NO863424L - Fremgangsmaate for rensing av et interferon. - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for rensing av et fysiologisk aktivt polypeptid produsert ved en rekombinant DNA-teknologi uten denaturering eller spaltning med proteaser, idet angitte polypeptid nærmere bestemt er fremstilt av en mikroorganisme transformert med en plasmidvektor som bærer et gen som koder for et polypeptid med fysiologisk aktivitet. Oppfinnelsen tilveiebringer i særdeleshet en effektiv metode for rensing av et ønsket polypeptid fra en kulturblanding av en mikroorganisme som er i stand til å produsere et polypeptid med interferonaktivitet, spesielt humant immun (eller gamma) interferonaktivitet.

Kjent teknikk

Interferonproteiner er blitt klassifisert i tre

typer, alfa, beta og gamma (forkortet til IFN-cc, IFN-(3 og IFN-Tf) basert på antigeniske og strukturelle forskjeller. Gamma-interferon har et utall karakteristika som særpreger

det fra a- og [3-interferoner. Blant disse forskjeller er antigeniske karakteristika og større aktivitet med hensyn til immunoregulering og antitumoreffekt. Humant gamma-interf eron (her angitt som "h-IFN-7") kan produseres av T-lymfocytter stimulert av mutagener eller av antigener overfor hvilke de er sensibilisert. Det kan også erholdes gjennom kloning og ekspresjonsteknikker som nå er velkjente innen faget.

Nylig er det blitt mulig takket være fremskrittet

innen genteknikk å produsere mange fysiologisk aktive polypeptider fra mikroorganismer eller dyreceller selv om

disse substanser er blitt produsert ved separasjon og rensing fra en organisme. Det kan imidlertid hittil ikke sies at en metode er blitt etablert for ekstrahering og rensing av den beregnede substans med en renhet tilstrekkelig til å kunne anvendes for legemidler og uten å bevirke denaturer-

ing eller spaltning.

Erholdte gamma-interferon-holdige celler oppsamles imidlertid og opprives med forskjellige metoder slik som osmotisk sjokk, ultrasonisk vibrering, gnidning eller opprivning med høy skjærkraft, og den opprevne celle-gamma-interferonblanding bearbeides deretter for å isolere gamma-interf eronet . De uløselige bestanddeler separeres ved sentrifugering, og den gamma-interferon-holdige supernatant oppsamles for rensing.

Selv om det finnes beskrivelse av visse teknologier for slike produksjonsmetoder, f.eks. en metode for ekstrahering og rensing av polypeptidet produsert av rekombinant mikroorganisme ved anvendelse av guanidin-hydroklorid og urea (japansk patentpublikasjon 161321/1984 og US patentskrift 4 476 049) og en rensemetode under anvendelse av et monoklonalt antistoff (japansk patentpublikasjon 186995/1984) vil ikke den tilsiktede substans alltid bli tilstrekkelig renset uten å bli underkastet denaturering og uten at dets aktivitet tapes.

Europapatentsøknad 0 087 686 beskriver en tretrinns-prosess for rensing av humane immun-interferoner fra den cellefrie supernatant eller ekstrakt fra den urene inter-feronkilde. I det første trinn (for naturlig forekommende interferon) anvendes en affinitetskolonne slik som Concanavalin-A Sepharose<®>, etterfulgt av kromatografi på en carboxymethyl-silicakolonne under anvendelse av en økende saltgradient, og sluttelig på en silicagel-gjennomtreng-ningskolonne. Hvis tilstrekkelig renhet ikke erholdes, anvendes konsentrering og kromatografi på enten TSK- eller CM-kolonnen.

Europapatentsøknad 0 063 482 beskriver en renseprosess som gjør bruk av kromatografiske metoder under anvendelse av 1) glasskuler med regulerte porer; 2) Concanavalin-A Sepharose<®>; 3) Heparin-Sepharose<®>eller Procion rød-agarose; og 4) gelfilrering.

Europapatentsøknad 0 107 498 og 0 077 670 beskriver et rensesystem under anvendelse av 1) polyethyleniminutfelling; 2) pH-utfelling av bakterielle proteiner;

3) konsentrering og dialyse; 4) kromatografi på a) carboxy- methylcellulose; b) en calciumfosfatgel; c) en carboxy-methylcellulose; og d) gelfiltreringsharpikser.

Disse renseprosesser krever et flertall av trinn, fremkaller nedbrytning av interferonet ved nedbrytning eller aggregering av interferonmolekylet, eller resulterer på annen måte i et gamma-interferonprodukt som erholdes i lavt utbytte eller med lav aktivitet.

Det fremgår således at en metode for ekstrahering

og rensing av det tilsiktede polypeptid fra kulturblandingen av den tilsiktede substans-produserende mikroorganisme uten at aktiviteten av den tilsiktede substans tapes, og uten at den ledsages av en denaturering, er viktig for slike anvendt som farmasøytiske midler og at etablering av slik teknologi er nyttig ut fra et industrielt synspunkt.

En slik rensemetode har særlig vært ønsket for interferon hvis anvendelse i farmasøytiske midler nå er stadig økende. Interferoner har anti-virusaktivitet, men IFN-7er forventet å være åpenbart som et anti-tumor-

middel og immunregulator på grunn av dets særlig sterke cellevekstinhibering. Enn videre har interferonaktivitet flere spesifisiteter; når f.eks. interferon anvendes som et farmasøytisk middel, foretrekkes det å anvende interferon som stammer fra et menneske. Enn videre er det ønskelig å tilveiebringe prosesser for ekstraksjon og rensing av interferon fremstilt ved genteknikken.

Ved ekstraksjon og rensing av et polypeptid erholdt fra rekombinante mikroorganismer, drepes vanligvis først de dyrkede mikroorganismer ved anvendelse av et baktericid

(en nødvendig prosess fra et sikkerhetsmessig synspunkt) hvoretter de døde celler opprives og underkastes deretter ekstraksjon. I disse behandlinger denatureres enkelte ganger det tilsiktede polypeptid, og dets aktivitet kan tapes. Enn videre er disse behandlinger tilbøyelige til å aktivere proteaser innbefattet i cellene og enkelte ganger spalte det tilsiktede polypeptid.

En metode hvori et protein denaturert og oppløselig-gjort med et denaturerende middel slik som urea eller guanidin-hydroklorid ekstraheres og hvor det denaturerende middel fjernes under rensingen, er tidligere blitt be-

skrevet for polypeptider renset fra celler eller rekombin-

ante mikroorganismer (som beskrevet i japansk patentpublikasjon 161321/1984, US patentskrift 4 476 049). Imidlertid er det vanskelig sikkert å oppnå en fullstendig renaturering av det tilsiktede polypeptid selv om de denaturerende midler fjernes. Derfor er denne metode ikke foretrukket hvis det tilsiktede polypeptid anvendes som et farmasøytisk middel fordi det delvis denaturerte polypeptid når dette blandes,

kan bli et antigen. Ved den rensemetode som gjør bruk av et monoklonalt antistoff som også er blitt rapportert (som beskrevet i japansk patentpublikasjon 186995/1984) , kan det på den annen side tenkes at et denaturert og uønsket polypeptid eller et polymerisert polypeptid slik som dimer eller trimer, kan bindes til det monoklonale antistoff avhengig av den antigeniske determinant som gjenkjennes med det anvendte monoklonale antistoff. Nylig er en metode for ekstrahering av IFN-7 produsert med rekombinant Escherichia coli i nærvær av

en proteaseinhibitor med det formål å inhibere spaltning av polypeptid med protease blitt beskrevet i det ovenfor angitte US patentskrift, men det guanidin-hydroklorid som anvendes

der, er også kjent som et protein-denaturerende middel (se f.eks. japansk patentpublikasjon 161321/1984). Det er derfor forventet, selv om spaltningen av polypeptid med protease kan inhiberes, at produksjon av et denaturert protein også godt kan være et resultat.

Det ville enn videre være ønskelig å 1) tilveiebringe et rensesystem for å separere gamma-interferon fra celle-bestanddelene av de opprevne celler i hvilke gamma-interferonet var produsert; 2) separere gamma-interferon fra celleforurensningene i høyt utbytte og med høy renhet og aktivitet; 3) separere rekombinant gamma-interferon fra celleforurensningene; og 4) separere gamme-interferon fra celleforurensningene uten vesentlig nedbrytning av interferonet. Den renseprosess som er beskrevet i det etter-følgende,~r en slik prosess.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Rensemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer effektivt et polypeptid med den tilsiktede fysiolog-iske aktivitet i hovedsakelig ren form, og som inhiberer spaltningen av polypeptidet med protease og som unngår denaturering av polypeptidet. Selv om foreliggende oppfinnelse vil muliggjøre rensing av et polypeptid med h-IFN-?-aktivitet, er enn videre fremgangsåten ifølge oppfinnelsen også anvendbar for ekstraksjon og rensing av andre polypeptider enn h-IFN-7som har et sete som er ømfintlig overfor proteasespaltning slik som Arg-Lys og Arg-Arg, og som produseres av rekombinante mikroorganismer.

Ved foreliggende oppfinnelse løses de ovenfor beskrevne problemer ved tilsetning av ett eller flere salter av zink eller kopper og polyethylenimin (forkortet til PEI)

i ekstraksjonsprosessen. Nærmere bestemt omfatter oppfinnelsen suspendering av kulturcellene av en rekombinant mikroorganisme i en bufferløsning inneholdende ett eller flere salter av zink eller kopper, opprivning av cellene og deretter tilsetning av PEI til den sentrifugerte supernatant, hvorpå den underkastes en egnet renseprosess.

Forskjellige forbindelser som kan anvendes som saltene av zink eller kopper, innbefatter zinkklorid, zinksulfat, zinkacetat, zinkacetylacetonat og koppersulfat,

men zinkklorid, zinkacetat og koppersulfat er foretrukne. Det er forskjeller i den optimale konsentrasjon av salt avhengig av den peptid-produserende stamme, men den er generelt i området på 0,5 - 5 mM, fortrinnsvis 1 - 3 mM når det gjelder zinksalter, og 0,01 - 3 mM, fortrinnsvis 0,25 -

1 mM når det gjelder koppersalt.

Disse salter blandes med en bufferløsning i den ovenfor beskrevne konsentrasjon, kulturcellene suspenderes i den resulterende løsning og opprives deretter, og supernatanten erholdes ved sentrifugering. PEI tilsettes til supernatanten for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,5 - 1,1%. Tilsetningen av PEI virker også til å utfelle en be-tydelig mengde av urene proteiner. Etter PEI-tilsetningen

tillates supernatanten å stå ved en lav temperatur,

f.eks. rundt 4°C. Etter sentrifugering for å fjerne ut-fellingene renses den ønskede substans ved en konvensjonell metode. Rensingen kan hensiktsmessig utføres ved kombin-asjon av flere kolonner og dialyser. I enkelte tilfeller kan utsaltning være involvert i prosessen. Spesifikke ut-førelsesformer forklares i det etterfølgende i eksemplene.

Før foreliggende oppfinnelse har det vært rapportert om tilsetning av et zinksalt til kulturmediet i IFN-G-produksjon med det for øye å øke produktiviteten (japansk patentpublikasjon 146597/1984). Denne rapport var imidlertid beregnet på å øke produksjonen i titer under dyrkningen og beskriver ikke tilsetning av saltet sammen med PEI i ekstraksjonstrinnet slik som ved foreliggende oppfinnelse. Med hensyn til anvendelse av kopperforbindelser i renseprosessen er et eksempel på anvendelse av en kopper-chelat-harpikskolonne beskrevet i japansk patentpublikasjon 167597/1984. Denne oppfinnelse angikk imidlertid en rensemetode for en preliminært renset IFN-løsning. Tidligere rapporter slik som de ovenfor angitte oppfinnelser, er vesentlig forskjellige fra foreliggende oppfinnelse som erkarakterisert vedtilsetning av saltene i ekstraksjonstrinnet med det formål å foreta en rensing uten å forår-sake denaturering eller spaltning av et protein. Et annet mål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et hovesake-lig rent polypeptid med h-IFN-7-aktivitet som kan erholdes ved rense- og ekstraksjonsmetoden ifølge oppfinnelsen.

Konstruksjonen av W3110/pIN5T4 som er en av stammene som er i stand til å produsere et polypeptid med h-IFN-7'-aktivitet, er beskrevet i Europapatentsøknad 0 134 673. Polypeptidet produsert av denne stamme, kalles G1F146 og

er representert ved følgende aminosyresekvens (I).

Den GIFl46-produserende stamme er Escherichia coli W3110 transformert med en plasmidvektor som bærer et DNA-fragment som koder for det ovenfor beskrevne GIF146 og representert ved DNA-sekvensen (II).

På den annen side kan stammen (W31lO/pIN5T4Nl43) som er i stand til å produsere et polypeptid med h-IFN-?-aktivitet og representert ved følgende aminosyresekvens (III), fremstilles som forklart i det etterfølgende under henvisning til eksemplene. Dette polypeptid er angitt som GIF143.

I denne aminosyresekvens betegner Gin<*>Gin eller p-Gln.

Enn videre kan DNA-fragmentet vise ved etterfølgende DNA-sekvens som koder for polypeptidet (GIF143), anvendes for produksjon av den tilsiktede plasmidvektor.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en figur som illustrerer konstruksjons-skjemaet av plasmidvektor pIN5T4N143 anvendt for trans-formasjon av Escherichia coli for å produsere GIF143 som vil bli renset ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Figur 2 er et flytdiagram av en foretrukket utfør-elsesform av gamma-interferon-renseprosessen ifølge oppfinnelsen . Figur 3 er et flytdiagram av en mer foretrukket utførelsesform av denne renseprosess som viser primært kromatografiske rensemetoder. Figur 4 er et flytdiagram av en særlig foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 5 er et fotografi som viser proteinbåndene av SDS-PAGE erholdt ved opprivning av cellene (W3110/ pIN5T4Nl46) i en bufferløsning inneholdende en forskjellig

konsentrasjon av zinkklorid og underkastelse av supernatanten for SDS-PAGE.

Figur 6 er et fotografi som viser proteinbåndene

av SDS-PAGE erholdt ved anvendelse av koppersulfat istedenfor zinkklorid.

Figur 7 er et fotografi som viser proteinbåndene av

SDS-PAGE erholdt ved opprivning av cellene (W31lO/pIN5T4Nl43) i en bufferløsning inneholdende en forskjellig konsentrasjon av zinkklorid og underkastelse av supernatanten for SDS-PAGE.

Fremstillingen forklares under henvisning til fig. 1 hvori DNA-fragmentet erholdt ved Aatll- og Bglll-oppslutning av pGIF4 som er hovedsakelig samme plasmid som pGIF4 beskrevet i japansk patentpublikasjon 201995/1983, ytterligere behandles med Avall for å oppnå et Avall-Bglll DNA-fragment som vist i fig. 1. Deretter erholdes det tilsiktede plasmid pIN5T4Nl43 ved innføring i nærvær av en DNA-ligase av et syntetisk linker DNA-fragment representert ved

mellom et Avall-sete av det ovenfor angitte Avall-Bglll-fragment og et EcoRI-sete av et lengre DNA-fragment som bærer et tetracyclinresistent gen (TC ) som erholdes ved behandling av pIN5T4 (beskrevet i Europapatentsøknad 0 134 673) med Bglll og EcoRI. Det resulterende plasmid inneholder et gen som koder for et polypeptid GIF143 svarende til GIF146 fra hvilket en sekvens på 3 aminosyre-rester, dvs. Cys-Tyr-Cys ved N-enden av GIF146 er eliminert. Deretter transformeres en vert (E. coli W3110) med plas-midet i henhold til en konvensjonell metode under dannelse av et GIF-produserende transformert Escherichia coli (W3110/pIN5T4N143).

I alle figurer starter renseprosessen med fjerning av nucleinsyrer fra supernatanten resulterende fra sentrifugering av homogeniserte gamma-interferon-holdige celler, idet tidligere trinn er vist for klarhetens skyld, men som ikke utgjør noen del av foreliggende oppfinnelse.

Selv om en rensing vil bli beskrevet under anvendelse av zinkklorid som zinksaltet i eksemplene, er oppfinnelsen ikke begrenset til dette salt. Salter av zink slik som zinksulfat og zinkacetat og salter av kopper slik som koppersulfat, anvendes også fortrinnsvis. Tabell I viser den protease-inhiberende effekt av forskjellige metallsalt-forbindelser som ble undersøkt ved opprivning av celler av de rekombinante bakterier i bufferløsninger inneholdende 1 mM eller 0,2 mM av den metalliske forbindelse og måling av stabiliteten av et polypeptid med h-IFN-7-aktivitet inneholdt i supernatantvaesken som en indikator på effekten.

Som angitt i tabell I, ble det funnet at zinksulfat, zinkacetat, zinkacetylacetonat og koppersulfat ga den ønskede effekt såvel som zinkklorid.

Fig. 5 (fotografi) er et SDS-PAGE mønster som viser stabiliteten av polypeptidet med h-IFN-Y-aktivitet (båndet av proteinet er vist ved en pil merket som GIF146 i figuren). Testprøvene ble fremstilt ved å opprive cellene 1 en ønsket buffer inneholdende en forskjellig konsentrasjon av zinkklorid. I fig. 5 kan det sees at polypeptidet som utviser h-IFN-7-aktivitet, er stabilt i nærvær av 0,5 mM - 2 mM zinkklorid og ømfintlig overfor spaltning i fravær av eller ved lavere konsentrasjon av zinkklorid. Båndet av proteinet vist ved en pil "B", viser polypeptidet erholdt ved spaltning av GIF146 med protease under renseforløpet. Prøven vist ved 2-1, ble fremstilt ved den ovenfor beskrevne behandling under anvendelse av 2 mM ZnC^ og deretter å foreta ytterligere rensing. Prøven vist ved 2-2, ble fremstilt ved å foreta rensingen etter behandlingen uten anvendelse av ZnC^. Resultatene av en lignende forsøksserie hvori koppersulfat ble anvendt istedenfor zinkklorid, er vist i fig. 6 (fotografi). I dette tilfelle observeres de ønskede resultater i området 0,1 mM - 4 mM. Selv om disse salter viser tilstrekkelig proteaseinhibering med høyere konsentrasjoner, anvendes de fortrinnsvis i så lav konsentrasjon som mulig på grunn av nødvendigheten av å fjerne disse i renseprosessen. Det foretrekkes at zinkklorid anvendes i området 1 - 3 mM og koppersulfat i området 0,25 - 1 mM.

Fig. 7 (fotografi) ble erholdt med hensyn til en prøve fremstilt ved behandling av GIFl43-produserende bakterier på samme måte som for fig. 5. I figuren er båndet av proteinet vist ved en pil angitt som GIFl43-polypeptidet med h-IFN-Tf-aktivitet, og "E" viser polypeptidet erholdt ved delvis spaltning GIF143 med protease.

De primære klasser av forurensninger i den opprevne celle/gamma-interferonblanding er partikkelformede bestanddeler med liten partikkelstørrelse og vannløselige fraksjoner slik som nucleinsyrer, proteaser, celleproteiner, carbohydrater, lipider, splittede interferonfragmenter og interferonaggregater og andre fragmenter resulterende fra opprivning av cellen i hvilken interferonet ble produsert. Det er nå funnet at gamma-interferon kan erholdes med høy renhet ved bibeholdelse av biologisk aktivitet og med gode utbytter, ved bearbeidelse av interferon-holdige blandinger i en spesifikk rekkefølge som beskrevet i det etterfølgende, for å nedsette nedbrytningen av interferonet til et minimum og for å fjerne forurensningene fra den interferon-holdige blanding i en definert rekkefølge.

Vesentlig forbedret renhet og aktivitet erholdes ved fjerning av forurensningene i den interferon-holdige blanding i følgende rekkefølge: 1) nucleinsyrer; 2) negativt ladede proteaser og forurensende celleproteiner; 3) positivt ladede proteaser og forurensende celleproteiner; og

4) splittet og aggregert interferon.

Denne sekvens av trinn er kritisk for oppnåelse av

de ønskede resultater ifølge oppfinnelsen. Forutsatt at de angitte forurensninger fjernes i den spesifiserte sekvens, kan ytterligere trinn anvendes for å fjerne andre forurensende materialer slik som høymolekylære, hydrofobe materialer hvis slike er til stede. Disse andre materialer kan hensiktsmessig fjernes enten etter trinn 3 eller etter trinn 4.

Det finnes utallige metoder, kjent innen faget, for

å bevirke hver av disse separasjoner. Som ovenfor angitt, er de metoder som kan bevirke separasjonene under de mildeste betingelser, for å minimalisere nedbrytning av interferonet, de mest ønskelige.

Det er funnet at en foretrukket metode er å anvende en begynnelses-polyethyleniminutfelling etterfulgt av flere kromatografiske separasjoner for å fjerne forurensningene i den ovenfor spesifiserte rekkefølge. Harpiksene anvendt i de kromatografiske separasjoner og deres anvendelsesrekke-følge, er som følger: 1) anionbytteharpiks;

2) kationbytteharpiks; og

3) molekylsil.

I tillegg til de kromatografiske separasjoner er det nyttig å anvende utfelling, filtrering, konsentrering og dialyseprosedyrer.

I en foretrukket prosedyre underkastes den gamma-interf eron-holdige blanding følgende prosedyrer: 1) nucleinsyrefjerning under anvendelse av polyethyleniminutfelling; 2) fjerning av negativt ladet protease og forurensende celleprotein under anvendelse av svakt basisk anion-bytte rharpiks. 3) fjerning av positivt ladet protease og forurensende celleprotein ved anvendelse av svakt sure kationbytterharpiks; og 4) fjerning av splittet og aggregert interferon og cellefragment under anvendelse av en molekylsil.

Filtrering etter hvert trinn, konsentrering etter trinn 3 og/eller 4 og dialyse etter trinn 5, er anvendbare tilleggsprosedyrer.

Denne nye prosedyre har gjennomført produsert gamma-interferon med en renhet på minst 95% og et utbytte over 5%.

Et viktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er det nye renseskjema som er egnet for anvendelse med gamma-interferon produsert på hvilket som helst av et utall måter slik som fra humane celler dyrket i vevkultur, fra leukocytter oppsamlet fra blodprøver eller via klonings-teknikker velkjente innen faget. Renseskjemaet er særlig godt egnet for rensing av rekombinant gamma-interferon gjenvunnet fra E. coli-celler. Cellene inaktiveres ved en av standardmetodene slik som ved tilsetning av et kjemisk avlivningsmiddel slik som klorhexidingluconat. De inaktiverte celler sentrifugeres, resuspenderes i en buffer og homogeniseres. En hensiktsmessig metode for homogenisering av de gamma-interferon-holdige celler er opprivning under anvendelse av høye skjærkrefter under anvendelse av en Manton-Gaulin homogenisator. Komponentene av de opprevne celler separeres ved sentrifugering i et bunnfall og supernatant. Supernatanten fra denne prosess er en egnet kilde for gamma-interferon for å isoleres og renses ved den her beskrevne metode.

Suspensjonen av de lyserte celler omfatter proteiner, lipider, carbohydrater og nucleinsyrer og uløselige cellu-lære bestanddeler. Under anvendelse av konvensjonelle prosedyrer separeres de vannuløselige komponenter fra den vannløselige fraksjon av cellen som blir tilbake i supernatanten .

Det er enkelte ganger ønskelig å tilveiebringe visse preliminære bearbeidelsestrinn før ekstrasjonen av gamma-interferon fra cellene slik som prosedyrer for å nedsette nedbrytning av interferon under bearbeidelsen til et minimum. Ethvert slikt preliminært bearbeidelsestrinn kan anvendes forutsatt at det ikke innvirke på det her beskrevne rense-skjerna.

Flertrinns-renseskjemaet gir glimrende utbytter av rent interferon mens den biologiske aktivitet opprettholdes. Sekvensen av separasjonstrinn er meget signifikant og er kritisk når det gjelder å oppnå de beskrevne, ønskede resultater.

Rekkefølgen for fjerning av forurensningene fra den interferon-holdige blanding er som følger: a) fjerning av nucleinsyrer; b) fjerning av negativt ladede proteaser og forurensende celleprotein; c) fjerning av positivt ladede proteaser og forurensende celleprotein; d) fjerning av lav- og høy-molekylære forurensninger, spaltet interferon og interferonaggregater.

Av årsaker som for tiden ikke er kjent, er fjerning av urenheter i den angitte rekkefølge kritisk når det gjelder å oppnå høye utbytter av renset gamma-interferon med bibeholdelse av biologisk aktivitet. De individuelle trinn anvendt for fjerning av hver klasse av urenheter, er konvensjonelle og kjent innen faget. På grunn av gamma-interferons tendens til å spaltes eller aggregere til inaktive former under strenge bearbeidelsesbetingelser fore trekkes rensetrinn som kan utføres under de mildeste be-arbeide Ise sbe tinge Iser .

Oppfinnelsen beskrives ytterligere under anvendelse av spesifikke bearbeidelsestrinn og betingelser som er blitt funnet å nedsette nedbrytning av interferon til et minimum, men det skal erkjennes at andre konvensjonelle bearbeidelsestrinn kan anvendes istedenfor de som er beskrevet, forutsatt at sekvensen av fjerningen av urenheter forblir som beskrevet.

Med mindre annet er angitt i den etterfølgende beskrivelse, kan pH-verdiene generelt variere - 0,5, fortrinnsvis i området 0,25 og helst - 0,1. Ledningsevne-målinger kan generelt variere - 5 mS og holdes fortrinnsvis i området - 3 mS. Operasjonene utføres ved en temperatur i området fra 2 til 15°C.

Det første trinn i bearbeidelsesskjemaet innbefatter fjerning av nucleinsyrer. Denne fjerning utføres hensiktsmessig ved tilsetning av polyethylenimin til supernatanten fra den sentrifugerte blanding av lyserte gamma-interferon-holdige celler. Alternativt kan polyethyleniminløsningen tilsettes før homogenisering av cellene om ønsket. Polyethyleniminet tilsettes langsomt under omrøring til en maksimumkonsentrasjort på 0,8%, og blandingen tillates å avleire i et egnet tidsrom, generelt i området fra 30 til 90 minutter. Blandingen sentrifugeres deretter, og supernatanten oppsamles. Glimrende resultater erholdes når polyethyleniminet tilsettes som en 10% (v/v) løsning i H20

i en mengde tilstrekkelig til å resultere i polyethylenimin bestående av fra 0,7 til 0,8% (v/v) av den totale løsning. pH på løsningen er 8 - 0,5, fortrinnsvis 0,1, og temp-eraturen holdes i området fra 2 til 15°C. Proteinkonsentrasjonen i supernatanten bestemmes ved dette trinn og ved hvert ytterligere bearbeidelsestrinn ved standard Coomassie blå bindingsbestemmelse.

En annen prosedyre for fjerning av nucleinsyren er ved anvendelse av kromatografi på hydroxyapatitt eller immobilisert PEI. Utfelling med protaminsulfat er en annen

anvendbar prosedyre.

Etter fjerning av nucleinsyrene underkastes den gamma-interf eron-holdige blanding et første protease-fjernings-trinn. Den mest hensiktsmessige metode for fjerning av proteasene er ved kromatografi av supernatanten fra nuclein-syre-fjerningstrinnet under anvendelse av en anionbytterharpiks. Kvartær aminomethyl, blandet amin eller annen intermediær baseharpiks eller en svak baseharpiks slik som p-aminobenzylcellulose, er særlig anvendbar.

Kvartær aminoethyl er en foretrukket anionisk bytter-harpiks. Det kvartære aminomethyl kan være bundet til en tverrbundet dextran-, cellulose-, agarose-eller acrylbærer.

pH på supernatantvæsken justeres til 8,7 - 0,5, fortrinnsvis - 0,1, under anvendelse av natriumhydroxyd eller en hvilken som helst annen egnet base. Løsningens ledningsevne justeres til under 10 mS, fortrinnsvis i området fra 4 til 8 mS ved tilsetning av avionisert 1^0.

Elueringsbufferen omfatter 20 mM natrium-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-propansulfonat og 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol. pH på bufferen justeres til ca. 8,7 med natriumhydroxyd eller annen base. Andre buffere egnet for anvendelse i samme pH-område kan anvendes istedenfor piperazinderivatet, og andre antioxydanter kan anvendes istedenfor mercaptoethanol.

Den kvartære aminoethylkolonne ekvilibreres på forhånd med bufferløsningen, den gamma-interferonholdige løsning tilsettes, og det adsorberte materiale elueres med samme buffer. De første to tredjedeler av den eluerte protein-løsning, dvs. de første to tredjedeler av volumet, oppsamles for overføring til neste rensetrinn. Den gjenværende tredjedel av eluatet kan rekromatograferes på samme kolonne ekvilibrert på lignende måte. Tilnærmet de første to tredjedeler av proteingjennomstrømningen oppsamles igjen. Den gjenværende løsning kan ytterligre bearbeides på samme måte. Som tidligere angitt, bestemmes proteinkonsentrasjonen ved en Coomassie blå bindingsbestemmelse.

Et eventuelt konsentreringstrinn kan anvendes ved dette punkt av rensingen. En hensiktsmessig metode for konsentrering av løsningen er utfelling med ammoniumsulfat. Eluatet fra den kvartære aminoethylkolonne føres gjennom

et 0,2^u filter, og ammoniumsulfat tilsettes til en sluttkonsentrasjon på fra 40 til 60% metning under omrøring i et tidsrom på 5-10 minutter. Suspensjonen tillates å stå i flere timer på et isbad. Bunnfallet oppsamles deretter ved sentrifugering og kan lagres ved ca. -20°C inntil dette kreves for ytterligere bearbeidelse.

Når nødvendig oppløses bunnfallet i en løsning omfattende 20 mM tris-HCl og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på ca. 7,5 som på forhånd er blitt ført gjennom et filter med molekylvektavbrytning på 10.000. Ledningsevnen av løsningen nedsettes til fra 3 til 5 mS ved tilsetning av en løsning omfattende 10 mM tris-HCl og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på tilnærmet 7,5. Løsningen føres gjennom et filter på 0, 2j- a og er klar for ytterligre bearbeidelse. Andre buffere egnet for anvendelse i samme pH-område kan anvendes istedenfor tris-HCl, og andre antioxydanter kan anvendes istedenfor mercaptoethanol.

De positivt ladede proteaser og andre proteiner i løsningen fjernes i neste bearbeidelsestrinn som hensiktsmessig utføres under anvendelse av en kationbytterharpiks.

Glimrende resultater er blitt oppnådd under anvendelse av en carboxymethylkationbytterharpiks (carboxymethyl) bundet til tverrbundet dextran, cellulose, agarose eller acrylbærer). pH på løsningen fra det foregående bearbeidelsestrinn justeres til ca. 7,5 under anvendelse av HC1 eller annen egnet syre. 2-mercaptomethanol eller annen egnet antioxydant tilsettes til en konsentrasjon på 0,1% (v/v). Avionisert vann inneholdende 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol tilsettes også for å redusere ledningsevnen til under 20 mS, fortrinnsvis til området 3-5 mS. Løsningen filtreres gjennom et 0,2^u filter ved prepareringen for den etterfølg-ende kromatografi.

Kationbytterharpikskolonnen ekvilibreres med en egnet buffer slik som en løsning omfattende 20 mM tris-HCl og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på ca. 7,5. Etter kolonne-ekvilibreringen ved vasking av kolonnen to eller tre ganger med den ekvilibrerende buffer og tilsetning av gamma-interferon elueres løsningen med ca. 13 til 15 kolonnevolumer av en gradient av natriumklorid oppløst i den ekvilibrerende buffer. Natriumkloridinnholdet økes fra 0 til et maksimum på ca. 0,5 M i bufferen.

Egnede fraksjoner oppsamles og kan analyseres ved gel-elektroforese (SDS-PAGE), analytisk HPLC og antiviral aktivitet. De reneste fraksjoner oppsamles for ytterligere bearbeidelse. Fraksjonene inneholdende interferon med lavere renhet, kan utfelles med ca. 40 til 60% mettet ammoniumsulfat, oppløses på nytt, filtreres og rekromatograferes på en carboxymethylkolonne som tidligere beskrevet. Fraksjoner oppsamlet fra den rekromatograferte løsning, analyseres, og de reneste fraksjoner oppsamles med fraksjonene erholdt fra første carboxymethyleluering.

Hvis nærvær av høymolekylære, hydrofobe urenheter påvises ved SDS-PAGE eller andre egnede prosedyrer, underkastes eluatet en eventuell kromatografi for å fjerne slike forurensninger ved dette trinn i renseprosessen. En fenylharpiks er blitt funnet å gi tilfredsstillende resultater. Octyl-og butylharpikser kan også anvendes. Løsningen fra det foregående bearbeidelsestrinn filtreres gjennom et 0,2^u filter, og natriumklorid tilsettes (0,5 - 0,75 M) for å heve ledningsevnen på løsningen til ca. 50 til 75 mS.

Bufferen er en løsning omfattende 20 mM tris-HCl, 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol og 500 til 850 mM, fortrinnsvis 500 til 700 mM, natriumklorid eller annet salt for å øke ledningsevnen til det egnede område.

Kolonnen pre-ekvilibreres med bufferen, og prøven fylles på kolonnen. Fra ca. 2 til 4 kolonnevolumer av bufferløsningen tilsettes til kolonne. Det adsorberte materiale elueres deretter med minst én og fortrinnsvis fra 5 til 10 kolonnevolumer av en løsning omfattende 20 mM tris-HCl, 100 mM NaCl og 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol ved en pH på ca. 7,5. Passende sorterte fraksjoner oppsamles og ana lyseres under anvendelse av SDS-PAGE, analytisk HPLC og antiviral aktivitet. De reneste fraksjoner oppsamles.

Det er generelt ønskelig å konsentrere den interferon-hoIdige løsning etter feny1-kolonnekromatografien. Det er også generelt ønskelig å konsentrere den interferon-holdige løsning ved dette trinn i de tilfeller hvori det eventuelle hydrofobe kolonnekromatografitrinn ikke er blitt anvendt.

Proteinkonsentrasjonen av løsningen bestemmes ved Coomassie blå bindingsbestemmelse. Hvis proteinkonsentrasjonen er bestemt til å være mindre enn 0,2 mg/ml, konsentreres løsningen fortrinnsvis ved ultrafiltrering under anvendelse av en membram med en avbrytelse på en molekylvekt på 10.000.

Ytterligere konsentrering kan utføres ved tilsetning av ammoniumsulfat til løsningen til en slutt-ammoniumsulfat-konsentrasjon på fra 40 til 60% metning under omrøring i løpet av 5 til 10 minutters periode. Suspensjonen tillates å stå på et isbad hvoretter bunnfallet oppsamles ved sentrifugering. Bunnfallet oppløses på nytt i en løsning omfattende 20 mM tris-HCl, 500 mM natriumklorid og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på 7,5 som på forhånd er blitt filtrert gjennom et filter med en molekylvektavbrytelse på 10.000. Den konsentrerte løsning føres gjennom et 0,2^u filter ved prepareringen for neste rensetrinn.

Lav- og høy-molekylære urenheter og spaltet gamma-interferon og interferonaggregater fjernes i et sluttelig kromatografisk rensetrinn ved å føre den gamma-interferon-holdige løsning fra det foregående bearbeidelsestrinn gjennom en gelfiltreringsharpiks. Den hydrofile filtreringsgel virker som en molekylsil for å separere fraksjoner med egnet størrelse fra høy- og lav-molekylære urenheter inneholdt i løsningen. En særlig anvendbar filtreringsgel er en tverrbundet dextranbasert gel, identifisert ved vare-merket Sephadex<®>G-100, fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals. Harpiksen har et fraksjonsmolekylvektområde på 4.000 til 150.000 for globulært protein og peptider, og 1.000 til 100.00 for polysaccharider. Andi^harpikser med avbrytningsområder på fra 1.000 til 200.000 for proteiner kan også anvendes.

Sephadex<®>G-100 harpikskolonnen preekvilibreres med

en bufferløsning omfattende 20 mM tris-HCl, 500 mM NaCl og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på ca. 7,5. Det adsorberte materiale elueres med bufferen, og egnede fraksjoner oppsamles. Proteinkonsentrasjonen av hver fraksjon bestemmes ved Coomassie blå bindingsbestemmelse. Fraksjonene kombineres på basis av renhet som bestemt ved SDS-PAGE, analytisk HPLC

og antiviral aktivitet.

Alternativt kan bunnfallet fra ammoniumsulfatkonsen-treringstrinnet oppløses i en bufferløsning på 20 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid og 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol ved en pH på ca. 7,5. Den gamma-interferon-holdige løsning fylles på en Sephacryl<®>S-200 gelfiltreringskolonne, preekvilibrert med samme buffer (Sephacryl<®>S-200 er et vare-merke til Pharmacia Fine Chemicals for en harpiks av agarose tverrbundet med acrylamid). Sluttproduktet er en klar til svakt blakket løsning, farveløs til lys gul i farve. Den tilsynelatende molekylvekt bestemt ved SDS-PAGE er i området 17.000 til 19.500.

Det rensede gamma-interferon dialyseres mot en buffer før bruk. En egnet buffer omfatter 20 mM natriumfosfat og 6 mM L-cystein ved en pH på ca. 6,8. En annen egnet buffer er 15 mM natriumfosfat, 8 mM natriumcitrat og 6 mM L-cystein HC1 ved en pH på 5,0. Det er fordelaktig å fortsette å dialysere i 8 timer eller mer og kontinuerlig spyle nitrogen gjennom systemet for å nedsette oxydasjonen til et minimum.

Om nødvendig, kan den rensede gamma-interferonløsning konsentreres på den ovenfor beskrevne måte.

Oppfinnelsen forklares i det etterfølgende under henvisning til referanseeksemplet og arbeidseksempel 1-3.

Referanseeksempel: ( konstruksjon av GIF143 ekspresjonsvektor)

En GIF143 ekspresjonsvektor ble fremstilt i henhold til følgende prosedyre.

pGIF54 (et plasmid ekvivalent med pGIF4 som bærer et

gen som koder for GIF146) ble erholdt fra WA802/pGIF54 som var en dem Escherichia coli transformant (en stamme som mangler methylering av cytosin) i henhold til en konvensjonell metode. 5^ug pGIF54 ble behandlet med 20 enheter Aatll og 20 enheter Bglll under dannelse av et DNA-fragment på ca.

600 basepar som bærer en del av GIF146 gen og en lac UV5 promoter. Deretter ble 0,5^,ug av DNA-fragmentet spaltet under anvendelse av 5 enheter Avall under dannelse av fragmentet på ca. 400 basepar som bærer en del av GIF146 gen. På den annen side ble 5^ug pIN5T4 oppsluttet under anvendelse av 20 enheter EcoRI og 20 enheter Bglll under dannelse av DNA-fragmentet som bærer et tetracyclin-resistent gen, lpp promoter, og et replikasjonsinitieringssete. Både DNA-fragmentet og 0,5^ug av den kjemisk-syntetiserte linker vist i fig. 1 (syntetisert under anvendelse av en DNA-syntetisator; Applied Biosystems 380A) ble underkastet blandet-ligering under dannelse av pIN5GN143. W3110 ble transformert med det erholdte pIN5T4N143 ved en konvensjonell metode, f.eks. den metode som er beskrevet i japansk patentpublikasjon 63395/1983 under dannelse av W3110/pIN5T4N143.

Det ble bekreftet at den erholdte transformant var en GIFl43-produserende stamme ved følgende prosedyrer.

W3110/pIN5T4Nl43 ble dyrket under rysting i 1,5 ml

av et medium inneholdende polypepton 3%, gjærekstrakt 2%, glucose 2%, KH2P040,5%, MgS04-7H20 0,010% og tetracyclin 20 ug/ml i et 16,5 mm testrør ved 30°C (OD66Q= 8), 0,5 ml av kulturblandingen ble overført til en Eppendorf kopp på 1,5 ml og sentrifugert for å oppsamle cellene 10.000 opm i 5 minutter) . Cellene ble suspendert i 0,5 ml PBS-løsning

(0,8% NaCl, 0,02% KC1, 0,115% Na2HP04, 0,02% NaH2P04) inneholdende 1 mg/ml lysozym ImM-EDTA og ble omsatt ved 0°C i 30 minutter. Cellene ble deretter opprevet ved gjentatt frysning-opptiningsbehandling 3 ganger, og supernatantfraksjonen ble gjenvunnet ved sentrifugering (10.000 opm i 10 minutter). Supernatantfraksjonen ble undersøkt for anti-virusaktivitet i henhold til den metode som er beskrevet i japansk patentpublikasjon 201995/1983. Som et resultat ble

en anti-virusaktivitet på 6 x 10 4 enheter/ml erkjent.

Cellene erholdt ved oppsamling på samme måte som ovenfor angitt, ble på den annen side oppløst i 200 ul av en SDS prøveløsning (10 mM fosfatbufferløsning inneholdende 7 M urea, 1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, pH 7,2) og ble der-

etter oppvarmet på et kokende vannbad i 10 minutter. Den resulterende prøve (20 ul) ble isolert med 13% SDS-PAGE og underkastet proteinbeising med Coomassie blått R250. Som et resultat av dette ble det bekreftet at GIF143 protein (molekylvekt ca. 18 kd) i et utbytte svarende til ca. 20%

av det totale protein av Escherichia coli, ble produsert.

Eksempel 1

Ekstraksjon og rensing av GIF146

W31lO/pIN5T4 som var en GIF146-produserende stamme, ble dyrket med gjennomluftning og rysting i et medium inneholdende 3% polypepton, 2% gjærekstrakt, 2% glucose,

0,5% KH2P04, 0,01% MgS047H20 og 20 ug/ml tetracyclin i 24 timer. Cellene av kulturblandingen ble fullstendig avlivet med klorhexidingluconat og sentrifugert (8.000 opm i

10 minutter) under dannelse av 800 g W3110/pIN5T4 våte celler. Disse ble suspendert i 5,1 liter av en avkjølt 20 mM tris-HCl-buffer (heretter forkortet til "THB") med en pH på 7,4

og inneholdende lmM ZnCl2, ble opprevet ved at disse ble underkastet en homogenisator M15 (fremstilt av Manton Gaulin Co., Ltd.), ble avkjølt med is og deretter sentrifugert (7.000 opm i 20 minutter) under dannelse av supernatanten. Til supernatanten ble tilsatt en vandig 15% løsning av polyethylenimin (heretter forkortet til "PEI") med en pH på 8,0 justert med HC1 slik at det ble oppnådd en sluttkonsentrasjon på 0,75%. Den resulterende løsning ble omrørt i 10 minutter og fikk stå ved 4°C i 2 timer. Det dannede bunnfall ble fjernet ved sentrifugering (7.000 opm i 20 minutter) under dannelse av 4,7 1 supernatant. Supernatanten ble underkastet en QAE Sephadex<®>A-25 (fremstilt av Pharmacia Co., Ltd.) kolonne ekvilibrert med en 20 mM N-2-hydroxyethylpiperazinyl-N'-3-propansulfonatbuffer

(EPPS buffer) med pH 8,6 under dannelse av den ikke-absorberte fraksjon. Den erholdte fraksjon ble deretter underkastet en CM Sepharose<®>CL6B (fremstilt av Pharmacia Co., Ltd.) kolonne ekvilibrert med 20 mM THB med pH 7,4 inneholdende 0,1% 2-mercaptoethanol (heretter forkortet til "2-ME"), og den aktive fraksjon absorbert på kolonnen, ble eluert med en lineær konsentrasjonsgradient på 0 til 0,5 M NaCl for å oppsamle fraksjoner som hadde en høy interferonaktivitet. Interferonaktiviteten ble målt i henhold til den metode som er beskrevet i japansk patentpublikasjon 201995/1983. Ammoniumsulfat ble deretter tilsatt til fraksjonen for å oppnå en 50% metning, og en utsaltning ble deretter utført etterfulgt av sentrifugering ved 7.000 opm i 20 minutter under dannelse av bunnfallet. Bunnfallet ble oppløst i en 20 mM natriumfosfatbuffer (heretter forkortet til "20 mM PBS") med pH 7,4 inneholdende 0,3% NaC og 0,1% 2-ME og ble underkastet en Sephacryl<®>S-200 (fremstilt av Pharmacia Co., Ltd.) kolonne ekvilibrert med samme bufferløsning under dannelse av 298 mg polypeptid svarende til GIF146 som et sluttelig renset produkt (den spesifikke aktivitet av interferon: 1,6 - 1,7 x 10<6>/mg). Analyse av polypeptidet med SDS-PAGE viste mer enn 99% renhet, og posisjonen av båndet ved samme SDS-PAGE var i overensstemmelse med det av GIF146 som ikke var spaltet. Enn videre ble det bekreftet at det erholdte polypeptid hadde den samme aminosyresekvens som aminosyresekvens (I) ved aminosyreanalyse. Dette viser anvendeligheten av rensemetoden ifølge oppfinnelsen .

Når Sephadex<®>G-100 (fremstilt av Pharmacia Co., Ltd.) ble anvendt istedenfor Sephacryl<®>S-200 anvendt i tidligere beskrevne renseprosess, ble lignende resultater erholdt.

Eksempel 2

Rensing og ekstraksjon av GIF143

På samme måte som beskrevet i eksempel 1, ble W3110/pIN^T4Nl43 (se referanseeksemplet) dyrket, og cellene ble avlivet med klorhexidingluconat og oppsamlet. De våte celler (300 g) ble suspendert i 2,1 liter 20 mM THB (pH 7,4) inneholdende 3 mM ZnCl2og ble opprevet ved homogenisering, etterfulgt av sentrifugering (7.000 opm i 20 minutter) under dannelse av supernatanten. Denne ble behandlet med PEI på samme måte som beskrevet i eksempel 1 under dannelse av 1.000 ml supernatant. Væsken ble deretter absorbert på en CM Sepharose<®>CL6B kolonne ekvilibrert med 20 mM THB (pH 7,4) inneholdende 0,1% 2-ME og eluert med en lineær konsentrasjonsgradient på 0,1 - 0,8 M NaCl. Den aktive fraksjon ble fortynnet til det 10-doble av det opprinnelige volum med 20 mM THB inneholdende 0,1% 2-ME, ble absorbert på en CM-Toyopearl kolonne (fremstilt av Toyo Soda Co., Ltd.) som var blitt ekvilibrert med samme buf f er løsning, ble vasket og deretter eluert med en lineær konsentrasjonsgradient på 0,1 -

0. 8 M NaCl. Fraksjonene med interferonaktivitet ble oppsamlet, og etter at ammoniumsulfat var tilsatt til de kombinerte fraksjoner for å oppnå en 20% metning, ble denne ført gjennom en Butyl Toyopearl kolonne (fremstilt av Toyo Soda Co., Ltd.). Fraksjonene ført gjennom kolonnen, ble oppsamlet og underkastet dialyse mot des-tillert vann under dannelse av 396 mg protein som slutt-produkt (interferon-spesifikk aktivitet: 4,8 x 10 U/mg protein).

Som et resultat av aminosyreanalyse og SDS-PAGE som beskrevet i eksempel 1, ble det funnet at det erholdte polypeptid (GIF143) hadde en renhet på mer enn 99% og hadde samme aminosyresekvens som den ovenfor beskrevne aminosyresekvens (III). Enn videre kunne ikke noe av zinkforbindelsen tilsatt under ekstraksjonstrinnet, påvises selv ved atomabsorpsjonsspektrometri.

Eksempel 3

1. Cellehøsting, proteinfrigivelse og polyethyleniminutfelling

Inaktiverte E. coli (W3110/pIN5T4) celler inneholdende rekombinant gamma-interferon, ble oppsamlet ved sentrifugering. Cellene ble resuspendert i 20 mM tris-HCl-buffer (pH 7,5) inneholdende 1 mM ZnC^. Cellene ble opprevet i en høytrykks-homogenisator. Cellehomogenatet ble sentrifugert, og supernatanten ble oppsamlet. En vandig 10% (v/v) polyethylenimin- (PEI) løsning justert til pH 8 med saltsyre, ble tilsatt til supernatanten for å bringe den sluttelige PEI-konsentrasjon til et maksimum på 0,8%. Blandingen ble sentrifugert, og supernatanten ble oppsamlet.

II. Kvartær aminoethyl ( QAE) kolonnekromatografi

pH på PEI-supernatanten ble justert til 8,7 med 4 N NaOH. Avionisert vann ble tilsatt for å redusere ledningsevnen til under 10 mS. Satsen ble anbragt på en QAE-kolonne med en oppfylling på ikke mere enn 50 g protein pr. liter gel. Kolonnen ble ekvilibrert med en buffer av 20 mM natrium-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin-propansul-fonat og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på 8,7 før oppfylling. Elueringen ble utført med samme buffer. Proteinløsningen ble oppsamlet og kromatografert i trinn

III.

III. Carboxymethyl ( CM) kolonnekromatografi

pH på proteineluatet fra trinn 2 ble justert til 7,5 med 4 N HC1, og 2-mercaptoethanol ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1%. Ledningsevnen ble justert til 20 mS eller lavere ved fortynning med ultrafiltrert vann inneholdende 0,1% 2-mercaptoethanol. Løsningen ble ført gjennom et 0,2 u filter og fylt på en CM kolonne med en påfylling ikke større enn 35 g protein pr. liter gel. Kolonnen ble ekvilibrert med en buffer av 20 mM tris-HCl

og 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på 7,5 justert til en ledningsevne på 20 mS eller lavere med natriumklorid før oppfylling. Kolonnen ble vasket med minst 2 kolonnevolumer av den ekvilibrerende buffer. Gamma-interferon ble eluert med en saltgradient i området 0 - 0,5 M NaCl opp-

løst i den ekvilibrerende buffer. Fraksjoner ble kombinert som bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE).

IV. Fenylkolonnekromatografi

Kromatografi på en fenylkolonne ble utført etter at nærvær av høymolekylære urenheter var påvist ved SDS-PAGE. Natriumklorid ble tilsatt for å bringe ledningsevnen til 50 - 75 mS før løsningen ble fylt på en fenylkolonne med en påfylling ikke større enn 15 g protein pr. liter gel. Kolonnen ble ekvilibrert med en buffer av 20 mM tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på 7,5 før oppfylling. Etter at prøven var fylt på kolonnen, ble dette etterfulgt av minst ett skiktvolum av ekvilibrerende buffer. Kolonnen ble eluert med 20 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,1% 2-mercaptoethanol ved pH 7,5. Aktive fraksjoner ble kombinert som bestemt ved SDS-PAGE og anti-viralbestemmeIse.

V. Ammoniumsulfatutfelling

Hvis proteinkonsentrasjonen av de kombinerte carboxymethyl- (trinn III) eller fenyl- (trinn IV) fraksjoner var mindre enn 0,2 mg/ml, ble løsningen konsentrert ved ultrafiltrering under anvendelse av en membran med molekylvektavbrytning på 10.000. Ammoniumsulfat ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 40 til 60% metning. Bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering og lagret ved -20°C om nød-vendig.

VI. Sephadex<®>G- 100 kolonnekromatografi

Ammoniumsulfatbunnfallet ble oppløst i en buffer av 20 mM tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% 2-mercaptoethanol ved en pH på 7,5. Løsningen ble sentrifugert før den ble ført gjennom et 0,2 u filter. Den filtrerte løsning ble fylt på en Sephadex<®>G-100 kolonne preekvilibrert med samme buffer. Oppfyllingen er ikke større enn 3,5 g protein pr. liter gel. Kolonnen ble eluert med samme buffer, og frak-

sjoner ble kombinert som bestemt ved SDS-PAGE.

VII. Renset gamma- interferondialyse

De kombinerte Sephadex<®>G-100 fraksjoner ble dia-lysert mot 15 mM natriumfosfat, 8 mM natriumcitrat, 6 mM L-cystein HC1 ved pH 5,0. Dialysen ble utført med kontinuerlig spyling av nitrogen gjennom bufferen med to for-andringer av buffer ved minimum 4 timers intervaller. Om nødvendig, ble den dialyserte løsning konsentrert ved ultrafiltrering under anvendelse av en membran med molekylvektavbrytning på 10.000 til en proteinkonsentrasjon på mer enn 1 mg/ml. Løsningen av renset gamma-interferon ble ført gjennom et 0.2 u filter og lagret ved -20°C eller lavere.

Det rensede gamma-interferon kan lagres i minst flere måneder ved temperaturer på -20 til -30°C ved tilsetning av 50% glycerol til den gamma-interferon-holdige løsning.

Gamma-interferonet bearbeides for bruk ved filtrering gjennom et 0,2 u filter og dialysering av løsningen mot en løsning omfattende 20 mM natriumfosfat og 6 mM L-cystein ved en pH på ca. 6,8. Alternativt er dialyseløsningen 15 mM natriumfosfat, 8 mM natriumcitrat og 6 mM L-cystein HC1, ved en pH på ca. 5. Etter en dialyseperiode på

minst 8 timer utført under kontinuerlig nitrogenspyling, filtreres løsningen fortrinnsvis gjennom et filter med molekylvektavbrytning på 10.000.

Det erholdte produkt har en renhet på minst 95% gamma-interferon og et utbytte i overkant av ca. 5%.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for rensing av et polypeptid med fysiologisk aktivitet fra en kulturblanding av en mikroorganisme erholdt ved en rekombinant DNA-teknikk og som er i stand til å produsere polypeptidet, karakterisert ved at et zinksalt eller kobbersalt og polyethylenimin tilsettes under et trinn for ekstraksjon eller rensing av polypeptidet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganisme-cellene gjenvunnet fra kulturblandingen av mikroorganismen som er i stand til å produsere polypeptidet, suspenderes i en løsning inneholdende et zinksalt eller koppersalt, og opprives, og at polyethylenimin tilse etes til supernatanten erholdt ved sentrifugering av suspensjonen av de opprevne celler.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at angitte fysiologisk aktive polypeptid er et med interferonaktivitet, fortrinnsvis human immun interferonaktivitet, i særdeleshet GIF146 eller GIF143.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at angitte zinksalt tilsettes i en slik mengde at konsentrasjonen derav er i området fra 0,5 mM til 5 mM; eller at angitte koppersalt tilsettes i en slik mengde at konsentrasjonen derav er i området fra 0,05 mM til 3 mM; og at polyethyleniminet tilsettes i en slik mengde at konsentrasjonen derav er i området fra 0,5 til 1,5%.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den omfatter ytterligere trinn for sekvensvis fjerning av negativt ladede forurensende proteiner, høymolekylære materialer fra den gamma-interferon-holdige løsning, i særdeleshet ved trinnene for sekvensvis fjerning av 1) negativt ladede forurensende proteiner ved kolonnekromatografi med en svak base-anionbytterharpiks; 2) positivt ladede forurensende proteiner ved kolonnekromatografi med en svakt sur kationbytterharpiks; 3) lav- og høy-molekylære materialer ved gjennom-trengningskromatografi ved en gelfiltreringsharpiks.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at fremgangsmåten innbefatter ytterligere trinn for fjerning av høymolekylære, hydrofobe materialer fra den gamma-interferon-holdige løsning enten umiddelbart etter fjerning av de positivt ladede proteiner eller umiddelbart etter fjerning av lav-og høy-molekylære materialer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at anionbytterharpiksen er en kvartær aminoethylharpiks; og/eller den svakt sure kationbytterharpiks er en carboxymethylharpiks, og/eller at gelfiltreringsharpiksen er valgt fra Sephadex <®> G-100 og Sephacryl <®> S-200, og/eller at den gamma-interferon-holdige løsning konsentreres etter trinn 1, f.eks. ved utfelling med ammoniumsulfat, i særdeleshet ved ultrafiltrering, utfelling med ammoniumsulfat eller ultrafiltrering etterfulgt av utfelling med ammoniumsulfat.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 5 til 7, karakterisert ved at fremgangsmåten innbefatter et sluttrinn for dialyse mot cystein-holdig buffer i oxygenfrie omgivelser av den gamma-interferon-holdige løsning.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den omfatter ytterligere trinn for: 1) sentrifugering av blandingen inneholdende polyethylenimin og zink eller koppersalt for å separere det resulterende bunnfall fra supernatant lø sn ingen; 2) adsorbering av løsningen fra trinn 1 på en kolonne inneholdende en anionbytterharpiks; 3) eluering av det adsorberte materiale; 4) adsorbering av eluatet fra trinn 3 på en kolonne inneholdende en kationbytterharpiks; 5) eluering av det adsorberte materiale; 6) adsorbering av eluatet fra trinn 5 på en kolonne inneholdende en gelfiltreringsharpiks; og 7) eluering av det adsorberte materiale.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det adsorberte materiale fra trinn 2 elueres med en buffer omfattende natrium-4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazin-propansulfonat og en antioxydant, fortrinnsvis 2-mercaptoethanol; og/eller at det adsorberte materiale fra trinn 4 elueres med en buffer omfattende tris-HCl og en antioxydant; og/eller at det adsorberte materiale fra trinn 6 elueres med en buffer omfattende tris-HCl.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at anionbytterharpiksen er en kvartær aminoethylharpiks; kationbytterharpiksen er en carboxymethylharpiks; og at gelfiltreringharpiksen er Sephadex <®> G-100.