中。使所得质粒pTT10304在大肠杆菌中生长并用商购 DNA纯化JETstar试剂盒(Genomed Gmbh)纯化。B)所产生的pTT10304载体的限制内切分析。 

图30显示人TF的糖基化位点中的点突变位置的图示。 

图31显示用抗TF1抗体探测的Western印迹。PM1是指在11位的Ala-Asn变化，PM2是指在124位的Ala-Asn变化，以及PM3是指在137位的Asn-Ala变化。PM1，2；1，3；以及1，2，3是指它们的组合。TT103MH是野生型TF。 

图32.TT-103和再脂化的rTF的促凝活性的剂量-反应曲线。使用混合的正常人血浆和不同浓度来自不同集合(pool)的TT-103或再脂化的rTF在血凝仪中测量促凝活性。 

图33显示未处理的TT-103(1)、经过曲拉通X-100(Triton X-100)处理的TT-103(2)、在透析后经过曲拉通X-100处理的并使rTF再脂化的TT-103(3)、空脂质体(4)和来自非表达rTF重组酵母的微泡(5)的体外促凝活性。在样品1、2和3中由ELISA测定的rTF的量相同(120ng/mL)。 

图34显示与再脂化的rTF、凝血酶和凝血活酶含钙试剂(Thromborel S)相比，TT-103在肝素化血浆(TT-103)中的促凝活性。 

发明详述 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡

一方面本发明涉及携带组织因子的酵母来源的微泡，下文称为“本发明的携带TF的酵母来源的微泡”，其包含(i)酵母膜，以及(ii)具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其变异体，其中所述具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其片段被整合到所述脂双层中。本发明的携带TF的酵母来源的微泡具有促凝活性，并且它能够用作治疗个体出血的药物。 

如本文所使用的，术语“酵母来源的微泡”是指基本上由来自酵母细胞的膜或其片段组成的封闭小区室。一般来说，膜是指形成细胞边界(即细胞膜或质膜)或胞内细胞器边界的几个分子厚度的有机层(organized layer)。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡的组分(i)是酵母膜，其来自于用于制备本发明的携带TF的酵母来源的微泡的酵母细胞。通常，膜由两层定向脂层(即脂双层)组成，其中能够植入蛋白质。在水性环境中，作为细胞膜基本结构的脂双层通常由两性分子(例如磷脂、脂肪酸等)形成，每一分子被定向为亲水基团在所述层的外部且疏水基团向着所述层的内部。通常，蛋白质被植入脂双层中；因此本发明的携带TF的酵母来源的微泡包含来自酵母细胞膜的蛋白质，其通常被整合到所述酵母细胞膜中。 

在具体实施方案中，所述酵母来源的微泡衍生自酵母细胞膜或其片段，例如酵母细胞质膜或其片段。在另一具体实施方案中，所述酵母来源的微泡衍生自细胞内的酵母细胞器膜或其片段，例如核、高尔基体、内质网等等。 

一般来说，所述酵母来源的微泡来自用于制备该微泡的酵母细胞(例如在将酵母发酵产物进行如实施例1公开的方法所示的匀浆处理后)。实际上任何酵母细胞均能够用于制备所述酵母来源的微泡，有利的是非絮凝酵母细胞(non-flocculent yeast cells)，并且优选由联邦药品管理局(FDA)分类为用于人类消耗的“公认为安全”(或GRAS)酵母细胞的酵母细胞，因为所述GRAS批准的物质由于它们基本上对包括人类的动物无害而不要求FDA的上市前批准。能够在制备本发明的携带TF的酵母来源的微泡方法中使用的酵母细胞的示例性而非限制性实例是所谓的酒类酵母(liquor yeast)菌种，其通过代谢酿造材料液体产生乙醇、二氧化碳、面包酵母(Baker’s yeast)等等。具体地，优选的酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces sp.)的酵母细胞等等，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株T73 ura3^-、酿酒酵母T73菌株的衍生物、广泛用于酿酒(实施例1)的菌株或毕赤酵母(Pichia sp.)。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡的组分(ii)是具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其变异体。 

如本文所使用的“TF变异体”是指通过置换、插入或添加一个或多个氨基酸衍生自TF的任何多肽。 

在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡的所述 组分(ii)是TF蛋白。 

本文所使用的术语“组织因子”或“TF”包括任何动物物种的天然或野生型(wt)TF，以及保持所述wt TF的至少一种功能的突变体，有利的是，保持涉及凝血的wt TF的功能，所述任何动物种类包括人类。 

TF蛋白是广泛分布于动物界的完整的膜糖蛋白，如天然发现的那样，其由蛋白质成分(蛋白质)和磷脂组成。某些糖基化位点存在于TF蛋白中，用于将寡糖侧链添加至所述蛋白质以提供糖基化形式的TF蛋白。根据糖基化程度能够获得不同糖基化形式的TF蛋白。在这点上，成熟TF包含Asn-Xaa-Ser/Thr形式的三个潜在N-连接糖基化位点(Asn¹¹-Leu¹²-Thr¹³、Asn¹²⁴-Val¹²⁵-Thr¹²⁶和Asn¹³⁷-Asn¹³⁸-Thr¹³⁹)。酵母中的N-连接糖基化通常包括涉及约10个甘露糖残基的内部核心和50-100甘露糖残基的分支外链，所述内部核心经由两个GlcNAc残基与天冬酰胺连接。因此，N-连接糖基化能够将多达300个甘露糖残基潜在地添加至TF，分子质量增加约60kDa。此外，也可以将若干个甘露糖残基与多个(多于25)O-连接糖基化位点连接。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡包含糖基化的TF蛋白。如本文所使用的术语“糖基化”包括任何程度的糖基化。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡的示意图在图27中显示。 

TF蛋白具有结构域结构，即它是具有独立功能区的蛋白质。在具体实施方案中，所述TF蛋白是人TF(hTF)蛋白。hTF蛋白的各结构域具有独特的结构特征和功能特征：(1)具有32个氨基酸前导序列的信号肽或区域，当该蛋白从未成熟形式被加工为成熟形式时，该信号肽或区域被翻译后加工；(2)包含约219个末端氨基酸的N-糖基化亲水性胞外结构域；(3)约23个氨基酸的片段，主要为疏水性，这些氨基酸被认为是跨膜结构域氨基酸；以及(4)21个氨基酸的羧基端，其被认为是蛋白胞质片段的氨基酸形成部分。hTF蛋白的结构域结构允许产生例如蛋白质或其功能片段的胞外结构域。hTF蛋白的氨基酸序列是已知的，并可在诸如NCBI的蛋白质数据库中查到(hTF，访问号码(Access number)：P13726)。 

此外，TF蛋白可以是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含含有 TF蛋白的第一区域，所述TF蛋白与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。所述第二区域可以与所述TF蛋白的氨基末端区域结合，或者所述第二区域可以与所述TF蛋白的羧基末端结合。第一区域和第二区域均可以彼此直接连接或者可以通过所述第一区域和第二区域间的连接多肽结合。

在具体实施方案中，所述融合蛋白包含TF蛋白和标签，所述标签与所述TF蛋白的C-末端或N-末端结构域结合，通常为肽标签。所述标签通常是能够用于分离和纯化所述融合蛋白的肽或氨基酸序列。因此，所述标签能够与一个或多个配体结合，例如，诸如色谱支持体或高亲和力磁珠的亲和基质的一个或多个配体。所述标签的实例是能够以高亲和力与镍(Ni²⁺)柱或钴(Co²⁺)柱结合的组氨酸标签(His-标签或HT)，例如包含6个组氨酸残基(His6或H6)的标签。如实施例2和实施例3所示，His-标签具有能够在大部分蛋白变性且大部分蛋白-蛋白相互作用破坏的条件下与其配体结合的期望特征。因此，它能够在诱饵已经参与的蛋白-蛋白相互作用被破坏后用于除去用H6标签的诱饵蛋白。 

用于分离或纯化融合蛋白的标签的其它示例性而非非限制性实例包括Arg-标签，FLAG-标签，Strep-标签，能够被抗体识别的表位，例如c-myc-标签(被抗c-myc抗体识别)、SBP-标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶-标签、麦芽糖结合蛋白、NusA、TrxA、DsbA、Avi-标签等等(TerpeK.，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2003)，60：523-525)，氨基酸序列，例如Ala-His-Gly-His-Arg-Pro(SEQ ID NO：2)；Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser(SEQ ID NO：3)；Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys(SEQ ID NO：4)；β-半乳糖苷酶等等。 

在具体实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白的C-末端结构域结合的His-标签。在另一实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白的N-末端结构域结合的His-标签。 

所述融合蛋白还具有促凝活性。所述融合蛋白的促凝活性能够如前所述进行测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析，例如通过血浆中的体外凝固分析，或者通过非抗凝全血中的体外凝固分析， 或者通过严重出血动物模型的体内测定或通过致命性动物出血模型的体内测定，例如实施例4中提到的那些测定法。 

所述融合蛋白可以通过常规手段获得，例如通过使编码所述融合蛋白的核苷酸序列在合适的酵母细胞中进行基因表达。如果需要，能够使用终标签(eventual tag)来分离或纯化所述融合蛋白。 

在另一具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡的所述组分(ii)是具有促凝活性的TF片段。 

如本文所使用的，术语“具有促凝活性的TF蛋白片段”包括当其被脂化时具有促凝活性的来自TF的任何肽。TF片段的促凝活性能够通过任何常规测定法容易地测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析。仅作为示例性说明，TF片段的促凝活性能够通过以下分析测定：通过血浆中的体外凝固分析，或者通过非抗凝全血中的体外凝固分析，或者通过严重出血动物模型的体内测定或通过致命性动物出血模型的体内测定，例如实施例4中提到的那些测定法。 

所述具有促凝活性的TF蛋白片段的氨基酸序列能够与天然TF蛋白的相应片段的氨基酸序列一致，或可选地，或者它相对于天然TF蛋白可以具有一个或多个氨基酸的插入、缺失或修饰，前提是是所得TF蛋白片段具有促凝活性。 

在具体实施方案中，具有促凝活性的TF片段包含成熟TF蛋白。如本文所使用的，术语“成熟TF”是指氨基酸序列缺乏信号肽的TF蛋白。在优选实施方案中，所述成熟TF蛋白包括人成熟TF蛋白。此外，在具体实施方案中，所述人成熟TF蛋白具有在SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列。 

在另一具体实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白片段是TF蛋白，其中负责与FVIIa结合的全部或部分结构域缺失，因此所得蛋白不能与FVIIa结合。具有促凝活性但缺失负责与FVIIa结合的结构域的所述TF蛋白片段在本说明书中有时被称为“截短TF蛋白”或“截短型TF”。推而言之，所述“截短TF蛋白”可以包括具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的。 

在具体实施方案中，所述截短TF蛋白包含与因子X、跨膜区和 胞质尾区相互作用结构域，并部分或全部缺失负责与FVIIa结合的结构域。此外，在具体实施方案中，所述截短TF蛋白是截短型人TF蛋白，其包含与因子X(aa 174-251)、跨膜区(aa 252-274)和胞质尾区(aa275-295)相互作用的结构域，以及额外组氨酸标签(extra histidine tag)(实施例3)。发明人现在意外地发现缺失负责与FVIIa结合的结构域的所述截短型TF蛋白具有促凝活性(实施例4，表3)。 

本发明的作者已经意外地发现缺失部分或全部负责与FVIIa结合的结构域的所述TF片段具有促凝活性。该结果令人惊讶，因为众所周知在血液凝固的外源途径中，在损伤部位的外膜细胞上暴露的TF结合循环凝血因子VII/活化的凝血因子VII(FVII/FVIIa)，以形成TF::FVIIa复合物，当钙离子存在时作为使FX活化的基质。公认如果发生由血管损伤导致的出血，则由于涉及TF与其配体，FVII/FVIIa的相互作用的外源途径活化，将启动凝血。 

在另一实施方案中，修饰的TF在负责与FVIIa结合的结构域中包含一个或多个突变，其导致修饰的TF不能与所述FVIIa结合，或虽然能够结合，但亲和力显著降低。已知TF的FVIIa结合结构域中的点突变破坏了TF与所述FVIIa的结合是本领域公知的(例如由Kelley，R.F.等人在1995，Biochemistry，34：10383-10392中描述的那些，其内容因而以引用的方式整体并入本文)。 

本发明的作者还观察到当所述TF在糖基化位点中携带突变时，TF的促凝活性以及它在酵母宿主细胞中的表达增加，所述突变防止在野生型TF中发现的三个N-连接糖基链中的至少一个的连接。因此，在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡包含具有促凝活性的TF蛋白的非糖基化片段。如上所述，术语“糖基化”包括任何程度的糖基化。在优选实施方案中，TF变异体是多肽，其中TF的至少一个N-糖基化位点已经被修饰以致于使其为非功能性的，即不能用作添加糖苷链的受体位点。能够被修饰的TF序列中的N-糖基化位点是上文提到的那些，即Asn¹¹-Leu¹²-Thr¹³位点、Asn¹²⁴-Val¹²⁵-Thr¹²⁶位点和/或Asn¹³⁷-Asn¹³⁸-Thr¹³⁹位点。N-糖基化共有区的任何修饰均适合，只要N-连接糖基链的添加被取消或被基本抑制。优选地，在与成 熟人TF中的11位、124位和/或136位对应的Asn残基处引入修饰，因为这是用作连接糖基链的受体。如本发明所使用的“与成熟人TF中的位点11、124和/或136对应的位点”涉及其它TF直向同源物(ortholog)中的N-糖基化位点，其可以在多肽链中的不同位置出现，但是当基于序列相似性比对人和直系同源序列时，其与成熟人TF中的N-糖基化位点匹配。因此，用于比对或重复TF序列并因此用于识别与人成熟TF中的位点对应的TF直向同源物中的N-糖基化位点的合适算法是PILEUP程序，其形成GCG软件包的一部分(GeneticsComputer Group，Program Manual for the GCG Package，Version 7，Madison，Wis.)。PILEUP使用渐进、双序列比对从一组相关序列中创建多序列比对以显示相互关系和序列同源性百分数。它还标绘了显示用于创建比对的聚类关系的树图或树状图。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360(1987)描述的渐进比对方法的简化处理。优选地，11、124和/或136位的Asn残基被Ala置换。因此在优选实施方案中，形成微泡的一部分的TF变异体选自人成熟TF中的N11A、N124A、N137A、N11A和N124A、N11A和N137A、N124A和N137A和N11A、N124A和N137A。在任何其它TF直向同源物中，在形成N-连接糖基化共有位点的相应Asn残基处发生突变。 

此外，正如同TF蛋白那样，用于实施本发明的具有促凝活性的TF蛋白片段可以是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含含有具有促凝活性的所述TF蛋白片段的第一区域，所述TF蛋白片段与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。所述第二区域可以与所述TF蛋白片段的氨基末端区域结合，或者所述第二区域可以与所述TF蛋白片段的羧基末端区域结合。第一区域和第二区域可以彼此直接结合或者可以通过所述第一区域和第二区域间的连接多肽进行结合。 

在具体实施方案中，所述融合蛋白包含具有促凝活性的TF蛋白片段和与所述TF蛋白片段的C-末端或N-末端结构域结合的标签。所述标签通常是能够用于分离或纯化所述融合蛋白的肽或氨基酸序列。适于制备该融合蛋白的标签的示例性而非限制性实例包括与其中第一区域是TF蛋白的融合蛋白连接的如前所述的那些。在具体实施方案 中，所述标签是与所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的C-末端结构域结合的His-标签。在另一实施方案中，所述标签是与所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的N-末端结构域结合的His-标签。该融合蛋白也具有促凝活性，其促凝活性能够如前所述测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析。 

根据本发明，所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的一部分被整合到所述酵母膜中。通常，所述部分包含所述蛋白或片段的亲脂区(即TF的中心结构域)，而其亲水区(即所述TF蛋白的氨基末端区域和羰基末端区域)面向膜的外质侧或内质侧。关于TF蛋白的亲脂区和亲水区的信息能够从图2获得，该图是TF蛋白的亲水性图。实施例1，第1.4节显示所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段被整合到膜中(即它是膜相关蛋白)。 

在具体实施方案中，具有促凝活性的TF蛋白或其片段的N-末端结构域面向所述膜的外质侧，而在另一具体实施方案中，所述具有促凝活性的TF蛋白或片段的N-末端结构域面向所述膜的内质侧(图27)。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡的大小能够在较宽范围内变化，通常所述尺寸等于或小于1μm，通常等于或小于0.1μm。在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡的尺寸为0.1μm至0.01μm，该尺寸由电子显微镜测定(实施例1，第1.6节)。 

用于制备本发明的携带TF的酵母来源的微泡的方法

本发明的携带TF的酵母来源的微泡通常能够通过重组技术获得。因此，在其它方面，发明涉及用于制备具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡(即本发明的携带TF的酵母来源的微泡)的方法，下文称为“本发明的方法”，其包括： 

a)将表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的重组酵母细胞的培养物在允许所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段表达的条件下发酵； 

b)将从步骤a)的发酵所得的产物沉淀，以提供发酵产物； 

c)将从步骤b)获得的所述发酵产物匀浆，以提供发酵匀浆液；以及 

d)将从步骤c)获得的所述发酵匀浆液分离，以提供沉淀和包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡(即本发明的携带TF的酵母来源的微泡)的澄清酵母提取物(CYE)； 

e)收集包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取物(CYE)；以及，任选地， 

f)如果需要，将所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。 

表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的重组酵母细胞能够通过本领域技术人员已知的常规重组方法来获得。简而言之，用包含编码具有促凝活性的TF蛋白或其片段的核苷酸序列的酵母表达载体来转化酵母细胞，所述核苷酸序列可操作地与酵母功能性启动子连接。 

可以使用作为模板的cDNA库和适当引物，通过聚合酶链反应(PCR)来扩增编码具有促凝活性的TF蛋白或其片段的cDNA。实施例1中公开了编码成熟hTF蛋白的cDNA的扩增；实施例2中公开了在3’端具有18个额外核苷酸(extra nucleotide)(编码6个组氨酸)的编码成熟hTF蛋白的cDNA的扩增；以及实施例3公开了在3’端具有18个额外核苷酸(编码6个组氨酸)的编码截短型hTF蛋白(TTF)的cDNA的扩增，所述截短型hTF蛋白包含与因子X相互作用结构域、跨膜区和胞质尾区。 

如本文所使用的“载体”是指能够运载已经与其连接的另一核酸的核酸分子。如本文所使用的，术语“酵母表达载体”是指能够在酵母中合成个体蛋白的DNA表达构建体，例如核酸片段、质粒、粘粒、噬菌体、病毒或病毒颗粒，所述个体蛋白由载体携带的其各自重组基因(即具有促凝活性的TF蛋白或其片段)编码。或者，核酸片段还可以使用不定向(non-directional)重组或同源重组用于制备转基因酵母细胞，其中基因或感兴趣基因被稳定地整合到酵母基因组中。通常，酵母表达载体包含可操作地与酵母细胞中的功能性启动子(即酵母功能性启动子)连接的、编码具有促凝活性的TF或其片段的核苷酸序列。 

本发明中使用的载体是例如能够在酵母细胞中自主复制和/或表达与其连接的核酸的载体。在本说明书中，术语“质粒”和“载体” 可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。此外，本发明意旨包括发挥等同功能并此后变为本领域公知的此类其它形式的表达载体。所述酵母表达载体可以是酵母游离表达载体或酵母整合表达载体，并且它们能够通过本领域技术人员已知的常规技术来获得。 

因此，在实施方案中，所述酵母表达载体是酵母游离表达载体。如本文所使用的术语“酵母游离表达载体”是指在酵母细胞质中作为染色体外DNA分子存在的表达载体。在具体实施方案中，除了可操作地与酵母功能性启动子连接的、编码具有促凝活性的TF蛋白或其片段的核苷酸序列以外，所述酵母游离表达载体还包含：(i)酵母选择基因；(ii)酵母复制起点；(iii)细菌选择基因；以及(iv)酵母转录终止信号。有利的是，所述酵母游离表达载体还包含用于在酵母功能性启动子的控制下克隆所选基因(具有促凝活性的TF蛋白或其片段)的唯一限制位点，其后是酵母转录终止信号。 

实际上任何酵母功能性启动子、酵母选择基因、酵母复制起点、细菌选择基因、酵母转录终止信号和用于克隆的限制位点均能够用于制备所述酵母游离表达载体；然而，在具体实施方案中，将甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(pGPD)用作酵母功能性启动子；在另一具体实施方案中，将URA3基因(URA3)用作酵母选择基因；在另一具体实施方案中，将酵母2微米(2μ)复制起点用作酵母复制起点；在另一具体实施方案中，将氨苄青霉素抗性基因(Amp)用作细菌选择基因；以及在另一具体实施方案中，将磷酸甘油酸激酶的转录终止信号(PGKt)用作特异性酵母转录终止信号。因此在具体实施方案(实施例1-3)中，酵母游离表达载体包含(i)URA3基因；(ii)用于在大肠杆菌中选择和增殖载体的Amp基因；(iii)酵母2μ复制起点；(iv)pGPD；(v)PGKt的特异性酵母转录终止信号；以及(vi)在pGPD的控制下允许克隆所选基因的唯一BamHI限制位点，其后是PGKt序列。 

在另一具体实施方案中，所述酵母表达载体是酵母整合表达载体。如本文所使用的，术语“酵母整合表达载体”是指能够整合到酵母基因组中的载体。在具体实施方案中，所述酵母整合表达载体包含：(i)细菌选择基因；以及(ii)插入酵母选择基因中的表达盒，所述表达盒还 包含酵母功能性启动子、酵母转录终止信号和用于克隆所选基因(具有促凝活性的TF蛋白或其片段)的唯一限制位点。 

实际上任何细菌选择基因、插入酵母选择基因中的表达盒、酵母功能性启动子、酵母转录终止信号和用于克隆所选基因的唯一限制位点均能够用于制备所述酵母整合表达载体；然而，在另一具体实施方案中，将氨苄青霉素抗性基因(Amp)用作细菌选择基因；在另一具体实施方案中，将插入URA3基因的中心区中的表达盒pGPD-BamHI-PGKt用作包含酵母功能性启动子(pGDP)、酵母转录终止信号(PGKt)和用于克隆URA3基因的中心区中的所选基因的唯一限制位点(BamHI)的表达盒。 

事实上易于被包含可操作地与酵母功能性启动子连接的、编码具有促凝活性的TF蛋白或其片段的核苷酸序列的所述酵母表达载体转化的任何酵母细胞都能够用于本发明。用所述酵母表达载体对酵母细胞的转化能够通过本领域技术人员已知的常规技术实施(Sambrook etal.，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual)。 

在优选实施方案中，所述酵母是非絮凝酵母(即当将其在发酵过程中分散时不会絮凝(聚集)的酵母细胞)。有利的是，所述酵母细胞是GRAS酵母细胞。能够用于本发明方法的酵母细胞的示例性而非限制性实例是通过代谢酿造材料液体产生乙醇、二氧化碳、面包酵母等的所谓酒类酵母菌种(用于产生酒类的酵母)。具体地，优选选自酿酒酵母的酵母。这样的酒类酵母的实例包括啤酒酵母细胞、葡萄酒酵母细胞和清酒酵母细胞。在本发明的优选实施方案中，酵母细胞是葡萄酒酵母细胞，例如酿酒酵母T73 ura3^-(实施例1-3)。 

一旦酵母细胞被转化，下一步骤在于使表达具有促凝活性的TF蛋白或其片段的重组酵母细胞的培养物在允许表达所述具有促凝活性的TF蛋白或其片段的条件下发酵。在具体实施方案中，所述酵母细胞在适当培养基中生长，其中所述酵母细胞能够表达所需异源产物(具有促凝活性的TF蛋白或其片段)。使酵母细胞生长的适当培养基是本领域技术人员公知的，并且根据待培养的酵母细胞从最适合的培养基中选择。可以使用制备发酵产物的任何材料，只要它适合由所用的非 凝集酵母细胞引起的发酵，并且能够任意使用已知的材料。例如，在酒的制备中通常单独使用或适当组合使用麦芽、果汁、糖液、谷物糖化液(cereal saccharified liquids)等等。并且当需要时可以向其中添加适当营养素等。 

发酵条件本质上与已知条件没有差别，并能够由本领域技术人员确定。在具体实施方案中，发酵后在发酵的整个过程中控制主要参数的演化，当氧分压(PO₂)达到稳定状态时停止发酵。 

然后将由步骤a)所得的发酵产物通过常规方法沉淀，例如通过离心，并且在将所述产物匀浆前在合适的裂解缓冲液中将其重悬浮。酵母能够通过常规方法匀浆，例如通过匀浆器的高压来提供发酵匀浆液。 

然后将发酵匀浆液通过常规方法分离，例如通过离心，以提供能够分开收集的沉淀和澄清酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物包含所述具有促凝活性的携带TF的酵母来源的微泡(即本发明的携带TF的酵母来源的微泡)的。本发明方法的总体方案示于图11。 

具有促凝活性的TF蛋白或其片段的存在能够通过常规方法测定，例如通过使用特异性抗TF蛋白单克隆抗体(mAb)的Western印迹分析。此外，CYE的促凝活性能够通过任何常规测定法测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析，例如通常通过血浆或非抗凝全血中的体外凝固分析等等。 

通过免疫电子显微镜对CYE样品的进一步检测显示出由抗TFmAb标记的酵母来源的微泡存在于所述微泡的表面。包含具有促凝活性的TF蛋白或其片段的所述微泡还具有促凝活性，并与本发明的携带TF的酵母来源的微泡对应。 

任选地，如果需要，能够通过本领域技术人员已知的常规方法将根据本发明方法预先获得的具有促凝活性的所述携带TF的酵母来源的微泡进行浓缩、分离或纯化。作为示例性说明，在C-末端或N-末端包含肽标签(例如His-标签等等)的蛋白的亲和色谱法纯化是用于获得大量蛋白的高纯度制剂的相当标准化的方法。作为任一种色谱方法，所述方法能够容易地被放大试验。能够进行可选的纯化操作，如免疫亲和色谱，虽然它要求利用特异性抗TF单克隆抗体或多克隆抗体的 相当标准化的母液，尤其是对于放大生产。 

因此分离方法和纯化方法将取决于具有促凝活性的TF蛋白或其片段的性质，即如果它是具有用来与亲和基质的一个或多个亲和配体结合的标签(例如His-标签等等)的融合蛋白，所述亲和基质例如色谱支持体或高亲和力磁珠，或者如果它是能够被诸如c-myc-标签(被抗c-myc抗体识别)的抗体识别的表位。 

图23通过示意图显示了用于纯化携带重组TF蛋白(或其具有促凝活性的片段)的酵母来源的微泡[即携带(TF-His-标签蛋白)的酵母来源的微泡或如图23中提到的“6HT-TF药品”]的方法，所述重组TF蛋白是与His-标签融合的融合蛋白形式。简言之，在将根据上文公开的方法获得的包含携带(TF-his-标签蛋白)的酵母来源的微泡的澄清酵母提取物(CYE)加载到适当亲和柱(例如 亲和柱)之前进行过滤(例如通过切向流过滤通过0.2μm孔径过滤器)；然后在施加样品后，回收穿流物(flow-through)(未结合的物质)，并且将柱进行几次洗涤，在最后洗涤后，通过在柱中添加适当缓冲液(例如包含咪唑的缓冲液)来洗脱携带(TF-His-标签蛋白)的酵母来源的微泡并且收集洗脱组分并透析，以提供分离或纯化的携带(TF-his-标签蛋白)的酵母来源的微泡。 

在另一实施方案中，也能够通过 prime设备纯化本发明的携带TF的酵母来源的微泡。 

prime是购自General ElectricHealthcare的自动液相色谱系统，其能够用于标准纯化方案的开发，所述标准纯化方案能够容易地被放大以用于大规模生产。 

用于纯化包含来自真核宿主的感兴趣膜蛋白的微泡的方法

本发明的作者也已经观察到存在于衍生自表达TF的细胞的澄清提取物中的泡囊还能够使用尺寸分配(size partitioning)来富集。在不希望受任何理论约束的情况下，应该相信使用具有确定孔径的膜的尺寸分配允许除去对蛋白的促凝活性不利的细胞提取物的其它组分。应该相信由发明人开发的方法通常是适用于纯化真核宿主中的任何膜蛋白，其中所述膜。因此，另一方面，本发明涉及用于制备包含感兴趣膜蛋白的微泡的制剂的方法，其包括以下步骤： 

(a)使真核宿主细胞的培养物在允许表达所述感兴趣膜蛋白的条件下生长； 

(b)将(a)的培养物中的细胞匀浆， 

(c)将由步骤(b)获得的匀浆液分离，以提供沉淀和澄清细胞提取物，所述细胞提取物包含所述细胞来源的包含感兴趣膜蛋白的微泡； 

(d)将所述细胞来源的微泡通过尺寸分配纯化。 

步骤(a)：使真核宿主细胞的培养物生长

能够用于本发明的上下文中的真核宿主包括能够在实验室中或在生产装置中培养的任何细胞，但是更优选能够被遗传操纵以允许感兴趣膜蛋白在细胞中表达的细胞。能够用于本发明的宿主包括酵母(例如毕赤酵母)、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293，3T3)。 

所用的真核宿主能够表达它们的蛋白作为正常蛋白质组的一部分或者可以通过引入编码感兴趣膜蛋白的外源核酸而被修饰。在两种情况下，细胞需要在允许感兴趣膜蛋白表达的条件下进行培养。如果感兴趣膜蛋白由核酸编码，该核酸在启动子的控制下可以位于载体中。适合实施本发明的公知启动子的实例包括组成型启动子，例如在某些真核病毒(多瘤病毒、腺病毒、SV40、CMV、禽类肉瘤病毒(avian sarcomavirus)、乙型肝炎病毒)中发现的那些，金属硫蛋白基因启动子(metalothionein gen promoter)、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、逆转录病毒LTR区、免疫球蛋白启动子、肌动蛋白启动子、EF-1α启动子以及诱导启动子，其中下游基因的表达要求添加外源信号物质至培养物，例如在WO/2006/135436中描述的四环素启动子、NFκB/UV光、Cre/lox、热休克启动子、可调控的聚合酶II启动子，以及组织特异性启动子，例如在WO2006012221中描述的PSA启动子。 

使用任何适当的培养基来培养细胞。技术人员应该理解培养基必须根据待使用的宿主细胞的类型来选择。然而，对于各细胞类型，技术人员可利用多种培养基，如Sambrook，J.et al.(Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册).2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1989))和Ausubel et al.(Current Protocols in MolecularBiology(分子生物学通用方法)，eds.Ausubel et al，John Wiley & Sons(1992))中描述的那样。 

实际上能够根据本发明的方法表达和纯化任何膜蛋白。如果感兴趣蛋白是膜蛋白，那么该蛋白能够如此表达，因为它会以宿主细胞的膜系统为靶标，前提是它包含信号序列。能够使用本发明的方法表达的膜蛋白包括例如雌激素受体、氨基酸转运体、雄激素受体、垂体受体、转铁蛋白受体、孕酮受体和葡萄糖转运体的受体、转运体。如果可溶蛋白在N-末端与信号序列融合并在C-末端与跨膜结构域融合，也可以使用本发明的方法表达这些可溶蛋白。这样，融合蛋白会插入到宿主细胞的膜中并在微泡中纯化。在优选实施方案中，感兴趣膜蛋白是如上所述的rTF、其片段或其N-糖基化突变体。 

步骤(b)：匀浆

在步骤(b)中，将培养物的细胞匀浆以获得匀浆液。需要使用技术人员可获得的任何技术(离心、沉降、过滤等等)将细胞与培养基分离。一旦细胞被分离出，将这些细胞匀浆以破裂细胞壁和质膜并将细胞内容物释放至缓冲液中，在其中进行匀浆。使用本领域已知的任何适当方法使细胞破裂，例如高压、氮空化作用(nitrogen cavitation)、使用低渗缓冲液的渗透休克法、超声处理、机械匀浆(mechanicalhomogeisation)、酶解组织破裂法(enzymolytic tissue disruptionmethods)、超声破碎(sonification)。在不存在任何去垢剂的情况下进行匀浆。优选通过高压进行匀浆。 

步骤(c)：匀浆液的分离

然后通过常规手段将匀浆液分级以将未破裂细胞细胞和大聚集物与从细胞释放的内容物分离。优选通过在13000xg下离心进行分级。在离心后获得的上清液是澄清细胞提取物，其包含可溶物质以及由细胞膜系统的破碎产生的不同尺寸的不同微泡群。 

步骤(d)：尺寸分配纯化

然后将由步骤(c)获得的澄清细胞提取物基于形成所述提取物的微泡的尺寸来分级，以便选择具有特定直径尺寸的那些。本发明的作者已经发现尺寸分配纯化技术可以用于提供足够纯度的微泡制剂，其可以施用于治疗中而不需要附加的纯化步骤，例如色谱法和以前认为需要的其它方法。在不意欲受本发明的任何特定理论约束的情况下，应该相信澄清细胞提取物通过尺寸分配分级的处理步骤产生污染减少的产物。此外，污染物具有的尺寸和性质使它们可以容易地通过简单尺寸分配纯化步骤从微泡中分离出。 

膜过滤是生物处理领域中公知的技术。膜被定义为横向尺度比它的厚度大得多的结构，物质可以在多种驱动力下通过所述膜发生转移。虽然许多过滤器可以被认为是膜，但是过滤器还包括这样的材料：其横向尺度通常不比它们的深度大100倍并且其分离性能主要通过俘获穿过其深度的物种或颗粒。用于表征膜特性的最常用参数分为三大类。这些是输运性质，孔(几何)特征和表面(或者主要是化学上的)性质。然而，输运性质主要取决于孔特征和表面特征。虽然与其它分离方法相比，膜分离是较慢并且较小容积的方法，但是其效能是使它成为能够用于回收少量有价值产物的方法。 

膜过滤器系统可以以多种方式设计，以具有不同的过滤性质。设计标准包括：盲端(dead-end)操作(搅拌或不搅拌)或错流模式；流入混合物的全部或部分回收；经由泵送的外部跨膜压的应用、惰性气体层或装置的渗透侧的排空；以及平板(单片或多片)、中空纤维束或管状膜的使用。尺寸分配分离方法利用尺寸分配膜，其可以是本领域普通技术人员已知的透析膜或其它类似膜。用于本发明的尺寸分配膜过滤的适当透析膜材料包括可商购的那些材料，例如由聚醚砜、聚碳酸酯、尼龙、聚丙烯等制备的那些材料。作为示例，这些透析膜材料的供应商包括Akzo-Nobel、Millipore，Inc.、Poretics，Inc.和Pall Corp.。 

在优选实施方案中，基于膜尺寸的分级是切向流过滤(TFF)，也被称为“错流过滤”。切向流过滤是压力驱动的分离方法，其中将流体 沿膜表面切向泵入。所施加的压力用来迫使包含杂质的部分流体穿过膜至滤液尺寸。过大而不能穿过膜孔的微粒和大分子被阻留在上游侧。与其中阻留的组分堵塞膜表面的常规流过滤(NFF)技术相比，切向流过滤通过流体的流动清除了阻留的组分。 

TFF基于被分离组分的尺寸来分类。膜孔径规格通常给定为微米值，表明大于该规格的颗粒会被膜阻留。另一方面标称分子量限度(NMWL)指示分子量高于NMWL的大部分溶解的大分子和分子量低于NMWL的某些分子会被膜阻留。组分形状、变形能力和它与溶液中的其它组分的相互作用都影响阻留。不同膜制造商使用不同标准来指定膜家族的NMWL规格，但是普通技术人员能够根据经验确定适当的规格。 

超滤是最广泛使用的TFF形式之一，并用于将蛋白与用于缓冲液交换、脱盐或浓缩的缓冲液组分分离，但是其还可以用于过滤本发明的澄清细胞提取物。微泡过滤的通常孔径在0.2微米至0.1微米的范围内。在优选实施方案中，TFF包含孔径为0.2微米的第一膜和孔径为0.1微米的第二膜，使得膜之间的空间聚积直径为0.2微米至0.1微米的微泡。 

在TFF单元操作中，使用泵来产生通过两层膜表面间通道的原料流的流动。在流体每次穿过膜表面时，所施加的压力迫使部分流体通过膜并进入滤液流中。结果是原料浓度从通道中心的散放条件至更集中的壁条件形成梯度。当更多流体进行性地经过滤液侧时沿着进料道的长度从入口至出口(保留物)也存在浓度梯度。沿着膜长度的进料流引起从通道的进料端至保留物端的压力下降。膜的滤液侧流通常较低并且几乎不受限制，因此沿着膜长度对滤液侧的压力近似恒定。 

膜可以由在冲洗特性和化学相容性上提供选择的各种材料制备。适合材料包括纤维素、聚醚砜和本领域技术人员已知的其它材料。在某些实施方案中使用聚醚砜。典型的聚醚砜膜易于吸收蛋白以及其它生物组分，导致膜污垢和通量降低。有些膜经亲水性修饰以更不易产生污垢，例如Biomax(Millipore)。 

本领域技术人员应当理解各种类型的TFF组件会用于本发明的实 践中。有用的TFF组件包括但不限于平板组件(也被称为片匣(cassettes))、螺旋卷组件和中空纤维组件。 

对于任何给定组件，普通技术人员可以容易地使关键处理参数最佳化。这样的参数包括错流速率、跨膜压(TMP)、滤液控制、膜面积和渗滤设计。错流速率取决于选择哪一种组件。通常在等TMP时更高的错流速率提供更高的通量，并增加穿过膜的清除作用以及降低向着膜表面的浓度梯度。许多TFF应用中应用了错流和压力设定点，以及不受组件控制和限制的滤液流。这是最简单的操作类型，但在某些情况下，期望使用某类滤液控制，其超出了通过用保留物阀简单调节压力实现的控制。在确定待处理的工艺流和总体积后选择膜面积，并且膜面积取决于处理时间。 

通常可以通过在2000g至4500g，例如2500g至4000g或2750g至3500g或3000g至3500g，例如3000g或3100g或3200g或3300g或3400g或3500g下离心来进行浓缩。 

通常离心可以运行若干小时，例如1小时以上，例如运行1小时至10小时。 

为了使对感兴趣多肽的稳定性的任何负面影响最小化，具体地可以在2-200C的温度范围内进行离心，例如3摄氏度至15摄氏度或3℃至10℃或3摄氏度至6摄氏度。 

用于TFF的优选缓冲液是磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液或TRIS缓冲液。然而，某些实施方案中的缓冲液的浓度为5mM至15mM，包括至少5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM和15mM的浓度，还包括它们之间的mM浓度。在某些实施方案中，缓冲液的pH为约7.2至7.5。因此，在一个实施方案中，缓冲液的pH为7.2、7.3、7.4或7.5或者它们之间的部分pH值。在另一实施方案中，缓冲液交换缓冲液还包括0.10M至0.20M的NaCl和3.5％至4.5％的蔗糖。 

在优选实施方案中，还将在尺寸分级步骤后获得的微泡制剂进行二次纯化步骤，该步骤使具有最高蛋白量/活性的微泡与存在于样品中的任何其它产物分离。 

在一个实施方案中，所述二次纯化步骤通过二次尺寸分级步骤来实施。在另一实施方案中，二次纯化步骤能够通过亲和色谱法来实施。如果微泡包含TF，则使用对TF显示亲和力的化合物(例如抗体)来实施亲和色谱法。如果微泡包含含有TF和标签的融合蛋白，则能够通过使用对所述标签显示亲和力的配体来实施亲和色谱法。优选地，标签是六聚组氨酸标签，在该情况下使用金属亲和柱来实施亲和色谱法。 

一旦微泡制剂已被纯化，则检测分级步骤的洗脱物中感兴趣蛋白的存在，然后将包含最高蛋白量或最高活性的那些组分混合并直接使用。能够使用本领域已知的检测给定蛋白存在的任何可利用的手段(ELISA、Western印迹、RIA等等)来测试柱洗脱谱的蛋白的存在，或者测试感兴趣蛋白活性的存在。技术人员应该理解活性测试取决于被纯化的蛋白。在优选实施方案中，感兴趣蛋白是TF，并且活性是如实施例5说明的促凝活性，所述活性能够被检测以鉴别包含含有所述蛋白的泡囊的那些组分。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡的治疗用途

不同测定法已经显示出本发明的携带TF的酵母来源的微泡显示促凝活性。实际上实施例4包括： 

a)体外测定，其表明了本发明的携带TF的酵母来源的微泡在健康状态下和患者疾病状态下引起纤维蛋白凝块形成和血液凝固；即所述测定显示本发明所述的携带TF的酵母来源的微泡能够凝固： 

-来自健康个体的血浆(血浆中的凝固分析)； 

-缺乏FVIII、FIX或FXI的血浆(血浆中的凝固分析)； 

-来自获得性血小板缺乏的血浆(血小板减少血浆中的凝固分析)； 

-在抗FVII抗体存在下来自FXI缺乏血浆的血浆(血浆中的凝固分析)； 

-来自健康个体的血液(非抗凝全血中的凝固分析)；以及 

-来自血友病患者的血液(非抗凝全血中的凝固分析)； 

b)体内测定，其表明了本发明的携带TF的酵母来源的微泡是在严重出血模型中用于局部抗出血治疗的药剂(通过直接应用于先前切 开的血管)；即所述测定显示所述携带TF的酵母来源的微泡在未处理和用肝素处理的试验动物中用作局部止血剂。 

c)体内测定，其表明了本发明的携带TF的酵母来源的微泡是在致命性出血模型中用于局部抗出血治疗的药剂(通过直接应用于先前切开的血管)；即所述测定显示所述携带TF的酵母来源的微泡在由近端切断FVIII缺乏小鼠尾部造成的致命性出血动物模型中用作局部止血剂。 

这些结果清楚地显示出本发明的携带TF的酵母来源的微泡是用于局部治疗个体出血的促凝剂或抗出血剂。 

因此，本发明的携带TF的酵母来源的微泡能够用作药物，即用作促凝剂或用作抗出血剂，具体地用作治疗个体出血的局部应用的抗出血剂。 

因此，另一方面，本发明涉及作为药物的本发明的携带TF的酵母来源的微泡。在具体实施方案中，本发明涉及作为适于治疗个体出血的具有促凝(抗出血)活性的局部药物的本发明的携带TF的酵母来源的微泡。 

虽然本发明的携带TF的酵母来源的微泡能够被局部应用于治疗个体出血，即不将其与药物可接受的介质混合，因为包含根据本发明方法获得的所述携带TF的酵母来源的微泡的澄清酵母提取物(CYE)的组分基本上对个体无害，通常对于向个体给药无害，因此本发明的携带TF的酵母来源的微泡被配制成适于其给药的药物给药形式，优选适于用于局部(局域性)治疗出血的局部给药的药物给药形式。 

因此，另一方面，本发明涉及药物组合物，下文称为本发明的药物组合物，其包含本发明的携带TF的酵母来源的微泡和药物可接受的介质、载体或赋形剂。然后将所述药物组合物配制成适于向个体给药的药物给药形式。 

然后对于向个体给药，本发明的携带TF的酵母来源的微泡会被配制成药物给药形式，优选适于局部给药的药物给药形式，为此将适于制备期望药物给药形式的药物可接受的载体和赋形剂并入其中。关于所述载体和赋形剂以及关于适于本发明所述产品给药的所述给药形 式的信息能够在galenic pharmacy treatises(格林药学论述)中查到。一般药物的不同药物给药形式及其制备方法的综述能够在C.FaulíiTrillo，1st Edition，1993，Luzán 5，S.A.of Ediciones的题为“Tratado deFarmacia Galénica”(“Galenic Pharmacy Treatise(格林药学论述)”)的书中查到。 

虽然能够使用本发明的携带TF的酵母来源的微泡的不同药物给药形式，但是在实践中局部给予所述产品最有利；因此所述本发明的携带TF的酵母来源的微泡被配制成适于局部给药的药物形式。所述药物形式的示例性而非限制性实例包括气雾剂、溶液、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱口液等等。为此本发明的药物组合物包含制备局部给药的本发明的携带TF的酵母来源的微泡的药物给药形式所需的药物可接受的介质、载体和/或赋形剂。 

因此，在具体实施方案中，本发明的药物组合物是用于本发明的携带TF的酵母来源的微泡的局部给药的药物组合物，其包含所述产品和适于所述本发明的携带TF的酵母来源的微泡的局部给药的药物可接受的介质、载体或赋形剂。适于所述携带TF的酵母来源的微泡的局部给药的药物可接受的介质、载体或赋形剂的示例性非限制性实例能够在galenic pharmacy treatises(格林药学论述)中查到。 

在具体实施方案中，本发明的药物组合物包含含有具有促凝活性的人TF蛋白或其片段的携带TF的酵母来源的微泡，例如成熟人TF或截短的人TF(即人TF蛋白，其中负责与FVIIa结合的全部或部分结构域缺失，或者具有促凝活性的人TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的)。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡以治疗有效量存在于本发明的药物组合物中。所述量可以在宽范围内变化，例如约1.0pg活性蛋白/ml至1.0mg活性蛋白/ml，优选0.05μg活性蛋白/ml至10μg活性蛋白/ml，以及甚至更优选约0.1μg活性蛋白/ml至2.0μg活性蛋白/ml。 

本发明的携带TF的酵母来源的微泡向个体给药的剂量可以在非常宽的范围内变化，例如约1.0pg活性蛋白/ml至1.0mg活性蛋白/ml，优选0.05μg活性蛋白/ml至10μg活性蛋白/ml，以及甚至更优选约 0.1μg活性蛋白/ml至2.0μg活性蛋白/ml。本发明的携带TF的酵母来源的微泡的给药剂量取决于多种因素，包括所使用的具有促凝活性的TF蛋白或其片段的特征等等，例如其活性和生物半衰期、具有促凝活性的TF蛋白或其片段在制剂中的浓度、个体或患者的临床疾病状态、待治疗的出血病症等等。因此本文提到的剂量必须仅被认为是对本领域技术人员的指导，并且技术人员必须根据前述变量调节剂量。然而，本发明的药物组合物用于预防或治疗目的能够一天给药一次或多次。 

本发明的药物组合物能够与用于预防和/或治疗出血素质的其它附加药物(例如凝血因子、人血浆等等)一起使用以提供联合治疗。对于本发明的药物组合物的给药，所述附加药物能够是同一药物组合物的一部分，或者它们能够以用于其同时或连续(时间上连续)给药的独立组合物被提供。 

本发明的药物组合物还能够被置于支持体上。因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的药物组合物和支持体的产品。如本文所使用的术语“支持体”是指适当材料的基质，其允许在其上沉积本发明的药物组合物，允许药物组合物被携带并在期望位点释放，例如在本发明的药物组合物发挥其治疗效果的位点。所述支持体能够是固体支持体或非固体支持体，例如液体支持体或气体支持体。固体支持体的示例性非限制性实例包括敷料、急救绷带、敷布、硬膏等等。液体支持体的示例性非限制性实例包括凝胶、喷雾剂、漱口液等等。气体支持体的示例性非限制性实例包括空气、推进剂等等。 

在具体实施方案中，本发明的药物组合物包含含有具有促凝活性的人TF蛋白或其片段的携带TF的酵母来源的微泡，例如成熟人TF或截短的人TF(即人TF蛋白，其中负责与FVIIa结合的全部或部分结构域缺失，或者具有促凝活性的人TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域不是功能性的)。 

包含沉积在支持体上的本发明的药物组合物的产品能够由常规方法获得，例如通过将本发明的药物组合物与支持体混合。本发明的药物组合物与支持体间的相互作用能够是物理作用或化学相互作用，取决于本发明的药物组合物的组分的性质和所使用的支持体。 

本发明其它方面涉及本发明的携带TF的酵母来源的微泡在制备用于治疗个体出血的药物中的用途，具体地用于局部治疗健康个体或具有出血素质个体的出血。 

如本文所使用的，术语“局部治疗”是指直接在需要治疗的位点治疗的应用，例如在由开放伤口、手术等导致的静脉出血和动脉出血中的皮肤不连续部分(切口等)和血管组织的不连续部分(破裂的血管等)以及在皮肤粘膜出血和微血管出血中的皮肤和血管组织的不连续部分。 

根据本发明并如实施例4所示，本发明的携带TF的酵母来源的微泡能够用作促凝剂或抗出血剂，因此所述产品能够用于治疗或改善出血病症，特别是那些与出血素质有关的出血病症。 

术语“出血素质”是指引起止血障碍的过程，并由此导致出血综合征的发生，该出血综合征有时可能发生长期的大量出血。出血素质可能由先天性或后天性凝血病和/或先天性或后天性血小板病症引起。 

术语“凝血病”是指凝血因子异常。这种异常可能是因为特定的凝血因子缺乏或不足引起的，该凝血因子缺乏或不足的结果是发生出血综合征，或是因为凝血因子异常所致。凝血病通常可以是先天性凝血病或后天性凝血病。 

先天性凝血病的示例性非限制性实例选自能够提及的以下凝血因子的缺乏：凝血因子V(FV)、凝血因子VII(FVII)、凝血因子VIII(FVIII)，其不足或缺乏导致血友病A，凝血因子IX(FIX)，其不足或缺乏导致血友病B，凝血因子X(FX)、凝血因子XI(FXI)，其不足或缺乏导致血友病C，凝血因子XII(FXII)，凝血因子XIII(FXIII)和它们的组合。 

后天性凝血病可能有不同的起因。示例性实例包括在严重的肝衰竭中凝血因子合成不足及抗凝血剂治疗(诸如肝素、低分子量肝素、华法林、香豆素衍生物、双香豆素等)。另一可选择的机制是基于过度消耗凝血因子，使得在出血损伤中无可利用的凝血因子来形成凝块。这种机制发生在因多种疾病消耗所致的弥散性血管内凝血综合征或凝血病中，所述多种疾病诸如损害微循环内皮、活化血小板及凝血因子、 形成多重微血栓的严重脓毒病；TF入侵血液中，如胎盘释放；死胎滞留；具有组织碎裂的多处创伤；毒蛇咬伤等等。在血管炎中，血管壁及内皮损伤释放出凝血活化剂。由于为抗血小板剂及抗凝血剂的胞浆素的作用及PDF释放，凝血因子的消耗因许多微血栓的纤维蛋白的溶解而加剧。 

术语“血小板异常”是指血小板的数量及功能上的异常，其结果是发生出血综合征。所述血小板异常可能是先天性或后天性。 

在具体实施方案中，所述血小板异常是先天性血小板异常。先天性血小板异常的示例性、非限制性的实例包括格兰茨曼病(Glanzmann′sdisease)、贝-苏综合征(Bernard Soulier disease)、Bolin-Jamieson’s综合征、维-奥综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、Paris-Trousseau-Jacobsen综合征、X染色体血小板减少症、灰色血小板综合征(Gray plateletsyndrome)、Sebastian综合征及范科尼贫血(Fanconi anemia)。 

在另一具体实施方案中，所述血小板异常是后天性血小板异常。后天性血小板异常的示例性非限制性实例包括骨髓增生性疾病，诸如血小板增多、红细胞增多或慢性粒细胞白血病等；髓样化生(myeloidmetaplasia)中的功能性血小板异常，伴随出血时间延长、玻璃珠滞留缺陷(retention defects)、血小板聚集缺陷、异常释放及血小板因子III缺陷。已在坏血病、先天性心脏疾病和肝硬化中的异常蛋白血症中发现了功能性血小板缺陷。 

术语“后天性凝血病”及“后天性血小板异常”指疾病的起因，其可能为医源性或继发于其它疾病。 

本文所使用的术语“个体”包括动物种类的任何成员，包括人类；以示例性非限制性方式举例来说，所属个体能够是哺乳动物，诸如灵长类、家畜、啮齿类等，所述个体优选为以任何年龄和种族的男人或女人。在具体实施方案中，所述个体是无止血障碍史的人，诸如无凝血病或血小板异常的个体。在另一具体实施方案中，所述个体是有止血障碍史的人，诸如具有出血素质的个体，例如凝血病，如先天性或后天性凝血病，或血小板异常，诸如先天性或后天性血小板异常。 

因此在具体实施方案中，本发明涉及本发明的携带TF的酵母来 源的微泡在制备用于局部治疗无止血障碍史的人类出血的药物中的用途。在另一具体实施方案中，本发明涉及本发明的携带TF的酵母来源的微泡在制备用于局部治疗具有出血素质的人类出血的药物中的用途。 

如上所述，为了对个体局部给药，本发明的携带TF的酵母来源的微泡将被配制成适于其局部给药以局部(局域性)治疗个体出血的药物形式。所述药物形式的示例性非限制性实例包括气雾剂、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、软膏、乳膏、敷料、贴片、油膏、漱口液等。为此，含有本发明的携带TF的酵母来源的微泡的药物制剂将包括为制备所选定的药物给药形式所需的药物可接受的介质、载体及赋形剂。已经提到了关于与本发明的药物组合物相关的药物组合物(药物给药形式、剂量、活性组分的量等)的信息。 

还已经报导了TF诱导血管生成并增加VEGF的生成(Ollivier et al.，2000，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，20：1374-1381；Chen et al.，2000，Thromb.Haemost.，86：334-345 y Watanabe et al.，1999，Thromb.Res.，96：183-189)。因此，另一方面，本发明涉及用于治疗其中需要增加血管生成或增加细胞迁移的疾病的本发明的酵母来源的微泡。 

与血管生成减少有关的并能够得益于本发明的促进血管生成组合物治疗的疾病包括冠心病，如心肌缺血、心肌梗死、缺血性心肌病，或外周动脉疾病，如慢性肢体缺血性跛行(chronic limb ischemiaclaudication)(骨骼肌)或静止痛/缺血溃疡/坏疽。在缺血性脑卒中/神经病中也需要促进血管生成，例如脑/神经组织，如在脑卒中/梗死周围的缺血半暗带(ischemic pneumbra)。可选择地，本发明的组合物的促血管效应可以用于促进血管内腔表面的愈合和/或内皮化，例如在例如冠状动脉/颈动脉中或在去内皮化内腔表面上促进不稳定/溃疡性动脉粥样硬化斑块的内皮化，所述去内皮化内腔表面例如在诸如颈动脉的动脉内膜切除术，血栓切除术(或者动脉/静脉)，诸如充气囊、激光或低温血管成形术的血管成形术，动脉粥样硬化斑块切除术，或者在通过给予包含一氧化氮剂的组合物进行血栓溶解之后发现的那些去内皮化内腔表面。本发明的促血管生成组合物还可以用于解决急性或慢性动 脉和/或静脉血栓形成，例如血运重建和/或新血管形成和/或再通。在另一实施方案中，本发明的组合物促进新毛细血管床(neocapillary bed)的发生，所述新毛细血管床用于基因治疗应用、器官再生应用，和用于生物人工杂化器官(bioartificial hybrid organ)(例如胰、肾、肺、肝)放置以及促进和/或增强伤口愈合和/或用于促进肉芽组织，例如用于慢性伤口，如基于缺血性、糖尿病性、神经性、静脉停滞性(venous statis)伤口。 

已经报导了TF促进细胞迁移(Ott et al.，2005，Circulation，111：349-355和WO0105353)。因此，另一方面，本发明涉及用于在有需要的患者中促进细胞迁移的包含本发明的TF的组合物。应该理解，取决于刺激迁移的细胞类型，本发明的组合物能够治疗不同的疾病。例如，诸如血管、动脉、冠状动脉、静脉、食管腔和尿道的身体内腔损伤的患者需要内皮细胞迁移的刺激；由缺血和出血性脑卒中引起的中枢神经系统损伤和创伤患者需要刺激神经细胞迁移到损伤位点；慢性顽固性溃疡患者，例如糖尿病患者和老年患者，例如下肢溃疡和褥疮、角膜伤口、烧伤、擦伤、手术切口、供体移植位点和由传染剂引起的损伤)。能够被治疗的其它医学疾病状态是慢性疾病状态(例如慢性静脉性溃疡、糖尿病溃疡、压迫性溃疡、压疮(pressure sore)和粘膜表面的溃疡或伤口)、由持续性炎性疾病状态或感染或由基因缺陷(例如瘢痕疙瘩形成和凝血异常)引起的皮肤和上皮表面损伤将得益于重建受损组织所需的上皮细胞迁移的刺激。 

包含本发明的携带TF的酵母来源的微泡的组合物

本发明其它方面涉及组合物，下文称为“本发明的组合物”，其包含本发明的携带TF的酵母来源的微泡和介质。 

实际上，不对本发明的携带TF的酵母来源的微泡产生不利影响的任何介质均能够用于所述本发明的组合物。 

在实施方案中，所述介质基本上是液体介质，例如包裹通过实施本发明方法获得的本发明的携带TF的酵母来源的微泡的介质。因此，在具体实施方案中，本发明的组合物包含在实施本发明方法中获得的 澄清酵母提取物。 

缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域的截短TF

如上所述，发明人已经令人惊讶地发现不能与FVIIa结合的截短TF蛋白具有促凝活性。如能够在实施例4中所观察到的，发明人已经表明所述截短型TF蛋白在血浆的凝血测定中具有促凝活性。 

因此，另一方面，本发明涉及缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域的截短TF，下文称为“本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF”，其中全部或部分负责与FVIIa结合的结构域缺失，因此其不能与FVIIa结合，但是具有促凝活性。由此扩展，所述“本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF”包括具有促凝活性的TF蛋白突变体，其中负责与FVIIa结合的结构域由于突变不是功能性的。 

本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF可以通过常规手段来获得，例如通过将编码所述蛋白的核苷酸序列在适当表达系统(酵母、细菌、真核细胞、昆虫细胞等等)中进行基因表达。 

为了测定本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF是否能够与FVIIa结合，可以使用如国际申请WO00/04148中描述的结合测定法。此外，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF的促凝活性能够如前所述测定，例如通过实施例4中提到的任何凝固分析，例如通过血浆中的体外凝固分析、或通过非抗凝全血中的体外凝固分析、或通过严重出血动物模型中的体内测定或通过致命性出血动物模型中的体内测定，例如在实施例4中提到的那些测定法。 

在具体实施方案中，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF包含与因子X相互作用的结构域、跨膜区和胞质尾区，并缺失部分或全部负责与FVIIa结合的结构域。此外，在具体实施方案中，所述本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF是截短型人TF蛋白，所述截短型人TF蛋白包含与因子X相互作用的结构域(aa 174-251)、跨膜区(aa 252-274)和胞质尾区(aa 275-295)，以及额外组氨酸标签(实施例3)。发明人现在已经令人吃惊地发现，缺失负责与FVIIa结合的结构域的所述截短型TF蛋白具有促凝活性(实施例4，表3) 

在另一具体实施方案中，TF在FVIIa结合结构域中被一个或多个点突变修饰，使得所述结构域不再能够结合FVIIa。TF的FVIIa结合结构域中的点突变是本领域公知的，所述点突变可以破坏与所述FVIIa的结合(例如在Kelley，R.F.et al.，1995，Biochemistry，34：10383-10392中描述的那样，其内容因此通过引用的方式整体并入本文)。 

已经令人吃惊地观察到缺失全部或部分负责与FVIIa结合的结构域的所述TF片段具有促凝活性，因为公知在血液凝固的外源途径中，TF结合循环FVII/FVIIa以形成TF::FVIIa复合物，以及当钙离子存在时作为基质以使FX活化发生。公认如果发生由血管损伤导致的出血，则由于涉及TF与其配体FVII/FVIIa相互作用的外源途径激活，将启动凝血。 

本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF可以被糖基化或不被糖基化。因此，在具体实施方案中，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF不被糖基化，而在另一具体实施方案中，本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF被糖基化。如上所述，术语“糖基化”包括任何程度的糖基化。 

携带一个或多个非功能性糖基化位点的TF突变体

如上所述，本发明的作者也已经观察到当所述TF在糖基化位点中携带突变时，TF的促凝活性以及它在酵母宿主细胞中的表达增加，所述突变防止在野生型TF中发现的三个N-连接糖基链中的至少一个的连接。因此，在具体实施方案中，本发明的携带TF的酵母来源的微泡包含具有促凝活性的TF蛋白的非糖基化片段。如上所述，术语“糖基化”包括任何程度的糖基化。在优选实施方案中，TF变异体是多肽，其中TF的至少一个N-糖基化位点已经被修饰以对使其呈现非功能性，即不能用作添加糖苷链的受体位点。能够被修饰的TF序列中的N-糖基化位点是前述的那些位点，即Asn¹¹-Leu¹²-Thr¹³位点、Asn¹²⁴-Val¹²⁵-Thr¹²⁶位点和/或Asn¹³⁷-Asn¹³⁸-Thr¹³⁹位点。N-糖基化共有区的任何修饰均适合，只要N-连接糖基链的添加被除去或被基本抑制。优选地，将修饰引入与成熟人TF中的11、124和/或136位对应 的Asn残基，因为这是用作连接糖基链的受体的残基。如本发明所使用的“与成熟人TF中的位点11、124和/或136对应的位点”涉及在其它TF直向同源物中的N-糖基化位点，当将人和直向同源序列基于序列相似性进行比对时，所述位点可以出现在多肽链的不同位置但与成熟人TF中的N-糖基化位点匹配。比对或倍增TF序列并因此用于识别与人成熟TF中的位点对应的TF直向同源物中的N-糖基化位点的适当算法是PILEUP程序，其组成GCG软件包的一部分(GeneticsComputer Group，Program Manual for the GCG Package(GCG包的程序手册)，Version 7，Madison，Wis.)。PILEUP使用逐级、成对序列比对算法从一组相关序列创建多序列比对以显示相互关系和序列同源性百分数。它还标绘了显示用于创建比对的聚类关系的树图或树状图。PILEUP使用Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360(1987)中逐级比对方法的简化。优选地，11、124和/或136位的Asn残基被Ala取代。因此在优选实施方案中，形成部分微泡的TF变异体选自人成熟TF中的N11A、N124A、N137A、N11A和N124A、N11A和N137A、N124A和N137A和N11A、N124A和N137A。在任何其它TF直向同源物中，在形成N-连接糖基化共有位点的相应Asn残基处发生突变。 

缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF和携带本发明的一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体可以是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含第一区域，所述第一区域包含所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF，所述携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF，以及所述携带本发明的一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体，其与包含另一肽或蛋白的第二区域结合。所述第二区域可以与所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF的氨基末端区域结合，所述突变体TF携带非功能性FVIIa结合结构域，以及所述TF突变体携带一个或多个本发明的非功能性N-糖基化位点，或者可选择地，所述第二区域可以与所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF、所述携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF以及所述携带一个或多个本发明的非功能性N-糖基化位点的TF突变体的羰基末端区域结合。第一区域和第二区域可以直接结合或通过第一 区域与第二区域间的连接多肽结合。 

在具体实施方案中，所述融合蛋白包含缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体，以及与本发明的缺失FVIIa结合结构域的所述截短TF的C-末端或N-末端结构域结合的标签，通常为肽标签。所述标签通常是能够用于分离或纯化所述融合蛋白的肽或氨基酸序列。所述标签的示例性、非限制性实例已经在上文中提到。在具体实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白的C-末端结构域结合的His-标签。在另一实施方案中，所述标签是与所述TF蛋白的N-末端结构域结合的His-标签。 

所述融合蛋白可以通过常规手段来获得，例如通过将编码所述融合蛋白的核苷酸序列在适当酵母细胞中进行基因表达。如果需要，能够使用终标签(eventual tag)来分离或纯化所述融合蛋白。 

缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF和携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体能够用作药物，例如用作治疗个体出血的促凝剂。 

因此，另一方面，本发明涉及作为药物的缺失FVIIa结合结构域的所述截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的所述TF突变体和携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的所述TF突变体。在具体实施方案中，本发明涉及作为适于治疗个体出血的具有促凝活性药物的缺失FVIIa结合结构域的所述截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的所述TF突变体和携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的所述TF突变体。 

此外，另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体和药物可接受的介质。在具体实施方案中，所述药物组合物是用于局部给予缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体以及药物可接受的载体的药物组合物，所述载体适于局部给予本发明的缺失FVIIa 结合结构域的截短TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体。 

另一方面，本发明涉及缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体，其用于治疗需要促进个体细胞迁移和/或血管生成的疾病。另一方面，本发明涉及缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体，其用于促进有需要的个体的血管生成或细胞迁移。 

通常，为了对个体给药，缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体会被配制成适于用于局部(局域性)治疗出血的局部给药的药物形式。所述药物形式的示例性非限制性实例包括气雾剂、溶液、悬浮剂、乳剂、凝胶、药膏、乳膏、敷料、贴片、软膏、漱口液等等。为此，包含本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF的药物组合物包含制备所选药物给药形式所需的药物可接受的载体和赋形剂。因此，在具体实施方案中，除了本发明的截短TF蛋白以外，本发明的药物组合物还包含能够在galenic pharmacy treatises(格林药物论述)中查到的药物可接受的介质。 

本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF、本发明的携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF以及本发明的携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体以治疗有效量存在于该药物组合物中。所述量可以在宽范围内变化，例如约1.0pg活性蛋白/ml至1.0mg活性蛋白/ml，优选0.05μg活性蛋白/ml至10μg活性蛋白/ml，以及甚至更优选地，约0.1μg活性蛋白/ml至2.0μg活性蛋白/ml。 

另一方面，本发明涉及编码所述缺失FVIIa结合结构域的截短TF、所述携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或所述携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体的多核苷酸序列(下文称为“本发明的多核苷酸”)。 

另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸序列的载体(下文称 为“本发明的载体”)。用于本发明的适当载体包括例如pUC18、pUC19，Bluescript及其衍生物mp18、mp19、pBR322、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、诸如pSA3和pAT28的噬菌体和穿梭载体的原核表达载体，例如2微米质粒(2 micro plasmids)、整合型质粒、YEP载体、着丝粒质粒等的酵母表达载体，例如pIBI、pEarleyGate、pAVA、pCAMBIA、pGSA、pGWB、pMDC、pMY、pORE载体等的植物表达载体，例如pAC和pVL载体的昆虫细胞表达载体，基于病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒和慢病毒)以及例如pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pCI、pSVL和pKSV-10、pBPV-1、pML2d和pTDT1的非病毒载体的真核表达载体。 

另一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或本发明的载体的宿主细胞(下文称为“本发明的宿主细胞”)。能够用于本发明目的的细胞优选真核细胞，更优选脊椎动物细胞或无脊椎动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞，甚至更优选地，脊椎动物细胞是爪蟾卵母细胞(Xenopuscell)，从斑马鱼或哺乳动物细胞分离出的细胞。优选地，哺乳动物细胞是来自诸如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK 293、3T3、WI38等建立的细胞系、胚胎干细胞、成体干细胞或体细胞的细胞。 

另一方面，本发明涉及与本发明的缺失FVIIa结合结构域的截短TF、携带非功能性FVIIa结合结构域的突变体TF或携带一个或多个非功能性N-糖基化位点的TF突变体特异性结合的抗体。用于本发明的适当抗体包括包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的“完整”抗体，其包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定区、CH1、CH2和CH3，由完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生的包含单一抗原结合位点和CL和CH1区域的“Fab”片段，由完整抗体的木瓜蛋白酶胃蛋白酶消化产生的包含两个抗原结合位点的“F(ab’)2”片段，包含轻链恒定区和重链第一恒定结构域(CH1)并仅具有一个抗原结合位点的“Fab’”片段。Fab’片段通过在包含一个或多个来自抗体铰链区域的半胱氨酸的重链CH1结构域的羰基末端处添加几个残基而不同于Fab片段，“Fv”是包含完全 整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段；单链FV或“scFv”抗体片段包含抗体的VL结构域和VH结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中；“双链抗体(diabody)”包含与同一多肽链(VH-VL)上的轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)，所述多肽链由过短而不能使同一链的两个结构域间配对的肽连接子连接，以及“双特异性抗体”(BAb)是具有两个不同特异性抗原结合位点的单个二价抗体(或其免疫治疗有效的片段)。 

以下实施例示例性说明本发明，不应该被理解为是对本发明的限制。 

实施例

实施例1-3公开了酵母中基于以下表达的促凝产物的制备：(i)任选地以与His-标签融合的融合蛋白形式的成熟人TF蛋白(实施例3)，(ii)与His-标签融合的截短型人TF蛋白(实施例4)，以及(iii)人TF蛋白的N-糖基化突变体(实施例5)。为简单起见，在实施例6中将所述所有促凝产物一般地命名为微泡化组织因子(microvesiculated tissuefactor)、微泡化TF或mTF。实施例2教导了微泡化TF的纯化。 

实施例6公开了为了评估所述mTF以不同浓度在健康个体和血友病个体中产生纤维蛋白凝块的能力而进行的一些体外测定，以及为了评估所述mTF治疗严重和致命性出血模型出血的能力而进行的一些体内测定。 

实施例1 

基于全长TF蛋白在酵母(CYE-TF)中表达的促凝产物的制备 

1.1.酵母表达载体 

根据图1所示的克隆策略，对于重组TF表达，酵母游离载体(pTT-10301)由质粒pG1(ATCC # 37305)和Yep352(ATCC # 37673)产生。质粒pTT-10301包含以下元件： 

i)URA3基因，允许在缺乏尿嘧啶的生长培养基中筛选重组酵母， 

ii)氨苄青霉素抗性基因(Amp)，用于在大肠杆菌中筛选和繁殖质粒载体，

iii)酵母2微米(2μ)复制起点，允许载体在酵母中游离复制， 

iv)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子，控制位于下游的基因的转录， 

v)磷酸甘油酸激酶(PGK)的特异性酵母转录终止信号，以及 

vi)唯一BamHI限制位点，允许所选基因GPD启动子(pGPD)的控制下进行克隆，且所述限制位点后是PGK停止序列(PGKt)。 

图1A显示质粒载体pTT10301的图谱。图1B中显示证实质粒中的所有元件正确组织的限制性内切核酸酶分析。 

将大肠杆菌菌株DH5α(Stratagene)用于质粒扩增。使携带质粒pTT10301的细菌细胞于37℃下在Luria Broth Ampicilin(LBA)培养基(每ml含1％胰蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母提取物、50mg氨苄青霉素)中生长。将包含pTT-10301质粒的重组细菌的培养物的甘油储备液(Glycerol stock)储存在-80℃。 

1.2.重组基因 

组织因子(TF)是具有32-aa前导序列的295-氨基酸(aa)蛋白。成熟蛋白能够被分成三个结构域：胞外结构域(aa 33-251)、跨膜区(aa252-274)和胞质尾区(aa 275-295)。图2显示人TF(hTF)蛋白的亲水性图。 

编码成熟hTF蛋白(aa 33-295)的cDNA通过聚合酶链反应(PCR)扩增为816-bp片段。对于该PCR反应，将人胎盘cDNA文库(Marathon-Ready cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)用作模板，并将分别在人TF基因的5’或3’端退火的寡核苷酸A和B用作引物。 

图3显示hTF DNA序列(SEQ ID NO：5)(基因库登录号#BC011029)中的引物A和B的退火序列。的引物A编码缺乏信号肽的成熟hTF的前四个氨基酸并包含带有hTF ORF的框内的起始密码子ATG。 

PCR条件如下：35个循环的PCR(94℃，30秒；45℃30秒；72℃ 1分钟)和在72℃下7分钟的最后延伸步骤。然后纯化PCR产物(Qiagen DNA纯化系统)。 

1.3.rTF质粒表达载体的产生 

将如1.2节所述获得的PCR-扩增的DNA片段用BamHI消化以除去端部，乙醇沉淀，并克隆至预先用BamHI消化的pTT10301载体中。在对几个克隆进行内切核酸酶限制性分析后，筛选包含相对于GDP启动子(pGDP)正确定位的重组成熟hTF(下文称为rTF)基因的质粒，其命名为pTT10302(图4)。 

包含在质粒pTT10302中的rTF的DNA序列与公布序列(基因文库#BC011029)100％一致。使用引物A和B以及Big Dye终止剂(BigDye Terminator reagents)在自动测序仪(ABI prism 370，AppliedBiosystems)上测序编码DNA的rTF的DNA序列。使携带pTT10302质粒的DH5α大肠杆菌细胞在37℃下在LBA培养基中生长过夜，并将其用于制备甘油储备液，将所述甘油储备液储存在-80℃。 

1.4.rTF由重组酵母的表达 

为了产生表达重组成熟人组织因子的重组酵母(rTF)，使用表达载体pTT10302来转化T73 ura3-酵母细胞。 

T73 ura3^-是广泛用于葡萄酒生产中的良好表征的酿酒酵母T73菌株的衍生物。T73是在西班牙阿利坎特(Colección 

de CultivosTipo，登录号#CECT1894)地区筛选出的二倍体菌株，并且它被Lallemand Inc.(Montreal，Quebec，Canada)在全世界范围内商品化用于食品工业。菌株T73 ura3^-是T73衍生物，其中URA3基因的两个拷贝都已被破坏(J.Agric.Food Chem.1998.46，1689-1693)。T73 ura3^-是允许使用携带URA3选择标记基因的质粒载体产生T73重组酵母的表型稳定的URA-和食品安全酵母菌株。 

为了产生工作储备液，使T73 ura3^-细胞在培养皿(Petri dish)中生长，并且分离出单菌落并使其在30℃下在YPD培养基(1％酵母提取物、2％细菌学蛋白胨(bacteriological peptone)，2％葡萄糖)中生长直到达到密度为10⁷个细胞/ml。然后通过离心沉淀酵母细胞，在15％甘油的基本选择性培养基(酵母提取物氮基和不含尿嘧啶的完全合成培养基；YNB CSM-URA)中重悬浮，并在-80℃下分装冷冻直到使用。将三个随机选择的代表性试样(aliquot)解冻，并检验是否无细菌污染。首先将新鲜的T73 ura3^-代表性试样解冻并根据LiAc/SS-DNA/PEG方案(Methods in Enzymology(酶学方法)1994.350：87-96的方法)使细胞易获得质粒载体。根据相似策略来产生携带空质粒pTT10301的对照重组酵母。 

通过它们在缺乏尿嘧啶的培养基中生长的能力来筛选重组酵母克隆。分离用pTT10302转化的八个独立克隆并将其在不含尿嘧啶的培养基中培养过夜。利用玻璃微珠沉淀这些被称为yTT10301的重组酵母培养物并匀浆。类似地，还可以对来自用pTT10301转化的酵母(被称为yTT10300)的独立克隆进行相同操作。 

将来自两种类型重组酵母的不同克隆的蛋白通过SDS-PAGE分离，并转移至硝酸纤维素膜，将所述膜进行Western印迹分析。如图5所示，所有从yTT10301培养物中筛选出的克隆(克隆1至克隆8)表达被抗人TF特异性单克隆抗体(mAb)CD142(BD BiosciencesPharmingen)识别的几种多肽。然而，没有yTT10300克隆显示出与特异性抗人TF mAb免疫反应性多肽(图5中的泳道C，对应于这些克隆中的一个)。 

如图5所示，yTT10301中的主要免疫反应性产物(泳道1至泳道8)的分子大小为约35kDa(由星号表示)。还能够观察到分子质量为44kDa和46kDa的其它产物(由箭头表示)和大小范围为70kDa至115kDa的大聚集体(箭头)。分子量低于35kDa的多肽可能与rTF降解产物对应。 

显示不同电泳迁移率的几种TF相关产物的出现是由于蛋白聚集、不同程度的糖基化或两者导致。为了研究这些可能性，用内切糖基化酶Endo H和PNGase F处理yTT10301的提取物(克隆#7)。如图6所示，在用Endo H(泳道2)或PNGase F(泳道3)孵育后，较大聚集体(75kDa 至150kDa)消失，而清楚地观察到75kDa产物(将泳道1与泳道2和泳道3比较)。此外，经过上述两种处理，44kDa和46kDa蛋白带也消失。在用Endo H处理的样品(泳道2)中，44kDa和46kDa产物看起来产生约36kDa的产物。PNGase F处理导致出现37kDa和39kDa(泳道3)两条带。另一方面，35kDa产物在用这些糖基化酶处理后保持不变。因此，看起来35kDa产物与未糖基化的rTF蛋白对应，并且在内切糖基化酶处理后能够被识别的75kDa产物可以代表非糖基化蛋白的二聚体。在未处理样品中观察到的大聚集体能够与相同但具有不同糖基化程度的二聚体对应。类似地，44kDa和46kDa蛋白看起来与具有不同糖基化模式的35kDa蛋白对应。 

根据氨基酸序列确定的缺乏信号肽的hTF的预测分子量是29.8kDa。预测的与观察到的分子质量的偏差可能是由于疏水氨基酸存在伸展而使蛋白在SDS-PAGE中异常迁移。 

此外，通过激光扫描共聚焦显微镜来分析rTF通过yTT10301的表达。为了进行这些研究，将来自未表达(yTT10300)和表达rTF(yTT10301，克隆#7)的重组酵母的原生质球(即通过酶处理产生的缺乏细胞壁的酵母)固定，并用抗人TF mAb或用抗酵母膜ATPase mAb孵育。如图7所示，抗ATPase mAb仅特异性标记原生质球的表面(图7A，1和图片3)。然而，抗人TF mAb显示出分布于整个细胞的信号，表明rTF不仅存在于质膜中，而且存在于细胞内部，可能与内膜细胞区室结合(图7B，图片5和图片7)。另一方面，如图8所示，在携带空质粒的酵母细胞(yTT10300)中，抗ATPase mAb也在细胞表面给出特异性信号(图8A，图片1)，但是如期望的那样，未检测到抗人TF抗体的标记(图8B，图片3)。 

为了证实rTF是膜相关蛋白，将yTT10301酵母细胞用含有去垢剂Triton X-114(至终浓度为1％)的裂解缓冲液处理。在4℃下孵育1小时后，将裂解液加载至6％蔗糖垫(sucrose cushion)上方，在30℃下温热3分钟，并在300xg下离心3分钟以将上部水相与下部去垢剂相分离。收集水相并将去垢剂沉淀置于冰上。在取出少量试样用于随后的分析后，将水相进行第二轮Triton X-114提取。在进行新的相分 离后，收集第二水相并将新的去垢剂沉淀添加到前次沉淀中。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色(图9A)，以及通过用抗人TF mAb的Western印迹(图9B)来分析两次去垢剂沉淀的混合物和两水相。如图9B所示，仅在去垢剂相(泳道4)中观察到特征性的rTF来源的产物，而在两水相中的任一个(泳道2和泳道3)中都未观察到。在考马斯蓝染色的凝胶中，我们能够观察到来自酵母提取物的大部分蛋白保留在水相(泳道2和泳道3)中。该结果清楚地显示出由yTT10301表达的rTF是膜相关的。 

1.5.发酵方法 

为了测试工业化前水平下的yTT10301酵母提取物的产生，发明人将其在2升生物反应器(Biostat B-2L.BRAUN)中进行发酵。操作条件和培养基如下： 

操作条件：T：30℃；搅拌速度：250-300rpm；pH：4.5；气流：6L/m。 

培养基：CSM-URA：0.78g/L；YNB：6.7g/L；蔗糖：20g/L。 

图10中的图表显示在整个发酵过程中主要参数的演化。唯一不受控制的参数氧分压(PO₂)的变化反映了在该过程中细胞需氧量的变化。当PO₂达到稳定状态时(由箭头表示)(18h)停止发酵。 

通过在3,000rpm(1,200xg)下离心10分钟沉淀由发酵产生的产物，并将其在200ml裂解缓冲液(25mM PIPES(pH 7.8)，50mM NaCl)中重悬浮。将酵母通过高压(1,000巴(108Pa))(匀浆器NIRO SOAVIS.Panda 2K)匀浆，并于4℃将匀浆液在13,000rpm(13,000xg)下离心30分钟，分别收集沉淀(50ml)和澄清酵母提取物(CYE)上清液(150ml)。图11表示操作的总体方案。 

通过标准比色BCA测定(Pierce)来定量两种制剂中的蛋白浓度，并通过Western印迹分析来测定rTF的存在。这些测定的结果表明两种样品的总蛋白浓度相似(沉淀：3.8mg/ml和CYE：3.9mg/ml)，因此如图12所示，通过Western印迹检测到的CYE和沉淀中的rTF量也相等。 

当将两种样品在制备当天(1,400ng/ml活性rTF)进行分析时，如实施例4中所述测定的CYE和沉淀的促凝活性也相似，但是可能由于沉淀组分中存在蛋白酶，因此在制备后第四天沉淀提取物中的rTF稳定性低得多(1,500ng/ml比199ng/ml)。因此，选择CYE组分用于制备随后的药品。 

1.6.电子显微镜 

为了更好地表征CYE产物而进行免疫电子显微镜分析。通过电子显微镜(EM)对CYE样品的检测显示出存在大量不同尺寸(从0.1μm至0.01μm)的酵母来源的囊泡。如通过在它们周边存在的金颗粒所观察到的，约5％至10％的这些泡囊被抗人TF mAb标记(图13)。另一方面，在用无关mAb孵育的控制栅(control grid)中观察到非常少的金颗粒，并且它们未与囊泡结合(未示出)。 

目前已知最佳凝血活性需要TF与脂质的结合(Thromb.Haemost.2001；86：66-74)，且由于来自yTT10300的非表达TF的酵母提取物不显示任何促凝活性，因此这些结果显示出CYE的促凝活性存在于由rTF与酵母来源的膜微泡结合产生的脂化的rTF，下文称为CYE-TF(即具有促凝活性并包含与酵母来源的膜微泡结合的rTF的CYE组分)。 

实施例2 

在包含全长TF(mTF)的微泡中富集的促凝产物的制备

2.1纯化方法

根据前述操作(实施例1，第1.1节至第1.5节)制备从yTT10301中获得的包含rTF的澄清酵母提取物(下文称为CYE-TF)。使用孔径逐渐减小的过滤器(0.45μm、0.2μm和0.1μm膜(Sartorius，聚砜)将CYE-TF在错流过滤系统(Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop)中进行切向流过滤的连续步骤。所参照的流程图在图14A中示出。 

为了纯化包含rTF(mTF)的微泡，将对应于尺寸为0.1μM至0.2μM(0.1μM保留物)的10mL过滤的CYE-TF提取物加载至预先用磷酸盐缓冲液平衡过并与AKTA-FPLC系统连接的尺寸排阻色谱柱 (Sephacryl S500column-HR(60cm-26mm，320mL-general Electric)。使用相同缓冲液在流速1mL/min下进行洗脱，并且收集42个组分，每个4mL。通过在280nm处测量组分的吸光度来监测洗脱模式。在不同纯化试验中获得的色谱图相似。图15中的图表显示代表性的色谱图。 

通过Western印迹和通过活性测定法来分析来自每一组分的等分试样以鉴别具有促凝活性的那些组分。图16显示出聚积mTF的组分5-25(如通过Western印迹观察到的)也是活性集中的组分(表1)。 

表1 

尺寸排阻纯化后获得的组分5-42中的mTF促凝活性 

最后，为了集中活性，将从来自各纯化过程的组分5-43混合，并通过0.1μm过滤器再次进行TFF。如表2所示，通过这些手段可以获得生物活性mTF的可再现批次(reproducible lots)(14.31、14.32、15.32、 15.36)，并且这些批次全部显示出相似的蛋白图谱(图17)。 

表2：批次间的总蛋白含量和促凝活性的比较 

	总蛋白μg/mL	活性蛋白ng/mL
			mTF集合(Pool)14.31  mTF集合14.32  mTF集合15.32  mTF集合15.36	346  283  271  342	709  659  745  718

2.2.通过尺寸排阻色谱法纯化的含rTF微泡的生化特征 

2.2.1.蛋白含量 

除rTF以外，插入rTF的微泡还包含衍生自酵母宿主细胞的其它整合膜蛋白。通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色来分析不同批次纯化mTF的蛋白含量(图17A)。染色的凝胶的视觉比较表明不同批次的蛋白图谱几乎相同。为了进行更准确的比较分析，扫描凝胶并将凝胶的各泳道进行密度测定，并从各批次获得显示与不同蛋白带对应的峰图，以及各蛋白的相对强度。图17(板B)所示的四个批次蛋白谱极其相似。 

2.2.2.脂质含量 

根据由Hara和Radin描述的操作(Anal.Biochem.1978，90：420-426)并作某些改进(Rodriguez-Sureda y Peinado-Onsurbe，2005，Anal.Biochem.343：277-282)后，通过薄层色谱法来分析纯化mTF的脂质含量。使置于玻璃管中的120mg冻干产品基本溶解于己烷和异丙醇(3∶2，v∶v)的1mL混合物中。将为避免脂质氧化而避光的小瓶置于轨道混合器(orbital shaker)中24小时。此时，添加0.3mL硫酸钠(0.47M)。将样品离心以促进相分离。上相(己烷)包含非极性脂质，而极性脂质如磷脂被发现接近相界面。将上相转移到不同瓶中并使用氮气将其蒸发以避免脂质氧化。将包含脂质的干燥提取物溶解于氯仿(0.2mL)中。使用氯仿∶甲醇和水(C∶M∶W，345∶133∶21，v∶v∶v)作为流动相在硅胶板上进行TLC。与样品平行地在相同条件下分析脂质标准品。一旦使样 品在板上移动，通过添加碘蒸气使脂质显现。通过将样品中不同脂质组分的迁移率与标准品的迁移率进行比较来鉴别样品中不同脂质组分。 

利用该技术可以确定不同浓度(5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml)的CYE-TF(批次91)和纯化产物(5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的批次14.31)均包含复合脂质内容物，所述复合脂质包含三酰甘油、麦角固醇、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇(图18)。含rTF微泡的脂质图谱不同于衍生自通过将rTF合并到合成脂质体中而获得的再脂化rTF的图谱，所述合并根据waters，E.K.和Morrisey，J.H.(Biochemistry，2006，45：3769-3774)、Brucato，C.etal(Protein Expression and Purification(蛋白表达和纯化)，1998，26：386-393)、WO9848283和Guha，A.et al(Proc.Natl.Acad.Sic.USA，1986，83：299-302)等描述的操作进行。然而，在所有这些文献中描述的合成脂质体基本上包含磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的组合或磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺的组合，而根据本发明纯化的酵母来源的微泡包含在含rTF的脂质体中未发现的其它组分，如麦角固醇和心磷脂。 

实施例3 

基于全长TF His-标签修饰蛋白在酵母(6HT-TF)中表达的促凝产物的制备

3.1.在羰基末端包含6xhis-标签的rTF的制备 

在C末端或N末端包含组氨酸标签(his-标签)的蛋白的亲和色谱法纯化是已经广泛用于获得大量蛋白的高纯度制剂的非常标准化方法。作为任何色谱方法，能够容易将操作扩大。基于此，制备了在羰基末端包含6xhis-标签的rTF。 

3.2.rTF-his-标签质粒表达载体的产生 

将在3’端具有18个额外核苷酸(编码6个组氨酸)的编码成熟hTF蛋白(aa 33-295)的cDNA通过PCR扩增为842-bp片段。对于该反应，按照与实施例1(第1.2和1.3节)中描述的策略相似的策略进行。因此，使用人胎盘cDNA文库(Marathon-Ready cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)作为模板，并将寡核苷酸A和E用作引物。在寡核苷酸E中，hTFDNA序列的终止密码子(TAA)被编码6个组氨酸残基的核苷酸序列取代，所述序列后是新的终止密码子(TAG)。图19显示引物A和E在hTF DNA序列(基因文库登录号#BC011029)中的位置。

在35个PCR循环(94℃，30s，45℃30s，72℃1 min)以及在72℃下7min的最后延伸步骤后，将具有预期大小的DNA产物纯化(QiagenDNA纯化系统)。 

将被PCR扩增的DNA片段用BamHI消化以除去端部(the ends)，乙醇沉淀，并将其克隆至预先用BamHI消化的pTT10301载体中。在对几个克隆进行内切核酸酶限制性分析后，筛选出包含相对于GDP启动子(pGDP)正确定位的重组hTF-his-标签基因的质粒pTT10303(图20)。 

发明人还证实了克隆至pTT10301中的重组hTF-his-标签的DNA序列与先前公布的hTF DNA序列(基因库#BC011029)100％一致，并且它在3’端包含预期18个额外核苷酸。使用引物A和E以及Big Dye终止剂在自动测序仪(ABI prism 370，Applied Biosystems)中进行重组hTF-his-标签的DNA序列分析。使携带pTT10303质粒的DH5α细胞于37℃在LBA培养基中生长过夜，并将其用于制备甘油储备液。 

3.3.rTF-his-标签的表达 

如实施例1(第1.4节)所述，为了产生表达重组成熟hTF-his-标签的重组酵母(rTF-his-标签)，使用表达载体pTT10303转化T73 ura3-酵母细胞。通过在缺乏尿嘧啶的培养基中生长的能力来筛选重组酵母克隆(被称为yTT10302)。分离出yTT10302的五个独立克隆，并在不含尿嘧啶的培养基中培养过夜。Western印迹分析显示出所有筛选出的克隆均表达被抗人TF mAb识别的多肽(图21)。图22显示出所选克隆 (yTT10302克隆#5)与来自yTT10300和yTT10301重组酵母的提取物的rTF-his-标签表达模式比较。如图所示，由yTT10302表达的抗TF免疫反应性产物的分子大小为约36kDa、38kDa、45kDa、47kDa和49kDa(由箭头表示)，同时也能够观察到大分子量(约100kDa至115kDa)的其它聚集体(箭头)。如图20所示，如同在yTT10301酵母提取物的情况下那样，这些迁移率的差异与rTF的不同程度的糖基化对应。 

3.4.通过色谱法纯化rTF-his-标签 

3.4.1.纯化方法

为了纯化rTF-his-标签，发明人根据前述操作(实施例1，第1.1节至第1.5节)从由yTT10302获得的包含rTF-his-标签的澄清提取物(下文称为CYE-6HT-TF)开始。通过切向流过滤将所述CYE-6HT-TF通过0.2μm孔径过滤器进行过滤，随后将所述CYE-6HT-TF加载至预先用水洗涤并用起始缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl，pH为7.4)平衡的5ml 

亲和柱(Pharmacia Biotech)上。在施加样品后，回收穿流物(flow-through)(未结合的物质)，并且将柱洗涤三次：第一次用40ml起始缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，500mM NaCl，pH为7.4)洗涤；第二次用40ml包含10mM咪唑的起始缓冲液洗涤；以及第三次用40ml添加有100mM咪唑的起始缓冲液洗涤。在末次洗涤后，通过将25ml包含1M咪唑的起始缓冲液添加至柱来洗脱被称为6HT-TF的微泡化的rTF-his-标签蛋白，并收集2.5ml洗脱组分(组分#1、#2、#3和#4)。该方法的总体方案在图23中示出。 

将这些组分在透析缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，50mM NaCl，pH为7.4)中进行透析，并通过SDS-PAGE和银染或通过Western印迹来分析起始提取物、未结合的物质、洗脱前的末次洗涤液和透析过的四种洗脱组分。如图24A中的Western印迹所示，在与柱结合后，产物6HT-TF能够主要在前三个洗脱组分(泳道4-6)中顺利回收。值得注意的是，当通过凝胶的银染使来自相同样品的蛋白显现时(图24B)，仅能够在与起始酵母提取物(泳道1)和未结合的物质(泳道2)对应的泳道中观察到蛋白带，而不是在洗脱组分中(泳道4-7)。此外，这些样品中 的总蛋白量在标准BCA试剂的检出限(20μg/ml)以下。 

这些结果与Western印迹的结果一起清楚地表明高纯度6HT-TF产物能够通过该亲和色谱操作来获得。最重要的是，透析过的洗脱组分#1-3保持促凝活性，所述促凝活性如在实施例4所述的那样测定，并且引人注意的是，组分#1基本显示出与起始提取物CYE-6HT-TF相同的促凝活性。正如预期的那样，包含较少量免疫反应性rTF蛋白的组分(组分#4，泳道7)不显示任何促凝活性。 

这两种样品中的总蛋白浓度与活性的差异归纳如下： 

	总蛋白浓度  (mg/ml)	rTF浓度  (ng/ml)
			CYE-6HT-TF	6.2	275
组分#1 6HT-TF	ND*	252

ND^*：通过标准比色测定法(BCA)无法检测(检出限20μg/ml) 

3.4.2.分析方法

如图19的Western印迹所示，如同在整个酵母提取物中，洗脱组分的6HT-TF产物由大小不同的几个蛋白带组成，所述不同可能由rTF-his-标签蛋白的差别糖基化产生。为了研究该可能性，将洗脱出的组分#1进行内切糖基化酶处理。简而言之，将来自rTF表达酵母(yTT10301)的提取物用500单位(U)的内切糖苷酶H(Endo H)或N-糖苷酶F(PNGase F)在37℃下处理1小时，进一步使用抗人TF mAb通过Western印迹进行分析。图25显示在用PNGase F(泳道2)或Endo H(泳道3)处理后，经过两种处理的45kDa、47kDa和49kDa蛋白条带消失。在PNGase F孵育后，仅观察到两个多肽36kDa和38kDa，其很可能由于45kDa、47kDa和49kDa产物的去糖基化而增强(比较泳道1和泳道2)。用Endo H处理产生36kDa的唯一免疫反应性产物(泳道3)，其应该与未糖基化rTF-his-标签蛋白对应。 

此外，如实施例1(第1.6节)所述，在将纯化的6HT-TF用抗人TF mAb进行免疫染色后通过EM进行分析。如图26所示，能够观察 到大量金颗粒，其中大部分与常规尺寸小囊泡结合。在来自非rTF表达酵母的相似样品中进行平行分析，金颗粒的数目急剧减少(未示出)。该结果表明用于纯化6HT-TF产物的亲和色谱操作允许回收与酵母来源的膜微泡结合的生物活性6HT-TF。 

实施例4 

基于截短型hTF蛋白在酵母中表达的促凝产物(CYE-TTF)的制备

4.1.截短TF-his-标签(TTF-his-标签)质粒表达载体的产生 

通过PCR将在3′端具有18个额外核苷酸(编码6个组氨酸)的编码截短型hTF蛋白(TTF)的cDNA扩增为398bp片段，所述截短型hTF蛋白(TTF)包含与因子X(aa 174 251)相互作用的结构域、跨膜区(aa252-274)和胞质尾区(aa 275-295)。按照与实施例1(第1.2节和第1.3节)中所述策略相似的策略实施。因此，使用人胎盘cDNA文库(Marathon-Ready cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)作为模板，并使用寡核苷酸F和E作为引物。在寡核苷酸E中，hTF DNA序列的终止密码子(TAA)被其后是新终止密码子(TAG)的编码6个组氨酸残基的核苷酸序列取代。图28显示引物F和E在hTF DNA序列(基因库登录号#BC011029)中的位置。 

在35个PCR循环(94℃，30s，45℃ 30s，72℃ 1min)以及在72℃下7min的最后延伸步骤后，将具有预期大小的DNA产物纯化(QiagenDNA纯化系统)。 

将通过PCR扩增的DNA片段用BamHI消化以除去端部，乙醇沉淀，并将其克隆至预先用BamHI消化的pTT10301载体中。在对几个克隆进行内切核酸酶限制性分析后，筛选包含相对于GDP启动子(pGDP)正确定位的重组TTF-his-标签基因的质粒pTT10304(图29)。 

发明人还证实了克隆至质粒pTT10301中的rTF-his-标签的DNA序列与先前公布的序列(基因库#BC011029)100％一致，并且它在3’端包含18个额外核苷酸(图25)。使携带pTT10304质粒的DH5α细胞于37℃在LBA培养基中生长过夜，并将其用于制备甘油储备液。 

4.2.rTTF-his-标签通过重组酵母的表达 

如实施例1(第1.4节)所述，为了产生表达重组人截短TF-his-标签(rTF-his-标签)的重组酵母，使用表达载体pTT10304来转化T73 ura3^-酵母细胞。通过它们在缺乏尿嘧啶的培养基中生长的能力来选择重组酵母克隆(被称为yTT10304)。 

为了rTTF-his-标签表达，根据实施例1(第1.5节)中的前述操作，制备从yTT10304中获得具有促凝活性的澄清酵母提取物(CYE)，即CYE-TTF(即包含微泡化截短组织因子(TTF)的澄清酵母提取物(CYE))，并如实施例1所述分析其活性。 

实施例5 

N-糖基化突变体TF质粒表达载体的产生

TF显示出发生N-糖基化的三个不同残基，即N11、N124和N137。使用标准操作构建包含这些残基(N11A、N124A和N137A)及其所有可能组合的单突变体(图30)。 

寡核苷酸定点诱变(Oligonucleotide-Directed Mutagenesis) 

已经使用利用表3中列出的寡核苷酸的标准PCR反应来产生不同突变体(Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的通用方法)，第15章)。使用质粒pTT10302作为DNA模板，并使用Pfu作为聚合酶，因为它显示非常高的保真度和低错误率。 

表3.用于在TF中产生糖基化突变的寡核苷酸序列。 

Ala表示丙氨酸，且Asn表示天冬酰胺。 

名称  (SEQ ID NO)	氨基酸  位置-变化	方向	寡核苷酸序列5′-3′
				TT-7071(6)	11-Asn至Ala	正向	TGACACCGTCGTATACGTAATTGAACCTTTAGT
TT7075(7)	11-Asn至Ala	反向	ACTGTGGCAGCATATCGATTAACTTGGAAATCA
				TT-7072(8)	124-Asn至Ala	正向	ATCTTCTACGGTCACTGCCACTTTTGTTCCCAC
TT-7076(9)	124-Asn至Ala	反向	GTGGGAACAAAAGTGGCAGTGACCGTAGAAGAT
				TPM1(10)	137-Asn至Ala	正向	ACTTTAGTCAGTTGGGCAAACACTTTCCTAAGC
TPM2(11)	137-Asn至Ala	反向	GCTTAGGAAAGTGTTTGCCCTTCTGACTAAAGT

结果 

影响糖基化位点的TF中的点突变 

图31显示了比较糖基化位点的不同突变体与野生型图谱的抗TFWestern印迹。如图所示，它们所有图谱均不同，并且当用糖基酶处理时，所有带变为一条，这意味着观察到的图谱是由于不同糖基化状态而产生的。 

已经测定了这些突变体的凝固活性，并将数据归纳于表4中。已经将所有数据根据野生型标准化，将野生型的活性和表达看作100。11(PM1)和124(PM2)的单突变均显示出活性增加，但是令人惊讶的是当使残基124突变时观察到了最显著影响，因为其活性和表达显著增加(分别为6倍和2倍)。那些包含PM2的双突变体和三突变体的活性也是增加的。 

表4 

当与野生型6HT-TF比较时，糖基化位点不同的突变体的相对活性和表达。 

PM＝点突变 

实施例6 

微泡化组织因子(mTF)的促凝活性的评估

为简单起见，在该实施例中，除非另外指明，“微泡化组织因子”、“微泡化TF”或“mTF”一般是指组织因子、修饰的组织因子(通过一个或多个氨基酸的取代、消除、附加或交换)、包含组织因子的融合蛋白或者缺失部分或全部与FVIIa结合的结构域的截短组织因子，它们全部被全部或部分糖基化，并与酵母来源的微泡结合(即被整合到微泡的脂层中)。 

出于评估本发明提供的微泡化组织因子的促凝活性的目的，进行了一系列体外和体内测定，具体地： 

1.证实微泡化TF在健康和患者疾病状态中均引起纤维蛋白凝块形成和血液凝固的体外测定。 

1.1健康个体血浆中的凝固分析。 

1.2通过凝胶过滤纯化的泡囊与再脂化的TF的促凝效果的比较。 

1.3在缺乏FVIII、FIX或FXI的血浆中的凝固分析。 

1.4血小板减少血浆中的凝固分析。 

1.5在抗FVII抗体的存在下，来自FVIII、FIX和FXI缺乏血浆的血浆中的凝固分析。 

1.6健康个体的非抗凝全血中的凝固分析。 

1.7来自血友病患者的非抗凝全血中的凝固分析(非抗凝全血中的凝固分析)。 

2.证实微泡化TF是在严重出血模型中用于局部抗出血治疗的药剂(通过直接将其应用至先前切开的血管)的体内测定。 

2.1由近端切割大鼠尾部造成的严重出血动物模型中的测定。 

2.2预先用肝素处理的严重出血动物模型中的测定。 

3.证实微泡化TF是在致命性出血模型中用于局部抗出血治疗的药剂(通过直接将其应用至先前切开的血管)的体内测定。 

3.1由近端切割FVIII缺乏小鼠尾部造成的致命性出血动物模型中的测定。 

I.材料和方法 

材料 

使用三种不同化合物作为微泡化组织因子(mTF)来源： 

(i)根据实施例1获得的包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)； 

(ii)根据实施例2获得的纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)；以及 

(iii)根据实施例3获得的包含微泡化截短组织因子的澄清酵母提取物(CYE-TTF)； 

商品化的凝血因子FVIII-、FIX-和FXI-缺乏血浆均购自DadeBehring Marburg GmbH。 

商品化的单克隆抗人FVII抗体(克隆HVII-1)购自Sigma Aldrich。 

商品化的血友病小鼠(等位基因：F8^tmlKaz；通用名MFVIII-16；由 Haig H Kazazian突变；参考文献：Bi L；Lawler AM；Antonarakis SE；High KA；Gearhart JD；Kazazian HH Jr.1995.Targeted disruption of themouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A(小鼠因子VIII基因的靶向破坏产生血友病A模型)，Nat.Genet.10：119-21)购自Jackson Laboratory。 

商品化的rTF来自于American Diagnostica。 

从“Banc de Sang i Teixits”行政区(Department″Bane de Sang iTeixits″，Pg，Vall d’Hebrón，119-129，08035 Barcelona)，Vall d’Hebrón医院的血库获得五位健康供者的血浆样品。检验血浆样品的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HIV和TPHA，全部为阴性。将五份血浆样品混合并在使用它们前置于1.5ml瓶中冻存于-20C。 

方法 

rTF的再脂化 

根据由Morrissey描述的标准操作(http://www.tf7.org/relipidation2.pdf)将商购的rTF(AmericanDiagnostica)再脂化，其中将rTF合并到磷脂脂质体中。通过AmericanDiagnostica Inc.的IMUBIND组织因子ELISA试剂盒(No.845)并根据供应商的说明书来定量存在于样品中的rTF量。 

体外测定 

为了测定微泡化截短组织因子是否缺失部分或全部与FVII连接(结合)的结构域，以及为了知道它是否仍然有活性，首先，进行微泡化截短组织因子与FVIIa的结合测定以测定微泡化截短组织因子与FVIIa的结合是否能够被检测到，其次，能够使用血浆中的凝固分析来测定微泡化截短组织因子作为促凝剂是否仍然具有促凝活性。 

微泡化截短组织因子与FVIIa的结合测定

为了测定纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签的融合蛋白(6HT-TF)、包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)或包含微泡化 截短TF的澄清酵母提取物(CYE-TTF)与凝血因子VIIa(FVIIa)间的相互作用，本发明的作者采用国际申请WO 00/04148中描述的方法的改进形式。通过这些方法，6H-TF、CYE-TF或CYE-TTF与生物素化FVIIa的结合如ELISA试验测定。基于此，如前所述制备生物素化FVIIa(BEGR-7a)(Kelley et al.，1995 Biochem.34：10383-10392)。然后，使用链霉亲和素作为捕获剂用BEGR-7a包被96孔板。用溶于蒸馏水中的0.05％的吐温20洗涤孔2次，并用包含1％脱脂奶粉(封闭液)的PBS封闭2小时。然后，将在TNC缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，100mMNaCl，5mM CaCl₂)中制备的从10μg/ml浓度开始的6HT-TF、CYE-TF或CYE-TTF的10倍稀释液添加至孔中，所述稀释液含有固定量的与BEGR-7a偶联的链霉亲和素或单独链霉亲和素。在R/T下孵育2小时后，用0.05％吐温20再次洗涤孔以除去未结合的物质。为了检测不同的含TF的溶液中TF-FVIIa复合物，使用特异性抗TF兔多克隆抗血清。因此，将为1∶500稀释的抗TF血清稀释液添加到孔中并在37℃下孵育2h。在添加检测抗体前洗涤板5次。将过氧化物酶-偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(Southern Biotechnology Associated)以1∶1000稀释至封闭液中，并在37℃下孵育1小时。将板再洗涤5次，并使用过氧化氢和邻苯二胺(OPD)0.05％来引发反应。在R/T下孵育10min至15min后，通过添加H2SO4(2N)停止反应，并在492nm处由Multiskan Plus板读数仪(labsystem)测量吸光度。 

血浆中的凝固分析

通过两步凝固分析在4通道血凝仪(Start 4，Diagnostica Stago)中测量血浆中的自发促凝活性(未经刺激)。简而言之，将50μl血小板贫乏的血浆添加到已经调温好的试管中，并添加50μl样品(以mTF或蒸馏水作为对照)。将混合物置于37℃下孵育60秒，并立即添加50μl的25mM氯化钙，在血凝仪中测定以秒为单位的凝血时间，由凝块形成来验证。通过离心获得血小板贫乏的血浆，并通过计数器(Coulter)测定血小板数。 

通过使用利用免疫亲和技术耗尽某种凝血因子的商购血浆(Dade Behring Marburg GmbH)来研究mTF对分别与血友病、血友病B或血友病C对应的凝血因子缺乏血浆(FVIII、FIX或FXI)的促凝效果。在每一情况下，所述凝血因子的终含量低于1％。 

在用连续离心方法耗尽血小板的血浆中研究血小板减少样疾病状态中的促凝效果。 

全血中的凝固分析

通过凝固方法测定非抗凝全血中的促凝活性。将待研究的不同药剂(mTF)以0.2ml终体积添加到0.8ml非抗凝全血中，并用记时计测量从提取开始直到出现稳定并固结的血凝块的凝血时间。通过血液凝固时间的缩短或延长来评估不同药剂的效果。 

全血样品从患者或健康志愿者获得。 

体内测定 

由大鼠尾部近端切割造成的严重出血模型

将重300克至600克的Sprage-Dawley雄性大鼠随机分成2个治疗组： 

-由至少3只动物组成的对照组，其接受用生理盐水溶液的局部治疗，以及 

-也由至少3只动物组成的第二组，其接受用mTF的局部治疗。 

使所有化合物局部接触动物尾部的近端切割面，以1ml/min体积直接施加于伤口表面来止血，大鼠处于仰卧姿势。通过确认未进一步出血来证实形成了稳定和固结的凝块。 

在用抗凝药物处理的动物中，通过大鼠尾部近端切割造成的严重出血模型

a)6HT-TF处理的动物

将重300克至600克的Sprage-Dawley雄性大鼠随机分成2个治疗组： 

-由14只动物组成的对照组，其接受用生理盐水溶液的局部治疗， 以及 

-由5只动物组成的第二组，其在开始尾部横断操作前15分钟接受200U/kg肝素静脉注射(i.v.)。 

15分钟后用mTF(6HT-TF)1494ng/ml处理该组。使mTF局部接触动物尾部的近端切割面，通过塑料移液器逐滴施加于切割面来止血。 

通过确认未进一步出血来证实形成了稳定和固结的凝块。 

b)CYE-TF处理的动物

将27只重300克至600克的Sprage-Dawley雄性大鼠随机分成5个治疗组： 

-由14只动物组成对照组，其接受生理盐水溶液的局部治疗； 

-在开始尾部横断操作前15分钟接受200U/kg肝素i.v的两组(待用CYE-TF处理(n＝3)，以及待用生理盐水溶液处理(n＝5))，以及 

-其它两组，其在开始尾部横断操作前接受3天口服0.1mg/kg/天的华法林(待用CYE-TF处理(n＝3)，以及待用生理盐水溶液处理(n＝2))。 

因此，对各抗凝治疗均存在对照治疗组。使CYE-TF局部接触动物尾部的近端切割面，通过塑料移液器逐滴施与来止血。通过确认未进一步出血来证实形成了稳定和固结凝块。 

使用因子VIII缺乏小鼠，通过小鼠尾部近端切割造成的致命性出血模型

该测定法的目的在于评价mTF在致命性出血模型(尾静脉断)中的局部给药效果，所述致命性出血模型使用通过基因定点突变获得的因子VIII-缺乏小鼠(血友病A)。 

为靶向性的X染色体连锁的突变体等位基因纯合子的小鼠是可存活的并可生育。纯合子雌性和基因携带雄性具有低于1％的正常因子VIII活性，并显示出凝血时间延长。这些小鼠再现了血友病A的关键特征并提供了用于探究备选治疗策略的优秀模型。 

有如下的5个治疗组，每组3只至5只小鼠： 

组A：对照小鼠          介质(vehicle)0ng/ml 

组B：血友病雄性小鼠    介质  0ng/ml 

组C：血友病雄性小鼠    mTF   1,494ng/ml 

组D：血友病雌性小鼠    介质  0ng/ml 

组E：血友病雌性小鼠    mTF   1,494ng/ml 

mTF储备液蛋白浓度为1,494ng/ml生物活性物质。仅仅直接使用来自储备液容器中的一个剂量并不进行稀释。使用两步凝固分析基于生物活性蛋白浓度计算测试品剂量。以速率为0.25ml/分钟逐滴将mTF和介质局部给予至小鼠尾部出血部位，最长给予20分钟(5ml)。 

II.结果 

1.证实微泡化TF引起健康和患者疾病状态的血液凝固的体外测定 

为了评估不同浓度的mTF引起健康个体和血友病个体中纤维蛋白凝块的能力，进行若干体外测定。如前所述，“凝血时间”是指在非抗凝血液样品中凝块固结的时间。 

1.1微泡化TF能够使来自健康个体的血浆凝固(血浆中的凝固分析)

在健康血浆中对不同浓度mTF促凝活性的直接测定表明mTF能够以明显的剂量-反应方式非常显著地减少健康血浆状态的凝固时间。即使在非常低的mTF浓度(2ng/ml)下，健康血浆的凝固时间也减少了大约3倍时间。在较高浓度(100ng/ml)下健康血浆的凝血时间出现了超过5倍的减少。表5显示在纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)的三次独立试验的结果，表6为包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)的结果，表7为包含微泡化截短TF的澄清酵母提取物(CYE-TTF)的结果。 

表5 

纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)以剂量-反应方式缩短健康血浆的凝血时间 

表6 

包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)以剂量-反应方式缩短健康血浆的凝血时间 

表7 

包含微泡化截短TF的澄清酵母提取物(CYE-TTF)缩短健康血浆的凝血时间 

1.2当与根据标准操作再脂化的rTF比较时，微泡化TF能够以改善的功效使血浆凝固。

1.2.1.mTF与按照标准操作再脂化的商购rTF的促凝活性比较。 

根据Morrissey(http://www.tf7.org/relipidation2.pdf)中所述标准操作将商品化的rTF(American Diagnostica)再脂化，其中将rTF合并到磷脂脂质体中。从Department“Banc de Sang i Teixits”(Pg，Vall d’Hebrón，119-129，08035 Barcelona)，Vall d’Hebrón医院的血库中获得五位健康供者的血浆样品。检验血浆样品的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HIV和TPHA，全部为阴性。将五份血浆样品混合，并在使用前将它们置于1.5ml小瓶中冻存于-20C。存在于样品中的rTF量通过American Diagnostica Inc.的IMUBIND组织因子ELISA试剂盒(No.845)并按照供应商的说明书来定量。 

首先，分析合并到酵母微泡中的rTF或当将其插入到合成脂质体中的rTF之间活性的可能差异。为了这些试验，测试四个不同批次(批次P4、批次P7、批次P8和批次P9)和一个批次体外再脂化的rTF的凝血活性，所述批次全部具有由ELISA测量的已知浓度。因此，在标准凝血试验中测试mTF(来自四个不同批次)或再脂化的商购rTF的连续稀释液的活性。结果表明所测试的全部浓度，且不依赖于测试的批次，mTF样品中的促凝活性通常高于(在1个或2个数量级间)相应的再脂化的rTF稀释液(图32)。 

1.2.2.插入到酵母来源的微泡(mTF)中的rTF与插入到合成脂质体中的相同rTF的促凝活性的比较。 

对再脂化从mTF微泡中提取的rTF的努力已经表明当与包含rTF的原酵母来源的微泡比较时，rTF活性显著降低(图33)。看起来对最佳组织因子活性存在构象要求。 

1.2.3.mTF在肝素化血浆中的促凝活性 

此外，存在于重组合制剂中的活性在某些出血体内模型(肝素化动 物)中是可以忽略的(图34)。 

总而言之，1.2中所示结果表明存在于本发明的mTF或6H-TF微泡中的组织因子和酵母膜的独特组合显示止血活性，其不能通过将rTF常规体外插入到合成脂质体中来实现。 

1.3.微泡化TF能够使FVIII、FIX和FXI-缺乏患者的血浆凝固(血浆中的凝固分析)

在通过免疫耗竭获得的凝血因子FVIII(血友病A)、FIX(血友病B)和FXI(血友病C)缺乏血浆中，不同浓度mTF促凝活性的直接测定证实了mTF能够以明显的剂量-反应方式非常显著地减少血友病状态中的凝血时间。即使在非常低mTF浓度(2ng/ml)下它也能够激发FVIII、FIX或FXI耗尽血浆的凝血。在较高浓度(100ng/ml)下，mTF将耗竭血浆中的凝血时间缩短到与在健康血浆中缩短到的相同水平。表8显示纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)的三次独立试验的结果，表9显示包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)的结果。 

表8 

纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)在凝血因子FVIII(血友病A)、FIX(血友病B)和FXI(血友病C)缺乏血浆中以剂量-反应方式缩短凝血时间 

表9 

包含微泡化TF的澄清酵母提取物在凝血因子FVIII(血友病A)、FIX(血友病B)和FXI(血友病C)缺乏血浆中以剂量-反应方式缩短凝血时间 

1.4.微泡化TF能够使后天性血小板缺陷血浆凝固(血小板减少血浆中的凝固分析)

后天性血小板缺陷血浆中的mTF促凝活性的直接测定证实mTF能够非常显著地减少具有不同血小板计数的血小板减少血浆中的凝血时间。如表10所示，即使在非常低的血小板计数(＜1,000/μl)下，也能够通过包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)来显著缩短凝血时间。 

表10 

包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)缩短血小板减少血浆的凝血时间 

1.5.微泡化TF能够在抗FVII抗体的存在下使来自FVIII、FIX和FXI缺乏血浆的血浆凝固(血浆中的凝固分析)

在抗FVII单克隆抗体的存在下，利用健康志愿者的FVIII、FIX和FXI缺乏血浆(FVIII DP、FIX DP和FXI DP)通过凝血测定来研究微泡化TF对血浆凝固的影响。如表11所示，结果清楚地表明包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)能够引起血浆凝固，即使在FVIII、FIX或FXI缺乏时和在抗FVII单克隆抗体存在下也非常减少凝血时间。令人惊讶的是，在FX缺乏和在FVII抗体存在下的凝血意味着mTF不是通过内源性或者外源性凝血途径起作用。 

表11 

包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)在抗FVII抗体存在下使FVIII、FIX和FXI缺乏血浆凝固 

1.6微泡化TF能够使健康个体的血液凝固(非抗凝全血中的凝固分析)

不同浓度的mTF在健康个体全血中促凝活性的直接测定证实mTF能够以明显的剂量-反应方式非常显著地缩短凝血时间。即使在非常低的mTF浓度(1ng/ml)下它也能够缩短健康个体全血中的凝血时间。在较高浓度(100ng/ml)下，mTF在耗竭血浆中减少了超过8倍的凝血时间。表1 2显示纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)的三次独立试验的结果，表13显示包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)的结果。 

表12 

纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白在健康个体全血中以剂量-反应方式缩短凝血时间 

表13 

包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)在健康个体全血中以剂量-反应方式缩短凝血时间 

1.7微泡化TF能够使血友病患者的血液凝固(非抗凝全血中的凝固分析)

不同浓度的mTF在血友病患者的全血中促凝活性的直接测定证实mTF能够以明显的剂量-反应方式非常显著地缩短凝血时间。即使在低mTF浓度(2ng/ml-5ng/ml)下它也能够使血友病患者全血的凝血时间正常化。在较高浓度(20ng/ml)下，mTF将血友病患者全血的凝血时间减少至小于1分钟。表1 4显示纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)的三次独立试验的结果，表15显示包含微泡化 TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)的结果。 

表14 

纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)在血友病A和血友病B患者的全血中以剂量-反应方式缩短凝血时间 

表15 

包含微泡化TF的澄清酵母提取物(CYE-TF)在血友病A和血友病B患者全血中以剂量-反应方式缩短凝血时间 

2.证实微泡化TF是在严重出血模型中用于局部抗出血治疗的药剂的体内测定(通过直接应用至先前切开的血管) 

为了评估不同浓度mTF在健康个体和血友病个体中引起纤维蛋白凝块的能力，进行若干体内测定。 

2.1微泡化TF在由大鼠尾部近端切割造成的严重出血动物模型中用作局部止血剂

使用全尾横断的严重出血大鼠模型进行的体内研究表明出血时间显著缩短：当用1494ng/ml至总蛋白浓度高达1.7μg的6HT-TF处理动物时从18.16±1.61缩短至8.36±0.82分钟；当用200ng/ml/min的CYE-TF处理动物时从18.16±5.98缩短至9.33±1.05分钟。 

2.2微泡化TF在预先用肝素处理的严重出血动物模型中用作局部止血剂

使用通过全尾切割导致的抗凝剂(即肝素200 IU)预处理大鼠的严重出血模型的体内研究显示出非常显著的抗出血效果。未用6HT-TF处理的大鼠在90分钟后出血致死，而用1494ng/ml的6HT-TF处理的大鼠在15.46±1.20分钟内停止出血并显示出100％存活率。另一方面，CYE-TF的使用也显示出相似的抗出血效应。用肝素预处理过的大鼠在90分钟后出血致死，而用CYE-TF处理过的大鼠在14.2±2.4(n＝5)分钟内停止出血并也显示出100％存活率。当用CYE-TF(200ng/ml)处理时，用华法林预处理过的大鼠的凝血时间从41.6±16.45减少为5.8±0.64(n＝3)分钟。 

3.证实微泡化TF是在致命性出血模型中用于局部抗出血治疗的药剂的体内测定(通过直接应用至先前切开的血管) 

3.1微泡化TF在由FVIII缺乏小鼠的尾部近端切割造成的致命性出血动物模型中用作局部止血剂

在血友病小鼠(FVIII缺乏小鼠)致命性出血模型中，6HT-TF的局部给药导致出血时间与在正常的非血友病小鼠中得到的出血时间(5.0±0.65分钟)相比显著减少(在血友病雄性小鼠中，从31.4±4.74减少至5.14±0.69分钟，且在雌性小鼠中从43.33±13.48减少至5.0±2.0分钟)。在用6HT-TF处理的组中该出血时间减少不伴随死亡，而所有用介质处理过的血友病小鼠则出血致死。表16显示纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)的五次/三次独立试验的结果。 

表16 

纯化的微泡化TF-六聚组氨酸标签融合蛋白(6HT-TF)在由FVIII缺乏小鼠的尾部近端切割造成的致命性出血模型中缩短出血时间 

全部的结果显示了mTF在健康个体甚至在血友病患者中强大的止血潜力，这通过使用血友病A基因缺陷小鼠模型的体外(血友病患者血浆和全血)以及体内模型得到证实。此外，mTF能够在内源性途径和外源性途径均被阻断的情况下使血浆凝固。 

序列表

 

<110>Thrombotargets Europe，S.L.

 

<120>衍生自重组酵母的具有止血活性的微泡及其用途

 

<130>P2186PC00

 

<150>EP06380342.3

<151>2006-12-29

 

<160>11

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>295

<212>PRT

<213>人

 

<400>1

Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val

1               5                   10                  15

Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala

            20                  25                  30

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser

        35                  40                  45

Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

    50                  55                  60

Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

65                  70                  75                  80

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

                85                  90                  95

Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala

            100                 105                 110

Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

        115                 120                 125

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

    130                 135                 140

Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

145                 150                 155                 160

Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

                165                 170                 175

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

        195                 200                 205

Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

    210                 215                 220

Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

225                 230                 235                 240

Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile

                245                 250                 255

Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile

            260                 265                 270

Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu

        275                 280                 285

Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser

    290                 295

 

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>用于分离或纯化融合蛋白的氨基酸序列

 

<400>2

Ala His Gly His Arg Pro

1               5

 

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>用于分离或纯化融合蛋白的氨基酸序列

 

<400>3

Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser

1               5                   10

 

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>用于分离或纯化融合蛋白的氨基酸序列

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(6)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

 

<400>4

Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys

1               5

 

<210>5

<211>888

<212>DNA

<213>人

 

<400>5

atggagaccc ctgcctggcc ccgggtcccg cgccccgaga ccgccgtcgc tcggacgctc    60

ctgctcggct gggtcttcgc ccaggtggcc ggcgcttcag gcactacaaa tactgtggca    120

gcatataatt taacttggaa atcaactaat ttcaagacaa ttttggagtg ggaacccaaa    180

cccgtcaatc aagtctacac tgttcaaata agcactaagt caggagattg gaaaagcaaa    240

tgcttttaca caacagacac agagtgtgac ctcaccgacg agattgtgaa ggatgtgaag    300

cagacgtact tggcacgggt cttctcctac ccggcaggga atgtggagag caccggttct    360

gctggggagc ctctgtatga gaactcccca gagttcacac cttacctgga gacaaacctc    420

ggacagccaa caattcagag ttttgaacag gtgggaacaa aagtgaatgt gaccgtagaa    480

gatgaacgga ctttagtcag aaggaacaac actttcctaa gcctccggga tgtttttggc    540

aaggacttaa tttatacact ttattattgg aaatcttcaa gttcaggaaa gaaaacagcc    600

aaaacaaaca ctaatgagtt tttgattgat gtggataaag gagaaaacta ctgtttcagt    660

gttcaagcag tgattccctc ccgaacagtt aaccggaaga gtacagacag cccggtagag    720

tgtatgggcc aggagaaagg ggaattcaga gaaatattct acatcattgg agctgtggta    780

tttgtggtca tcatccttgt catcatcctg gctatatctc tacacaagtg tagaaaggca    840

ggagtggggc agagctggaa ggagaactcc ccactgaatg tttcataa                 888

 

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于在TF中产生糖基化突变的引物TT-7071

 

<400>6

tgacaccgtc gtatacgtaa ttgaaccttt agt                                 33

 

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于在TF中产生糖基化突变的引物TT7075

 

<400>7

actgtggcag catatcgatt aacttggaaa tca                            33

 

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于在TF中产生糖基化突变的引物TT-7072

 

<400>8

atcttctacg gtcactgcca cttttgttcc cac                            33

 

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于在TF中产生糖基化突变的引物TT-7076

 

<400>9

gtgggaacaa aagtggcagt gaccgtagaa gat                            33

 

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于在TF中产生糖基化突变的引物TPM1

 

<400>10

actttagtca gttgggcaaa cactttccta agc                            33

 

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>用于在TF中产生糖基化突变的引物TPM2

 

<400>11

gcttaggaaa gtgtttgccc ttctgactaa agt                            33

Claims (18)

1.携带组织因子(TF)的酵母来源的微泡，其包含(i)酵母膜，以及(ii)具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其变异体，其中所述具有促凝活性的组织因子(TF)蛋白或其变异体的一部分被整合到所述膜内，其中所述具有促凝活性的变异体对应于具有选自以下的至少一种修饰的组织因子蛋白：

(a)包含与TF蛋白的C-末端或N-末端结构域结合的标签；

(b)去除信号肽而成为成熟TF蛋白；

(c)对应于人成熟TF蛋白中第11-13位残基的N-糖基化位点的修饰，其通过将第11位的Asn取代为Ala，所述修饰使所述位点为非功能性的；

(d)对应于人成熟TF蛋白中第124-126位残基的N-糖基化位点的修饰，其通过将第124位的Asn取代为Ala，所述修饰使所述位点为非功能性的；

(e)对应于人成熟TF蛋白中第137-139位残基的N-糖基化位点的修饰，其通过将第137位的Asn取代为Ala，所述修饰使所述位点为非功能性的；

(f)对应于人成熟TF蛋白中第11-13位和第124-126位残基的N-糖基化位点的修饰，其通过将第11位和第124位的Asn取代为Ala，所述修饰使所述位点为非功能性的；

(g)对应于人成熟TF蛋白中第124-126位和第137-139位残基的N-糖基化位点的修饰，其通过将第124位和第137位的Asn取代为Ala，所述修饰使所述位点为非功能性的；

(h)对应于人成熟TF蛋白中第11-13位、第124-126位和第137-139位残基的N-糖基化位点的修饰，其通过将第11位、第124位和第137位的Asn取代为Ala，所述修饰使所述位点为非功能性的；以及

(i)去除负责与FVIIa结合的结构域的全部或一部分；以及

其中可通过下述方法获得所述携带TF的酵母来源的微泡，包括：

1)将表达所述具有促凝活性的TF蛋白或其变异体的重组酵母细胞的培养物在允许所述具有促凝活性的TF蛋白或其变异体表达的条件下发酵；

2)将由步骤1)的发酵得到的所述产物沉淀，以提供发酵产物；

3)将从步骤2)获得的所述发酵产物在不存在去垢剂的情况下匀浆，以提供发酵匀浆液；

4)将从步骤3)获得的所述发酵匀浆液分离，以提供沉淀和澄清酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物包含所述携带TF的酵母来源的微泡；

5)收集包含所述携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取物(CYE)；以及，任选地，

6)如果需要，将所述携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。

2.如权利要求1所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF因子蛋白或其变异体是糖基化的。

3.如权利要求1所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF因子蛋白或其变异体是人的。

4.如权利要求1所述的酵母来源的微泡，其中所述标签是组氨酸标签(His-标签)。

5.如权利要求3所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF变异体是人成熟TF蛋白，其对应于缺少信号肽的人TF蛋白。

6.如权利要求1所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF变异体对应于具有权利要求1中定义的修饰的N-糖基化位点的TF蛋白，并且所述变异体在成熟人TF蛋白中的第124位的Asn残基处包含Asn至Ala的突变。

7.如权利要求1所述的酵母来源的微泡，其中所述具有促凝活性的TF变异体是在C-末端含有His-标签并且在成熟人TF蛋白中的第124位的Asn残基处携带Asn至Ala的突变的人成熟TF蛋白。

8.组合物，其包含权利要求1-7中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡。

9.如权利要求1-7中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡，其作为药物。

10.如权利要求9所述的携带TF的酵母来源的微泡，其作为具有促凝活性的药物。

11.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡和药物可接受的介质。

12.如权利要求1-7中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡，其用于治疗个体出血。

13.如权利要求12所述的携带TF的酵母来源的微泡，其用于局部治疗个体出血。

14.如权利要求1-7中任一权利要求所述的携带TF的酵母来源的微泡，其用于治疗需要促进个体细胞迁移和／或血管生成的疾病。

15.用于制备权利要求1所述的携带TF的酵母来源的微泡的方法，其包括：

a)将表达权利要求1中定义的具有促凝活性的TF蛋白或其变异体的重组酵母细胞的培养物在允许所述具有促凝活性的TF蛋白或其变异体表达的条件下发酵；

b)将由步骤a)的发酵得到的所述产物沉淀，以提供发酵产物；

c)将从步骤b)获得的所述发酵产物在不存在去垢剂的情况下匀浆，以提供发酵匀浆液；以及

d)将从步骤c)获得的所述发酵匀浆液分离，以提供沉淀和澄清酵母提取物(CYE)，所述酵母提取物包含所述携带TF的酵母来源的微泡；

e)收集包含所述携带TF的酵母来源的微泡的所述澄清酵母提取物(CYE)；以及，任选地，

f)如果需要，将所述携带TF的酵母来源的微泡分离或纯化。

16.如权利要求15所述的方法，其中通过标签纯化或通过免疫亲和色谱法实施所述纯化。

17.用于制备包含来自酵母宿主细胞的感兴趣膜蛋白的微泡的方法，其中所述感兴趣蛋白是权利要求1中定义的具有促凝活性的TF蛋白或其变异体，所述方法包括以下步骤：

a)使所述酵母宿主细胞的培养物在允许所述感兴趣膜蛋白表达的条件下生长；

b)将a)的培养物的细胞部分在不存在去垢剂的情况下匀浆；

c)将从步骤b)获得的匀浆液分离，以提供沉淀和澄清细胞提取物，所述细胞提取物包含所述含有感兴趣膜蛋白的细胞来源的微泡；

d)使用切向流过滤和／或使用保留直径为0.1μm至0.2μm的微泡的膜过滤器通过尺寸分配来纯化所述细胞来源的微泡。

18.如权利要求17所述的方法，所述方法包括通过尺寸排阻色谱法的附加浓缩步骤或通过亲和色谱法的附加纯化步骤，所述亲和色谱法使用对所述感兴趣膜蛋白显示亲和力的配体。

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