DK174889B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af væksthormoner - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af væksthormoner Download PDFInfo
- Publication number
- DK174889B1 DK174889B1 DK198503779A DK377985A DK174889B1 DK 174889 B1 DK174889 B1 DK 174889B1 DK 198503779 A DK198503779 A DK 198503779A DK 377985 A DK377985 A DK 377985A DK 174889 B1 DK174889 B1 DK 174889B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hormone
- analog
- suspension
- liquid
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 75
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 52
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 50
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 43
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 18
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 17
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 17
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 17
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 17
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 17
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 17
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 16
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 16
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 16
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 claims description 16
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 8
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 5
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 229920002491 Diethylaminoethyl-dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 33
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 61
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 21
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 21
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 19
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 18
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 18
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 5
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- AXMJGXMRGDCRND-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)cyclohexyl]oxyethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1CCC(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)CC1 AXMJGXMRGDCRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N Met-Asp-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O JQECLVNLAZGHRQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- CDMADVZSLOHIFP-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane;decahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 CDMADVZSLOHIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 e.g. Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 239000003668 hormone analog Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940088174 thiamine 1 mg Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i DK 174889 B1
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde som beskrevet i krav 1.
Et mål med forskning inden for genetisk manipulation har været at udvikle metoder til fremstilling af proteiner i mikroorganismer, hvilke proteiner i naturen kun dannes i højere 5 organismer. Dette mål er nået med hensyn til visse eukaryote væksthormoner eller analoge deraf. Stammer af genetisk modificerede bakterier, fx Escherichia coii, der er i stand til ved dyrkning og induktion at danne forskellige væksthormoner eller analoge * deraf, er blevet deponeret i American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland.
Sådanne hormoner har stor potentiel værdi til landbrugsanvendelser, fx for at forøge 10 mælke- og kødproduktionen hos husdyr, samt til medicinske anvendelser, fx til behandling af mennesker, som lider af dværgvækst.
| Dannelsen af et væksthormon i en mikroorganisme omfatter følgende generelle trin: (l) fremmed DIVIA, der er indkodet med de genetiske instruktioner til dannelse af et ønsket 15 hormon, indsættes i en hensigtsmæssig mikroorganisme såsom Escherichia coii, (2) mikroorganismen dyrkes under hensigtsmæssige betingelser og danner og lagrer hormonet i store mængder, og (3) hormonet isoleres fra mikroorganismen og oprenses.
Isolering og oprensning af hormonet indebærer sædvanligvis sprængning af cellen, 20 adskillelse af væksthormonet fra de andre cellebestanddele og yderligere oprensning af det isolerede hormon. Uønskede cellulære bestanddele kan nedbrydes med enzymer, solubiliseres med overfladeaktive midler og adskilles fra hormonet ved centrifugering.
Endelig kan væksthormonet oprenses i varierende omfang ved hjælp af forskellige teknikker, der er blevet udviklet til oprensning af proteiner i almindelighed. Sådanne 25 teknikker omfatter én eller flere af følgende: dialyse, zone-centrifugering, molekylær eksklusionschromatografi, isoelektrisk udfældning, indsaltning og udsaltning, opløsningsmiddelfraktionering, elektroforetiske metoder, ionbytningschromatografi og affinitetschromatografi. Disse metoder varierer indbyrdes både med hensyn til rentabilitet og graden af opnåelig oprensning.
30 Nærværende ansøgeres EP 0 173 215 Bl, beskriver en isolerings- og oprensningsmetode for bovint væksthormon. Denne metode omfatter isolering af hormonet ved mekanisk at sprænge en blandet cellesuspension og inkubere bundfaldet med lysozym og derefter med deoxyribonuclease. Hormonet oprenses derefter ved sonikering af det solubiliserede 35 hormon, klaring af opløsningen ved centrifugering og underkastelse af opløsningen, der indeholder hormonet, gelchromatografi, ionbytningschromatografi, dialyse og lyofilisering.
Ovenstående metode kræver temmelig store mængder lysozym og medfører gentagne og tidskrævende vaskninger for at opnå det oprensede hormon, og selv da fås det kun i et 40 relativt lavt udbytte {ca. 10-15% baseret på vægten af hormonet i cellerne ved fermenteringens afslutning). Den ovenstående metode har en anden ulempe, fordi den er afhængig af nedbrydningen med deoxyribonuclease. Deoxyribonuclease er et dyrt enzym, som er blevet anvendt til at nedbryde cellulært DNA under hormonisoleringsprocessen. Deoxyribonudeasepræparationer har vist sig at være kontamineret med proteaser, der 2 DK 174889 B1 nedbryder det ønskede produkt under isoleringen. Anvendelse af deoxyribonuclease som i ovenstående metode kan således reducere udbyttet af isoleret hormon, medmindre man tager yderligere forholdsregler ved at inhibere eventuelt tilstedeværende protease. Selv da kan en fuldstændig inhibering af protease ikke være mulig. Ud over at reducere 5 produktudbyttet medfører anvendelsen af deoxyribonuclease også et produkt, som har en stabilitet, der er mindre end ønskelig, på grund af proteasekontamination.
Der er nu udviklet en fremgangsmåde til isolering af et oprenset eukaryot væksthormon * eller en analog deraf, hvilken fremgangsmåde er lettere at udføre og er bedre kontrolleret 10 og mindre kostbar end hidtil kendte metoder. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse medfører isolering af det ønskede produkt i et højere udbytte og i en mere stabil form, end det hidtil har været muligt. Fremgangsmåden kræver kun 2,5-5% af den lysozymmængde, som anvendes i den hidtil kendte metode, hvorved oprensningen lettes, og isoleringsomkostningerne reduceres. Endvidere kræver metoden ikke nogen anvendelse 15 af deoxyribonuclease. Ud over yderligere at reducere isoleringsomkostningerne mere end fordobles udbyttet af produkt ved eliminering af behovet for deoxyribonuclease, og produktet foreligger i signifikant mere stabil form. Endvidere frembyder fremgangsmåden I ifølge opfindelsen en mere hensigtsmæssig og tidsbesparende proces til isolering af oprensede væksthormoner eller analoge deraf, idet det krævede antal vaskninger 20 reduceres, og fremgangsmaden kun tager 10-20% af den tid, som den hidtil kendte metode tager. Under anvendelse af ultrafiltrering opnås der ved den foreliggende fremgangsmåde både en signifikant nedsættelse af omkostninger og en forbedret produktrenhed.
25 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af et oprenset animalsk eller humant væksthormon eller en polypeptidanaiog deraf fra en bakteriecelle, i hvilken det animalske væksthormon eller analogen deraf er blevet dannet ved hjælp af ekspression af en DNA-sekvens, som indkoder hormonet eller analogen. Fremgangsmåden omfatter følgende trin: 30 a. bakteriecellens cellevæg eller fragmenter deraf sprænges til dannelse af et lysat, b. et bundfald, der indeholder partikelformigt og uopløseligt materiale, skilles fra lysatet, 35 c. der fremstilles en suspension af det fraskilte bundfald i en hensigtsmæssig pufferopløsning, d. suspensionen bringes i kontakt med op til 100 μg lysozym/ml opløsning i et passende tidsrum i fravær af DNAse og suspensionen behandles for at tilvejebringe kontakt mellem 40 væsken og de faste stoffer, e. det delvis eller fuldstændigt udfældede materiale skilles fra den suspension, i hvilken væsken og de faste stoffer er bragt i kontakt med hinanden, 3 DK 174889 B1 f. det fraskilte bundfald solubiliseres i en tilstrækkelig mængde vand, og pH-værdien indstilles til mellem 9.0 og 12.0 til dannelse af en opløsning, g. det solubiliserede hormon eller analogen deraf skilles fra de øvrige cellebestanddele ved 5 ultrafiltrering under anvendelse af en membran med en molekylevægtgranse på ca. 100 kilodalton under hensigtsmæssige betingelser til dannelse af et ultrafiltrat, som indeholder hormonet eller analogen deraf og et retentat, og Ψ h. det solubiliserede hormon eller analogen deraf behandles for yderligere at oprense og 10 koncentrere hormonet eller analogen deraf og derved isolere oprenset hormon eller en analog deraf.
I trin d) kan der anvendes lysozym til behandling af suspensionen af det bundfald, der skilles fra lysatet før kontakt mellem væske og faste stoffer og efterfølgende fraskillelse af 15 bundfaldet. De sidste to trin samt ultrafiltreringen kan gentages. I trin h) kan der anvendes ionbytningschromatografi for yderligere at oprense og koncentrere hormonet eller analogen. Endvidere kan de fleste procestrin udføres i en kontinuerlig strøm og kan automatiseres.
20 Hensigtsmæssige hormondannende bakterieceller til anvendelse i den foreliggende opfindelse omfatter Escherichia coli stamme ATCC nr. 39806, 39785, 39386, 39384, 39804 og 39792. Væksthormoner, som kan isoleres og oprenses under anvendelse af den foreliggende opfindelse, omfatter bovint, porcint, hønse- og humant væksthormon og analoge deraf.
25
Der er udviklet en ny fremgangsmåde til isolering af et oprenset animalsk eller humant væksthormon eller en analog deraf fra en bakteriecelle, i hvilken væksthormonet eller analogen er blevet dannet ved ekspression af en DNA-sekvens, som indkoder hormonet eller analogen.
30
Genetisk modificerede bakterieceller ti! anvendelse I denne fremgangsmåde er kendte. Fx er en stamme af Escherichia coli, som er genetisk modificeret til dannelse af en analog af bovint væksthormon (bGH), blevet deponeret i American Type Culture Collection (ATCC,
Rockville, Maryland) under deponeringsnummeret ATCC nr. 39806. 1 bGH-analogen er 35 aminosyresekvensen Met-Asp-GIn blevet sat til N-terminalen af phenyla la ninformen af naturligt bGH. En anden genetisk modificeret E. co//-cellelinje, der er deponeret i ATCC under deponeringsnummeret ATCC nr. 39785, danner en bGH-analog, til hvilken der ved den N-terminale ende af phenylalaninformen af naturligt bGH er sat en methioninrest.
Endnu en stamme af E. coli, som er deponeret i ATCC under deponeringsnummeret ATCC 40 nr. 39386, danner en analog til humant væksthormon (hGH), der har det naturlige hGH's aminosyresekvens begyndende med Met14, og som mangler aminosyrerne 1-13, medens E. co//-cellelinjen med deponeringsnummeret ATCC nr. 39384 danner en hGH-analog med naturligt hGH's sekvens, foran hvilken der ved den N-terminale ende er anbragt methionin. Tilsvarende danner E. co//-cellelinjerne med deponeringsnummeret ATCC nr. 39804 og 1 DK 174889 B1 4 39792 en analog til henholdsvis porcint væksthormon (pGH) og hønsevæksthormon (cGH), hvortil der ved den N-terminale ende af phenylalaninformen af de respektive naturlige hormoner er sat en methioninrest. Hver af de ovenstående hormonanaioge kan fremstilles ved dyrkning og induktion af de hensigtsmæssige celler under hensigtsmæssige 5 betingelser og kan isoleres i oprenset form ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.
Denne fremgangsmåde er lettere at udføre, bedre kontrolleret og mindre kostbar end de * hidtil kendte metoder og medfører isolering af det ønskede produkt i et højere udbytte og i 10 mere stabil form. Sådanne produkter kan ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen isoleres i udbytter på over 25 eller endog 30 vægtprocent baseret på vægten af hormonet eller analogen, som findes i bakterien ved fermenteringens afslutning. Der anvendes lysozym i mindre mængder, end det kræves i de hidtil kendte metoder. Desuden kræver metoden ikke anvendelse af deoxyribonuclease, den kan udføres i en kontinuerlig strøm og kan 15 hensigtsmæssigt automatiseres.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen suspenderes efter dyrkning, induktion og høst af de hensigtsmæssige bakterieceller de fradekanterede bakterieceller, fragmenter deraf eller cellekagen i en hensigtsmæssigt pufret opløsning ved neutral pH, fx en pH på ca. 7,4. Et 20 hensigtsmæssigt suspensionsmedium til dette formål er en vandig opløsning af 50 mM Tris (pH 7,4): 50 mM NaCI; 50 mM Tris (pH 7,4): 50 mM EDTA; 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,4): 50 mM NaCI eller 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,4): 50 mM EDTA.
Alternativt kan cellesuspensionen i fermenteringsblandingen anvendes direkte efter indstilling af dens pH-værdi til en neutral pH.
25
Derefter sprænges cellevæggen af de suspenderede bakteriecel ler eller fragmenter deraf til dannelse af et lysat. I en foretrukken udførelsesform sprænges cellerne mekanisk ved temperaturer på under ca. 35°C, fx mellem ca. -10°C og ca. +8°C. En kuglemølle eller homogenisator, fx et Dynomill KD-5-apparatur (Willy A. Bachofen, Basel) er et 30 hensigtsmæssigt, kommercielt sprængningsapparatur til dette formål. Sprængningen udføres fortrinsvis ved kontinuerligt at lade suspensionen passere gennem sprængningsapparaturet med en hensigtsmæssig strømningshastighed, fx ca. 80 liter/time.
35 Derefter skilles et bundfald, der indeholder partikelformigt og uopløseligt materiale, herunder hormonet eller analogen og andre vanduopløselige proteiner samt cellemembran-og cellevægsfragmenter og aggregater, fra lysatet, der også indeholder vandopløselige proteiner, DNA og RNA eller fragmenter deraf. For at foretage denne fraskillelse fortyndes lysatet fortrinsvis med en hensigtsmæssig mængde, fx et omtrent lige så stort volumen, 40 deioniseret vand og centrifugeres derefter i en centrifuge med skålformet rotor uden perforeret væg og kontinuerlig gennemstrømning (fx Cepa 101) ved en strømningshastighed, som er tilstrækkelig til at forårsage den ønskede fraskillelse, fx ca. 60-80 l/time.
Derefter fremstilles en suspension af det fraskilte bundfald i en hensigtsmæssig mængde af en hensigtsmæssig pufferopløsning ved neutral pH, fx en pH på ca. 7,4. Fortrinsvis 5 DK 174889 B1 indeholder opløsningen 50 mM Tris eller natriumphosphat (pH 7,4) og 50 mM EDTA. En hensigtsmæssig mængde pufferopløsning til suspensionen er ca. 0,5-2,5 liter pr. kg af udgangsmængden af bakterieceller, fortrinsvis ca. 1,2 I pr. kg celler.
5 Uønsket cellulært materiale såsom cellevægfragmenter kan derefter nedbrydes ved inkubation af suspensionen med et hensigtsmæssigt enzym, der er i stand til at nedbryde polysaccharider i suspensionen, fx lysozym (Sigma L-6876, St. Louis, Missouri, USA) under > hensigtsmæssige betingelser og i et hensigtsmæssigt tidsrum. Den for tiden foretrukne koncentration af lysozym er ca. 50-100 ug pr. ml opløsning, hvilket er en betydelig 10 nedsættelse i forhold til de 2 mg/ml, der anvendes i de hidtil kendte metoder. Et hensigtsmæssigt tidsrum til lysozyminkubation er mellem ca. 1 og 20 timer. I inkubationsperioden holdes temperaturen fortrinsvis pi ca. 37°C. En hensigtsmæssig mængde af et passende overfladeaktivt middel, fx Triton(R) X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania), kan derefter sættes til suspensionen til en slutkoncentration 15 på ca. 1% (v/v) for at solubilisere materiale såsom cellulære lipider. Suspensionen inkuberes derefter yderligere i et passende tidsrum, fx ca. 30 minutter.
Væsken og de faste stoffer, der er indeholdt i suspensionen, behandles derefter således, at der foretages en grundig kontakt mellem væske og faste stoffer, fx ved sonikering under 20 hensigtsmæssige betingelser såsom ved hjælp af en 370W sonicator med kontinuerlig gennemstrømning (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, New York), der er sat til 65% af den maksimale styrke og med en strømningshastighed på ca. 18-25 l/time. Udfældet materiale skilles derefter fra den suspension, hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, fortrinsvis ved centrifugering af suspensionen, hvor væske og faste stoffer er 25 blevet bragt i kontakt, i en centrifuge med kontinuerlig gennemstrømning og skålformet rotor uden perforeret væg (fx Cepa 101) med en hensigtsmæssig strømningshastighed, fx ca. 30 l/time. I en anden udførelsesform kan fraskillelsen i dette og følgende trin udføres ved mikrofiltrering med en hensigtsmæssig membran, fx en Millipore Durapore 0,45 μητι membran, i stedet for centrifugering. Efter fraskillelsen kan det udfældede materiale, som 30 er skilt fra suspensionen, hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, fx ved sonikering, vaskes, hensigtsmæssigt med 50 mM Tris eller phosphat (pH 7,4) og 100 mM NaCI, og resuspenderes i en hensigtsmæssig mængde af et passende medium, fx en pufret eller ikke-pufret vandig opløsning, I den således fremstillede suspension bringes væske og faste stoffer derefter i kontakt såsom ved sonikering under hensigtsmæssige betingelser, og det 35 resulterende udfældede materiale skilles delvis eller fuldstændigt fra suspensionen, hvor væsken og de faste stoffer er bragt i kontakt, fx ved sonikering, fx ved centrifugering eller ultrafiltrering som beskrevet ovenfor. Resuspensionen, kontakt mellem væske og faste stoffer (fx sonikering) og fraskillelse udføres fortrinsvis mindst yderligere 1 gang. I en særlig foretrukken udførelsesform udføres disse trin fire gange som følger: det 40 resulterende bundfald resuspenderes først i 20 mM Tris (pH 7,4) eller 50 mM
natriumphosphatpuffer (pH 7,4), og i suspensionen bringes væske og faste stoffer i kontakt (fx ved sonikering) som beskrevet ovenfor. Suspensionen centrifugeres derefter som beskrevet ovenfor, og det isolerede bundfald gensuspenderes i 50 mM Tris (pH 7,4) og 100 mM NaCI eller 20 mM natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 10 mM EDTA og 100 mM
6 DK 174889 B1
NaCI. I denne suspension bringes væske og faste stoffer i kontakt sisom ved sonikering, suspensionen centrifugeres som beskrevet ovenfor, og det isolerede bundfald gensuspenderes i deioniseret vand. I den vandige suspension bringes væske og faste ' stoffer i kontakt, fx ved sonikering, suspensionen centrifugeres som beskrevet ovenfor, og 5 det isolerede bundfald suspenderes påny i deioniseret vand. I denne anden vandige suspension bringes væske og faste stoffer i kontakt, fx ved sonikering, og suspensionen centrifugeres som ovenfor beskrevet, hvorved fås et bundfald, som har et forhøjet indhold af det ønskede hormon eller den ønskede analog. ' 10 Herefter solubiliseres det fraskilte bundfald, fx ved resuspension af bundfaldet ved en hensigtsmæssig temperatur, fx 4-40°C, i en tilstrækkelig mængde vand, fortrinsvis ca. 25 volumen, og pH-værdien indstilles til en hensigtsmæssig basisk pH, fx ca. 9,0-12,0, til dannelse af en opløsning, som indeholder hormonet eller analogen. Agitering ved høj forskydning (fx ved hjælp af en Polytron-blender [Kinematica]) kan anvendes til at lette 15 opløsningen. pH-Værdien i udgangssuspensionen kan hensigtsmæssigt indstilles ved tilsætning af NaOH til suspensionen, fx 1-10N NaOH, indtil pH-værdien er ca. 9,0-12,0, fortrinsvis ca. 11,8-12,0. Der tilsættes fortrinsvis NaOH til opløsningen samtidig med kraftig omrøring. Opløsningen inkuberes derefter og omrøres i ca. 1 time, hvorefter pH-værdien kan reduceres til ca. 10,5.
20
En passende mængde af en hensigtsmæssigt koncentreret vandig opløsning af natriumborat, fx ca. 1M (ved en hensigtsmæssig pH, fx 11,5-12,0), sættes derefter til opløsningen tii opnåelse af en slutkoncentration af borat på fortrinsvis ca. 10 mM.
Proteinopløsningen titreres derefter til en pH på 10,5 enten ved fortynding deraf med 2-10 25 volumen 10 mM natriumboratpuffer (pH 10,2) eller ved titrering med koncentreret HCI eller IN HCI. Opløsningen inkuberes derefter yderligere i 1-12 timer under omrøring. Den således vundne opløsning kan om ønsket klares ved sonikering af opløsningen under hensigtsmæssige betingelser, fx ved hjælp af en Heat System Sonicator Model 370 med kontinuerlig gennemstrømning med en strømningshastighed på ca. 10 l/time, 30 centrifugering af den sonikerede opløsning under hensigtsmæssige betingelser, fx ved hjælp af en centrifuge med kontinuerlig gennemstrømning og skålformet rotor uden perforeret væg (fx Cepa 101) ved en strømningshastighed på ca. 30 l/time, fraskillelse af supernatantvæsken og vakuumfiltrering af væsken, fx gennem et Whatman-papir nr. 2 eller på et Buchner-vakuumfilter til dannelse af en klaret opløsning, som indeholder det 35 solubiliserede hormon eller den solubiliserede analog. Alternativt kan der alene anvendes centrifugering.
Det solubiliserede hormon eller analogen skilles derefter fra de øvrige cellulære bestanddele såsom proteiner, lipider og andre partikler, og aggregater dissocieres ved 40 ultrafiltrering under hensigtsmæssige betingelser. Det vundne retentat underkastes fortrinsvis på ny ultrafiltrering mindst én gang. Under denne procedure bør retentatets volumen blive reduceret med ca. 95%, fx fra ca. 10 liter til ca. 0,5 liter, og filtratet indsamles. En Pellicon® Cassette eller PUF-100 spiral (Millipore Corp., Bedford,
Massachusetts) med en molekylvægtgrænse på 100 kilodalton egner sig til anvendelse ved 7 DK 174889 B1 ultrafiltreringsproceduren. Retentatet fortyndes fortrinsvis yderligere med en hensigtsmæssig puffer ved en passende basisk pH, fx ca. 9-12, og underkastes yderligere ultrafiltrering. I en for tiden foretrukken udførelsesform anvendes 10 mM boratpuffer (pH 10,5-12,0). Genfortynding og genkoncentrering ved ultrafiltrering gentages fortrinsvis 5 mindst én gang. Alternativt kan ultrafiltreringen udføres én eller flere gange ved et i det væsentlige konstant retentatvolumen. I en særlig foretrukken udførelsesform gentages ultrafiltreringen, indtil retentatets absorbans ved 280 nm er mindre end ca. 0,1 optiske • densitetsenheder. Hormonet kan hensigtsmæssigt udvindes fra ultrafiltratet i et renhedsniveau og med en biologisk aktivitet, som er bedre end den, der hidtil er opnået 10 ved gelchromatografi.
Det oprensede hormon eller analog, der fås i ultrafiltratet, behandles derefter såsom ved ionbytningschromatografi, fx med en aminholdig ionbytterharpiks såsom diethylaminoethyl for yderligere at oprense og koncentrere hormonet og analogen og isolere det oprensede 15 hormon eller den oprensede analog. Koncentration af ultrafiltratet under anvendelse af en membran med en molekylvægtgrænse på 10 kilodalton til fjernelse af vand er fakultativ før ionbytningschromatografi. I ionbytningschromatografitrinet skilles resterende DNA, eventuelt tilstedeværende lysozym og multimerer fra hormonet eller analogen. I dette trin indstilles ultrafiltratets pH først til en hensigtsmæssig pH, fx pH 9,0, ved tiltrering med 20 saltsyre, og ultrafiltratet anbringes på en hensigtsmæssig ionbytningssøjle, fx en DEAE-Sepharose(R) CL-6B (hurtig gennemstrømning) KS-370 sektionsdelt søjle (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Systemet vaskes derefter med en egnet buffer, fx en 10 mM boratpuffer, hvorefter prøven elueres ved en hensigtsmæssig hastighed med en egnet eluent, fx 10 mM boratpuffer (pH 9,0), der indeholder 100 mM NaCI. De fraktioner, 25 som indeholder hormonet eller analogen, kan koncentreres ved ultrafiltrering under anvendelse af en Pellicon® Cassette eller PUF-100 spiral med en molekylvægtgrænse på 10 kilodalton og kan derefter dialyseres mod en opløsning, som indeholder en hensigtsmæssig koncentration af et egnet salt, fx 3 mM ammoniumhydroxid eller ammoniumhydrogencarbonat, idet der igen anvendes en Pellicon® Cassette med en 30 molekylvægtgrænse på 10 kilodalton. Det dialyserede materiale kan derefter tørres ved lyofilisering eller spraytørring under hensigtsmæssige betingelser. Spraytørring er den mest økonomiske proces og kan hensigtsmæssigt udføres i et lille sprøjtetørringsapparat (Niro Atomizer) under anvendelse af en indgangstemperatur på ca. 200°C, en udgangstemperatur på ca. 50°C og en strømningshastighed på ca. 2,5 l/time. Animalske 35 væksthormoner eller analoge deraf, som oparbejdes på denne måde, kan således vindes i form af et fint hvidt pulver.
Oprensede animalske væksthormoner eller analoge deraf kan isoleres ved denne fremgangsmåde i udbytter, som er større end eller lig med ca. 30% baseret på vægten af 40 tilstedeværende hormon eller analog i bakterierne ved fermenteringens afslutning. Det således vundne hormon eller analog optræder som én plet, når det fremkaldes på en 15%'s polyacrylamid-SDS-gel sammenlignet med lavmolekylvægtstandarder (Pharmacia).
8 DK 174889 B1
De peptider, som fis efter ultrafiltrering og ionbytningschromatografi ifølge opfindelsen, er renere og mere stabile, end nar der anvendes gelchromatografi i stedet for ultrafiltrering, eller når koncentrationen af peptiderne blev udført ved ultrafiltrering med en molekylvægtgrænse pi 10 kilodalton i stedet for ionbytningschromatografi.
5
Med hensyn til de isolerede hormoners og analoges biologiske aktivitet viser radioimmunoassayresultater, at antistoffer mod det naturlige hormon har omtrent lige så stor affinitet over for det hormon eller den analog, som dannes af den egnede mikroorganisme og isoleres ifølge opfindelsen. Tilsvarende viser 10 radioreceptorbindingsassays, at passende membraner har en bindingsaktivitet over for hormonerne eller analogene, som er oprenset ifølge den foreliggende opfindelse, hvilken bindingsaktivitet er ækvivalent med bindingsaktiviteten over for autentiske prøver af de naturlige hormoner. Endvidere blev der ikke detekteret nogen antistoffer over for hormonerne eller analogene efter enten primære eller forstærkende injektioner af 15 peptiderne i hensigtsmæssige dyr. Endvidere viste den bovine væksthormonanalog sig at forøge mælkeydelsen, når den blev administreret til maelkeydende køer.
Opfindelsen kan endvidere belyses ved nedenstående punkter: 20 1. Fremgangsmåde til isolering af et oprenset animalsk eller humant væksthormon eller en analog deraf fra en bakteriecelle, i hvilken det animalske eller humane væksthormon eller analogen deraf er blevet fremstillet ved hjælp af ekspression af en DNA-sekvens, der indkoder hormonet eller analogen, hvor a. bakteriecellens cellevæg eller fragmenter deraf sprænges til dannelse af et lysat, 25 b. et bundfald, som indeholder partikelformigt og uopløseligt materiale, skilles fra tysatet, c. en suspension af det fraskilte bundfald fremstilles i en hensigtsmæssig pufferopløsning, 30 d. suspensionen bringes i kontakt med op til 100 ug lysozym/ml opløsning i et passende tidsrum i fravær af DNAse og suspensionen behandles, således at væske og faste stoffer bringes i kontakt, e. delvis eller fuldstændigt udfældet materiale skilles fra suspensionen, hvor væske og 35 faste stoffer er bragt i kontakt, f. det fraskilte bundfald solubiliseres i en tilstrækkelig mængde vandig opløsning, og pH indstilles til mellem 9.0 og 12.0 til dannelse af en opløsning, 40 g. det solubiliserede hormon eller analogen deraf skilles fra andre cellebestanddele ved ultrafiltrering under anvendelse af en membran med en molekylærvægtgrænse på ca. 100 kilodalton under hensigtsmæssige betingelser til dannelse af et ultrafiltrat, som indeholder hormonet eller analogen og et retentat, og a i 9 DK 174889 B1 h. det solubiliserede hormon eller analogen deraf behandles for yderligere at oprense og koncentrere hormonet eller analogen og derved isolere oprenset hormon eller analog.
2. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor hormonet eller analogen er et animalsk 5 væksthormon eller en analog deraf.
3. Fremgangsmåde ifølge punkt 2, hvor hormonet eller analogen er bovint væksthormon « eller en analog deraf.
10 4. Fremgangsmåde ifølge punkt 3, hvor analogen omfatter aminosyresekvensen Met-Asp-Gln sat til den N-terminale ende af phenylalaninformen af naturligt bovint væksthormon, og bakteriecellen er Escherichia coli stamme ATCC nr. 39806.
5. Fremgangsmåde ifølge punkt 3, hvor analogen omfatter en methioninrest sat til den N-15 terminale ende af phenylalaninformen af naturligt bovint væksthormon, og bakteriecellen er Escherichia coli stamme ATCC nr. 39785.
6. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor hormonet eller analogen er humant væksthormon eller en analog deraf.
20 7. Fremgangsmåde ifølge punkt 6, hvor analogen omfatter naturligt humant væksthormons aminosyresekvens begyndende med Met1 2 3, og bakteriecellen er Escherichia coli stamme ATCC nr. 39386.
25 8. Fremgangsmåde ifølge punkt 6, hvor analogen omfatter naturligt humant væksthormons aminosyresekvens, hvortil der ved den N-terminale ende er sat methionin, og bakteriecellen er Escherichia co/;stamme ATCC nr. 39384.
9. Fremgangsmåde ifølge punkt 2, hvor hormonet er porcint væksthormon eller en analog 30 deraf.
10. Fremgangsmåde ifølge punkt 9, hvor analogen omfatter en methioninrest sat til den N-terminale ende af phenylalaninformen af naturligt porcint væksthormon, og bakteriecellen er Escherichia co/istamme ATCC nr. 39804.
35 11. Fremgangsmåde ifølge punkt 2, hvor hormonet eller analogen er hønse-væksthormon eller en analog deraf.
Fremgangsmåde ifølge punkt li, hvor analogen omfatter en methioninrest sat til den 2 40 N-terminale ende af phenylalaninformen af naturligt hønse-væksthormon, og 3 bakteriecellen er Escherichia co//stamme ATCC nr. 39792.
10 DK 174889 B1 13. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor bakteriecellen eller fragmenter deraf før trin a) holdes i suspension i fermenteringsvæsken eller er suspenderet i en hensigtsmæssigt pufret opløsning ved neutral pH.
5 14. Fremgangsmåde ifølge punkt 13, hvor den neutrale pH er ca. 7,4.
15. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor cellerne sprænges mekanisk i trin a).
ί 16. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor lysatet fortyndes med en hensigtsmæssig 10 mængde deioniseret vand, før det partikelformige materiale fraskilles.
17. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor separationen i trin b) eller trin e) omfatter centrifugering.
15 18. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor separationen i trin b) eller trin e) omfatter ultrafiltrering.
19. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor behandlingen i trin d) endvidere omfatter, at suspensionen i et passende tidsrum bringes i kontakt med et egnet enzym, som er i stand 20 til at nedbryde de polysaccharider, som findes i suspensionen.
20. Fremgangsmåde ifølge punkt 19, hvor det egnede enzym er lysozym.
21. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor behandlingen i trin d) til at tilvejebringe kontakt 25 mellem væske og faste stoffer omfatter sonikering.
22. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor der til suspensionen yderligere sættes en hensigtsmæssig mængde af et egnet overfladeaktivt middel, og suspensionen yderligere inkuberes i et passende tidsrum, før der foretages kontakt mellem væske og faste stoffer i 30 suspensionen i trin d).
23. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor det udfældede materiale, der delvis eller fuldstændigt skilles fra suspensionen i trin e), hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, resuspenderes i en hensigtsmæssig mængde af et egnet medium, væske og faste 35 stoffer i den således fremstillede suspension bringes i kontakt under hensigtsmæssige betingelser, og det resulterende udfældede materiale skilles fra suspensionen, hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, før solubilisering i trin f).
24. Fremgangsmåde ifølge punkt 23, hvor det egnede medium er en pufret eller Ikke-40 pufret vandig opløsning.
25. Fremgangsmåde ifølge punkt 23, hvor det resulterende bundfald resuspenderes, væske og faste stoffer bringes i kontakt, og bundfaldet separeres i det mindste yderligere én gang.
11 DK 174889 B1 26. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor den hensigtsmæssige basiske pH til solubilisering i trin f) er en pH på ca. 9,0-12,0.
5 27. Fremgangsmåde ifølge punkt 26, hvor pH efter solubilisering af bundfaldet ved en pH på ca. 9,0-12,0 sænkes til ca. 10,5.
i ' 28. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor en passende mængde af en hensigtsmæssig koncentreret vandig opløsning af natriumborat sættes til den i trin f) vundne opløsning.
10 29. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, der yderligere omfatter klaring af den i trin f) vundne opløsning ved at bringe væske og faste stoffer i opløsningen i kontakt under hensigtsmæssige betingelser, centrifugere opløsningen, hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, under hensigtsmæssige betingelser, separere supernatantvæsken og 15 filtrere væsken til dannelse af en klaret opløsning, som indeholder hormonet eller analogen.
30. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor separationen ved ultrafiltrering i trin g) udføres med en hensigtsmæssig membran med en molekylvægtgrænse på ca. 100 kilodalton.
20 31. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor det i trin g) vundne retentat genunderkastes ultrafiltrering mindst én gang før eller efter behandlingen i trin h).
32. Fremgangsmåde ifølge punkt 31, hvor retentatet fortyndes med en hensigtsmæssig 25 puffer ved en passende basisk pH, før det igen underkastes ultrafiltrering.
33. Fremgangsmåde ifølge punkt 32, hvor den passende basiske pH er ca. 9,0-12,0.
34. Fremgangsmåde ifølge punkt 32, hvor fortyndingen og ultrafiltreringen gentages 30 mindst én gang.
35. Fremgangsmåde ifølge punkt 31, hvor retentatet holdes ved et i det væsentlige konstant volumen under ultrafiltreringen.
35 36. Fremgangsmåde ifølge punkt 35, hvor ultrafiltreringen ved det i det væsentlige konstante retentatvolumen gentages mindst én gang.
37. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor behandlingen af det solubiliserede hormon i trin h) omfatter ionbytningschromatografi.
40 38. Fremgangsmåde ifølge punkt 37, hvor ionbytningschromatografien udføres ved hjælp af en aminholdig ionbytterharpiks.
12 DK 174889 B1 39. Fremgangsmåde ifølge punkt 38, hvor den aminholdige ionbytterharpiks er diethylaminoethyl-dextran eller -sepharose.
40. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor det oprensede hormon eller analogen deraf 5 koncentreres ved ultrafiltrering.
41. Fremgangsmåde ifølge punkt 1, hvor det oprensede hormon eller analogen yderligere oprenses ved dialyse efterfulgt af tørring.
10 42. Fremgangsmåde ifølge punkt 41, hvor dialysen er mod en opløsning, som indeholder en hensigtsmæssig koncentration af et egnet salt.
43. Fremgangsmåde ifølge punkt 42, hvor det egnede salt er ammoniumhydroxid eller ammoniumhydrogencarbonat.
15 44. Fremgangsmåde ifølge punkt 41, hvor tørringen udføres ved lyofilisering.
45. Fremgangsmåde ifølge punkt 41, hvor tørringen udføres ved spraytørring under hensigtsmæssige betingelser.
20
Opfindelsen belyses nærmere i nedenstående eksempler, der ikke på nogen måde skal opfattes som begrænsende for opfindelsens omfang. Eksemplerne omfatter ikke detaljerede beskrivelser af sædvanlige metoder, som er velkendte for fagfolk.
25 EKSEMPEL 1
Dyrkning af E. coli og fremstilling af en bGH-analog 30 I. Stamkulturer
Stamkulturer af E. cofi stamme ATCC nr. 39806, der ved dyrkning og induktion danner bGH-analogen Met-Asp-GIn-bGH, blev dyrket på caseinmedium (se afsnittet podestof) og derefter fortyndet to gange med frysemedium og lagret ved -801C. Frysemediet indeholder 35 pr. 500 ml: K2HP04 6,3 g KH2P04 1,8 g
Na-citrat 0,45 g 40 MgS0j.7H2O 0,09 g (NH4)2S04 0,9 g glycerol 44,0 g 13 DK 174889 B1 II. Podestof
Podestoffet blev opformeret i 20 g/l caseinhydrolysat, 10 g/l gærekstrakt og 2 g/l NaCI.
Sterilt medium i rystekolbe blev inokuleret med stamkultur og inkuberet i 15 timer på et 5 rysteapparat ved 30°C ved ca. 200 omdrejninger pr. minut. Efter behov blev efterfølgende trin i podestof-opformeringen udført i omrørte fermentorer. Sterilt medium blev inokuleret med 2-10% podestofkultur og inkuberet i 15 timer ved 30°C, pH 7±0,5, under agitation og ' luftning til opretholdelse af et niveau af opløst oxygen på ca. 20%'s luftmætning.
. 10 III. Produktion
Produktionsmediet indeholder:
Caseinhydrolysat 20 g/l 15 Gærekstrakt 10 g/l K2HPO« 2,5 g/l
MgS0«.7H20 1 g/l
NaCi 5 g/l
Biotin 0,1 mg/l 20 Thiamin 1 mg/l
Sporstofopløsning 3 ml/l
Mediet indeholder også 100 mg/l ampicillin. Ampicillinet er fakultativt for produktion, men findes altid i det medium, der anvendes til dyrkning af podestoffet.
25
Biotin, thiamin og ampicillin i koncentrerede opløsninger blev filtersteriliseret separat og sattes til det sterile produktionsmedium før inokulering. Indledningsvis blev der tilsat steril glucoseopløsning op til 10 g/l. I induktionstrinet tilsattes yderligere 10 g/l glucose.
30 Sporstofopløsningen indeholder:
FeClj 16 g/l
ZnCI2.4H20 2 g/l
CoCI2.6H20 2 g/l 35 Na2M0O„.2H2O 2 g/l
CaC!2.2H20 1 g/l
CuCI2 1 g/l
HjBOj 0,5 g/l
Koncentreret 40 HCI 100 ml/l
Mediet inokuleres med 0,5-10% podekultur og inkuberes ved 30°C. Agiterings/luftningshastigheder sættes, så der opretholdes et niveau af opløst oxygen på over 20%'s luftmætning. pH-Værdien holdes ved 7,0-7,5±0,2 ved hjælp af NH3. Når 5 14 DK 174889 B1 cellekoncentrationen når ca. 3,5 g/l (OD6m = 10), påbegyndes induktionen ved at hæve temperaturen til 42°C. Temperaturen holdtes derefter ved 42"C i 1-5 timer, hvorefter cellerne kan høstes fra cellesuspensionen.
EKSEMPEL 2 Cellehøst 10 500 I cellesuspension (indeholdende 6,15 DCW/I og 490 mg bGH/Ι), der vandtes som beskrevet i eksempel 1, blev afkølet til stuetemperatur og overført til en lagertank. Cellesuspensionen blev centrifugeret ved 14.000 omdrejninger pr. minut (16.000 x g) i en CEPA 101-centrifuge med rørformet rotor ved en strømningshastighed på 250 l/time. CEPA 101-centrifugen havde en rørlængde på 73,7 cm, en radius til udløbsspærringen pi 3,25 15 cm, og en radius til rotorvæggen på 7,35 cm. Den var forsynet med accelerationsfinner og afkølet på yderkappen.
Den klare supernatant havde en massefylde på 1,0 g/ml, indeholdt ikke noget detekterbart bGH og blev kasseret. Kagen, der vejede 11,4 kg (75% væde), indeholder det 20 aggregerede bGH og blev gemt. Kagen havde typisk en tykkelse på ca. 2 cm og en massefylde på 1,1 g/ml. En alternativ fremgangsmåde er at lade cellerne bundfælde sig natten over og bortlede den klare supernatant.
Analysemetoder: Kvantiteret gelscanning af cellesuspension, supernatant og kage.
25 Trinudbytte1: 100%
Totaludbytte: 100%
Udbyttevolumen: 2,3% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 21,5 g bGH/kg kage
Berigelsesfaktor: 44 (bGH koncentration i udbytte/bGH koncentration i 30 udgangsmaterialet).
1 Udbytter blev bestemt ved måling af OD-enheder, som defineres som opløsningens absorbans ved 280 nm (1 cm's celle) gange opløsningens volumen i ml. Hvis OD-værdien fx er 9,1, og opløsningens volumen er 32.600 ml, er værdien af OD-enhederne 297.000 35 OD. Hvis absorbanslæsningen foretages ved pH 9, kan OD-værdien omdannes til g/bGH ved at multiplicere med omdannelsesfaktoren 0,00157, hvorved fås 14,3 g bGH/l.
EKSEMPEL 3 40
Cellesprængning
De våde celler (11,4 kg) fra cellehøstningstrinet (eksempel 2) blev suspenderet i 4 liter 50 mM Tris og 50 mM NaCI-puffer ved pH 7,4 for hvert kg våde celler (i alt 45,6 I). En 15 DK 174889 B1
Polytron-blander med høj forskydning (Kinematica) er med til at dispergere kagen. De suspenderede celler blev ført til et Dynomill KD-5 kuglemølle-sprængningsapparat (Willy A. Bachofen, Basel) ved en strømningshastighed på 80 l/time. Kuglemøllen blev holdt ved -10eC-+8eC ved afkøling. De sprængte celler blev derefter fortyndet med et lige så stort 5 volumen deioniseret vand før centrifugering i CEPA 101-centrifugen med rørformet rotor. Strømningshastigheden til centrifugen var 30-60 l/time. Alle centrifugeringsbetingelser undtagen strømningshastigheden var identiske med betingelserne under cetlehøst.
' Supernatanten, der indeholdt ca. 10% af det tilførte bGH, blev kasseret. Kagen, der vejede 5,28 kg (75% væde), indeholder det aggregerede bGH og blev gemt.
10
Sprængningspuffer (50 mM Tris, 50 mM NaCI, pH 7,4): 6,06 g Tris og 2,97 g NaCI i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 7,4 med koncentreret saltsyre, fortyndet til 1 I med deioniseret vand og om nødvendigt genindstillet 15 til pH 7,4.
Analysemetoder: Kvantiteret gelscanning af celler, supernatant og kage
Trinudbytte: 90%
Totaludbytte: 90% 20 Udbyttevolumen: 1,05% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 37,1 g bGH/kg kage
Berigelsesfaktor: 1,7 25 EKSEMPEL 4
Lysozymbehandling
Den våde kage (5,28 kg) fra sprængningstrinnet (eksempel 3) blev suspenderet i 1,2 I 50 30 mM tris, 50 mM EDTA-puffer, pH 7,4, for hvert kg af de oprindelige høstede våde celler (i alt 13,7 I). En Polytron-blander med høj forskydning er med til at dispergere kagen.
Lysozym (Sigma kvalitet II) tilsattes (0,05 g/l opslæmning), og opslæmningen blev blandet ved 37eC i 1 time. Der tilsattes Triton® X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania) (100 ml af en 10% v/v opløsning pufret til pH 7,4 pr. I, hvilket giver en 35 slutkoncentration på 1% Triton® X-100), og blandingen blev inkuberet i yderligere 30 minutter. Opslæmningen blev sonikeret i en Heat Systems 370 W sonicator, som var sat til 65%'s styrke, os som var forsynet med en gennemstrømningscelle.
Strømningshastigheden gennem sonicatoren var 18 l/time. Den sonikerede opslæmning blev centrifugeret på CEPA 101-centrifugen med 30 !/time. Alle centrifugeringsbetingelser 40 undtagen strømningshastigheden var identiske med betingelserne for cellehøst.
Supernatanten, der indeholdt ca. 3% af udgangsmængden af bGH, blev kasseret. Kagen, der vejede 3,07 kg (75% væde), indeholder det aggregerede bGH og blev gemt.
16 DK 174889 B1
Lysozympuffer (50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,4): 6,06 g Tris og 14,6 g EDTA i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 7,4 med koncentreret HCI eller 50%’s NaOH, fortyndet til 1 liter med deioniseret vand og om 5 nødvendigt genindstillet til pH 7,4.
Analysemetoder: Kvantiterede gelscanninger på supernatanter og kager
Trinudbytte: 97%
Totaludbytte: 87,3% 10 Udbyttevolumen; 0,61% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 61,9 g bGH/kg kage
Berigelsesfaktor: 1,7 15 EKSEMPEL 5 Første vask
Den våde kage (3,07 kg) fra lysozymtrinnet (eksempel 4) blev suspenderet i 0,6 I 20 mM 20 Tris-puffer, pH 7,4, for hvert kg af de oprindelige høstede våde celler (i alt 6,8 I). En
Polytron-blander med høj forskydning er med til at dispergere kagen. Opslæmningen blev sonikeret ved en strømningshastighed på 18 l/time i en Heat Systems 370 W sonicator ved 65%'s styrke. Den sonikerede opslæmning blev centrifugeret på CEPA 101-centrifugen med 30 l/time. Alle centrifugeringsbetingelserne undtagen strømningshastighed var som 25 beskrevet for cellehøst. Supernatanten blev kasseret. Kagen, der vejede 2,46 kg (75% væde), indeholder det aggregerede bGH og blev gemt.
Første vaskepuffer (20 mM Tris, pH 7,4): 30 2,42 g Tris i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 7,4 med koncentreret saltsyre, fortyndet til 1 liter med deioniseret vand og om nødvendigt genindstillet til pH 7,4.
Analysemetoder: Kvantiterede gelscanninger af supernatanter og kager
Trinudbytte: 100% 35 Totaludbytte: 87,3%
Udbyttevolumen: 0,49% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 77,3 g bGH/kg våd kage
Berigelsesfaktor: 1,2 * * 17 DK 174889 B1 EKSEMPEL 6
Saltvask 5
Den våde kage (2,46 kg) fra det første vasketrin (eksempel 5) blev suspenderet i 0,6 I 50 mM Tris-puffer, 100 mM NaCI-puffer, pH 7,4, for hvert kg oprindelige høstede våde celler ' (i alt 6,8 I). En Polytron-blander med høj forskydning er med til at dispergere kagen.
Opslæmningen blev sonikeret ved en strømningshastighed på 18 l/time gennem en Heat 10 Systems 370 W sonicator ved 65%’s styrke. Den sonikerede opslæmning blev derefter centrifugeret i CEPA 101-centrifugen med 30 l/time. Alle centrifugeringsbetingelser undtagen strømningshastigheden var som beskrevet for cellehøst. Supernatanten blev kasseret. Kagen, der vejede 2,15 kg (75% væde), indeholder det aggregerede bGH og blev gemt.
15
Saltvaskpuffer (50 mM Tris, 100 mM NaCI, pH 7,4): 6,06 g Tris og 5,85 g natriumchlorid i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 7,4 med koncentreret saltsyre, fortyndet til 1 liter med deioniseret vand og om nødvendigt 20 genindstillet til pH 7,4.
Analysemetoder: Kvantiterede gelscanninger af supernatanter og kager
Trinudbytte: 100%
Totaludbytte: 87,3% 25 Udbyttevolumen: 0,43% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 88,4 g bGH/kg kage
Berigelsesfaktor: 1,14.
30 EKSEMPEL 7 Første vandvask
Den våde kage (2,15 kg) fra saltvasketrinet (eksempel 6) blev suspenderet i 1,2 I 35 deioniseret pyrogenfrit vand for hvert kg oprindelige høstede våde celler (i alt 13,7 I). En Polytron-blander med høj forskydning er med til at dispergere kagen. Opslæmningen blev sonikeret ved en strømningshastighed på 18 l/time i en Heat Systems 370 W sonicator ved 65%’s styrke. Opslæmningens pH bør stige fra vandets udgangs-pH på ca. 6,2 til ca. 7,8-8,0. Den sonikerede opslæmning blev derefter centrifugeret i CEPA 101-centrifugen med 40 en strømningshastighed på 30 l/time. Alle centrifugeringsbetingelser med undtagelse af strømningshastigheden var som beskrevet for cellehøst. Supernatanten blev kasseret.
Kagen, der vejede 1,90 kg (75% væde), indeholder det aggregerede bGH og blev gemt.
DK 174889 B1 18
Analysemetoder: Kvantiterede gelscanninger af supernatanter og kager
Trinudbytte: 99%
Totaludbytte: 86,4%
Udbyttevolumen: 0,38% af cellesuspensionens udgangsvolumen 5 Bedømt ved assay: 99,0 g bGH/kg kage
Berigelsesfaktor: 1,12 EKSEMPEL 8 10
Anden vandvask
Den våde kage (1,90 kg) fra det første vandvasketrin (eksempel 7) blev suspenderet i 1,2 I deioniseret pyrogenfrit vand for hvert kg oprindelige høstede våde celler (i alt 13,7 I). En 15 Polytron-blander med høj forskydning er med til at dispergere kagen. Opslæmningens pH bør være ca. 8,4. Opslæmningen blev sonikeret ved en strømningshastighed på 18 l/time i en Heat Systems 370 W sonicator ved 65%'s styrke. Den sonikerede opslæmning blev derefter centrifugeret i CEPA 101-centrifugen med en strømningshastighed pi 30 l/time.
Alle centrifugeringsbetingelser med undtagelse af strømningshastigheden var som 20 beskrevet for cellehøst. Supernatanten blev kasseret. Kagen, der vejede 1,31 kg (75% væde), indeholder det aggregerede bGH og blev gemt.
Analysemetoder: Kvantiterede gelscanninger af supernatanter og kager
Trinudbytte: 99% 25 Totaludbytte: 85,6%
Udbyttevolumen: 0,26% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 160 g bGH/kg kage
Berigelsesfaktor: 1,62 30 EKSEMPEL 9 Opløsningstrin 35 Den våde kage (1,31 kg) fra den anden vandvask (eksempel 8) blev suspenderet i 25 I deioniseret pyrogenfrit vand for hvert kg vasket kage (i alt 32,6 liter). En Polytron-blander med høj forskydning er med til at dispergere kagen. pH-Værdien blev langsomt indstillet til 11,8 ved tilsætning af 10N NaOH. Det aggregerede bGH opløstes langsomt i løbet af 1 time. Efter 1 times inkubation sattes 1M natriumborat, pH 11,8, til opløsningen til en 40 slutkoncentration på 10 mM natriumborat. Opløsningen blev holdt i 30 minutter før sonikering i en Heat System 370 W sonicator ved 65%'s styrke. Tilførselshastigheden til sonicatoren var 18 l/time. Hvis opløsningen var meget uklar, blev den centrifugeret ved 30 l/time gennem CEPA 101-centrifugen; ellers blev opløsningen filtreret i 5 Ilters portioner gennem 3 stk. Whatman-filterpapir nr. 2 med en diameter på 24 cm i et enkelt Buchner- 19 DK 174889 B1 filter. Vakuummet blev indstillet til at forhindre opskumning under filtreringen. Der var kun et spor af uopløseligt materiale. Filtratet {32,6 I) indeholder bGH i opløsning.
Den klarede opløsnings absorbans var 9,1 O.D. ved 280 nm (1 cm's celle). Hvis al 5 absorptionen skyldtes bGH, hvilket den ikke gør, ville dette svare til 14,3 g bGH/Ι. Det virkelige bGH-indhold er mindre end halvdelen af denne værdi. UV-Absorberende urenheder forklarer forskellen. En absorbans på 1,0 ved 280 nm (1 cm’s celle) fås fra en ’ 1,57 g/l's opløsning af rent bGH ved pH 9 (bGH’s absorbans forandrer sig med pH).
, 10 Opløsningspuffer (1M natriumborat, pH 11,8): 61,8 g borsyre opløses i 750 ml deioniseret vand, og pH indstilles til 11,8 med 50%'s NaOH. Der fortyndes til et slutvolumen på 1 I med deioniseret vand.
15 Analysemetoder: Kvantiteret gelscanning af vasket kage og opløst bGH
Trinudbytte: 100%
Totaludbytte: 85,6%
Udbyttevolumen: 6,8% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 6,2 g bGH/l 20 Berigelsesfaktor: 0,039 EKSEMPEL 10 25 100 kilodalton ultrafiltrering
Den klarede proteinopløsning (32,6 I, 297.000 OD) (eksempel 9) blev opdelt i separate portioner (6 x 5,4 I), der hver havde en absorbans på 50.000-60.000 OD. Hver portion blev ultrafiltreret separat gennem et Pellicon® Cassette System-ultrafilter (Millipore, 30 Bedford, Massachusetts) forsynet med tre kassetter med en molekylvægtgrænse på 100.000 (type PTHK) hver med et areal på 4645 cm*. Den første portion blev koncentreret * til 11 retentatvolumen. Ultrafiltratet blev indsamlet, analyseret ved UV og gemt.
Retentatet blev fortyndet til det oprindelige volumen med frisk 10 mM natriumboratpuffer, pH 11,8, og blandet grundigt. Portionen blev igen koncentreret til 1 I retentatvolumen.
35 Ultrafiltratet blev indsamlet og kombineret med det første ultrafiltrat. Når den løbende totalværdi for OD-absorbansen i ultrafiltraterne svarede til 20% af OD-absorbansen i det på ultrafilteret anbragte udgangsmateriale, blev retentatvolumenet ved næste koncentration bragt til 0,5 I i stedet for 1 I. Koncentrations- og fortyndingscyden med 10 mM natriumboratpuffer blev fortsat, indtil ultrafiltratet fra et retentatvolumen på 0,5 I havde en 40 absorbans ved 280 nm (1 cm's celle) på mindre end 0,1. Dette tager sædvanligvis mellem 9 og 12 ultrafiltrerings- og fortyndingscyder. Slutretentatet blev kasseret. Strømningshastighederne til ultrafiltreringen er vist i tabel I.
DK 174889 B1 20
Alle ultrafiltrater blev derefter kombineret og indstillet til pH 9,0 med 6N HCI. De andre 5,4 liters portioner blev ledt gennem Pellicon®-systemet på tilsvarende måde, og alle pH-indstillede ultrafiltrater blev kombineret. Et typisk forsøg gav i alt 380 I ultrafiltrat med en absorbans på 0,26 OD/ml svarende til en samlet OD-værdi på 100.000 (pH 12) og 5 krævede 24-40 timer at fuldføre.
i
Tabel I
Strømningshastigheder for ultrafiltrering ved en molekylvægtgrænse på 100 kilodalton 10 Betingelser Hastighed pr. Hastighed med enhed membran- 3 kassetter areal (13,935 cm2 15 Ultrafiltreringshastighed, når retentatet er mest koncentreret 1,7 ml/time/cm2 24 l/time
Ultrafiltreringshastighed, 20 når retentatet er mest fortyndet 2,6 ml/time/cm2 36 l/time
Recirkulationshastighed, når retentatet er mest 25 koncentreret 77,5 ml/time/cm2 18 l/min
Recirkulationshastighd, når retentatet er mest fortyndet 38,75 ml/time/cm2 9 l/min 30 _ 1 Ved et indløbstryk på 345 kN/mz og et bagtryk på 34,5 kN/m2.
Analysemetoder: Kvantiteret gelscanning af udgangsmaterialet og absorbans ved 280 35 nm (1 cm's celle) på udbyttet, kvalitativ gelchromatografi
Trinudbytte: 75,5%
Totaludbytte: 64,6%
Udbyttevolumen: 76% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 0,4 g bGH/liter 40 Berigelsesfaktor: 0,065
Det tilførte materiale, retentatet og ultrafiltratet blev hver især undersøgt ved Sepharose(R) CL-6B-gelchromatografi (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New 21 DK 174889 B1
Jersey) for at bestemme omfanget og kvaliteten af separationen. Betingelserne i gel kolonnen er:
Diameter 2,6 cm, længde 100 cm 5 Totalvolumen: 500 ml
Porevolumen: 150 ml
Strømningshastighed: 40-60 ml/time Påfyldning: 50 OD i 5 ml
Eluent: 10 mM natriumborat, pH 12 10 Normal gennemløbstid: 5 timer
Detektion: 280 nm UV.
Gelchromatografipuffer (10 mM natriumborat, pH 12): 15 Fremstilles som beskrevet i eksempel 9.
i j EKSEMPEL 11 20 lonbytningschromatografi
De kombinerede ultrafiltrater (380 I med en absorbans på 100.000 OD) fra 100 kilodalton-ultraflltreringen i eksempel 10 blev anbragt på en Sepharose(R) CL-6B DEAE-ionbyttersøjle (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey) ved en lineær strømningshastighed 25 på 93 cm/time (100 l/time). Søjlen, som havde en diameter på 37 cm og en længde på 15 cm, blev vasket med 2 lejevolumen (32 liter) 10 mM natriumboratpuffer ved pH 9,0, og eluatet fra påfyldnings- og vasketrinnet blev kasseret. En ændring i eluent til 10 mM natriumborat, 100 mM natriumchlorid, pH 9, fjernede bGH fra søjlen. Eluerings-strømningshastigheden var 93 cm/time. Elueringsforløbet blev overvåget ved at følge 30 eluatets absorbans ved 280 nm. bGH-Toppen blev samlet i 4-5 lejevolumen (84 liter med en samlet absorbans på 43.000 OD) og gemt. Den gennemsnitlige koncentration af bGH-fraktionen var 0,8 g bGH/l.
Søjlen blev regenereret ved at vaske lejet ved en hastighed pi 93 cm/time som følger: et 35 lejevolumen 1M natriumacetat indstillet til pH 3,0 med HCI blev anbragt pi søjlen efterfulgt af 1,5 lejevolumen 0,5N NaOH. Efter behandling med NaOH lodes søjlen henstå i 2 timer, hvorefter søjlen blev vasket med 1,5 lejevolumen 1M natriumacetat indstillet til pH 3,0 med HCI. Lejet blev derefter ækvilibreret med 10 mM natriumborat (pH 9) ved at lade mindst tre lejevolumen puffer løbe gennem ionbytterlejet. Eluatets ledningsevne og pH bør 40 kontrolleres med den indløbende opløsning.
Analysemetoder: Absorbans ved 280 nm (1 cm's celle).
Trinudbytte: 43%
Totaludbytte: 27,7% 22 DK 174889 B1
Udbyttevolumen: 16,8% af cellesuspensionens udgangsvolumen
Bedømt ved assay: 0,8 g bGH/l
Berigelsesfaktor: 2 5 Søjlevaskepuffer (10 mM natriumborat, pH 9): 0,62 g borsyre i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 10 med koncentreret saltsyre, fortyndet til 1 I med deioniseret vand og om nødvendigt genindstillet til pH 9,0.
10 Elueringspuffer (10 mM natriumborat, 100 mM natriumchlorid, pH 9).
3,81 g natriumborat-decahydrat og 5,85 g natriumchlorid i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 9,0 med koncentreret saltsyre, fortyndet til 1 liter med deioniseret vand og om nødvendigt genindstillet til pH 9,0.
15
Regeneringspuffer (1M natriumacetat, pH 3,0).
136,09 g natriumacetat.3HzO i 750 ml deioniseret vand blev indstillet til pH 3,0 med koncentreret saltsyre, fortyndet til 1 liter med deioniseret vand og om nødvendigt 20 genindstillet til pH 3,0.
EKSEMPEL 12 25 Koncentration og dialyse bGH-Fraktionen fra ionbytningstrinnet (84 liter, 43.000 OD) (eksempel 11) blev indstillet til pH 10,5 med IN NaOH. Den indstillede opløsning blev koncentreret ved ultrafiltrering gennem et Mil lipore PelliconO-ultrafilter forsynet med tre kassetter (type PTGC) med en 30 molekylvægtgrænse pi 10.000 og et areal på 4.645 cm2 hver, indtil den beregnede absorbans ved 280 nm (1 cm's celle) af retentatet er 10. Ultrafiltratet bør ikke indeholde noget bGH og blev kasseret. Retentatet blev sædvanligvis koncentreret med en faktor på ca. 20 (4,2 liter retentat). Strømningshastigheder er vist i tabel II.
35 Efter at bGH'et var blevet koncentreret, blev opløsningen afsaltet ved dialyse mod NH4OH under anvendelse af Pellicon®-systemet med kassetten med en molekylvægtgrænse pi 10 kilodalton (diafiltrering). 3 mM NH4-OH-opløsning (25 volumen pr. retentatvolumen eller i dette tilfælde 105 liter 3 mM NH40H) blev kontinuerligt sat til retentatet med en hastighed, der netop var tilstrækkelig til at erstatte volumentabet ved diafiltrering. Diafiltratet blev 40 derefter kasseret. Det indeholder salte og 10% af udgangs-bGH'et målt ved absorbans. Retentatet, der indeholder det afsaltede bGH, drænes fra Pellicon®-systemet, og ultrafilteret blev vasket med en lille mængde 3 mM NH4OH, der kombineres med retentatet. Retentatvolumenet før tilsætning af vaskevæsken var 4,2 liter (39.000 OD) ved en koncentration på 14,6 g bGH/Ι. Strømningshastigheder er vist i tabel III.
23 DK 174889 B1 j ί
Tabel II
Strømningshastigheder for ultrafiltrering ved en molekylvægtgrænse på 100 kilodalton1 5 Betingelser Hastighed pr. Hastighed med enhed mem- 3 kassetter branareal (13,935 cm2) 10 Ultrafiltreringshastighed, når retentatet er mest koncentreret 1,9 ml/time/cm2 27 l/time
Ultrafiltreringshastighed, 15 når retentatet er mest fortyndet 2,6 ml/time/cm2 36 l/time
Recirkulationshastighed, når retentatet er mest 20 koncentreret 9,7 ml/time/cm2 2,25 l/min
Recirkulationshastighed, når retentatet er mest fortyndet 6,5 ml/time/cm2 1,5 l/min ; 25 _ ' Ved et indløbstryk på 138 kN/m2 og et bagtryk på 69 kN/m2.
30 Tabel III
Strømningshastigheder for diafiltrering1 mod 3 mM NH4OH
Betingelser Hastighed pr. Hastighed med 35 enhed mem- 3 kassetter branareal (13,935 cm2) •
Ultrafiltreringshastighed 2,6 ml/time/cm2 36 l/time 40
Recirkulationshastighed 9,7 ml/time/cm2 2,25 l/min
Ved et indløbstryk på 103 kN/m2 og et bagtryk på 34,5 kN/m2.
24 DK 174889 B1
Analysemetoder: Absorbans ved 280 nm (1 cm's celle)
Trinudbytte: 90%
Totaludbytte: 25%
Udbyttevolumen: 0,84% af cellesuspensionens udgangsvolumen 5 Bedømt ved assay: 14,6 g bGH/liter
Berigelsesfaktor: 18,3 EKSEMPEL 13 1 10
Frysetørring
Retentatet og vaskevæsken fra dialysetrinnet (4,2 liter, 39.000 OD ved en koncentration på 14,6 g bGH/l) blev skalfrosset i en høj glaskrukke. Krukken blev forbundet med et 15 laboratorie-frysetørringsapparat i 24-48 timer, indtil indholdet var lyofiliseret til tørhed.
Krukkens yderflade blev udsat for omgivelsestemperatur under hele tørringscyclen. Der var intet detekterbart tab af bGH. bGH (61,3 g) blev høstet som et fnugagtigt, hvidt pulver.
20 Analysemetoder: Absorbans pi udgangsmaterialet og frigivelses- assays på tørt bGH Trinudbytte: 100%
Totaludbytte: 25%
Udbyttevolumen: 0,012% af cellesuspensionens udgangsvolumen 25 Bedømt ved assay. 100% maskvolumen
Berigelsesfaktor: 68
Claims (10)
1. Fremgangsmåde til isolering af et oprenset animalsk eller humant væksthormon eller en polypeptidanalog deraf fra en bakteriecelle, i hvilken det eukaryote væksthormon eller 5 analogen deraf er blevet fremstillet ved hjælp af ekspression af en DNA-sekvens, der indkoder hormonet eller analogen, hvilken omfatter følgende trin: a) bakteriecellens cellevæg eller fragmenter deraf sprænges til dannelse af et lysat, * 10 b) et bundfald, som indeholder partikelformigt og uopløseligt materiale, skilles fra lysatet, c) en suspension af det fraskilte bundfald fremstilles i en hensigtsmæssig pufferopløsning, d) suspensionen bringes i kontakt med op til 100 μg lysozym/ml opløsning i et passende 15 tidsrum i fravær af DNAse og suspensionen behandles, således at væske og faste stoffer bringes i kontakt, ; e) delvis eller fuldstændigt udfældet materiale skilles fra suspensionen, hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, 20 f) det fraskilte bundfald solubiliseres i en tilstrækkelig mængde vandig opløsning, og pH indstilles til mellem 9.0 og 12.0 til dannelse af en opløsning, g) det solubiliserede hormon eller analogen deraf skilles fra andre cellebestanddele ved 25 ultrafiltrering under anvendelse af en membran med en molekylvægtgrænse på ca. 100 kilodalton under hensigtsmæssige betingelser til dannelse af et ultrafiltrat, som indeholder hormonet eller analogen og et retentat, og h) det solubiliserede hormon eller analogen deraf behandles for yderligere at oprense og 30 koncentrere hormonet eller analogen og derved isolere oprenset hormon eller analog.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvori hormonet eller analogen er humant væksthormon eller en analog deraf.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvori analogen omfatter naturligt humant væksthormons aminosyresekvens, hvortil der ved den N-terminale ende er sat methionin, og bakteriecellen er Escherichia coli stamme ATCC nr. 39384.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvori bakteriecellen eller fragmenter deraf før trin a) holdes i suspension i fermenteringsvæsken eller er suspenderet i en hensigtsmæssigt pufret opløsning ved neutral pH. 26 DK 174889 B1
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvori separationen i trin b) eller trin e) omfatter centrifugering eller ultrafiltrering.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 5 hvori behandlingen i trin d) til at tilvejebringe kontakt mellem væske og faste stoffer omfatter sonikering eventuelt i nærvær et overfladeaktivt middel efterfulgt af inkubation.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvori det udfældede materiale, der delvis eller fuldstændigt skilles fra suspensionen i trin 10 e), hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, resuspenderes mindst yderligere 1 gang i en hensigtsmæssig mængde af et egnet medium, væske og faste stoffer i den således fremstillede suspension bringes i kontakt under hensigtsmæssige betingelser, og det resulterende udfældede materiale skilles fra suspensionen, hvor væske og faste stoffer er bragt i kontakt, før solubilisering i trin f). 15
8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvori pH efter solubilisering af bundfaldet ved en pH på ca. 9,0-12,0 sænkes til ca. 10,5.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 20 hvori en passende mængde af en hensigtsmæssig koncentreret vandig opløsning af natriumborat sættes til den i trin f) vundne opløsning, eller som yderligere omfatter klaring af den i trin f) vundne opløsning ved at bringe væske og faste stoffer i opløsningen i kontakt under hensigtsmæssige betingelser, centrifugere opløsningen under hensigtsmæssige betingelser, separere supernatantvæsken og filtrere væsken til dannelse 25 af en klaret opløsning, som indeholder hormonet eller analogen.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvori det i trin g) vundne retentat genunderkastes ultrafiltrering mindst én gang før eller efter behandlingen i trin h), eller hvori behandlingen af det solubiliserede hormon i trin h) 30 omfatter ionbytningschromatografi, eller hvori ionbytningschromatografien udføres ved hjælp af diethylaminoethyl-dextran eller diethylaminoethyl-sepharose, eller hvori det oprensede hormon eller analogen deraf koncentreres ved ultrafiltrering, og yderligere oprenses ved dialyse efterfulgt af tørring. 35 f
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64443584A | 1984-08-27 | 1984-08-27 | |
US64443584 | 1984-08-27 | ||
US73445085A | 1985-05-15 | 1985-05-15 | |
US73445085 | 1985-05-15 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK377985D0 DK377985D0 (da) | 1985-08-20 |
DK377985A DK377985A (da) | 1986-02-28 |
DK174889B1 true DK174889B1 (da) | 2004-01-19 |
Family
ID=27094481
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198503779A DK174889B1 (da) | 1984-08-27 | 1985-08-20 | Fremgangsmåde til fremstilling af væksthormoner |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0173215B1 (da) |
JP (1) | JPH0655154B2 (da) |
KR (1) | KR930009336B1 (da) |
AT (1) | ATE90389T1 (da) |
AU (1) | AU589569B2 (da) |
CA (1) | CA1267615A (da) |
DE (1) | DE3587391T2 (da) |
DK (1) | DK174889B1 (da) |
ES (1) | ES8606496A1 (da) |
GR (1) | GR852031B (da) |
HK (1) | HK147695A (da) |
HU (1) | HU201806B (da) |
IE (1) | IE58860B1 (da) |
IL (1) | IL76191A (da) |
NZ (1) | NZ213153A (da) |
PT (1) | PT81012B (da) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
CA1272144A (en) * | 1984-06-29 | 1990-07-31 | Tamio Mizukami | Fish growth hormone polypeptide |
US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
US5064943A (en) * | 1988-12-16 | 1991-11-12 | American Cyanamid Company | Method for solubilization and naturation of somatotropin |
US4975529A (en) * | 1989-08-18 | 1990-12-04 | Monsanto Company | Method of folding somatotropins |
DK0432419T3 (da) * | 1989-12-05 | 1994-11-14 | American Cyanamid Co | Fremgangsmåde til solubilisering og naturering af somatotropiner under anvendelse af lav urinstofkoncentration |
KR940005594B1 (ko) * | 1991-12-24 | 1994-06-21 | 주식회사 럭키 | 양 성장 호르몬의 정제방법 |
KR100229420B1 (ko) * | 1992-05-09 | 1999-11-01 | 성재갑 | 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬의 정제 방법 |
US5437986A (en) * | 1994-06-22 | 1995-08-01 | Schering Corporation | Extraction of heterologous insoluble proteins from bacteria |
KR970061918A (ko) * | 1996-02-22 | 1997-09-12 | 성재갑 | 대장균에서 발현된 유전자 재조합 닭 성장 호르몬의 정제방법 |
US6316240B1 (en) | 1999-01-25 | 2001-11-13 | Novozymes A/S | Recovery of a glycosidase or peptidase from a culture broth at high pH |
US6566329B1 (en) | 1999-06-28 | 2003-05-20 | Novo Nordisk A/S | Freeze-dried preparation of human growth hormone |
KR101460266B1 (ko) * | 2012-06-05 | 2014-11-11 | 씨제이헬스케어 주식회사 | 신규한 지속형 인간 성장호르몬의 정제 방법 |
CN104379598B (zh) | 2012-06-05 | 2017-04-05 | Cj医药健康株式会社 | 高度糖基化的长效人生长激素蛋白及其生产方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0111814A3 (en) * | 1982-12-16 | 1985-08-14 | Mgi Pharma, Inc. | The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone |
GR79124B (da) * | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
CA1340597C (en) * | 1984-08-27 | 1999-06-22 | Haim Aviv | Expression vectors containing pl promoter, and engineered restriction site for convenient replacement of ribosomal binding site, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids and related methods |
-
1985
- 1985-08-15 CA CA000488765A patent/CA1267615A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-16 KR KR1019850005918A patent/KR930009336B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-08-16 AU AU46268/85A patent/AU589569B2/en not_active Expired
- 1985-08-19 AT AT85110371T patent/ATE90389T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-19 DE DE85110371T patent/DE3587391T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-19 EP EP85110371A patent/EP0173215B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-20 NZ NZ213153A patent/NZ213153A/xx unknown
- 1985-08-20 DK DK198503779A patent/DK174889B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-08-22 GR GR852031A patent/GR852031B/el unknown
- 1985-08-22 JP JP60184984A patent/JPH0655154B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-22 HU HU853203A patent/HU201806B/hu unknown
- 1985-08-23 ES ES546395A patent/ES8606496A1/es not_active Expired
- 1985-08-23 PT PT81012A patent/PT81012B/pt unknown
- 1985-08-26 IE IE209285A patent/IE58860B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-08-26 IL IL76191A patent/IL76191A/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-09-14 HK HK147695A patent/HK147695A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0173215A3 (en) | 1987-11-25 |
KR870002258A (ko) | 1987-03-30 |
EP0173215B1 (en) | 1993-06-09 |
ES8606496A1 (es) | 1986-04-16 |
IE58860B1 (en) | 1993-11-17 |
PT81012B (pt) | 1987-09-18 |
PT81012A (en) | 1985-09-01 |
KR930009336B1 (ko) | 1993-09-27 |
EP0173215A2 (en) | 1986-03-05 |
DE3587391D1 (de) | 1993-07-15 |
GR852031B (da) | 1985-12-30 |
ES546395A0 (es) | 1986-04-16 |
AU589569B2 (en) | 1989-10-19 |
HUT38398A (en) | 1986-05-28 |
CA1267615A (en) | 1990-04-10 |
IE852092L (en) | 1986-02-27 |
IL76191A0 (en) | 1985-12-31 |
DE3587391T2 (de) | 1994-01-13 |
IL76191A (en) | 1990-12-23 |
AU4626885A (en) | 1986-03-06 |
HU201806B (en) | 1990-12-28 |
JPS6193128A (ja) | 1986-05-12 |
NZ213153A (en) | 1988-07-28 |
JPH0655154B2 (ja) | 1994-07-27 |
ATE90389T1 (de) | 1993-06-15 |
HK147695A (en) | 1995-09-22 |
DK377985A (da) | 1986-02-28 |
DK377985D0 (da) | 1985-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK174889B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af væksthormoner | |
JP3801196B2 (ja) | 乳からの対象化合物の単離 | |
US4620948A (en) | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins | |
CA1308680C (en) | Method of recovering microbially produced recombinant ricin toxin a chain | |
Leser et al. | The use of reverse micelles for the simultaneous extraction of oil and proteins from vegetable meal | |
US4599197A (en) | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins | |
JPS6253928A (ja) | 放出が制御されたインプラント及びその製造方法 | |
US5151358A (en) | Processes for the recovery of naturally produced chymosin | |
CA2058948C (en) | Processes for the recovery of naturally produced chymosin | |
EP0758380A1 (en) | A process for separating milk clotting enzymes, and stable rennet compositions | |
US5139943A (en) | Processes for the recovery of microbially produced chymosin | |
Shetty et al. | Preparation of yeast protein isolate with low nucleic acid by succinylation | |
US2808362A (en) | Preparation of hyaluronidase | |
US6121421A (en) | Methods for isolating recombinant β-casein | |
US3862109A (en) | Method for obtaining a protein isolate from hydrocarbon assimilating microbial cells | |
US5360729A (en) | Method for purification of recombinant copper/zinc (CU-ZN) superoxide dismutase from bacteria or eucaryotic cells | |
CA2073043C (en) | Improved method for purification of recombinant copper/zinc (cu-zn) superoxide dismutase from bacteria or eucaryotic cells | |
KR920005973B1 (ko) | 유전자 재조합한 효모에서 인간 성장 호르몬의 정제 방법 | |
DD236942A5 (de) | Verfahren zur gewinnung eines gereinigten eukaryotischen wachstumshormons | |
JPS62272992A (ja) | 微生物によつて産生された組換え体リシン毒素a鎖の回収方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |