PL213297B1

PL213297B1 - Stabilizowana, wolna od HSA kompozycja farmaceutyczna, sposób zwiekszania rozpuszczalnosci interferonu beta (IFN-β), sposób wytwarzania wolnej od HSA kompozycji farmaceutycznej oraz kompozycja farmaceutyczna otrzymana tym sposobem

Info

Publication number: PL213297B1
Application number: PL366790A
Authority: PL
Inventors: Bret A. Shirley; Susan Babuka; Bao-Lu Chen; Manider Hora; Minna Choe; Melanie Tellers
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2001-04-09
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2013-02-28
Also published as: EP2283897B1; JP2004529917A; CZ20032735A3; EP1381432B9; CZ305994B6; KR20030097825A; EP2283896B1; US20110104116A1; ES2367761T3; PL366790A1; NO20034492L; JP2008285499A; ATE545430T1; NO330259B1; ES2453623T3; US20080193415A1; US20040191219A1; US7371373B2; CY1113609T1; EP2283897A2

Description

Przedmiotem wynalazku jest stabilizowana, wolna od HSA kompozycja farmaceutyczna zawierająca interferon beta, sposób zwiększania rozpuszczalności interferonu beta (IFN-β), sposób wytwarzania wolnej od HSA kompozycji farmaceutycznej zawierającej interferon beta oraz kompozycja farmaceutyczna otrzymana tym sposobem.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy ogólnie kompozycji farmaceutycznych, dokładniej stabilizowanych preparatów interferonu β, które są wolne od albuminy surowicy ludzkiej (HSA) jako dodanej zaróbki farmaceutycznej.

Tło wynalazku

Interferony stanowią rodzinę glikoprotein, których wydzielanie z komórek indukowane jest przez szereg sygnałów, włączając wirusy, dwuniciowe RNA, inne polinukleotydy, antygeny i mitogeny. Interferony wykazują złożone aktywności biologiczne, w tym aktywności przeciwwirusowe, antyproliferacyjne i immunomodulujące. Na podstawie szeregu czynników, w tym aktywności przeciwwirusowych i antyproliferacyjnych, rozróżniono przynajmniej 3 różne typy ludzkich interferonów, α, β, γ.

Interferon-β (IFN-β) stanowi pierwszy zidentyfikowany skuteczny środek leczniczy dla chorych ze stwardnieniem rozsianym (MS) i wykazano, że zmniejsza ilość ataków doświadczanych przez pacjentów z ustępującym i nawracającym MS oraz wtórnym postępującym MS. Kompozycje IFN-β są również użyteczne w leczeniu infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i C.

Jak ma to miejsce w przypadku wszystkich środków farmaceutycznych opartych na białku, jedną główną przeszkodą, która musi zostać ominięta w zastosowaniu IFN-β jako środka terapeutycznego jest utrata przydatności farmaceutycznej, która może być skutkiem jego niestabilności w preparatach farmaceutycznych. Niestabilności fizyczne, które zagrażają aktywności polipeptydu i skuteczności w preparatach farmaceutycznych obejmują denaturację oraz tworzenie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych agregatów, natomiast chemiczne niestabilności obejmują hydrolizę, tworzenie imidu, utlenianie, racemizację i deamidowanie. O pewnych z tych zmian wiadomo, że prowadzą do utraty lub zmniejszenia aktywności farmaceutycznej białka będącego przedmiotem zainteresowania. W innych przypadkach dokładne skutki tych zmian nie są znane, ale powstające produkty degradacyjne są wciąż uważane za farmaceutycznie niedopuszczalne ze względu na potencjał niepożądanych skutków ubocznych.

Stabilizacja polipeptydów w kompozycjach farmaceutycznych pozostaje obszarem, w którym próby i błędy odgrywają główną rolę (analizowane przez Wang (1999) Int. J. Pharm., 185: 129 - 188; Wang i Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3 - S26). Zaróbki, które dodawane są do polipeptydowych preparatów farmaceutycznych w celu zwiększenia ich stabilności obejmują bufory, cukry, substancje powierzchniowo czynne, aminokwasy, glikole polietylenowe i polimery, ale skutki stabilizujące tych dodatków chemicznych różnią się w zależności od białka.

Jedną z głównych przeszkód w preparowaniu stabilizowanych preparatów farmaceutycznych IFN-β jest słaba rozpuszczalność cząsteczki IFN-β. Obecne preparaty wykorzystują zastosowanie HSA jako środka zwiększającego rozpuszczalność dla IFN-β. Jednakże, zastosowanie HSA ma wady. HSA jest produktem pochodzącym z ludzkiej krwi i musi być zatem zbierana od ludzi. Chociaż podejmuje się kroki w celu zmniejszenia ryzyka, to stosowanie ludzkich produktów krwiopochodnych, takich jak HSA, wiąże się z potencjalnym wprowadzeniem ludzkich wirusów, takich jak HIV i HCV. Wprowadzenie HSA do preparatu zakłóca również możliwość dokładnego określenia stabilności IFN-β w preparacie. Dzieje się tak dlatego, że zarówno HSA, jak i IFN-β, są białkami i HSA interferuje w pewne oznaczenia wskazujące stabilność IFN-β.

Preparaty IFN-β zawierające HSA opisano przykładowo w publikacji patentowej o numerze WO 95/31213. Natomiast pewne wolne od HSA preparaty IFN-β opisano przykładowo w z zgłoszeniu patentowym U.S.A. o numerze US-5004605 oraz publikacji patentowej o numerze WO 99/15193.

IFN-β jest białkiem, które w przypadku preparowania kompozycji farmaceutycznych wykazuje się tworzeniem agregatów, i z tego powodu pewna ilość tego białka w jego monomerycznej biologicznie aktywnej postaci tracona jest podczas przechowywania tych kompozycji. Tworzenie agregatów przez polipeptyd taki jak IFN-β podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznej może w niepożądany sposób wpłynąć na aktywność biologiczną tego polipeptydu, skutkując utratą skuteczności terapeutycznej kompozycji farmaceutycznej. Ponadto, tworzenie agregatów może stwarzać również inne problemy, takie jak blokowanie przewodów, błon i pomp, w przypadku gdy kompozycję farPL 213 297 B1 maceutyczną IFN-β podaje się z użyciem systemu do wlewek. Dodatkowo, wstrzyknięcie kompozycji farmaceutycznej zawierającej zagregowaną postać białka może potencjalnie spowodować wytworzenie reakcji immunogennej wobec zagregowanego białka.

W konsekwencji, istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe kompozycje farmaceutyczne IFN-β zawierające fizjologicznie kompatybilne substancje stabilizujące, które poprawiają rozpuszczalność tego białka oraz stabilizują białko przed tworzeniem agregatów, wzmacniając w ten sposób ich przydatność farmaceutyczną.

Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest stabilizowana wolna od HSA kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera od 0,01 do 20,0 mg/ml interferonu beta (IFN-β), lub jego biologicznie aktywnego wariantu, solubilizowanego w preparacie o niskiej sile jonowej, przy czym preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór posiadający siłę jonową nie większą niż 20 mM i zawierający bufor w stężeniu od 2 mM do 20 mM, przy czym bufor stanowi bufor glicynowy, kwasu asparaginowego, bursztynianu sodu, cytrynianowy, mrówczanowy, octanowy, kwasu glutaminowego, histydynowy, imidazolowy lub fosforanowy, przy czym pH wynosi od 3,0 do 4,5, i przy czym co najmniej 80% IFN-β jest w postaci monomerycznej.

Korzystnie wspomniany bufor występuje w stężeniu od 1 mM do 10 mM.

Korzystniej wspomniany bufor występuje w stężeniu od 2 mM do 10 mM.

Jeszcze korzystniej wspomniany bufor występuje w stężeniu od 2 mM do 7 mM.

Jeszcze bardziej korzystnie wspomniany bufor występuje w stężeniu od 2 mM do 5 mM.

Najkorzystniej wspomniany bufor występuje w stężeniu 5 mM.

Korzystnie bufor stanowi bufor glicynowy.

Korzystnie bufor stanowi bufor cytrynianowy.

Korzystnie bufor stanowi bufor octanowy.

Korzystnie bufor stanowi bufor mrówczanowy.

Korzystnie bufor stanowi bufor histydynowy.

Korzystnie bufor stanowi bufor bursztynianu sodu.

Korzystnie siła jonowa wspomnianego preparatu jest określona jedynie przez stężenie buforu.

Korzystniej preparat nie zawiera dodatkowych rodzajów jonów.

Korzystnie określone pH mieści się w zakresie 3,0 do 4,0.

Korzystniej określone pH mieści się w zakresie 3,5 do 4,0.

Jeszcze korzystniej określone pH wynosi 4,0.

Korzystnie preparat zawiera niejonowy środek tonizujący w ilości wystarczającej do nadania preparatowi izotoniczności w stosunku do płynów ustrojowych.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi monosacharyd aldozowy albo ketozowy.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi disacharyd.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi alditol.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi sacharoza.

Jeszcze korzystniej gdy niejonowy środek tonizujący stanowi alditol, niejonowy środek tonizujący stanowi mannitol.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza, sacharoza, mannitol lub ich kombinacja.

Korzystniej niejonowy środek tonizujący występuje w stężeniu od 1% do 10%.

Jeszcze korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza lub sacharoza w stężeniu od 8% do 10% wag./obj.

Jeszcze korzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi mannitol w stężeniu od 4% do 6% wag./obj.

Najkorzystniej niejonowy środek tonizujący stanowi mannitol w stężeniu 5% wag./obj.

Korzystnie IFN-β stanowi ludzki IFN-β.

Korzystnie IFN-β jest glikozylowany.

Korzystnie IFN-β jest nieglikozylowany.

Korzystnie IFN-β jest kowalencyjnie związany z glikolem polietylenowym.

Korzystnie IFN-β jest wytworzony rekombinacyjnie.

Korzystniej IFN-β jest wytworzony poprzez hodowlę komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IFN-β, przy czym jako komórki gospodarza stosowane są komórki prokariotyczne.

PL 213 297 B1

Korzystniej IFN-β jest wytworzony poprzez hodowlę komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IFN-β, przy czym jako komórki gospodarza stosowane są komórki eukariotyczne.

Jeszcze korzystniej komórkę gospodarza stanowi komórka drożdżowa.

Jeszcze korzystniej komórkę gospodarza stanowi komórka owadzia.

Jeszcze korzystniej komórkę gospodarza stanowi komórka ssacza.

Korzystnie IFN-β występuje w stężeniu 0,015 mg/ml do 12,5 mg/ml.

Korzystnie IFN-β występuje w stężeniu 0,025 mg/ml do 10,0 mg/ml.

Korzystnie IFN-β występuje w stężeniu 0,05 mg/ml do 8,0 mg/ml.

Korzystnie IFN-β występuje w stężeniu 0,075 mg/ml do 6,0 mg/ml.

Korzystnie IFN-β występuje w stężeniu 0,1 mg/ml do 4,0 mg/ml.

Korzystnie kompozycja zawiera EDTA lub jedną z jego soli.

Korzystniej kompozycja zawiera EDTA disodowy.

Korzystnie kompozycja zawiera surfaktant niejonowy.

Korzystniej surfaktant niejonowy stanowi ester polioksyetylenu sorbitolowego.

Jeszcze korzystniej surfaktant niejonowy stanowi polisorbat 80.

Jeszcze korzystniej surfaktant niejonowy stanowi polisorbat 20.

Jeszcze korzystniej surfaktant niejonowy stanowi ester polioksypropylenopolioksyetylenowy.

Jeszcze korzystniej surfaktant niejonowy stanowi Pluronic F68.

Jeszcze korzystniej surfaktant niejonowy stanowi Pluronic F127.

Jeszcze korzystniej surfaktant niejonowy stanowi alkohol polioksyetylenowy.

Korzystnie kompozycja jest przechowywana we wstępnie napełnionej strzykawce gotowej do użycia.

Korzystnie okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 6 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

Korzystniej okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 12 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

Jeszcze korzystniej okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 18 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

Nawet jeszcze korzystniej okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 20 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

Nawet jeszcze korzystniej okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 22 miesiące przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

Nawet jeszcze korzystniej okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 24 miesiące przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

Korzystnie kompozycja ta jest przeznaczona do zastosowania w leczeniu stwardnienia rozsianego.

Korzystnie kompozycja ta jest podawana przez wstrzyknięcie.

Korzystniej kompozycja ta jest podawana przez wstrzyknięcie podskórne.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób zwiększania rozpuszczalności interferonu beta (IFN-β), lub jego biologicznie aktywnego wariantu, w kompozycji farmaceutycznej pod nieobecność albuminy surowicy ludzkiej, polegający na tym, że preparuje się wspomnianą kompozycję z preparatem o niskiej sile jonowej, przy czym preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór posiadający siłę jonową nie większą niż 20 mM i zawierający bufor w stężeniu od 2 mM do 20 mM, przy czym bufor stanowi bufor glicynowy, kwasu asparaginowego, bursztynianu sodu, cytrynianowy, mrówczanowy, octanowy, kwasu glutaminowego, histydynowy, imidazolowy lub fosforanowy, przy czym pH wynosi od 3,0 do 4,5; oraz wprowadza się wspomniany IFN-β, lub jego biologicznie aktywny wariant, do wspomnianej kompozycji, przy czym co najmniej 80% IFN-β jest w postaci monomerycznej.

Korzystnie jako wspomnianą kompozycję stosuje się kompozycję jak określono w jednym z zastrz. 1 do 64.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania wolnej od HSA kompozycji farmaceutycznej zawierającej interferon beta (IFN-β), polegający na tym, że preparuje się wspomnianą kompozycję z preparatem o niskiej sile jonowej, przy czym preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór posiadający siłę jonową nie większą niż 20 mM i zawierający bufor w stężeniu od 2 mM do 20 mM, przy czym bufor stanowi bufor glicynowy, kwasu asparaginowego, bursztynianu sodu, cytrynianowy, mrówczanowy, octanowy, kwasu glutaminowego, histydynowy, imidazolowy i fosforanowy, przy czym pH wynosi od 3,0 do 4,5; oraz wprowadza się wspomniany IFN-β, lub jego biologicznie

PL 213 297 B1 aktywny wariant, do wspomnianej kompozycji i przy czym co najmniej 80% IFN-β jest w postaci monomerycznej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że została wytworzona powyższym sposobem.

Wynalazek dostarcza kompozycji zawierających interferon beta (IFN-β) jako terapeutycznie aktywny składnik oraz sposoby użyteczne do ich wytwarzaniu. Kompozycje stanowią stabilizowane kompozycje farmaceutyczne, które są wolne od albuminy surowicy ludzkiej (HSA) jako zaróbki farmaceutycznej i które zawierają zasadniczo monomeryczny IFN-β solubilizowany w preparacie o niskiej sile jonowej. Preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór, który zawiera bufor w ilości wystarczającej do utrzymania kompozycji w ustalonym pH plus lub minus 0,5 jednostki, przy czym ustalone pH wynosi około 3,0 do około 5,0, i który ma siłę jonową nie większą niż około 20 mM. Do kompozycji farmaceutycznych włączany jest niejonowy środek tonizujący aby spowodować izotoniczność kompozycji, przy czym środek tonizujący stanowi węglowodan. Dostarczono również sposoby zwiększania rozpuszczalności IFN-β w kompozycjach farmaceutycznych oraz zwiększania ilości monomerycznego IFN-β w tych kompozycjach, bez stosowania albuminy surowicy ludzkiej.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia rozpuszczalność IFN^-1b w roztworach chlorku sodu.

Figura 2 przedstawia rozpuszczalność IFN^-1b w preparatach o niskiej sile jonowej.

Figura 3 przedstawia wpływ pH 3,0 na stan agregacji IFN-β·^

Figura 4 przedstawia wpływ pH 4,0 na stan agregacji IFN-β·^

Figura 5 przedstawia wpływ pH 5,0 na stan agregacji IFN-β·^

Figura 6 przedstawia wpływ siły jonowej (0 mM NaCl) na stan agregacji IFN-β·^

Figura 7 przedstawia wpływ siły jonowej (50 mM NaCl) na stan agregacji FN^-W.

Figura 8 przedstawia wpływ siły jonowej(150 mM NaCl) na stan agregacji FN^-W.

Figura 9 przedstawia stan agregacji IFN^-1b w preparacie o pH 3, zawierającym jedynie 5 mM glicynę jako środek buforujący.

Figura 10 przedstawia wpływ niejonowego środka tonizującego (9% sacharoza) na stan agregacji IFN^-1b w preparacie pokazanym na Figurze 9.

Figura 11 przedstawia wpływ niejonowego środka tonizującego (9% trehaloza) na stan agregacji IFN^-1b w preparacie pokazanym na Figurze 9.

Figura 12 przedstawia procent początkowego stężenia IFN^-1b w liofilizowanych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 8-tygodniowym przechowywaniu w 40°C. Stężenie określono poprzez absorpcję UV.

Figura 13 przedstawia procent głównego maksimum IFN^-1b w liofilizowanych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 8-tygodniowym przechowywaniu w 40°C. Procent głównego maksimum określono poprzez analizę RP-HPLC.

Figura 14 przedstawia procent początkowego stężenia IFN^-1b w liofilizowanych preparatach zawierających 9% trehalozę po 9-miesięcznym przechowywaniu w 5°C lub 30°C. Stężenie określono poprzez spektroskopię UV.

Figura 15 przedstawia procent głównego maksimum IFN^-1b w liofilizowanych preparatach zawierających 9% trehalozę po 9-miesięcznym przechowywaniu w 5°C lub 30°C. Procent głównego maksimum określono poprzez analizę RP-HPLC.

Figura 16 przedstawia procent początkowego stężenia IFN^-1b w ciekłych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 9-tygodniowym przechowywaniu w 30°C. Stężenie określono poprzez absorbancję UV.

Figura 17 procent głównego maksimum IFN^-1b w ciekłych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 8-tygodniowym przechowywaniu w 30°C. Procent głównego maksimum określono poprzez analizę RP-HPLC.

Figura 18 przedstawia procent początkowego stężenia IFN^-1b w ciekłych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 9-miesięcznym przechowywaniu w fiolkach w 5°C. Stężenie określono poprzez spektroskopię UV.

Figura 19 przedstawia procent głównego maksimum IFN^-1b w ciekłych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 9-miesięcznym przechowywaniu w fiolkach w 5°C. Procent głównego maksimum określono poprzez analizę RP-HPLC.

PL 213 297 B1

Figura 20 przedstawia procent początkowego stężenia IFN-e-1b w ciekłych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 9-tygodniowym przechowywaniu w 30°C. Stężenie określono poprzez spektroskopię UV.

Figura 21 przedstawia procent początkowego stężenia IFN^-1b w liofilizowanych preparatach zawierających 9% trehalozę lub 9% sacharozę po 8-tygodniowym przechowywaniu w 40°C. Stężenie określono poprzez spektroskopię UV.

Figura 22 przedstawia procent początkowego stężenia IFN^-1b w ciekłych preparatach zawierających 5% mannitol po 6-miesięcznym przechowywaniu w 5°C. Stężenie określono poprzez spektroskopię UV.

Figura 23 procent głównego maksimum IFN^-1b w ciekłych preparatach zawierających 5% mannitol po 6-miesięcznym przechowywaniu w 5°C. Procent głównego maksimum określono poprzez analizę RP-HPLC.

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek ukierunkowany jest na stabilizowane kompozycje farmaceutyczne, które zawierają interferon beta (IFN-β) oraz sposoby ich wytwarzania. Kompozycje te wytwarza się bez albuminy surowicy ludzkiej (HSA), i są one w ten sposób wolne od tej zaróbki farmaceutycznej. Kompozycje takie przywoływane są tu jako kompozycje farmaceutyczne IFN-β „wolne od HSA. Kompozycje te zawierają zasadniczo monomeryczny IFN-β, który solubilizuje się w preparacie o niskiej sile jonowej. Przez preparat o „niskiej sile jonowej rozumie się roztwór, który zawiera bufor w ilości, która jest wystarczająca, aby utrzymać pH kompozycji farmaceutycznej między plus lub minus 0,5 jednostki ustalonego pH, i który ma siłę jonową nie większą niż około 20 mM. Poprzez „siłę jonową rozumie się standardową definicję chemiczną stosowaną w odniesieniu do roztworu, gdzie siła jonowa roztworu ₂ równa się ½ Σ CiZi², w którym C oznacza stężenie a z oznacza ładunek. Bufor występuje w preparacie o niskiej sile jonowej w stężeniu około 2 mM do około 20 mM, korzystniej około 2 mM do około 10 mM i jeszcze korzystniej około 2 mM do około 5 mM. Zatem, w pewnych postaciach realizacji preparat o niskiej sile jonowej zawiera bufor w stężeniu około 2 mM do około 10 mM, około 2 mM do około 7 mM, około 2 mM do około 5 mM, około 2 mM, około 3 mM, około 4 mM lub około 5 mM. Odpowiednie bufory, które mogą być zastosowane do wytwarzania preparatu o niskiej sile jonowej, w których IFN-β jest solubilizowany, obejmują, ale bez ograniczeń, glicynę, kwas asparaginowy, bursztynian sodu, cytrynian, mrówczan, octan, kwas glutaminowy, histydynę, imidazol i fosforan, korzystnie glicynę, kwas asparaginowy i bursztynian sodu, korzystniej glicynę i kwas asparaginowy.

W pewnych postaciach realizacji siła jonowa preparatu jest określana jedynie przez stężenie buforu i w ten sposób preparat nie zawiera dodatkowych rodzajów jonów, takich jak chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek magnezu, sól amonowa i tym podobne, przyczyniających się do jego siły jonowej.

Zastosowanie preparatu o niskiej sile jonowej, który jest roztworem zawierającym bufor w stężeniu około 2 mM do około 5 mM, zapewnia, że preparat stabilizowanych kompozycji farmaceutycznych IFN-β ma pH około 3,0 do około 5,0, korzystnie około 3,0 do około 4,5, korzystniej 3,0 do około 4,0, jeszcze korzystniej 3,5 do około 4,0, najkorzystniej 4,0, w zależności od szczególnie zastosowanego buforu. Zatem, gdy buforem jest glicyna, pH kompozycji wynosi około 3,0 do około 3,5, korzystnie około 3,0. Gdy buforem jest kwas asparaginowy, pH kompozycji wynosi około 3,5 do około 4,5, korzystnie około 4,0. Gdy buforem jest bursztynian sodu, pH kompozycji wynosi około 4,5 do około 5,0, korzystnie około 5,0.

Dzięki utrzymywaniu pH kompozycji farmaceutycznych według wynalazku w zakresie około pH 3,0 do pH około 5,0 możliwe jest zwiększenie rozpuszczalności IFN-β w tych kompozycjach poza taką, która jest zwykle możliwa przy braku zastosowania albuminy surowicy ludzkiej. Ponadto, poprzez wprowadzenie IFN-β do preparatu o niskiej sile jonowej jak tu zdefiniowano możliwe jest wytworzenie kompozycji farmaceutycznych, które zawierają zasadniczo monomeryczny IFN-β. Przez „zasadniczo monomeryczny rozumie się, że większość IFN-β (wagowo) obecnego w kompozycji występuje raczej w swej postaci monomerycznej niż w postaci zagregowanej. Przez „zagregowana rozumie się oddziaływanie fizyczne pomiędzy cząsteczkami polipeptydowymi, które skutkuje powstaniem multimerów (dimerów, trimerów itp.), które mogą pozostawać rozpuszczalne lub wytrącać się z roztworu. Postać monomeryczna polipeptydu IFN-β pozostaje rozpuszczalna, więc mówi się, że jest „solubilizowana w preparacie o niskiej sile jonowej lub kompozycjach farmaceutycznych według niniejszego wynalazku. Odsetek (wagowo) IFN-β, który jest w swej postaci monomerycznej w kompozycjach wolnych od HSA według niniejszego wynalazku wynosi od 80% i więcej. Niniejszy wynalazek dostarcza zatem

PL 213 297 B1 kompozycji farmaceutycznych IFN-β wolnych od HSA, które zawierają przynajmniej około 80% IFN-β w jego postaci monomerycznej, w przeciwieństwie do jego postaci zagregowanej, dogodnie przynajmniej około 85%, w szczególności przynajmniej około 90%, a zwłaszcza przynajmniej około 91%, 92%,

93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej IFN-β w jego postaci monomerycznej.

W pewnych postaciach realizacji wynalazku, kompozycje farmaceutyczne IFN-β wolne od HSA zawierają ponadto środek tonizujący w ilości wystarczającej aby spowodować izotoniczność z płynami ciała. Można sprawić aby kompozycje były izotoniczne dzięki zastosowaniu szeregu niejonowych środków modyfikujących toniczność znanych pospolicie specjalistom w dziedzinie. Są to zazwyczaj węglowodany różnych klasyfikacji (patrz, na przykład, Voet i Voet (1990) Biochemistry (John Willey & Sons, Nowy Jork). W niniejszym wynalazku mogą być zastosowane jako niejonowe środki tonizujące monosacharydy klasyfikowane jako aldozy, takie jak glukoza, mannoza, arabinoza i ryboza, jak również klasyfikowane jako ketozy, takie jak fruktoza, sorboza i ksyluloza. Mogą być również zastosowane disacharydy, takie jak sacharoza, maltoza, trehaloza i laktoza. Dodatkowo, niejonowymi środkami tonizującymi użytecznymi w niniejszym wynalazku mogą być alditole (acykliczne polihydroksyalkohole) takie jak glicerol, mannitol, ksylitol i sorbitol. Najkorzystniejszymi niejonowymi środkami tonizującymi są trehaloza, sacharoza i mannitol, lub ich kombinacja. Niejonowy środek tonizujący dodaje się w ilości wystarczającej, aby uzyskać izotoniczność preparatu z płynami ustrojowymi. Po wprowadzeniu do kompozycji farmaceutycznych IFN-β wolnych od HSA niejonowy środek tonizujący występuje w stężeniu około 1% do około 10% zależnie od zastosowanego środka. Zatem, w jednej postaci realizacji niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza lub sacharoza w stężeniu około 8% do około 10%, korzystnie około 9% wag./obj., i korzystnie jest nim trehaloza w tym stężeniu. W innej postaci realizacji niejonowym środkiem tonizującym jest mannitol w stężeniu około 4% do około 6%, korzystnie około 5% wag./obj. W innych postaciach realizacji niejonowy środek tonizujący to kombinacja trehalozy i mannitolu, lub sacharozy i mannitolu, przy czym trehalozy i sacharozy obecne są w stężeniu około 1% wag./obj. a mannitol obecny jest w stężeniu około 3% do około 5% wag./obj., w szczególności około 4,6% wag./obj.

Kompozycje farmaceutyczne IFN-β wolne od HSA według niniejszego wynalazku to kompozycje ciekłe. Dla celów niniejszego wynalazku określenie „ciekłe w odniesieniu do kompozycji farmaceutycznych lub preparatów ma obejmować określenie „wodne, i obejmuje preparaty ciekłe, które są zamrożone.

Wolne od HSA kompozycje farmaceutyczne IFN-β według niniejszego wynalazku są kompozycjami „stabilizowanymi. Przez „stabilizowane rozumie się, że kompozycje zachowują polipeptyd IFN-β w jego zasadniczo monomerycznym stanie podczas przechowywania, więc i skuteczność terapeutyczna tego polipeptydu nie jest zaburzona przez tworzenie agregatów. Przez „podczas przechowywania rozumie się, że ciekła kompozycja farmaceutyczna lub preparat po wytworzeniu nie są natychmiastowo podawane podmiotowi. Jest ona raczej po wytworzeniu zapakowana do przechowywania albo w postaci ciekłej, w stanie zamrożonym, albo w postaci liofilizowanej do późniejszego dodania do postaci wodnej lub innej odpowiedniej postaci do podania podmiotowi. Stabilność uzyskuje się dzięki wykluczeniu zastosowania HSA jako środka stabilizującego i solubilizującego. Zaleca się, by kompozycje według wynalazku przechowywać bezpośrednio w ich postaci ciekłej, aby w pełni wykorzystać zaletę posiadania stabilności podczas przechowywania w postaci ciekłej, ułatwienia podawania bez rekonstytucji, i możliwości dostarczania preparatu we wstępnie napełnionych strzykawkach gotowych do użycia lub jako preparatów wielodawkowych, w przypadku gdy preparat jest kompatybilny z środkami bakteriostatycznymi. Stabilizowane wolne od HSA kompozycje farmaceutyczne IFN-β według wynalazku dogodnie mają okres trwałości przynajmniej 6 miesięcy, 12 miesięcy, 18 miesięcy, dogodniej przynajmniej 20 miesięcy, jeszcze dogodniej przynajmniej 22 miesiące, w szczególności przynajmniej około 24 miesiące przy przechowywaniu w 2 - 8°C.

Sposoby monitorowania stabilności wolnych od HSA kompozycji farmaceutycznych IFN-β według wynalazku są znane w dziedzinie, w tym sposoby opisane w przykładach tu ujawnionych. Zatem, tworzenie agregatów IFN-β podczas przechowywania ciekłej kompozycji farmaceutycznej według wynalazku może być łatwo określone poprzez mierzenie zmiany rozpuszczalnego IFN-β w roztworze w czasie. Ilość rozpuszczalnego polipeptydu w roztworze może być określona ilościowo z użyciem szeregu oznaczeń analitycznych przystosowanych do wykrywania IFN-β. Oznaczenia takie obejmują przykładowo HPLC z odwróconą fazą (RP-HPLC) i spektroskopię absorpcji UV jak opisano w przykładach poniżej. Oznaczanie agregatów zarówno rozpuszczalnych jak i nierozpuszczalnych podczas przechowywania w ciekłych preparatach można uzyskać przykładowo, jak stwierdzono w przykładach

PL 213 297 B1 poniżej, z użyciem ultrawirowania analitycznego do odróżniania części rozpuszczalnego polipeptydu, który jest obecny w postaci rozpuszczalnych agregatów i tej części, która jest obecna w niezagregowanej, biologicznie aktywnej postaci molekularnej.

Stabilizowane preparaty farmaceutyczne według wynalazku zawierają IFN-β i jego warianty. Określenie „IFN-β w użytym tu znaczeniu odnosi się do IFN-β lub jego wariantów, czasami określanych jako polipeptydy IFN-3-podobne. Warianty ludzkiego IFN-β, mogą być wariantami naturalnie występującymi (np. wariantami allelicznymi występującymi w lokus IFN-β) lub mogą być wytworzone rekombinacyjnie i mają sekwencje aminokwasowe, które są takie same jak sekwencja dojrzałego natywnego IFN-β, podobne do niej lub zasadniczo podobne do niej. Objęte są również fragmenty IFN-β lub skrócone postaci IFN-β, które zachowują swoją aktywność biologiczną. Te biologicznie aktywne fragmenty lub skrócone postaci IFN-β są wytwarzane poprzez usuwanie reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej IFN-β pełnej długości z użyciem technik rekombinacji DNA dobrze znanych w dziedzinie. Polipeptydy IFN-β mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane, jako że istnieją doniesienia w literaturze, że zarówno glikozylowane jak i nieglikozylowane IFN-β wykazują jakościowo podobne właściwości specyficzne i że, z tego powodu, ugrupowania glikozylowe nie są zaangażowane ani nie przyczyniają się do aktywności biologicznej IFN-β.

Zawarte tu warianty IFN-β obejmują muteiny sekwencji dojrzałego natywnego IFN-β, w których jedna lub więcej reszt cysteiny, które nie są zasadnicze dla aktywności biologicznej zostały celowo usunięte lub zastąpione innymi aminokwasami w celu eliminacji miejsc dla albo sieciowania albo niepoprawnego wewnątrzcząsteczkowego tworzenia mostków disiarczkowych. Warianty IFN-β tego typu obejmują warianty zawierające glicynę, walinę, alaninę, leucynę, izoleucynę, tyrozynę, fenyloalaninę, histydynę, tryptofan, serynę, treoninę lub metioninę podstawione za cysteinę znajdowaną w miejscu aminokwasu 17 dojrzałej natywnej sekwencji aminokwasowej. Seryna i treonina stanowią najbardziej zalecane zastąpienia ze względu na ich analogię chemiczną do cysteiny. Najbardziej zalecane są podstawienia seryny. W pewnej postaci realizacji cysteinę znajdowaną w pozycji aminokwasu 17 dojrzałej natywnej sekwencji aminokwasowej zastępuje się seryną. Cysteina 17 może również być usunięta z użyciem sposobów znanych w dziedzinie (patrz przykładowo Patent U.S. o numerze 4588584), co skutkuje powstaniem dojrzałej muteiny IFN-β, która jest o jeden aminokwas krótsza niż dojrzały natywny IFN-β. Patrz również, jako przykłady, Patenty U.S. o num erach 4530787, 4572798 i 45588585. Zatem, niniejszym wynalazkiem objęte są również warianty IFN-β z jedną lub więcej mutacjami, które poprawiają, na przykład, ich użyteczność farmaceutyczną.

Specjalista w dziedzinie uzna, że można poprzez mutację wprowadzić dodatkowe zmiany w sekwencjach nukleotydowych kodujących IFN-β, prowadząc w ten sposób do zmian w sekwencji aminokwasowej IFN-β, bez zmieniania aktywności biologicznej interferonu. Zatem, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca wariant IFN-β o sekwencji, która różni się od sekwencji aminokwasowej dojrzałego natywnego IFN-β może być wytworzona poprzez wprowadzenie jednej lub więcej substytucji nukleotydowych, addycji lub delecji do odpowiednich sekwencji nukleotydowych ujawnionych tutaj, tak że jedna lub więcej substytucji aminokwasowych, addycji lub delecji wprowadzanych jest do kodowanego IFN-β. Mutacje mogą być wprowadzane z użyciem standardowych technik, takich jak mutageneza ukierunkowana i mutageneza z użyciem PCR. Takie warianty IFN-β są również objęte niniejszym wynalazkiem.

Przykładowo, konserwatywne substytucje aminokwasowe mogą być stworzone w jednej lub więcej przewidzianych, dogodnie niezasadniczych resztach aminokwasowych. „Niezasadnicza reszta aminokwasowa jest resztą, która może być zmieniona w sekwencji IFN-β dzikiego typu bez zmieniania jego aktywności biologicznej, natomiast „zasadnicza reszta aminokwasowa jest wymagana dla aktywności biologicznej. „Konserwatywna substytucja aminokwasowa jest tą, w której resztę aminokwasową zastępuje się resztą aminokwasową o podobnym łańcuchu bocznym. Rodziny reszt aminokwasowych o podobnych łańcuchach bocznych określono w dziedzinie. Rodziny te obejmują aminokwasy o zasadowych łańcuchach bocznych (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowych łańcuchach bocznych (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nienaładowanych polarnych łańcuchach bocznych (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnych łańcuchach bocznych (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), betarozgałęzionych łańcuchach bocznych (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatycznych łańcuchach bocznych (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Substytucji takich nie przeprowadzałoby się dla konserwowanych reszt aminokwasowych lub dla reszt aminokwasowych usytuowanych w obrębie konserwowanego motywu.

PL 213 297 B1

Ewentualnie, sekwencje nukleotydowe wariantów IFN-β mogą być stworzone przez wprowadzenie mutacji w sposób przypadkowy w całej lub części sekwencji kodującej IFN-β, tak jak przez mutagenezę wysycenia, a powstające w wyniku tego mutanty mogą być przeszukiwane pod względem aktywności biologicznej IFN-β w celu identyfikacji mutantów, które zachowują aktywność. Po mutagenezie kodowane białko może być wyrażane rekombinacyjnie a aktywność białka może być określona z użyciem standardowych technik oznaczeniowych tutaj opisanych.

Biologicznie aktywne warianty IFN-β będą miały przynajmniej 80%, dogodnie około 90% do około 95% lub więcej i dogodniej około 96% do około 99% lub więcej identyczności sekwencji aminokwasowej w stosunku do sekwencji aminokwasowej dojrzałego natywnego IFN-β, który służy jako podstawa dla porównania. Przez „identyczność sekwencji rozumie się, że takie same reszty aminokwasowe znajdowane są w polipeptydzie wariantu i cząsteczce polipeptydu, który służy jako odniesienie gdy określone przyległe segmenty sekwencji aminokwasowej wariantu przyrównuje się i porównuje do sekwencji aminokwasowej cząsteczki referencyjnej.

W celach optymalnego przyrównania dwóch sekwencji w celu określenia identyczności sekwencji przyległy segment sekwencji aminokwasowej wariantu może mieć dodatkowe reszty aminokwasowe lub usunięte reszty aminokwasowe w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej cząsteczki referencyjnej. Przylegający segment stosowany do porównania z referencyjną sekwencją aminokwasową będzie zawierał przynajmniej 20 przylegających reszt aminokwasowych. Poprawki dla zwiększonej identyczności sekwencji związane z włączaniem przerw w sekwencji aminokwasowej wariantu można wprowadzić poprzez przypisanie kar za przerwy. Sposoby przyrównań sekwencji są dobrze znane w dziedzinie.

Zatem, określenie procentu identyczności pomiędzy dowolnymi dwoma sekwencjami można uzyskać z użyciem algorytmu matematycznego. Jednym zalecanym nieograniczającym przykładem algorytmu matematycznego wykorzystywanego dla porównań sekwencji jest algorytm Myersa i Millera (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11 - 7. Taki algorytm wykorzystywany jest w programie ALIGN (wersja 2.0), który jest częścią pakietu oprogramowania porównań GCG.

Przy porównywaniu sekwencji aminokwasowych z użyciem programu ALIGN może być stosowana macierz podstawień aminokwasów PAM 12 0, długość przerwy 12 i kara za przerwę 4. Innym zalecanym nieograniczającym przykładem algorytmu matematycznego do zastosowania przy porównywaniu dwóch sekwencji jest algorytm Karlina i Altschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 - 5877, modyfikowany jak opisano w Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 - 5877. Taki algorytm wprowadzony jest do programów NBLAST i XBLAST Altschula i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410. W celu uzyskania sekwencji aminokwasowej podobnej do polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania można przeprowadzić poszukiwania sekwencji aminokwasowych BLAST z użyciem programu XBLAST, wartość = 50, długość słowa = 3. W celu uzyskania dopasowań sekwencji z przerwami w celu porównania można wykorzystywać BLAST z przerwami (ang. gapped BLAST) jak opisano w Altschul i wsp., (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3389 - 3402. Ewentualnie, w celu przeprowadzenia zintegrowanego poszukiwania, które wykrywa odległe związki między cząsteczkami można zastosować PSI-BLAST. Patrz Altschul i wsp. (1997) powyżej. Używając programów BLAST, BLAST z przerwami lub PSI-BLAST można stosować standardowe parametry. Patrz http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Patrz również program ALIGN (Dayhoff (1978) w Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl.3, National Biomedical Research Foundation, Waszyngton, D.C.) oraz programy w Wisconsin Sequence Analysis Package, Wersja 8 (dostępne od Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), na przykład, program GAP, gdzie wykorzystuje się standardowe parametry programu.

Rozważając procent identyczności sekwencji aminokwasowej pewne pozycje reszt aminokwasowych mogą różnić się jako wynik konserwowanych substytucji aminokwasowych, które nie wpływają na właściwości funkcjonalne białka. W takich przykładach, procent identyczności sekwencji może być zwiększony biorąc poprawkę na podobieństwo konserwatywnie podstawionych aminokwasów. Takie zwiększenia identyczności są dobrze znane w dziedzinie. Patrz, na przykład, Myers i Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17.

Biologicznie aktywne warianty IFN-β objęte niniejszym wynalazkiem obejmują również polipeptydy IFN-β, które zostały kowalencyjnie połączone, na przykład, z glikolem polietylenowym (PEG) lub albuminą. Takie kowalencyjne hybrydowe cząsteczki IFN-β mają pewne pożądane właściwości farmaceutyczne, takie jak wydłużony okres półtrwania w surowicy po podaniu pacjentowi. Sposoby tworzenia adduktów PEG - IFN-β wymagają chemicznej modyfikacji glikolu monometoksymetylenowego

PL 213 297 B1 w celu stworzenia aktywowanego związku, który będzie reagował z IFN-β. Sposoby wytwarzania i stosowania adduktów polipeptydów połączonych z PEG są opisane, przykładowo, w Delgado i wsp.

(1992) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 9: 249 - 304. Sposoby wytwarzania polipeptydów fuzyjnych z albuminą wymagają fuzji sekwencji kodujących polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania (np. IFN-β) z albuminą i są opisane w Patencie U.S. o numerze 5876969.

Biologicznie aktywne warianty IFN-β objęte niniejszym wynalazkiem powinny zachowywać aktywności IFN-β, zwłaszcza zdolność do wiązania z receptorami IFN-β. W pewnych postaciach realizacji warianty IFN-β zachowują przynajmniej około 25%, około 50%, około 75%, około 85%, około 90%, około 95%, około 98%, około 99% lub więcej aktywności biologicznej polipeptydów, których sekwencje aminokwasowe przedstawione są na Figurze 1 lub 2. Objęte są również warianty IFN-β, których aktywność jest zwiększona w porównaniu z aktywnością polipeptydów przedstawionych na Figurze 1 lub 2. Aktywność biologiczną wariantów IFN-β można zmierzyć z użyciem dowolnego sposobu znanego w dziedzinie. Przykłady takich oznaczeń można znaleźć w Fellous i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 3082 - 3086; Czerniecki i wsp. (1984) J. Virol. 49(2): 490 - 496; Mark i wsp. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 5662 - 5666; Branca i wsp. (1981) Nature 277: 221 - 223; Williams i wsp. (1979) Nature 282: 582 - 586; Herberman i wsp. (1979) Nature 277: 221 - 223; Anderson i wsp. (1982) J. Biol. Chem. 257(19): 11301 - 11304 i oznaczeniu mocy IFN-β opisanym tutaj (patrz Przykład 2).

Preparaty IFN-β według wynalazku mogą pochodzić z dowolnego gatunku zwierząt w tym, ale bez ograniczeń, gatunków ptaków, psów, bydła, świń, koni i ludzkie. Dogodnie w przypadku gdy preparat ma być zastosowany w leczeniu zaburzenia ssaka IFN-β pochodzi z gatunków ssaków i dogodniej pochodzi z tego samego gatunku ssaka jak ssak poddawany leczeniu takiego zaburzenia. Zatem, gdy ssakiem poddawanym leczeniu jest człowiek dogodnie podaje się podmiotowi wolną od HSA kompozycję farmaceutyczną zawierającą zasadniczo monomeryczny ludzki IFN-β lub jego biologicznie aktywny wariant.

Nieograniczające przykłady polipeptydów IFN-β oraz wariantów polipeptydów IFN-β objętych niniejszym wynalazkiem przedstawione są w Nagata i wsp. (1980) Nature 284: 316 - 320; Goeddel i wsp. (1980) Nature 287: 411 - 416; Yelverton i wsp. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 731 - 741; Streuli i wsp. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 2848 - 2852; EPO28033B1 i EP109748B1. Patrz również Patenty U.S. o numerach 4518584; 4569908; 4588585; 4738844; 4753795; 4769233; 4793995; 4914033; 4959314; 5545723 i 5814485. Odsyłacze te dostarczają również wytycznych dotyczących reszt i regionów polipeptydu IFN-β, które mogą być zmienione bez utraty aktywności biologicznej.

W pewnej postaci realizacji niniejszego wynalazku IFN-β w stabilizowanych preparatach farmaceutycznych stanowi dojrzały natywny polipeptyd IFN-β. W innej postaci realizacji IFN-β w tych preparatach stanowi dojrzały polipeptyd IFN-β, w którym cysteinę znajdowaną w pozycji 17 dojrzałej natywnej sekwencji zastępuje się seryną jak dyskutowano powyżej. Jednakże, niniejszy wynalazek obejmuje inne postaci realizacji, w których IFN-β w stabilizowanym preparacie farmaceutycznym stanowi dowolny biologicznie aktywny polipeptyd IFN-β lub wariant jak opisano gdziekolwiek w niniejszym opisie.

W niektórych postaciach realizacji niniejszego wynalazku IFN-β wytwarza się rekombinacyjnie. Przez „rekombinacyjnie wytworzony IFN-β rozumie się, że IFN-β, który ma porównywalną aktywność biologiczną z dojrzałym natywnym IFN-β został wytworzony z użyciem technik rekombinacji DNA. IFN-β można wytworzyć poprzez hodowanie komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd IFN-β. Komórka gospodarza jest tą, która transkrybuje sekwencję nukleotydową i wytwarza pożądane białko i może być prokariotyczna (na przykład E. coli) lub eukariotyczna (na przykład komórka drożdży, owadzia lub ssacza). Przykłady rekombinacyjnego wytwarzania IFN-β przedstawione są w Mantei i wsp. (1982) Nature 297: 128; Ohno i wsp. (1982) Nucleic Acids Res. 10: 967; Smith i wsp. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156 i Patent U.S. o numerze 4462940, 5702699, 5814485. Sklonowano ludzkie geny interferonu z użyciem technologii rekombinowanego DNA („rDNA) i zostały one wyrażone w E. coli (Nagola i wsp. (1980) Nature 284: 316; Goeddel i wsp. (1980) Nature 287: 411; Yelverton i wsp. (1981) Nuc. Acid Res. 9: 731; Streuli i wsp. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 2848). Ewentualnie, IFN-β można wytworzyć z użyciem transgenicznego zwierzęcia lub rośliny, które zostały genetycznie przetworzone w sposób techniczny tak, aby wyrażały białko IFN-β będące przedmiotem zainteresowania według sposobów znanych w dziedzinie.

Białka lub polipeptydy, które wykazują natywne właściwości interferono-beta-podobne mogą być również wytworzone z użyciem technologii rDNA przez ekstrakcję informacyjnego RNA 12S bogaPL 213 297 B1 tego w poli-A z wirusowo zaindukowanych komórek ludzkich, syntetyzowanie dwuniciowego cDNA z zastosowaniem jako matrycy mRNA, wprowadzanie cDNA do odpowiedniego wektora do klonowania, transformowanie odpowiednich drobnoustrojów wektorem, zbieranie drobnoustrojów i ekstrakcję z nich interferonu beta. Patrz, na przykład Europejskie Zgłoszenie Patentowe o numerze 28033 (opublikowane 6 maja 1981); 32134 (opublikowane 15 lipca 1981) i 34307 (opublikowane 26 sierpnia 1981), które opisują różne sposoby wytwarzania interferonu beta wykorzystujące techniki rDNA.

Ewentualnie IFN-β można zsyntetyzować chemicznie z użyciem dowolnego z kilku sposobów, które znane są w dziedzinie specjalistom w dziedzinie peptydów. Patrz, na przykład, Li i wsp. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2216 - 2220, Steward i Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) oraz Baraney i Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, wyd. Gross and Meinhoffer, Tom 2 (Academic Press, Nowy Jork, 1980), str. 3 - 254, dyskutujące techniki syntezy peptydów w fazie stałej; i Bodansky (1984) Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin) oraz Gross i Meinhofer, wyd. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, wyd. Gross and Meinhoffer, Tom 1 (Academic Press, Nowy Jork), dyskutujące klasyczne syntezy w roztworze. IFN-β może również być chemicznie wytworzony sposobem jednoczesnej syntezy wielokrotnej peptydów. Patrz, na przykład, Houghten (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 5131 - 5135; i Patent U.S. o numerze 4631211.

Rekombinacyjnie wytworzony IFN-β do zastosowania w wytwarzaniu stabilizowanych wolnych od HSA kompozycji farmaceutycznych IFN-β według wynalazku może być odzyskany i oczyszczony z użyciem dowolnego sposobu znanego specjaliście w dziedzinie. Sposoby takie obejmują te ujawnione w Patentach U.S. o numerach 4462940 i 5702699. W sposobach tych odzyskuje się interferon w czystej postaci IFN-β, która ma tendencje do tworzenia agregatów pod nieobecność SDS, który jest stosowany jako środek stabilizujący. Ponadto, sposoby te wystawiają białko na działanie warunków wysokiego pH, które mogą niekorzystnie wpływać na właściwości biologiczne białka i mogą skutkować powstaniem kompozycji zawierających resztkowe ilości SDS stosowanego do solubilizacji białka podczas oczyszczania. Zatem, chociaż można uzyskać IFN-β z użyciem tych sposobów, dogodnie odzyskuje się go i oczyszcza z użyciem udoskonalonego sposobu ujawnionego w zgłoszeniu patentowym U.S.A. nr US-2002/0137895.

Dwa udoskonalone sposoby oczyszczania i odzyskiwania IFN-β ujawniono w tych również będących w toku i złożonych jednocześnie zgłoszeniach. Pierwszy z tych sposobów oczyszczania i odzyskiwania obejmuje strącanie zasadniczo oczyszczonego IFN-β alkoholem takim jak alkohol alifatyczny i rozpuszczenie strąconego IFN-β z chlorowodorkiem guanidyny. Powstały w ten sposób roztwór następnie rozcieńcza się odpowiednim buforem aby renaturować białko. Drugi z tych sposobów oczyszczania i odzyskiwania omija etap strącania. W ten sposób próbkę zawierającą zasadniczo oczyszczony IFN-β miesza się z chlorowodorkiem guanidyny do stworzenia roztworu zawierającego rozpuszczony zdenaturowany IFN-β; roztwór ten następnie rozcieńcza się odpowiednim buforem aby zrenaturować białko. W obu tych sposobach roztwór zawierający IFN-β jest następnie diafiltrowany lub dializowany z użyciem buforu stosowanego w celach farmaceutycznych. W przypadku stosowania do wytwarzania wolnych od HSA kompozycji farmaceutycznych według niniejszego wynalazku oczyszczone renaturowane białko IFN-β diafiltruje się lub dializuje do preparatu o niskiej sile jonowej według niniejszego wynalazku jak opisano poniżej w przykładzie 8.

Kompozycje objęte niniejszym wynalazkiem mogą zawierać co najmniej od około 0,01 mg/ml IFN-β do najwięcej około 20,0 IFN-β mg/ml (waga/objętość). W różnych postaciach realizacji IFN-β obecny jest w stężeniu około 0,01 mg/ml do około 20,0 mg/ml, około 0,015 mg/ml do około 12,5 mg/ml, około 0,025 do około 10,0 mg/ml, około 0,05 mg/ml do około 8,0 mg/ml, około 0,075 mg/ml do około 6,0 mg/ml, około 0,1 mg/ml do około 4,0 mg/ml, około 0,125 mg/ml do około 2,0 mg/ml, około 0,175 do około 1,0 mg/ml, około 0,2 mg/ml do około 0,5 mg/ml, około 0,225 do około 0,3 mg/ml i około 0,25 mg/ml.

W pewnych postaciach realizacji preparaty według wynalazku zawierają farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Przez „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik rozumie się nośnik, który jest konwencjonalnie stosowany w dziedzinie do ułatwienia przechowywania, podawania i/lub wpływu leczniczego składników terapeutycznych. Nośnik może również zmniejszać niepożądane skutki uboczne IFN-β. Odpowiedni nośnik powinien być stabilny, tj. niezdolny do reagowania z innymi składnikami w preparacie. Nie powinien wywoływać znaczących miejscowych lub układowych skutków ubocznych u przyjmującego w dawkowaniach i stężeniach używanych w leczeniu. Nośniki takie są ogólnie znane w dziedzinie. Odpowiednie nośniki do tego wynalazku to nośniki konwencjonalnie stosowane będące

PL 213 297 B1 dużymi stabilnymi makrocząsteczkami, takimi jak żelatyna, kolagen, polisacharyd, monosacharydy, poliwinylo-pirolidon, kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, aminokwasy polimeryczne, oleje nielotne, oleinian etylu, liposomy, glukoza, laktoza, mannoza, dekstroza, dekstran, celuloza, sorbitol, glikol polietylenowy (PEG) i podobne. Nośniki o wolnym uwalnianiu, takie jak kwas hialuronowy mogą być również odpowiednie. Patrz zwłaszcza Prisell i wsp. (1992) Int. J. Pharmaceau. 85: 51 - 56 i Patent U.S. o numerze 5166331.

Kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać środek solubilizujący lub substancję wzmacniającą rozpuszczanie, który przyczynia się do rozpuszczalności białka poza zwiększoną rozpuszczalność uzyskaną z użyciem preparatów o niskiej sile jonowej tutaj ujawnionych. Związki zawierające grupę guanidyny, w szczególności argininy, są odpowiednimi substancjami wzmacniającymi rozpuszczalność dla IFN-β. Przykłady takich substancji wzmacniających rozpuszczalność obejmują aminokwas argininę, jak również analogi aminokwasowe argininy, które zachowują zdolność do zwiększania rozpuszczalności IFN-β. Takie analogi obejmują, bez ograniczeń, dipeptydy i tripeptydy, które zawierają argininę. Dodatkowe odpowiednie środki rozpuszczające są dyskutowane w patentach U.S. o numerach 4816440, 4894330, 5004605, 5183746, 5643566 i w Wang i wsp. (1980) J. Parenteral Drug Assoc. 34: 452 - 462.

W celu dalszego zwiększenia stabilności ciekłych kompozycji farmaceutycznych oprócz tych środków ujawnionych powyżej mogą być dodawane inne środki stabilizujące, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub jedna z jego soli, takich jak disodowy EDTA. EDTA działa jak wyszukiwacz jonów metali, o których wiadomo, że katalizują wiele reakcji utleniania, dostarczając w ten sposób dodatkowo środek stabilizujący. Inne odpowiednie środki stabilizujące obejmują niejonowe środki powierzchniowo czynne (surfaktanty), w tym estry polioksyetylenowe sorbitolu, takie jak polisorbat 80 (Tween 80) i polisorbat 20 (Tween 20); estry polioksypropylenowe-polioksyetylenowe, takie jak Pluronic F68 i Pluronic F128; alkohole polioksyetylenowe, takie jak Brij 35; simethicone; glikol polietylenowy, taki jak PEG400; lizofosfatydylocholina i polioksyetyleno-p-t-oktylofenol, taki jak Triton X-100. Klasyczna stabilizacja środków farmaceutycznych z użyciem substancji powierzchniowo czynnych opisana jest, na przykład, w Levine i wsp. (1991) J. Parenteral. Sci. Technol. 45(3): 160 - 165.

Farmaceutycznie skuteczną ilość stabilizowanego wolnego od HSA preparatu IFN-β według wynalazku podaje się podmiotowi. Przez „farmaceutycznie skuteczną ilość rozumie się ilość, która jest użyteczna w leczeniu, profilaktyce lub rozpoznawaniu choroby lub stanu. Typowe drogi podawania obejmują ale bez ograniczeń podawanie doustne, dostarczanie donosowe, dostarczanie dopłucne i podawanie pozajelitowe, w tym wstrzyknięcia lub wlewki przezskórne, dożylne, domięśniowe, podskórne, dotętnicze i śródotrzewnowe. W pewnej takiej postaci realizacji podawanie ma miejsce przez wstrzyknięcie, dogodnie wstrzykniecie podskórne. Możliwe do wstrzyknięć postaci kompozycji według wynalazku obejmują, ale bez ograniczenia, roztwory, zawiesiny i emulsje. Zazwyczaj, terapeutycznie skuteczna ilość IFN-β obejmuje około 0,01 μg/kg do około 5 mg/kg kompozycji, dogodnie około 0,05 μg/kg do około 1000 μg/kg, dogodniej około 0,1 μg/kg do około 500 μg/kg, jeszcze dogodniej około 0,5 μg/kg do około 30 μg/kg.

W jednej postaci realizacji stabilizowaną wolną od HSA kompozycję farmaceutyczną zawierającą zasadniczo monomeryczny IFN-β wytwarza się w jednostce dawkowania i może być ona w postaci możliwej do wstrzyknięcia lub wlewki, takiej jak roztwór, zawiesina lub emulsja. Ponadto, może być ona przechowywana jako zamrożona lub wytworzona w postaci wysuszonej, takiej jak Iiofilizowany proszek, który może być rekonstytuowany do roztworu wodnego, zawiesiny lub emulsji przed podaniem przy użyciu dowolnego z różnych sposobów włączając doustne lub pozajelitowe drogi podawania. Stabilizowana kompozycja może być sterylizowana z użyciem filtracji przez błonę i przechowywana w jednostce dawki lub pojemnikach wielo-jednostkowych, takich jak szczelnie zamknięte fiolki lub ampułki. Dodatkowe sposoby do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej ogólnie znane w dziedzinie mogą być stosowane do dalszego wzmacniania stabilności podczas przechowywania kompozycji farmaceutycznych ujawnionych tutaj pod warunkiem, że nie wpływają one niekorzystnie na pożądane wpływy środków stabilizujących jak tu ujawniono. Dyskusję dotyczącą preparowania i wyboru farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, stabilizatorów itp. można odnaleźć w Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) (18-te wyd., Mack Publishing Company, Eaton, Pensylwania.

Preparaty zawierające skuteczną ilość kompozycji farmaceutycznych według wynalazku zawierających β-interferon (IFN-β) lub jego wariant, taki jak muteina ludzkiego IFN-β (hIFN-β) oznaczona hIFN-3_ser17. Użyteczne są w rozpoznawaniu, zapobieganiu i leczeniu (miejscowym lub układowym) wskazań klinicznych odpowiadających na leczenie tym polipeptydem. Takie wskazania kliniczne

PL 213 297 B1 obejmują, na przykład, zaburzenia lub choroby centralnego układu nerwowego (CNS), mózgu i/lub rdzenia kręgowego, w tym chorobę Alzheimera, chorobę Parkinsona, demencję z ciałkami Lewy'ego, stwardnienie rozsiane, epilepsję, ataksję móżdżkową, postępujące porażenie nadjądrowe, stwardnienie zanikowe boczne, zaburzenia afektywne, zaburzenia lękowe, zaburzenia kompulsywno-obsesyjne, zaburzenia osobowości, zaburzenia uwagi, zespół nadpobudliwości psychoruchowej, zespół Touretta, Tay Sachs, Nieman Pick i schizofrenię; uszkodzenie nerwu wynikające z zaburzeń naczyniowo - mózgowych, takich jak udar w mózgu lub rdzeniu kręgowym, z infekcji CNS w tym zapalenie opon i HIV, z nowotworów mózgu i rdzenia kręgowego lub z choroby prionowej; choroby autoimmunizacyjne, włączając nabyte niedobory odporności, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycę, chorobę Crohna, zespół Sjorgena, stwardnienie zanikowe boczne i tocznia, i nowotwory; włączając nowotwory piersi, prostaty, pęcherza, nerek i jelita grubego. Podawanie IFN-β lub jego mutein ludziom może być przeprowadzane doustnie, śródotrzewnowo, domięśniowo, podskórnie, dożylnie, donosowo lub przez dostarczanie płucne jak stwierdzi jako odpowiednie lekarz.

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu zwiększania rozpuszczalności interferonu beta (IFN-β) lub jego biologicznie aktywnego wariantu w kompozycji farmaceutycznej przy braku albuminy surowicy ludzkiej. Sposób obejmuje wytwarzanie kompozycji w preparacie o niskiej sile jonowej jak ujawniono tu w dowolnym miejscu, tak że pH kompozycji utrzymuje się w pH około 3,0 do pH około 5,0 oraz wprowadzanie IFN-β lub jego biologicznie aktywnego wariantu do kompozycji. Kompozycja może ponadto zawierać niejonowy środek tonizujący w ilości wystarczającej aby sprawić by kompozycja była izotoniczna z płynami ustrojowymi jak ujawniono tu gdziekolwiek. W pewnej postaci realizacji niejonowy środek tonizujący wybiera się z grupy składającej się z trehalozy, sacharozy, mannitolu i dowolnej ich kombinacji. Ponadto, dzięki utrzymywaniu pH tej kompozycji między pH około 3,0 a pH około 5,0, korzystnie pH 4,0, możliwe jest utrzymanie większości IFN-β w stanie monomerycznym. Zatem, wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania stabilizowanej wolnej od HSA kompozycji farmaceutycznej zawierającej zasadniczo monomeryczny IFN-β.

Następujące przykłady przedstawiane są dla ilustracji, a nie ograniczenia.

Część doświadczalna

Obecny wynalazek stworzono dzięki lepszemu zrozumieniu właściwości rozpuszczalności i stabilności IFN-β·^ Dogodne cechy charakterystyczne wolnych od HSA preparatów IFΝ-β-1b stanowią pH 3,0 do pH około 5,0 i warunki bardzo niskiej siły jonowej. Zastosowanie warunków bardzo niskiej siły jonowej w tym zakresie pH skutkuje wyższą zawartością monomerycznego IFN^-1b i niższą zawartością zagregowanych gatunków ΙΕΝ-β-W. Warunki te zapewniają rozpuszczalność i stabilność IFN-P-1b poprzednio niemożliwą do uzyskania bez zastosowania w preparacie HSA. Zapewniają również preparaty o maksymalnej zawartości monomerycznego IFN^-1b.

IFN^-1b do zastosowania w tych doświadczeniach został wytworzony w E. coli zasadniczo jak opisano w pierwszych kilku etapach oczyszczania przedstawionego w Patentach U.S. o numerach 4462940 lub 48816400. To jest, transformowane bakterie zostały użyte do wytworzenia IFN-β, komórki gospodarza zatężono i rozerwano ich błony komórkowe w celu uzyskania dużej ilości materiału IFN-p-1b.

Duża ilość materiału IFN^-1b uzyskana w ten sposób zawiera 50 mM octanu sodu, 1 mM EDTA, 0,1% siarczanu dodecylu sodu (SDS) w pH 5,5. Aby wytworzyć materiał startowy do pomiarów rozpuszczalności i stabilności opisanych poniżej z dużej ilości materiału IFN^-1b usunięto SDS przez przepuszczanie materiału przez kolumnę G-25 (Pharmacia) równoważoną 1,5 mM wodorotlenku sodu w >pH 11. Po zebraniu puli z kolumny G-25 dodano 1 M glicynę, pH 3, w objętości równej w przybliżeniu 1/10 puli szybko mieszając aby dostosować pulę do pH ~3. Materiały przechowywano w 4°C lub zamrożono do późniejszego zastosowania w pomiarach rozpuszczalności i stabilności.

P r z y k ł a d 1: - określanie rozpuszczalności IFN-P-1b

Doświadczenia wstępne przeprowadzono w celu zrozumienia rozpuszczalności IFN^-1b w szeregu różnych warunkach pH, typu buforu i siły jonowej. Roztwór IFN^-1b (~0,8 mg/ml IFN^-1b w 100 mM glicynie, pH 3,0) dializowano wobec buforów przedstawionych w Tabeli 1. Wyniki przedstawione są na Figurze 1. Wyniki te pokazują, że rozpuszczalność IFN^-1b zależna jest od pH i siły jonowej. W pH 3,0 ΙFΝ-β-1b pozostaje rozpuszczalny we wszystkich stężeniach chlorku sodu do 200 mM. Dla preparatów w pH 4,0 IFN^-1b staje się mniej rozpuszczalny gdy stężenie chlorku sodu osiąga 150 mM. Dla preparatów w pH 5,0 IFΝ-β-1b staje się mniej rozpuszczalny gdy preparat zawiera tylko 100 mM chlorku sodu. Dane te wzięte razem wskazują, że ΙFΝ-β-1b jest najbardziej rozpuszczalny w preparatach o pH 3,0, mniej rozpuszczalny w preparatach o pH 4,0 i najmniej rozpuszczalny

PL 213 297 B1 w preparatach o pH 5,0. Dane te wskazują również, że zwiększając siłę jonową preparatów (przez zwiększanie stężenia chlorku sodu) zmniejsza się również rozpuszczalność IFN^-1b.

Chociaż powyższe doświadczenie było w stanie określić warunki sprzyjające rozpuszczalności ^Ν-β-W, nie określiło ono limitu rozpuszczalności w dowolnym z danych warunków. Następne doświadczenie przeprowadzono w celu określenia limitów rozpuszczalności IFΝ-β-1b. W celu maksymalizacji ^Ν-β-W zastosowano preparaty o niskiej sile jonowej (tj. 5 mM bufor i brak takich soli jak chlorek sodu). Po dializie ΙFΝ-β-1b zatężono, aby określić limit rozpuszczalności w danym preparacie. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono na Figurze 2. Preparaty o pH 3,0 i 4,0 są najbardziej rozpuszczalne, wykazując rozpuszczalność przynajmniej 16 mg/ml. Preparat o pH 5,0 był rozpuszczalny do około 8 mg/ml. Preparaty powyżej pH 5,0 były rozpuszczalne jedynie do około 0,2 mg/ml. Wyniki te ponownie wskazują, że pH ma silny wpływ na rozpuszczalność IFN^-1b. Preparaty o niskiej sile jonowej w pH 3,0 i pH 4,0 są bardziej rozpuszczalne niż w pH 5,0. Powyżej pH 5,0 IFN^-1b jest zasadniczo nierozpuszczalny w preparatach o niskiej sile jonowej.

T a b e l a 1: Preparaty do badania rozpuszczalności IFN-P-1b w różnym pH, typie buforu i stężeniu chlorku sodu

Bufor	pH	Stężenie chlorku sodu (mM)
1	2	3
5 mM glicyna	pH 3	0 mM
5 mM glicyna	pH 3	50 mM
5 mM glicyna	pH 3	100 mM
5 mM glicyna	pH 3	150 mM
5 mM cytrynian	pH 4	0 mM
5 mM cytrynian	pH 4	50 mM
5 mM cytrynian	pH 4	100 mM
5 mM cytrynian	pH 4	150 mM
5 mM octan	pH 4	0 mM
5 mM octan	pH 4	50 mM
5 mM octan	pH 4	100 mM
5 mM octan	pH 4	150 mM
5 mM mrówczan	pH 4	0 mM
5 mM mrówczan	pH 4	50 mM
5 mM mrówczan	pH 4	100 mM
5 mM mrówczan	pH 4	150 mM
5 mM octan	pH 5	0 mM
5 mM octan	pH 5	50 mM
5 mM octan	pH 5	100 mM
5 mM octan	pH 5	150 mM
5 mM histydyna	pH 5	0 mM
5 mM histydyna	pH 5	50 mM

PL 213 297 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
5 mM histydyna	pH 5	100 mM
5 mM histydyna	pH 5	150 mM
5 mM bursztynian sodu	pH 5	0 mM
5 mM bursztynian sodu	pH 5	50 mM
5 mM bursztynian sodu	pH 5	100 mM
5 mM bursztynian sodu	pH 5	150 mM

P r z y k ł a d 2 - Doświadczenia ultrawirowania analitycznego

Chociaż doświadczenia z rozpuszczalnością mogą określić jak dużo IFN^-1b znajduje się w roztworze, to wymagane są inne techniki do określenia stanu agregacji białka. Istotne jest określenie czy białko jest monomeryczne w danym preparacie oraz określenie jak dużo białka (jeśli w ogóle) występuje w postaciach wyższego rzędu takich jak dimery, trimery itp. Ultrawirowanie analityczne jest jedną z najbardziej potężnych technik do oceny stanu agregacji białek (patrz Liu i Shire (1999) J. Pharm. Sci. 88: 1237 - 1241). W celu scharakteryzowania zawartości monomerów w kilku preparatach IFN^-1b przeprowadzono trzy doświadczenia z użyciem ultrawirowania analitycznego. Każde z tych doświadczeń zostało przeprowadzone z innym preparatem IFN^-1b. W tej kwestii każde doświadczenie obejmowało zwykły preparat (5 mM glicyna, pH 3,0). Jednakże, każdy z tych zwykłych preparatów różnił się nieznacznie procentem zawartości monomerów (Figura 3 - 89,8%; Figura 6 94,2%; Figura 9 - 86,3%). Procedura odzyskiwania i oczyszczania stosowana do wytwarzania tych preparatów IFN^-1b wywołuje pewną agregację cząsteczki IFN^-1b, która w naturze jest głównie kowalencyjna. Preparat 5 mM glicyna, pH 3,0 dla każdego doświadczenia służy zatem jako linia wyjściowa dla ilości agregatu w preparacie na początku każdego doświadczenia.

Pierwsze doświadczenie zbadało wpływ pH na stan agregacji IFN^-1b. Zanalizowano preparaty o pH 3,0 (zawierające jedynie 5 mM glicynę do zbuforowania roztworu), pH 4,0 (zawierające jedynie 5 mM kwas asparaginowy do zbuforowania roztworu) i pH 5,0 (zawierające jedynie 5 mM bursztynian sodu do zbuforowania roztworu). Wyniki przedstawione są na Figurach 3, 4 i 5. Główne maksimum tych profili odpowiada masie cząsteczkowej około 20 kDa, która jest bardzo bliska masie cząsteczkowej IFN^-1b (19,878 kDa). Główne maksimum stanowi zatem monomer IFΝ-β-1b. Wyższe gatunki (dimery, trimery itp.) odpowiadają wyższym współczynnikom sedymentacji. Wyniki te pokazują, że chociaż w pH 3,0 i pH 4,0 IFΝ-β-1b jest głównie monomeryczny, w pH 5,0 cząsteczka zaczyna agregować do postaci wyższego rzędu i jedynie około 75% jest monomerycznych. Wyniki te wskazują, że stan agregacji IFΝ-β-1b wrażliwy jest na zmiany pH oraz że monomerowi IFN^-1b sprzyjają warunki niskiego pH, takiego jak pH 3,0 i pH 4,0.

Drugie doświadczenie badało wpływ siły jonowej na stan agregacji IFΝ-β-1b. Siłę jonową zwiększono w preparatach o pH 3,0 (buforowanych 5 mM glicyną) przez dodanie 0,50 mM i 150 mM chlorku sodu. Wyniki przedstawione są na Figurach 6, 7 i 8. Dla preparatów nie zawierających dodanego chlorku sodu (Figura 6), postać monomeryczna IFN^-1b obejmuje około 94% całkowitego ^Ν-β-^ (tj. 94% głównego maksimum). Gdy do preparatu dodaje się 50 mM chlorku sodu, zawartość monomeru spada do około 76% (Figura 7), a ze 150 mM chlorku sodu w preparacie zawartość monomeru spada do mniej niż 10% (Figura 8). Wyniki te wskazują, że stan agregacji IFΝ-β-1b silnie zależy od siły jonowej oraz że monomerowi IFΝ-β-1b sprzyjają warunki niskiej siły jonowej.

Pożądaną cechą charakterystyczną preparatu farmaceutycznego możliwego do zastosowania do wstrzyknięć jest by był on izotoniczny z płynami ustrojowymi. Do wytworzenia izotoniczności preparatu z płynami ustrojowymi można zastosować substancje jonowe (takie jak chlorek sodu) i substancje niejonowe (takie jak cukry sacharoza i trehaloza). Poprzednie doświadczenia z ultrawirowaniem analitycznym badały preparaty, które były albo nie izotoniczne (zawierające jedynie 5 mM bufor) albo zawierały chlorek sodu jako jonowy środek tonizujący. Trzecie doświadczenie badało wpływ niejonowych środków tonizujących na stan agregacji IFΝ-β-1b. W doświadczeniu tym wytworzono trzy preparaty o pH 3,0 (zbuforowane 5 mM glicyną). Jeden zawierał jedynie środek buforujący glicynę, drugi był tonizowany 9% sacharozą a trzeci był tonizowany 9% trehalozą. Wyniki ultrawirowania analitycznego

PL 213 297 B1 przedstawione są na Figurze 9, 10 i 11. Zawartość monomeru preparatu jedynie ze środkiem buforującym (Figura 9) wynosi około 86%. Dodając albo sacharozę (Figura 10) albo trehalozę (Figura 11) jako środka tonizującego zawartość monomeru wynosi około 89%. Wyniki te wskazują, ze niejonowe środki tonizujące nie sprzyjają agregacji cząsteczki IFΝ-β-1b.

P r z y k ł a d 3 - Stabilność liofilizowanych preparatów IFΝ-β-1b wolnych od HSA w warunkach podwyższonej temperatury

Wolne od HSA preparaty IFΝ-β-1b o pH 3,0 (5 mM glicyna jako bufor) i pH 4,0 (5 mM kwas asparaginowy jako bufor) zawierające albo 9% trehalozę (pH 3,0 i pH 4) albo 9% sacharozę (pH 4,0) liofilizowano. Liofilizowane preparaty przechowywano następnie w 40°C i ich stabilność mierzono przez 8 tygodni. Sacharoza i trehaloza są typowymi środkami stabilizującymi stosowanymi w preparatach liofilizowanych. Poziom 9% tych środków stosuje się, aby rekonstytuowany preparat był izotoniczny z płynami ustrojowymi. W celu zminimalizowania siły jonowej preparatów i zatem ilości zagregowanego IFN^-1b utrzymywano ilość buforu na poziomie minimalnym. Zatem, wszystkie bufory były w stężeniu 5 mM.

Typowe warunki przechowywania dla białkowych produktów farmaceutycznych stanowi często 5°C. Jednakże, warunki podwyższonej temperatury są często stosowane w badaniach nad preparatami aby zwiększyć szybkość degradacji szczególnego preparatu tak, że istotne dane dotyczące stabilności można zebrać w krótszym czasie. W tym doświadczeniu zastosowano 40°C aby zrobić próbę przyspieszonej degradacji IFΝ-β-1b w wolnych od HSA preparatach IFΝ-β-1b. Wyniki pomiarów stężenia oraz analizy HPLC odwróconej fazy (RP-HPLC) pokazane są na Figurach 12 i 13. Wyniki te pokazują, że w podwyższonych temperaturach te preparaty IFΝ-β-1b nie wykazują żadnych wykrywalnych zmian w okresie 8 - tygodniowego badania.

P r z y k ł a d 4 - Stabilność liofilizowanych preparatów IFΝ-β-1b wolnych od HSA zawierających trehalozę w warunkach przechowywania w czasie rzeczywistym

Chociaż typowe warunki przechowywania dla białkowych środków farmaceutycznych wynoszą 5°C, wskazane jest posiadać produkt charakteryzujący się stabilnością w temperaturze pokojowej (25°C do 30°C). W tym doświadczeniu liofilizowano preparaty zawierające 9% trehalozę (5 mM glicyna, pH 3,0 lub 5 mM kwas asparaginowy, pH 4,0). Zastosowano stężenie 9% trehalozy, aby rekonstytuowany preparat był izotoniczny z płynami ustrojowymi. Preparaty przechowywano w 5°C i 30°C a ich stabilność mierzono w ciągu 9 miesięcy. Wyniki dla pomiarów stężenia oraz analizy HPLC z odwróconą fazą (RP-HPLC) pokazane są na Figurze 14 i Figurze 15. Wyniki te pokazują, że nawet w 30°C te preparaty IFN^-1b nie wykazują żadnych wykrywalnych zmian podczas 9 miesięcy badania.

P r z y k ł a d 5 - Stabilność ciekłych preparatów IFN^-1b wolnych od HSA w warunkach podwyższonej temperatury.

Stabilność wolnych od HSA preparatów IFN^-1b o pH 3,0 i pH 4,0 badano również w stanie ciekłym. Skład preparatów był taki sam jak przedstawiony w przykładzie 3 (9% trehaloza (pH 3,0 i pH 4,0) lub 9% sacharoza (pH 4,0)). Ponownie, w celu zminimalizowania siły jonowej preparatów i zatem zminimalizowania ilości zagregowanego IFN^-1b utrzymywano ilość w buforze na poziomie minimalnym (5 mM). Preparaty ciekłe przechowywano w 30°C a ich stabilność mierzono przez 9 tygodni. Typowe warunki przechowywania dla ciekłych preparatów białkowych wynoszą 5°C. Zatem, przechowywanie w 30°C reprezentuje warunki podwyższonej temperatury zaprojektowane do zwiększenia szybkości degradacji IFN^-W. Wyniki pokazane na Figurze 16 (pomiary stężenia) i Figurze 17 (HPLC z odwróconą fazą) nie wykazują wykrywalnych zmian w preparatach w ciągu 9-tygodniowego badania. Wyniki te wskazują, że w tych preparatach w tych warunkach IFN^-1b jest stabilny w czasie trwania badania.

P r z y k ł a d 6 - Stabilność ciekłych preparatów IFN^-1b wolnych od HSA w warunkach przechowywania w czasie rzeczywistym

W tym doświadczeniu w warunkach przechowywania w czasie rzeczywistym w 5°C badano ciekłe preparaty zawierające 9% trehalozę (5 mM glicynę, pH 3, o lub 5 mM kwas asparaginowy pH 4,0) lub 9% sacharozę (5 mM glicyna, pH 3 lub 5 mM kwas asparaginowy, pH 4,0). Preparatami napełniono fiolki, a ich stabilność mierzono w czasie 9 miesięcy. Wyniki pomiarów stężenia oraz HPLC z odwróconą fazą (RP-HPLC) pokazane są odpowiednio na Figurze 18 i Figurze 19. Wyniki te wskazują, że IFN^-1b w tych preparatach jest stabilny podczas 9 miesięcy tego badania.

PL 213 297 B1

P r z y k ł a d 7 - Trehaloza jest korzystniejsza od sacharozy jako niejonowy środek tonizujący dla preparatów IFN^-1b

W tym doświadczeniu wytworzono preparaty zawierające 9% trehalozę (5 mM glicynę, pH 3,0 lub 5 mM kwas asparaginowy, pH 4,0) i sacharozę (5 mM glicynę, pH 3,0 lub 5 mM kwas asparaginowy, pH 4,0) i napełniono nimi fiolki i fioki z takim samym preparatem Iiofilizowano. Ich stabilności mierzono w warunkach podwyższonej temperatury, które często mogą być pomocne do przewidzenia szeregu stopni stabilności danego białka. Preparaty ciekłe przechowywano w 30°C przez 9 tygodni, a liofilizowane preparaty przechowywano w 40°C przez 8 tygodni. Wyniki pomiarów stężenia pokazane są na Figurze 20 (ciekłe) i Figurze 21 (liofilizowane). Wyniki te wskazują, że preparaty o pH 3,0 zawierające sacharozę wykazują widoczny wzrost stężenia. Ten widoczny wzrost stężenia wynika z hydrolizy sacharozy w niskim pH do wytworzenia cukrów redukujących, które skutkuje nieenzymatycznym brązowieniem (tj. reakcją Maillarda) preparatów. Trehaloza jest bardziej oporna na hydrolizę i jest zatem korzystniejsza niż sacharoza w tych preparatach (patrz o'Brien (1996) Science 61: 679 - 682).

P r z y k ł a d 8 - Usuwanie SDS i preparatu IFN^-1b przy pomocy precypitacji chlorowodorkiem guanidyny

Oczyszczony IFΝ-β-1b (1 I, 1,91 mg/ml w 0,4% SDS, 50 mM bufor octanowy, pH 5,5) przechowywano w 5°C. Podczas przechowywania pewna ilość SDS uległa precypitacji. 250 ml tego materiału (477,5 mg) zmieszano z 229 g chlorowodorku guanidyny (6 M, całkowita objętość 400 ml) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy pomocy mieszadełka magnetycznego. Następnie przefiltrowano roztwór chlorowodorku guanidyny/białka z użyciem Sorbatan® P Capsule (wielkość porów 0,45 μm) w celu usunięcia sprecypitowanego SDS. Stężenie białka jak określono z użyciem UV przy 280 nm wynosiło 1,02 mg/ml. Wydajność uzyskiwania białka wyniosła 406 mg lub 85%.

400 ml materiału traktowanego chlorowodorkiem guanidyny zatężono używając systemu diafiltracji Millipore® Labscale® TFF (Millipore, Inc.) z dwiema błonami polisulfonowymi 10 kDa Pellicon® ₂

XL Biomax® 0,1 cm². Objętość po etapie zatężania wynosiła 37 ml ze stężeniem białka 10,3 mg/ml dla wydajności po zatężaniu wynoszącej 381 mg lub 93%.

Z użyciem pipety transferowej stopniowo dodano 10 ml (103 mg) zatężonego roztworu chlorowodorku guanidyny/białka do 590 ml 5 mM roztworu glicynowego, pH 3,2. Bufor był w stanie szybkiego mieszania na mieszadle magnetycznym; roztwór białka był dodawany bezpośrednio do vorteksu. To rozcieńczenie 60 X roztworu chlorowodorku guanidyny/białka dało w rezultacie roztwór chlorowodorku guanidyny/białka w stężeniu 0,17 mg/ml. Te 600 ml przeniesiono do jednostki diafiltracyjnej ₂ o skali 500 ml z dwiema błonami polisulfonowymi 10 kDa Pellicon® II 0,1 cm². Roztwór ten zatężono wstępnie do ~ 400 ml do stężenia białka 0,23 mg/ml i następnie diafiltrowano wobec 9 zmian objętościowych (3,7 I) 5 mM glicyny o pH 3,2. Końcowy diafiltrat mierzono z użyciem UV przy 280 nm dla końcowego stężenia białka 0,23 mg/ml z wydajnością 92,46 mg lub 90% dla etapu diafiltracji i całkowitą wydajnością 72% rozpuszczalnego białka dla sposobu oczyszczania.

P r z y k ł a d 9 - Stabilność ciekłych preparatów IFN^-1b wolnych od HSA zawierających mannitol jako środek tonizujący

W tym doświadczeniu ciekłe preparaty zawierające 5 mM kwas asparaginowy, 5% mannitol badano w warunkach przechowywania w czasie rzeczywistym 5°C. Trzy oddzielne preparaty (oznaczone Prep A, Prep B, Prep C na Figurach) wytworzono z pojedynczej partii IFN^-1b wolnego od HSA i wlano do fiolek. Fiolki te przechowywano w 5°C a stabilność preparatów mierzono przez 6 miesięcy. Wyniki pomiarów stężenia i HPLC z odwróconą fazą (RP-HPLC) pokazane są odpowiednio na Figurze 22 i Figurze 23. Wyniki pokazują, że nie występują wykrywalne zmiany w tych preparatach w czasie 6-miesięcznego badania.

Chociaż przedstawiony wynalazek został opisany w pewnych szczegółach na zasadzie ilustracji i przykładu w celu jasności i zrozumienia, oczywistym będzie, że w zakresie wynalazku zdefiniowanym zastrzeżeniami patentowymi mogą być praktykowane pewne zmiany i modyfikacje.

Claims

1. Stabilizowana wolna od HSA kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera od 0,01 do 20,0 mg/ml interferonu beta (IFN-β), lub jego biologicznie aktywnego wariantu, solubilizowanego w preparacie o niskiej sile jonowej, przy czym preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór posiadający siłę jonową nie większą niż 20 mM i zawierający bufor w stężeniu od 2 mM do 20 mM,

PL 213 297 B1 przy czym bufor stanowi bufor glicynowy, kwasu asparaginowego, bursztynianu sodu, cytrynianowy, mrówczanowy, octanowy, kwasu glutaminowego, histydynowy, imidazolowy lub fosforanowy, przy czym pH wynosi od 3,0 do 4,5, i przy czym co najmniej 80% IFN-β jest w postaci monomerycznej.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wspomniany bufor występuje w stężeniu od 1 mM do 10 mM.

3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że wspomniany bufor występuje w stężeniu od 2 mM do 10 mM.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że wspomniany bufor występuje w stężeniu od 2 mM do 7 mM.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że wspomniany bufor występuje w stężeniu od 2 mM do 5 mM.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że wspomniany bufor występuje w stężeniu 5 mM.

7. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor glicynowy.

8. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor cytrynianowy.

9. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor octanowy.

10. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor mrówczanowy.

11. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor histydynowy.

12. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienna tym, że bufor stanowi bufor bursztynianu sodu.

13. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 12, znamienna tym, że siła jonowa wspomnianego preparatu jest określona jedynie przez stężenie buforu.

14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że preparat nie ma dodatkowych rodzajów jonów.

15. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienna tym, że określone pH mieści się w zakresie 3,0 do 4,0.

16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że określone pH mieści się w zakresie 3,5 do 4,0.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że określone pH wynosi 4,0.

18. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 17, znamienna tym, że preparat zawiera niejonowy środek tonizujący w ilości wystarczającej do nadania preparatowi izotoniczności w stosunku do płynów ustrojowych.

19. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi monosacharyd aldozowy albo ketozowy.

20. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi disacharyd.

21. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi alditol.

22. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza.

23. Kompozycja według zastrz. 20, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi sacharoza.

24. Kompozycja według zastrz. 21, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi mannitol.

25. Kompozycja według zastrz. 18, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza, sacharoza, mannitol lub ich kombinacja.

26. Kompozycja według jednego z zastrz. 18 do 25, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący występuje w stężeniu od 1% do 10%.

25. Kompozycja według zastrz. 26, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi trehaloza lub sacharoza w stężeniu od 8% do 10% wag./obj.

PL 213 297 B1

28. Kompozycja według zastrz. 26, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi mannitol w stężeniu od 4% do 6% wag./obj.

29. Kompozycja według zastrz. 28, znamienna tym, że niejonowy środek tonizujący stanowi mannitol w stężeniu 5% wag./obj.

30. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 29, znamienna tym, że IFN-β stanowi ludzki

IFN-β.

31. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 30, znamienna tym, że IFN-β jest glikozylowany.

32. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 30, znamienna tym, że IFN-β jest nieglikozylowany.

33. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 32, znamienna tym, że IFN-β jest kowalencyjnie związany z glikolem polietylenowym.

34. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 33, znamienna tym, że IFN-β jest wytworzony rekombinacyjnie.

35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że IFN-β jest wytworzony poprzez hodowlę komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IFN-β, przy czym jako komórki gospodarza stosowane są komórki prokariotyczne.

36. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że IFN-β jest wytworzony poprzez hodowlę komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IFN-β, przy czym jako komórki gospodarza stosowane są komórki eukariotyczne.

37. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka drożdżowa.

38. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka owadzia.

39. Kompozycja według zastrz. 36, znamienna tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka ssacza.

40. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 39, znamienna tym, że IFN-β występuje w stężeniu 0,015 mg/ml do 12,5 mg/ml.

41. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 39, znamienna tym, że IFN-β występuje w stężeniu 0,025 mg/ml do 10,0 mg/ml.

42. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 39, znamienna tym, że IFN-β występuje w stężeniu 0,05 mg/ml do 8,0 mg/ml.

43. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 39, znamienna tym, że IFN-β występuje w stężeniu 0,075 mg/ml do 6,0 mg/ml.

44. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 39, znamienna tym, że IFN-β występuje w stężeniu 0,1 mg/ml do 4,0 mg/ml.

45. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 44, znamienna tym, że kompozycja zawiera EDTA lub jedną z jego soli.

46. Kompozycja według zastrz. 45, znamienna tym, że kompozycja zawiera EDTA disodowy.

47. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 46, znamienna tym, że kompozycja zawiera surfaktant niejonowy.

48. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi ester polioksyetylenu sorbitolowego.

49. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi polisorbat 80.

50. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi polisorbat 20.

51. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi ester polioksypropylenopolioksyetylenowy.

52. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi Pluronic F68.

53. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi Pluronic F127.

54. Kompozycja według zastrz. 47, znamienna tym, że surfaktant niejonowy stanowi alkohol polioksyetylenowy.

55. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 54, znamienna tym, że kompozycja jest przechowywana we wstępnie napełnionej strzykawce gotowej do użycia.

56. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 55, znamienna tym, że okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 6 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

PL 213 297 B1

57. Kompozycja według zastrz. 56, znamienna tym, że okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 12 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

58. Kompozycja według zastrz. 56, znamienna tym, że okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 18 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

59. Kompozycja według zastrz. 56, znamienna tym, że okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 20 miesięcy przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

60. Kompozycja według zastrz. 56, znamienna tym, że okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 22 miesiące przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

61. Kompozycja według zastrz. 56, znamienna tym, że okres przydatności kompozycji wynosi co najmniej 24 miesiące przy przechowywaniu w 2 do 8°C.

62. Kompozycja jak określono w jednym z zastrz. 1 do 61 do zastosowania w leczeniu stwardnienia rozsianego.

63. Kompozycja według jednego z zastrz. 1 do 62, znamienna tym, że kompozycja ta jest podawana przez wstrzyknięcie.

64. Kompozycja według zastrz. 63, znamienna tym, że kompozycja ta jest podawana przez wstrzyknięcie podskórne.

65. Sposób zwiększania rozpuszczalności interferonu beta (IFN-β), lub jego biologicznie aktywnego wariantu, w kompozycji farmaceutycznej pod nieobecność albuminy surowicy ludzkiej, znamienny tym, że preparuje się wspomnianą kompozycję z preparatem o niskiej sile jonowej, przy czym preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór posiadający silę jonową nie większą niż 20 mM i zawierający bufor w stężeniu od 2 mM do 20 mM, przy czym bufor stanowi bufor glicynowy, kwasu asparaginowego, bursztynianu sodu, cytrynianowy, mrówczanowy, octanowy, kwasu glutaminowego, histydynowy, imidazolowy lub fosforanowy, przy czym pH wynosi od 3,0 do 4,5; oraz wprowadza się wspomniany IFN-β, lub jego biologicznie aktywny wariant, do wspomnianej kompozycji, przy czym co najmniej 80% IFN-β jest w postaci monomerycznej.

66. Sposób według zastrz. 65, znamienny tym, że jako wspomnianą kompozycję stosuje się kompozycję jak określono w jednym z zastrz. 1 do 64.

67. Sposób wytwarzania wolnej od HSA kompozycji farmaceutycznej zawierającej interferon beta (IFN-β), znamienny tym, że preparuje się wspomnianą kompozycję z preparatem o niskiej sile jonowej, przy czym preparat o niskiej sile jonowej stanowi roztwór posiadający siłę jonową nie większą niż 20 mM i zawierający bufor w stężeniu od 2 mM do 20 mM, przy czym bufor stanowi bufor glicynowy, kwasu asparaginowego, bursztynianu sodu, cytrynianowy, mrówczanowy, octanowy, kwasu glutaminowego, histydynowy, imidazolowy i fosforanowy, przy czym pH wynosi od 3,0 do 4,5; oraz wprowadza się wspomniany IFN-β, lub jego biologicznie aktywny wariant, do wspomnianej kompozycji i przy czym co najmniej 80% IFN-β jest w postaci monomerycznej.

68. Sposób według zastrz. 67, znamienny tym, że jako wspomnianą kompozycję stosuje się kompozycję jak określono w jednym z zastrz. 1 do 64.

69. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że została wytworzona sposobem jak określono w zastrz. 67.