JPS62272992A - 微生物によつて産生された組換え体リシン毒素ａ鎖の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生化学工学の分野に関する。より詳しくは、
本発明は、生化学的分離又は回収方法に関し、ここで組
換え体リシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）が、ＲＴＡを産生ずる
ために遺伝的に構成された微生物から回収される。

〔従来の技術〕

リシン毒素は、通常ヒマの種子として知られているユ之
±久　コミュニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　　Ｃｏｍｍｕｎｉ
ｓ）の種子に由来する、天然に存在する毒素である。

それは、酵素的に活性の細胞毒性ポリペプチド鎖（通常
“Ａ”鎖と呼ばれ、そして時々本明細書において“ＲＴ
Ａ”として言及されている）から成り、該“ＲＴＡ”は
、細胞に毒素分子を結合し、そして細胞質中にＲＴＡを
転移するのを助けることを担当すると推定される、通常
“Ｂ”鎖と呼ばれる第２ポリペプチドに単一のジスルフ
ィド結合によって結合されている。ＲＴＡは、不ヱ　二
重旦でリポソームの大サブユニットを触媒的に不活性化
することができ、そして盃エ　　■での細胞毒性につい
てのＲＴＡの機構は、リポソーム不活性化についてのこ
の能力にあると思われる。

０１ｓｎｅｓ、Ｓ、　Ｐｅｒｓ　ｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ
　Ｔｏｘｉｃｏｌｏ　　、Ａ、Ｗ。

Ｂｅｒｎｈｅｉａｅｒ＋　１９７７年出版１Ｊ、Ｗｉｌ
ｅｙ　＆　５ｏｎｓ、ＮＹ。

１２２〜１４７ページ及び０１ｓｎｅｓ＋Ｓ、＋など、
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＡｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｘｉｎ
ｓ　ａｎｄ　Ｖｉｒｎｓｅｓ、Ｃｏｈｅｎ、など。

１９８２年出版１Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｎ＋ｓｔｅｒｄ
ａｍ、　５１−１０５ページは、３２．０００の見掛分
子量を有するような天然のＲＴＡを特徴化する。１９８
５年８月５日に発表された、継続中のシータス所有のＲ
ＣＴ第讐０８５１０３５０８号は、ＲＴＡのための天然
の構造遺伝子、ＲＴＡ遺伝子をクローニングし、そして
発現するためのＤＮＡ構造体、ＲＴＡの推定アミノ酸配
列及び細胞内産生され、可溶性の組換え体ＲＴＡを合成
することができる、形質転換された細菌を開示する。

１９８６年１１月１３日に提出された、ｍｔｒｔｔ中の
シータス所有のヨーロッパ特許出願筒８６３０８８７７
．９号は、さらにそのような細菌によるそのような組換
え体ＲＴＡの産生及び該細菌からのＲＴＡの回収方法を
開示している。回収方法は、ｐＨ８，５で還元条件下で
水性懸濁液中の細胞を音波処理し、該音波処理物を遠心
分離し、そして一部端製されたＲＴＡの可溶性形を生成
するためにフェニルセファロースカラムを用いて上清液
をクロマトグラフィー処理することを含んで成る。この
ＲＴＡは、カルボキシメチルセルロースカラム及びＦａ
ＧＡカラム上で連続的にクロマトグラフィー処理するこ
とによってさらに精製される。この回収方法は実質的に
純粋なＲＴＡを提供するが、それは低収率である。

本発明は、形質転換体から高収率で、実質的に純粋で可
溶性の組換え体ＲＴＡを回収するためのより簡単な方法
を提供する。

ＲＴＡを含む、水性懸濁液中の形質転換された微生物か
ら、細胞内産生された組換え体リシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ
）を回収するための本発明の新規方法は、 （ａ）約７以上のｐｉ（で、該微生物の細胞膜を破壊し
； （ｂ）約７以上のｐｉで、該破壊物から不溶性細胞膜物
質を除去し； （ｃ）段階（ｂ）から得られた溶液のｐＨを、約６〜約
６．５に及び前記溶液の伝導率を約１．２５〜約１．７
５ミリシエメンに調整し； （ｄ）　次に、前記溶液をＳＰ−セルロースカチオン交
換体のベッドを通し、それによって溶液中のＲＴＡをそ
の交換体によって保持し：そして（ｅ）　　ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって決定される場合、タンパク質含有率が少
なくとも約９０重量％のＲＴＡである溶液を得るために
前記ベッドからＲＴＡを溶離することを含んで成る。

好ましくは、前記方法の段階を、ＲＴＡを含む沈殿物の
形成が減じられる温度で別々に又は組み合せて行う。

本発明はさらに、前記方法によって産生されたＲＴＡ及
び精製されたＲＴＡを含んで成る。

本明細書に使用される場合、“リシン毒素Ａ”又は“Ｒ
ＴＡ″とは、そのアミノ酸配列がヒマの種子から抽出で
きるリシンＡペプチドのアミノ酸配列に実質的に類似す
るタンパク質として言及される。ヒマのＲＴＡは、長さ
にしておよそ２６５個のアミノ酸であり、そしておよそ
３２，０００ドルトンの分子量を有する。しかしながら
、その正確な配列はヒマの種類に依存して異なり、そし
て実際に、少なくとも２つのわづかに異なったＲＴＡの
形が１つの種類のヒマに存在することが知られている。

天然のＲＴＡに関して、用語“実質的に類似する”とは
、問題のポリペプチドがおよそ同じ長さく活性のための
本質的な特徴は、より短い長さの配列、すなわち“フラ
グメント”又はより長い配列、すなわち融合タンパク質
のペプチドに存在することが知られているが、任意にお
よそ１０％以内である）であるべきであるが、しかしよ
り重要なことには、６０Ｓのりボゾームサブユニソトと
相互作用するためにＡ鎖の能力を保持し、そして無能力
にすべきであることを意味する。この酵素活性をほとん
どそこなわない鎖長の変性が含まれる。

タンパク賞配列におけるある少々の変性は、他の変性が
完全に破壊的であるのに対して、タンパク質分子の機能
的能力を妨げることなしに可能であることが良く知られ
ている。特定の変性がこのカテゴリイーにあることを確
信をもって予測することは、現在のところ不可能である
。本発明の定義は、第１カテゴリイーにあるいづれかの
変性を可能にする。そのような変性は、遺伝子配列にお
ける偶然の突然変異又はその故意の変性に起因する。

要約すれば、ＲＴＡの細胞毒性活性を保持するアミノ酸
配列の変性された形が含まれる。

さらに、良く知られているように、タンパク質配列は、
翻訳後プロセシング、たとえば他の分子、たとえばグリ
コシド、脂質又はホスフェートのような無機イオンとの
関連によって変性され得る。

イオン化状態はまた、培地のｐｎ又は単離形の結晶化又
は沈殿化が起こるｐＨに依存して異なるであろう。さら
に、空気の存在は、不安定基、たとえば−３Ｈの酸化を
引き起こすかも知れない。特別な一次構造のすべての変
性、たとえばグリコジル化された及びグリコジル化され
ていない両者の形、中和形、酸性及び塩基性塩、脂質又
は他の関連ペプチド形、酸化又は誘導体化による側鎖の
変化及び同じ遺伝子コドン配列によってコードされたア
ミノ酸配列のいづれか他の変性がＲＴＡの定義内に含ま
れる。

本明細書に使用される場合、“可溶性”とは、１０■／
−はどのタンパク質濃度で、生理的に等張条件、たとえ
ば０．１４Ｍの塩化ナトリウム又はスクロース下で水性
緩衝液中において３０分間ｔｏｏ、ＯＯＯｘｇで遠心分
離した後の上清液に残存する組換え体ＲＴＡを意味する
。これらの条件は特に、有効濃度の界面活性剤又は他の
変性剤、たとえばグアニジン又は尿素の不在に関係する
。

“形質転換された微生物”とは、可溶性ＲＴＡを調製す
るために遺伝的に処理された有機体を意味する。そのよ
うな有機体の例は、前記国際特許出願第ＷＯ３５１０３
５０８号及び本明細書の例に記載される０組換え体ＲＴ
Ａはまた、形質転換された適切な真核宿主、たとえば酵
母細胞によって製造され得るが、本発明の回収のための
組換え体ＲＴＡを調製するためには、細菌類が好ましい
微生物である、旦−ユユが特に好ましい宿主である。

細胞内で産生された可溶性組換え体ＲＴＡを合成するた
めに使用されるＤＮＡ構造及び形質転換された微生物は
、前記国際特許出願第ＷＯ３５１０３５０８号に記載さ
れている。

第１図は、ＲＴＡをコードするｐＲＡ１２３　（１９８
４年８月１４日＾ＴＣＣに寄託され、そして寄託番号第
３９．７９９号を得た）のクローンされたｃＤＮＡ挿人
体を示し、そしてそれはそのようなＲＴＡを調製するた
めに使用された。この挿入体を、ブライマー指図の突然
変異生成によって変性し、ＲＴＡ構造遺伝子の先の新し
く構成されたＡＴＣ出発コドンの前に旧ｎｄＩＩ［部位
を配置し、そして旧ｎｄｎｌ／ＢａｍＨＩカセットとし
て除去され、そして適切な発現ベクターに連結され得る
ＲＴＡのために正しく終結するコード配列を提供するた
めにＣ−末端で停止コドンを配置した。好ましい発現制
御配列は、アルカリ性ホスファターゼＡ　（Ｐｈｏ　Ａ
）プロモーター／オペレーター及びリーダー配列並びに
Ｌムリンジエンシス（Ｌ」エビｊ」１μｔｓｉΩ−の結
晶タンパク質遺伝子に由来された陽性レトロレギュレー
ターを含む。その発現制御配列及びそのコード配列は、
発現ベクターｐＲＡＰ２２９　（１９Ｂ５年３月８日に
＾ＴＣＣに寄託され、そして寄託番号５３．４０８を得
た）を形成するために組合わされた。この発現系におい
て、不可欠な成分は、ＲＴＡコード配列の上流の、それ
に近いほうの及びそれと位相を異にする末端化されたＰ
ｈｏ　Ａリーダー配列であり、ここで該ＲＴＡコード配
列はＡＴＧ出発コドンによって開始される。

この発現系は、適切な細菌宿主、たとえばＥ。

Ｊ　ＭＭ２９４中に形質転換される。形質転換された培
養物は、従来の条件、たとえばＭｉｃｈａｅｌ　ｉｓな
ど、。

Ｊ、Ｂａｃｔ、　（１９８３Ｈ５４：３５６〜３６５に
記載されている条件下で、適切な増殖培地中で増殖され
る。細胞によるＲＴＡの発現は、目的とする増殖のレベ
ルを達成するまでホスフェートイオンの存在下で細胞を
維持し、そして次に発現が所望される場合、ホスフェー
トレベルを低くすることによって遅延され得る。細胞を
誘発した後、濾過、遠心分離又は他の既知の方法によっ
て細胞の水性懸濁液を提供するために、細胞を収穫し、
そして必要なら濃縮する。

形質転換体の細胞膜を、還元下で破壊し、細胞内で産生
された可溶性ＲＴＡを懸濁培地に放す。

その培地のｐＨを、破壊段階において溶液中にＲＴＡを
保持するレベルで（約７以上、好ましくは８．５〜８．
８で）維持する。破壊は、高圧シリンダーによって行な
われ、そして光学密度によってモニターされる。還元条
件は、培地に還元剤、たとえばジチオトレイトール又は
２−メルカプトエタノールの有効量を添加することによ
って維持される。

破壊した後、不溶性細胞膜物質を、遠心分離又は好まし
くはダイアフィルトレーションによって細胞破壊物から
除去する。ｐｉ（は、溶液中にＲＴＡを保持するために
上記のようにアルカリ性に保たれる。

不溶性細胞物質の除去の後、得られた溶液のｐＨ及び伝
導率を、次の分離用イオン交換クロマトグラフィ一段階
のために調整する。そのｐＨを、好ましくはホスフェー
トを用いて約６〜６．５の間に緩衝し、そしてその伝導
率を、約１．２５〜１．７５ミリシエメン、好ましくは
約１．４５〜１．５５ミリシエメンの間に調整する。伝
導率は、適切なイオン性種を添加することによって高め
られ、そして希釈によって低められる。その溶液の伝導
率は、（１）その交換体の結合容量、（２）溶液中にＲ
ＴＡを維持すること及び（３）汚染タンパク質の結合に
よって、次のＳＰ−セルロースクロマトグラフィ一段階
の効率に影響を及ぼす。上記に示された伝導率よりも有
意に高い伝導率は、交換体の結合容量に逆に影響を及ぼ
すが、ところがそれよりも有意に低い伝導率はＲＴＡの
沈殿を引き起こしがちであり、且つ汚染タンパク質の結
合を高めがちである。

次に、その溶液は、１又はそれよりも多くのベッドの平
衡化されたＳＰ−セルロースカチオン交換体を通され、
その溶液からＲＴＡを分離される。

そのＳＰ−セルロースカチオン交換体は、ペンダントス
ルホプロピル官能基を担持するビニルボリマーにより架
橋されたセルロース主鎖からなる弾性の立体網状構造体
である。ＳＰ−セルロースカチオン交換体は、商業的に
入手できる。そのベッドは、好ましくは、溶液の急激な
流路のために適合される。溶液の流速は、ベッドのサイ
ズ及び形状に依存するであろう。ベッドの容量を越える
ことは避けるべきである。その容量を越えた場合、ＲＴ
Ａは保持されず、そしてベッドからの流出液中に存在す
るであろう。従って、ベッド容量は、流出液中にＲＴＡ
のレベルを探知することによってモニターされ得る。一
連のベッドは、流出液中にＲＴＡの損失を避けるために
使用され得る。他方、最大ベッド容量に達した場合、そ
のベッドは溶出され、そして再生され得る。そのベッド
は、使用する前、リン酸緩衝液（ｐｆ１６．５　）　、
０．１％のβ−メルカプトエタノール（又は他の適切な
還元剤）により平衡化され得る。

ＲＴＡは、該ＲＴＡがベッドから分離するように、ｐＨ
又は伝導率を変えられた溶液を用いて、ベッドから溶離
され得る。グラジェント又は非グラジェント溶離が使用
され得る。好ましい溶離剤は、ＩＭのＮａＣ１である。

好ましい態様においては、ＲＴＡ産生細胞の破壊からＳ
Ｐ−セルロースカチオン交換体からの溶離までのすべて
の段階は、それ自体又は細胞の成分もしくは細胞成分、
たとえば細胞から抽出されたタンパク賞のいづれかを含
む、ＲＴＡの沈殿物の形成を減じ又は排除するのに十分
に冷たい温度で行なわれる。一般的に、その温度は１０
℃以下の範囲であり、但し、細胞及びＲＴＡを懸濁し、
抽出し、そして溶離するために使用される溶液が凍結し
ないような十分に高い温度である。より好ましくは２〜
８℃の温度である。最とも好ましくは約４℃である。

得られた溶離物のタンパク賞含有率は、少なくとも約９
０重量％、及びより一般的には少なくとも９５重量％の
ＲＴＡである。この実質的に純粋なＲＴＡ中のピロゲン
含有量は、ＲＴＡ■当り約１１００ｎよりも少ない。収
率は典型的には５．８０％〜９０％の間である。これに
関しては、形質転換された微生物からそのような純度の
可溶性ＲＴＡを回収するために使用された従来の方法は
、複数のクロマトグラフィ一段階（これは、ＳＰ−セル
ロース交換体を含まない）を含み、そして一層低い収率
を有した。

ＲＴＡはさらに、ＳＰ−セルロース交換体からの溶離物
を、平衡化されたフェニル−セファロースカラムを用い
て、分離用クロマトグラフィー処理することによって９
９％を越えるレベルに精製され得る。ＲＴＡは、プロピ
レングリコール又はグリセロールグラジェントを用いて
カラムから溶離され得る。

次の例は、さらに、本発明のＲＴＡ回収方法を例示する
。その例は、本発明を限定するものではない。

ｐＲＡＰ２２９により形質転換された旦エユユＭＭ２９
４を、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓなど、１前記によって記載さ
れた条件に類似する条件下で増殖した。その形質転換体
を、外因性ホスフェート濃度を低め、そして１６〜１７
時間、その培養物を、維持することによって誘発した。

誘発した後、その培養物を一２０℃で凍結した。

凍結細胞の３３６ｇを融解し、そして０．１　Ｍのグリ
シン、ｉｎ＋Ｈのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）及び０．１％の２−メルカプトエタノール（ｐＨ８
，８）の溶液３１中に再懸濁した。その懸濁液を３度、
ホモナイザー（６０００〜７０００ｐｓｉ）を通した。

その後、懸濁液はシロップ状懸濁液であった。

゛イアフィルトレージョン 破壊物３１を、１０平方フイートのセルロースカートリ
ッジを用いるユニットによりダイアフィルトレーション
処理した。上記の再懸濁培地を、ダイアフィルトレーシ
ョン緩衝液として使用した。

流入圧は２０ｐｓｉであり、そして流出圧は１５ｐｓｉ
であった。その破壊物の体積を、およそ１．５６に減じ
た。およそ１７．５１のダイアフィルトレーション処理
物（ｐＨ８，８、伝導率０．９６ミリシエメン）を、４
つの百分に集めた。このダイアフィルトレーション処理
物のタンパク質分析は、それがおよそ１９．９　ｇのタ
ンパク質を含んでいることを示した。

そのダイアフィルトレーシッン処理物を、ＩＭのリン酸
によりｐＨ６，５に滴定し、局部沈殿を避けた。

滴定の後の溶液の伝導率は、１．０ミリシエメンであり
、そしてその体積は１９．５　ｆｉであった。その伝導
率は、およそ３０ａＺのＩＭのＮａＨｚＰＯａの添加に
よって１．３１ミリシエメンに上昇した。

ＳＰ−セルロースイオン六　クロマ　グーフエニ ２５０ｃｃのＳＰカートリッジと１０００ｃｃのＳＰカ
ートリッジとを連続して連結した。　２５０ｃｃのカー
トリッジへの入口を、ポンプを経て、調整されたダイア
フィルトレーション処理物が入っている容器に連結し、
そして１０００ｃｃのカートリッジからの出口を、画分
コレクターにＡＨ０検出器を経て連結した。

そのカートリッジは、（１）０．１ＭのＮａ３ＰＯ４，
５１、（２）０．１Ｍの酢酸０．７１、（３）０．２Ｍ
のホスフェート（ｐＨ６，５）２１及び（４）１０ｍＭ
のホスフェート　（ｐＨ６、５）　、０．１％メルカプ
トエタノール５、６１により連続に洗浄することによっ
て活性化された。

調整されたダイアフィルトレーション処理物を、８０−
７分（２０ｐｓｉの背圧）でカートリッジを通してポン
プで注入し、そして流出液を、２１両分に集めた．両分
ごとに、ＳＤＳ　−　ＰＡＧＥによって検定した．その
ＳＤＳ　−　ＰＡＧＥ分析は、流出液画分中に、はとん
ど又は完全にＲＴＡが含まれないことを示した。

ダイアフィルトレーション処理物１９．５　１を、カー
トリッジに通過した後、そのカートリッジは、Ａ２．。

がベースラインに達するまで、１０ｍＭホスフェ−）　
（ｐＨ６．５）　、０．１％２−メルカプトエタノール
溶液により洗浄した。カートリッジを離し、そして結合
されたＲＴＡを、溶離緩衝液（２０ｍＭのホスフェート
、ｐＨ６、５、０．　１％の２−メルカプトエタノール
、ＩＭの塩化ナトリウム）によりそれらから２０００−
画分にそれぞれ溶離した．　　２５０ｃｃカートリツジ
からの百分１４は、ダイアフィルトレーション処理物中
にＲＴＡが９５％以上含まれることを見出された。これ
は、この２５０ｃｃカートリツジの容量が（１．３１ミ
リシエメンで）　、１９．５１の体積のダイアフィルト
レーション処理物からＲＴＡを単離するのに十分であっ
たことを示す。

およそ２．７４ｇの実質的に純粋な（ＳＤＳ　−　ＰＡ
ＧＥによって測定された場合、〉９５％）ＲＴＡを、画
分１４から回収した。

五−ｌ この例は、ＳＰ−セルロース交換体に適用されるＲＴＡ
溶液の伝導率を変えることの効果を示す。

又血生夏玉飢化 カートリッジを、５ｍ１／分で１００〜２００−の０、
１Ｍリン酸ナトリウム及び３０　〜５０　ｍｊの０．　
１　Ｍ酢酸により連続的に洗浄した。次に、そのカート
リッジを、１０〜２０ａＩＭのホスフェート、ｐｌｉ６
．５、０．　１％の２−メルカプトエタノール溶液によ
り平衡化した。

調整されていないダイアフィルトレーシッン処理物のサ
ンプル（例１）を、ｐＨ６、５に、そして１、　０　、
　１．２６及びおよそ２．２ミリシエメンの伝導率に調
整し、そして３〜５−７分でカートリッジに充填した．
流出液を、およそ４５０ｍｆ画分に集めた。

すべてのサンプルを、カートリッジに通過した後、その
カートリッジを、Ａ２．。がベースラインに達するまで
平衡化緩衝液により洗浄した。次に、保持されたＲＴＡ
を、溶離緩衝液（２０ｍＭのホスフェート、ｐｏｓ．ｓ
、０．　１％の２−メルカプトエタノール、１．　０　
ＭのＮａＣＩｌ　）により溶離した。その保持物中のＲ
ＴＡ含有率を、Ａ２。。吸光度測定及びＳＤＳ　−　Ｐ
ＡＧＩ！分析によって決定した。ＲＴＡ沈殿度を、目に
よって評価した。

下の表は、おのおのの実験についての結合容量（＋＋ｇ
）及び観察された沈殿度を報告する。

サンプル １、０　　　　１．２６　　　　２．２ＲＴＡ結合容量
　　２００　　　　１８１　　　　１１５沈　殴　　　
　　　高い　　　低い　無視してよい示されるように、
容量及び溶解度の最良のバランスは、これらの試験にお
いて１．２６ミリシエメンの伝導率で生じた。

五−主 この例は、交互のＳＰ−セルロース交換体の使用を例示
する。　　□ トリサクリルＭＳＰ樹脂のｌＸＩＱｃｍカラム（７，８
５ｄ）を、用意し、そして平衡化緩衝液により平衡化料
た。例２の１．０ミリシエメン調整ダイアフイル□計レ
ーシヨン処理物のサンプル５０ｍ１を、２５−７時の流
速でカラムに負荷した。□次に、そのカラムを、Ａ、。

がベースラインにもどるまで平衡化緩衝液により洗浄し
、そして溶離緩衝液により溶離した。ＳＤＳ　−ＰＡＧ
Ｅ分析を、カラムからのダイアフィルトレーション処理
物の流出液及びカラム保持物に行なった。これらの分析
は、有意な量のＲＴＡがカラムに結合するが、しかし有
意な量のＲＴＡがまたダイアフィルトレーション処理物
の流出液中に存在したことも示す。従って、トリサクリ
ルＭＳＰ樹脂は、クロマトグラフィー処理のＲＴＡにお
いてＳＰカートリッジと同じように有効であるように思
えなかった。

■−■ 例１に記載のようにして増殖し、そして誘発した後、ｐ
ＲＡ２２９により形質転換されたＥ、コリＭＭ２９４の
Ｌｏｇを得、そして０．１Ｍのグリシン、ｌｌ１１Ｍの
ＥＤＴＡ、　０．１％の２−メルカプトエタノール（Ｂ
ＭＥ）　、＄）Ｉ（８，８の）容量１０〇−中に懸濁し
た。

その細胞懸濁液を、１分当り８．０の出力でＭ−１９５
細胞破壊器Ｗ−３７５（５０％使用サイクル）により音
波処理した。その破壊物を、４℃で３０分間、５Ｓ３４
０一ターＲＣ５遠心分離機（〜１２．０００ｘｇ）によ
り１０．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。上滑液をデカン
トし、そして４０℃で保存した。そのペレットを、緩衝
液に再懸濁し、上のようにして音波処理し、そして遠心
分離した。上清液を集め、そして１９６＠１の体積を得
、そしてそれを４℃で保存した。

次の段階のすべてにおいて、５ＲＴＡ上清溶液及びカラ
ムは、４℃で維持された。

上清液を、０．２μＭのＮａｌ遺伝子フィルターを通し
て濾過し、そして保持物を除去した。上清液をＩＭのＨ
，＋ＰＱ、によりｐＨ６，５に滴定し、そしてその伝導
率を０．１　ＭのＮａ５ＰＯ，により１．５　ｍｓに調
整し、そしてそのｐＨを、１ｌｚＰＯ４により６．５に
再調整した。

ｐＨの伝導率滴定の間、沈殿物は観察されなかった。

ｓｐディスク（ＡＭＦ分＠　Ｓ　Ｐ　００１０７）を、
０．１ＭのＮａ５Ｐ０４３０〇−及びＮａＰＯ４，１ｍ
ＨのＨＤＴＡ、　０．１　　□％のＢＭＥ　（ｐＨ６，
５）の溶液３００ｒｄにより活性化した。

調整されたサンプルを、５−７分の流速で前記ディスク
上に負荷した。その負荷されたディスクを、２８０ｎＭ
での吸光度がＯに等しくなるまで、１０ｍＭのＮａ、Ｐ
Ｏａ、１ｍＨのＥＤＴＡ、　０．１％のＢＭＥ（ｐＨ　
６．５　）の溶液により洗浄し、そしてサンプルを、１
００ｍＭのＮａＰＯａ　、１ｍＨのＢＤＴＡ、１ＭのＮ
ａＣ１。

０、１％のＢ　Ｍ　Ｅ　（ｐＨ１６，５）の溶液２１３
ｍ１により溶離した。

保持物２．５−を、ＰＢＳ中サイズ排除クロマトグラフ
ィー　（Ｇ　　２５５ｅｐｈａｄｅｘ）ＰＤＩＯカラム
によって脱塩した。脱塩された保持物３．５　ｍＺを集
めた。

２８０ｎＭで単一のピークを観察した。

ディスク上に負荷された溶液（レーン２）、通過した流
れ（レーン３）、脱塩された保持物（レーン４．５．６
）、負荷上清液（レーン７）及び負荷沈殿物（レーン８
）（後者の２つの両分は例１におけるようにして得られ
た）を、１２％ＳＯ５−ＰＡＧＥにゆだねた。５ＲＴＡ
標準（レーン１）が行なわれた。これらのＳＤＳ　−Ｐ
ＡＧＥ分析のｉ果は、第２図に示される。

遺伝子工学、生化学及び化学工学の分野における熟練者
にとっては明らかである、本発明を実施するための上記
態様の修飾は、次の特許請求の範囲内で行なわれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＲＴＡをコードするｐＩ？Ａ１２３のクロー
ンされた挿入体の完全なヌクレオチド配列及びＲＴＡの
推定さ・れる”アミノ酸配列を示す。 第２図は、本発明の方法によって産生されたＲＴＡ及び
ＲＴＡを含む沈殿物のＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析を示し、
そしてこれは写真であって、図面に代る写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）を含む形質転換された微
   生物の水性懸濁液から、細胞内産生され、可溶性の組換
   え体リシン毒素Ａ鎖の回収方法であって、 （ａ）溶液中にＲＴＡを保持するｐＨで、該微生物の細
   胞膜を破壊し； （ｂ）溶液中にＲＴＡを保持するｐＨで、該破壊物から
   不溶性細胞膜物質を除去し； （ｃ）必要ならば、段階（ｂ）から得られた溶液のｐＨ
   を６〜６．５に及び前記溶液の伝導率を１．２５〜１．
   ７５ミリシエメン、好ましくは１．４５〜１．５５ミリ
   シエメンに調整し； （ｄ）次に、前記溶液を、ＳＰ−セルロースカチオン交
   換体のベッドを通し、それによって溶液中のＲＴＡを、
   その交換体によって保持し；そして （ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、タン
   パク質含有率が少なくとも９０重量％のＲＴＡである溶
   液を得るために前記ベッドからＲＴＡを溶離することを
   含んで成る方法。 ２、前記カチオン交換体を、スルホプロピル官能側基を
   担持するビニルポリマーにより架橋されたセルロース主
   鎖から構成し、そして前記ベッドを、溶液が容易にベッ
   ドを通過されるように構成する特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、前記タンパク質含有率が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
   て決定される場合、少なくとも９５重量％のＲＴＡであ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記段階（ａ）を、高圧循環によって行ない、段階
   （ｂ）を、ダイアフィルトレーションによって行ない、
   前記伝導率が１．４５〜１．５５ミリシエメンであり、
   そして前記タンパク質含有率が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
   って決定される場合、少なくとも９５重量％のＲＴＡで
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、（ｆ）フェニル−セパロースカラムを用いて溶離さ
   れたＲＴＡをクロマトグラフィー処理し、それによって
   ＲＴＡの純度を、９９％以上に高める特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ６、ＲＴＡを含む沈殿物の形成を減じる温度で、好まし
   くは溶液を冷凍させない十分な温度〜１０℃の範囲の温
   度で、段階（ａ）〜（ｆ）を、別々に又は組み合せて行
   なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１〜６項記載の方法によって産生
   されたリシン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ）。 ８、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、少なく
   とも９０重量％のＲＴＡを含有する、精製された組換え
   体リシン毒素Ａ鎖。 ９、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、少なく
   とも９５重量％のＲＴＡを含有する、精製された組換え
   体リシン毒素Ａ鎖。 １０、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、少な
   くとも９９重量％のＲＴＡを含有する、精製された組換
   え体リシン毒素Ａ鎖。