BG108322A

BG108322A - Свободни от hsa формулировки на интерферон-бета

Info

Publication number: BG108322A
Application number: BG108322A
Authority: BG
Inventors: Bret Shirley; Minna Choe; Melanie Tellers; Susan Babuka; Bao-Lu Chen; Maninder Hora
Original assignee: Chiron Corporation
Priority date: 2001-04-09
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2005-08-31
Also published as: EP2283897B1; JP2004529917A; CZ20032735A3; EP1381432B9; PL213297B1; CZ305994B6; KR20030097825A; EP2283896B1; US20110104116A1; ES2367761T3; PL366790A1; NO20034492L; JP2008285499A; ATE545430T1; NO330259B1; ES2453623T3; US20080193415A1; US20040191219A1; US7371373B2; CY1113609T1

Abstract

Изобретението се отнася до стабилизирани фармацевтични състави, включващи практически мономерен интерферон-бета (IFN-бета). Съставите включват IFN-бета, солюбилизиран във формулировка с ниска йонна сила, като формулировката поддържа състава при рН от около 5.0. Изобретението се отнася и до методи за получаване на тези състави и за увеличаване разтворимостта на IFN-бета във фармацевтични състави.

Description

СВОБОДНИ ОТ HSA ФОРМУЛИРОВКИ НА ИНТЕРФЕРОН-БЕТА

Област на техниката

Изобретението се отнася най-общо до фармацевтични състави, поспециално до стабилизирани формулировки на интерферон-β, които са свободни от човешки серумен албумин като добавен фармацевтичен пълнител.

Предшестващо състояние на техниката

Интерфероните са семейство от глюкопротеини, чието секретиране от клетките се индуцира от множество сигнали включващи вируси, двойноверижни рибонуклеинови киселини (RNAs), различни от полинуклеотиди, антигени и митогени. Интерфероните проявяват множество биологични активности, включително антивирусна, антипролиферативна иимуномодулаторна активност. Различени са най-малко три отделни типа човешки интерферони α, β и γ, въз основа на множество фактори, включително антивирусна и антипролиферативни активности.

Интерферон-β (IFN-β) е първото идентифицирано ефективно лечение за мултиплена (множествена) склероза (MS) и е показано, че намалява броя на атаките на които са подложение пациентите с повторна и затихваща MS и вторична прогресираща MS. IFN-β състави са също полезни при лечението на инфекции от хепатит В и С.

··· · · ···· ·· · ······ ·· ··

Както при всички фармацевтични средства на база протеини, едно главно препятствие, което трябва да се преодолее при използването на IFN-β като лечебно средство, е загубата на фармацевтични качества, която може да е в резултат на неговата нестабилност във фармацевтичните формулировки. Физически нестабилности, отнасящи се до полипептидна активност и ефикасност във фармацевтични формулировки, включват денатуриране и образуването на разтворими и неразтворими агрегати, докато химическите нестабилности включват хидролиза, образуване на имиди, оксидиране, рацемизиране и деаминиране. Някои от тези промени са известни, че водят до загуба или намаляване на фармацевтична активност на представляващия интерес протеин. При други случай, точните ефекти на тези промени са неизвестни, но получаващите с в резултат продукти на разграждане се смятат все още за фармацевтично неприемливи, дължащо се на наличието на нежелани странични ефекти.

Стабилизирането на полипептиди във фармацевтични състави остава област, в която опити и грешки играят главна роля (преглед на Wang (1999) Int. J. Pharm., 185: 129 - 188, Wang and Hanson (1988), J. Parenteral Sci. Tech., 42: S3-S26). Пълнители, които се прибавят към полипептидни фармацевтични формулировки за увеличаване на тяхната стабилност, включват буфери, захари, повърхностноактивни вещества, аминокиселини, полиетиленгликоли и полимери, но стабилизиращите ефекти на тези химически добавки варират в зависимост от протеина.

Едно от главните препятствия за получаването на стабилизирани IFN-β фармацевтични формулировки е лошата разтворимост на IFN-β молекулата. Настоящи формулировки прилагат използването на HSA като подобряващо разтворимостта средство на IFN-β. Използването на HSA обаче има недостатъци. HSA е продукт на човешката кръв и поради това трябва да се събира от хора. Докато се предприемат стъпки за намаляване на риска, използването на човешки кръвни продукти като HSA носи в себе си

потенциалната възможност за въвеждане на човешки вируси като HIV и HCV. Въвеждането на HSA във формулировката също пречи на възможността за точно определяне на стабилността на IFN-β във формулировката. Това се дължи на факта, че HSA и IFN-β и двата са протеини и HSA пречи на някои от определящи стабилността на IFN-β изпитания.

Нещо повече, IFN-β е протеин, който проявява свойството да се агрегира във формулировката на фармацевтичния състав и от тук количеството на този протеин в неговото мономерно биологически активна форма се компрометира при съхранение на тези състави. Образуването на агрегати от полипептид като IFN-β при съхранение на фармацевтичен състав може да повлияе неблагоприятно на биологическата активност на този полипептид проявяващо се в загуба на лечебна ефективност на фармацевтичния състав. Нещо повече, образуването на агрегати може да предизвика други проблеми като блокиране на тръби, мембрани или помпи, когато IFN-β фармацевтичен състав се прилага при използване на инфузионна система. В допълнение, инжектирането на фармацевтичен състав, включващ агрегирана форма на протеин, има способността да образува имуногенна реакция към агрегирания протеин.

Следователно, съществува необходимостта от допълнителни IFN-β фармацевтични състави, включващи физиологично съвместими стабилизатори, които подобряват разтворимостта на този протеин и стабилизират протеина срещу образуване на агрегарти, при което се подобрява неговата фармацевтична използваемост.

Техническа същност на изобретението

Разработени са състави включващи интерферон-бета (IFN-β) като лечебноактивна съставка и методи за тяхното получаване. Съставите са стабилизирани фармацевтични състави, които са свободни от човешки ··· · « ···· • · · ····«· · · ·· серумен албумин (HSA) като фармацевтичен пълнител и които вклюват практически мономерен IFN-β, солюбилизиран във формулировка с ниска йонна сила (ниско йонно съдържание). Формулировката с ниска-йонна сила е разтвор, който включва буфер в количество, което е достатъчно да поддържа в състава специфично pH плюс или минус 0.5 единици, където специфичното pH е около 3.0 до около 5.0, и който състав има йонна сила не по-голяма от около 60 мМ. He-йонното тонифициращо (придаващо изотоничност) средство е включено във фармацевтичния състав за да предаде на съставите изотоничност, при което тонифициращото средство е въглехидрат. Разработени са също методи за увеличаване на разтворимостта на IFN-β във фармацевтични състави и за увеличаване на количеството на мономерен IFN-β в тези състави, без да се използва човешки серумен албумин.

Кратко описание на графиките

Фигура 1 показва ΙΡΝ-β-lb разтворимостта в разтвори на натриев хлорид.

Фигура 2 показва ΙΡΝ-β-lb разтворимостта във формулировки с ниска йонна сила.

Фигура 3 показва ефекта на pH 3.0 върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb.

Фигура 4 показва ефекта на pH 4.0 върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb.

Фигура 5 показва ефекта на pH 5.0 върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb.

Фигура 6 показва ефекта на йонната сила (0 мМ NaCl) върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb.

Фигура 7 показва ефекта на йонната сила (50 мМ NaCl) върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb.

• · · ·

Фигура 8 показва ефекта на йонната сила (150 мМ NaCI) върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb.

Фигура 9 показва агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb във формулировка с pH 3.0, съдържаща само 5 мМ буфериращо средство глицин.

Фигура 10 показва ефекта на нейонно тонифициращо средство (9 % захароза) върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb във формулировката показана на фигура 9.

Фигура 11 показва ефекта на нейонно тонифициращо средство (9 % трехалоза) върху агрегатното състояние на ΙΡΝ-β-lb във формулировката показана на фигура 9.

Фигура 12 показва процент от началната ΙΡΝ-β-lb концентрация в лиофилизирани формулировки, съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в в продължение на 8 седмично съхранение при 40° С. Концентрацията е определена чрез UV абсорбция.

Фигура 13 показва процента на главния пик ΙΡΝ-β-lb в лиофилизирани формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в продължение на 8 седмично съхранение при 40° С. Концентрацията е определена чрез обратнофазов ВЕТХ анализ.

Фигура 14 показва процент от началната ΙΡΝ-β-lb концентрация в лиофилизирани формулировки, съдържащи 9 % трехалоза в продължение на 9 месечно съхранение при 5° С или 30° С. Концентрацията е определена чрез UV спектроскопия.

Фигура 15 показва процента на главния пик ΙΡΝ-β-lb в лиофилизирани формулировки съдържащи 9 % трехалоза в продължение на 9 месечно съхранение при 5° С или 30° С. Процента на главния пик е определен чрез обратнофазов ВЕТХ анализ.

Фигура 16 показва процент от началната ΙΡΝ-β-lb концентрация в течни формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза след 9 ··· · · · · · · ·· · · · · · · · ·· ·· седмично съхранение при 30° С. Концентрацията е определена чрез UV абсорбция.

Фигура 17 показва процента на главния пик ΙΕΝ-β-lb в течни формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в продължение на седмично съхранение при 30° С. Процентът на главния пик е определен чрез обратнофазов ВЕТХ анализ.

Фигура 18 показва процент от началната IFN-p-lb концентрация в течни формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в продължение на 9 месечно съхранение при 5° С. Концентрацията е 0 определена чрез UV спектроскопия.

Фигура 19 показва процента на главния пик IFN-P-lb в течни формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в продължение на месечно съхранение в ампули при 5° С. Процентът на главния пик е определен чрез обратнофазов ВЕТХ анализ.

Фигура 20 показва процент от началната IFN-p-lb концентрация в течни формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в продължение на 9 седмично съхранение при 30° С. Концентрацията е определена чрез UV спектроскопия.

Фигура 21 показва процент от началната IFN-p-lb концентрация в лиофилизирани формулировки съдържащи 9 % трехалоза или 9 % захароза в продължение на 8 седмично съхранение при 40° С. Концентрацията е определена чрез UV спектроскопия.

Фигура 22 показва процент от началната IFN-β-Ι Ь концентрация в течни формулировки съдържащи 5 % манитол в продължение на 6 месечно съхранение при 5° С. Концентрацията е определена чрез UV спектроскопия.

Фигура 23 показва процента на главния пик IFN-P-lb в течни формулировки съдържащи 5 % манитол в продължение на 6 месечно съхранение при 5° С. Процентът на главния пик е определен чрез обратнофазов ВЕТХ анализ.

Изобретението е насочено към стабилизирани фармацевтични състави, които включват интерферон-бета (IFN-β) и методи за получаването им. Тези състави се получават в отсъствие на човешки серумен албумин (HSA) и поради това са свободни от този фармацевтичен пълнител. Такива състави се означават тук като “свободни от HSA” IFN-β фармацевтични състави. Съставите включват по същество мономерен IFN-β, който е солюбилизиран във формулировка с ниска-йонна-сила. Под формулировка с “ниска-йонна-сила” се има предвид разтвор, който съдържа буфер в

С-у»¹ количество, което е достатъчно за да поддържа pH на фармацевтичния състав в границите на плюс или минус 0.5 единици от специфизираното pH и която има йонна сила, която не е по-голяма от около 60 мМ. Под “йонна сила” се има предвид стандартната химическа дефиниция както е приложена към разтвор, където йонната сила на разтвора е равна на Ά Σ CiZ², в която с е концентрацията и z е заряда. Буферът присъства във формулировката с ниска йонна сила в концентрация от около 1 мМ до около 30 мМ, с предпочитание около 2 мМ до около 25 мМ, по-предпочитано около 2 мМ до около 20 мМ, дори още по-предпочитано около 2 мМ до около 10 мМ и най-добре около 2 мМ до около 5 мМ. Така, при някои изпълнения, формулировката с нискайонна сила включва буфер в концентрация от около 2 мМ до около 10 мМ, 2 мМ до около 7 мМ, около 2 мМ до около 5 мМ, около 2 мМ, около 3 мМ, около 4мМ или около 5 мМ. Подходящи буфери, които могат да се използват за получаването на формулировки с ниска йонна сила, в които е солюбилизиран IFN-β, включват, без да са ограничаващи, глицин, аспарагинова киселина, натриев сукцинат, цитрат, формиат, ацетат, глутаминова киселина, хистидин, имидазол и фосфат, за предпочитане глицин, аспарагинова киселина и натриев сукцинат, по-предпочитано глицин и аспарагинова киселина.

• · ··

··· · · · · · · «· 9 999999 99 99

С предпочитание, формулировката с ниска йонна сила има йонна сила, която не е по-голяма от около 60 мМ, по-предпочитано не по-голяма от около 40 мМ, още по-предпочитано не по-голяма от около 20 мМ. При някои изпълнения, йонната сила на формулировката няма допълнителни йонни видове като натриев хлорид, калиев хлорид, магнезиев хлорид, амониева сол и подобни, допринасящи за нейната йонна сила.

Използването на формулировки с ниска йонна сила в разтвор, включващ буфер в концентрация от около 1 мМ до около 30 мМ, с предпочитание около 2 мМ до около 5 мМ, осигурява получаването на стабилизирани IFN-β фармацевтични състави, които имат pH около 3.0 до около 5.0, с предпочитание около 3.0 до около 4.5, по-предпочитано около 3.0 до около 4.0, още по-предпочитано около 3.5 до около 4.0, най-добре около 4.0, в зависимост от използвания конкретен буфер. Така, когато буфера е глицин, pH на състава е около 3.0 до около 3.5, с предпочитание около 3.0. Когато буферът е аспарагинова киселина, pH на състава е около

3.5 до около 4.5, с предпочитание около 4.0. Когато буферът е натриев сукцинат, pH на състава е около 4.5 до около 5.0, с предпочитание около 5.0.

При поддържане на pH на IFN-β фармацевтичните състави съгласно изобретението в граници от около pH 3.0 до около 5.0 е възможно да се увеличи разтворимостта на IFN-β в тези състави над нормално възможната в отсъствие на използвания човешки серумен албумин. Нещо повече, чрез включване на IFN-β във формулировки с ниска йонна сила, съгласно дефиницията тук, е възможно да се получат фармацевтични състави, които включват мономерен IFN-β. Под “по същество мономерен” се има предвид че главната част от IFN-β (тегловно), присъстваща в състава, е в мономерната си форма, а не в агрегираната си форма. Под “агрегирана” се има предвид физическо взаимодействие между полипептидни молекули, което води до образуването на многомери (димери, тримери и т.н.), които могат да останат разтворими или могат да се утаят от разтвора. Мономерната

форма на IFN-β полипептида остава разтворима и от тук се казва, че е “солюбилизирана” във формулировката с ниска йонна сила или във фармацевтичните състави от настоящето изобретение. Процентът (тегловен) на IFN-β, който е в неговата мономерна форма в свободните от HSA състави на изобретението може да варира от 80 % или да е по-голям. Настоящето изобретение с това осигурява свободни от HSA IFN-β фармацевтични състави, които включват най-малко около 80 % от IFN-β в неговата мономерна форма по отношение на неговата агрегирана форма, за предпочитане около 85 %, по-предпочитано най-малко около 90 %, още попредпочитано най-малко около 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или повече от IFN-β в неговата мономерна форма.

При някои изпълнения на изобретението, свободните от HSA IFN-β фармацевтични състави, които включват допълнително не-йонно тонифициращо (придаващо изотоничност) средство в количество, което е достатъчно за предаване на съставите на изотоничност с телесните течности. Съставите могат да се направят изотонични с различни неионни модифициращи тоничността средства, обикновено известни на специалистите от областта. Това обикновено са въглехидрати от различни © видове (виж например Voet and Voet (1990) Biochemistry (John Wiley & Sons, New York)). Монозахариди, класифицирани като алдози, примерно глюкоза, маноза, арабиноза и рибоза, както и такива класифицирани като кетози като фруктоза, сорбоза и ксилулоза, могат да се използват като не-йонни тонифициращи средства съгласно настоящето изобретение. Дизахариди, примерно захароза, малтоза, трехалоза и лактоза, могат също да се използват. В допълнение, алдитоли (ациклични полихидрокси алкохоли) като глицерол, манитол, ксилитол и сорбитол са не-йонни тонифициращи средства, които са приложими в настоящето изобретение. Найпредпочитаните не-йонни тонифициращи средства са трехалазоа, захароза и манитол или комбинация от тях. He-йонното тонифициращо средство се • · · · · ···· ·· · ♦·»!»♦ · » 4· прибавя в количество достатъчно за да предаде на формулировката изотоничност с телесните флуиди. Когато се включат в свободните от HSA IFN-β фармацевтични състави, не-йонното тонифициращо средство присъства в концентрация от около 1 % до около 10 %, в зависимост от използваното средство. Така, съгласно едно изпълнение, не-йонното тонифициращо средство е трехалоза или захароза в концентрация около 8 % до около 10 %, с предпочитание около 9 % тегловно за обем и това е предпочитаната концентрация за трехалоза. Съгласно друго изпълнение, нейонното тонифициращо средство е манитол в концентрация от около 4 % до около 6 %, с предпочитание около 5 % тегловно за обем. В други изпълнения не-йонното тонифициращо средство е комбинация от трехалоза и манитол или захароза и манитол, където трехалозата и захарозата присъстват в концентрация от около 1 тегловен % за обем и манитолът присъства в концентрация от около 3 % до около 5 тегловни % за обем, с предпочитание около 4.6 тегловни % за обем.

Свободните от HSA IFN-β фармацевтични състави от изобретението включват течни състави и тяхни изсушени форми. За целите на настоящето изобретение, терминът “течни” по отношение на фармацевтичните състави или формулировки има предвид да включва терминът “водни” и включва течни формулировки, които са замразени. Под “изсушена форма” се има предвид течен фармацевтичен състав или формулировка, която е изсушена било чрез замразяване (т.е. лиофилизиране; виж например Williams and Polli (1984), J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48 - 59), сушене чрез разпръскване (виж Masters (1991) в Spray-Drying Handbook (5 ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491 - 676; Broadhead et al., (1992) Drug Devel. Ind. Pharm., 18: 1169 - 1206; и Mumenthaler et al., (1994), Pharm. Res., 11: 12-20) или сушене на въздуха (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459 - 470; и Roser (1991) Biopharm., 4: 47 - 53). Терминът “лиофилизиране” по отношение на IFN-β фармацевтичните формулировки се има предвид да се

• · · отнася до сушене чрез бързо замразяване под намалено налягане на множесто ампули, всяка от които съдържа единична доза от интерфероновата формулировка съгласно настоящето изобретение. Лиофилизатори, които провеждат гореописаното лиофилизиране, са търговски достъпни и специалистите от областта лесно работят с тях. Съгласно едно изпълнение на настоящето изобретение, течният състав се получава като лиофилизиран състав.

Съгласно други изпълнения на изобретението, свободните от HSA, IFN-β фармацевтични състави от изобретението могат да се получат под форма подходяща за белодробно предаване и прилагане на препарата към пациента чрез белодробно инхалиране. Под “белодробно инхалиране” се има предвид, че фармацевтичният състав се прилага директно към белия дроб чрез предаване на състава в аерозолна или друга подходяща препаративна форма от предаващо устройство в усната кухина на пациента, тъй като пациента инхалира през устната кухина. Под “аерозол” се има предвид суспензия от твърди или течни частички във въздушен поток или друг физиологично приемлив газов поток. Други подходящи препарати включват, без да се ограничава до тях, мъгла, пари или спрейови препарати дотолкова, доколкото частичките, включващи протеиновия състав се предават в размер на частичките в граници съвпадащи с описаните за суха праховидна форма на фармацевтичен състав, съгласно дефиницията по-долу. Белодробно инхалиране може също да се осъществи по други подходящи методи известни на специалистите в областта. Те могат да включват течно капково предаване като се използва подходящо устройство или други такива методи. Белодробно инхалиране води до депозиране на инхалирания протеинов състав в алвеолите на белия дроб на пациента. Веднаж депозиран, протеинът може да се абсорбира, пасивно или активно, през алвеолния епителни и капилярните епителни слоеве в кръвния поток за последващо системно разпространяване.

• ♦ · • · · ♦ · • · · • · · • · е · ·*« · · · · · ··

Белодробно приложение на полипептид или протеин като IFN-β изисква разпределяне на биологично активната субстанция от устройството за предаване в устната кухина на пациента при инхалирането. За целите на настоящето изобретение, свободните от HSA фармацевтични състави включващи IFN-β или негови варианти се прилагат чрез инхалиране на аерозол или на друга подходяща препаративна форма, която се получава от воден или неводен разтвор или от суспензионна форма, или от твърда или суха прахообразна форма на фармацевтичния състав, в зависимост от използваното предаващо устройство. Такива предаващи устройства са добре известни в областта и включват, без да се ограничава до тях, небулизатори, премерено-дозиращи инхалатори и инхалатори за сух прах или всякакви други предаващи механизми, които позволяват диспергирането на фармацевтичен състав като воден или неводен разтвор или суспензия или като твърда или суха прахообразна форма. Когато се използва в контекста на фармацевтични състави, подходящи за белодробно предаване, тези термини имат следните предвидени значения. Под “воден” се има предвид състав, който е получен в или е разтворен във вода, включително смеси в които водата е преобладаващото вещество в сместа. Преобладаващото вещество е присъстващото в по-голямо количество от другата съставка в сместа. Под “неводен” се има предвид състав, който е приготвен с, съдържа или е разтворен в различно от вода вещество или в смеси, в които водата не е преобладаващото вещество в сместа. Под “разтвор” се има предвид хомогенен препарат от две или повече вещества, които могат да бъдат твърди, течни, газообразни или комбинация от такива. Под “суспензия” се има предвид смес от вещества, в която едно или повече вещества са хомогенно диспергирани в другото преобладаващо вещество.

За целите на настоящето изобретение термините “твърд” и сух прах” са взаимно заменяеми по отношение на свободните от HSA фармацевтични състави, подходящи да белодробно предаване. Под “твърда” или “суха · · * · · · · ·

9 ··· »·« ·· ·· прахообразна” форма на фармацевтичен състав се има предвид състав, който е сушен до финораздробен прах, с съдържание на влага под около 10 тегловни %, обикновено под около 5 тегловни % и с предпочитание под около 3 тегловни %. Тази суха прахова форма на състава се състои от частички, включващи IFN-β или негови варианти. Предпочитани размери на частичките са по-малки от около 10.0 мкм среден диаметър, попредпочитано по-малък от около 7.0 мкм, дори по-предпочитано по-малък от около 6.0 мкм, още по-предпочитано в границите на 0.1 до 5.0 мкм, найпредпочитано в границите на около 1.0 до около 5.0 мкм среден диаметър.

Така, свободен от HSA течен фармацевтичен състав, включващ IFN-β или негови варианти, който е предвиден за белодробно предаване, може да бъде използван или като течен разтвор или суспензия в предаващото устройство или предварително да се обработи в сух прах при използване на лиофилизация или техника на разпръскващо сушене, добре известни в областта. Когато се прилагат течен разтвор или суспензия в предаващо устройство, може да се използва небулизатор, инхалатор за премерени дози или друго предаващо устройство, на единични или множество разделени дози чрез белодробно инхалиране на фармацевтично ефективно количество и от състава в белите дробове на пациента като капчици, притежаващи същия размер на частичките в определените по-горе граници за сухата прахообразна форма. Под “фармацевтично ефективно количество” се има предвид количество, което е приложимо при лечението, предпазването или диагностицирането на заболяване или състояние реагиращо към IFN-β. Течният разтвор или суспензия на състава може да се използва с физиологично подходящи стабилизиращи средства, пълнители, вискозитетни модификатори, спичащи средства, повърхностноактивни вещества или комбинация от тях , известни на специалистите от областта, дотолкова, доколкото те не влошават отличителните характеристики на свободните от HSA IFN-β състави на изобретението.

.”.Г4·: • · ·	• •	• · ·»·· ·· · · · • · · ·
• · · ·· ·	• *··	• · · · · 4·· ·· ··

Когато течният фармацевтичен състав е лиофилизиран преди използването му в белодробното устройство, лиофилизираният състав се смила за да се получи финораздробен сух прах, състоящ се от частички с размери в горните желани граници. Когато се изполва разпръскващо сушене за получаването на суха прахова форма на течния фармацевтичен състав, процесът се провежда при условия, които водят до практически аморфен, фино раздробен сух прах, състоящ се от частички с размери в горните желани граници. По подобен начин, ако изходният фармацевтичен състав е

вече в лиофилизирана форма, съставът можеда се смели за да се получи сухата прахова форма за последващо получаване на еаерозол или друг подходящ препарат за белодробно инхалиране. Когато изходният фармацевтичен състав е в сушена чрез разпръскване форма, съставът е с предпочитание получен така ,че той е вече в суха прахообразна форма, притежаващ подходящите размери на частичките за диспергиране във воден или неводен разтвор или суспензия или суха прахообразна форма в съответствие с белодробното приложение. За методи за получаване на прахови форми на белодробни състави виж например WO 96/32149, WO 97/41833, WO 98/20096 и U.S. патенти с №№ 5 976 574, 5 985 248 и 6 001 336, включени тук за справка.

Получената прахообразна форма на състава след това се поставя в подходящо предаващо устройство за последващо получаване на аерозол или друг подходящ препарат, който се прилага на пациента чрез белодробно инхалиране. Когато трябва да се получи сухата прахообразна форма на фармацевтичния състав и да се разпръсне като воден или неводен разтвор или суспензия, се използва отмерващ дозите инхалатор или друго подходящо предаващо устройство. Фармацевтично ефективно количество от сухата прахообразна форма на състава се прилага в аерозол или друг препарат подходящ за белодробно инхалиране. Количеството на сухата прахообразна форма на състава, поставено в предаващото устройство е ······ ·1с · ·· ····

J ; · · · ·..

··· · · «··· ·· · ···.., ,, ,, достатъчно за да позволи предаването на фармацевтично ефективно количество от състава на пациента чрез инхалиране. Така, количеството на сухата прахообразна форма, което се поставя в предаващото устройство ще компенсира възможни загуби в устройството при съхранението и предаването на сухата прахообразна форма на състава. След поставянето на сухата прахообразна форма в предаващото устройство, частичките с подходящите размери, както по-горе бе отбелязано, се суспендират в аерозолен пропелант. Неводната суспензия под налягане след това се освобождава от предаващото устройство във въздушен поток за инхалиране от пациента. Предаващото устройство предава по начин на единични или множество разделени дози, чрез белодробно инхалиране, фармацевтично ефективно количество от състава към белите дробове на пациента. Аерозолният пропелант може да бъде всеки обичаен продукт, използван за тази цел, като хлорофлуоровъглерод, хидрохлоро-флуоровъглерод, хидрофлуоровъглерод или въглеводород, включително трихлорофлуорометан, дихлородифлуоро-метан, дихлоротетрафлуороетан, дихлородифлуоро-метан, дихлоротетрафлуороетанол и 1,1,1,2-тетрафлуороетан и комбинации от тях. Може да се прибави и повърхностноактивно вещество към фармацевтичния състав за да се намали адхезията на протеин-съдържащия сух прах към стените на предаващото устройство от което аерозола се разпръсква. Подходящи повърхностноактивни вещества за целта включват, без да са ограничителни, сорбитан триолеат, соев лецитин и олеинова киселина. Подходящи за белодробно предаване устройства на суха прахова форма на протеиновия състав като неводна съспензия са търговски достъпни. Примери на такива устройства включват Ventolin metered-dose инхалатор (Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC) и Intal Inhaler (Fisons, Corp., Bedford, МА). Виж също аерозолните предаващи устройства описани в U.S. патенти с №№ 5 522 378, 5 775 320, 5 934 272 и 5 960 792, включени тук реферативно.

.:16.

Когато твърда или суха прахообазна форма на свободния от HSAIFNβ състав трябва да се предаде като суха прахообразна форма се използва с предпочитание инхалатор за сух прах или друго подходящо предаващо устройства. Сухата прахообразна форма на фармацевтичния състав се получава с предпочитание като сух прахообразен аерозол чрез диспергиране във въздушен поток или в друг подходящ физиологично приемлив газов поток по обичаен начин. Примери на търговски достъпни инхалатори за сухи прахове, за използване съгласно методите тук, включват Spinhaler powder inhaler (Fisons Corp., Bedford, MA) Ventolin Rotahaler (Glaxo, Inc., Triangle Park, NC). Виж също устройствата за предаване на сухи прахове, описани в WO 93/00951, WO 96/09085, WO 96/32152 и U.S. патенти с №№ 5 458 135, 5 785 049 и 5 993 783, включени тук за справка.

Сухата прахообразна форма на свободния от HSA фармацевтичен състав включващ IFN-β или негов биологично активен вариант може да се реконституира до воден разтвор за последващо прилагане като аерозолен воден разтвор при използването на небулизатор, инхалатор предаващ отмерена доза или друго подходящо предаващо устройства. В случай на небулизатор, водният разтвор поставен във флуиден резервоар се превръща във воден спрей, от който само малка част напуска небулизатора за да се приложи към пациента в дадено време. Останалият спрей се просмуква обратно във флуидния резероар на небулизатора, където отново се аеролизира във воден спрей. Този процес се повтаря до пълното изчерпване на флуидния резероар или до прилкючване предаването на аерозолизирания спрей. Такива небулизатори са търговски достъпни и включват например Ultravent nebulizer (Mallinckrodt Inc., St. Louis, МО) и Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood, CO). Виж също небулизаторите описани в WO 93/00951 и устройството за предаване на аеролизирани водни формулировки, описани в U.S. патент № 5 544 646, включен тук за справка.

.·· ···· 5-7 · ·· ···· : : ·4/ .....

·· · ··· ··· ·. ..

Свободните от HSA IFN-β фармацевтични състави на настоящето изобретение са “стабилизирани” състави. Под “стабилизирани” се има предвид, че съставите запазват IFN-β полипептида в по същество мономерно състояние при съхранение и от тук лечебната ефективност на полипептида не се компрометира поради образуването на агргати. Под “през време на съхраняване” се има предви течен фармацевтичен състав или формулировка, които не се прилагат към пациента веднага след получаването им. По-скоро, след получаването им те се опаковат за съхранение било в течна форма, в замразено състояние или в изсушена форма за по-късно реконституиране в течна форма или в друга форма подходяща за приложение към пациента. Тази стабилност се постига в отсъствието на HAS като стабилизиращо и солюбилизиращо средство. С предпочитание, съставите от изобретението се съхраняват направо в течната им форма за да се използва напълно удобството на притежаваната стабилност при съхранение в течна форма, лекотата на приложение, без да се реконституира, и свойството да се доставя формулировката в предварително напълнени, готови за употреба спринцовки или препарати съдържащи многократни дози, ако формулировката е съвместима с бактериостатични средства. Стабилизираните, свободни от © HSA IFN-β състави от изобретението имат срок за съхранение най-малко около 6 месеца, 12 месеца, 18 месеца, по-предпочитано най-малко 20 месеца, още по-предпочитано най-малко около 22 месеца и най-предпочитано наймалко около 24 месеца, когато се съхраняват при 2 - 8° С.

Методи за проследяване стабилността на свободни от HSA IFN-β фармацевтични състави от изобретението са достъпни в областта, включително методите описани в примерите по-долу. Така образуването на IFN-β агрегат при съхранение на течен фармацевтичен състав от изобретението може лесно да се определи чрез измерване на промяната на разтворимия IFN-β в разтвора във времето. Количеството на разтворим полипептид в разтвора може да се определи чрез няколко аналитични • · ···· .18 • · • · « · изпитания, пригодени за проследяване на IFN-β. Такива изпитания включват например обратнофазова ВЕТХ и UV абсорбционна спектроскопия, както е описано в примерите по-долу. Определянето на двата вида разтворими и неразтворими агрегати при съхранение в течни формулировки може да се постигне, например, като се използва аналитично ултрацентрофугиране, както е отбелязано в примерите по-долу, за да се отличи частта разтворим полипептид, присъстващ като разтворими агрегати и частта налична в неагрегирана, биологично активната молекулна форма.

Стабилизираните фармацевтични формулировки на изобретението включват IFN-β и негови варианти. Терминът “ПЧ^”използван тук, се отнася до IFN-β или негови варианти, понякога наречени подобни на IFN-β полипептиди. Човешки IFN-β варианти, които могат да се срещат естествено (например алелни варианти, които се появяват на IFN-β мястото) или да се получат рекомбинантно, имат аминокиселинни последователности, които са еднакви или подобни на практически подобната зряла естествена IFN-β секвенция. Включени са също фрагменти на IFN-β или съкратени форми на IFN-β, които запазват своята активност. Тези биологически активни фрагменти или съкратени форми на IFN-β се получават при отстраняване на аминокиселинни остатъци от IFN-β аминокиселинната секвенция с пълна дължина, при използването на рекомбинантни ДНК техники, които са добре известни в областта. IFN-β полипептиди могат да бъдат гликозилирани или негликозилирани, както е описано в литературата и двата гликозилирани и негликозилирани IFN-β показват количествено подобни специфични активности и поради това, гликозиловите части не участват в и не допринасят за биологичната активност на IFN-β.

Обхванатите тук IFN-β варианти включват мутеини на зрялата естествена IFN-β секвенция, в която един или повече цистеинови остатъци, които не са от съществено значение за биологичната активност, са били

произволно делетирани или заменени с други аминокиселини за да се елиминират места или за междумолекулно напречно свързване или за образуване на неправилно междумолекулно свързване чрез дисулфидна връзка. IFN-β вариантите от този тип включват тези съдържащи заместители глицин, валин, треонин или метионин вместо цистеин, намерен при аминокиселина 17 на зрялата естествена аминокиселинна секвенция. Серин и треонин са по-предпочитаните заместители поради тяхната химическа аналогия с цистеин. Най-предпочитани са сериновите замествания. В едно изпълнение, намерения при аминокиселина 17 цистеин на зрялата естествена секвенция е заместен със серин. Цистеин 17 може също да бъде делетиран при използване на известни в областта методи (виж например U. S. патент No 4 588 584, включен тук за справка), което води до зрял IFN-β мутеин, който е с една аминокиселина по-къс от зрялия естествен IFN-β. Виж също като пример U. S. патенти с №№ 4 530 787,4 572 798 и 4 588 585. Така IFN-β варианти, с една или повече мутации, които подобряват примерно тяхната фармацевтична приложимост, са също обхванати от настоящето изобретение.

Добрият специалист ще разбере, че допълнителни промени могат да се въведат чрез мутации в нуклеотидните секвенции кодиращи IFN-β, водещи до промени в IFN-β аминокиселинната секвенция, без да се променя биологичната активност на интерферона. Така, изолирана молекула на аминокиселина, кодираща IFN-β вариант, притежаваща секвенция която се различава от аминокиселинната секвенция на зрелия естествен IFN-β, може да се създаде чрез въвеждане на едно или повече нуклеотидни замествания, добавки или делетирания в съответната нуклеотидна секвенция описана тук, така, че едно или повече аминокиселинни замествания, добавки или делетирания се въвеждат в кодирания IFN-β. Мутации могат да се въведат чрез стандартни техники, като направляван към местата мутагенезиз и PCR• > · · е · « · « ·

медииран мутагенезиз. Такива IFN-β варианти са също включени в настоящето изобретение.

Например, консервативни аминокиселинни замествания могат да се направят при един или повече предицирани, с предпочитание несъществени аминокиселинни остатъци. “Несъществени” аминокиселинни остатъци е остатък, който може да бъде изменен от див-тип секвенция на IFN-β без да се промени неговата биологическа активност, докато “съществен” аминокиселинен остатък е необходим за биологическата активност. “Консервативно аминокиселинно заместване” е това, при което аминокиселинният остатък се заменя с аминокиселинен остатък, притежаващ подобна странична верига. Семейства аминокиселинни остатъци, притежаващи подобни странични вериги са известни в областта. Тези семейства включват аминокиселини с базични странични вериги (например лизин, аргинин, хистидин), с киселинни странични вериги (например аспарагинова киселина, глутаминова киселина) с незаредени полярни странични вериги (например глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), с неполярни странични вериги (например аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с бета-разклонени странични вериги (например треонин, валин, изолевцин) и с ароматни странични вериги (например тирозин, фенилаланин, триптофан, хистидин). Такива замествания не биха били направени за консервирани аминокиселинни остатъци или за аминокиселинни остатъци намиращи се в консервиран мотив.

Алтернативно, вариантни IFN-β нуклеотидни секвенции могат да се направят чрез въвеждане на мутации произволно в продължение на цялата или на част от IFN-β кодиращата секвенция, такива както при сатурираща мутагенеза, и получените в резултат мутанти могат да бъдат скринирани за IFN-β биологическа активност за да се идентифицират мутанти, които запазват активност. След мутагенеза, кодираният протеин може да бъде експресиран рекомбинантно и активността на протеина може да бъде определена като се използват стандартни техники на изпитване, описани тук.

Биологично активни варианти на IFN-β най-общо биха имали наймалко 80 % , за предпочитане около 90 % до около 95 % или повечеи найпредпочитано около 96 % до около 99 % или повече аминокиселинна секвентност идентична на аминокиселинната секвентност на зрял естествен IFN-β, която служи като база за сравнение. Под “секвентна идентичност” се има предвид, че същите аминокиселинни остатъци се намират във

вариантния полипептид и полипептидната молекула служи като образец за сравняване на специфизиран съседен сегмент на аминокиселинната секвенция на варианта се съпоставя и сравнява с аминокиселинната секвентност на молекулата на образеца.

За целите на оптимално съпоставяне на две секвенции за определяне на секвентната идентичност, съседен сегмент на аминокиселинната секвенция на варианта може да има допълнителни аминокиселинни остатъци или делетирани аминокиселинни остатъци по отношение на аминокиселинната секвенциина на молекулата образец. Съседният сегмент, използван за сравнение на аминокиселинната секвенция на образеца ще включва най-малко 20 съседни аминокиселинни остатъка. Корекции за увеличена секвентна идентичност, свързана с включване на пролуки във вариантната аминокиселинна секвенция, могат да се направят чрез определяне на недостатъците от пролуките. В областа са добре известни методи за съпоставне на секвенции.

Така, определянето на процентната идентичност между които да са две секвентности може да се осъществи като се използва математичен алгоритъм. Предпочитан, неограничаващ пример на математичен алгоритъм, използван при сравняването на секвенции е алгоритъма на Myers and Miller (1988), Comput. Appl. Bioscdi., 4: 11 - 7. Такъм алгоритъм се използва в ALIGN програмата (версия 2.0), която е част от GCG подреждането на .··. ··*: .22 .

• · · · • · · · · • · · · • · · · · · « • · « • * · програмния пакет. С ALIGN програмата могат да weight residue table, a gap length penalty of 12 и се използват PAM 120 gap penalty of 4 при сравняване на аминокиселинни секвенции. Друг предпочитан неограничаващ пример на математичен алгоритъм за използване при сравняване на две секвенции е алгоритъма на Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 - 5877, модифициран съгласно Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 - 5877. Такъв алгоритъм е включен в NBLAST и XBLAST програмите на Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410. Изследване на BLAST амино киселинна © последователност може да се осъществи с XBLAST програма, score = 50, wordlenght = 3, за да се получи аминокиселинна последователност подобна на представляващия интерес полипептид. За да се получи подреждане на пролуките за сравнение, може да се използва BLAST с пролуки, както е описано от Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389 - 3402. Алтернативно, може да се използва PSI-BLAST за провеждането на интегрирано изследване, което проследява връзките между молекулите. Виж Altschul et al., (1997) от по-горе. Когато се използват BLAST, BLAST с пролуки или PSI-BLAST програми, могат да се използват недостатъчните параметри. Виж http.7/www.ncbi.nlm.nih.gov. Виж също ALIGN програма (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) и програми от Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (достъпни от Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) например GAP програмата, където се използват параметри на недостатъците в програмата.

Когато се обсъждат проценти на идентичност на аминокиселинна секвенция, някои позиции на аминокиселинни остатъци могат да се различават в резултат на консервативни аминокиселинни замествания, които не повлияват на свойства на протеиновата функция. В тези случаи, процентната секвентна идентичност може да се нагласи нагоре за да отчете • ♦ ··*· .23 сходството в консерватинво заместените аминокиселини. Такива нагласяния са добре известни в областта. Виж например Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11 - 17.

Биологично активни IFN-β варианти, включени в изобретението, също обхващат IFN-β полипептиди, които са били ковалентно свързани с, например, полиетиленгликол (PEG) или албумин. Тези ковалентни хибридни IFN-β молекули притежават някои желани фармацевтични свойства като удължен серумен полуживот след прилагането към пациент. Методи за създаване на PEG-IFN адукти включва химическо модифициране на монометоксиполиетиленгликол за да се създаде активирано съединение, което ще реагира с IFN-β. Методи за получаване и използване на PEGсвързани полипептиди са описани например от Delgado et al., (1992) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Sy st. 9: 249 - 304. Методи за създаване на албумин сляти полипептиди включват сливане на кодиращата секвенция за представляващия интерес полипептид (например IFN-β) и албумин и са описани в U. S. патент № 5 876 969, включен тук за справка.

Биологично активни IFN-β варианти, включени в изобретението, трябва да запазват IFN-β си активност, по-специално способността си да се свързват към IFN-β рецептори. При някои изпълнения IFN-β варианта запазва най-малко около 25 %, около 50 %, около 75 %, около 85 %, около 90 %, около 95 %, около 98 %, около 99 % или повече от биологическата активност на полипептидите, чиито аминокиселинни секвенции са дадени на фигура 1 или 2. IFN-β варианти, чията активност е увеличена в сравнение с активността на полипептидите показани на фигура 1 или 2, са също включени. Биологичната активност на IFN-β варианти може да се измери по всеки от известните в областта методи. Примери на такива изпитания могат да се намерят в Fellous et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3082 3086; Czerniecki et al., (1984), J. Virol. 49(2): 490 - 496 ; Mark et al., (1984)) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662 - 5666; Branca et al., (1981) Nature 277 :

• · · ·

τ>/1

221 - 223 ; Wiliams et al., (1979) Nature 282 : 582 - 586 ; Herberman et al., (1979) Nature 277 : 221 - 223 ; Anderson et al., (1982) J. Biol. Chem., 257(19) :

11301 - 11304 и изпитанието за IFN-β активността описано тук (виж пример

2)·

IFN-β от формулировките може да бъде от всеки животински вид включително, но без да се ограничава до тях птичи, заешки, говежди, свински, конски и човешки. Предпочита се IFN-β да е от бозайников вид, когато формулировката е за използване при лечението на IFN-β нарушение при бозайници и по-предпочитано е когато е от бозайник от същия вид на бозайника върху който ще се прилага лечението на такова нарушение. Така, когато подлежащия на лечение бозайник е човек, предпочита се към пациента да се приложи свободен от HSA фармацевтичен състав, включващ по същество мономерен човешки IFN-β или негов биологично активен вариант.

Неограничаващи примери на IFN-β полипептиди и IFN-β вариантни полипептиди обхванати от изобретението са дадени в Nagata et al., (1980) Nature 284: 316 - 320; Goeddel et al., (1989) Nature 287: 411 - 416; Yelverton et al., (1981), Nucleic Acids Res., 9: 731 - 741, Streuli et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A. 78: 2848 - 2852; ЕР 028033B1 и ЕР 109748B1. Виж също U. S. патентни c №№ 4 518 584; 4 569 908; 4 588 585; 4 738 844; 4 753 795; 4 769 233; 4 793 995; 4 914 033; 4 959 314; 5 545 723 и 5 814 485. Тези описания са включени тук за справка. Цитираното в тях също осигурява насоки по отношение на остатъците и регионите на IFN-β полипептид, които могат да бъдат променени, без да се загуби от биологическата активност.

Съгласно едно изпълнение на настоящето изобретение, IFN-β в стабилизираните фармацевтични формулировки е зрял естествен IFN-β полипептид. В друго изпълнение, IFN-β в тези формулировки е зрелия IFN-β полипептид, при който цистеина, намиращ се при аминокиселина 17 на зрялата естествена секвенция, е заменен със серин, както е описано по-горе.

Настоящето изобретение обхваща обаче и други изпълнения, при които IFNβ в стабилизираната фармацевтична формулировка е всеки биологично активен IFN-β полипептид или вариант, както е описано тук.

При някои изпълнения на настоящето изобретение, IFN-β се получава рекомбинантно. Под “рекомбинантно получен IFN-β “ се има предвид IFN-β , които е сравним по биологична активност със зрелия естествен IFN-β и е бил получен чрез рекомбинантни ДНК техники. IFN-β може да се получи чрез култивиране на клетка гостоприемлинк, трансформиран с експресиращ вектор включващ нуклеотидна секвенция, която кодира IFN-β полипептид. Гостоприемниковата клетка е тази, която може да транскрибира нуклеотидната секвенция и да произведе желания протеин, и може да бъде прокариотна (например Е. coli) или еукариотна (например дрождена, инсектна или бозайникова клетка). Примери на рекомбинантно получаване на IFN-β са даденои в Mantei et al., (1982) Nature 297: 128; Ohno et al., (1982), Nucleic Acids Res., 10: 967; Smith et al., (1983), Mol. Cell Biol., 3: 2156 и U.S. патентои c №№ 4 462 940, 5 702 699 и 5 814 485, включени тук за справка. Клонирани са човешки интерферон гени при използване на рекомбинантна ДНК (“rDNA”) технология и са били експресирани в Е. coli (Nagola et al., (1980) Nature 284: 316; Goeddel et al., (1989) Nature 287:411; Yelverton et al., (1981) Nuc. Acid Res., 9: 731; Streuli et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 2848). Алтернативно, IFN-β може да се получи от трансгенно животно или растение, което е било генетично обработено да експресира представляващия интерес IFN-β протеин в съответствие с известни в областта методи.

Протеини или полипептиди, които проявяват подобни на интерферон свойства, могат също да се получат чрез rDNA технология чрез екстрахиране на поли-А-богат 12 S месенджер RNA от вирусно индуцирани човешки клетки, синтезирайки двойно-верижни cDNA при използване на mRNA като матрица, въвеждайки cDNA в подходящ клониращ вектор, трансформирайки подходящи микроорганизми с вектор, реколтиране на микроорганизмите и екстрахиране от тях на интерферон-бета. Виж например Европейски патентни заявки с № № 28033 (публикувана на 6 май 1981 г.), 32134 (публикувана на 15 юли 1981гл) и 34307 (публикувана на 26 август 1981 г), където са описани различни методи за получаването та интерферон-бета при използването на rDNA технологии.

Алтернативно, IFN-β може да бъде синтезиран химически, по всяка от няколкото известни технологии, които са известни на специалистите от пептидната област. Виж например Li et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA © 80: 2216 - 2220, Steward and Yong (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce

Chemical Company* Rockford, Illinois) и Baraney and Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Sythesis, Biology, ed. Gross and Meinhofer, Vol. 2 (Academic Press, New York, 1980), pp. 3 - 254, където са обсъдени пептидни синтезни техники в твърда фаза и Bodansky (1984), Principles of Peptide Synthesis (Springer - Verlag, Berlin) и Gross and Meinhofer, eds. (1980) The Peptides: Analysis, Sythesis, Biology, Vol.l (Academic Press, New York,), където са разгледани класически синтези в разтвор. IFN-β може да бъде получен химически също по метод на едновременен множествен пептиден синтез. © Виж например Houghten (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131 - 5135 и

U.S. патент № 4 631 211.

Рекомбинантно получения IFN-β за използване в стабилизирани свободни от HSA IFN-β фармацевтични състави на изобретението може да бъде изолиран и пречистен чрез всички известни на специалистите методи. Такива методи включват описаните в U.S. патенти с №№ 4 462 940 и 5 702 699, включени тук за справка. Тези методи изолират интерферона в чиста форма на IFN-β, който има тенденция за образуване на агрегати в отсъствието на SDS, който се използва като стабилизиращо средство. Освен това, тези методи излагат протеина на условия на високо pH, което може да повлияе неблагоприятно на биологичните свойства на протеина и може да •9 ··♦·

доведе до състави, които съдържат остатъчни количества натриев додецилсулфат (SDS), който се използва за солюбилизиране на протеина при пречистването. Така, докато IFN-β може да се получи при използването на тези методи, за предпочитане той се изолира и пречиства по подобрения метод, описан в сродна нерешена заявка със заглавие “Improved Method of Protein Purification and Recovery”, подадена на 27 октоври 2000 г. и означена U.S. Application Serial No. 60/243 965, в сродна нерешена заявка със заглавие “Improved Method of Protein Purification and Recovery”, подадена на 9 април 2001 г. и означена U.S. Application Serial No. 60/282 607 и сродна нерешена конкурентна заявка със заглавие “Methods of Protein Purification and Recovery” и означена U.S. Application Serial No._______, чиито съдържания са включени тук за справка в своята цялост.

В тези нерешени и конкурентно подадени заявки са описани два подобрени метода за пречистване и изолиране. Първият от тези методи на пречистване и изолиране включва утаяване на по същество пречистен IFN-β с алкохол като алифатен алкохол и разтваряне на утаения IFN-β в гаунидин хидрохлорид. След това полученият разтвор се разрежда в подходящ буфер за да се отново натурира протеина. Вторият от тези методи за пречистване и изолиране изпуска етапа на утаяване. По този начин проба, включваща практически пречистен IFN-β, се смесва с гуанидин хидрохлорид за да образува разтвор включващ солюбилизиран денатуриран IFN-β; този разтвор след това се разрежда в подходящ буфер за да се натурира отново протеина. При двата метода, разтворът включващ ренатурирания IFN-β се диафилтрува или диализира в буфер, използван за фармацевтични цели. Когато се използва за получаването на свободен от HSA фармацевтичен състав на настоящето изобретение, пречистения ренатуриран IFN-β протеин се диафилтрува във формулировка с ниска йонна сила от настоящето изобретение, както е описано в пример 8 по-долу.

Съставите включени в изобретението, могат да имат толкова малко като около 0.01 мг/мл IFN-β и толкова много като около 20.0 мг/мл IFN-β (тегло/обем). При различни изпълнения, IFN-β присъства в концентрация от около 0.01 мг/мл до около 20.0 мг/мл, около 0.015 мг/мл до около 12.5 мг/мл, около 0.025 мг/мл до около 10.0 мг/мл, около 0.05 мг/мл до около 8.0 мг/мл, около 0.075 мг/мл до около 6.0 мг/мл, около 0.1 мг/мл до около 4.0 мг/мл , около 0.125 мг/мл до около 2.0 мг/мл около 0.175 мг/мл до около 1.0 мг/мл, около 0.2 мг/мл до около 0.5 мг/мл, около 0.225 мг/мл до около 0.3 мг/мл и около 0.25 мг/мл.

При някои изпълнения, формулировките от изобретението включват фармацевтично приемлив носител. Под “фармацевтично приемлив носител” се има предвид носител, който удобно се използва в областа за улесняване на съхранението, приложението и/или оздравителния ефект на лечебните съставки. Носителят може също да намалява нежелани странични ефекти на IFN-β. Подходящият носител трябва да бъде стабилен, т.е. да не е способен да взаимодейства с други съставки от формулировката. Той не трябва да дава значителни местни или системни неблагоприятни ефекти в приемника при дозировките и концентрациите използвани за лечението. Тазива носители са най-общо известни в областта. Подходящи носители за настоящето изобретението са обичайно използваните голями стабилни макромолекули като желатин, колаген, полизахарид, монозахариди, поливинил-пиролидон, полимлечна киселина, полимерни аминокиселини, стабилизирани масла, етилолеат, липозоми, глюкоза, лактоза, маноза, декстроза, декстран, целулоза, сорбитол, полиетиленгликол (PEG) и подобни. Бавноосвобождаващи носители, като например хиалуронова киселина, могат също да бъдат подходящи. Виж по-специално Prisell et al., (1992), Int. J. Pharmaceu. 85 : 51 - 56 и U.S. патент № 5 166 331.

Фармацевтичните състави могат допълнително да включват солюбилизиращо средство или подобрителн на разтворимостта, което ··♦·

допринася за разтворимостта на протеина над подобрената разтворимост, получена при използването на формулировки с ниска йонна сила, описани тук. Съединения, съдържащи гуанидинова група, най-предпочитано аргинин, са подходящи подобрителни на разтворимостта на IFN-β. Примери на такива подобрителни на разтворимостта включват аминокиселината аргинин, както и аминокиселинни аналози на аргинин, които запазват способността да подобряват разтворимостта на IFN-β. Такива аналози включват, без да са ограничителни, дипептиди и трипептиди, които съдържат аргинин. Други подходящи солюбилизиращи средства са описани в U.S. патенти №№ 4 816 С* 440; 4 894 330; 5 004 605; 5 183 746; 5 643 566 и Wang et al., (1980) J.

Parenteral Drug Assoc. 34: 452 - 462, включени тук за справка.

В допълнение, освен описаните по-горе средства, могат да се прибавят и други средства за подобряване на стабилоността на течните фармацевтични състави като етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) или една от нейните соли като динатриевата EDTA. EDTA действа като събирач на метални йони известни че катализират много оксидационни реакции, с това представлява допълнително стабилизиращо средство. Други подходящи средства включват не-йоногенни повърхностноактивни вещества, включително полиоксиетиленсорбитолови естери като полисорбат 80 (Tween 80) и полисорбат 20 (Tween 20); полиоксипропиленполиоксиетилнови естери като Pluronic F68 и Pluronic Fl 27; полиоксиетиленови алкохоли като Brij 35; симетикон; полиетиленгликол като PEG400; лизофосфатидилхолин и полиоксиетилен-р-трет.-октилфенол като Triton Х-100. Класическо стабилизиране на фармацевтични препарати чрез повърхностноактивни вещества е описано например от Levine et al., (1991) J. Parenteral Sci. Technol., 45(3): 160 - 165, включен тук за справка.

Към пациента се прилага фармацевтично ефективно количество от стабилизирана свободна от HSA IFN-β формулировка съгласно изобретението или реконституирана стабилизирана свободна от HSA IFN-β ·· ··♦· • · ·· формулировка съгласно изобретението. Под “фармацевтично ефективно количество” съгласно изобретението се има предвид количество което е използваемо при лечението, предпазването или диагностицирането на заболяване или нарушение. Типични пътища на приложение включват, без да са ограничителни, орално приложение, отдаване през носа, отдаване през белия дроб и парентерално приложение, включително трансдермално, венозно, мускулно, подкожно, в артериите и интраперитонеално инжектиране или инфузиране. При едно такова изпълнение, прилагането е чрез инжектиране, с предпочитание подкожно инжектиране. Инжекционни форми на съставите на изобретението включват, без да се ограничава до тях, разтвори, суспензии и емулсии. Характерно лечебноефективно количество от IFN-β включва около 0.01 мкг/кг до около 5 мг/кг от състава, с предпочитание около 0.05 мкг/кг до около 1000 мкг/кг, по-предпочитано около 0.1 мкг/кг до около 500 мкг/кг, дори по-предпочитано около 0.5 мкг/кг до около 30 мкг/кг.

Съгласно едно изпълнение, стабилизираната свободна от HSA IFN-β фармацевтична формулировка включва предимно мономереният IFN-β формулиран в единични дози и може да бъде в инжекционна или инфузионна форма като разтвор, суспензия или емулсия. Нещо повече, тя може да се съхранява замразена или да е приготвена в сушена форма като лиофилизиран прах, който може да се реконституира в течен разтвор, суспензия или емулсия преди приложение по всеки от различните методи, включващи орални или парентерални пътища на прилагане. Стабилизираният фармацевтичен състав може да бъде стерилизиран чрез мембранно филтруване и се съхранява в контейнери, съдържащи единични или многократни дози, като запечатани флакони или ампули. Други методи за формулиране на фармацевтичен състав, обичайно известни в областта, могат да се използват за по-нататъшно подобряване на стабилността при съхранение ан фармацевтичните състави описани тук, при условие, че те не повлияват неблагоприятно върху положителните ефекти на описаните тук стабилизиращи средства. Обстоен преглед на формулирането и подбора на фармацевтично приемливи носители, стабилизатори и т.н.може да се намери в Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) (18 ed.,Mack Publishing Company, Reaton, Pennsylvania), включен тук за справка.

Формулировки, включващи ефективно количество от фармацевтичните състави от изобретението съдържащи β-интерферон (IFNβ) или негов вариант като мутеин на човешки IFN-β (hIFN-β), означен hlFNβεβΓίϊ, са полезни при диагностицирането, предпазването и лечението (локално или системно) на клинични състояния, които реагират на лечение с този полипептид. Такива клинични състояния включват например нарушения и заболявания на централната нервна система (CNS), на мозъка и/или гръбначния мозък, включително болестта на Alzheimer, болестта на Parkinson, Lewy телесна деменция, мултиплена склероза, епилепсия, церебрална атаксия, прогресивна супрануклеарна палсия, амиотрофична латерална склероза, нарушения във възбудимостта, страхови нарушения, натрапчиви компулсивни нарушения, нарушения в персоналността, нарушения свързани с дефицит на внимание, с дефицит на вниманието хиперактивни нарушения, синдром на Tourette, Tay Sachs, Nieman Pick и шизофрения; нервно увреждане от цереброваскуларни нарушения като удар в мозъка или гръбначния мозък, от CNS инфекции включително менингит и HIV, от тумори на мозъка и на гръбначния мозък и от прионно заболяване, автоимунни заболявания, включително придобит имунен дефицит, ревматоиден артрит, псориаза, болестта на Crohn, Sjogren’s синдром, амиотропична латерална склероза и лупус и ракове, включително рак на гърдата, на простатата, на пикочния мехур, на бъбреците и на дебелото черво. Приложението на IFN-β или на негови мутеини към хора и животни може да стане орално, интраперитонеално, мускулно, подкожно, венозно, в

• ·

носа или чрез белодробно предаване, според преценката на съответния лекуващ специалист.

Настоящето изобретение осигурава метод за увеличаване разтворимостта на интерферон-бета (IFN-β) или на негов биологично активен вариант във фармацевтичен състав в отсъствие на човешки серумен албумин. Методът включва получаване на състав с формулировка с нискайонна-сила, както е описано тук, така че pH на състава да се поддържа около pH 3.0 до около pH 5.0 и включване на IFN-β или на негов биологично активен вариант в състава. В едно изпълнение формулировката с нискайонна-сила включва глицин, аспарагинова киселина или натриев сукцинат като буфер в концентрация от около 1 мМ до около 30 мМ, за предпочитане около 2 мМ до около 5 мМ. Съставът може освен това да включва не-йонно тонифициращо средство в достатъчно количество за да придаде на състава изотоничност с телесните флуиди, както вече беше описано. В едно изпълнение, не-йонното тонифициращо средство е подбрано от група състояща се от трехалоза, захароза, манитол и всякаква комбинация от тях. Чрез поддържане на pH на този състав между около pH 3.0 и pH 5.0, с предпочитание pH 4.0, е възможно да се запази по-голямата част от IFN-β в неговото мономерно състояние. С това изобретението осигурява също така и метод за получаване на стабилизиран свободен от HSA фармацевтичен състав, включващ по-същество мономерен IFN-β.

Следващите примери се дават за илюстрация, а не за да ограничават изобретението.

Примери за изпълнение на изобретението

Настоящето изобретение бе постигнато чрез по-добро разбиране на свойствата на разтворимост и стабилност на IFN-βΙλ Предпочитани характеристики на свободни от HSA IFN-βΙ) формулировки са pH в граници от около pH 3.0 до около pH 5.0 и условия на много ниска-йонна сила.

Използването на условия на много ниска-йонна сила в границите на това pH води до по-високо съдържание на мономерен IFN-pb и по-ниско съдържание на агрегирани IFN-pb видове. Тези условия осигуряват разтворимост на IFN-pb и стабилност, която по-рано не е достигана без да се използва HSA във формулировката. Те също осигуряват формулировки съдържащи максимално съдържание на мономерен IFN-pb.

Използваният при тези експерименти IFN-pb е получен в Е. coli, по същество както е описано в няколкото първи етапа на пречистване, дадено в U.S. патенти с №№ 4 462 940 и/или 4 816 400. Това ще рече, че ©

трансформирани бактерии се използват за получаване на IFN-β, гостоприемниковите клетки се концентрират и клетъчните им стени се раздробяват за да се получи IFN-pb като насипен материал.

Така получения IFN-pb насипен материал съдържа 50 мМ натриев ацетат, 1 мМ EDTA, 0.1 % натриев додецилсулфат (SDS) при pH 5.5. За да се създаде изходното вещество за измерванията на разтворимост и стабилност, описано по-долу, SDS се отстранява от IFN-pb насипния материал чрез прекарване на материала през G-25 колона (Pharmacia) еквилибрирана с 1.5 мМ натриев хидроксид при > pH 11. След събиране на полученото от G-25 колоната, обем от 1 М глицин, pH 3, равен на приблизително 1/10 от събраното се прибавя при енергично бъркане за да се нагласи pH на събраното на ~ 3. Материалът се съхранява при 4° С или замразен за последващо изполване при измерванията за разтворимост и стабилност.

Пример 1: Определяне на разтворимостта на IFN-pb

Провеждат се първоначално експремиенти за установяване на разтворимостта на IFN-pb при широко разнообразие от условия на pH, буферен тип и йонна сила. Разтвор на IFN-pb (~0.8 мг/мл IFN-pb в 100 мМ глицин, pH 3.0) се диализира срещу буферите от таблица 1. Резултатите са показани на фигура 1. Тези резултати показват, че разтворимостта на IFN-pb ••34· зависи от pH и йонната сила. IFN-pb при pH 3.0 остава разтворим при всички концентрации на натриев хлорид до 200 мМ. При формулировки при pH 4.0,

IFN-pb става по-малко разтворим при достигане на концентрация на натриев хлорид 150 мМ. При формулировки с pH 5.0, IFN-pb става по-малко разтворим, когато формулировката съдържа само 100 мМ натриев хлорид. Взети заедно, тези данни показват, че IFN-pb е най-разтворим във формулировки при pH 3.0, по-малко разтворим във формулировки с pH 4.0 и най-малко разтворим при pH 5.0. Тези данни също показват, че увеличаването на йонната сила на формулировките (чрез увеличаване на концентрацията на натриев хлорид) също намалява разтворимостта на IFNрь.

Докато при горния експеримент е възможно да се определят условията, които са благоприятни за разтворимостта на IFN-pb, с него не се определя границата на разтворимост при дадените условия. Провежа се последващ експеримент за определяне на границите на разтворимост на IFNpb. За максимизиране на IFN-pb се използват формулировки с ниска йонна сила (т.е. 5 мМ буфер и отсъствие на соли като натриев хлорид). След диализа, IFN-pb се концентрира за да се определи границата на разтворимост в дадена формулировка. Резултатите от тези експерименти са показани на фигура 2. Формулировки при pH 3.0 и 4.0 са най-разтворими, показвайки разтворимост най-малко 16 мг/мл. Формулировката с pH 5 е разтворима до приблизително 8 мг/мл. Формулировки над pH 5.0 са разтворими само до приблизително 0.2 мг/мл. Тези резултати отново показват, че pH има мощен ефект върху разтворимостта на IFN-pb. Формулировки с ниска йонна сила при pH 3.0 и pH 4.0 са по-разтворими от тези с pH 5.0. Над pH 5.0, IFN-pb е по същество неразтворим във формулировки с ниска йонна сила.

Таблица 1: Формулировки за изследване разтворимостта на IFN-pb pH, буферен тип и концентрация на натриев хлорид

.:35.

буфер	pH	Натриев хлорид концентрация (мМ)
5 мМ глицин	рНЗ	0 мМ
5 мМ глицин	рНЗ	50 мМ
5 мМ глицин	рНЗ	100 мМ
5 мМ глицин	рНЗ	150 мМ
5 мМ цитрат	рН4	0 мМ
5 мМ цитрат	рН4	50 мМ
5 мМ цитрат	рН4	100 мМ
5 мМ цитрат	рН4	150 мМ
5 мМ ацетат	рН4	0 мМ
5 мМ ацетат	рН4	50 мМ
5 мМ ацетат	рН4	100 мМ
5 мМ ацетат	рН4	150 мМ
5 мМ формиат	рН4	0 мМ
5 мМ формиат	рН4	50 мМ
5 мМ формиат	рН4	100 мМ
5 мМ формиат	рН4	150 мМ
5 мМ ацетат	pH 5	0 мМ
5 мМ ацетат	рН5	50 мМ
5 мМ ацетат	pH 5	100 мМ
5 мМ ацетат	pH 5	150 мМ
5 мМ хистидин	pH 5	0 мМ
5 мМ хистидин	рН5	50 мМ
5 мМ хистидин	рН5	100 мМ
5 мМ хистидин	pH 5	150 мМ
5 мМ натриев сукцинат	pH 5	0 мМ
5 мМ натриев сукцинат	pH 5	50 мМ
5 мМ натриев сукцинат	pH 5	100 мМ

« · · · · · • · · • · · • · · • · · · · ·

буфер	pH	Натриев хлорид концентрация (мМ)
5 мМ натриев сукцинат	pH 5	150 мМ

Пример 2 - аналитични експерименти с ултрацентрофугиране

Докато експериментите за разтворимост могат да определят какво количество IFN-pb е в разтвора, необходими са други техники за определяне състоянието на агрегиране на протеина. Важно е да се определи дали даден протеин е мономерен в дадена формулировка и да се определи колко от протеина (ако има такъв) съществува в по-висока форма като димери, тримери и т.н. Аналитичното центрофугиране е една отнай-мощните техники за осветляване агрегатното състояние на протеини (виж Liu and Shire (1999), J. Pharm. Sci. 88: 1237- 1241). Тези експерименти се провеждат за определяне на мономерното съдържание в няколко IFN-βΙ) формулировки при използване на аналитично центрофугиране. Тези експремиенти с аналитично центрофугиране се провеждат като при всеки се използва различна формулировка на IFN-pb. Всеки експеримент съдържа една проста формулировка (5 мМ глицин, pH 3.0). Обаче, всека от тези прости формулировки варират леко в процента на мономера (фигура 3 - 89.8 %; фигура 6 - 94.2 %, фигура 9 - 86.3 %). Методът на изолирането и пречистване, използван за получаването на тези IFN-pb формулировки води до известно агрегиране на IFN-pb молекулата, което е предимно ковапентно по характер. Формулировка съдържаща 5мМ глицин, pH 3.0, за всеки от експериментите служи като базова линия за количеството на агрегат във формулировката в началото на всеки експеримент.

Първият експеримент изследва ефекта на pH върху степента на агрегиране на IFN-pb. Анализарат се формулировки при pH 3.0 (съдържащи само 5 мМ глицин за буфериране на разтвора), pH 4.0 (съдържащи само 5 мМ аспарагинова киселина за буфериране на разтвора) и pH 5.0 (съдържащи

само 5 мМ натриев сукцинат за буфериране на разтвора). Резултатите са показани на фигури 3, 4 и 5. Главният пик при тези профили отговаря на молекулно тегло от приблизително 20 kDa, което е много близко до молекулното тегло на IFN-pb (19.878 kDa). Главният пик е поради това IFNРЬ мономер. Видовете от по-висок порядък (димери, тримери и т.н.) отговарят на по-високи коефициенти на седиментиране. Тези резултати показват, че докато IFN-pb е главно мономерен при pH 3.0 и pH 4.0 (около 90 %), при pH 5.0 молекулата започва да агрегира във видове от по-висок порядък и е само 75 % мономерна. Тези резултати показват, че степента на агрегиране на IFN-pb е в зависимост от промените в pH и че IFN-pb мономер е предимно при ниски pH стойности като pH 3.0 и pH 4.0.

Вторият експеримент изследва ефекта на йонната сила върху състоянието на агрегиране на IFN-pb. Йонната сила на формулировката се увеличава във формулировки при pH 3.0 (буфериране с 5 мМ глицин) чрез прибавяне но 0, 50 и 150 мМ натриев хлорид. Резултатите са показани на фигури 6, 7 и 8. За формулировката, която не съдържа прибавен натриев хлорид (фитура 6), мономерната форма на IFN-pb представлява около 94 %

от общото количество IFN-pb (т.З. 94 % главен пик). Когато 50 мМ натриев хлорид се прибавят към формулировката, съдържанието на мономер спада до около 76 % (фигура 7) и при 150 мМ във формулировката, мономера спада на по-малко от 10 % (фигура 8). Тези резултати показват, че степента на агрегиране на IFN-pb е силно зависима от йонната сила и че IFN-pb мономер се влияе благоприятно от условия с ниска йонна сила.

Желана характеристика на инжекционната фармацевтична формулировка е тя да е изотонична с телесните течности. Йонни вещества (като натриев хлорид) и не-йонни вещества (като захарите захароза и трехалоза) могат да се използват за да се направи формулировката изотонична с телесните течности. В предишните аналитични експерименти с ултрацентрофугиране се изследват формулировки които са или • · · · · ·· 3ό · · ··· · · JO·» ··· · · · · · · •· · ····*· ·· ·· неизотонични (съдържащи само 5 мМ буфер) или съдържат натриев хлорид като йонен тонификатор. Третият експеримент изследва ефекта на не-йонни тонифициращи средства върху състоянието на агрегиране на IFN-pb. При този есперимент се приготвят три формулировки с pH 3.0 (буферирани с 5 мМ глицин). Едната съдържа само глицин като буфериращо средство, втората е тонифицирана с 9 % захароза и третата е тонифицирана с 9 % трехалоза. Аналитичните резултати от утрацентрофугирането са показани на фигури 9, 10 и 11. Съдържанието на мономер във формулировата само с буфериращото средство (фигура 9) е около 86 %. Когато се прибавят било захароза (фигура 10) или трехалоза (фигура 11) като тонифициращо средство, съдържанието на мономер е около 89 %. Тези резултати показват, че не-йоннои тонифициращи средства като захароза и трехалоза не предизвикват агрегиране на IFN-pb молекулата.

Пример 3 - Стабилност на лиофилизирани IFN-pb, свободни от HSA формулировки при повишени температури условия

Свободни от HSA формулировки на IFN-pb при pH 3.0 (5 мМ глицин като буфер) и pH 4.0 (5 мМ аспарагинова киселина като буфер), съдържащи или 9 % трехалоза (pH 3.0 и pH 4.0) или 9 % захароза (pH 4.0) се лиофилизират. Лиофилизираните формулировки след това се съхраняват при 40° Сив продължение на 8 седмици се измерва тяхната стабилност. Захароза и трехалоза са типични стабилизиращи средства, използвани при лиофилизирани формулировки. Ниво от 9 % от тези реактиви се използва така, че реконституираната формулировка е изотонична с телесните течности. За свеждане до минимум на йонната сила на формулировките и с това на количеството от агрегиран IFN-pb, количеството на буфера се поддържа на минимално ниво. Така, всички буфери са в концентрация 5 мМ.

Характерните условия на съхранение за протеинови фармацевтични продукти е често 5° С. Често обаче се използват повишени температурни условия при изследване на формулировки за да се повиши скоростта на

• · · · · · · · · ·· · ······ ·· ·· разграждане на конкретна формулировка, така че да се получат релевантни данни за стабилност за по-кратък период от време. При този експеримент се използват 40° С за да се увеличи разграждането на IFN-pb, свободни от HSA формулировки. Резултатите от измерванията на концентрацията и от анализите чрез обратнофазова ВЕТХ (RP-HPLC) са показани на фигури 12 и

13. Тези резултати показват, че дори при повишени температури, тези IFNРЬ формулировки не показват проследяеми изменения в период попродължителен от 8 седмици.

Пример 4 - Стабилност на лиофилизирани IFN-pb, свободни от HSA формулировки, съдържащи трехалоза при реални по време условия на съхранение

Въпреки че характерно условие за съхранение за протеинови препарати е 5° С, желателно е продуктите да са със стабилност при съхранение при стайна температура (25 до 30° С). При този експеримент се лиофилизират формулировки съдържащи 9 % трехалоза (5 мМ глицин, pH 3 или 5 мМ аспарагинова киселина, pH 4). Използва се 9 % трехалоза така че реконституираната формулировка е изотонична с телесните течности. Формулировките са съхраняват при 5° С и 30° С и се измерва стабилността им в продължение на 9 месеца. Резултатите от измерванията на концентрацията и от анализите чрез обратнофазова ВЕТХ (RP-HPLC) са показани на фигури 14 и 15. Резултатите показват, че дори при 30° С, тези формулировки не показват проследяеми промени в продължение на 9 месеца изследване.

Пример 5 - Стабилност на течни IFN^b, свободни от HSA формулировки при повишени температурни условия

Стабилността на свободни от HSA формулировки на IFN-Pb при pH 3.0 и pH 4.0 се изследват също в течно състояние. Съставите на формулировките са същите както е дадено в пример 3, (9 % трехалоза (pH 3.0 и pH 4.0) или 9 % захароза (pH 4.0)). Отново, за да се сведе до минимум ··· · · · · » * •· · ······ ·· ·· йонната сила на формулировката и с това да се минимизира количеството на агрегиран IFN-pb, количеството на буфера се поддържа на минимално ниво (5 мМ). Течните формулировки се съхраняват при 30° С и стабилността им се измерва в продължение на 9 седмици. Характерно условие за съхранение за течни протеинови препарати е 5° С. Поради това, съхранение при 30° С представлява повишени температурни условия, предвидени за да се повиши скоростта на разграждане на IFN-pb. Показаните на фигура 16 резултати (измервания на концентрацията) и фигура 17 (обратнофазов ВЕТХ анализ) не показва проследяеми промени във формулировките при тези условия, IFN-pb е стабилен в периода на изследването.

Пример 6 - Стабилност на течни IFN-pb, свободни от HSA формулировки при реални температурни условия

При този експеримент, течни формулировки, съдържащи 9 % трехалоза (5 мМ глицин, pH 3 или 5 мМ аспарагинова киселина, pH 4) или 9 % захароза (5 мМ глицин, pH 3 или 5 мМ аспарагинова киселина, pH 4) се изследват при реални температурни условия от 5° С. Формулировките се поставят във флакони и стабилностите им се измерват в продължение на 9 месеца. Резултатите от измерванията на концентрацията и обратнофазов ВЕТХ (RP-HPLC) анализ са показани на фигура 18 и съответно на фигура 19. Тези резултати показват, че IFN-pb е стабилен в тези формулировки през 9те месеца на изследването.

Пример 7 - Трехалоза се предпочитан пред захароза като не-йонно тонифициращо средство за IFN-pb формулировки

При този опит се приготвят формулировки съдържащи 9 % трехалоза (5 мМ глицин, pH 3 или 5 мМ аспарагинова киселина, pH 4) и 9 % захароза (5 мМ глицин, pH 3 или 5 мМ аспарагинова киселина, pH 4) и се пълнят във флакони като течност и флаконите със същата формулировка се лиофилизират. Измерват се стабилностите им при повишени температурни условия, които често дават указание за порядъка на стабилност на ··· ······ ·· « ······ · · ·· формулировки на даден протеин. Течни формулировки се съхраняват при 30° С в продължение на 9 седмици, а лиофилизирани формулировки се съхраняват при 40° С 8 седмици. Резултатите от измерванията на концентрацията са показани на фигура 20 (течни) и фигура 21 (лиофилизирани). Тези резултати показват, че формулировки с pH 3, съдържащи захароза, имат очевидно увеличаване на концентрацията. Това очевидно увеличение на концентрацията се дължи на хидролиза на захарозата при ниско pH за да се образуват редуциращи захари, което води до не-ензиматично потъмняване (т.е. маипардова реакция) на формулировката. Трехалозата е много по-устойчива спрямо хидролиза и поради това е предпочитана пред захароза при тези формулировка (виж O’Brien (1996) Science 61: 679 - 682).

Пример 8: Отстраняване на SDS и формулиране на IFN-pb при използване на гуанидин хидрохлоридно утаяване

Пречистен IFN-pb (1 л от 1.91 мг/мл в 0.4 % SDS, 50 мМ ацетатен буфер, pH 5.5) се съхранява при 5° С. През време на съхранението, част от наличния SDS се утаява. 250 мл от този материал (477.5 мг) се смесва с 229 г гуанидин хидрохлорид (6 М, общ обем 400 мл) и се бърка при стайна температура 15 минути като се използва магнитна бъркалка. След това 6 М гуанидин хидрохлорид/протеиновия разтвор се филтрува с Sartobran ® Capsule (0.45 мкм размер на порите) за да се отстрани утаения SDS. Концентрацията на протеина е, съгласно определението чрез UV при 280 нм, 1.02 мг/мл. Добивът от протеин е 406 мг или 85 %.

400 мл от гуанидин-хидрохлорид обработения материал се концентрира като се използва Millipore® Labscale® диафилтруваща система (Millipore, Inc.) с две Pellicon® XL Biomax® 0.1 см² 10 kD полисулфонови мембрани (Millipore, Inc.). Обемът след етапа на концентриране е 37 мл с концентрация на протеина 10.3 мг/мл с добив след концентрирането 381 мг или 93 %.

• · · · · · · # a · · : ; ·, • · · · · ···· •· · ······ ·· ··

При използване на пипета за пренасяне, 10 мл (103 мг) от концентрирания гуанидин хидрохлорид/протеинов разтвор постепенно се прибавя към 590 мл 5 мМ глицин, pH 3.2 разтвор. Буферът се бърка енергично с магнитна бъркалка; протеиновият разтвор се прибавя директно към вортрекса. Това 60 х разреждане на 6 М гуанидин хидрохлорид/протеинов разтвор дава 0.1 М гуанидин хидрохлорид/протеинов разтвор с 0.17 мг/мл. Тези 600 мл се пренасят в 500 мл скалово диафилтруващо устройство, снабдено с две Pellicon® II 10 kD,

Λ

0.1 м полисулфонови мембрани. Този разтвор първоначално се концентрира до ~ 400 мл до протеинова концентрация 0.23 мг/мл и след това се диафилтрува срещу 9 обемни промени (3.6 л) 5 мМ глицин при pH 3.2. Крайното диафилтруване (402 мл) се измерва чрез UV при 280 нм за крайна концентрация на протеина 0.23 мг/мл с 92.46 мг или 90 % добив за етапа на диафилтруване и общ добив 72 % разтворим протеин за процеса на пречистване.

Пример 9 -Стабилност на течни IFN-pb, свободни от HSA формулировки, съдържащи манитол като тонифициращо средство При този експеримент се изследват течни формулировки съдържащи 5 мМ аспарагинова киселина, 5 % манитол при реални условия на съхранение от 5° С. Три отделни формулировки (означени формулировка А, формулировка В и формулировка С във фигурите) се получават от една единствена проба свободна от HSA IFN-pb формулировка и запълнена във флакони. Флаконите се съхраняват при 5° С и стабилността на формулировките се измерва в продължение на 6 месеца. Резултатите от измерванията на концентрацията и от обратнофазовите ВЕТХ (RP-HPLC) анализи са показани на фигури 22 и съответно 23. Резултатите показват, че няма откриваеми промени в тези IFN-pb формулировки при изследването в продължение на 6 месеца.

Всички публикации и патентни описания, споменати в изложението са укузателни за нивото за специалистите от областта, за които настоящето изобретение претендира. Всички публикации и патентни описания са включени тук за справка в своята цялост. Подзаглавията в описанието са дадени единствено за по-голяма прегледност на документа и няма за цел да го ограничават по какъвто и да е начин.

Въпреки че изобретението е описано в известни детайли чрез различни илюстрации и примери с цел за яснота и по-добро разбиране, то е ясно, че известни промени и модификации могат да бъдат направени в обхвата му.

Claims

Патентни претенции

1.

Стабилизиран свободен от HSA фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва практически мономерен интерферонбета (IFN-β) или негов биологично активен вариант, солюбилизиран във формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва буфер в количество достатъчно за поддържане на pH на този състав в плюс минус 0.5 единици на специфизираното pH, при което специфизираното pH е около 3.0 до около 5.0, и тази формулировка има йонна сила, която не е по-голяма от около 60 мМ.
2. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че буферът присъства в концентрация от около 1 мМ до около 30 мМ.
3. Състав съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че буферът присъства в концентрация от около 1 мМ до около 10 мМ.
4. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че буферът присъства в концентрация от около 2 мМ до около 7 мМ.
5. Състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че буферът присъства в концентрация от около 2 мМ до около 5 мМ.
6. Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че буферът присъства в концентрация от около 5 мМ.
7. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 3.0 и буферът е глицин.
8. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 4.0 и буферът е аспарагинова киселина.
9. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 5.0 и буферът е натриев сукцинат.
10.

·♦···« 4 4 . _»« ·· 44 • · · · · · · Д ··

4 4 4 · · •ф' · · ·«· · 4 4444· ··· 4 44444 «4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 44

Състав съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 3.0 и буферът е глицин.
11. Състав съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 4.0 и буферът е аспарагинова киселина.
12. Състав съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 5.0 и буферът е натриев сукцинат.
13. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съставът е в течна или в изсушена форма, при което изсушената форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
14. 'Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
15. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съставът съдържа също количество от нейонно тонифициращо средство, достатъчно за да придаде на състава изотоничност, при което това нейонно тонифициращо средство е трехалоза.
16. Състав съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че трехалозата присъства в концентрация от около 9 тегловни % за обем.
17. Състав съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че съставът е е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
18. Състав съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
19.

• · · • · · • · · • · 4

4 · · · • · · ··

Състав съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че съставът съдържа също количество от нейонно тонифициращо средство, достатъчно за да придаде на състава изотоничност, при което това нейонно тонифициращо средство е трехалоза.
20. Състав съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че трехалозата присъства в концентрация от около 9 тегловни % за обем.
21. Състав съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
22. Състав съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
23. Състав съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че съдържа освен това количество от нейонно тонифициращо средство, достатъчно за да направи състава изотоничен, при което това нейонно тонифициращо средство е трехалоза.
24. Състав съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че трехалозата присъства в концентрация от около 9 тегловни % за обем.
25. Състав съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
26. Състав съгласно претенция 23, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
27.

• · · · ···· •· · ······ ·· ··

Състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че съдържа освен това количество от нейонно тонифициращо средство, достатъчно за да направи състава изотоничен, при което това нейонно тонифициращо средство е трехалоза.
28. Състав съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че трехалозата присъства в концентрация от около 9 тегловни % за обем.
29. Състав съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
30. Състав съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
31. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че IFN-β е полипептида с аминокиселинна секвентност на зрял естествен IFN-β или негов биологично активен вариант.
32. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че IFN-β е получен рекомбинантно.
33. Състав съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че IFN-β е гликозилиран или негликозилиран.
34. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че IFN-β е негликозилиран човешки IFN-β (hIFN-β) или негов биологично активен мутеин.
35. Състав съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че мутеинът е hIFN^_ser-i7.
36. Стабилизиран свободен от HSA фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва практически мономерен интерферонбета (IFN-β) или негов биологично активен вариант, солюбилизиран във ·· ·<♦· • · · • · · • · · · · ·· • · · • · · · • · · · формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва буфер подбран от група състояща се от глицин, аспарагинова концентрация от 3.0 до около 5.0, от около 60 мМ.

около и тази киселина или натриев сукцинат, присъстващ в 1 мМ до около 10 мМ, този състав има pH от около формулировка има йонна сила която не е по-голяма
37.

Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че IFN-β е рекомбинантен човешки IFN-β (rhIFN-β) или негов биологично активен мутеин.
38. Състав съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че rhIFN-β или неговия биологично активен мутеин е негликозилиран.
39. Състав съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че мутеинът е hIFN^_ser-i7-
40. Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че rhIFN-β присъства в концентрация от около 0.01 мг/мл до около 20.0 мг/мл.
41.

Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че буферът е глицин и глицинът присъства в концентрация от около 5 мМ и съставът има pH около 3.0.
42. Състав съгласно претенция 41, характеризиращ се с това, че включва още около 9 % тегло/обем трехалоза.
43. Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че буферът е аспарагинова киселина и аспарагиновата киселина присъства в концентрация от около 5 мМ и съставът има pH около 4.0.
44. Състав съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че включва още около 9 % тегло/обем трехалоза.
45. Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че буферът е натриев сукцинат и натиевият сукцинат присъства в концентрация от около 5 мМ и съставът има pH около 5.0.
46.

·· ·«·· · · 49·* ·♦·♦ • · · ♦· ·♦ · * • · · ·· ··« • · · · · ···«· ··· · · · · ··

99 · ··· ··· ····

Състав съгласно претенция 45, характеризиращ се с това, че включва още около 9 % тегло/обем трехалоза.
47. Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
48. Състав съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
49. 'Състав съгласно претенция 41, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
50. Състав съгласно претенция 41, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
51. Състав съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
52. Състав съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
53. Състав съгласно претенция 45, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е

50.x ....

• ♦9

9 99

9 9 9· • 9999

999999

9 9 99

9 99

9 99

99 99 • · подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
54. Състав съгласно претенция 45, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
55. Състав съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
56. 'Състав съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
57. Състав съгласно претенция 44, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
58. Състав съгласно претенция 44, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
59. Състав съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
60. Състав съгласно претенция 46, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
61.

Стабилизиран свободен от HSA фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва практически мономерен човешки интерферон-бета (IFN-β) или негов биологично активен мутеин, солюбилизиран във формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва глицин като буфер, при което буферът присъства в концентрация от около 2 мМ до около 5 мМ, този състав има pH от около 3.0 до около 4.0 и тази формулировка има йонна сила която не е по-голяма от около 40 мМ.
62. Състав съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че rhIFN-β или неговия биологично активен мутеин е негликозилиран.
63. Състав съгласно претенция 62, характеризиращ се с това, че мутеинът е hIFN-p_scr_] ₇.
64. Състав съгласно претенция 63, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 5 мМ, pH е около 3.0 и йонната сила не е по-голяма от 20 мМ.
65. Състав съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
66. Състав съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
67. Състав съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че включва още около 9 % тегло/обем трехалоза.
68. Стабилизиран свободен от HSA фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва практически мономерен човешки »· ··♦· интерферон-бета (IFN-β) или негов биологично активен мутеин, солюбилизиран във формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва аспарагинова киселина като буфер, при което буферът присъства в концентрация от около 2 мМ до около 5 мМ, този състав има pH от около 3.5 до около 4.5, и тази формулировка има йонна сила която не е по-голяма от около 40 мМ.
69. Състав съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че rhIFN-β или неговия биологично активен мутеин е негликозилиран.
70. Състав съгласно претенция 69, характеризиращ се с това, че мутеинът е 1ιΙΡΝ-β_5εΓ-ΐ7·
71. Състав съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 5 мМ, pH е около 4.0 и йонната сила не е по-голяма от 20 мМ.
72. Състав съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
73. Състав съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
74. Състав съгласно претенция 68, характеризиращ се с това, че включва още около 9 % тегло/обем трехалоза.
75. Стабилизиран свободен от HSA фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва практически мономерен човешки интерферон-бета (IFN-β) или негов биологично активен мутеин, солюбилизиран във формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва натриев сукцинат като буфер, при което буферът присъства в концентрация от около

2 мМ до около 5 мМ, този състав има pH от около 4.5 до около 5.0 и тази формулировка има йонна сила която не е по-голяма от около 40 мМ.
76. Състав съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че rhIFN-β или неговия биологично активен мутеин е негликозилиран.
77. Състав съгласно претенция 76, характеризиращ се с това, че мутеинът е hIFN-p_ser-i7·
78. Състав съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 5 мМ, pH е около 5.0 и йонната сила не е по-голяма от 20 мМ.
79. Състав съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че съставът е течност или изсушена форма, при което тази изсушена форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, изсушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
80. Състав съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
81. Състав съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че включва още около 9 % тегло/обем трехалоза.
82. Метод за увеличаване разтворимостта на интерферон-бета (IFN-β) или негов биологично активен вариант във фармацевтичен състав, свободен от човешки серумен албумин, характеризиращ се с това, че методът включва получаване на този състав с формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва буфер в количество достатъчно за да поддържа pH на състава плюс или минус 0.5 единици от специфизираното pH, специфизираното pH е около 3.0 до около 5.0, формулировката има йонна сила не по-голяма от около 60 мМ и включване на IFN-β или на негов биологично активен вариант в състава.
83.

54··.···;

• · · • · · · • ·· «4 ♦·«· • « « • · · « · · «· · t ·

Метод съгласно претенция 82, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 1 мМ до около 30 мМ.
84. Метод съгласно претенция 83, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 2 мМ до около 5 мМ.
85. Метод съгласно претенция 84, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 3.0 и буферът е глицин.
86. Метод съгласно претенция 84, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 4.0 и буферът е аспарагинова киселина.
87. Метод съгласно претенция 84, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 5.0 и буферът е натриев сукцинат.
88. 'Метод съгласно претенция 82, характеризиращ се с това, че съставът включва също не-йонно тонифициращо средство в количество достатъчно за да придаде на състава изотоничност и това нейонно тонифициращо средство е трехалоза.
89. Метод съгласно претенция 82, характеризиращ се с това, че включва също етап на получаване на изсушена форма на състава, при което изсушената форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, сушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
90. Метод съгласно претенция 82, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
91. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че е получен съгласно метода от претенция 82.
92. Метод за получаване на свободен от HSA фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва практически мономерен интерферон-бета (IFN-β), който метод включва получаване на състав с формулировка с ниска йонна сила, при което тази формулировка с ниска йонна сила е разтвор, който включва буфер в количество, което е достатъчно за поддържане на pH на състава от плюс или минус 0.5 единици от специфизираното pH, специфизираното pH е около 3.0 до около 5.0, тази формулировка има йонна сила която не е по-голяма от около 60 мМ и включване на IFN-β или негов биологично активен вариант в състава.
93. Метод съгласно претенция 92, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 1 мМ до около 30 мМ.
94. Метод съгласно претенция 93, характеризиращ се с това, че буферат присъства в концентрация от около 2 мМ до около 5 мМ.
95. Метод съгласно претенция 94, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 3.0 и буферът е глицин.
96. Метод съгласно претенция 94, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 4.0 и буферът е аспарагинова киселина.
97. Метод съгласно претенция 94, характеризиращ се с това, че специфизираното pH е около 5.0 и буферът е натриев сукцинат.
98. Метод съгласно претенция 92, характеризиращ се с това, че съставът включва също не-йонно тонифициращо средство в количество достатъчно за да придаде на състава изотоничност, и това нейонно тонифициращо средство е трехалоза.
99. Метод съгласно претенция 92, характеризиращ се с това, че включва също етап на получаване на изсушена форма на състава, при което изсушената форма е подбрана от група състояща се от лиофилизирана форма, сушена на въздуха форма и изсушена чрез разпръскване форма.
100. Метод съгласно претенция 92, характеризиращ се с това, че съставът е воден или неводен разтвор, водна или неводна суспензия или е под формата на сух прах, който е подходящ за отдаване на пациент чрез белодробно инхалиране.
101. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че е получен съгласно метода от претенция 92.
102.

Формулировка за диагностициране, предпазване или лечение на заболявания, които реагират на лечение с интерферон- бета (IFN

β), характерицираща се с това, че включва фармацевтичния състав съгласно претенции 1, 36, 61, 68 или 75.