HU228581B1

HU228581B1 - Hsa-free formulations of interferon-beta

Info

Publication number: HU228581B1
Application number: HU0303732A
Authority: HU
Inventors: Susan Babuka; Bao-Lu Chen; Minna Choe; Maninder Hora; Bret A Shirley; Melanie Tellers
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2001-04-09
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2013-04-29
Also published as: CN1313148C; PL213297B1; EP2283897A3; JP2008285499A; EP2283896B1; AU2002241769B2; US7892531B2; HUP0303732A2; EP2283896A3; IL157963A; EP1381432B9; ES2524322T3; EP2283896A2; PT1381432E; JP5701323B2; EP2283897A2; US20050142110A1; JP2015044882A; CY1113609T1; WO2002080976A3

Description

Ssága nátrium-ki orid oldatokban

A jelen találmány tárgyát gyógyászati készítményt képezik, pontosabban az interferon-β stabilizált .kiszerelési formái, amik mentesek a humán szérum-albumintől, mint hozzáadott gyógyászati töltőanyagtól..

Az interferonok egy olyan glikoprotein családba tartoznak, amiknek a sejtekből való szekrécióját számos különböző szignál indukálja, beleértve a vírusokat, kétszálú RNS-eket, más polinukleoiidokai, antigéneket és mitogéneket. Az interferonoknak több biológiai aktivitásuk, van, beleértve az antivirális, antiproliferatív és immunmodulátor aktivitásokat. A humán interferonoknak legalább három különböző típusát, azaz az α, β és y interferonokat különböztették meg különböző faktorok figyelembe vételével, beleértve az antivirális és antiproííferatív aktivitásokat is.

Az interferon-β (lFN-β) az első azonosított hatékony kezelés a szklerózis multiplexben. (MS) szenvedők számára, és demonstrálták, hogy csökkenti a támadások számát azoknál a betegeknél, akik visszaeső és időnként átmenetileg csökkenő S2k1.erőzis multiplexben, illetve szekunder progresszív szklerózis multiplexben szenvednek. Az interferon-β készítmények jól használhatók a hepatitisz B és hepatitisz C fertőzések kezelésében..

111

ALMI φφφ φ φ χ· φ. φ φ

Φ φ χ· φ φ Φ

Φ *·φ· φ V φφ φ »»

Ugyanúgy, mint az összes fehérje-alapú gyógyszernél, az φ»··* »1 egyik fő akadály, amit. le kell győzni az interferon-β .mint terápiás ágens használatakor, a gyógyászati alkalmazhatóság elvesztése, ami a gyógyászati készítményekben tapasztalható instabilitásból származhat. A fizikai instabilitások, amik a polipepíid aktivitást és hatékonyságot fenyegetik a gyógyászati készítményekben,, lehetnek. a denaturálás és az oldható és oldhatatlan aggregátumok képződése, mig a kémiai instabilitások közé tartozik a hidrolízis, imidképzödés, oxidáció, raeemizáeió és dezamidálás, Ezek közül a változások közöl néhányról ismert, hogy a számunkra érdekes fehérje gyógyászati aktivitásának elvesztéséhez vagy csökkenéséhez vezet. Más esetekben ezeknek a változásoknak a pontos hatásai nem ismertek, de a keletkező bomlástermékeket győgyászatílag elfogadhatatlannak tartják, mivel megvan a lehetősége a nern-kivánt mellékhatásoknak.

egy olyan terület marad, ahol a pröhálkozás-hibázás fő szerepet játszik (Wang: International Journal of Pharmaceuíics 185, 129188 (1999); Wang és Hanson: J. Pharm. Sci. Technoi. 42, S3--S26 (1988)]. A töltőanyagok, amiket a polipeptid gyógyászati készítményekhez adnak, hogy fokozzák stabilitásukat, közé tartoznak a pufferek, a cukrok, a felületaktív anyagok, az aminosavak, a polietilénglikolok és a polimerek, de ezeknek a kémiai adalékanyagoknak a stabilizáló hatása változó, a. fehérjétől függően.

A S Í.Ü it interferon-β gyógyászati készítmények előállításának egyik fő akadálya az ínferferon-p molekula rossz oldhar * » χ « φ ♦ » h «· ♦ » · ♦ a -* *444 * * * ♦ >

a♦»« « « * x a ♦ a lósága. A jelenleg alkalmazott kiszerelési formákban HSA~t használnak az interferon-β oldhatóságát növelő ágensként. Azonban a HSA használatának vannak hátrányai. A HSA egy humán vérkészítmény, és ezért emberekből kell előállítani. Bár különböző lépéseket tesznek, hogy csökkentsék a kockázatot, a humán vérkészítményeknek, azaz például· a HSA-nak, megvan a veszélyük, hogy humán, vírusokat, azaz például HIV-t vagy HCV-t hordoznak. A HSA-nak a kiszerelési formába való bevitele zavarja azt a lehetőséget, hogy pontosan megtartsa az interferon-β stabilitását a kiszerelési formában. Ez azért van, mert mind a HSA, mind az interferon-β fehérje, és a HSA zavar néhány esszét, ami vek az interferon-β stabilitását lehet vizsgálni.

Emellett, az interferon-β egy olyan fehérje, ami aggregátumképződést mutat, ha .gyógyászati készitményekban alkalmazzák, ezért ennek a fehérjének a. biológiailag aktív monomer állapotában levő mennyisége csökken, ezeknek a készítményeknek a tárolása során. Egy poiipeptid, azaz például az interferon-β aggregátum-képződése egy gyógyászati készítmény tárolása során károsan érintheti a szóban forgó poiipeptid biológiai aktivitását, ami a gyógyászati készítmény terápiás hatékonyságának elvesztését eredményezheti Emellett az aggregátum-képződés más problémákat is okozhat, azaz például a csővezetékek, membránok vagy pumpák eldugulását, ha az interferon-β gyógyászati készítményt egy infúziós rendszerrel adjuk be. Emellett, egy fehérje aggregálődott formáját tartalmazó- gyógyászati készítmény ♦ ♦ ♦ * * * «XX ♦ « X injekciózásának megvan a veszélye, hogy az· aggregálödott fehéije ellen immunogén reakciót generál.

Ezért szükség van további olyan interferon·· 0 gyógyászati készítményekre, amik fiziológiásán kompatíbilis stabílizálőszereket tartalmaznak, amik javítják a. szóban forgó fehérje oldhatóságát, és a fehérjét az aggregátum képződésével szemben stabilizálják, ezzel fokozva gyógyászati használhatóságát.

A jelen találmány tárgyát az interferon-0-t terápiásán hatásos komponensként tartalmazó készítmények, és ezek előállítási módszerei képezik.. A készítmények humán szérum-albummt (HSA), mint gyógyászati töltőanyagot nem tartalmazó stabilizált gyógyászati készítmények, ami lényegében monomer interferonβ-t tartalmaznak., alacsony íonerösségű kiszerelési formában. Az alacsony ionerősség készítmény egy oldat, ami tartalmaz egy puffért, olyan mennyiségben ami elég ahhoz, hogy a készítményt egy specifikált pH-érfcéken tartsa (plusz-mínusz 0,5 egységé a szóban forgó pH érték körülbelül 3,0 és körülbelül 5,0 között van, és aminek ionerőssége nem nagyobb körülbelül 60 m.M-náh Egy nem-ionos, tonicítást biztosító ágenst is beteszünk a gyógyászati készítményekbe, hogy a készítményt izotöniássá tegyük, és a szóban, forgó, tonicítást biztosító ágens egy szénhidrát. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá as interferon-β gyógyászati készítményben való oldhatóságának növelésére, valamint a monomer interferon-β ilyen készítményekben való mennyiségének növelésére szolgáló módszerek, humán szérum-aibumín hasza nélkül.

♦♦ ♦ » 9 9 *' * » * ν ν * ♦♦ fc * · ♦ * * * *

Ψ · «« » Λ «* « er χ

Az alábban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1, ábra az interferon-p~lb oldhatóságát mutatja nátrium-klorid oldatban.

A 2. ábra az interferon-p-lb oldhatóságát mutatja alacsony ionerösségü készítményekben,

Á 3, ábra a pH^:;::3,0 hatását mutatja az interferon-β 1b a.ggregáciős állapotára.

A 4, ábra a pH~4,0 hatását mutatja az interferon-β-1b aggregációs állapotára.

Áz 5. ábra a pH-5,0 hatását mutatja az interíeron-p-lb aggregációs állapotára.

A 6. ábra az ionerösség (0 mmol/1 nátrium-klorid) hatását

A 7. ábra az ionerősség (50 mmol/1 nátrium-klorid) hatását mutatja az interferon-β- lb aggregáciös állapotára.,

A 8, ábra az ionerősség (150 mmol/1 nátrium-klorid) hatását mutatja az ínterteron-β-1 b aggregáciös állapotára.

A 9. ábra az .interferon-β- lb aggregáciös állapotát mutatja. pH-3,0 értékű készítményben, ami csak 5 mmol/1 glicin pufíérelő ágenst, tartalmaz.

A 10. ábra egy nem-ionos, tonicítást biztosító ágens (9% szacharóz) hatását mutatja az interferon-β-Ι b aggregáciös állapotára, a 9. ábrán .ismertetett készítményben.

A 11, ábra egy nem-ionos, tonícitást biztosító ágens (9% trebalóz) hatását mutatja az ínterferon-β·· lb aggregáciös állapotára, a 9. ábrán ismertetett készítményben.

t X Φ * » « «

Φ » > 9 4 9 * * « φ φφ « * » Φ Φ * * *

Φ Φφ ΦΦ Φ* Μ*4

Α 12. ábra. a kiindulási interferon-β- lb koncentráció százalékát mutatja liofilezett készítményekben, amik 9% vagy 9% szacharózt tartalmaznak, nyolchetes, 40 °C-on is után. A koncentrációt ultraibolya elnyelés alapjí rozsuk meg.

A 13. ábra az interferon-p-lb fő csúcsának százalékát mutatja liofilezett készítményekben, amik 9% trehalőzt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, nyolchetes, 40 °C-on végzett tárolás után. A fő csúcs százalékát RP-HPLC elemzés alapján határozzuk meg.

A 1.4. ábra a kiindulási íníeríeron-p-lb koncentráció százalékát mutatja liofilezett készítményekben, amik 9% trehalőzt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, kilenchönapos, 5 °C~on vagy 30 ^eC--on végzett tárolás után. A koncentrációt ultraibolya spektroszkópia alapján ha tározzuk meg.

A 1.5. ábra az interferon-p-lh fő csúcsának százalékát mutatja liofilezett készítményekben, amik 9% trehalőzt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, kilenchönapos, 5 °C-on vagy 30 °C-on végzett tárolás után. A fő csúcs koncentrációját RP-HPLC elemzés alapján határozzuk meg.

A 16. ábra a kiindulási interferon--β- ib koncentráció százalékát mutatja liofilezett készítményekben, amik 9% trehalőzt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, kllenchetes, 30 °C-on végzett lás után. A koncentrációt ultraibolya, elnyelés alapján h.a.tác meg.

χ χ X χ * ·χ χ * « Φ» 9 4 χ χ

X λ χ χ * χ «χχχ χ χ Χχ ♦ * XX χ X XX X X X κ ♦ XX Χν χΧ χ*«

Α 17. ábra az interferon-β- lb fő csúcsának százf mutatja folyékony készítményekben, amik 9% trehalózt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, nyolchetes, 30 °C-on végzett tárolás után. A fő csúcs százalékát RP-HPLC elemzés alapién határozzuk meg.

A 18. ábra a kiindulási interferon-β-1 b koncentráció százalékát mutatja folyékony készítményekben, amik 9% trehalózt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, ampullában való kilenchónapos, 5 °C~on végzett, tárolás után. A koncentrációt ultraibolya spektroszkópia alapján határozzuk meg.

A. 19. ábra az inferferon-0-lb fő csúcs százalékát mutatja folyékony készítményekben, amik' 9% trehalózt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, ampullában való kilenchőnapos, S ®C-on végzett tárolás után.. A koncentrációt RP-HPLC elemzés alapján határozzuk meg.

A 20. ábra a kiindulási interferon-0-lb· koncentráció százalékát mutatja folyékony készítményekben, amik 9% trehalózt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, Idlenchetes, 30 °C~on végzett tárolás után. A koncentrációt ultraibolya spektroszkópia alapján határozzuk meg.

A 21. ábra a kiindulási interferon-β-lb koncentráció százalékát mutatja ííoíílezett készítményekben, amik 9% trehalózt vagy 9% szacharózt tartalmaznak, nyolchetes, 40 ^öC-on végzett tárolás után. A koncentrációt ultraibolya, spektroszkópia alapján határozzuk meg.

χ V. JÍ χ<«« ** * * φ W · « Φ # « λ « Φ k Φ ΦΦλ

Φφ^₄ X φ « ν » ♦ « φ ΦΦ φ« χ* >*φ

Λ 22, ábra. a kiindulási interferon - β- lb koncentráció száza lékát mutatja, folyékony készitményekben, amik 5% mannitot tartalmaznak, hathónapos, 5 ’C-on végzett tárolás után. A kon centrációt ultraibolya spektroszkópia alapján határozzuk meg.

A 23. ábra az interferon-β--lb fő csúcsának százalékát mutatja folyékony készítményekben, amik 5% mannitot tartalmaznak, hathónapos, 5 °C-on végzett tárolás után. A koncentrációt RP-HFbC alapján határozzuk meg.

A jelen találmány táigyát stabilizált gyógyászati készítmények képezik, amik interferon-β-ί (IF'N-β) tartalmaznak, valamint a jelen találmány tárgyát képezik ezek előállítási módszerei. Ezeket a készítményeket humán szérum-albumin nélkül állítjuk elő, ezért nem. tartalmazzák ezt a gyógyászati töltőanyagot. Az ilyen készítményeket a továbbiakban „HSA-mentes” interferon-β gyógyászati készítményeknek nevezzük. A készítmények lényegében monomer interferon -β-t tartalmaznak, amik egy alacsony .ionerősségű készítményben vannak szolubibzalva. Az „alacsony ionerősségü* készítmény alatt egy olyan oldatot értünk, ami puffért. tartalmaz, ahhoz elegendő mennyiségben, hogy a gyógyászati készítmény pH-ját egy meghatározott pH-η tartsa., plusz-mínusz 0,5 egységen belül, és aminek íonerőssége nem nagyobb, mint körülbelül 60 mmol/1. Az „íonerősség” szakkifejezés alatt a standard kémiai definíciót egy oldatra alkalmazva értjük, .ahol egy oldat ionerőssége egyenlő 1/2 XcízA, amely képletben c jelentése koncentráció, z jelentése töltés. A puffer az alacsony ionerősségü készítményben körülbelül I mmol/1. és körülbelül 30 mmol/1

S χ« 444« 4 S χ < >4 4*

X χ 4 * 4*4* «»#* 4 4 4 4 x « 4

4 4 *φ «4 4*X koncentrációban, előnyösebb körülbelül 2 mmól/l és körülbelül 25 mmol/1 koncentrációban, előnyösebben körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 20 mmol/1 koncentrációban, még előnyösebben körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 10 mmol/1 koncentrációban, még ennél is előnyösebben körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 5 mmól/l koncentrációban van jelen. Tehát néhány megvalósítási mód szerint az alacsony ionerösségü készítmény körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 10 mmol/1 közötti koncentrációban, körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 7 mmol/1 közötti koncentrációban, körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 5 mmol/1 koncentrációban, körülbelül 2 mmol/1 koncentrációban, körülbelül 3 mmol/1 koncentrációban, körülbelül 4 mmol/1 koncentrációban, vagy körülbelül 5 mmol/1 koncentrációban tartalmaz puffért. Az alacsony ionerősségu készítményekben használható, megfelelő pufferek közé, amikben az interferon-p-t szolubilizáljuk, tartozik a glicin, az aszparaginsav, a nátriura-szukcinát, a cl trát, a formát, az acetát, a glutaminsav, a hísztidin, az ímidazol és a foszfát,, előnyösen a glicin, az aszparaginsav és a nátrium-szukcinát, előnyösebben a glicin és az aszparaginsav.

Az alacsony ionerősségű készítménynek olyan az íonerőssége, ami nem nagyobb körülbelül 60 mmol/l-nél, előnyösebben nem nagyobb körülbelül 40 mmol/l-nél, még ennél is előnyösebben nem nagyobb körülbelül 20 mmol/l-nél. Néhány megvalósítási mód szerint a készítmény ionerősségét kizárólag a puffer koncentrációjával. határozzuk meg. és így a készítmény nem tartalmaz további ionos anyagokat, azaz például nátrium-kloridot, < ' *ί V» ♦ β 'ν> s kálium-kioridot, magnézíum-kloridot, ammóniumsókat és hasonlókat, amik hozzájárulnak ion erősségéhez.

Egy olyan alacsony ionerősségű készítmény használata, ami egy olyan oldat, ami egy puffért körülbelül 1 mmol/1 és körülbelül 30 mmol/1, előnyösen körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 5 mmol/1 közötti koncentrációban, tartalmaz, biztosítja stabilizált interferon-β· gyógyászati' készítmények előállítását, amiknek a pH-ja. körülbelül 3,0 és körülbelül 5,0 között van, előnyösen körülbelül 3,0 és körülbelül 4,5 között van, előnyösebben, körülbelül 3,0 és körülbelül 4,0 között van, ennél előnyösebben körülbelül 3,5 és körülbelül 4,0 között van, legelőnyösebben körülbelül 4,0, a hasmáit pufféitól függően. Azaz, ha a puffer glicin, akkor a készítmény pH-ja körülbelül 3,0 és körülbelül 3,5 között van, előnyösen körülbelül 3,0. Ha a. puffer aszparaginsav, akkor a készítmény pH-ja körülbelül 3,5 és körülbelül 4,5 között van, előnyösen körülbelül 4,0. Ha a puffer nátrium-szukeinat, akkor a készítmény pH-ja körülbelül 4,5 és körülbelül 5,0 között van, előnyösen körülbelül 5,0.

Ha a jelen találmány szerinti interferon-β· gyógyászati készítmények pH-jáf körülbelül 3,0 és körülbelül 5,0 között tartjuk, akkor lehetséges, hogy az interferon-β oldhatóságát ezekben a készítményekben a fölé a szint fölé növeljük, ami normális körülmények között lehetséges a. humán szémm-albumin távollétében. Emellett, ha az interferon-β-t egy itt ismertetett alacsony ionerősségű készítménybe tesszük, akkor olyan gyógyászati készítményeket állíthatunk elő, amik lényegében monomer interfeΗ fc* rori-β-Ι: tartalmaznak. A „lényegében monomer'⁵ szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a készítményben levő interferon-β többsége (tömeg alapján) monomer formában van, és nem aggregálődott tormában van. Az „aggregatt szakkhejezes azt ért fizikai kölcsönhatás van a poiipeptid molekulák között, ami mulümerek (dimerek, trimerek, stb.) képződését eredményezi, amik. vagy oldatban maradnak, vagy kicsapódhatnak az oldatból. Az interferon-β poiipeptid monomer formája oldható marad, és így azt mondjuk, hogy „szolubílízált” a jelen találmány .szerinti alacsony ionerősségü készítményben vagy gyógyászati' készítményekben. Áz interferonénak az a százaléka (tömeg alapján), ami monomer formában van a jelen találmány szerinti HSAmentes készítményekben 80%, vagy több. Tehát a jelen találmány tárgyát olyan HSA-mentes, interferon-β gyógyászati készítmények képezik, amik legalább 80%-ba.n az interferon-β monomer formáját tartalmazzák (az aggregálődott formával szemben), előnyösen legalább körülbelül 85%-ban, előnyösebben legalább körülbelül 90%-ban, még előnyösebben legalább körülbelül 91 Tóban, 92%-ban, 93%-ha.n, 94%-han, 95%-ban, 96%-ban, 97%~ bán, 98%-ban, 99%-ban vagy ennél is nagyobb mértékben tartalmazzák az interféron-β monomer formáját.

A jelen találmány néhány megvalósítási módja szerint a HSA-mentes interferon-β gyógyászati készítmények tartalmaznak még egy nem-ionos tonicitást beállító ágenst, olyan mennyiségben, ami elég ahhoz, hogy a készítményt a te.stfolyadékokk.a.1 ízotóniássá tegye. A készítményeket számos, a szakterületen ál12

:.í taiánosan ismert, nem-ionos tonicitást módosító ágenssel lehet izotóniássá tenni. Ezek általában különböző szénhidrátok [V'oet és Voet: Bi.ochemist.ry John Wiley and Sons, New York (1990)], Az aldózokhoz sorolt monoszacharidok, azaz például a glükóz, a mannőz, az arafoinőz és nböz. valamint a kötözőkhöz sorolt monoszacharídok, azaz például a fruktőz, a szőrhöz és a silnlőz használhatók a jelen találmányban, nem-ionos tonieitási ágensekként. A. diszacharidok, azaz például a szacharóz, rnaitőz, trehaióz és iaktóz, szintén használhatók. Emellett az alditolok (aciklusos polihidroxi alkoholok), azaz például a glicerin, a manóit, a. xilit és a szórtat a jelen találmányban jól használható, nem-ionos tonicitást befolyásoló ágensek. A leginkább előnyben részesített nemionos tonicitást befolyásoló ágens a trehaióz, a szacharóz és a mannit, vagy ezek .kombinációja. A nem-ionos tonicitást befolyásoló ágenst olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a készítményt a testfolyadékokkal izotóniássá tegyük. Ha HSA-mentes interferon-β gyógyászati készítményekbe tesszük, akkor a nemionos tonicitást befolyásoló ágens körülbelül 1-10% bán van jelen, a használt ágenstől függően.. Tehát az egyik megvalósítási rnöd szerint a nem-ionos tonicitást befolyásoló ágens trehaióz vagy szacharóz, körülbelül 8-10%~ban, előnyösen 9 tömeg/ téridgat%-ban, és előnyösen trehaióz ebben a koncentrációban. Egy másik megvalósítási mód szerint a nem-ionos tonicitást befolyásoló ágens mannit körülbelül 4-6%-ban, előnyösen körülbelül 5 tömeg/térfogat%~han. Más megvalósítási módok szerint a nemionos tonicitást befolyásoló ágens trehaióz és. mannit, vagy sza13 ** ch&róz és marmit kombinációja, amiben a. írehalőz és a szacharóz körülbelül 1 tÖmeg/térfogat%~ban van jelen, és a mannit körülbelül 3-5 tömeg/térfogat%-ban van jelen, előnyösen körülbelül 4,6 töm eg/ térfogati- bán.

A jelen találmány szerinti HSA-mentes interferon-β gyógyászati készítmények lehetnek folyadék készítmények, illetve ezek szárított formái., A jelen találmány szempontjából a „folyadék” szakkifejezés, ha a gyógyászati készítményekre vagy kiszerelési formákra alkalmazzuk, akkor „vizes”-! jelent, és ide tartoznak a lefagyasztott folyadék készítmények ís. A „szárított forma” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a folyékony -gyógyászati készítmény vagy kiszerelési forma le van szárítva fagyasztva szárítással {azaz például liofilezéssek Williams és Polli: 3. Parenteral. Sci. Technot

38, 48-59 (1984); porlasztva szárítással: Masters: ín: SprayDrüng Handbook, 5.. kiadás, 491-676. oldal, Longrnan Scientific and Teehnícal, Essez, Hagy-Britannia (1991); Broadhead és mtsai: Drag Devel. Ind, Pharm. 18; 1169-1206 (1992);

Mumenthaler és mtsai: Pharmaceutical Research 11, 12-20 (1994), vagy iégszárítással: Carpenter és -Crowe: Cryiobiology 25, 459-470 (1988); Kóser; Biopharm. 4, 47-53 (1991)]. A „hőihez” szakkifejezés az interferon-β gyógyászati készítményekkel kapcsolatban szándékaink szerint: gyors fagyasztva szárítást jelent csökkentett nyomáson, több ampullára alkalmazva, amik mint egy egységdózisnyí jelen találmány szerinti interferon készítrnenvt tartalmaz ismertetett liofílezést végző liofilező berendezések kereskedelmi, forgalomban vannak, és a.

:„.ί szakterületen jártas szakemberek könnyen tudják működtetni.. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a folyékony készítményeket liofilezett készítmények formájában állítjuk elő.

Λ jelen találmány másik megvalósítási módja szerint a jelen találmány szerinti HSA-mentes ínterferon-β gyógyászati, készítményeket olyan' formában állíthatjuk elő, amik megfelelnek a pulmonáris beadásnak, és a készítmény pulmonáris inhallálással történő beadásának. A „pulmonáris inhalálás” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a gyógyászati készítményt közvetlenül a tüdőbe juttatjuk be, oly módon, hogy' a készítményt egy bejuttató beren dezésbál aeroszol vagy' más megfelelő· készítmény formájában juttatjuk be az alany szájüregébe, és az alany a szájüregen keresztül helélegzí. Az „aeroszol'” szakkifejezés alatt szilárd vagy folyékony anyag szuszpenzíőját értjük, áramló levegőben, vagy más, fiziológiásán elfogadható gázáramban eloszlatva. Más megfelelő .készítmény lehet például, anélkül, hogy ezekre .korlátoznánk magunkat, a köd, a pára, vagy permet készítmények, mindaddig, amíg a feherjekészítményt: tartalmazó részecskéket olyan mérettartományban juttatjuk be, ami összhangban van a gyógyászati készítmény alábbiakban definiált száraz por tormájára megadottal. A pulmonáris inhalálást megvalósíthatjuk a szakterületen jártas szakember számára ismert más megfelelő módszerekkel Ezek közé tartozhat a folyadék instilláciő, megfelelő berendezés használatával, vagy rnás ilyen módszerek. A pulmonárís inhalálás az ínhalált fehérjékészitménynek az alany tüdejében. való lerakódását eredményezi. Ha egyszer lerakodott, akkor ♦ ♦ ♦ * »* » J **«φ

a fehérje passzívan vagy aktívan abszorbeálódhat a vérbe az alveolusok epitéliumán és a kapilláris epítélíurrion keresztül, az ezt követő szisztémás eloszláshoz.

Egy polípeptid vagy fehérje, azaz például az interferon-β puimonáris beadásához arra van -szükség, hogy a biológiailag aktív anyagot az inhalálás során egy bejuttató berendezésből az alany szájúregébe juttassuk be. A jelen találmány szempontjából az interferon-^ variánsokat tartalmazó HSA-raentes interferon-β .gyógyászati készítményeket egy aeroszol, vagy más megfelelő készítmény inhalálásával adjuk be, amit a gyógyászati készítmény egy vizes vagy nem-vizes oldat vagy szuszpenzió- formájából, vagy kapunk, a használt bejuttató berendezéstől függően. Az ilyen be juttató berendezések a szakterületen jól ismertek, és ide tartóznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a nebulizátorok, a mért dőzisú inhalálőszerek és a száraz por inhalátorok, vagy bármilyen más megfelelő bejuttató mechanizmus, ami lehetővé teszi egy gyógyászati készítmény vizes vagy nem-vizes oldat vagy szusz-penzió, vagy szilárd vagy száraz por formában való bejuttatását. Ha a puimonáris beadáshoz alkalmas gyógyászati készítményekkel kapcsolatban használjuk, akkor ezeknek a szakkifejezéseknek a jelentése szándékaink szerint a következő. A „vizes” szakkifejezés alatt olyan készítményt értünk, amit ű riő, hogy vizet tartalmaz, vagy vízben o t az etegyeket is, amikben a víz a predomináns komponense az elegynek. Egy predomináns anyag nagyobb mennyi £>?

beleértve ségben van jelen, mint az elegy niás komponense. A „nem-vizes” szakkifejezés alatt egy olyan készítményt értünk, amit ügy állítunk elő, hogy egy olyan anyagot tartalmaz, vagy olyan anyagban oldjuk, ami nem víz, vagy olyan elegyekben, amikben nem a víz a predoinináns komponens az elegyben. Az „oldat” szakkifejezés alatt két vagy több anyag homogén készítményét értjük, amik lehetnek szilárd anyagok, folyadékok, gázok, vagy ezek interkombinációk A „szuszpenzíő* szakkifejezés alatt egy anyagok olyan keverékét értjük, amikben egy vagy több oldhatatlan anyag van homogén módon diszpergálva egy másik predomínáns anyagban.

A jelen találmány szempontjából a „szilárd” és „száraz por” szakkifejezések egymás helyett is használhatók a pulmonárls beadáshoz használható, HSA-me.nt.es ínterferon-β gyógyászati készítményekkel kapcsolatban. Egy gyógyászati készítmény „szilárd” vagy „száraz por” formája alatt olyan készítményt, értünk, amit finom porrá szárítottunk, aminek nedvességtartalma körülbelül 10 tömegszázalék alatt van, általában körülbelül 5 tömegszázalék alatt van, előnyösen körülbelül 3 tömegszázalék alatt van. A készítménynek ez a száraz por formája olyan részecskéket tartalmaz, amik az mterferon-(i-t vagy annak variánsait tartalmazzák. Az előnyben részesített részecskeméret kisebb mint körülbelül 10 pm átlagos átmérőjű, előnyösebben kisebb mint körülbelül 7 pm, még ennél is előnyösebben kisebb min t körülbelül 6,0 pm, még ennél is előnyösebben a 0,1-5,0 pm tartományban van, átlagos átmérője legelőnyösebben a körülbelül 1,0-0,5 pm tartom án vban van.

X? .......

*♦<

:,í.

ehát egy HSA--mentes interferon-β-t, vagy annak variánsait tartalmazó folyékony gyógyászati készítményt, amit pulmonáris bevitelre szántak, vagy folyékony oldatként vagy szuszpenzióként lehet a bejuttató berendezésben használni, vagy először száraz por formává kell alakítani, a szakterületen jól ismert, liofilezési vagy porlasztva-száritási technikákat használva. Ha egy folyékony oldatot vagy szuszpenziöt használunk a bejuttató berendezésben, egy nebuüzátorban, egy mért dőzisű inhalálőban, vagy más megfelelő bejuttató berendezésben, akkor a bejuttató berendezés egy vagy több dózisban pulmonáris inhalálással a készítményből gyógyászatilag hatásos mennyiséget juttat: be az alany tüdejébe, olyan részecskék formájában, amiknek a mérete ugyanabban a tartományban van, mint az előzőkben említett száraz por formának. A ..gyógyászatilag hatásos mennyiség* szakkifejezés alatt egy olyan mennyiséget értünk, ami jól használható egy interferon-p-ra reagáló betegség vagy állapot kezelésére, megelőzésére vagy diagnosztizálására. A készítmény folyékony oldata vagy szuszpenziója használható a szakterületen jártas szakember számára ismert, fiziológiásán elfogadható stabilizáló ágensekkel, töltőanyagokkal, viszkozitás módosítókkal, térkitöltő ágensekkel, felületaktív anyagokkal vagy ezek kombinációival, mindaddig, amíg nem veszélyeztetik a jelen találmány szerinti HSA-mentes interferon-β gyógyászati készítmények megkülönböztető jellegzetességeit.

Ha a folyékony gyógyászati készítményt a pulmonáris beaz való felhasználás előtt üofilezzük. akkor a liofilezett ke 4 -» >**».·

XJw, szitmenyt megoroijux, nogy olyan finom port kapjunk, amiben, a részecskék mérete az előzőkben említett tartományban van. Ha porlasztva szárítást használunk arra, hogy a folyékony gyógyászati készítményből száraz port kapjunk, az eljárást olyan körülmények között hajtjuk végre, amik lényegében amorf, finom száraz port eredményeznek, ami .az előzőkben említett, kívánt, mérettartományba tartozó részecskéket tartalmaz. Hasonlóképpen, ha a kiindulási gyógyászati készítmény már liofilezett formában van, akkor a készítményt megőrőlhetjük, hogy megkapjuk a száraz por formát, amivel a későbbiekben aeroszolt, vagy más, pulmonáris inhaláláshoz használható készítményt állíthatunk elő. Ha a kiindulási gyógyászati készítmény porlasztva szárított formában van, akkor a készítményt előnyösen már úgy állítottuk elő, hogy már száraz por formájú, aminek vizes vagy nem-vizes oldatban vagy szuszpenzióban, vagy száraz por formában való bejuttatása összhangban van a pulmonáris beadással. A gyógyászati készítmények száraz por formában való előállításának módszerei megtalálhatók a szakirodalomban (WO 96/32149, WO 97/41833, WO 98/2906 és 5,976,574, 5,985,248 és 6,001,336 számú Amerikai. Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, amely publikációkat a. továbbiakban referenciaként kezelünk].

A készítmény kapott, száraz por formáját azután egy megfelelő bejuttató berendezésbe tesszük, hogy ezután egy aeroszolt, vagy más megfelelő készítményt állítsunk elő, amit az alanyba pulmonáris inhalálással lehet bejuttatni. Ha a gyógyászati készítmény száraz por formáját vizes vagy nem-vizes oldat, vagy szusz19 nziőban készítjük el és adagoljuk, akkor egy mért dózisú inhalátort, vagy más megfelelő bejuttató berendezést használunk. A

*. ·»*» , * ♦ Κ .« *·· χ ♦ « * * fi fix 9 «99» fit χ «ί χ 0 fi _v * · *» fc* v készítmény száraz por formájának gyögyászatilag hatásos mennyiségét egy aeroszolban, vagy más, a pulmonáris inhaláláshoz alkalmas készítményben juttatjuk be. Tehát a bejuttató berendezésbe helyezendő· száraz por forma mennyisége elég ahhoz, hogy lehetővé tegye a készítmény gyógvászatilag hatásos mennyiségének bejuttatását az alanyba inhalálással. Tehát a bejuttató berendezésbe helyezendő száraz por forma mennyisége kompenzálja a veszteségeket a berendezésben való tárolás, és a készítmény száraz por formájának bejuttatása során. A száraz por fonnának egy bejuttató berendezésbe való helyezése után az előzőkben említett, megfelelő mérető részecskéket' egy aeroszol hajtóanyagban szuszpendaljuk. A nyomás alá helyezett nem vizes szuszpenzlőt azután a bejuttató berendezésből az alany légútjába juttatjuk be, miközben az alany inhalál. A bejuttató berendezés egy vagy több dózisban, pulmonáris inhalálással a ké szítményből gyögyászatilag hatásos mennyiséget juttat az alany tüdejébe. Az aeroszol hajtóanyag lehet bármilyen hagyományos anyag, amit erre a célra használnak, azaz például klőr-fluorszénhidrogén, hidroklör-öuor-szénhidrogén, h-idrofluor-szénhidrogén, vagy szénhidrogén, beleértve a. triklőr-trifiuor-metánt, diHőr-diöuor-metání, a. díklór-tetraöuor-etánt, a diklőr-difíuoretánt, a diklőr-téírafiuor-etanolt és az 1,1,1,2-tetraíluor-etánt, vagy ezek kombinációit, Egy felületaktív anyagot adhatunk a gyógyászati készítményhez, hogy csökkentsük a fehérjetartalmú

- S * -s · száraz pornak a bejuttató berendezés falához való tapadását,, amely berendezésből az aeroszolt adagoljuk. Az erre a célra használható felületaktív anyagok közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szorbitán-trioieát,. a szójalecitin és az olajsav. Egy fehérjekészítmény száraz por formájának nem-vizes szuszpenzióként való pulmonáiis bejuttatására alkalmas berendezések kereskedelmi forgalomban vannak. Ilyen berendezés például a Ventolin mért dózisű inhalátor (Glaxo Inc., Research Tríangle Park, NC), és az Intal Inhaler (Físons Corp.., Bedford, MA), valamint a szakirodalomban ismertetett többi aeroszol bejuttató berendezés {5,522,378, 5,775,320, 5,934,272 és

5,96.0,792 számú Amerikai Egyesült Aliamok-belí szabadalmi leírás, amely publikációkat a. továbbiakban referenciaként, kezeHa a HSA-mentes interferon ~β gyógyászati készítmény szilárd vagy száraz por formáját száraz, por formában, akarjuk bejuttatni. akkor előnyösen egy száraz' por inhalátort, vagy más megfelelő berendezést használunk. Λ gyógyászati készítmény száraz por formáját előnyösen száraz· por aeroszolként állítjuk elő, áramló levegőben vagy más, fiziológiásán elfogadható gázáramban diszpergálva, hagyományos módon. A kereskedelmi forgalomban levő száraz por inhalátorok, amik az itt ismertetett módszerekben használhatók, közé tartozik a Spínhaler por inhalátor (Pisons Corp., Bedford, MA) és a Ventolin Rotahaler {Glaxo, Inc., Research Tríangle Park, NC). Lásd még a .szakirodalomban ismertetett többi száraz por bejuttató berendezéseket (WO

WO 96/09085. WO /32152 és 5,458,

35,

5,785,049, valamint 5,993,783 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk).

Az interferon-p-t vagy annak biológiailag aktív variánsát tartalmazó H SA- .mentes interferon'-β gyógyászati készítmény száraz por formája vizes oldattá alakítható át, hogy ezt követően vizes oldat aeroszolként lehessen beadni egy nebulizátor, egy mért dözisú inhalátor, vagy rnás megfelelő berendezés alkalmazásával. A nebulizátor esetében a folyadék tárolóban levő vizes oldatot alakítjuk át vizes permetté» aminek csak egy kis része hagyja el a nebulizátort, hogy egy adott időpontban bejusson az alanyba. A megmaradt permet visszafolyik a nebulizátorban levő folyadék tárolóba, ahol ismét vizes permetfé aeroszolizálódik. Ezt az eljárást addig lehet ismételni, amíg a folyadéktartály kiürül, vagy addig, amíg az aeroszolizált permet beadását leállítják. Az. ilyen nebulizátorok kereskedelmi forgalomban vannak, ide tartozik például az Ultravent nebulizátor (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO) és az Acom H nebulizátor (Maerquest Medical

Products, Englewood, CO), lásd még a Wö 94/00951 szabadalmi leírásban ismertetett nebulizátort, valamint azt a berendezést, amivel aeroszolizált vizes készítményeket, lehet bejuttatni (5,544,646 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk).

X Λ- « »>* «

A jelen találmány szerinti HSA-mentes iníerferon~B gyógyászati készítmények „stabilizált” készítmények. A „stabilizált” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a készítményekben az interfe ron-β polipeptid a tárolás során lényegében monomer állapotban marad, és így ennek a polípepíidnek terápiás hatékonysága nem károsodik aggregátumok képződése következtében. A „tárolás során” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy egy folyékony gyógyászati készítményt, vagy kiszerelési formát elkészülte után nem azonnal adunk be egy alanynak.. Ehelyett, az elkészítés után tároláshoz becsomagolják, folyadék formájában, lefagyasztott állapotban, vagy a későbbi feloldáshoz szárított formában, vagy más, egy alanynak való beadáshoz alkalmas formában. Ezt a. stabilitást HSA mint stabilizáló és szolubilízáló ágens alkalmazása nélkül érjük el. A jelen találmány szerinti készítményeket előnyösen közvetlenül folyadék formában tároljuk, hogy teljesen kihasználjuk a folyadék formában való tárolás során tapasztalt stabilitás előnyeit, a feloldás nélkül való beadás egyszerűségét, és azt a képességet, hogy a készítményt előre töltött, felhasználásra kész fecskendőkben adhatjuk be, vagy multidózís készítményekben, ha a kiszerelési forma kompatibilis a bakteriosztatikus ágensekkel. A jelen találmány szerinti HSA-mentes interferon-β készítmények tárolási ideje legalább körülbelül 6 hónap, 12 hónap, 18 hónap, előnyösebben legalább 20 hónap, még ennél is előnyösebben legalább 22 hónap, és legelőnyösebben legalább 24 hónap, 2-8 °C on tárolva.

φ. * Α φ V Φ Φ * Φ

A jelen találmány szerinti HSA-mentes interferon-β készítmények stabilitásának követésére szolgáló módszerek hozzáférhetők a szakterületen, beleértve az alábbiakban ismertetett példákban leírt módszereket is. Azaz, az interferon-β aggregátum, képződése egy jelen találmány szerinti folyékony gyógyászati készítmény tárolása során könnyen meghatározható, ha az oldatban mérjük az oldható interferon-β mennyiségének időbeli változását. Az oldatban levő oldható peptidek mennyisége számos analitikai esszével meghatározható, amik az interferon-β meghatározására. vannak adaptálva. Az: ilyen esszék közé tartozik például a fordított fázisú HPLC és az UB abszorpciós spektroszkópia, amint azt az alábbi példákban ismertetjük. Az oldható és oldhatatlan aggregátumok meghatározását a folyadék készítményekben a tárolás során elvégezhetjük például analitikai ultracentrifugálással, amint azt az. alábbi példákban ismertetjük, hogy különbséget tudjunk tenni az oldható polipeptid azon része, amely oldható aggregátumok formájában van jelen, és azon része között, ami nem-aggrcgálodot, biológiailag aktív molekulásris formában van jelen.

A jelen találmány szerinti stabilizált gyógyászati készítmények interferon-β-1 és azok variánsait tartalmazzák. Az ptnteríeron-β* szakkifejezés a továbbiakban vonatkozik az interferonéra, vagy annak variánsaira, amiket néha interferon-p-szerö polipeptideknek neveznek. A humán, interferon-β variánsoknak, amik természetes körülmények között fordulhatnak elő (azaz például az interferon-β lókuszban előforduló allélvariánsokj, vagy re24 «44« :u.

komhináns módszerekkel lehet őket előállítani, az aminosav szekvenciájuk azonos, hasonló, vagy lényegében hasonló az érett természetes interferon-β szekvenciájához. Az ínterferon-β fragmenseí, vagy az interferon-β aktivitásukat megtartó csonkított formái is ide tartoznak.. Az interferon-p-nak ezeket a biológiailag aktív fragmenseít vagy csonkított formáit úgy állítjuk elő. hogy aminosav csoportokat távolítunk el a teljes hosszúságú interferön-β aminosav szekvenciájából, a szakterületen jól ismert rekombináns DNS technika alkalmazásával. Az ínterferon-β polipeptidek lehetnek glikozilezettek vagy nem-glikozilezettek, mivel a szakirodalomban leírták, hogy mind a glikozilezett, mind a glíkozilezetlen interferon-β mennyiségileg hasonló specifikus aktivitásokat mutat:, és ezért a glíkozil egységek nem játszanak szerepet, és nem járulnak hozzá az interferon-β biológiai aktivitásához.

Az itt említett interferon-β variánsok közé tartoznak az érett natív interferon-β szekvencia muteinjei, amikben egy vagy több eisztein-csoportot, amik nem esszenciálisak a biológiai aktivitás szempontjából, szándékosan kivágunk, vagy más aminosavakkal helyettesítünk, hogy elimináljuk azokat a helyeket, amiken keresztül interniolekulárís keresztkötések vagy inkorrekt intramoiekulárís diszulfid-híd képződés jöhet létre. Az ilyen típusú interféron-β variánsok közé tartoznak azok, amelyek, glicint, vaíint, alanint, leucínt. ízoieucínt, tirozint, fenilalaniní, hisztidint, triptofání, szerint, treonint vagy metionint tartalmaznak a eisztein helyett, az érett természetes aminosav szekvencia 17-es ciójában.. A szerin és a treonin az inkább előnyben részesített .helyettesítés, mivel kémiailag a cisztein analógjai. Az egyik megvalósítási mód szennt az érett, természetes szekvencia 17-es aminosav pozíciójában levő eiszteint szérűinél helyettesítjük. A 17-es ciszteínt ki is vághatjuk a szakterületen ismeri: módszerekkel (lásd például 4,588,584 számú Amerikai Egyesült Államok··beli szabadalmi leírást, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk), ennek eredménye érett Interferon-β mütéín, ami egy amínosavval rővidehb mint az érett természetes interferon-β. Lásd még például a 4,530,787, 4,572,798 és 5,588,585 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírást. Tehát azok az interferon-β variánsok, amik egy vagy több mutációt tartalmaznak, amik a molekulának javítják például a gyógyászati használhatóságát, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy mutációval további változások vihetők be az interferon -β-t kódoló nukleotíd szekvenciákba, ezzel megváltoztatva az interferon-β aminosav szekvenciáját, anélkül hogy megváltoztatnánk az interferon biológiai aktivitását. Tehát egy interferon-β variánst kódoló izolált nukleinsav molekulát, aminek a szekvenciája eltér az érett természetes interferon-β aminosav szekvenciájától, egy vagy több nukleotíd helyettesítésnek, addiciőnak, vagy deléciónak az itt ismertetett, megfelelő- nukleotíd szekvenciában, való elvégzésével hozhatunk létre, oly módon, hogy egy vagy több aminosav helyettesítést, addícíót vagy deléciót viszünk be a kódolt interíeron-p-ba. A mutációkat bevihetjük standard techtokákkal, azaz például helyspecifikus mútagenezissel és polimeráz láncreakcióval végrehajtott mútagenezissel. Ezek az interferon-β variánsok is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Például konzervatív aminosav helyettesítések végezhetők egy vagy több, előre .megjósolt, előnyösen nem-esszenciális aminosav csoportban. Egy „nem-esszenciális” aminosav csoport olyan csoport, ami megváltoztatható a vad-típusú ínterferon-β szekvenciában, anélkül hogy megváltoztatnánk a biológiai aktivitását, míg egy ^esszenciális* aminosav csoportra, szükség van a biológiai aktivitáshoz, A „konzervatív aminosav helyettesítés” egy olyan helyettesítés, amiben az aminosav csoportot hasonló oldallánccal rendelkező aminosav csoporttal helyettesítünk. A hasonló oldallánccal rendelkező aminosav csoportok családjait a szakterületen definiálták. Ezek közé a családok közé tartoznak a bázikus oldalíánccal rendelkező (azaz például lizín, arginin, hisztidin), savas· oldalíánccal rendelkező (azaz például aszparagínsav, giutaminsav), töltetlen poláros oldallánccal rendelkező (azaz például glicin. aszparagin, glutamin, szerín, treonín, tírozin, ciszteín), apoláros oldallánccal' rendelkező (azaz: például alanin, valín, leucin, ízoleucin, prolin, fenílalanin, metionin, triptofán), bétaelágazásos oldallánccal rendelkező (azaz például treonín, valín, ízoleucin) és aromás oldalíánccal rendelkező (azaz például tírozin, fenílalanin, triptofán, valin, hisztidin, ízoleucin) aminosavak. Az ilyen helyettesítések nem végezhetők el a konzervált aminosav csoportok esetében, vagy olyan aminosav csoportok esetében, arník egy konzerválódott motívumban talá

·.·>*»

X φ» zgj másik változat szerint a variáns interferon-β nukleotid szekvenciákat úgy állíthatjuk elő, hogy mutációkat viszünk be egy interferon-β-t. kódoló szekvenciába, annak egy részén, vagy teljes hosszában, például telítési mutagenezíssel, és a kapott mutánsokat az interferon-^ aktivitás alapján átvizsgálhatjuk, hogy azonosítsuk azokat a mutánsokat, amik megtartották az aktivitásukat. A mutagenézist követően a kódolt fehérjét rekombináns módszerekkel expresszáltatbatjuk, és a fehérje aktivitását az itt ismertetett standard esszé technikákkal határozhatjuk meg.

Az interferon-β biológiailag aktív variánsai legalább 80%-os, előnyösebben, körülbelül 90-95%-os vagy több, és legelőnyösebben körülbelül 96-99%-os vagy főbb aminosav szekvencia azonosságot mutatnak az érett természetes interferon-β aminosav szekvenciájával, ami az összehasonlítás alapjául szolgál. A „szekvencia-azonosság* szakkifejezés alatt azt értjük, hogy ugyanazok az aminosavak találhatók egy variáns polipeptídhen és abban a polípeptid molekulában, ami referenciaként szolgál, ha a variáns aminosav szekvenciájának, egy specifikált, egybefüggő szegmensét illesztjük egymáshoz, és hasonlítjuk a referencia molekula aminosav szekvenciájához.

Két szekvenciának a szekvencia azonosság meghatározásához végzett optimális egymáshoz illesztése céljából a variáns aminosav szekvenciájának egybefüggő szegmense tartalmazhat további aminosav csoportokat vagy kivágott aminosav csoportokat, a referencia molekulához viszonyítva. A referencia aminosav

szekvenciához való összehasonlításhoz használt egybefüggő szegmens legalább· 20 egybefüggő aminosav csoportot tartalmaz·. A réseknek a variáns aminosav szekvenciába való beviteléhez kap csolódó megnőtt, szekvencia azonosság korrekciójához, rés-büntetéseket használhatunk. A szekvencia-illeszkedés módszerei jól ismertek.

Tehát bármilyen két szekvencia százalékos azonosságának meghatározására bármilyen matematikai, algoritmust használhatunk. A szekvenciák összehasonlítására használt matematikai algoritmusok egy előnyben részesített, nem-korlátozó példája Myers és Miller algoritmusa pMyers és Miller: Compuh Appl. Biosci. 4, 11.-7 (.1938)], Egy Ilyen algoritmust használnak az ALIGN programban (2.0 verzió), ami a GCG illesztési programcsomag része.. Egy ΡΑΜΙ20 csoport súlyozási táblázat, 1.2-es réshosszúság büntetés és 4-es ré-sbüntetés használható az ALIGN programmal, ha aminosav szekvenciákat hasonlítunk össze. Két szekvencia összehasonlítására használt matematikai algoritmusok egy másik, előnyben részesített, nem-korlátozó példája Kariin és Altschul algoritmusa [Karlin és ALtschul: Proceedings of the National Academy of Sciences, VSA 90, 587.35877 (1990)], amit Karún és Altschul módosított. [Kariin és Altschul: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 5873-5877 (1993)]. Egy ilyen algoritmust építettek be Altschul és munkatársai NBLA8T és XBLAST programjaiba [Altschul és mtsai: Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)|. Az XBLAST programmal BLAST aminosav szekvencia *41' keresést lehet végezni, éríék“50, szóhossz-3, hogy ezzel a számunkra érdekes poilpeptídhez hasonló aminosav szekvenciát kapjunk. Ahhoz, hogy összehasonlítási célokból réses illeszkedéseket kapjunk Altschul és munkatársai réses BLAST-ja használható (Altschul és mtsai; Nucleic Acids Research 25, 33893402 (1997)], Egy másik változat szerint PSÍ-BLAST hajtható végre egy integrált kutatás végrehajtásához, amivel a molekulák közötti távoli kapcsolatokat lehet kimutatni (Altschul és mtsai; Nucleic Acids Research 25, 3389-3402 11997)]. A BLAST, réses BLAST vagy PSí-BLAST programok végrehajtásakor az alap paraméterek használhatók, lásd a http: / /www. ncbl.nlm.nih.gov webhelyei. Lásd még az AL1GN programot (Dayhoff: Zn: Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl.3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978)], valamint a Wísconsin Sequence Analysis Package-ben (8-as verzió] található programokat (beszerezhető a. Genetics Computer Group-tol, Madison, Wísconsin), például a GAP programot, amikben a programok alap paramétereit használjuk.

Ha az aminosav szekvencia azonosságot vizsgáljuk, néhány aminosav csoport pozíció eltérő lehet, konzervatív aminosav helyettesítések eredményeképpen, amik nem érintik a fehérje , Eze k ben a ne kos azonosságot, teiieie lehet változtatni, hogy lígj^elembe Vegyük a konzervatív módon helyettesített aminosavak hasonlóságát. Az ilyen változtatások jól ismertek a szakterületen f'Myers és Miller: Comput. Appl. Blosoi. 4, 11-17 U 988)1.

» fc$ ♦ * *

♦ fc»** * V * * *

V » fc * * * * * «4 *OC A * 0

A jelen találmány oltalmi körébe tartozó biológiailag aktív interferon-β variánsok közé tartoznak olyan interferon-β polipeptidek is, amik kovalens kötéssel kapcsolódnak például polietilénglikolboz (PBG) vagy alfeutninhoz. Az ilyen kovalens hibrid interferon-β molekulák rendelkeznek bizonyos kívánatos gyógyszerészeti tulajdonságokkal., azaz például hosszabb szérum felezési idővel, egy betegnek való beadás után. A PEG-1FN adduktok létrehozására szolgáló módszerek közé tartozik a monoraetoxi-polietilénglikol kémiai módosítása, amivel olyan aktivált vegyűletet lehet előállítani, ami reagál az interferon· β-val. A PEG-hez kapcsolt polipeptídek előállítási és alkalmazási módszereit a szakirodalomban publikálták jDelgado és mtsai: Crit. Rév. Ther. Drug Carrier Sysh 9, 249-304 (1992)). Az aibumin fúziós fehérjék készítési módszerei közé tartozik a kódoló szekvenciák íűzionáitatása a ez (azaz például az interferon-β-hoz) és az albumínhoz, azeket az 5,876,969 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírásban ismertetik, amely publikációt a továbbiakban referenciakén t kezelünk.

Az interferon-p-nak a jelen találmány oltalmi körébe tartozó, biológiailag aktív variánsainak meg kell tartaniuk az interferon-β aktivitásukat, különösen azt a képességüket, hogy kötődnek az interferon-β receptorokhoz. Néhány megvalósítási mód szerint az interferon-β variánsok legalább körülbelül 25%ban, körülbelül 50%-ban, körülbelül 90%-ban, körülbelül 75%-ban, körülbelül 85%korülhelül 95%-ban, körülbelül 98%bán. körülbelül vagy nagy mértekben :4, azoknak a polipeptídeknek a biológiai aktivitását, amiknek az ammosav szekvenciáját az 1. és 2. ábrán mutatjuk be. Ide tartoznak azok az ínterferon-p variánsok is, amiknek az aktivitása az 1. és 2. ábrán bemutatott polipeptidek. aktivitásához viszonyitva, megnőtt. Az interferon-β variánsok aktivitását bármelyik, a szakterületen ismert módszerrel mérhetjük. Az ilyen esszék példái megtalálhatók a szakirodalomban fFellous és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 3082-3086 {1982); Czerníecki és mtsai: J. Virol, 49(.2), 490-496 {1984); Mark. és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 81, 5662-5666 (1984); Brarxca és mtsai: Natúré 277, 221-223 (1981); Williams és mtsai: Natúré 282, 582-586 (1979); H.erberman és mtsai: Natúré 277, 221-223 (1979); Amderson és mtsai: Journal of Biologícal Chemistry 257(19), 11301-11304 (1982)(, valamint az alábbiakban, a 2. példában ismertetett interferon-β potenciál esszé,

A jelen találmány szerinti készítményekben levő interferonβ származhat bármelyik állatfajból, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szárnyas, kutya, szarvasmarha, sertés, ló és humán eredetűeket. Az interferon-β előnyösen egy emlősfaiból származik, ha a készítményt egy emlős interferon-β· rendellenességének kezelésére használjuk, előnyösebb, ha a interferon-β ugyanabból az emlősfajból származik, mint amelyikben ilyen rendellenesség kezelésére akarjuk használni. Tehát ha. a kezelt emlős ember, akkor az alanynak előnyösen egy HSAmentes gyógyászati készítményt adunk be, ami lényegében monomer humán irrterfemn-β-ί, vagy annak biológiailag aktív variánsát tartalmazza.

A jelen találmány oltalmi körébe tartozó ínterferon-β polipeptidek és interferon-β variáns polipepiidek nem-korlátozó példái megtalálhatók a szakirodalomban (Nagata és mtsal: Natúré 284, 316-320 (1980); Goeddel és mtsai: Natúré 287, 411416 (1980); Yeiverton. és mtsai: Nueleic Acids Research 9, 731741 (1981); Streuli. és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 2848-2852 (1981); EP028033B1 és EPI0974881J. Lásd még a 4,518,584, 4,569,908, 4,588,585, 4,738,844, 4,753,795; 4,769,233, 4,793,995, 4,914,033,

4,959,314, 5,545,723 és 5,814,485 számú Amerikai Egyesült ÁUamok-beli szabadalmi leírást, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az idézett publikációk arra is útmutatást adnak, hogy az ínterferon-β polipeptídnek milyen csoportjai és régiói változtathatok meg, a biológiai aktivitás elvesztése nélkül.

A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint a stabilizált gyógyászati készítményekben levő ínterferon-β az érett természetes interferon-β poiipeptid.. Egy másik megvalósítási mód. szerint ezekben a kiszerelési formákban az interferon-β az érett ínterferon-β poiipeptid, amiben az érett természetes szekvencia 17-es pozíciójában levő cisztein csoportot szerinnel helyettesítjük, az előzőkben ismertetett módon. Azonban a jelen találmány más megvalósítási módokra is vonatkozik, amikben a stabilizált gyógyászati készítményben levő interferon-β bármelyik χ χ.*· ** . < ' “*<·♦ ?JL .'ί * _Α * . \ _w Α ΆΥ & .'** biológiailag aktív interferon·· β polipeptid, vagy annak variánsa, amint azt ebben a leírásban máshol ismertettük.

A jelen találmány néhány megvalósítási módja szerint az interferou-p-t rekombináns módszerrel állítjuk elő. A „rekombináns módszerrel előállított ínterferon-β” szakkifejezés alatt olyan ínterferon-p-t értünk, aminek biológiai aktivitása összemérhető az érett természetes ínterferon-β aktivitásával, amit rekombináns DNS technikával állítottunk elő. Áz interferon- β úgy állítható elő, tenyésztünk egy gazdasejtet, ami egy interíéron-β polipeptidet ő núkleotid szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral van transzformálva, A gazdasejt olyan, hogy képes átírni a nukleotid szekvenciát, és termelni a kívánt fehérjét, és lehet prokarióta (azaz például Sscherfchiu coli), vagy eukariőta (például élesztő, rovar vagy emlős sejt). Az interferon-β rekombináns módszerekkel való előállítási módszereire számos példát ismertetnek a szakirodalomban (Mantei és mtsai: Natúré 297, 128 (1982); Ohno és mtsai: Nucleic Acids Research 10, 967 (1982); Smith és mtsai: Moieeular Celküar Bíology 3, 2156 (1983); 4,402,940 és 5,814.485 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként 'kezelünk). A humán interferon géneket rekombináns DNS technikával klónozták, és Eschenehia cok-han expresszálták (Nagola és mtsai: Natúré 284, 816 (1980); Goeddel és mtsai: Natúré 287, 411 (1980); Yelverton és mtsai: Nucleic Acids Research 9, 731 {(981); Streulí és mtsai: Froceedíngs of the National Acadexny of Sciences, USA 78, 2848 (1981)1 Egy másik változat szerint az in Χ..-fc fc**»

terferon-β előállítható egy transzgenikus állatban vagy növényben, amit: genetikailag módosítottak, hogy a számunkra érdekes interferon-β fehérjét a szakterületen Ismert módszerekkel összhangban expresszálja.

A természetes mterferon-ji-szerű tulajdonságokkal rendelkező fehérjéket vagy polípeptideket is előállíthatjuk rekombináns DNS technikával, ha poii-A-han gazdag 128 mRNS-t extrahálunk virálisan indukált humán sejtekből, a mRNS-t templátként használva kétszálú cDNS-t szintetizálunk, majd a cDNS-t egy megfelelő klónozd vektorba juttatjuk be, a vektorral egy megfeleld mikroorganizmust transzformálunk, a mikroorganizmust összegyűjtjük, majd extraháljuk belőle az interferon-p-t (2803-3 számú európai szabadalmi leírás (1981. május 26.); 32134 számú európai szabadalmi leírás (1981. július 15.}: és 34037 számú európai szabadalmi leírás (1981. augusztus 26.}, amely leírások különböző módszereket ismertetnek az interferon-β rekombináns DNS technikával való előállítására).

Egy másik változat szerint az interferon-β kémiailag is megszintetizálbató, a peptíd szakterületen jártas szakember számára ismert számos különböző technika egyikével (Li és mtsai: Proceedings of the National Aoademy of Sciences, USA 80, 22162220 (1983); Steward és Young: Solíd Phase Pepiidé Synthesis emical Company, Rockfbrd, Illinois); Bárány és Merrifíeld: The Peptídes: Ánalysís, Synthesis, Biology, 2, 3-254, szerk.: Grnss és- Meínhofer, Academic Press, New York (1980), amiben a szilárd fázisú pepiid szintézis technikákat tárgyalják;

Bodansky: Princíples of Peptide Synthesis (Springer Verlag, Berlin|(1984); Gross és .Meinhofér, szerk.; The Peptides; Analysís, Synthesis, Blology J, (Academíc Press, New York) (1980), amiben a klasszikus, oldatban végrehajtott szintéziseket tárgyalják). Az interferon-β kémiailag előállítható meg a szimultán többszörös peptid-szintézís módszerével is (Boughten: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82, 5131-5135 (1984); 4,631,211 számú Amerikai Egyesüli Államok-beli szabadalmi

A jelei: találmány szerinti HSÁ-mentes interferon-β gyógyászati készítmények előállításában használt, rekombináns módszerrel előállított interferon-β a szakterületen jártas szakember számára ismert bármelyik módszerrel kinyerhető és izolálható (lásd például a 4,462,940 és 5,702,699 számú Amerikai Egyesült Állam.ok-heh szabadalmi leírásokat, amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk]. Ezekkel a módszerekkel az interferont az interferon-β tiszta formájában nyerjük ki, ami a szoiubíiizáió ágensként használt SDS távollétében hajlamos aggregátumokat képezni. Emellett, ezekben a módszerekben a fehérje magas pH-jn körülményekkel érintkezik, ami károsan érintheti a fehérje biológiai tulajdonságait, és olyan készítményeket eredményezhet, amik a tisztítás során a fehérje szoluhílizálására. használt SDS-maradványokkal van szennyezve. Tehát, bár ezekkel a módszerekkel az interferon-β előállítható, előnyösen inkább azzal a javított módszerrel nyerjük ki és tisztítjuk, amit az „Improved Method of Protein Purification and Recovery* című Ideiglenes szabadalmi leírásban, (benyújtva 2000. október

27-én), ami a 60/243,965 USA benyújtási sorozatszámot kapta, a függő Ump^oved Method of Protein Purification and Recovery” című ideiglenes szabadalmi leírásban (benyújtva 2ÖÖ1. április 9.), ami a 60/282,607 USA benyújtási sorozatszámot kapta, és az ezzel egyidőben benyújtott „Method of Protein Purifieaiion and

Recovery” című ideiglenes szabadalmi leírásban, ami a_

USA benyújtási sorozatszámot kapta, ismertetnek, amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk.

ÍV

Ezekben a függő és egyidőben benyújtott leírásokban az interferon-p-ra két javított tisztítási és kinyerési módszert ismertetnek. Ezek közül. a. tisztítási és kinyerési módszerek közül az első abból áll, hogy lény egében tiszta interferon-β-t alkohollal, azaz· például alifás alkohollal csapunk, ki, és a 'kicsapott interferon-p-t guanidin-hidrokloridban oldjuk. A kapott oldatot azután megfelelő pufferben oldjuk, hogy a fehérjét renaturáljuk. E közöl a tisztítási és kinyerési módszerek közül a másodikban kimarad a .kicsapási lépés. Ezáltal a lényegében tiszta interferonját tartalmazó mintát guanidin-bidrokloriddal keverjük össze, ezzel olyan oldatot kapunk, ami szolubilizált denaturált interferoh-p-t tartalmaz; ezt az oldatot azután megfelelő pufferben hígítjuk, hogy a fehérjét renaturáljuk. A renaturálódott interferonβ-t tartalmazó oldatot mindkét módszerben diaszűrjük, vagy •diaüzáljuk egy gyógyászati, célokra használt pufferbe. Ha a jelen találmány szerinti HSA-mentes gyógyászati készítmény elöállíXX látjuk,, akkor a tisztított renaturálődott interferon-β len találmány szerinti alacsony ionerősségű, oldatba áializáljuk, az alábbi 8,példában ismertetett mó*» fehérjét a j diaszűrjük dón.

A jelen találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak csak kőrtiibelül 0,01 rng/rnl mterieron-p-t, de tartalmazhatnak 20,0 mg/ml interferon-p-t is (tömeg/térfogat). A különböző megvalósítási módok szerint az interferon-β körülbelül 0,01 mg/ml koncentrációtól körülbelül 20,0 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,015 mg/ml-től körülbelül 12,5 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,025 mg/ml-től körülbelül 10,0 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,05 mg/mltől körülbelül 8,0 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,1 mg/ml-től körülbelül 4,0 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,125 mg/ml-től körülbelül 2,0 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,175 mg/ml-től. körülbelül 1,0 mg/mlig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,2 mg/ml-től körülbelül 0,5 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, körülbelül 0,225 mg/mltől körülbelül 0,3 mg/ml-ig terjedő koncentrációban, és .körülbelül 0,25 mg/ml koncentrációban van jelen.

Néhány megvalósítási mőd szerint a jelen találmány szerinti készítmények egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak. A „gyógyászatilag elfogadható hordozó” szakkifejezés jelentése egy olyan hordozó, amit hagyományosan használnak a szakterületen a tárolás, beadás megkönnyítésére, és/vagy a terápiás adalékanyagok gyógyító hatásának növelésére. Egy hordozó csökkentheti is az interferon-8 bármilyen nem-kívánt mellé is.

CV felelő hordozónak stabilnak kell lennie, azaz nem szabad, hogy képes legyen a készítményben levő többi adalékanyagokkal való reakcióra. Nem szabad, hogy szignifikáns lokális vagy szisztémás káros hatásokat okozzon a befogadóban, a kezelésre használt dózisokban és koncentrációkban. Az ilyen hordozók általában ismertek a szakterületen. A jelen találmány szempontjából azokat tartjuk használhatóknak, amik hagyományosan használt nagy stabil makromolekulák, azaz például zselatin, kollagén, poliszacharítí, monoszachariá, poliviníl-pirrolidon, polítejsav, poHghkolsav, aminosav polimerek, fixált olajok, etil-oleát, liposzómák, glükóz, laktőz, mannoz, dextróz, dexfrán, cellulóz, szorbit, polietiiénglikol (PEG) és hasonlók. A lassú felszabadulású hordozók azaz például a hialurons&v, szintén megfelelőek IPrisell es mtsai; International Journal of Pharmaceutics 85, 51-56 (1992); és 5,166,331 számú Amerikai Egyesült Államok·-beli szabadalmi leírás f

A gyógyászati készítmény emellett tartalmazhat egy szolubílizáiö ágenst vagy oldhatóságot fokozó ágenst is, ami hozzájárul a fehérje old hatóságához, azon a fokozott oldhatóságon felül, amit az itt ismertetett alacsony ionerősségű kiszerelési formákkal lehet kapni. A guamdnim-csoportot tartalmazó vegyületek, legelőnyösebben az argínín, alkalmas oldhatóságot fokozó szerek az íníerferon-p-hoz. Az ilyen oldhatóságot fokozó szerekre példa lehet az argínín, valamint az argínín aminosav analógjai, amik megtartják azt a képességüket, hogy fokozzák az interféron-β old39

♦4 hatóságát- Ezek közé az analógok közé tartoznak, anélkül ezekre korlátoznánk magunkat, az argínint tartalmazó dipeptidek és tid peptidek. Más megfelelő szolubílizáló ágenseket is leírnak a szakirodalomban (4,816,440; 4,894,330; 5,004,605; 5,183,746; 5,643,566 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Wang és mtsai: J. Parenteral Drug. Assoc. 34, 452-462 y publikációkat a továbbiakban referenciaként kezeAz előzőkben ismertetett ágensek mellett más stabilizáló ágensek is használhatók, hogy tovább fokozzuk a folyékony gyógyászati készítmények stabilitását, ilyen például az etiléndiamintetraecetsav (EDTA), vagy annak egy sója, azaz például a dinátrium ED'TA, Az EDTA a fémionok begyűjtője, amikről ismert, hogy számos oxidációs reakciót katalizálnak, ezért egy további stabilizáló ágens. Más megfelelő stabilizáló ágensek lehetnek például a nem-ionos felületaktív anyagok, beleértve a polioxíetilén szerbit észtereket, azaz például a poliszorbát 80-at (Tween 80) és a poliszorbát 2ö-at (Tween 20); a políoxopropilén-polioxíetilén. észterek azaz például a Piurortic P68 és a Pluroníc FI 27; a azaz például a Brii 35; a sir

polietiléngiikol, azaz például a PEG4Ö0, a lizofosziatidilkolin és a polioxietilén-p-t-oktilfenol, azaz például a. Triton X-100. A .gyógyszerek: felületaktív anyagokkal való klasszikus stabilizálását a szakirodalomban ismertetik (Lcvine és mtsai: J. Parenteral Sci. Technot 45(3), 160-165 (1991). amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk!..

Egy jelen találmány szerinti,, stabilizált folyékony HSAmentes interferon-β kiszerelési forma, vagy egy jelen találmány szerinti visszaoídott stabilizált liofilezett HSA-mentes interferon«Ο β gyógyászati készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségét adjuk be egy alanynak, A „gyógyászatilag hatásos mennyiség* szakkifejezés alatt egy olyan mennyiséget értünk, ami jól használható egy betegség vagy állapot kezelésében, megelőzésében vagy diagnosztizálásában.. A beadás tipikus útjai közé tartozik, anélkül., hogy ezekre korlátoznánk, .magunkat, az orális beadás, a nazális bejuttatás,, a pulmonáris bejuttatás, a. parenterális beadás, beleértve a transzdermális, intravénás, íntramuszkuláris, szubkután, intraarteríálís és íntraperitoneális injekciót vagy az infúzió. Az egyik megvaiösitási mód szerint a beadás módja injekciózás, előnyösen szubkután injekció. A jelen találmány szerinti injekciózható készítmények közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk, magunkat az oldatok, a szuszpenziók és az emulziók. A készítményben az interferon-β terápiásán hatásos mennyisége körülbelül 0,01 gg/kg és körülbelül 5 mg/kg között van, előnyösen körülbelül 0,05 pg/kg és körülbelül 1000 gg/kg között előnyösebben körülbelül 0,1 Ag/kg és körülbelül 500 pg/kg, még előnyösebben körülbelül 0,5 pg/kg és körülbelül 30 van.

Az egyik megvalósítási mód szerint a stabilizált HSA-mentes gyógyászati készítményt, ami lényegében monomer interferon-p-t tartalmaz, egységdózisban szereljük ki, és lehet injekciózható vagy infundálbató formában, azaz lehet oldat, szuszpenzió vagy emulzió. Emellett tárolható lefagyasztva vágj' szárított formában, .azaz lehet lioSlezett por, amit azután folyékony oldattá, szuszpenzióvá vagy emulzióvá lehet alakítani a különböző módszerek bármelyikével való· beadás előtt, beleértve az orális vagy parenterális beadási módokat is. A stabilizált gyógyászati készítmény membránszúréssel sterilezhető, és egységdőzis vagy mulfidözis konténerekben, azaz például lezárt fiolában vagy ampullában tárolható. Egy gyógyászati készítmény formulálásának a szakterületen általánosan ismert további módszerei használhatók arra, hogy tovább fokozzuk az itt ismertetett .gyógyászati készítmény tárolási stabilitását, azzal a feltétellel, hogy nem érintik károsan az itt ismertetett stabilizáló ágensek jótékony hatásait. A kiszerelési formák, és a gyógyászatilag elfogadható hordozók, stabilizálószerek, stb. alapos leírása megtalálható a szakirodalomban (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Mack Publi'shing. Company, Eaton, Pennsylvania. (1990), amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk).

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények hatékony mennyiségét tartalmazó kiszerelési formák, amik interferon-p-t, vagy annak variánsát, azaz például a humán interferon-β (hIFN-p) muteinjét, aminek jelölése hlFN-p_s«ri7, tartalmazzák, jól használhatók az ezzel a polípeptíddel végzett terápiára reagáló klinikai indikációk diagnosztizálására, megelőzésére és kezelésére (ami lehet lokális vagy szisztémás). Ilyen klinikai indikációk például központi idegrendszer (CNS), az agy és/vagy a gerincvelő betegségei, beleértve az Alzheimer kórt, a Parklnson

4, kört:, a Lewy test. demenciát, a szklerőzís multiplexet, az epilepsziát, a kisagyi aímááí, a. progresszív szuptanukleáris bénulást, az amiotrőp laterális szklerózist, a mániás-depressziós pszichózist, a szorongásos rendellenességeket, rögeszmés kényszeres rendellenességeket, a személyiség-zavarokat, a koncentrálóképesség hiányát, á koncentrálóképesség hiányán alapuló hiperaktivitási rendellenességet, a Tourette szindrómát, a Tay Sachsot, a Níeman Pick-et és a. skizofréniát; az agyér rendellenességekből, azaz például az agyban vagy a gerincvelőben lejátszódó szírekből származó ídegkárosodásokat, a központi idegrendszer fertőzésekből, beleértve az agyhártyagyulladásból és HlV-ből származó ídegkárosodásokat, az agy és a gerincvelő tumoraiból vagy egy prion betegségből származó idegrendszeri károsodásokat; az autoimmun betegségekből, beleértve a szerzett immunhiányos betegségből, a reumás arthritisből, a pszoriázisból, a Crobn betegségből, az amiotrőp laterális szklerózisból és a bőrfarkas bői származó ídegkárosodásokat; valamint a rákból, beleértve az emlőrákot, prosztatarákot, hőlyagrákot, vese- és vastagbél rákot, származó idegrendszeri károsodások. Az interferonβ-nak vagy muteinj-einek embereknek vagy állatoknak való beadását végezhetjük orálisan, intraperitoneálisan, intramuszkulárísan, szubkután, intravénásán, intranazálisan, vagy pulmonárisan, amint azt a kezelőorvos megfelelőnek ítéli.

A jelen találmány tárgya eljárás az interferon-β (Ϊ.ΡΝ-β), vagy annak biológiailag: aktív variánsai oldhatóságának növelésére egy gyógyászati készítményben humán szérum-albumín távollétében.

* »♦ * « >**

Az eljárás abból áll, hogy a készítményt alacsony ionerősségű: kiszerelési formában állítjuk elő, amint azt ebben a leírásban máshol ismertetjük, oly módon, hogy a készítmény pH-ja körülbelül 3,0 és 5,0 között marad, majd az interferon-p-t vagy annak biológiailag aktív variánsát betesszük a készítménybe. Az egyik megvalósítási mód szerint az alacsony ionerösségö készítmény glicint, aszparaginsavaí: vagy nátríum-szukcinátot tartalmaz pufféiként, körülbelül 1 romol/1 és körülbelül 30 mmol/1 közötti koncentrációban, előnyösen körülbelül 2 mmol/1 és körülbelül 5 mmol/1 közötti koncentrációban. A készítmény tartalmazhat még egy nem-ionos tonicitást beállító ágenst, olyan mennyiségben, ami elég abhoz, hogy a készítményt izotőniássá tegye a testfolyadékokkal, amint azt ebben a leírásban máshol ismertetjük. Az egyik megvalósítási mód szerint a nem-ionos tonicitást beállító ágenst a következő csoportból választjuk ki: trehalóz, szacharóz, maimit, és ezek bármilyen, kombinációja. Emellett, ha. ennek a készítménynek a pH-ját körülbelül 3,0 és 5,0 között tartjuk, előnyösen 4,Ö-n, akkor az interferon-β túlnyomó részéi: monomer állapotban tudjuk tartani. Tehát a. jelen találmány tárgya továbbá eljárás stabilizált HSA-mentes gyógyászati készítmény előállítása, ami lényegében monomer interferon-β-ί tartalmaz.

Az alábbi példákat csak illusztráció céljából adjuk meg, és ezekkel nem szándékunk a találmány oltalmi körének korlátozása.

KÍSÉRLETI RÉSZ

Ji· φ*.

? Φ««ν » * φφφ * ♦ φ 49

A jelen találmányt az tette lehetővé, hogy jobban megértettük az ínferferon-p-lb oldhatósági és stabilitási tulajdonságait. A HSA-mentes interferon-p-lb készítmények előnyben részesített jellemzői a következők: a pH körülbelül 3,0 és 5,0 között van, és az ionerösség nagyon alacsony. Ha ebben £3. pHtartományban nagyon alacsony ionerösséget alkalmazunk, akkor ennek eredménye a monomer interferon-p-lh nagyobb koncentrációja és az aggregálődott interferon-β-1 b csökkent mennyisége. Ezek a körülmények biztosítják az- interferon-^- l b oldhatóságát és stabilitását, amit korábban csak. akkor lehetett elérni, amikor HSA-í. használtak a készítményben.

Az ezekben a kísérletekben használt interferon-β 1-b-t Escheríc/ua coá-ban állítottuk elő, lényegében a 4,462,940 és/vagy 4,815,400 számú Amerikai Egyesült Államok-betí szabadalmi leírásban, ismertetett tisztítás első néhány lépésének megfelelő módon. Azaz, a transzformált baktériumokat használjuk az interferon-β előállítására: a gazdasejteket tőményítjük, majd falukat elroncsoljuk, így kapjuk az ínterferon-β- lb alapanyagot.

Az- így kapott interíeron-^-lh alapanyag tartalmaz 50 mmol/1 nátríum-acetátot, 1 mmol/1 EDTA-t, 0,1% nátrium-dodeeil-szulfátot (pH-5,5). .Ahhoz, hogy az előzőkben ismertetett oldhatósági és stabilitási kísérletekhez előállítsuk a kiindulási anyagot, az SDS-t eltávolítjuk az ínterferon-β-lb alapanyagból, oly módon, hogy az anyagot egy G-25 oszlopon (Pharmacia) bocsátjuk át, amit 1,5 mmol/1 nátrium-hidroxiddal hoztunk egyensúlyba, ρΗ>Π értéken. A G-25 oszlopról lejött anyag össze 45 :4.

... _Γ * e>*

A ·♦ gyűjtésa után, az összegyűjtött anyag térfogatának l/IÖ részét 'kitevő 1 rnol/I glicin pH~3 oldatot, adunk hozzá, gyors kevertetés közben, hogy a pool p'H-ját körülbelül 3-ra állítsuk, Az: anyagokat 4 ’C-on, vagy lefagyasztva, tároljuk, majd az oldhatóság? és stabilitási kísérletekben használjuk.

Az interferonA kiindulási kísérleteket azzal a. céllal hajtjuk végre, hogy megértsük az interferon-β-lb oldhatóságát számos különböző pH. puffer-típus és ionerösség mellett. Egy interferon-p-lb oldatot (körülbelül 0,8 mg/ml inieríeron-p-Ib 100 mol/1 gUcinben, pH~3,0) eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az interferon-p-lb oldhatósága, függ a pH-tői és az ionerősségtől. ρΗ«3,0 értéken az interferon-p-lb minden koncentrációban oldható marad, 200 mmo.l/1 nátrium-klorid mellett. A pH=4,ö~es készítményekben az interferon-β-lb kevésbé oldódik, ahogy a nátrium-klorid koncentráció eléri a 1.50 m.m.oi/1-t. Á pH~5,0-s készítmények esetében az interferon-β-lb kevésbé oldódik, amikor a készítmény csak 100 mmo.l/1 nátrium-kloridot tartalmaz. Ezeket összerakva, az adatok azt mutatják, hogy az iníerferon-β- lb ρΗ--3.0-η a legoldhatóbb, .kevésbé oldódik, ha a. pH~4,0, és legkevésbé ρΗ^δ,Ο-η oldódik. Ezek az adatok azt is mutatják, hogy ha növeljük a készítmények ionerősségét (a nátri46

ί ♦ * » ''fc *n ί*** • > 4 # χ * * X .χ *’ *β χ >χ <

um-klorid koncentráció növelésével), akkor ez is csökkenti az interferon- β-1 b oldhatóságát.

Bár az előzőkben említett, kísérletekben meg tudtuk határozni azokat a körülményeket, amik előnyösek az interferon -β-lb old hatósága szexnpontjábói, ezzel nem határoztuk meg az oldhatóság határát egyik adott körülmény mellett sem. Ezután egy másik kísérletet hajtottunk végre, hogy meghatározzuk az interferon-β- 1b oldhatósági határait. Az interferon-p-lb maximalizálására alacsony íonerősségö készítményeket használtunk (azaz 5 mmol/1 puffer, só, azaz nátríum-kiorid nélkül). Á dialízis után az interfeΓοη-β-lb-t tőményítjük, hogy meghatározzuk az oldhatóságát egy adott készítményben. Ezeknek a kísérleteknek az eredményét a 2. ábrán, mutatjuk be. A pH-3,0 és pH«4.,0 pH-jú készítményekben a legnagyobb az oldhatóság, ami legalább 16 mg/ml. A ρΗ-5-ös készítményben az oldhatóság körülbelül 8 mg/ml. A pH~5,0 fölötti készítményekben az oldhatóság csak körülbelül 0,2 mg/ml volt. Ezek az eredmények megint azt mutatják, hogy a pH-nak erős hatása van az interferon-p-lb oldhatóságára. Az alacsony ionerosségn készítményekben, pH~3,Ö és pH~4,ö mellett, nagyobb az oldhatóság, mint ρΗΑδ,Ο mellett. pH~^:5,() fölött az interferon-p-lb lényegében oldhatatlan az alacsony íonerősségö készítményekben.

1. Táblázat

Készítmények az interferon-β-1b oldhatóságának meghatározására, pH, pu&rtipusok és nátríum-kiorid koncentráció » * ♦ 4 « *« *·» *·4· fc · 4

1 i '	PufTer 5 mmol/1 giicin	pH	Nátrium-klorid koncentráció (mmol/1)
pH«3~~~ *	0 mmol/1
5 mmol/1 giicin	pH-3	50 mmol/1
5 mmol/1 giicin	1 pH~3	100 mmol/i
	5 mmol/1 giicin	pH-3	150 mmol/1
	5 romol/1 citrát	pH-4	0 mmol/1
	5 mmol/1 citrát	pH=4	50 mmol/1
	5 mmol/1 citrát	p.H-4	100 mmol/1
5 mrnol/i citrát	pH-4	1.50 mmol/1
	5 mmol/1 acetát	pH-4	0 m.mol/1
5 mmol/1 acetát	p.H~4	50 mmol/1 j
	5 m.mol/1 acetát	pH-4 ............... .....	100 mmol/1 j
	5 mmol/1 acetát	pH~4	150 mmol/1
	5 mmol/1 formát	p.H~4	0 mmol/1 j
	5 mmol/1 formát	pH~4	50 mmol/1
	5 mmol/i formát	pH-4	100 mmol/1
	5 mmol/1 formát	pH^::::4	150 mmol/1 : ........ !
.......	5 mmol/1 acetát	pH=5 ;	0 mmol/1 :

1	5 mmol/1 acetát	pH-5	100 mmol/1	—
____	5 mmol/1 acetát	1 pH“5 )	150 m.mol/1	1
	5 m.mol/1 hisztidin	r pH“5~3~~~~	0 mmol/1	j
	5 mmol/1 hisztidin	pH-δ □...................................—ι—	50 m.mol/1	•

mmol/1 hisztidin

100 m.mol/1 * ♦ * Λ > X fc* mmol/l hisztidín 5 mmol/l nátriurn-szn 5 mmol/l nátríum-szukeinái I mmol/I nátrium-szukemát mmol/l nátrium-sznkcináí

150 mmol/l mmol/l 50 mmol/l 100 mmol/l 150 m.mol/1

2. Példa

Analitikai ultracentrifugálási kísérletek

Míg az oldhatósági kísérletekkel meg lehet határozni, hogy mennyi interferon-β-1b van oldatban, más technikákra van szükség ahhoz, hogy meghatározzuk a fehérje aggregáclós állapotát. Fontos meghatározni, hogy a fehérje monomer állapotban van-e a készítményben, és fontos azt is meghatározni, hogy a fehérjéből mennyi (ha van egyáltalán valamennyi) létezik a magasabbrendű formában, azaz például dimerként, trimerként, sth. Az analitikai ültracentrifugálás az egyike a legjobb technikáknak, amikkel ki lehet, deríteni a fehérjék állapotát ÍLiu és Shire: J. Phai'maceutícal Sciences 88, 1237-1241 (1999)1. Három kísérletet hajtunk végre, hogy jellemezzük. a különböző interferon-βIh készítmények monomer-tartalmát, analitikai ultracentrifügálás használatával. Ezeket az analitikai ultracentrifugálási kísérleteket különböző interferon-β-Ih készítményekkel hajtjuk végre, ílymődon minden egyesben azonos kiszerelési formát használunk (5 mmol/l glicín, pH=3,0). Azonban ezekben a kiszerelési formákban a monomer százaléka kissé változó volt (3. ábra: 89,8%, 6. ábra: 94,2%; 9. ábra: 86,3%). Az ezeknek az interferon-β-lb ••fcfc * * *·>_Λ > X '· ♦ *·* »4 ί.».·' készítményeknek a készítésére használt kinyerési és tisztítási eljárások a kovalens természetű interferon-β-lb molekula valamennyi aggregálódását okozza. Az 5 mmol/l glíein pfí™3,0 kiszerelési forma minden egyes kísérletben alapvonalként szolgál a kiszerelési formában levő aggregátum mennyiségeként szolgál az egyes

Az első kísérletben a. pH-nak az interferon-β-lb aggregációjára gyakorolt hatását vizsgáljuk. A pH”3,0~s készítményeket (amik csak 5 mmol/l glicint. tartalmaznak az oldat pufferelésére), a pH~4,0-s készítményeket (amik csak 5 mmol/l aszparagin.sa.vat tartalmaznak az oldat, pufferelésére), és a. pkfefyO-s készítményeket (amik. csak 5 mmol/l nátrium- szukcinátot tartalmaznak az oldat pufferelésére) elemezzük. Az eredményeket a 3., 4. és 5. ábrán mutatjuk be. Ezekben a profilokban a fö csúcs körülbelül 20 kDa-nak felei meg, ami nagyon közel van az interferon-β-1 b molekulasúlyához (19,878 kDa). Tehát a fő csúcs az interferon-β1b monomer. A nagyobb fajták fdimerek, trimerek, stb.) a nagyobb ülepedés! koefficienseknek felelnek meg. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy miközben az interferon- β-1 b főleg monomer pH-3,0 és pH=4„Ö értékben (körülbelül 90%), pH~5,0 értéken a molekula elkezd m&gasabbrendű fajtákká aggregálódní, és csak körülbelül 75%-uk monomer. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az interferon-β-Xb aggregácios állapota érzékeny a pH változására, és az interferon-β-lb monomert az alacsony pH körülmények részesítik előnyben, azaz például a pH=3,Ö- és a

A második kísérletben az ionerősség hatását vizsgáljuk az interferon-β-1b aggregáeiós állapotára. A készítmény ionerőssége menyben (5 mmol/1 glícinnel pufféd nátrium-klorid hozzáadásával. Az növelhető a ^0-s

0, 50 és 150 eredményeket a S„, 7, és 8. ábrán mutatjuk he. Abban a készítményben, ami nem tartalmaz hozzáadott nátrium-kloridot (6. ábra], az interferon-p-lb monomer formája az őssz-interferon-βIb-nek .körülbelül 94%-át teszik ki (azaz a fö csúcs 94%), Ha 50 mm-ol/l nátrium-kloridot: adunk a készítményhez, .akkor a monomer-tartalom körülbelül 76%-ra. csökken (7. ábra), és ha a készítményben 150 mmol/1 nátrium-klorid van, akkor a monomertartalom kisebb mint 10%-ra csökken (8. ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az ínterferon-β-Ib aggregáeiós állapota nagyon érzékeny az ionerősségre, és az Interferon-β- 1b monomer előnyben részesíti az alacsony ionerősségű állapotokat.

Egy injekciózható· gyógyászati, készítménynek kívánatos jellemzője, hogy a. testfolyadékkal izotóníás. Ionos anyagok .(azaz például nátrium-klorid] és nem-ionos anyagok (azaz például cukrok, úgymint szacharóz és trebalöz) használhatók arra, hogy a készítményt a testfolyadékokkel izotóniássá tegyük. A korábbi analitikai ultracentrifugálási kísérletekkel olyan készítményeket Vizsgáltunk, amik vagy nem voltak izotöniásak (csak 5 mmol/1 puffért tartalmaztak), vágy nátrium-kloridot tartalmaztak ionos tonicítási ágensként. Egy harmadik kísérletben a nem-ionos főnicitási ágensek hatását vizsgáltuk az interléron-β- Ib aggregáeiós állapotára. Ebben a kísérletben három, pH-3,ö-s készítményt (5

Si mmol/í gllcinnel pufí'erelve) készítettünk. Az egyik csak a gliein pufferelo ágenst tartalmazza, a másodiknak, a. tonicitását 9% szacharózzal állítottuk be, a harmadiknak a tonicitását. 9% trehalózzal állítottuk be. Az analitikai ultraeentrifugálás eredményeit a 9., 10. és 11. ábrán mutatjuk he. A csak. pufferelo ágenst, tartalmazó készítmény monomer-tartalma csak. körülbelül 86% (9. ábra). Ha vagy szacharózt (10. ábra), vagy trehalózt (1.L adunk hozzá tonicitási ágensként, akkor a monomer-tartalom körülbelül 89%. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a. nemionos tonicitást ágensek, azaz például a szacharóz és a trehalóz nem segíti elő az inferferon-β- 1b molekula aggregálödását.

3. Példa

A liofílezett interferon-B-1b HSA-mentes készítmény stabilitása gyorsított hőmérsékleti körülmények között

Az interferon-β-ih HSA-mentes készítményeit pH~3,ö~nál^: (pufferkéht 5 mmol/1 glícint használva) és p.H~4,0-nál (pufferként 5 mmol/1 aszparaginsavaí: használva), amik vagy 9% trehalózt (pH-3,0 és pH“4,0) vagy 9% szacharózt (pH=4,0) tartalmaznak, hofilezzük. A liofílezett készítményeket azután 40 °C-on tároljuk, stabilitásukat 8 hét alatt vizsgáljuk, A szacharóz és a trehalóz a hofilezett készítményekben tipikusan használt stabilizáló ágensek. Ezekből a reagensekből 9%-ot használunk, hogy a visszaoldott készítmény izotöniás legyen a testfolyadékokkal. Ahhoz, hogy a készítmények ion-erősségét, és ezzel az aggregálődott interferon-β -Ih mennyiségét minimalizáljuk, a puffer mennyiségét *

minimális .szinten tartjuk. így minden pufíemek a koncentrációja 5 mmol/1

A fehérje gyógyászati készítmények tipikus tárolási körülménye gyakran az 5 °C-os tárolás. Azonban a gyorsított hőmérsékleti állapotokat gyakran használják a készítmények vizsgálatában, hogy egy adott készítménynek gyorsítsák a bomlását, és ezzel releváns stabilitási adatokat kapjunk rövídebb- idő alatt. Ebben a kísérletben 40 °C-t használunk, hogy megkíséreljük az interferon-β-íh gyorsított bomlását HSA-mentes kiszerelési formákban. A koncentráció-mérések és a fordított fáziséi HPLC (RPHPLC) elemzés eredményeit a 12. és 13. ábrán mutatjuk be. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy még magas hőmérsékleten is, ezek az interferon-β- 1b készítmények nem mutatnak kimutatható változásokat a nyolchetes vizsgálat alatt.

A trehalózt tartalmazó, liofiiezett HSA-mentes interferon-β-lb készítmények stabilitása valós idejű tárolási körülmények között

Bár a fehérje gyógyszerek tipikus tárolási körülménye az 5 °C, kívánatos, hogy legyen olyan termék, ami szobahőmérsékleten (25 °C-től 30 °C-igj stabil. Ebben a kísérletben a 9% trehalózr. tartalmazó készítményeket (5 mmol/1 glícin, pH-3, vagy 5 mmol/1 aszparaginsav pH=4,Ö) liofdezzük. 9% trehalóz koncentrációt használunk, hogy a visszaoldott készítmény izotőniás legyen a testfolyadékokkal. A készítményeket 5 °C-on és 30 °Con tároljuk, stabilitásukat 9 hónapig mérjük. A koncentrációmérések és a fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) elemzések eredményeit a 14. és 15. ábrán mutatjuk be. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy még 30 °C-on ís, ezek az interferon-β- lb készítmények nem mutatnak kimutatható változásokat a küenchönao. Példa

A folyékony HSÁ-mentes interferon-β-lb készítményekstabilitása gyorsított hőmérsékleti körülmények között

Az interferon-p-lb HSÁ-mentes készítményeinek pH~3,ö és pH~4,ö értékeken mérhető stabilitását is vizsgáljuk folyékony állapotban. A készítmények összetétele ugyanaz, mint amit a 3. példában megadtunk (9% trehalóz (pH-3,0 és pH-4,0), vagy 9% szacharóz (pH~4,ö)). ismét, ahhoz, hogy minimalizáljuk a készítmények ionerősségét, és ezzel minimalizáljuk az aggregálódott interferon-p-lh mennyiségét, a puffer mennyiségét minimum szinten tartjuk (5 mmol/1). .A folyadék készítményeket. 30 °C-on tartjuk, stabilitásukat 9 hétig vizsgáljuk. A folyékony fehérje-készítmények tipikus tárolási hőmérséklete 5 ^C'C, Ennek következtében a 30 '°C~on végzett tárolás gyorsított tárolási körülményeket jelent, amiket úgy terveztünk meg, hogy növelje az interferonβ-lb bomlását. A 16. ábrán (koncentráció mérések) és a. 17. ábrán (fordított, fázisú HPLC elemzés) bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a 9-hetes vizsgálat során nincs kimutatható változás a készítményekben. Ezek az eredmények azt mutatják, >4 * # * ♦ » «

hogy ezekben a készítményekben, ilyen körülmények között az ínteríeron-0-lb stabil a vizsgálat időtartama alatt.

6. Példa

A folyékony mterferon-fMb HSA-mentes készítmények stabilitása valós idejű tárolási körülmények kozott

Ebben a kísérletben a 9% trehalózt (5 mmol/l glicin, pH~-3, vagy 5 mmol/l aszparaginsav, pH=4,0) vagy 9% szacharózt (5 mmol/l glicin, pH~3, vagy 5 mmol/l aszparaginsav, pH-4,0) tartalmazó folyékony készítményeket vizsgálunk valós idejű tárolási körülmények között, 5 °C-on,A készítményeket ampullákba töltjük, és stabilitásukat 9 hónapig mérjük; A koncentrációmérések és a fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) elemzés eredményeit a 18. illetve 19. ábrán mutatjuk be, Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ezekben a készítményekben az mterferon-β1b stabil ennek a vizsgálatnak 9 hónapja alatt.

Az interferon-β-1b készítményekben a... szacharózzal szemben a trehalózt részesítjük előnyben___nem-ionos tompítást beállító

Ebben a kísérletben 9% trehalózt (5 mmol/l glicin, pH~3, vagy 5 xnmol/l aszparaginsav, ρ-ΗΜ,Ο) vagy 9% szacharózt mmol/l glicin, pH~3, vagy 5 mmol/l aszparaginsav, ρΗ^Α,Ο) tartalmazó folyékony készítményeket állítunk elő, és töltünk folyadékként ampullákba, és az azonos összetételű ampullákat liofi(o φφ .ί, ί lezzük. Stabilitásukat gyorsított hőmérsékleti körülmények között mérjük, amik gyakran előre jelzik, hogy egy adott fehérje készítményeinek stabilitása mennyi lesz·. A folyékony .készítményeket 30 °C-on tartjuk 9 hétig, és a iioblezett készítményeket 40 °C-on tartjuk 8 hétig. A koncentráció -mérések eredményeit a 20. ábrán (folyadék) és 21. ábrán (iioSlezett) mutatjuk be. Ezek az ábrák azt mutatják, hogy a szacharózt tartalmazó készítmények pH~3-on látszólagos koncentráció-növekedést mutatnak. A koncentrációnak ez a látszólagos növekedése a szacharóz alacsony pH-η való hidrolízisének következménye, .redukáló cukrok képződése közben, ami a készítmények nem-enzimes bámulását (azaz például a Maillard reakciót) eredményezi. A trehaióz rezisztensebb a hidrolízisre, és így ezekben a készítményekben a szacharózzal szemben előnyben részesítjük jO'Brien: Science 61,

679-682 (1996)

Az SDS eltávolítása és az interferon-p-lb, kiszerelése guanidinhldroklorid kicsapás használatával

Tisztított ínteríéron -p -lb-t ( I liter, 1,91 mg/ml koncentrációjú oldat 0,4% SDS, 50 mmol/1 acetát-puílér pH-5,5 összetételű oldatban) tárolunk 5 °C-on. A tárolás során a jelenlevő SDSből valamennyi kicsapódik. Ebből az anyagból 250 ml-t (477,5 mg) összekeverünk 229 g guanidín-hldrokloriddal (6 mol/1, össztérfogata 400 ml), majd 15 percig szobahőmérsékleten kevertetjúk egy mágneses keverővei. A 6 mol/l-es guanidin-hidroklorid ***♦ «« oldatot azután. egy Sartobran© P kapszulával (0,45' gm-es pőrusméret) megszűrjük, hogy eftávolítsuk a kicsapódott SDS-t. Az UV-val 280 nm-en meghatározott fehérje-koncentráció 1,02 mg/ml. A fehérje .hozama 406 rag, vagy 85%.

A 400 ml .guanidm-hádrokloriddal kezelt anyagot egy Míllípore Labscale© TFF diaszűrő rendszerrel (Míllipore, Inc.) tőményitjük, két PelHcon© XL Biomax © 0,1 cm²-es 10 kDa poliszukon membránnal (Kifliiporé Corp., Bedford, MA). A tőményítési lépés után kapott térfogat 37 ml, a fehérje-koncentráció 10,3 mg/ml, a koncentrációs lépés utáni hozam 380 mg, vagy 93%.

A töményitett guanidin-hidroklorid/fehéxje oldatból egy transzfer pipettával 10 nü-t (103 mg) lépésenként hozzáadunk 590 ml 5 mmol/I glicin (pH-3,2 oldathoz). A puffért gyorsan kevertetjük egy mágneses keverővei: a fehérje-oldatot közvetlenül a vortexhez adjuk. A 6 mol/l guanidín-bidroklorid/íehérje oldatnak ez a 60-szoros hígítása. egy 0,1 moí/l guani&in-hidroklorid/fehérje oldatot eredményez, 0,17 mg/ml koncentrációban. Ezt a 600 ml-t transzferáljuk egy 500 mi-es diaszűrő egységbe, ami két Fellicon® II, 10 kDa-os, 0,1 m²-es poliszukon membránnal van felszerelve. Ezt az oldatot először körülbelül 400 ml-re tőményitjük, ekkor a fehérje-koncentráció 0,23 mg/ml, ezt kővetően 5 mmol/1 glieinnel (pH-3,2) szemben diaüzáljuk, kilencszeres oldatcserével (3,6 liter). A végső diahltráiumot (402 ml) 280 nmes UV-vel mérjük, a végső fehérje-koncentráció 0,23 mg/ml, a.

·* ♦ ♦· ♦.

diaszűrési lépés hozama 92,46 mg vagy 90%, és a teljes· hozam e a. tisztítási

A ioniclfási ágensként mannitot tartalmazó folyékony, HSAments interferon-β-lb készítmények stabilitása

Ebben a kísérletben az 5 mmol/1 aszparaginsavat, 5% mannitot tartalmazó folyadék készítményeket vizsgáljuk valós idejű tárolási körülmények között, 5 ®C~on. Három különböző készítményt (Prep A, Prep B és Prep C az ábrákon) készítünk egyetlen HSA-mentes interferon-β-lb-ből, és ampullákba töltjük. Az ampullákat 5 °C~on tároljuk, majd a készítmények stabilitását 6 hónapig vizsgáljuk. A koncentráció-mérések és a fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) elemzés eredményeit a 22. illetve 23. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt demonstrálják, hogy a hathónapos vizsgálat során ezekben az interferon-β-lb készítményekben nincsenek kimutatható változások.

A leírásben említett összes publikáció és szabadalmi leírás azoknak a szakterületen jártas szakembereknek szól, akik a találmány területén jártasak. Ebben a leírásban az összes publikációt referenciaként kezelünk, ugyanúgy, mintha, minden egyes publikációnál vagy szabadalmi leírásnál specifikusan említenénk ezt a tényt. A specifikációban az alcímeket csak a dokumentum egyszerűbb áttekintéséhez adjuk meg, és ezek semmilyen módon nem korlátozzák a dokumentum tartalmát.

♦ Φ k Φ

ΖΟ

Bár az előzőkben ismertetett találmányi: bizonyos részletességgel ismertettük, az érthetőség szempontjait előtérbe helyezve, az nyilvánvaló, hogy bizonyos módosítások és változtatások tehetők a jelen találmány oltalmi korén belül.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Stabilizált HSA-mentes gyógyászati készítmény, ami lényegében monomer - interferon-β-t (ÍFN-β) vagy annak biológiailag aktív variánsát tartalmazza egy alacsony, körülbelül 20 mM értéknél nem nagyobb ionerősségű készítményben szoluhillzálva, amely említett alacsony toneró-sségú készítmény egy olyan oldat, ami egy púkért tartalmaz körülbelül I mM - körülbelül 3ÖmM koncentrációban, ami elég ahhoz, hogy az említett készítmény pH-ját egy specifikált pH-hoz viszonyítva plusz-mínusz 0,5 egységen belül tartsa, amely említett specifikált pH körülbelül 3,0-5,0 között van.
2, Az 1. igénypont szerinti készítmény, amiben az említett puffer körülbelül 2- körülbelül 20 mmol/1 koncentrációban van jelen.
3, A 2. igénypont, szerinti készítmény, amiben az említett puffén körülbelül 1- körülbelül 10 mmol/1 koncentrációban van jelen.
4, A 3, igénypont szerinti készítmény, amiben az említett puffer körülbelül 2- körülbelül 10 mmol/1 koncentrációbanvan jelen,
5, A 4. igénypont, szerinti készítmény, amiben az említett, puffer körülbelül 2- körülbelül 7 mmol/1 koncentrációban van jelen,

ó. Az 5. igénypont szerinti készítmény, amiben az említett puffer körülbelül 2- körülbelül 5 mmol/1 koncentrációban van jelen.
7, A 6. igénypont szerinti készítmény, amiben az említett puffer körülbelül 5 mmol/1 koncentrációban van jelen.
8, Az 1-7, igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amiben a puffer glícin, aszparaginsav, nátríum-szukemát., cifrát, formíát, acetát, glutaminsav, hisztídin, ímidazol vagy foszfát.
9, A 8, igénypont szerinti készítmény, amiben a puffer glicín.
10, A 8. igénypont szerinti készítmény, amiben a puffer cifrát.
11, A 8. Igénypont szerinti készítmény, amiben a puffer acetát.

.
12. A 8. igénypont, szerinti készítmény, amiben a puffer formíát.
13. A 8. igénypont szerinti készítmény, .amiben a puffer hisztidin.
14. A. 8, igénypont szerinti készítmény, amiben a puffer nátriumszukcinát.

'
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a készítmény ionerősségét egyedül a puííerkoncentráciö határozza meg.
16. A 15. igénypont szerinti készítmény, nincs jelen további ionféleség.
17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelynek pH-értéke 3,0-4,0.

IS. A 17. igénypont, szerinti készítmény, amelynek pH.-értéke 3,54,0.
19, A 18. igénypont szerinti készítmény, amelynek pH-értéke 4,0.
20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ami egy nem-ionos tonicitást beállító ágenst tartalmaz, olyan mennyiségben, hogy az elég legyen ahhoz, hogy az említett készítményt a testfolyadékkal izotóniássá
21, A 20. igénypont szerinti készítmény, amiben beállító· ágens egy monoszaccharíd áldoz vagy ketöz.
22, A 20. igénypont szerinti készítmény, amiben beállító ágens egy diszaeeharid.
23, A 20. igénypont szerinti készítmény, amiben beállító ágens egy aldítoí.
24, A 22. igénypont szerinti készítmény, amiben beállító ágens trehalóz.
25, A 22. igénypont szerinti készítmény, amiben beállító ágens szaceharóz,
26, A 23. igénypont szerinti készítmény, amiben beállító ágens mannitoL a nem-ionos tonicitást a nem-ionos tonicitást a nem-ionos tonicitást a nem-ionos tonicitást a nem-ionos tonicitást a nem-ionos tonicitás t
27. A 20. igénypont szerinti készítmény, amiben a nem-ionos tonicitást beállító ágens trehalóz, szaceharóz:, manóitól, vagy azok kombinációja.
28. A 20-27. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a nemionos tonicitást beállító ágens körülbelül 1- .körülbelül 10%· koncentrációban van jelen.
29, A 28. igénypont szerinti készítmény, ahol a nem-ionos tonicitást beállító ágens trehalóz vagy szaceharóz, mely körülbelül 8- körülbelül 10 tömeg/térfogat% koncentrációban van jelen.

·* ί«*χ »„ » ♦ * * * »·» « ν χ « φ '« <

*♦ ♦*«
30, Α 29. igénypont .szerinti készítmény, ahol a nem-ionos tonicitást beállító ágens mannitol, és körülbelül 4- körülbelül 6 tömeg/térfogattá koncentrációban van jelen,
31, A 30« igénypont szerinti készítmény, ahol a nem-ionos toníoitást beállító ágens mannitol, és körülbelül 5 tömeg/ térfogat.% koncentrációban, van jelen.
32, Az 1-31, igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az IFN-β· humán lFN-β.
33, Az 1-32, igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az IFN-β glíkozilezett.
34, Az 1-32. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az IFN-β glikozilezetlen,
35, Az 1-34. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az IFN-β kovalensen kötődik polietilén-glikollal..
36, Az 1-35. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az IFN-β rekombináns úton előállított.
37, A 36, igénypont szerinti készítmény, ahol az IFN-β egy IFN-β poíipeptidet kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral transzformált gazdasejt tenyésztésével került előállításra, ahol a gazdasejt prokariőta.
38, A 36. igénypont szerinti készítmény, ahol az IFN-β· egy IFN-β poíipeptidet kódoló nnkleotid-szekvenciái tartalmazó kifejező vektorral transzformált gazdasejt tenyésztésével került, előállításra, ahol a gazdasejt eukarióta.
39, A 38. igénypont szerinti készítmény, ahol a gazdasejt élesztősejt.
40·. A 38, igénypont szerinti készítmény, ahol a gazdasejt rovar sejt,
41, A 38. igénypont szerinti készítmény, ahol a gazdasejt emlős sejt.
42. Az 1-41. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol az IFN-β körülbelül 0,01- körülbelül 20,0 mg/ml koncentrációban van jelen,
43, A 42. igénypont szerinti készítmény, ahol az IFN-β körülbelül 0,015- körülbelül 1.2,5 mg/ml koncentrációban van jelen.
44. A 42, igénypont szerinti készítmény, ahol az IFN-β körülbelül 0,025- körülbelül 1.0,0 mg/ml koncentrációban van jelen.

* ♦ * « φ Μ ♦ ♦ Φ Φ X ' ₄ * Κ Φ Φ φ >

* * * ♦ Φ *♦ ΦΦ *».* _Φ._Μ#
45. Α 42. igénypont szerinti készítmény, ahol az ÍFN-β körülbelül 0,-05kőrüihelü! 8,0 mg/ml koncentrációban van jelen.
46. A 42. igénypont -szerinti készítmény, ahol az. lFN-β körülbelül 0,075- körülbelül 6,0 mg/ml koncentrációban van jelen.
47. A 42, igénypont szerinti készítmény, ahol az ÍFN-β körülbelül 0,1körülbelül 4,0 mg/ml koncentrációban van jelen.
48. Az 1-47. igény pontok bármelyike szerinti készítmény, mely EDTA-t vagy annak valamely sóját tartalmazza.
49. A 48, igénypont szerinti készítmény, mely dínátrium-EDTA-t tartalmaz.
50. Az 1-49. igénypontok, bármelyike szerinti készítmény, mely egy nem-ionos felületaktív szert tartalmaz.
51. Az 50. igénypont szerinti készítmény, ahol szer poliomedlén-szorbitol észter.
52. Az 50. igénypont szerinti készítmény, ahol szer poliszorbát 80.
53. Az 50, igénypont szerinti készítmény, ahol szer poliszorbát 20,
54. Az 50, igénypont szerinti készítmény, ahol szer polioxcípropílén-políoxietiién-észter.
55. Az 50. igénypont szerinti készítmény, ahol szer Pluroníc F68.

a nem-ionos felületaktív a nem-ionos felületaktív a nem-ionos felületaktív a nem-ionos felületaktív a nem-ionos felületaktív
56. Az 50. igénypont szerinti készítmény, ahol a nem-ionos felületaktív szer Pluroníc FI27,
57. Az 50, igénypont szerinti készítmény, ahol a nem-ionos felületaktív szer egy polioxietilén-alkohoh
58. Az 1-57. igénypontok, bármelyike szerinti készítmény, mely felhasználásra előre töltött fecskendőben van tárolva.
59. Az .1.-58, igénypontok bármelyike szerinti készítmény, melynek tárolási ideje .2-8X1 hőmérsékleten legalább 6 hónap,
60, A.z 59. igénypont szerinti készítmény, melynek tárolási ideje 2-8°C hőmérsékleten legalább 12 hónap.

* -X X ί» ► ·« -χ ·« *0 9 ól. Az 59. igénypont szerinti készítmény, melynek tárolási .ideje 2-8^6 hőmérsékleten legalább 18 hónap.
62. Az 59. igénypont szerinti készítmény. melynek tárolási ideje 2-8°C hőmérsékleten legalább 20 hónap,
63. Az 59. igénypont azerinti készítmény, melynek tárolási ideje 2-8°C hőmérsékleten legalább 22 hónap.
64. Az 59. igénypont szerinti készítmény, melynek tárolási ideje 2-8°C hőmérsékleten legalább 24 hónap.
65. Az 1-64. igénypontok bármelyike szerinti készítmény selerosis multiplex kezelésében történő alkalmazásra.
66. Az 1-65. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a készítményt injektálással adagoljuk.
67. A 66. igénypont szerinti készítmény, ahol a készítményt szubkután. injektálással adagoljuk.
68. Eljárás interferon·$ fiFN-β) vagy annak biológiailag aktív variánsa oldhatóságának növelésére egy gyógyászati készítményben, humán szérum-albumín távoiíétében, azzal jellemezve, hogy az említett készítményt egy alacsony, körülbelül 20 mM értéknél nem nagyobb ionerősségü készítménnyel állítjuk elő, amely említett alacsony ionerősségü készítmény egy olyan oldat, amely körülbelül 1 mM - körülbelül 30 mM koncentrációban puffért tartalmaz, ami elég ahhoz, hogy az említett készítmény pH-ját egy specifikált pH-hoz viswnyítva plusz-mínusz 0,5 egységen belül tartsa., amely említett specifikált pH 3,0-5,0 között van, és az említett interferon-fbt, vagy annak biológiailag aktív variánsát betesszük az említett készítménybe,
69. A 68. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1- 64, 66. és 67, igénypontok bármelyike- szerintí készítményt alkalmazzuk.
70. Eljárás stabilizált HSA-mentes gyógyászati készítmény előállítására. amely készítmény lényegében monomer interferon-fM (ίΡΝ-β) vagv? annak biológiailag aktív variánsát tartalmazza, azzal jellemezve, hogy az említett készítményt egy alacsony, körülbelül 20 mM értéknél nem. nagyobb ionerősségü készítménnyel állítjuk elő, amely említett alacsony ionerősségü készítmény egy olyan oldat, amely említett alacsony ionerősségü készítmény egy olyan oldat, amely körülbelül 1 m.M - körülbelül 30 mM koncentrációban pufiért tartalmaz, ami elég ahhoz, hogy az. említett készítmény pH-ját egy specifikált pH-hoz. viszonyítva plusz-mínusz 0,5 egységen belül tartsa, amely említett, specifikált pH 3,0-5,0 között van, majd az említett interferon-p-t vagy annak biológiailag aktív variánsát betesszük az említett készítménybe.

7.1. A 70. igénypont szerinti, eljárás, azzal jellemezve, hogy .az 1- 64, 66. és 67. .igénypontok bármelyike szerinti készítményt alkalmazzuk.
72. A 70. igénypont szerinti eljárással előállitatt gyógyászati készítmény,