CZ301360B6

CZ301360B6 - Zpusob prípravy kompozice obsahující monomerní interferon-beta

Info

Publication number: CZ301360B6
Application number: CZ20031157A
Authority: CZ
Inventors: Wolfe@Sid; Esikova@Irina; Babuka@Susan; A. Shirley@Bret; Fordham@Dennis
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc.
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2010-01-27
Also published as: CZ20031157A3; BG107844A; EP1366060A2; CN100493601C; IL155577A0; JP2004512343A; JP3946139B2; PT1366060E; NO20031839L; NO326288B1; CA2427088A1; ATE383368T1; ES2299528T3; WO2002034791A2; US20090123424A1; DE60132366T2; US20020137895A1; PL365896A1; US20040115169A1; US7544354B2

Abstract

Zpusob prípravy kompozice obsahující monomerní interferon-beta (IFN-.beta.), který zahrnuje (a) prípravu vzorku obsahujícího precištený IFN-.beta.; (b) smíchání uvedeného vzorku s guanidin hydrochloridem (HCl) pro získání prvního roztoku obsahujícího rozpuštený denaturovaný IFN-.beta.; a (c) renaturaci IFN-.beta. zredením uvedeného prvního roztoku prvním pufrem, pricemž první pufr má pH od 3,0 do 5,0.

Description

Způsob přípravy-kompozice obsahující monomerní interferon-beta

Oblast techniky

Tento vynález se týká oblasti biochemického inženýrství. Konkrétně se tento vynález týká zlepšeného biologického procesu, který vede ke způsobu přípravy kompozice obsahující monomemí interferon-beta. Tato látka může být použita ve farmaceutických prostředcích.

io

Dosavadní stav techniky

Přirozeně se vyskytující interferony jsou druhově specifické proteiny produkované různými buňkami po indukci viry, dvoušroubovicovými RNA, jinými póly nukleotidy, antigeny amitogeny.

Interferony vykazují řadu biologických aktivit včetně antivirové, antiproliferační, imunomodtilační a protibuněčné aktivity. Výzkum těchto aktivit vedl k identifikací a charakterizaci alespoň tří rozdílných typů lidských interferonů, o kterých je publikováno, že jsou to různé proteiny kódované různými strukturními geny. Interferony, které jsou často glykoproteiny, byly původně klasifikovány na základě jejich buněčného zdroje a později překlasifikovány jako alfa, beta (β) a ga; 20 ma.

Interferon-beta (IFN-β) je produkován fibroblasty a epiteliálními buňkami. Nativní interferoi beta byl produkován superindukováním lidských fibroblastových kultur polyriboinosinovou a polyribocytidylovou kyselinou a izolací a přečištěním interferonu/interferonů takto vyproduko25 váných chromatografickými a elektroforetickými technikami. Náklady na přečištění interferonů a obtíže při přečištění touto cestou zabránily intenzivnímu klinickému výzkumu terapeutické hodnoty interferonů. Izolace interferonů z přírodních zdrojů zůstává relativně složitou a náročnou cestou.

Nedávno bylo klonováno několik lidských interferonových genů za použití technologie s rekombinantní DNA (rDNA) a byly podrobeny expresi v E. colí (Nagola et al. (1980) Nátuře 284: 316; Goeddel etal. (1980) Nátuře 287: 422; Yelverton etal. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 731; Stereuli etal. (1981) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78; 2 848). Proteiny nebo polypeptidy, které vykazují vlastnosti podobné nativnímu interferonů beta, mohou být tak produkovány technologií srDNA extrahováním poly-A-bohaté 12$ mediátorové RNA z virově indukovaných lidských buněk, syntetizováním dvouřetězcových cDNA za použití mRNA jako templátu, zavedením cDNA do vhodného klonovacího vektoru, transformováním vhodných mikroorganismů vektory, shromážděním mikroorganizmů a extrakcí interferonů beta z nich. Viz například evropské patentové přihlášky 28 033 (zveřejněná 6. května 1981); 32 134 (zveřejněná 15. července 1981) a 34 307 (zveřejněná 26. srpna 1981), které popisují různé metody výroby interferonu-beta za použití technik s rDNA. Proteiny získané expresí proteinů nebo polypeptidů z klonů rekombinantní DNA byly přečištěny, testovány a bylo zjištěno, že mají obdobné vlastnosti jako přirozeně se vyskytující interferony. Bakteriálně vyrobené interferony tak mají potenciální terapeutické použití jako protivirová a protinádorová činidla. Produkce interferonů touto bakteriální fermenta45 cí poskytuje velké množství interferonů s relativně nízkými náklady, což činí interferon dostupnější pro mnoho použití, jako jsou klinické studie.

Interferon-beta pro použití v klinických studiích musí mít relativně velkou čistotu a nesmí být v podstatě kontaminován toxickými buněčnými složkami, buněčnými zbytky a jinými externími chemikáliemi zavedenými během extrakčního o prečišťovacího kroku. Je několik aktuálně dostupných metod pro přípravu, získání a přečištění IFN-β.

Metody přečištění a získání IFN-β popsané v patentech US 4 462 940 a US 5 702 699 a podobné metody produkují čistou formu IFN-β, která má tendenci tvořit agregáty v přítomnosti silných solubilizačních činidel, například dodecylsulfátu sodného (SDS). Kromě toho vystavují tyto

- 1 CZ 301360 B6 metody (1) protein podmínkám vysokého pH, které mohou nežádoucím způsobem ovlivnit biologicKe vlastnosti proteinu a {/) mají za nasieoex Kompozice oDsanujici reziuuaini muozsivi juj používaného k rozpouštění proteinu během přečištění.

Proto existuje potřeba zlepšení procesu získání a přečištění, ve kterém IFN-β není podroben vysoce alkalickému prostředí, kompozice je prosta nebo v podstatě prosta SDS a protein je rezpustný při pH vhodném pro parenterální podávání. Účelem tohoto vynálezu je poskytnout farmaceuticky přijatelný vzorek IFN-β, který má relativně vysokou čistotu a snadno se regeneruje během procesu přečištění a získávání.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy kompozice obsahující monomem í interferon-beta (IFN-β), jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

a) přípravu vzorku obsahujícího přečištěný IFN-β;

b) smíchání uvedeného vzorku s guanidin hydrochloridem (HCl) pro získání prvního roztoku obsahujícího rozpuštěný denaturovaný IFN-β; a

c) renaturaci IFN-β zředěním uvedeného prvního roztoku prvním pufrem, přičemž první pufr má pH od 3,0 do 5,0.

Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém zbytkový guanidin HCl je přítomen v roztoku renaturovaného IFN-β v koncentraci 1,6 M nebo menší.

Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém první pufr má pH 3,0 až 4,0 a kde zbytkový guanidin HCl je přítomen v roztoku renaturovaného IFN-β v koncentraci

0,2 M nebo menší.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém první pufr má pH 3,0 a kde zbytkový guanidin HCl je přítomen v koncentrací 0,1 M nebo menší.

Další výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, který dále zahrnuje krok odstraňování zbytkového guanidin HCl z roztoku renaturovaného IFN-β diafiltrací nebo dialýzou roztoku renaturovaného IFN-β v druhém pufru, přičemž druhý pufr má pH od 3,0 do 5,0 a je vybrán ze souboru sestávajícího z glycinu, asparagové kyseliny a sukcinátu sodného.

Ještě další výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém IFN-β je glykosylován nebo neglykosylován.

Ještě další výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém IFN-β je produkován rekombinantně.

Ještě jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém IFN-β je zralý lidský IFN-β nebo jeho varianta a kde tato jeho varianta má alespoň 80% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí zralého lidského IFN-β. Výhodné provedení takového řešení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu, při kterém jeho uvedená varianta má aminokyselinovou sekven50 ci zralého lidského IFN-β, ve které je cysteinový zbytek v poloze 17 nahrazen serinovým zbytkem zralé lidské 1FN β sekvence.

-2CZ 301360 B6

Dále je popsán předmětný vynález detailněji v širších souvislostech.

Popsaný vynález skýtá zlepšené metody vhodné při přípravě farmaceutických přípravků s IFN-β. Metody poskytují monomemí kapalné farmaceutické kompozice obsahující IFN-β. Způsoby zahrnují podmínky, které zvyšují regeneraci proteinu během procesu získávání.

K dosažení výše uvedených a jiných cílů a v souladu s účely tohoto vynálezu, jak jsou popsány výše, tento vynález poskytuje zlepšené způsoby přečištění a získání IFN-β. V jednom provedení zlepšený způsob zahrnuje přípravu roztoku obsahujícího IFN-β, izolaci zásoby (poolu) v podstatě to přečištěného IFN-β z tohoto roztoku, vysrážení (precipitaci) přečištěného IFN-β z této zásoby alkoholem a rozpuštění vysráženého IFN-β v guanidin hydrochloridu (hydrochloridu guanidinu) za tvorby roztoku obsahujícího znovu rozpuštěný (resolubilizovaný) denaturovaný IFN-β. Tento roztok obsahující znovu rozpuštěný denaturovaný IFN-β je poté zředěn vhodným prvním pufrem k získání roztoku obsahujícího znovu rozpuštěný renaturovaný IFN-β. Výsledný roztok je poté is diafíltrován nebo dialyzován do pufru vhodného pro farmaceutické účely. Tento poslední krok odstraňuje zbytkový guanidin hydrochiorid, čímž se získá farmaceutický prostředek obsahující v podstatě monomemí IFN-β vhodný pro parenterální podávání.

V jiném provedení zlepšený způsob přečištění a získání IFN-β zahrnuje získání vzorku v podsta20 tě přečištěného IFN-β a smíchání tohoto vzorku s guanidin hydrochloridem za tvorby roztoku obsahujícího rozpuštěný denaturovaný IFN-β. Tento roztok obsahující rozpuštěný denaturovaný IFN-β je poté zředěn vhodným prvním pufrem k získání roztoku obsahujícího rozpuštěný renaturovaný IFN-β. Výsledná roztok rozpuštěného renaturovaného IFN-β je poté diafíltrován nebo dialyzován do pufru vhodného pro farmaceutické účely. Jak je uvedeno výše, tento poslední krok odstraňuje zbytkový guanidin hydrochiorid, čímž se získá farmaceutický prostředek obsahující v podstatě monomemí IFN-β vhodný pro paranterální podávání.

Jiný aspekt tohoto vynálezu se týká zlepšených způsobů získání mikrobiálně produkovaného IFN-β. Za použití způsobů podle tohoto vynálezu je možno připravit farmaceutické přípravky

IFN-β, které jsou bez nebo v podstatě bez SDS (méně než 10 mikrogramů SDS na miligram IFN-β). Jiný aspekt tohoto vynálezu spočívá v tom, že pokud jsou použity způsoby podle tohoto vynálezu, nejsou nezbytné pro stabilní přípravky IFN-β látky, jako je lidský sérový albumin (human sérum albumin-HSA). V podstatě monomemí forma IFN-β může být poté zředěna vodným pufrem pro použití ve farmaceutických prostředcích. Tyto způsoby tak nacházejí uplat35 nění při přípravě farmaceutických prostředků podle vynálezu.

Stručný popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje získaná data z HPLC chromatografie po zředění IFN-β z kroku rozpuštění v guanidin hydrochloridu různými pufry.

Obrázek 2 ukazuje účinek soli a pH na získám IFN-β z pufru 0,4 M guanidin HCI, 10 mM NaPO₄, pH 7,0.

Obrázek 3 ukazuje účinek Tween 80 na agregaci renaturovaného ÍFN-β připraveného způsobem podle tohoto vynálezu.

Detail popis vynálezu

Tento vynález je zaměřen na nové způsoby přípravy v podstatě monomemí formy IFN-β. Pod pojmem „v podstatě monomemí“ je míněno, že většina IFN-β (hmotnostně) přítomného v prostředku nebo kompozici je monomemí spíše než agregovaná. Pod pojmem „agregovaná“ je míněna fyzikální interakce mezi molekulami polypeptidů, které vedou k formaci nekovalentních

-3CZ 301360 B6 multimerů, které mohu zůstat rozpustné nebo se mohou srážet z roztoku. Procentické množství (hmotnostní) IFN-β, který je monomemí ve v puusíaíě monoinemí kompozici nebo přípravku se může pohybovat od 51 % výše. Způsoby podle vynálezu poskytují přípravu kompozic obsahujících v podstatě monomemí IFN-β, které jsou připraveny bez použití tradičního stabilizátoru HSA a které jsou bez nebo v podstatě bez rozpouštědla dodecyl sul fátu sodného (SDS) (tj. obsahují méně než lOmikrogramů SDS na miligram IFN-β). Tyto kompozice obsahující v podstatě monomemí IFN-β jsou tak proto vhodné pro použití ve farmaceutických nebo terapeutických prostředcích. Monomemí forma IFN-β póly peptidu zůstává rozpustná a proto je nazývána „rozpuštěnou“ ve farmaceutických kompozicích podle tohoto vynálezu. Tento vynález proto io poskytuje farmaceutické kompozice IFN-β bez HSA, bez SDS, které obsahují alespoň asi 51 % IFN-β ve své monomemí formě, jako protiklad své agregované formy, výhodně alespoň asi 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 %, zvláště výhodně alespoň asi 90 % nebo více IFN-β ve své monomemí formě.

V jednom provedení je připravena kompozice obsahující v podstatě monomemí IFN-β srážením v podstatě přečištěného IFN-β z roztoku, opětným suspendování sraženiny rozpuštěním v guanidin hydrochloridu (HCI), odstraněním zbytkového SDS filtrací, kde původní vzorek IFN-β obsahuje SDS, a poté renaturací IFN-β zředěním výsledného roztoku guanidin HCl-IFN-β vhodným roztokem pufru. Pojmem „v podstatě přečištěný“ je zamýšleno, že IFN-β ve výchozím materiálu je v podstatě nebo v zásadě bez složek, které normálně doprovázejí nebo interagují s proteinem, jak se nachází ve svém běžně se vyskytujícím prostředí, tj. v nativních nebo hostitelských buňkách v případě rekombinantně produkovaného IFN-β. Polypeptid IFN-β, který je v podstatě bez buněčného materiálu, zahrnuje proteinové přípravky, které obsahují méně než asi 30, 25, 20, 15, 10, 5 nebo 1 % (vztaženo na sušinu) kontaminujícího proteinu. Pokud je polypep25 tid IFN-β nebo jeho biologicky aktivní varianta připravena rekombinantně, výhodné kultivační médium přestavuje méně než asi 30, 25, 20, 15, 10, 5 nebo 1 % (vztaženo na sušinu) chemických prekurzorů nebo chemikálií jiných než uvedený protein. Proto jako „v podstatě přečištěný“ IFNβ pro použití v metodách podle tohoto vynálezu je uveden ten, který má stupeň čistoty alespoň asi 70 %, výhodně stupeň čistoty alespoň asi 75 %, 80 %, 85 %, zvláště výhodně stupeň čistoty alespoň asi 90 % nebo vyšší, jak je stanoveno analýzou SDS/PAGE.

V jiném provedení je kompozice obsahující v podstatě monomemí IFN-β připravena v nepřítomnosti výše uvedeného srážecího kroku. Tímto způsobem je vzorek obsahující v podstatě přečištěný IFN-β smíchán s guanidin HCI k získání roztoku obsahujícího rozpuštěný denaturovaný

IFN-β; tento IFN-β je poté renaturován zředěním výsledného roztoku guanidin HCl-IFN-β vhodným pufrem. Rozvětvení těchto kroků přípravy je základem pro kompozice obsahující v podstatě monomemí IFN-β a způsoby podle tohoto vynálezu pro přípravu injektovatelných prostředků obsahujících v podstatě monomemí IFN-β, které jsou vhodné pro terapii IFN-β zaměřenou na choroby s citlivostí k IFN-β.

Pojem „lFN-beta“ nebo „IFN-β“, jak je zde použit, označuje IFN-β nebo jeho varianty, někdy označované jako polypeptidy podobné IFN-β. Tak například lidské varianty IFN-β, které se mohou vyskytovat přirozeně (např. alelické varianty, které se vyskytují na místech IFN-β) nebo rekombinantně produkované, mají aminokyselinové sekvence, které jsou stejné nebo podobné nebo v podstatě stejné jako sekvence zralého nativního lidského IFN-β. Fragmenty nebo zkrácené formy IFN-β, které si zachovávají svoji aktivitu, jsou také začleněny pod pojem „IFN-β“ nebo „IFN-beta“. Tyto biologicky aktivní fragmenty nebo zkrácené formy IFN-β jsou vytvořeny odstraněním aminokyselinových zbytků z aminokyselinové sekvence IFN-β o plné délce za použití DNA rekombinantních technik dobře známých v oboru. Polypeptidy IFN-β mohou být glykosylovány (IFN-β-Ι a) nebo neglykosylovány (IFN-β-1 b), a jak bylo popsáno v literatuře, jak glykosylováné, tak neglykosy 1 ováné IFN-β vykazují kvalitativně obdobné specifické aktivity, z čehož se usuzuje, že glykosylované části se nepodílí na biologické aktivitě IFN-β.

Zde popsané varianty IFN-β zahrnují muteiny nativních zralých sekvencí IFN-β (víz například patent US 5 814 485, na který se tímto odkazuje), kde jeden nebo více cysteinových zbytků, které

-4CZ 301360 B6 nejsou podstatné pro biologickou aktivitu, bylo podrobeno deleci nebo nahrazeno jinými aminokyselinami k eliminování tvorby míst intramolekulámího spojení nebo nesprávných intramolekulamích disulfídových vazeb. Varianty IFN-β tohoto typu zahrnují ty, které obsahují glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, threonin nebo methionin pro substituci cysteinu v pozici 17 zralé nativní aminokyselinové sekvence. Serin a threonin představují nejvýhodnější náhradu díky jejich chemické analogii s cysteinem. Nejvýhodnější jsou substituce serinem. Viz např. varianty IFN-β kde cystein nacházející se v poloze 17 zralé nativní sekvence je nahrazen serinem (patent US 5 814 485). Cystein 17 může být také podroben deleci za použití metod známých v oboru (viz například patent US 4 518 584, na který se tímto odkazuio je), což má za následek zralý IFN-β mutein, která je o jednu aminokyselinu kratší než zralý nativní IFN-β. Viz také například patenty US 4 530 787, US 4 572 798 a US 4 588 585. Varianty s jednou nebo více mutacemi, které zlepšují například jejich farmaceutické využití, jsou také zahrnuty do tohoto vynálezu.

Zkušenému odborníkovi v oboru je zřejmé, že další změny mohou být zavedeny mutací v nukleotidové sekvenci kódující IFN-β, což vede ke změnám v aminokyselinové sekvenci IFN-β bez změny biologické aktivity interferonu. Molekula izolované nukleové kyseliny kódující variantu IFN-β mající sekvenci, která se liší od aminokyselinové sekvence pro nativní IFN-β, může být vytvořena zavedením jedné nebo více nukleotidových substitucí, adici nebo deleci do odpovídají20 cí nukleotidové sekvence kódující nativní IFN-β, takže jedna nebo více aminokyselinových substitucí, adicí nebo deleci je zavedena do kódovaného IFN-β. Mutace mohou být zavedeny standardními technikami, jako je na místo zaměřená mutageneze a mutageneze zprostředkovaná PCR. Tyto varianty IFN-β jsou také součástí tohoto vynálezu.

Konzervativní aminokyselinové substituce mohou být například provedeny na jednom nebo více předem určených zbytcích výhodně neesenciálních aminokyselin. „Neesenciální“ zbytek aminokyseliny je zbytek, který může být změněn u přirozeně se vyskytujícího typu sekvence IFN-β bez pozměnění jeho biologické aktivity, přičemž zbytek „esenciální“ aminokyseliny je požadován pro biologickou aktivitu. „Konzervativní aminokyselinová substituce“ je ta, ve které je amino30 kyselinový zbytek nahrazen aminokyselinovým zbytkem majícím obdobný boční řetězec. Skupiny aminokyselinových zbytků majících obdobné boční řetězce byly definovány ve stavu techniky. Tyto skupiny zahrnují aminokyseliny s bazickým bočním řetězcem (např. lysin, arginin, histitin), kyselými bočními řetězci (např. kyselina asparagová, glutamová), nenabitými polárními bočními řetězci (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), nepolárními bočními řetězci (např. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), beta-rozvětvenými bočními řetězci (např. threonin, valin, isoleucin) a aromatickými bočními řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Tyto substituce by neměly být vytvořeny pro konzervativní aminokyselinové zbytky nebo aminokyselinové zbytky s konzervovaným motivem.

Alternativně může být varianta IFN-β nukleotidové sekvence vytvořena zavedením mutací náhodně po celé nebo po části sekvence kódující IFN-β, jako pomocí saturaění mutageneze, a výsledné mutanty mohou být sledovány z hlediska své IFN-β biologické aktivity k identifikaci mutantů, u kterých přetrvává aktivita. Po mutagenezi může být kódovaný protein podroben rekombinantní expresi a aktivita proteinu může být stanovena za použití zde popsaných standardních zkušebních technik.

Biologicky aktivní varianty IFN-β budou mít obecně alespoň 80%, výhodně asi 90 až 95% nebo větší, nejvýhodněji asi 99% identitu aminokyselinové sekvence s aminokyselinovou sekvencí referenční molekuly IFN-β, například nativního lidského IFN-β, který slouží jako základ pro srovnání. Pojmem „identita sekvence“ je míněno to, že při srovnání specifických sousedních segmentů aminokyselinové sekvence molekuly varianty polypeptidu s aminokyselinovou sekvencí referenční molekuly se ve variantním polypeptidu nachází stejné aminokyselinové zbytky jako v molekule polypeptidu, která slouží jako referenční.

-5CZ 301360 B6

Pro účely optimálního porovnání dvou sekvencí pro stanovení identity sekvence mohou mít sousední segmenty aminokyselinové sekvence varianty daiší aí 11 inokyse i i nové zbytky nebo vypuštěné aminokyselinové zbytky oproti aminokyselinové sekvenci referenční molekuly. Sousední segment použitý pro srovnání s referenční aminokyselinovou sekvencí bude obsahovat alespoň

20 sousedících aminokyselinových zbytků. Korekce pro zvýšení identity sekvence spojené se zahrnutím mezer v aminokyselinové sekvenci variant mohou být provedeny započtením penalizací na mezery. Metody porovnání sekvencí jsou dobře známy z oboru.

Stanovení procentické identity mezi jakýmikoli dvěmi sekvencemi může být provedeno za použilo ti matematického algoritmu. Jeden výhodný nelimitující příklad matematického algoritmu používaného pro srovnání sekvencí je algoritmus uvedený v Myers a Miller (1988) Comput. Appl.

Biosci, 4: 11-7. Tento algoritmus je použit v programu ALIGN (verze 2.0), což je jedna z částí porovnávacího softwarového balíčku GCG. Tabulka hmotností zbytků ΡΑΜΙ20, penalizace délky mezer 12 a penalizace mezer 4 může být použito s programem ALIGN při srovnání amino15 kyselinových sekvencí. Jiný výhodný nelimitující příklad matematického algoritmu pro použití při porovnávání dvou sekvencí je algoritmus uvedený v Karlin a Altschul (1990) Proč. Nati. Acad, Sci. USA 90: 5 873-5 877, modifikovaný v Karlin a Altschul (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5 873-5 877. Tento algoritmus je zahrnut do programů NBLAST a XBLAST z Altschul et. al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Rešerše aminokyselinových sekvencí s XBLAST mohou být provedeny pomocí XBLAST programu, skóre = 50, délka slova = 3 k získání aminokyselinové sekvence podobné jako sledovaný polypeptid. K získání srovnání se zahrnutím mezer pro účely porovnání může být použit program gapped BLAST popsaný v Altschul et. al, (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativně může být použit PSI-BLAST k provedení integrovaného sledování, které detekuje vzdálenější vztahy mezi molekulami. Viz Altschul et al.

(1997) výše. Při použití programů BLAST, gapped BLAST nebo PSI-BLAST mohou být použity defaultní parametry. Viz internetovou stránku ncbi.nlm.nih.gov. Viz také program ALIGN (Dayhoff (1978) v Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3, National Biomedical Reserach Foundation, Washington, D.C.) a programy v balíčku Wisconsin Sequence Analysis Package, Verze 8 (k získání u Genetics Comuputer group, Madison, Wisconsin), například GAP program, kde jsou použity defaultní parametry programů.

Při uvážení procentické identity aminokyselinové sekvence se mohou některé pozice aminokyselinových zbytků lišit jako výsledek konzervativních aminokyselinových substitucí, které neovlivňují funkci proteinu. V těchto případech může být identita sekvence na vyšší hodnotě k zahrnutí obdobnosti konzervativně substituovaných aminokyselin. Tato stanovení jsou dobře známa ze stavu techniky. Víz např. Myers a Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17,

Biologicky aktivní varianty IFN-β zahrnuté do vynálezu by si měly uchovávat aktivity IFN-β, zvláště schopnost se vázat na receptory IFN-β. Biologická aktivita variant IFN-β může být měře40 na jakoukoli metodou známou ze stavu techniky. Příklady těchto zkoušek mohou být nalezeny v Fellous et. al. (1982) Proč. Nati. Acad. Sci USA 79: 3 082-3 086; Czemiecki etal. (1984) J. Virol. 49 (2): 490-496; Mark et. al. (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 5662-5666; Branca et al. (1981)Nátuře 277: 221-223; Williams etal. (1979)Nátuře 282: 582-586; Herberman etal. (1979) Nátuře 277: 221-223; a Anderson etal. (1982) J. Biol. Chem. 257 (19): 11 301-11 304.

Nelimitující příklady polypeptidů IFN-β a variant polypeptidů IFN-β zahrnutých do vynálezu jsou uvedeny v Nagata etal. (1980) Nátuře 284: 316-320; Goeddel etal. (1980) Nátuře 287: 411-416; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 731-741; Streuli et al. (1981) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2848-2852; EP 028 033 Bl, EP 109 748 Bl. Viz také patenty US 4 518 584;

US 4 569 908; US 4 588 585; US 4 738 844;US 4 753 795; US 4 769 233; US 4 793 995; US 4 914 033; US 4 959 314;US 5 545 723 a US 5 814 485. Na tyto dokumenty se tímto odkazuje. Tyto citace také poskytují základního průvodce co do zbytků a oblastí peptidu IFN-β, které mohou být změněny bez ztráty biologické aktivity.

-6CZ 301360 B6

Pojmem „rekombinantně produkovaný IFN-β“ je zamýšlen IFN-β, který má srovnatelnou biologickou aktivitu jako nativní IFN-β, a který byl připraven způsoby s použitím rekombinantní DNA. IFN-β může být produkován kultivací hostitelské buňky transformované expresním vektorem obsahujícím nukleotidovou sekvenci, která kóduje polypeptid IFN-β. Hostitelská buňka je ta, která může provádět transkripci nukleotidové sekvence a produkovat požadovaný protein a může být prokaryotická (například E. coli) nebo eukaryotická (například kvasinka, hmyzí nebo savčí buňka). Příklady rekombinantní produkce IFN-β jsou uvedeny v Maňte i etal. (1982) Nátuře297: 128; Ohmo etal. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 96; Smith etal. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2 156 a patent US 4 462 940, US 5 702 699 a US 5 814 485; na které se tímto odkazuje, ío Víz také patent US 5 795 779, kde IFN-^la je rekombinantně produkován ve vaječníkových buňkách čínského křečka (CHO); na který se tímto odkazuje. Lidské interferonové geny byly klonovány za použití technologie s rekombinantní DNA („rDNA“) a byly podrobeny expresi v E. coli (Nagola et al. (1980) Nátuře 284: 316; Goeddel et al. (1980) Nátuře 287:411; Yelverton etal. (1981) Nuc. Acid Res. 9: 731; Streuli etal. (1981) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2 848).

Alternativně může být IFN-β produkován transgenními zvířaty nebo rostlinami, které byly pozměněny genetickým inženýrstvím k expresi požadovaného proteinu IFN-β v souladu s metodami známými ze stavu techniky.

Proteiny nebo polypeptidy, které vykazují vlastnosti podobné vlastnostem nativního interferonu beta mohou být také vyrobeny pomocí technologie rDNA extrakcí mediátorové RNA bohaté na poly-A 12S z virově indukovaných lidských buněk, syntetizováním dvouřetězcové cDNA za použití mRNA jako vzoru, zavedením cDNA do vhodného klonovacího vektoru, transformací vhodného mikroorganismu vektorem, sklizením mikroorganismů a extrakcí interferonu beta z nich. Viz například evropské patentové přihlášky 28 033 (zveřejněná 6. května 1981); 32 134 (zveřejněná 15. července 1981); a 34 307 (zveřejněná 26. srpna 1981), které popisují různé metody produkce IFN-β za použití technik s rDNA.

Alternativně může být IFN-β syntetizován chemicky nebo jakoukoli z technik, které jsou známy odborníkovi v oblasti peptidů. Viz například Li etal. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci USA 80:

2216-2220, Steward a Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company,

Rockford, Illionois) a Beraney a Merrifíeld (1980) The peptides: Anylysis, Synthesis, biology, ed. Gross a Meinhofer, svazek 2 (Academie Press, New York), str. 3-254, kde se diskutují techniky syntézy peptidů v pevné fázi; a Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin) a Goss a Meinhofer, eds. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, sv. 1 (Academie Press, New York), diskutující klasické syntézy v roztoku. IFN-β může být také chemicky připraven metodami simultánní několikanásobné syntézy peptidů. Viz například Houghten (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135; patent US 4 631 211.

Příprava kompozic obsahující v podstatě monomemí IFN-β zde popsaných je výhodně provádě40 na v souladu s jednou nebo dvěmi vylepšenými způsoby přečištění podle tohoto vynálezu. První z těchto způsobů přečištění zahrnuje tři základní kroky: 1) vysrážení IFN-β z roztoku obsahujícího v podstatě přečištěný IFN-β; (2) rozpuštění sraženiny IFN-β v guanidin hydrochloridu (HCI) k dosažení opětného rozpuštění IFN-β; a (3) renaturace IFN-β, výhodně zředěním nebo dialýzou za použití přijatelného pufru. Tento způsob přečištění dává rozpustnou stabilní v podstatě mono45 měrní formu. Výsledná kompozice může být vytvořena jako farmaceutická kompozice další diafiltrací nebo dialýzou této kompozice s farmaceuticky přijatelným pufrem. Tento konečný krok odstraňuje zbytkový guanidin HCI z roztoku obsahujícího renaturovaný IFN-β a poskytuje prostředek mající pH, které je přijatelné pro parenterální podávání.

Za použití způsobů přečištění podle vynálezu je sraženina IFN-β nejprve připravena vysrázením v podstatě přečištěného IFN-β z roztoku. Srážení je doprovázeno snížením rozpustnosti IFN-β. Snížení rozpustnosti IFN-β a vysrážení IFN-β může být dosaženo za použití alkoholu, například alifatického alkoholu, jako je ethanol. Pro určité proteiny srážení vyúsťuje v denaturační a/nebo agregační reakci, která je ireverzibilní, což vede k ínaktivaci proteinu, ale v případě vy sráženého

-7CZ 301360 B6

IFN-β podle tohoto vynálezu je srážecí reakce reverzibilní, Rozpustný IFN-β získaný v následných krocích ίυΐιυίυ způsobu přečištění si uuliuvává svoji biologickou aktivitu.

Výsledná sraženina je poté rozpuštěna v guanidin HCI pro získání roztoku obsahujícího znovu rozpuštěný denaturovaný IFN-β a guanidin HCI. V těchto případech, kde v podstatě přečištěný IFN-β byl získán za použití vstupního kroku přečištění, který zahrnuje použití SDS jako solubilizačního činidla, SDS zůstává jako sraženina po rozpuštění v guanidin HCI. Tento vysrážený SDS je odstraňován filtrací za použití standardních filtračních technik známých ze stavu techniky, výhodně před provedením následných kroků tohoto zlepšeného způsobu přečištění. Množství guanidin HCI, který má být smíchán se sraženinou IFN-β je množství dostatečné k rozpuštění vysráženého IFN-β ve výsledném roztoku guanidin HCl-IFN-β, tj. asi 6 M až asi 10 M guanidin HCI, výhodně asi 6 M až asi 9 M, zvláště výhodně asi 6 M až asi 8 M guanidin HCI v tomto výsledném roztoku guanidin HCl-IFN-β. Avšak rozpuštěný IFN-β v tomto roztoku je také denaturovaný. Renaturace tohoto proteinu je dosaženo zředěním roztoku guanidin HCl-IFN-β roztokem pufru, čímž se získá roztok obsahující opět rozpuštěný IFN-β a zbytkový hydrochlorid guanidinu. Tento IFN-β v tomto výsledném roztoku je v podstatě monomemí, tj. alespoň asi 51 % je ve své monomemí formě, výhodně alespoň asi 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, zvláště výhodně alespoň asi 90 % nebo více je ve své monomemí formě, jak se stanovuje například velikostní HPLC.

Během kroku opětného rozpuštění (resolubilizace) a renaturace slouží guanidin HCI jako solubilizační činidlo ke zvýšení rozpustnosti IFN-β. Pojmem „zvýšení rozpustnosti“ IFN-β je míněno zvýšení množství ÍFN-β, který může být rozpuštěn v roztoku při pH asi 3,0 až asi 9,0 v přítomnosti guanidin HCI ve srovnání s množstvím IFN-β, který může být rozpuštěn při stejném pH v roztoku stejných složek ale bez guanidin HCI Schopnost hydrochloridu guanidinu zvyšovat rozpustnost IFN-β může být stanovena za použití metod dobře známých ze stavu techniky včetně těch, které jsou zde popsány.

V kroku zředění způsobu přečištění podle vynálezu může být použito k dosažení renaturace

IFN-β jakéhokoliv vhodného pufru. Vhodné pufry pro použití v tomto kroku zahrnují ty, které jsou popsány dále, jako je acetátový, citrátový, fosfátový a Tris HCI, jejichž volba závisí na požadovaném pH výsledného roztoku po kroku zředění. Pokud metoda přečištění zahrnuje krok srážení, má pufr použitý pro krok zředění výhodně pH asi 4,0 až asi 8,0 zahrnující asi 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 a 8,0, zvláště výhodně pH asi 5,0 až asi 7,0. Po tomto kroku zředění je zbytkového guanidin HCI v roztoku znovu rozpuštěného renaturovaného IFN-β asi 1,6 M nebo méně, zvláště výhodně asi 0,8 M nebo méně.

Výsledný roztok opět rozpuštěného renaturovaného IFN-β obsahuje IFN-β v podstatě ve své monomemí formě (tj. více než asi 51 % je monomemí). Kromě toho roztok opětně rozpuštěného renaturovaného IFN-β obsahuje zbytkové množství guanidin HCI. Tato směs může být použita pro přípravu farmaceutických prostředků, které jsou vhodné pro parenterální podávání. Tímto způsobem může být zbytkový zvyšovač rozpustnosti guanidin HCI odstraněn z roztoku opětně rozpuštěného renaturovaného IFN-β dialýzou nebo diafiltrací tohoto roztoku s farmaceuticky přijatelným pufrem. Pojmem „odstranění zbytkového guanidin HCI“ je míněn farmaceutický pro45 středek obsahující v podstatě monomemí IFN-β připravený za použití kroku tohoto způsobu přečištění zahrnujícího guanidin HCI v koncentraci 10 mM nebo menší, výhodně 5 mM nebo menší. Jakýkoli farmaceuticky přijatelný pufr může být použit k přípravě farmaceutického prostředku, pokud IFN-β zůstává rozpuštěný a v podstatě ve své monomemí formě. V jednom provedení obsahuje farmaceuticky přijatelný pufr arginin nebo chlorid sodný v množství dosta50 tečném ke zvýšení výtěžnosti monomemí formy IFN-β ve srovnání s výtěžností získanou bez argininu nebo chloridu sodného ve farmaceuticky přijatelném pufru. Pro arginin je množství ke zvýšení výtěžnosti asi 0,2 M až asi 1,0 M, výhodně asi 0,4 M až asi 0,8 M, včetně asi 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M a 0,8 Μ. V jednom provedení je množství argininu přítomného ve farmaceuticky přijatelném pufru asi 0,5 M. U chloridu sodného je množství dostatečné ke zvýšení výtěžnosti asi 0,2 M až asi 1,2 M, výhodně asi 0,2 M až asi 1,0 M, zvláště výhodně asi 0,5 M až

-8CZ 301360 B6 asi 1,0 Μ. V jednom provedení je množství chloridu sodného přítomného ve farmaceuticky přijatelném pufru asi 1,0 M.

Druhý způsob přečištění pro přípravu kompozice obsahující v podstatě monomemí IFN-β je podobný prvnímu způsobu, ale poskytuje možnost přípravy kompozice bez kroku srážení. Tento druhý způsob zahrnuje dva základní kroky: (1) smíchání vzorku obsahujícího v podstatě přečištěný IFN-β s guanidin hydrochloridem (guanidin HCl) k získání roztoku obsahujícího rozpuštěný denaturovaný IFN-β; a (2) renaturaci IFN-β, výhodně pomocí zředění za použití přijatelného pufru. Guanidin HCl slouží jako činidlo zvyšující rozpustnost, jak je uvedeno výše, a je použit io v obdobných množstvích, jak je uvedeno výše u prvního způsobu přečištění. Po prvním kroku je tak množství guanidin HCl v roztoku obsahujícím rozpuštěný denaturovaný IFN-β asi 6 M až asi 10 M guanidin HCl, výhodně asi 6 M až asi 9 M, zvláště výhodně 6 M až asi 8 M guanidin HCl. Jak je uvedeno výše, tam, kde původní v podstatě přečištěný IFN-β obsahuje SDS, SDS se sráží v tomto kroku a může být odfiltrován z roztoku za použití standardních filtračních technik zná15 mých ze stavu techniky.

Jako v prvním způsobu přečištění, IFN-β v tomto roztoku guanidin HCl-IFN-β je denaturovaný. Renaturace se dosahuje zředěním za použití přijatelného pufru majícího pH v rozmezí asi 3,0 až asi 5,0, výhodně asi 3,0 až asi 4,0, zvláště výhodně asi 3,0. Vhodné pufry pro tento krok zředění k dosažení renaturace IFN-β obsahují glycin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou a sukcinát, acetat, fosfát, formiat a citrát, stejně jako jejich soli. Po kroku zředění je množství zbytkového guanidin HCl zůstávajícího v roztoku rozpuštěného IFN-β asi 1,6 M nebo menší, výhodně asi 0,8 M nebo menší, zvláště výhodně asi 0,1 M nebo menší. Po renaturaci výsledná kompozice obsahuje v podstatě monomemí IFN-β, tj. alespoň 51 %, výhodně alespoň 70% ve své mono25 memí formě, jak je stanoveno například za použití velikostní HPLC, výhodně za použití analytické ultracentrifugace (viz např. Liu a Shte (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1 237—1 241, na který se tímto odkazuje). Zbytkový guanidin HCl v tomto roztoku renaturovaného IFN-β může být odstraněn obdobným způsobem, jako je zmíněn pro první metodu přečištění k přípravě farmaceutického prostředku obsahujícího v podstatě monomemí IFN-β. Pokud ÍFN-β zůstane rozpuštěn a v pod30 statě ve své monomemí formě, může být použit jakýkoli farmaceuticky přijatelný pufr, jak je uvedeno jinde. V jednom provedení je farmaceuticky přijatelný pufr vybrán ze skupiny sestávající z glycinu, kyseliny asparagové a sukcinátu sodného, výhodně glycinu, tak, že farmaceutický prostředek má pH asi 3,0 až asi 5,0, výhodně asi 3,0 až asi 4,0, nejvýhodněji asi 3,0.

V podstatě monomemí forma ÍFN-β poskytnutá způsoby přečištění podle tohoto vynálezu má několik použití, jak je popsáno v tomto vynálezu. Tato forma IFN-β může byt například použita přímo při vytváření farmaceutické směsí vhodné pro parenterální podávání, jak je zde uvedeno.

Po kroku diafiltrace nebo dialýzy s farmaceutickým pufrem podle výběru k odstranění zbytko40 vého guanidin HCl může být výsledná farmaceutická kompozice stabilizována proti denaturaci a ztrátě biologické aktivity zavedením stabilizátoru, který zahrnuje ale není omezen na uhlovodíky, výhodně vybrané ze skupiny sestávající zmannitolu, sorbitolu, glycerolu, dextrózy, sacharózy a trehalózy, nebo jejich směsí. V dalším aspektu tohoto vynálezu je preparát IFN-β získaný z kroků diafiltrace (nebo dialýzy) a stabilizace dále lyofilizován a rekonstituován v inertním neto45 xickém fyziologicky přijatelném nosičovém médiu pro terapeutické a klinické aplikace.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou vytvořeny se známou koncentrací v podstatě monomemí formy IFN-β tak, aby podávání konkrétní dávky vyvolalo požadovanou terapeutickou odezvu ve vztahu ke konkrétnímu stavu s odezvou na IFN-β v závislosti na podstupované terapii. Pojmem „požadovaná terapeutická odezva“ je označováno zlepšení stavu nebo symptomů spojených s daným stavem.

Farmaceutické kompozice obsahující IFN-β jsou užitečné při terapii zaměřené na stavy s odezvou na IFN-β. Pojmem „terapie“ jsou zamýšlena ošetření existujícího normálního stavu, které je zesíleno terapií pomocí IFN-β, terapeutickým ošetřením abnormálních stavů, které jsou s odez-9CZ 301360 Bó vou na IFN-β, a preventivní nebo pro fy faktické procedury zahrnující ošetření pomocí IFN- β tak, aby sc zabránilo výskytu nebo snížila intenzita výskytu abnormálních podmínek, rujuiěin „stavy s odezvou na IFN-β“ jsou zamýšleny jakékoli stavy, na které má buď pozitivní nebo negativní vliv IFN-β. Tyto stavy s odezvou na IFN-β mohou být normální stavy. Například savci mohou podstupovat terapii IFN-β ke zvýšení odezvy a/nebo schopnosti imunitní odezvy. Tyto terapie zahrnují ošetření k poskytnutí ochrany proti virovým infekcím nebo snížení intenzity virových infekcí, například viry Dengue nebo Sindbis. Naproti tomu stav s odezvou na IFN-β může být stav, který může být charakterizován jako chronický i akutní, jako je roztroušená skleróza se stavy zmírnění a opětného zhoršení. Na chorobu s odezvou na IFN-β může mít příznivý vliv io podávání farmaceutických kompozic podle tohoto vynálezu. Stavy s odezvou na IFN-β mohou také zahrnovat imunologické poruchy, jako je nedostatek imunity včetně snížené imunitní tolerance jako výsledek choroby nebo infekce nebo poruchy imunitní odezvy následkem vlivů prostředí a jiných účinků, jako je chemoterapie nebo jiné vystavení působení toxických chemikálií.

Následující příklady jsou poskytnuty pro ilustraci, nikoli pro jakékoli omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava IFN-β

IFN-β pro použití při těchto experimentech byl vyprodukován E. coli v podstatě stejným způsobem, jako je způsob popsaný v prvních několika krocích přečištění uvedeného v patentech US 4 462 940 a/nebo US 4 816 400. Transformované bakterie byly použity k produkci IFN-β; hostitelské buňky byly zkoncentrovány ajejich buněčné stěny byly narušeny. Poté byl připraven

IFN-β způsobem podle tohoto vynálezu a byla připravena zásoba přečištěného IFN-β,

Základní procedura byla následující:

1) Ze zásoby IFN-β byl vysrážen za použití ethanolu IFN-β. Šest dílů zásoby přečištěného

IFN-β bylo použito na čtyři díly ethanolu. Tento krok poskytnul více než 80 % interferonu jako pelety, které mohou být odstředěny.

2) Pelety byly poté rozpuštěny v 8 M guanidin HC1 na roztok asi 10 mg/ml proteinu. Toto rozpuštění je rychlé; malé množství přítomného SDS nebylo rozpuštěno a bylo odstraněno filtrací.

3) Výsledný roztok guanidin HCI byl poté zředěn v 10 mM pufru.

Příklad 2

Diluční (zřeďovací) parametiy pro krok s guanidin hydrochloridem (hydrochloridem guanidinu)

Byly provedeny vstupní experimenty ke zjištění optimálních zřeďovacích parametrů pro krok zředění guanidin hydrochloridem. Způsobem, který je uveden v tabulce 1, byl proveden v malém so rozsahu experiment, při kterém se stanovovala relativní výtěžnost; nej lepší výsledky byly získány při pH vyšším než 4,0 a pod 0,8 M guanidin hydrochloridu po zředění. Koncentrace monomeru interferonu-beta byla stanovena za použití HPLC s 40 mM glycinu a pufru o pH 3,0. Výsledky v tabulce 2 a typický soubor chromatogramů na obrázku 1 ukazuje, že přestože při nižších pH byly získány nekovalentní multimery, při pH 5,0 a vyšším byl získán monomemí interferon-beta.

- 10CZ JV1JW Bó

Tabulka 1

Relativní výtěžnost po zředění guanidin HCl (8M) IFN (-10 mg/ml) stanovená HPLC

		Koncentrace guanidin HCl po	zředění
10 mM pufr	pH	0,2 M	0,4 M	0,8 M	1,6 M
glycin	3	2	2,1	1	1
octan 3Odný	4	13	12,7	6	2
octan sodný	5	69	69	33	30
citrát sodný	6	79	62	43	42
fosforečnan sodný	7	82	71	41	48
Tris HCl	8	99	83	40	38

Tabulka 2

Procento agregátů po zředění guanidin HCl (8 M) IFN (-10 mg/ml) stanovené HPLC

		Koncentrace guanidin HCl po	zředěni
10 rriM pufr	pH	0,2 M	0,4 M	0,8 M	1,6 M
glycin	3	78	51	35	39
octan sodný	4	1	3	4	11
octan sodný	5	1	1	1	2
citrát sodný	6	1	1	1	2
fosforečnan sodný	7	1	1	1	3
Tris HCl	8	1	2	1	2

io Příklad 3

Výtěžnost kroku zředění guanidinem

Způsob byl rozpracován ke stanovení výtěžnosti kroku zředění guanidinem. Výsledky v tabulce 3 15 ukazují, že 41 až 57% výtěžnost byla získána čtyřnásobným zředěním při pH 6 až 8 s konečnou koncentrací proteinu asi 0,15 mg/ml. Koncentrace SDS v testovaných vzorcích byla menší než mikrogramů na miligram IFN.

- 11 CZ 301360 B6

Tabulka 3

Získání po regeneraci z 8 M guanidin HC1 (40x zředění)

10 mM pufr	pH	[IFN] mg/ml	výtěžnost %
Citrát sodný	6	0,12	41
.Fosforečnan sodný	7	0,17	57
Tris HCI	8	0,15	52

Příklad 4

Odstranění zbytkového guanidin HCI přítomného po zředění dialýzou

Dialýza byla použita k odstranění zbytkového guanidin HCI přítomného po zředění. Při pH 5 io byla nejvyšší výtěžnost, 83 %, získána bez přítomnosti dalšího NaCl; a při pH 7 bylo nejvyšší výtěžnosti, 70%, dosaženo pomocí 1000 mM NaCl, jak je uvedeno na obrázku 2. Ve všech případech došlo po dialýze k srážení, avšak rozpustné frakce byly monomemí, jak bylo zjištěno za použití HPLC.

Příklad 5

Účinek míchání na materiál guanidin hydrochlorid-renaturovaný IFN-β

Malý objem IFN-β v pufru obsahujícím 10 mM fosfátu (při pH 7,0) a 100 mM NaCl byl umístěn do zkumavky na třepačce. Po asi 3 hodinách se vysráželo asi 50 % materiálu IFN-β. To napovídá, že stabilita se bude zvyšovat vhodným povrchově aktivním činidlem, jako je Tween 80. Přídavek Tween 80 stabilizuje interferon a tím zvyšuje výtěžnost u dialyzačního kroku. Tween 80 však také může vyvolávat agregaci způsobem závislým na koncentraci, jak je uvedeno na obráz25 ku 3. Tyto agregáty jsou rozpustné. Jiná povrchově aktivní činidla mohou působit optimálněji.

Příklad 6

Renaturace proteinu a optimalizace složení prostředku za použití provozního přístupu

K odhadu zpětného získání IFN-β byly provedeny série experimentů během (1) denaturace IFNβ v 8 M guanidin hydrochloridu; (2) regenerace IFN-β rychlým zředěním pufrem; a (3) dialýzy k odstranění zbytkového guanidin hydroch loridu s a bez přítomnosti argininu k získání konečné35 ho prostředku. Složení směsi a podmínky v krocích 1 až 3 byly optimalizovány za použití poloprovozního pokusu. Použité faktory byly koncentrace proteinu, koncentrace guanidin hydrochloridu, pH, teplota a koncentrace argininu.

Bylo zjištěno, že pH, koncentrace IFN-β, koncentrace guanidin hydroch loridu po zředění a kon40 centrace argininu byly podstatné modelové faktory. Největší vliv byl pozorován u koncentrace IFN-β a argininu. Interakce mezi argininem a pH hrála podstatnou roli. Nej lepší výsledky byly dosaženy s pufrem s 10 mM NaPO4 pH 7,0 obsahujícím arginin v konečném pufru. Celková výtěžnost kroků 1 až 2 byla 80 až 100 % a výtěžnost kroku 3 byla 70 až 80 %.

-12CZ 301360 B6

Příklad 7

Odstranění SDS a tvorba IFN-β bez použití srážení ethanolem

Přečištěný IFN—β—1 b (1 1, 1,92 mg/ml v 0,4 % SDS, 50 mM acetátový pufr, pH 5,5) byl skladován při 5 °C. Během skladování se část přítomného SDS srážela. 250 ml tohoto materiálu (477,5 mg) bylo smícháno s 229 g guanidin hydrochloridu (6 M, celkový objem 400 ml) a mícháno při pokojové teplotě po dobu 15 minut za použití magnetického míchadla. Roztok 6 M guanidin hydrochlorid/protein byl poté přefiltrován přes Sartobran® P Capsule (velikost párů io 0,45 pm) k odstranění vysráženého SDS. Koncentrace proteinu stanovená UV při 280 nm byla

1,2 mg/ml. Výtěžnost proteinu byla 406 mg nebo 85 %.

400 ml materiálu zpracovaného guanidin hydrochloridem bylo zkoncentrováno za použití diafíltračního systému Mílii póre® Labscaley® TFF (Milipore lne) se dvěmi polysulfonovými mem15 bránami Pellicon® XL Biomax® 0,1 cm, 10 kD. (Milipore lne). Objem po koncentračním kroku byl 37 ml s koncentrací proteinu 10,3 mg/ml při výtěžnosti po koncentraci 381 mg nebo 93 %.

Za použití pipety bylo postupně přidáno 10 ml (103 mg) koncentrovaného roztoku guanidin hydrochlorid/protein k 590 ml 5 mM glycinu, pH roztoku 3,2. Pufr byl rychle míchán za použití magnetického míchadla, roztok proteinu byl přidán přímo k míchanému roztoku. Toto 60X zředění roztoku 6 M guanidin hydrochlorid/protein dalo roztok 0,1 M guanidin hydrochlorid/protein při 0,17 mg/ml. Těchto 600 ml bylo převedeno do 500ml diafiltrační jednotky vybavené dvěmi polysulfonovými membránami Pellicon® II 10 kD, 0,1 m². Tento roztok byl nejprve zkoncentrován na asi 700 ml na koncentraci proteinu 0,23 mg/ml a následně diafíltrován proti 9 obje25 mům (3,6 1) 5 mM glycinu při pH 3,2. Konečný diafiltrát (402 ml) byl měřen UV při 20 nm na konečnou koncentraci proteinu 0,23 mg/ml s 92,46 mg nebo 90% výtěžností pro diafiltrační krok a celkovou výtěžností 72 % rozpustného proteinu pro způsob přečištění.

Všechny publikace a patentové přihlášky uvedené v tomto popisu jsou uvedeny jako stav techni30 ky pro odborníka v oboru, kterého se tento vynález týká. Na všechny publikace a patentové přihlášky se tímto odkazuje ve stejném rozsahu, jako by každá individuální publikace nebo přihláška vynálezu byla specificky a individuálně uvedena. Podkapitoly popisu jsou určeny pouze pro usnadnění orientace v dokumentu a nejsou zamýšleny jako jakékoli omezení obsahu tohoto dokumentu.

Přestože výše uvedený vynález byl popsán v příkladech provedení do detailů za účelem jasnosti a porozumění, je zřejmé, že mohou být provedeny v rozsahu vynálezu určité změny a modifikace.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy kompozice obsahující monomemí interferon-beta (IFN-β), vy znač u 5 jící se t í m, že zahrnuje:

a) přípravu vzorku obsahujícího přečištěný IFN-β;

b) smíchání uvedeného vzorku s guanidin hydrochloridem (HCI) pro získání prvního roztoku io obsahujícího rozpuštěný denaturovaný IFN-β; a

c) renaturaci IFN—β zředěním uvedeného prvního roztoku prvním pufrem, přičemž první pufr má pH od 3,0 do 5,0.

15
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v roztoku renaturovaného IFN-β je přítomen zbytkový guanidin HCI v koncentraci 1,6 M nebo menší.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že první pufr má pH 3,0 až 4,0 a v roztoku renaturovaného IFN-β je přítomen zbytkový guanidin HCI v koncentraci 0,2 M nebo

20 menší.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že první pufr má pH 3,0 a v roztoku denaturovaného ÍFN-β je přítomen zbytkový guanidin HCI v koncentraci 0,1 M nebo menší.

25
5. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok odstraňování zbytkového guanidin HCI z roztoku renaturovaného IFN-β diafiltrací nebo dialýzou roztoku renaturovaného IFN-β v druhém pufru, přičemž druhý pufr má pH od 3,0 do 5,0 a je vybrán ze souboru sestávajícího z glycinu, asparagové kyseliny a sukcinátu sodného.

30
6. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že IFN-β je glykosylován nebo neglykosylován.
7. Způsob podle jakéhokoli z nároků laž6, vyznačující se tím, že IFN-β je produkován rekombinantně.
8, Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že IFN-β je zralý lidský IFN-β nebo jeho varianta a kde tato jeho varianta má alespoň 80% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí zralého lidského IFN-β.

40 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená varianta má aminokyselinovou sekvenci zralého lidského IFN-β, ve které je cysteinový zbytek v poloze 17 zralé lidské IFN-β sekvence nahrazen serinovým zbytkem.