WO2016052584A1 - ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出方法及び定量方法 - Google Patents

ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出方法及び定量方法 Download PDF

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WO
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ifn
peg
sample solution
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polyethylene glycol
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PCT/JP2015/077662
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祐二 山下
成見　英樹
利恵子 名黒
智美 浅野
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東レ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a pretreatment method, a detection method, and a quantification method for a sample solution used for detection and quantification of polyethylene glycol-modified interferon- ⁇ .
  • Non-patent Document 3 a method for removing a protein having a sugar chain
  • Patent Documents 2 to 4 describe the use of PEG-modified IFN- ⁇ for medical purposes.
  • PEG-modified IFN- ⁇ for medical purposes, specific doses and usages are described.
  • a method for measuring the content of PEG-modified IFN- ⁇ capable of high-sensitivity and multi-analyte treatment for a large number of sample solutions collected from a living body in clinical trials is essential.
  • Patent Document 5 and Non-Patent Document 3 describe methods for removing unnecessary proteins. From a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist, PEG-modified IFN- There is no description of how to remove PEG-unmodified IFN- ⁇ which affects the detection of ⁇ , nor is there a description of the appropriate pH suitable for that method.
  • the present inventors added an acid to a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexisted, and adjusted the pH of the sample solution to pH ⁇
  • a pretreatment method for selectively reducing IFN- ⁇ relative to PEG-modified IFN- ⁇ by removing aggregated proteins after adjusting to a range of 0.10 to pH 0.50, and completing the present invention It came to.
  • the present invention is a pretreatment method of a sample solution used for detection and quantification of PEG-modified IFN- ⁇ , and an acid is added to the sample solution to adjust the pH of the sample solution to pH-0.10 to pH0.50.
  • a pretreatment method is provided which makes it possible to remove ⁇ .
  • the pretreatment method may include a sugar chain-modifying substance removing step of contacting the sample solution with a sugar chain-binding protein immobilization carrier and removing a substance that binds to the sugar chain-binding protein immobilization carrier.
  • the sugar chain-binding protein is preferably a lectin, and more preferably a lectin is concanavalin A.
  • the detection sensitivity of PEG-modified IFN- ⁇ is increased, and accurate quantification can be realized.
  • the PEG modified IFN- ⁇ is preferably PEG modified IFN- ⁇ having no sugar chain.
  • the sample solution is preferably a biological sample solution, and more preferably the biological sample solution is blood, plasma, serum or ascites.
  • the present invention provides a pretreatment step in which a sample solution is pretreated by the pretreatment method, and a detection for immunologically or biologically detecting PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution pretreated in the pretreatment step.
  • PEG-modified IFN- ⁇ can be specifically detected with high sensitivity.
  • the present invention also includes a pretreatment step for pretreating a sample solution by the pretreatment method, and immunologically or biologically detecting PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution pretreated in the pretreatment step. And a measurement step of measuring the content of the PEG-modified IFN- ⁇ , and a method for quantifying PEG-modified IFN- ⁇ in a sample solution.
  • PEG-modified IFN- ⁇ is specifically detected with high sensitivity, and PEG-modified IFN- ⁇ is accurately quantified without being affected by PEG-unmodified IFN- ⁇ . it can.
  • the present invention relates to an acid used for acid-treating a sample solution in the acid treatment step, and an anti-IFN- ⁇ antibody used for detecting PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution in the detection step, Selected from the group consisting of a virus capable of infecting IFN-sensitive cells, an expression vector incorporating a reporter gene under the control of an IFN stimulation response region, and a transformed cell incorporating a reporter gene under the control of an IFN stimulation response region
  • a PEG-modified IFN- ⁇ detection kit comprising one or more kit components.
  • the present inventors added acid to a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist, thereby adjusting the pH of the sample solution.
  • a pretreatment method for selectively reducing IFN- ⁇ relative to PEG-modified IFN- ⁇ was found by removing the aggregated protein after adjusting to 3 or less, and the present invention was completed.
  • the present invention is a pretreatment method of a sample solution used for detection and quantification of PEG-modified IFN- ⁇ , and an acid treatment step of adjusting the pH of the sample solution to 3 or less by adding an acid to the sample solution;
  • An aggregated protein removal step for removing the protein aggregated in the acid treatment step from the sample solution, and before removing PEG-unmodified IFN- ⁇ that affects the detection of PEG-modified IFN- ⁇ .
  • the pretreatment method of the present invention removes PEG-unmodified IFN- ⁇ that affects detection of PEG-modified IFN- ⁇ from a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist. Therefore, PEG-modified IFN- ⁇ can be specifically detected, and the content can be accurately quantified.
  • the pretreatment method of the sample solution used for detection and quantification of PEG-modified IFN- ⁇ of the present invention adjusts the pH of the sample solution to a range of pH-0.10 to pH0.50 by adding acid to the sample solution.
  • a non-PEG-modified IFN- ⁇ that affects the detection of PEG-modified IFN- ⁇ , and an acid-treating step that removes the protein aggregated in the acid treatment step from the sample solution It is possible to make it possible.
  • PEG-unmodified IFN- ⁇ means IFN- ⁇ that is not PEG-modified, and is used separately from “PEG-modified IFN- ⁇ ”.
  • the above PEG-unmodified IFN- ⁇ has not only the same amino acid sequence as that of naturally occurring IFN- ⁇ (hereinafter referred to as “natural IFN- ⁇ ”), but also natural IFN- ⁇ .
  • Amino acid of IFN- ⁇ having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence, and having biological activity as IFN- ⁇ (hereinafter referred to as “IFN activity”) Includes variants.
  • PEG-unmodified IFN- ⁇ amino acid mutants include, for example, an IFN- ⁇ mutation in which the first methionine of the amino acid sequence of human IFN- ⁇ is deleted and the 17th cysteine is replaced with serine
  • the body is betaferon (registered trademark).
  • the above-mentioned PEG-unmodified IFN- ⁇ includes PEG-unmodified IFN- ⁇ having a sugar chain (including IFN- ⁇ in which the sugar chain of natural type IFN- ⁇ is modified) and PEG having no sugar chain. Unmodified IFN- ⁇ is also included.
  • the above-mentioned PEG-unmodified IFN- ⁇ also includes recombinant IFN- ⁇ produced by gene recombination technology based on the amino acid sequence or base sequence of natural IFN- ⁇ .
  • PEG-modified IFN- ⁇ is a molecule in which one molecule or two or more molecules of PEG are covalently bonded to one molecule of the above-mentioned PEG-unmodified IFN- ⁇ , and has IFN activity. Or one having two or more PEG-unmodified IFN- ⁇ molecules covalently bonded to one molecule of PEG and having IFN activity Preferably, one molecule or two or more molecules of PEG are covalently bonded to one molecule of the above-mentioned non-PEG-modified IFN- ⁇ and have IFN activity.
  • the PEG-modified IFN- ⁇ may be one in which the above IFN- ⁇ and PEG are directly bound, or may be bound via a linker or the like.
  • PEG-modified IFN- ⁇ is also called a covalent conjugate of IFN- ⁇ and PEG, IFN- ⁇ chemically modified with PEG, PEGylated IFN- ⁇ , or PEG-conjugated IFN- ⁇ .
  • Examples of the covalent bond site between IFN- ⁇ and PEG in PEG-modified IFN- ⁇ include, for example, the amino group, thiol group, N-terminus, C-terminus or sugar chain of IFN- ⁇ , and a known gene group Unnatural amino acids introduced into IFN- ⁇ using a replacement technique can also be used as a covalent binding site.
  • the PEG-modified IFN- ⁇ is a molecule in which one molecule or two or more molecules of IFN- ⁇ are covalently bonded to one molecule of PEG
  • the molecular weight of one molecule of PEG is 5, 000 or more and 520,000 or less are preferable, 10,000 or more and 200,000 or less are more preferable, and 39,000 or more and 45,000 or less are more preferable.
  • PEG is expressed by an average molecular weight because one molecule is composed of a large number of repeating units, and the molecular weight of PEG is generally different for each molecule. Therefore, the molecular weight of PEG in this specification means the average molecular weight.
  • PEG-modified IFN- ⁇ PEG-conjugated IFN- ⁇ is extracted from tissue, protein synthesis using genetic recombination technology, biological production using natural cells or recombinant cells that express IFN- ⁇ It may be obtained using a known method such as Further, as IFN- ⁇ , commercially available IFN- ⁇ may be used.
  • a sample solution pretreatment method comprising an acid treatment step and an aggregated protein removal step is performed by using a protein other than PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution ⁇ PEG-unmodified IFN- ⁇ (PEG-unmodified IFN having a sugar chain). Including both ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ having no sugar chain).
  • PEG-modified IFN- ⁇ may have a sugar chain or may not have a sugar chain.
  • the sample solution pretreatment method further includes a sugar chain-modifying substance removing step of contacting the sample solution with the sugar chain-binding protein-immobilized carrier and removing a substance that binds to the sugar chain-binding protein-immobilized carrier. Is preferred.
  • PEG-unmodified IFN- ⁇ having a sugar chain contained in the sample solution can be removed.
  • the ratio of the content of non-PEG-modified IFN- ⁇ to the content of PEG-modified IFN- ⁇ in the medium can be further reduced.
  • the sugar chain modifying substance removing step removes the protein having sugar chains from the sample solution, when the sugar chain modifying substance removing step is performed, PEG-modified IFN- ⁇ is PEG-modified IFN- having no sugar chain. ⁇ is preferred.
  • Examples of the PEG-modified IFN- ⁇ having a sugar chain include a covalent conjugate of natural IFN- ⁇ and PEG, or a covalent conjugate of IFN- ⁇ and PEG expressed in animal cells (eg, CHO cells). Is mentioned.
  • Examples of PEG-modified IFN- ⁇ having no sugar chain include a covalent conjugate of IFN- ⁇ expressed in E. coli and PEG.
  • PEG-modified IFN- ⁇ may be prepared by the following method. For example, a method of covalently bonding PEG to the amino group of IFN- ⁇ (for example, a method described in US Pat. No. 4,917,888 and International Publication No. 1987/00056), a method of covalently bonding PEG to the thiol group of IFN- ⁇ (For example, the method described in International Publication No. 1999/55377), a method for covalently bonding a polymer to the N-terminus of IFN- ⁇ (for example, the method described in International Publication No.
  • the terminal may be a PEG derivative activated with hydroxysuccinimide ester, nitrobenzenesulfonate ester, maleimide, orthopyridyl disulfide, vinyl sulfone, maleimide, iodoacetamide, carboxylic acid, azide, phosphine or amine structure.
  • PEG-modified IFN- ⁇ include a covalent conjugate of human IFN- ⁇ and PEG.
  • PEG-modified IFN- ⁇ prepared by the method described in Japanese Patent No. 4850514 Can be mentioned.
  • the binding site of PEG in human IFN- ⁇ the amino group of the 19th or 134th lysine in the amino acid sequence of human IFN- ⁇ is preferable, and PEG-modified IFN in which one molecule of PEG is covalently bonded to this site - ⁇ is more preferred.
  • 134th lysine of the amino acid sequence of human IFN- ⁇ means that the N-terminal amino acid (methionine) of the amino acid sequence of human IFN- ⁇ consisting of 166 amino acids (SEQ ID NO: 1) is number 1.
  • sample solution means a liquid sample containing water or an organic solvent as a main solvent.
  • the sample solution may be any sample solution as long as the pH can be adjusted in the range of pH-0.10 to pH 0.50 by adding an acid, and may or may not contain a biological substance.
  • a buffer solution is preferable, and examples thereof include physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, acetate buffer, and phosphate buffered saline.
  • a biological sample solution is preferable.
  • the “biological sample solution” means a liquid sample containing water as a main solvent prepared from tissues collected from mammals, blood and excreta.
  • blood, plasma, serum, ascites lymph, urine, body cavities such as abdominal cavity and digestive tract, and supernatant after centrifugation of homogenates such as feces and tissue fragments.
  • blood, plasma, serum or ascites and more preferred is plasma or serum.
  • mammals from which the biological sample solution is derived include humans, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, and the like, with humans being particularly preferred.
  • the “acid treatment step” is a step of adding an acid to the sample solution, and the acid used in the acid treatment step has a pH of ⁇ 0.10 or more when added to the sample solution.
  • Any acid that can be adjusted to a pH range of 0.50 and can aggregate or precipitate proteins in the sample solution other than PEG-modified IFN- ⁇ for example, inorganic acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid, sulfophthalic acid, or sulfosalicylic acid Examples include strongly acidic organic acids such as citric acid, or weakly acidic organic acids such as citric acid, acetic acid (including glacial acetic acid) or formic acid, and hydrochloric acid, nitric acid or sulfuric acid is preferred.
  • the acid may be the acid itself or a diluted acid. Examples of the diluted acid include 2M to 6M hydrochloric acid.
  • the acid may be an acidic buffer containing the acid or a salt of the acid.
  • the acid treatment step preferably adjusts the pH of the sample solution to a range of pH-0.10 to pH 0.50, and the pH of the sample solution is pH-0.10 to pH 0.32. It is more preferable to adjust to the range, and it is particularly preferable to adjust the pH of the sample solution to 0.17.
  • hydrochloric acid is preferably added to adjust the pH of the sample solution to a range of pH-0.10 to pH0.50, and the pH of the sample solution is adjusted to pH-0.10. It is more preferable to adjust to the range of ⁇ pH 0.32, and it is particularly preferable to adjust the pH of the sample solution to 0.17.
  • the aggregation of the protein in the sample solution generated by the acid treatment step can generally be confirmed by white turbidity when the protein in the sample solution is large, immediately after adding the acid to the sample solution and mixing. It may become cloudy. When there is little protein in a sample solution, cloudiness may not be confirmed. Aggregation of proteins in the sample solution can be induced by incubation for several minutes to several tens of minutes after adding an acid to the sample solution. In this case, the cloudiness may occur or the cloudiness may not be confirmed.
  • the incubation time is about 1 second to 2 hours, preferably about 1 second to 30 minutes, and more preferably about 1 second to 15 minutes.
  • Proteins aggregated by the acid treatment step are proteins other than PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution, and include PEG-unmodified IFN- ⁇ (PEG-unmodified IFN- ⁇ having a sugar chain and sugar chains).
  • PEG-unmodified IFN- ⁇ PEG-unmodified IFN- ⁇ having a sugar chain and sugar chains.
  • contaminating proteins derived from the biological sample solution are included in the aggregated protein.
  • the aggregated protein removal step for removing the protein aggregated in the acid treatment step from the sample solution may be any method as long as the aggregated protein can be removed.
  • the sample solution is centrifuged to remove the precipitate (recovering the supernatant) (pelleting method) or filtered through a filter that can separate the protein (solid) aggregated from the sample solution and the liquid.
  • examples include a method of collecting the filtrate, and a method of removing the precipitate by centrifugation (collecting the supernatant) is preferable. Centrifugation may be performed at a centrifugal force of 10,000 to 40,000 ⁇ g for about 5 to 10 minutes.
  • the pH of the sample solution after the acid treatment step is adjusted to a range of pH-0.10 to pH0.50, so that the pH of the sample solution is around neutral (specifically, pH 5 to It is preferable to perform a neutralization step of adjusting to 8, preferably 5 to 7, more preferably pH 5 to 6, and more preferably pH 6).
  • the neutralization step may be a step performed before or after the aggregated protein removing step.
  • the neutralization step may be a step performed after the sugar chain modifying substance removing step.
  • the pretreatment method includes a pretreatment method including a neutralization step before the aggregated protein removal step, a pretreatment method including a neutralization step after the aggregated protein removal step, or a sugar chain modifying substance removal step.
  • a pretreatment method including a neutralization step is preferable, and a pretreatment method including a neutralization step after the aggregated protein removing step is more preferable.
  • C-type lectin which shows affinity for galactose
  • Lodae lectin which forms a large family in the plant legumes, and has structural similarities to legume lectins and is involved in animal cell transport
  • L-type lectin "P-type lectin” that binds to lysosomal enzymes in cells
  • Annexin that binds to acidic sugar chains such as glycosaminoglycan, immunoglobulin superfamily It is classified as a “type I lectin”.
  • WFA Wood Fuji lectin
  • WGA common wheat lectin
  • ConA Tortana bean lectin
  • LCA lentil lectin
  • WGA bread wheat lectin
  • PNA peanut lectin
  • the sugar chain binding protein can be immobilized on the above support carrier using a conventional method according to the support carrier.
  • the amount of the sugar chain binding protein to be immobilized is usually 0.0001 mg to 100 mg / mL, preferably 0.01 mg to 20 mg / mL.
  • the carrier is an agarose gel, it can be activated with CNBr and then coupled to the sugar chain binding protein.
  • a sugar chain binding protein may be immobilized on a gel into which an activation spacer is introduced.
  • the sugar chain-binding protein may be immobilized on a gel into which a formyl group has been introduced and then reduced with NaCNBH 3 .
  • a commercially available activated gel such as NHS-Sepharose (manufactured by GE Healthcare Bioscience) may also be used.
  • the sugar chain-binding protein-immobilized carrier may be a commercially available product, for example, ConA Sepharose 4B (GE Healthcare Bioscience) or Glycoprotein Isolation Kit, WGA (Thermo Scientific). .
  • the protein having a sugar chain in the sample solution binds to the sugar chain-binding protein-immobilized carrier. It can be removed from the liquid.
  • the protein having a sugar chain that can be removed in this sugar chain modifying substance removing step includes PEG-unmodified IFN- ⁇ having a sugar chain derived from a living body. Therefore, by adding this step, particularly when a biological sample solution is used, the ratio of the content of PEG-unmodified IFN- ⁇ to the content of PEG-modified IFN- ⁇ can be further reduced.
  • this sugar chain modifying substance removal step is not suitable as a pretreatment for detecting and measuring the content of PEG-modified IFN- ⁇ having a sugar chain.
  • the sugar chain-binding protein immobilization carrier may be used in combination of a plurality of types of sugar chain-binding protein immobilization carriers.
  • the sample solution may be contacted multiple times with one kind of sugar chain-binding protein-immobilized carrier. For example, the sample solution is preferably brought into contact with the ConA immobilization carrier twice.
  • the method for removing the sugar chain modification product in the sample liquid by contacting the sample liquid with the sugar chain-binding protein-immobilized carrier used in the sugar chain modifying substance removing step can be carried out by a known general method.
  • the sample solution was added to a ConA affinity column filled with ConA-immobilized Sepharose in a disposable polypropylene spin column that can be filled with a carrier, and mixed by inverting at room temperature for about 10 to 30 minutes, and then obtained by centrifugation.
  • a method of collecting the filtrate is mentioned.
  • a commercially available sugar chain-binding protein immobilization carrier or a kit thereof it may be performed according to the attached instructions.
  • the amount of the sample solution required for the above pretreatment method depends on the content of PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution to be used and the detection and measurement method, but may be 1 ⁇ L to 10 mL.
  • the method for detecting PEG-modified IFN- ⁇ of the present invention includes a pretreatment step in which a sample solution is pretreated by the pretreatment method described above, and PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution pretreated in the pretreatment step is immunized.
  • a method for quantitatively detecting PEG-modified IFN- ⁇ according to the present invention includes a method for detecting PEG-modified IFN- ⁇ in a sample solution, A pretreatment step in which the sample solution is pretreated by the pretreatment method, and PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution pretreated in the pretreatment step is detected immunologically or biologically. And a measuring step for measuring the content.
  • the sample solution pretreated by the above pretreatment method may be subjected to the above neutralization step before immunologically or biologically detecting PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution, or may be subjected to an appropriate buffer. It may be diluted with a solution or the like (for example, a buffer used in an immunological detection system, a cell culture medium used in a biological detection system, etc.). This may be appropriately performed in consideration of the characteristics of a method for immunologically detecting or biologically detecting PEG-modified IFN- ⁇ .
  • Specific examples of the method for detecting PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution pretreated by the above pretreatment method and the method for measuring the content include the following methods.
  • Examples of the immunological detection method and the content measurement method include ELISA (enzyme immunoassay method) using an antibody that specifically recognizes IFN- ⁇ .
  • the ELISA method can be performed, for example, by the following method.
  • the sample solution pretreated by the above pretreatment method is added to the well of the plate on which the anti-IFN- ⁇ polyclonal antibody is immobilized, and the PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution is bound to the polyclonal antibody.
  • An anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody labeled with an enzyme such as Horseradish Peroxidase (hereinafter referred to as “HRP”) is added to the well of the plate and allowed to bind to PEG-modified IFN- ⁇ .
  • HRP Horseradish Peroxidase
  • the ELISA method can also be carried out by using a commercially available kit such as a human interferon- ⁇ ELISA kit (manufactured by Kamakura Technoscience).
  • Examples of the biological detection method and the content measurement method include the CPE method (cytopathic effect measurement method) in which IFN activity can be measured using the antiviral activity of IFN- ⁇ as an index. Specifically, after the sample solution pretreated by the above pretreatment method is allowed to act on cells highly sensitive to IFN (hereinafter referred to as “IFN sensitive cells”) (for example, FL cells), these cells are used.
  • IFN sensitive cells for example, FL cells
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • IFN- ⁇ infectious Sindbis virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • the PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution is detected by measuring IFN activity by measuring the degree, ie antiviral activity. Further, the content of PEG-modified IFN- ⁇ is measured using the numerical value of IFN activity as an index.
  • Antiviral activity is measured using suppression of virus growth as an indicator, and the dilution ratio of the sample that inhibits 50% of the cytopathic effect (abbreviated as CPE) that destroys cells as a result of virus growth.
  • CPE cytopathic effect
  • IFN titer (U) is calculated (Kobayashi et al., “Immunobiochemistry Experimental Method (Second Life Chemistry Experiment Course 5)”, edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, 1986, p. 245).
  • reporter assay a method called reporter assay.
  • luciferase is expressed under the control of an interferon stimulation response region (IFN Sensitive Response Element; abbreviated as ISRE) present in the promoter region of interferon response gene 15 (Interferon-Stimulated Gene15; abbreviated as ISG15).
  • ISRE interferon stimulation response region
  • ISG15 Interferon-Stimulated Gene15
  • PEG-modified IFN- ⁇ in the sample solution is detected by measuring IFN activity using the amount of luciferase expressed by the cells into which the reporter gene is introduced as an index. Further, the content of PEG-modified IFN- ⁇ is measured using the numerical value of IFN activity as an index.
  • IFN interferon stimulation response region
  • ISG15 Interferon-Stimulated Gene15
  • the above-mentioned ELISA method or CPE method is preferred, and a simple measurement reagent in the form of a kit
  • the ELISA method provided as is more preferred.
  • the PEG-modified IFN- ⁇ kit of the present invention comprises an acid used for adjusting the pH of the sample solution in the acid treatment step to a range of pH-0.10 to pH 0.50, and an acid in the sample solution in the detection step.
  • Anti-IFN- ⁇ antibody used for detecting PEG-modified IFN- ⁇ virus capable of infecting IFN-sensitive cells, expression vector incorporating a reporter gene under the control of IFN-stimulated response region, and IFN-stimulated response region
  • kit components selected from the group consisting of transformed cells in which a reporter gene under the control of is incorporated into a chromosome.
  • the PEG-modified IFN- ⁇ kit may further contain an alkali and sugar chain-binding protein immobilization carrier used for adjusting the pH of the sample solution to around neutral in the neutralization step.
  • region may be included as a component.
  • Example 1 Production of PEG-modified IFN- ⁇ As PEG-modified IFN- ⁇ , a covalent conjugate of recombinant human IFN- ⁇ and PEG was prepared. “Recombinant Human IFN- ⁇ ” is described in Nucleic Acid Research, 1980, Vol. 8, p. 4057-4074 (hereinafter referred to as “recombinant human IFN- ⁇ ”). Since this recombinant human IFN- ⁇ is expressed in E. coli, it does not have a sugar chain.
  • Elution was performed by continuously increasing the solvent B feed ratio from 0% to 65% while passing the mixed solution of the solvents A and B by 40 times the resin amount of the cation exchange column. .
  • the eluted fraction was further applied to an SP-5PW column (manufactured by Tosoh Corporation), and a PEG having a molecular weight of 42,000 was added to the amino group of the 134th lysine of the amino acid sequence of recombinant human IFN- ⁇ (SEQ ID NO: 1).
  • SP-5PW column manufactured by Tosoh Corporation
  • PEG-modified human IFN- ⁇ was isolated, in which one molecule was covalently bound.
  • the obtained PEG-modified human IFN- ⁇ does not have a sugar chain.
  • Example 2 Removal of PEG-unmodified IFN- ⁇ by pretreatment comprising an acid treatment step and a sugar chain modifying substance removal step: 1.
  • Experimental procedure Blood was collected from healthy adults, and serum was prepared by a conventional method. Serum samples were prepared by adding natural human IFN- ⁇ ⁇ Feron (registered trademark; manufactured by Toray Industries, Inc.) ⁇ , or recombinant human IFN- ⁇ or PEG-modified human IFN- ⁇ prepared in Example 1, respectively. .
  • the aggregate formed in the acid treatment step is centrifuged with a cooling centrifuge (MX-150, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd., rotor type: TMP-11) ⁇ 4 ° C., 15,000 rpm (37,740 ⁇ g). 5 minutes ⁇ and allowed to settle (aggregated protein removal step).
  • a cooling centrifuge MX-150, manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd., rotor type: TMP-11
  • ⁇ 4 ° C. 15,000 rpm (37,740 ⁇ g). 5 minutes ⁇ and allowed to settle (aggregated protein removal step).
  • To 300 ⁇ L of the collected supernatant 8M sodium hydroxide and pH adjusting phosphoric acid solution ⁇ 150 g / L disodium hydrogen phosphate 12 hydrate, 30 g / L potassium dihydrogen phosphate, 0.005% Tween 20 (registered trademark) ) Containing aqueous solution (pH 6.0) ⁇ was added to adjust the pH
  • measurement sample A a serum sample having an acid treatment step and not subjected to pretreatment was used as a control sample (containing natural human IFN- ⁇ , recombinant human IFN- ⁇ or PEG-modified human IFN- ⁇ ).
  • ConA immobilization carrier was used as the sugar chain-binding protein immobilization carrier.
  • the ConA Sepharose 4B was washed twice with PBS, and the solvent was replaced.
  • the ConA affinity column was added 250 ⁇ L of measurement sample A to the ConA affinity column, mix by inverting at room temperature for about 30 minutes, and then use a low-speed cooling centrifuge (RLX-135, Tommy Seiko Co., Ltd., rotor type: TS-39). Then, centrifugation ⁇ 4 ° C., 5,000 rpm (5,340 ⁇ g), 5 minutes ⁇ was performed to obtain a filtrate (sugar chain modifying substance removing step). The obtained filtrate was designated as measurement sample B.
  • a wash buffer containing 1 g / L BSA ⁇ 11.7 g / L sodium chloride, 7.44 g / L disodium hydrogen phosphate.12 hydrate, 12.4 g / L phosphorus Substitution with sodium dihydrogen diacid dihydrate and an aqueous solution containing 0.05% Tween 20 (registered trademark) ⁇ for about 2 hours at room temperature or overnight in a refrigerator (temperature range: 4 ⁇ 3 ° C.) 15-26 hours) blocked. After blocking, it was stored refrigerated (temperature range: 4 ⁇ 3 ° C.) and used within 5 days from the day of blocking. At the time of use, the water in the well was removed, and this was used as an ELISA plate.
  • Goat IgG (manufactured by Beckman Coulter) was added to the measurement samples A and B and the control sample for the purpose of blocking nonspecific binding of the goat-derived anti-human IFN- ⁇ polyclonal antibody to the serum protein (final concentration). 125 ⁇ g / mL), the measurement samples A and B and the control sample were added to the ELISA plate at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for about 1 hour. As a background well, a well containing serum (no addition of IFN- ⁇ ) was provided.
  • the detection and quantification of PEG-modified IFN- ⁇ was performed using the amount of luminescence as an index.
  • the substrate solution was SuperSignal ELISA Femto Luminol / Enhancer Solution (Pierce Biotechnology) and SuperSignal Femto Stable Peroxidase Solution (Pierce Bio).
  • the substrate solution was added to the ELISA plate at 100 ⁇ L / well, and the light intensity (unit: count) per integration time of 2 minutes was measured with a luminescence photometer (E6521, manufactured by Promega). The value obtained by subtracting the background well count from the count of wells to which each sample was added was used as the light emission amount of each sample.
  • results are shown in FIGS.
  • the vertical axis of the figure shows the amount of luminescence (count), and the horizontal axis shows the concentration (pg / mL) of natural human IFN- ⁇ , recombinant human IFN- ⁇ or PEG-modified human IFN- ⁇ added to the serum sample.
  • the effect of the pretreatment including the acid treatment step is shown in FIG. 1, and the effect of the pretreatment including the acid treatment step and the sugar chain modifying substance removal step is shown in FIG.
  • control sample naturally human IFN- ⁇
  • control samples containing recombinant human IFN- ⁇ or PEG-modified human IFN- ⁇ are shown.
  • the description in parentheses of “measurement sample A” and “measurement sample B” in the figure has the same meaning as the description in parentheses of “control sample”.
  • measurement sample A naturally human IFN- ⁇
  • measurement sample A recombinant human IFN- ⁇
  • amount of luminescence of measurement sample A decreased to 20% or less and 10% or less of the control sample, respectively.
  • no decrease in the amount of luminescence of measurement sample A PEG-modified human IFN- ⁇ was observed (FIG. 1). Therefore, it was shown that pretreatment with an acid treatment step reduces natural human IFN- ⁇ and recombinant human IFN- ⁇ in serum, but does not change PEG-modified human IFN- ⁇ .
  • measurement sample B naturally human IFN- ⁇
  • measurement sample B recombinant human IFN- ⁇
  • amount of luminescence of measurement sample B decreased to 1% or less and 5% or less, respectively, of the control sample.
  • almost no decrease in the amount of luminescence of measurement sample B was observed (FIG. 2). Therefore, pretreatment including an acid treatment step and a sugar chain modifier removal step significantly reduces serum natural human IFN- ⁇ and recombinant human IFN- ⁇ , but does not change PEG-modified human IFN- ⁇ . Indicated.
  • PEG that affects the detection of PEG-modified IFN- ⁇ is performed by performing pretreatment including an acid treatment step on a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist. It has been shown that unmodified IFN- ⁇ can be reduced and eliminated. In addition, it has been clarified that the effect is further enhanced by performing a sugar chain modifying substance removing step.
  • Example 3 PEG-unmodified IFN- ⁇ in a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist by a pretreatment including an acid treatment step and a sugar chain modifying substance removal step Reduction: 1.
  • Experimental procedure Blood was collected from healthy adults, and serum was prepared by a conventional method.
  • the relative absorbance decrease (%) was 14.0% and 10.0%, respectively, 20% Was less than. Therefore, it was shown that when the amount of 6M hydrochloric acid added was 40% or less of the total volume, the content of PEG-modified human IFN- ⁇ was not substantially affected by the acid treatment step. On the other hand, when 6M hydrochloric acid was added to 50% and 75% of the total volume and the acid treatment step was performed, the relative absorbance decrease (%) was 35.7% and 72.6%, respectively. It was shown that the acid treatment step reduces the content of PEG-modified human IFN- ⁇ .
  • Example 5 Upper limit of pH in acid treatment step: 1.
  • Experimental method Serum (manufactured by Kojin Bio, lot number: BJ4734A) is combined with the recombinant human IFN- ⁇ prepared in Example 1 (final concentration 1500 pg / mL) and PEG-modified human IFN- ⁇ (final concentration 1500 pg / mL).
  • the added serum sample was prepared as a sample solution.
  • the aggregate formed by the acid treatment step is centrifuged with a cooling centrifuge (MX-307, Tommy Seiko Co., Ltd., rotor type: AR015-24) ⁇ 4 ° C., 15,000 rpm (20,400 ⁇ g) 5 minutes ⁇ and allowed to settle (aggregated protein removal step).
  • a cooling centrifuge MX-307, Tommy Seiko Co., Ltd., rotor type: AR015-24
  • PEG-modified human IFN- ⁇ prepared in Example 1 was added to the serum to a final concentration of 400, 800, 1600, 3200, 4800, 6400 pg / mL, and 6M hydrochloric acid was added to 20% of the total volume.
  • Serum samples that had been pretreated with an acid treatment step by adding 5%, 15%, or 12.5% were simultaneously measured as standard samples for preparing a calibration curve.
  • Wash buffer ⁇ 11.7 g / L sodium chloride, 7.44 g / L disodium hydrogen phosphate 12 hydrate, 12.4 g / L sodium dihydrogen phosphate dihydrate, and 0.05% HRP labeled anti-human IFN- ⁇ monoclonal antibody in which anti-human IFN- ⁇ monoclonal antibody (manufactured by Yamasa Shoyu Co., Ltd.) was labeled with HRP after washing in the wells with an aqueous solution containing Tween 20 (registered trademark) three times.
  • Tween 20 registered trademark
  • ELISA POD substrate TMB solution (Easy) (manufactured by Nacalai Tesque) was added to the ELISA plate at 100 ⁇ L / well, allowed to stand at room temperature for 15 to 45 minutes, and then 0.5 M sulfuric acid was added to the ELISA plate at 100 ⁇ L / well. Addition to stop color development. Absorbance (measurement wavelength: 450 nm) was measured with a microplate reader (Model 680 Microplate Reader, manufactured by Bio-Rad).
  • Example 6 PEG-unmodified IFN- ⁇ in a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist by a pretreatment including an acid treatment step using plural kinds of acids Reduction: 1. Experimental Method Recombinant human IFN- ⁇ (1500 pg / mL) and PEG-modified human IFN- ⁇ (final concentration 1500 pg / mL) prepared in Example 1 were added to serum (manufactured by Kojin Bio, lot number: BJ4734A). Serum samples were prepared and used as sample solutions.
  • the PEG-modified human IFN- ⁇ prepared in Example 1 was added to the serum to a final concentration of 400, 800, 1600, 3200, 4800, 6400 pg / mL, and an acid treatment step using 6M nitric acid or sulfuric acid was performed.
  • the pretreated serum sample was simultaneously measured as a standard sample for preparing a calibration curve.
  • Results The results are shown in Table 4.
  • the theoretical value indicates the concentration of PEG-modified human IFN- ⁇ added to the serum sample, and the measured value is the concentration obtained by measuring the PEG-modified human IFN- ⁇ concentration of the measurement sample subjected to pretreatment with an acid treatment step by ELISA. Indicates.
  • the pretreatment method of the present invention removes PEG-unmodified IFN- ⁇ that affects detection of PEG-modified IFN- ⁇ from a sample solution in which PEG-modified IFN- ⁇ and PEG-unmodified IFN- ⁇ coexist. be able to.
  • the PEG-modified IFN- ⁇ detection method and quantification method and the PEG-modified IFN- ⁇ detection kit of the present invention include the content of PEG-modified IFN- ⁇ in a sample solution collected from a living body after administration of PEG-modified IFN- ⁇ . Can be used to measure

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Abstract

　本発明は、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βとポリエチレングリコール非修飾のインターフェロン－βとが共存する試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βを検出及び定量するための試料液の前処理方法を提供することを目的としている。本発明は、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程と、を備える、前処理方法を提供する。

Description

ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出方法及び定量方法
　本発明は、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法、検出方法及び定量方法に関する。
　インターフェロン－β（以下「ＩＦＮ－β」と言う）は、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性や免疫調節活性等を有するタンパク質であり、慢性Ｂ型肝炎治療薬、慢性Ｃ型肝炎治療薬、癌治療薬及び多発性硬化症治療薬としての用途が広く知られている。
　また、ＩＦＮ－βとポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と言う）を共有結合することにより、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－β（以下「ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β」と言う）が得られることが報告されており（特許文献１及び２並びに非特許文献１）、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、生体内持続性が高いため、ＰＥＧ修飾されていないＩＦＮ－β（以下「ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β」と言う）と比べて少ない投与頻度で効果を発揮することが報告されている（特許文献２～４）。
　ここで、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する方法としては、従来のＩＦＮ－βの含有量を測定する方法と同じ方法で実施できることが知られており、例えば、ＩＦＮ－βを特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定方法）又は、抗ウイルス活性を指標としたＣＰＥ法（細胞変性効果測定方法）等で試料液中のＩＦＮ－βを検出できることが報告されている（特許文献３及び非特許文献２）。
　一方、タンパク質は、酸の添加やｐＨの変化により変性することが知られている。そのため、そのタンパク質の性質を利用して、試料液中に含まれるさまざまな夾雑タンパク質を除去し、試料液中の不要なタンパク質を低減するために、試料液を酸やアルカリ等で処理して精製を行う方法が知られており、また、目的のタンパク質を残して不要なタンパク質を低減させるためには、適切なｐＨを選択する必要があることが知られている。例えば、ＩＦＮ－βでは、中性緩衝液で夾雑タンパク質を除去した後、ｐＨ１．５～３の酸性緩衝液にて溶出を行う方法が報告されている（特許文献５）。さらに、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βでは、約ｐＨ３～６の緩衝液中にて安定であることが報告されている（特許文献６）。
　また、糖鎖を有するタンパク質の除去方法としては、糖鎖結合性タンパク質であるレクチンを固定化した担体に糖鎖を有するタンパク質を吸着させて除去する方法が報告されている（非特許文献３）。
米国特許第４９１７８８８号 特許第４８５０５１４号 国際公開第１９９９／０５５３７７号 国際公開第２０００／０２３１１４号 特開昭６１－２４２５９３号 特許第４６５８９６１号
Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００１年、第２９７巻、ｐ．１０５９－１０６６ Ｈｕら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１１年、第３３８巻、ｐ．９８４－９９６ Ｏｇａｔａら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７５年、第７８巻、ｐ．６８７－６９６
　このように、特許文献２～４にはＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを医療用途に用いることが記載されているが、実際にＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを医療用途に用いるにあたって、具体的な用量や用法を設定するためには、臨床試験において被験者に投与後、被験者から採取された試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの濃度、特に血中濃度の時間推移を把握することが重要である。そのためには、臨床試験で生体から採取された多数の試料液に対して、高感度かつ多検体処理が可能なＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する方法が必須となる。
　しかしながら、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを生体に投与した後、分析のために生体から採取された試料液には、投与されたＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β以外に、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βのＰＥＧが投与後に外れることにより生じたＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β及び生体由来のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βが共存した状態となっている。そのため、特許文献３及び非特許文献２に記載される測定方法を用いた場合、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを区別して測定できないために、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を正確に測定することは困難である。
　さらに、特許文献５及び非特許文献３では、不要なタンパク質を除去する方法が記載されているが、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βが共存する試料液から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除く方法についての記載はなく、その方法に適した適切なｐＨについての記載もない。
　すなわち、従来において、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βが共存する試料液から、試料液中に含まれるＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出してその含有量を正確に測定する測定方法及び、そのために必要な、試料液からＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除く前処理方法はこれまで知られていなかった。
　そこで本発明は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液中に存在するＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出及び定量するための試料液の前処理方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液に酸を加え、試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整した後に凝集したタンパク質を除去することにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βに対してＩＦＮ－βを選択的に低減させる前処理方法を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程とを備え、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除くことを可能とする前処理方法を提供する。
　上記の前処理方法は、上記試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、上記糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合する物質を除去する糖鎖修飾物質除去工程を備えていてもよく、上記の糖鎖結合性タンパク質は、レクチンであることが好ましく、レクチンはコンカナバリンＡであることがより好ましい。
　上記の糖鎖修飾物質除去工程を備えることで、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出感度が上がり、正確な定量を実現できる。
　上記の糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理方法において、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、糖鎖を有しないＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βであることが好ましい。
　上記の試料液は、生体試料液であることが好ましく、さらに、生体試料液については、血液、血漿、血清又は腹水であることがより好ましい。
　本発明は、上記前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、上記前処理工程で前処理した上記試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを免疫学的又は生物学的に検出する検出工程とを備える、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出方法を提供する。
　上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出方法によれば、高い感度でＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを特異的に検出することができる。
　また本発明は、上記前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、上記前処理工程で前処理した上記試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを免疫学的又は生物学的に検出し、上記ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する測定工程とを備える、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの定量方法を提供する。
　上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの定量方法によれば、高い感度でＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを特異的に検出し、ＰＥＧ非修飾ＩＦＮ－βの影響を受けることなく正確にＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを定量できる。
　さらに本発明は、上記酸処理工程で試料液を酸処理するために使用する酸と、上記検出工程で試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出するために使用する、抗ＩＦＮ－β抗体、ＩＦＮ感受性細胞に感染能を持つウイルス、ＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクター及びＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた形質転換細胞からなる群から選択される１以上のキット構成品と、を備える、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β検出キットを提供する。
　また、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液に酸を加え、試料液のｐＨを３以下に調整した後に凝集したタンパク質を除去することにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βに対してＩＦＮ－βを選択的に低減させる前処理方法を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨを３以下に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程とを備え、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除くことを可能とする前処理方法を提供する。
　本発明の前処理方法は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液中から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除くことができるため、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを特異的に検出でき、含有量を正確に定量することが可能となる。
血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β、天然型ＩＦＮ－β及びリコンビナントＩＦＮ－βに対する、酸処理工程を備える前処理による効果を示す図である。 血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β、天然型ＩＦＮ－β及びリコンビナントＩＦＮ－βに対する、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理による効果を示す図である。 血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－αに対する、酸処理工程を備える前処理による効果を示す図である。 血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βに対する、各容量の酸処理工程を備える前処理による効果を示す図である。
　本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法は、上記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、上記酸処理工程で凝集したタンパク質を上記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程とを備え、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除くことを可能とすることを特徴とする。
　本明細書においては、「ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β」とは、ＰＥＧ修飾されていないＩＦＮ－βを意味し、「ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β」とは区別して用いる。上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βは、天然に存在するＩＦＮ－β（以下「天然型ＩＦＮ－β」と言う）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型ＩＦＮ－βのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＩＦＮ－βとしての生物活性（以下「ＩＦＮ活性」と言う）を有するＩＦＮ－βのアミノ酸変異体を包含する。ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βのアミノ酸変異体としては、例えば、ヒト・ＩＦＮ－βのアミノ酸配列の第１番目メチオニンが欠失し、かつ第１７番目のシステインがセリンに置換されたＩＦＮ－β変異体であるベタフェロン（登録商標）が挙げられる。さらに、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βは、糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β（天然型ＩＦＮ－βの糖鎖が改変されたＩＦＮ－βも含む）及び糖鎖を有しないＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βをも包含する。また、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βは、天然型ＩＦＮ－βのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製されたリコンビナントＩＦＮ－βも包含する。
　「ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β」とは、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの１分子に対してＰＥＧの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、ＩＦＮ活性を有しているもの、又は、ＰＥＧの１分子に対して上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、ＩＦＮ活性を有しているもの、を意味するが、上記のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの１分子に対してＰＥＧの１分子又は２分子以上が共有結合したものであり、かつ、ＩＦＮ活性を有しているものが好ましい。ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、上記ＩＦＮ－βとＰＥＧとが直接結合したものであっても、リンカー等を介して結合したものであってもよい。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、ＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体、ＰＥＧで化学修飾したＩＦＮ－β、ＰＥＧ化ＩＦＮ－β又はＰＥＧ結合ＩＦＮ－βとも呼ばれるものである。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの、ＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合部位としては、例えば、ＩＦＮ－βのアミノ基、チオール基、Ｎ末端、Ｃ末端又は糖鎖が挙げられ、また、公知の遺伝子組換え技術を用いてＩＦＮ－βに導入した非天然アミノ酸も共有結合部位とすることができる。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βが、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの１分子に対してＰＥＧの１分子又は２分子以上が共有結合したものである場合、ＩＦＮ－βの１分子に結合するＰＥＧの分子量の合計は、５，０００以上２４０，０００以下が好ましく、１０，０００以上８０，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。ただし、ＩＦＮ－βの１分子に分子量２０，０００のＰＥＧの２分子が共有結合したＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βである場合は、ＩＦＮ－βの１分子に分子量４０，０００のＰＥＧが共有結合していることを意味する。
　また、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βが、ＰＥＧの１分子に対して、ＩＦＮ－βの１分子又は２分子以上が共有結合したものである場合であっても、ＰＥＧの１分子の分子量は、５，０００以上５２０，０００以下が好ましく、１０，０００以上２００，０００以下がより好ましく、３９，０００以上４５，０００以下がさらに好ましい。
　なお、ＰＥＧは、１個の分子が多数の繰り返しユニットからできており、ＰＥＧの分子量は個々の分子により異なるのが一般的であるため、平均分子量で表される。したがって、本明細書におけるＰＥＧの分子量とは、平均分子量の意味である。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの、ＰＥＧに結合したＩＦＮ－βは、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、ＩＦＮ－βを発現する天然細胞又は組換え細胞を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得られたものであってよい。また、ＩＦＮ－βとして、市販のＩＦＮ－βであってよい。
　酸処理工程及び凝集タンパク質除去工程を備えた、試料液の前処理方法は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β以外のタンパク質｛ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β（糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β及び糖鎖を有しないＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの両方）を含む｝を低減できる。ここで、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、糖鎖を有していても、糖鎖を有していなくてもよい。
　また、試料液の前処理方法は、さらに試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合する物質を除去する糖鎖修飾物質除去工程を備えることが好ましい。
　酸処理工程及び凝集タンパク質除去工程に加えて、糖鎖修飾物質除去工程を備えることにより、試料液中に含まれる糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを除去することができるため、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量に対するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの含有量の比率をさらに低下させることができる。ここで、糖鎖修飾物質除去工程は、試料液から糖鎖を有するタンパク質を除去するため、糖鎖修飾物質除去工程を行う場合、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、糖鎖を有しないＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βであることが好ましい。
　糖鎖を有するＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとしては、天然型ＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体、又は、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）にて発現させたＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体が挙げられる。糖鎖を有しないＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとしては、大腸菌にて発現させたＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体が挙げられる。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βは、以下の方法で作製されたものであってよい。例えば、ＩＦＮ－βのアミノ基にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第１９８７／０００５６号に記載の方法）、ＩＦＮ－βのチオール基にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、国際公開第１９９９／５５３７７号に記載の方法）、ＩＦＮ－βのＮ末端に高分子を共有結合する方法（例えば、国際公開第２０００／２３１１４号及び特開平９－２５２９８号に記載の方法）、ＩＦＮ－βの糖鎖にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７８年、第１７９巻、ｐ．３０１、米国特許第４１０１３８０号又は米国特許第４１７９３３７号に記載の方法）、ＩＦＮ－βに導入した非天然アミノ酸にＰＥＧを共有結合する方法（例えば、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、第１４巻、ｐ．５７４３－５７４５に記載の方法）、ＩＦＮ－βのＣ末端にＰＥＧを共有結合する方法（ＩＦＮ－βのＣ末端又はその近傍にシステインや非天然アミノ酸を導入することで可能）が挙げられる。なお、上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βのＰＥＧは、ＩＦＮ－βとの共有結合反応に使用する際には、その結合の方法に応じて、ＰＥＧの末端を活性化する必要があるが、ＰＥＧの末端がヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、マレイミド、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で活性化されたＰＥＧ誘導体であってよい。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの好ましい例としては、ヒト・ＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体を挙げることができ、例えば、特許第４８５０５１４号に記載された方法により作製されたＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βが挙げられる。ヒト・ＩＦＮ－βにおけるＰＥＧの結合部位としては、ヒト・ＩＦＮ－βのアミノ酸配列の第１９番目又は第１３４番目のリジンのアミノ基が好ましく、この部位にＰＥＧが１分子共有結合したＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βがより好ましい。具体的には、ヒト・ＩＦＮ－βのアミノ酸配列の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４０，０００以上（好ましくは、分子量４２，０００）のＰＥＧが１分子共有結合したＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを例示できる。
　ここで、「ヒト・ＩＦＮ－βのアミノ酸配列の１３４番目のリジン」とは、１６６アミノ酸からなるヒト・ＩＦＮ－βのアミノ酸配列（配列番号１）のＮ末端のアミノ酸（メチオニン）を１番としたときに、１３４番目に位置するアミノ酸であるリジンを意味する。すなわち、本明細書では、ＩＦＮ－βのＮ末端のアミノ酸を１番として、ＩＦＮ－βのアミノ酸残基の位置を表す。
　「試料液」とは、水又は有機溶剤を主たる溶媒とする液体状の試料を意味する。試料液は、酸を加えることによりｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整できるものであればよく、生物由来の物質を含まなくてもよいし、含んでもよい。生物由来の物質を含まない試料液としては、緩衝液が好ましく、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液又はリン酸緩衝生理食塩水等が挙げられる。生物由来の物質を含む試料液としては、生体試料液が好ましい。「生体試料液」とは、哺乳動物から採取される組織、血液や排泄物から調製される水を主たる溶媒とした液体状の試料を意味する。例えば、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、尿や、腹腔等の体腔や消化管等の洗浄液や、糞、組織片等のホモジネートの遠心分離後上清等が挙げられる。好ましくは、血液、血漿、血清又は腹水であり、さらに好ましくは、血漿又は血清である。
　また、生体試料液の由来である哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ又はサル等が挙げられるが、特にヒトが好ましい。
　上記の試料液の前処理方法において、「酸処理工程」とは、試料液に酸を加える工程であり、酸処理工程で使用する酸は、試料液に加えた時に、ｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整でき、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β以外の試料液中のタンパク質を凝集又は析出させることができる酸であればよく、例えば、塩酸若しくは硫酸等の無機酸、スルホフタル酸若しくはスルホサリチル酸クエン酸等の強酸性有機酸、又はクエン酸、酢酸（氷酢酸を含む）若しくはギ酸等の弱酸性有機酸が挙げられるが、塩酸、硝酸又は硫酸が好ましい。また、上記の酸は、酸そのもの又は希釈された酸であってもよく、希釈された酸としては、例えば、２Ｍ～６Ｍの塩酸が挙げられる。さらに、上記の酸は、該酸を含む酸性緩衝液又は該酸の塩であってもよい。
　上記の前処理方法において、酸処理工程は、試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整することが好ましく、試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．３２の範囲に調整することがより好ましく、試料液のｐＨを０．１７に調整することが特に好ましい。
　上記の前処理方法において、酸処理工程は、塩酸を加えて、試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整することが好ましく、試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．３２の範囲に調整することがより好ましく、試料液のｐＨを０．１７に調整することが特に好ましい。
　上記の前処理方法において、酸処理工程によって発生する試料液中タンパク質の凝集は、試料液中のタンパク質が多い場合は一般的には白濁することにより確認でき、試料液に酸を加え混合した直後に白濁する場合もある。試料液中のタンパク質が少ない場合は白濁を確認できない場合もある。試料液中のタンパク質の凝集は、試料液に酸を加えた後、数分～数十分間程度のインキュベーションにより誘導することも可能である。この場合、白濁する場合もあれば白濁を確認できない場合もある。インキュベーションの時間は、１秒～２時間程度であり、１秒～３０分間程度が好ましく、１秒～１５分間程度がより好ましい。酸処理工程により凝集したタンパク質は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β以外のタンパク質であり、それには、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β（糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－β及び糖鎖を有しないＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの両方）が含まれ、さらに生体試料液を用いた場合、生体試料液由来の夾雑タンパク質が凝集したタンパク質に含まれる。
　上記の前処理方法において、酸処理工程で凝集したタンパク質を試料液から除去する凝集タンパク質除去工程は、凝集したタンパク質を除去できる方法であればどのような方法でもよく、公知の一般的な方法を用いることができる。例えば、試料液を遠心分離して沈降物を除去（上清を回収）する方法（ペレッティング（ｐｅｌｌｅｔｉｎｇ）法）又は試料液を凝集したタンパク質（固体）と液体とを分離できるフィルターに通して濾過（濾液を回収）する方法等が挙げられるが、遠心分離して沈降物を除去（上清を回収）する方法が好ましい。遠心分離は、１０，０００～４０，０００×ｇの遠心力で５～１０分間程度行えばよい。
　上記の前処理方法において、酸処理工程後の試料液のｐＨはｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整されているため、試料液のｐＨを中性付近（具体的にはｐＨ５～８、好ましくはｐＨ５～７、より好ましくはｐＨ５～６、さらに好ましくはｐＨ６）に調整する中和工程を行うことが好ましい。中和工程は、凝集タンパク質除去工程の前に行う工程であってもよいし後に行う工程であってもよい。また、糖鎖修飾物質除去工程を備える場合、中和工程は、糖鎖修飾物質除去工程の後に行う工程であってもよい。
　すなわち、上記の前処理方法は、凝集タンパク質除去工程の前に中和工程を備える前処理方法、凝集タンパク質除去工程の後に中和工程を備える前処理方法、又は、糖鎖修飾物質除去工程の後に中和工程を備える前処理方法であることが好ましく、凝集タンパク質除去工程の後に中和工程を備える前処理方法であることがより好ましい。
　試料液のｐＨを中性付近（具体的にはｐＨ５～８、好ましくはｐＨ５～７、より好ましくはｐＨ５～６、さらに好ましくはｐＨ６）に調整する際に使用するアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム若しくは水酸化リチウム等のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸（水素）ナトリウム、炭酸（水素）カリウム等の炭酸（水素）塩、アンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム等が挙げられる。また、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの安定性や溶解性に影響しないものであれば、上記のアルカリは、該アルカリを含むアルカリ性緩衝液又は該アルカリの塩であってもよい。
　上記の前処理方法で前処理した試料液は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの安定性や溶解性を維持することを目的として、適当な緩衝液で希釈することができる。緩衝液は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの安定性や溶解性に影響しないものであればよく、例えば、リン酸緩衝液や酢酸緩衝液が好ましい。緩衝液には、界面活性剤等を添加することができ、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤及び両イオン性界面活性剤から選択される任意のものを用いることができる。例えば、陰イオン性界面活性剤としてはエマール２０Ｃ（登録商標）及びエマールＮＣ３５（登録商標）等、陽イオン性界面活性剤としては、コータミン８６Ｗ（登録商標）及びコータミン２４Ｐ（登録商標）等、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、ＮＰ－４０（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（登録商標）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ７２１（登録商標）、ＭＥＧＡ－８、レオコールＳＣ７０（登録商標）、レオコールＴＤ９０（登録商標）及びレオドールＴＷ－０１２０（登録商標）等、両イオン性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（登録商標）、ＣＨＡＰＳＯ（登録商標）、アンヒトール２０Ｎ（登録商標）及びアンヒトール２４Ｂ（登録商標）等が挙げられる。
　上記の糖鎖修飾物質除去工程に用いる糖鎖結合性タンパク質としては、例えば、レクチンが挙げられる。レクチンとは、動植物、真菌、細菌又はウイルス等に存在するタンパク質又は糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質である。レクチンは、リシンＢ鎖スーパーファミリーに属する「Ｒ型レクチン」、糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン」及び「カルレティキュリン」、「セレクチン」又は「コレクチン」等の代表的なレクチンを含むカルシウム要求性の「Ｃ型レクチン」、ガラクトースに親和性を示す「ガレクチン」、植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」、豆科レクチンと構造類似性を持ち動物細胞内輸送に関わる「Ｌ型レクチン」、リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース６‐リン酸結合性の「Ｐ型レクチン」、グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する「I型レクチン」等に分類される。
　レクチンは、具体的には、実施例で使用したコンカナバリンＡ（タチタナ豆レクチン；以下「ＣｏｎＡ」と言う）の他、ＡＣＡ（センニンコクレクチン）、ＢＰＬ（ムラサキモクワンジュレクチン）、ＤＢＡ（Ｈｏｒｓｅｇｒａｍレクチン）、ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオレクチン）、ＥＣＡ（デイゴマメレクチン）、ＥＥＬ（Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｔｒｅｅレクチン）、ＧＮＡ（ユキノハナレクチン）、ＧＳＬ　Ｉ（グリフォニアマメレクチン）、ＧＳＬ　ＩＩ（グリフォニアマメレクチン）、ＨＨＬ（アマリリスレクチン）、ジャカリン（ジャックフルーツレクチン）、ＬＢＡ（リママメレクチン）、ＬＣＡ（レンズマメレクチン）、ＬＥＬ（トマトレクチン）、ＬＴＬ（ロータスマメレクチン）、ＭＰＡ（アメリカハリグワレクチン）、ＮＰＡ（ラッパズイセンレクチン）、ＰＨＡ－Ｅ（インゲンマメレクチン）、ＰＨＡ－Ｌ（インゲンマメレクチン）、ＰＮＡ（ピーナッツレクチン）、ＰＳＡ（エンドウレクチン）、ＰＴＬ－Ｉ（シカクマメレクチン）、ＰＴＬ－ＩＩ（シカクマメレクチン）、ＰＷＭ（ヨウシュヤマゴボウレクチン）、ＲＣＡ１２０（ヒママメレクチン）、ＳＢＡ（ダイズレクチン）、ＳＪＡ（エンジュレクチン）、ＳＮＡ（セイヨウニワトコレクチン）、ＳＳＡ（ニホンニワトコレクチン）、ＳＴＬ（ジャガイモレクチン）、ＴＪＡ－Ｉ（キカラスウリレクチン）、ＴＪＡ－ＩＩ（キカラスウリレクチン）、ＵＤＡ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｓｔｉｎｇｉｎｇ Ｎｅｔｔｌｅレクチン）、ＵＥＡ　Ｉ（ハリエニシダレクチン）、ＶＦＡ（ソラマメレクチン）、ＶＶＡ（ヘアリーベッチレクチン）、ＷＦＡ（ノダフジレクチン）又はＷＧＡ（パンコムギレクチン）等が挙げられる。好ましくは、幅広い種類の糖鎖を認識する、ＣｏｎＡ（タチタナ豆レクチン）、ＬＣＡ（レンズマメレクチン）、ＷＧＡ（パンコムギレクチン）又はＰＮＡ（ピーナッツレクチン）であり、より好ましくは、ＣｏｎＡ（タチタナ豆レクチン）である。
　上記の糖鎖修飾物質除去工程に用いる糖鎖結合性タンパク質固定化担体は、上記の糖鎖結合性タンパク質と支持担体とを含む。支持担体を構成する材料としては、糖鎖結合性タンパク質を結合させることのできるものであればよく、例えば、実施例で使用したセファロース（登録商標）の他、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレンとポリスチレンとのコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア又はセラミックス等が挙げられるが、セファロース（登録商標）又はアガロースが好ましい。また支持担体の構造としては、例えば、多孔質構造、繊維状構造、ゲル状構造又は膜構造等を挙げることができる。アフィニティーカラムを用いる場合は、ゲル状構造が好ましい。
　糖鎖結合性タンパク質は上記の支持担体に対して、支持担体に応じた常法を用いて固定化することができる。固定化する糖鎖結合性タンパク質の量は、通常、０．０００１ｍｇ～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１ｍｇ～２０ｍｇ／ｍＬである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してから糖鎖結合性タンパク質とカップリングさせることができる。活性化スペーサーを導入したゲルに糖鎖結合性タンパク質を固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルに糖鎖結合性タンパク質を固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ－セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。また、糖鎖結合性タンパク質固定化担体は市販のもの、例えば、ＣｏｎＡ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）又はＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ＷＧＡ（サーモサイエンティフィック社製）等を使用することもできる。
　上記の糖鎖修飾物質除去工程において、試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させると、試料液中の糖鎖を有するタンパク質が糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合するため、試料液中から除去できる。この糖鎖修飾物質除去工程で除去できる糖鎖を有するタンパク質には、生体由来の糖鎖を有するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βが含まれる。したがって、この工程を加えることにより、特に生体試料液を用いた場合、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量に対するＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの含有量の比率をさらに低下させることができる。一方で、この糖鎖修飾物質除去工程は、糖鎖を有するＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出及び含有量を測定するための前処理としては、適さない。なお、糖鎖を有するタンパク質の除去率を向上させるために、糖鎖結合性タンパク質固定化担体は、複数種の糖鎖結合性タンパク質固定化担体を組み合わせて用いてもよい。また、１種の糖鎖結合性タンパク質固定化担体に複数回、試料液を接触させてもよい。例えば、ＣｏｎＡ固定化担体に２回、試料液を接触させることが好ましい。
　糖鎖修飾物質除去工程で用いられる、試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、試料液中の糖鎖修飾物を除去する方法は、公知の一般的な方法で実施できるが、例えば、担体を充填できる使い捨てのポリプロピレンスピンカラムにＣｏｎＡ固定化セファロースを充填したＣｏｎＡアフィニティーカラムに、試料液を添加し、室温で約１０～３０分間、転倒混和した後、遠心分離して得られた濾液を回収する方法が挙げられる。また、市販の糖鎖結合性タンパク質固定化担体又はそのキットを使用する場合は、添付の説明書に従って行えばよい。
　上記の前処理方法に必要な試料液の量は、使用する試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量及びその検出及び測定の方法に依存するが、１μＬ～１０ｍＬであればよい。
　また、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出方法は、上記の前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、前処理工程で前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを免疫学的又は生物学的に検出する検出工程とを備えることを特徴としており、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの定量方法は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出方法を包含するとともに、上記前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、前処理工程で前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを免疫学的又は生物学的に検出し、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する測定工程とを備えることを特徴としている。
　上記の前処理方法により前処理した試料液は、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを免疫学的又は生物学的に検出する前に上記の中和工程を行なってもよいし、適当な緩衝液等（例えば、免疫学的に検出する系で使用する緩衝液、生物学的に検出する系で使用する細胞培養培地等）で希釈してもよい。これは、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを免疫学的に検出又は生物学的に検出する方法の特性を考慮し、適宜行えばよい。
　上記の前処理方法により前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出する方法及び含有量を測定方法としては、具体的には以下の方法が挙げられる。
　免疫学的に検出する方法及び含有量を測定する方法としては、ＩＦＮ－βを特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定方法）等が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば以下の方法で実施できる。抗ＩＦＮ－βポリクローナル抗体を固相化したプレートのウェルに、上記の前処理方法により前処理した試料液を添加し、試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとポリクローナル抗体とを結合させる。Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（以下「ＨＲＰ」と言う）などの酵素で標識した抗ＩＦＮ－βモノクローナル抗体をプレートのウェルに添加し、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βと結合させる。ＴＭＢなどの発色基質を加え、酵素と反応させ発色させることにより、試料中液のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出するとともに、得られた発色量を指標としてＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する。また、ＥＬＩＳＡ法は、市販のキット、例えば、ヒトインターフェロン－βＥＬＩＳＡキット（鎌倉テクノサイエンス社製）等を用いることでも実施できる。
　生物学的に検出する方法及び含有量を測定する方法としては、例えば、ＩＦＮ－βの抗ウイルス活性を指標としてＩＦＮ活性を測定できる、ＣＰＥ法（細胞変性効果測定方法）が挙げられる。具体的には、ＩＦＮに感受性の高い細胞（以下「ＩＦＮ感受性細胞」と言う）（例えば、ＦＬ細胞）に対して、上記の前処理方法により前処理した試料液を作用させた後に、これら細胞に感染能を持つシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）又は水ほう性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶと略される）等を一定量添加して感染させ、ＩＦＮ－βにより誘導されたウイルス抵抗性の程度、すなわち、抗ウイルス活性を測定することで、ＩＦＮ活性を測定することにより試料中液のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出する。さらに、このＩＦＮ活性の数値を指標としてＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する。抗ウイルス活性は、ウイルス増殖の抑制を指標に測定されるものであり、ウイルス増殖の結果として細胞を破壊させる細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ；ＣＰＥと略される）を５０％阻止する検体の希釈倍率から、ＩＦＮ力価（Ｕ）が算出される（小林ら、「免疫生化学実験法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年、ｐ．２４５）。
　また、その他の生物学的に検出する方法及び含有量を測定する方法としては、例えば、レポーターアッセイと呼ばれる方法が挙げられる。具体的には、インターフェロン応答遺伝子１５（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｇｅｎｅ１５；ＩＳＧ１５と略される）のプロモーター領域に存在するインターフェロン刺激応答領域（ＩＦＮ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｌｅｍｅｎｔ；ＩＳＲＥと略される）の制御下でルシフェラーゼが発現するレポーター遺伝子を導入した細胞が発現するルシフェラーゼの量を指標にして、ＩＦＮ活性を測定することにより試料中液のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出する。さらに、このＩＦＮ活性の数値を指標としてＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量を測定する。これは市販のキットを用いることができる。
　上記の前処理方法により前処理した試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出する方法及び含有量を測定する方法としては、上記のＥＬＩＳＡ法又はＣＰＥ法が好ましく、キット化された簡便な測定試薬として提供されているＥＬＩＳＡ法がより好ましい。
　さらに、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βキットは、酸処理工程で試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲にするために使用する酸と、検出工程での試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βを検出するために使用する、抗ＩＦＮ－β抗体、ＩＦＮ感受性細胞に感染能を持つウイルス、ＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクター及びＩＦＮ刺激応答領域の制御下のレポーター遺伝子が染色体に組み込まれた形質転換細胞からなる群から選択される１以上のキット構成品と、を備えることを特徴としている。上記のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βキットには、さらに、中和工程で試料液のｐＨを中性付近に調整するために使用するアルカリ及び糖鎖結合性タンパク質固定化担体が含まれていてもよい。また、ＩＦＮ感受性細胞又はＩＦＮ刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクターを導入するための宿主細胞を構成品として含んでいてもよい。
　以下、実施例を示して本発明を具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの作製：
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとして、リコンビナント・ヒト・ＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体を作製した。「リコンビナント・ヒト・ＩＦＮ－β」は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８０年、第８巻、ｐ．４０５７－４０７４に記載の方法に従って作製した（以下「リコンビナントヒトＩＦＮ－β」と言う）。このリコンビナントヒトＩＦＮ－βは、大腸菌で発現させているため、糖鎖を有しない。
　また、特許第４８５０５１４号の実施例６に記載の方法に従って、リコンビナントヒトＩＦＮ－βのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「リコンビナントヒトＩＦＮ－βとＰＥＧとの共有結合体」を調製した（以下「ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β」と言う）。具体的には、まず、０．５Ｍ　塩化ナトリウムを含む１００ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したリコンビナントヒトＩＦＮ－β（最終濃度２００μｇ／ｍＬ）に、エチレングリコールを（最終濃度２０％）添加した後、１Ｍ　リン酸水素二ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．６に調整した。これに、ヒドロキシスクシンイミドエステル活性化ＰＥＧ（分子量４２，０００、日油株式会社製；品番６１Ｇ９９１２２Ｂ０１）を加え混合し、４℃で一晩、結合反応させた。この結合反応溶液に５倍容の１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＣＭ　６５０（Ｓ）；東ソー株式会社製）に供した。下記の展開溶媒で、タンパク質を溶出及び分画した。
≪展開溶媒≫
　溶媒Ａ：１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
　溶媒Ｂ：１Ｍ　塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
　上記溶媒Ａ、Ｂの混合液を陽イオン交換カラムの樹脂量に対して４０倍量通液させる間に溶媒Ｂの送液比率を０％から６５％に連続的に上昇させて溶出を行った。溶出された分画は、さらに、ＳＰ－５ＰＷカラム（東ソー株式会社製）に供し、リコンビナントヒトＩＦＮ－βのアミノ酸配列（配列番号１）の１３４番目のリジンのアミノ基に分子量４２，０００のＰＥＧが１分子共有結合した「ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β」を単離した。得られたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βは、糖鎖を有しない。
（実施例２）　酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理によるＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの除去：
１．実験手法
　健康成人より血液を採取し、常法により血清を調製した。血清に、天然型ヒトＩＦＮ－β｛フエロン（登録商標；東レ社製）｝又は、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ－β若しくはＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを、それぞれ加え、血清試料を調製した。
　各血清試料４００μＬに、６Ｍ　塩酸１００μＬ（全容量の２０％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ－５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８－１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は０．１７（約０．２）であった。
　酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ－１５０、トミー精工社製、ローター型式：ＴＭＰ－１１）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（３７，７４０×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清３００μＬに８Ｍ　水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ　リン酸２水素カリウム、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料Ａとした。また、酸処理工程を備える前処理を行わない血清試料を対照試料（天然型ヒトＩＦＮ－β、リコンビナントヒトＩＦＮ－β又はＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを含む）とした。
　糖鎖結合性タンパク質固定化担体として、ＣｏｎＡ固定化担体を用いた。懸濁させたＣｏｎＡ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）２５０μＬをフィルターカップ（バイオ・ラッド社製）に添加した後、ＰＢＳにてＣｏｎＡ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂを２回洗浄し、溶媒置換を行ったものをＣｏｎＡアフィニティーカラムとして用いた。２５０μＬの測定試料ＡをＣｏｎＡアフィニティーカラムに添加し、ローテーターにて室温で約３０分間、転倒混和した後、低速冷却遠心機（ＲＬＸ－１３５、トミー精工社製、ローター型式：ＴＳ－３９）を用いて、遠心分離｛４℃、５，０００ｒｐｍ（５，３４０×ｇ）、５分間｝し、濾液を得た（糖鎖修飾物質除去工程）。得られた濾液を、測定試料Ｂとした。
　９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）に、ヤギ由来抗ヒトＩＦＮ－βポリクローナル抗体（天然型ＩＦＮ－βを抗原としてヤギに免疫して血清を得た後、抗原に対するアフィニティー精製により作製した）をＰＢＳで希釈した溶液を１３５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにて添加し、室温で約２時間又は冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５～２６時間）静置した。ＰＢＳにてウェル内を洗浄した後、１ｇ／Ｌ　ＢＳＡを含む洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ　リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝に置換して室温で約２時間又は冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５～２６時間）ブロッキングした。ブロッキング後は冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて保管し、ブロッキングを行った日から５日間以内に使用した。使用時、ウェル内の水分を取り除き、これをＥＬＩＳＡプレートとして用いた。
　測定試料Ａ、Ｂ及び対照試料に対し、ヤギ由来抗ヒトＩＦＮ－βポリクローナル抗体の血清中タンパク質への非特異的結合をブロッキングする目的でヤギＩｇＧ（ベックマン・コールター社製）を添加した（最終濃度１２５μｇ／ｍＬ）後、測定試料Ａ、Ｂ及び対照試料を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温にて約１時間静置した。なお、バックグラウンドウェルとして、血清（ＩＦＮ－βは添加しない）を添加したウェルを設けた。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を２回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。
　ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出及び定量は発光量を指標として行った。基質溶液は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｆｅｍｔｏ　Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｆｅｍｔｏ　Ｓｔａｂｌｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を等量混合したものを用いた。基質溶液を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、発光光度計（Ｅ６５２１、プロメガ社製）にて積分時間２分間あたりの光強度（単位：カウント）を測定した。各試料を添加したウェルのカウントから、バックグラウンドウェルのカウントを差し引いた値を、各試料の発光量とした。
２．結果
　結果を図１及び２に示す。図の縦軸は、発光量（カウント）を示し、横軸は、血清試料に加えた天然型ヒトＩＦＮ－β、リコンビナントヒトＩＦＮ－β又はＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。酸処理工程を備える前処理による効果を図１に示し、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理による効果を図２に示す。図中の、「対照試料（天然型ヒトＩＦＮ－β）」、「対照試料（リコンビナントヒトＩＦＮ－β）」又は「対照試料（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β）」はそれぞれ、天然型ヒトＩＦＮ－β、リコンビナントヒトＩＦＮ－β又はＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを含む対照試料を示す。図中の「測定試料Ａ」、「測定試料Ｂ」の括弧内の記載についても、「対照試料」の括弧内の記載と同じ意味である。
　測定試料Ａ（天然型ヒトＩＦＮ－β）及び測定試料Ａ（リコンビナントヒトＩＦＮ－β）の発光量は、それぞれ、対照試料の２０％以下、１０％以下にまで低下した。これに対して、測定試料Ａ（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β）の発光量の低下は認められなかった（図１）。したがって、酸処理工程を備える前処理によって、血清中の天然型ヒトＩＦＮ－β及びリコンビナントヒトＩＦＮ－βは低減するが、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βは変化ないことが示された。
　測定試料Ｂ（天然型ヒトＩＦＮ－β）及び測定試料Ｂ（リコンビナントヒトＩＦＮ－β）の発光量は、それぞれ、対照試料の１％以下、５％以下にまで低下した。これに対して測定試料Ｂ（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β）の発光量の低下はほとんど認められなかった（図２）。したがって、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理によって、血清中の天然型ヒトＩＦＮ－β及びリコンビナントヒトＩＦＮ－βは著しく低減するが、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βは変化ないことが示された。
　この結果から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液に対して酸処理工程を備える前処理を行うことにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを低減し、取り除くことができることが明らかとなった。また、その効果は、さらに糖鎖修飾物質除去工程を行うことにより、高まることが明らかとなった。
（実施例３）　酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理による、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液中のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの低減：
１．実験手法
　健康成人より血液を採取し、常法により血清を調製した。血清に天然型ヒトＩＦＮ－β｛フエロン（登録商標；東レ社製）｝（最終濃度３３３ｐｇ／ｍＬ）と実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料（Ｉ）、及び、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ－β（最終濃度１００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料（ＩＩ）を調製した。
　各血清試料４００μＬに、６Ｍ　塩酸１００μＬ（全容量の２０％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ－５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８－１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は０．１７（約０．２）であった。
　酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ－１５０、トミー精工社製、ローター型式：ＴＭＰ－１１）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（３７，７４０×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清３００μＬに８Ｍ　水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ　リン酸２水素カリウム、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、酸処理後試料とした。
　実施例２と同じ方法で作製したＣｏｎＡアフィニティーカラムに２５０μＬの酸処理後試料を添加し、ローテーターにて室温で約３０分間、転倒混和した後、低速冷却遠心機（ＲＬＸ－１３５、トミー精工社製、ローター型式：ＴＳ－３９）を用いて、遠心分離｛４℃、５，０００ｒｐｍ（５，３４０×ｇ）、５分間｝し、濾液を得た。得られた濾液全量を、別のＣｏｎＡアフィニティーカラムに添加し、上記と同様に遠心分離し、濾液を得た（糖鎖修飾物質除去工程）。得られた濾液を、測定試料とした。
　測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（ベックマン・コールター社製）を添加した（最終濃度１２５μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５～２６時間）静置した。また、血清に実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを、最終濃度２０、４０、８０、１６０、３２０ｐｇ／ｍＬとなるように加え、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行った血清試料を、検量線作成用の標準試料として同時に測定した。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ　リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を２回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。
　ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの検出及び定量は、発光量を指標として行った。基質溶液は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｆｅｍｔｏ　Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ　ＥＬＩＳＡ　Ｆｅｍｔｏ　Ｓｔａｂｌｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を等量混合したものを用いた。基質溶液を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、発光光度計（Ｅ６５２１、プロメガ社製）にて積分時間２分間あたりの光強度（単位：カウント）を測定した。
　解析ソフトＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ（ｖｅｒ３．１．２、日本モレキュラーデバイス社製）を用い、標準試料の光強度から、４パラメーターのロジスティック回帰によって検量線を作成した。各試料に含まれるＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度（測定値）は、検量線を用いた逆回帰濃度として算出した。さらに、理論値に対する真度（正確性）の指標であるＲ．Ｅ．（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｅｒｒｏｒ）を下記の式１に従って求めた。
　　Ｒ．Ｅ．（％）＝｛（測定値－理論値）／理論値　｝×１００・・・式１
２．結果
　結果を表１に示す。表中の血清試料（Ｉ）は、天然型ヒトＩＦＮ－β（最終濃度３３３ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料であり、血清試料（ＩＩ）は、リコンビナントヒトＩＦＮ－β（最終濃度１００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度０、４０、２４０ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料である。理論値は、血清試料に加えたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの濃度を示し、測定値は、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行った測定試料のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度をＥＬＩＳＡによって求めた濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　いずれの血清試料においても、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度の測定値のＲ．Ｅ．が２０％未満であった。したがって、血清試料に、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行うことにより、ＥＬＩＳＡによって、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できることが示された。
　この結果から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液であっても、酸処理工程及び糖鎖修飾物質除去工程を備える前処理を行うことにより、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除き、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。
（比較例１）　ＰＥＧ修飾されたヒトＩＦＮ－αに対する酸処理工程を備える前処理の影響：
１．実験手法
　血清（Ｇｅｍｉｎｉ　Ｂｉｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、ロットナンバー：Ｈ１５Ｌ０３Ｚ）に、リコンビナントヒトＩＦＮ－α２ａとＰＥＧとの共有結合体｛ペガシス（中外製薬社製）；以下「ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－α」と言う｝を加え、血清試料を調製した（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）。
　血清試料に、０．３７５Ｍ、１．５Ｍ又は６Ｍの塩酸を全容量の２０％になるよう添加した（酸処理工程）。０．３７５Ｍ、１．５Ｍ又は６Ｍの塩酸で酸処理後の血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ－５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８－１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、３．２５、０．７６、０．１７であった。
　酸処理により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ－１５０、トミー精工社製、ローター型式：ＴＭＰ－１１）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（３７，７４０×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清に８Ｍ　水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ　リン酸２水素カリウム、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料とした。また、酸処理工程を備える前処理を行わない血清試料を対照試料（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－αを含む）とした。
　測定試料及び対照試料中のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－αを、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡは、ＶｅｒｉＫｉｎｅ（登録商標）　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ａｌｐｈａ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＰＢＬ社製）を用い、操作はキットに添付のプロトコールに従った。検出は、マイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、バイオ・ラッド社製）にて測定した吸光度（測定波長４５０ｎｍ）を指標として行った。
２．結果
　結果を図３に示す。図は、対照試料、及び、０．３７５Ｍ、１．５Ｍ又は６Ｍの塩酸で酸処理工程を行った測定試料の吸光度（４５０ｎｍ）を示す。
　いずれの濃度の塩酸で酸処理工程を行った測定試料においても、対照試料の１５％未満にまで吸光度が低下した。したがって、血清中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－αは、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βと異なり、酸処理工程を備える前処理によって著しく低減することが示された。
　（実施例４）　酸処理工程におけるｐＨの下限：
１．実験手法
　血清（コージンバイオ社製、ロットナンバー：ＢＪ４７３４Ａ）に、実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度４０００ｐｇ／ｍＬ）を加えた血清試料を調製して試料液とした。
　血清試料３００μＬに、６Ｍ　塩酸７５μＬ（全容量の２０％）、１３０μＬ（全容量の３０％）、２００μＬ（全容量の４０％）、３００μＬ（全容量の５０％）又は９００μＬ（全容量の７５％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の各血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ－５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８－１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、０．１７、０．０３、－０．１０、－０．２０、－０．４１であった。
　酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製、ローター型式：ＡＲ０１５－２４）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（２０，４００×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清２２５μＬに８Ｍ　水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ　リン酸２水素カリウム、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料とした。また、各測定試料と容量が揃うように蒸留水を添加した、酸処理工程を備える前処理を行なわない血清試料を対照試料（ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを含む）とした。
　測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（日本バイオテスト研究所社製）を添加した（最終濃度１３４μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５～２６時間）静置した。なお、バックグラウンドウェルとして、血清（ＩＦＮ－βは添加しない）を添加したウェルを設けた。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ　リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。
　ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの検出及び定量は、吸光度を指標として行った。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）（ナカライテスク社製）を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１５～４５分間静置した後、０．５Ｍ 硫酸を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加して、発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ　６８０　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ、バイオ・ラッド社製）にて吸光度（測定波長４５０ｎｍ）を測定し、各試料を添加したウェルの測定値から、バックグラウンドウェルの測定値を差し引いた値を、各試料の吸光度とした。
　対照試料と比較した、測定試料の吸光度低下度を式２に従って求めた。
　　吸光度低下度（％）＝（測定試料の吸光度／対照試料の吸光度）×１００　・・・式２
　さらに、６Ｍ　塩酸を全容量の２０％になるよう添加し酸処理工程を行った測定試料を基準試料とし、基準試料の吸光度低下度を０％と設定した場合の相対的な吸光度低下度（％）を式３に従って求めた。
　　相対的な吸光度低下度（％）＝１００－測定試料の吸光度低下度／基準試料の吸光度低下度×１００　・・・式３
２．結果
　結果を図４及び表２に示す。図は、６Ｍ　塩酸を全容量の３０％、４０％、５０％又は７５％になるよう添加し酸処理工程を行った場合の、相対的な吸光度低下度（％）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　６Ｍ　塩酸を全容量の３０％及び４０％になるよう添加し、酸処理工程を行った場合、相対的な吸光度低下度（％）はそれぞれ１４．０％及び１０．０％であり、２０％未満であった。したがって、６Ｍ　塩酸添加量が全容量の４０％以下であれば、酸処理工程によってＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量に概ね影響を与えないことが示された。一方、６Ｍ　塩酸を全容量の５０％及び７５％になるよう添加し、酸処理工程を行った場合、相対的な吸光度低下度（％）はそれぞれ３５．７％及び７２．６％であり、酸処理工程によってＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量が低下することが示された。
　この結果から、血清試料のｐＨが－０．１０以上の場合、酸処理工程を備える前処理によってＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量に概ね影響を与えず、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。
（実施例５）　酸処理工程におけるｐＨの上限：
１．実験手法
　血清（コージンバイオ社製、ロットナンバー：ＢＪ４７３４Ａ）に、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ－β（最終濃度１５００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度１５００ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料を調製して試料液とした。
　血清試料３００μＬに、６Ｍ　塩酸７５μＬ（全容量の２０％）、６５μＬ（全容量の１７．５％）、５６μＬ（全容量の１５％）又は４７μＬ（全容量の１２．５％）を添加した（酸処理工程）後、全ての試料の容量が３７５μＬになるよう、蒸留水を添加した。酸処理工程後の各血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ－５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８－１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、０．１７、０．２１、０．２７、０．３２であった。
　酸処理工程により形成された凝集物を、冷却遠心機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製、ローター型式：ＡＲ０１５－２４）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（２０，４００×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清２２５μＬに８Ｍ　水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ　リン酸２水素カリウム、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）後、全ての試料の容量が３６４μＬになるよう、蒸留水を添加した。これらを、測定試料とした。
　測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（日本バイオテスト研究所社製）を添加した（最終濃度１３４μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５～２６時間）静置した。また、血清に実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを、最終濃度４００、８００、１６００、３２００、４８００、６４００ｐｇ／ｍＬとなるように加え、６Ｍ　塩酸を全容量の２０％、１７．５％、１５％又は１２．５％になるよう添加することによる酸処理工程を備える前処理を行った血清試料を、検量線作成用の標準試料として同時に測定した。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ　リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。
　ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの検出及び定量は、吸光度を指標として行った。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液（Ｅａｓｙ）（ナカライテスク社製）を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１５～４５分間静置した後、０．５Ｍ　硫酸を１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加して、発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ　６８０　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ、バイオ・ラッド社製）にて吸光度（測定波長４５０ｎｍ）を測定した。
　Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ　２０１０を用い、標準試料の吸光度から、４パラメーターのロジスティック回帰によって検量線を作成した。各試料に含まれるＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度（測定値）は、対応する検量線を用いて、逆回帰濃度として算出した。さらに、理論値に対する真度（正確性）の指標であるＲ．Ｅ．（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｅｒｒｏｒ）を実施例３にて使用した式１に従って求めた。
２．結果
　結果を表３に示す。理論値は、血清試料に加えたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの濃度を示し、測定値は、酸処理工程を備える前処理を行った測定試料のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度をＥＬＩＳＡによって求めた濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　６Ｍ　塩酸を全容量の２０％、１７．５％、１５％及び１２．５％になるよう添加し酸処理工程を行った場合の、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度の測定値のＲ．Ｅ．は、それぞれ３．１７％、６．９７％、１４．９％及び１９．９％であり、２０％未満であった。
　この結果から、血清試料のｐＨが０．５０以下の場合、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液中において、ＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βが選択的に低減し、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。
（実施例６）　複数種の酸を用いた酸処理工程を備える前処理による、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液中のＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βの低減： 
１．実験手法
　血清（コージンバイオ社製、ロットナンバー：ＢＪ４７３４Ａ）に、実施例１で作製したリコンビナントヒトＩＦＮ－β（１５００ｐｇ／ｍＬ）とＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β（最終濃度１５００ｐｇ／ｍＬ）とを加えた血清試料を調製して試料液とした。
　血清試料３００μＬに、６Ｍ　硝酸、硫酸、酢酸又はリン酸７５μＬ（全容量の２０％）を添加した（酸処理工程）。酸処理工程後の各血清試料のｐＨをｐＨメータ（Ｄ－５４、ＨＯＲＩＢＡ社製）及びｐＨ電極（９６１８－１０Ｄ、ＨＯＲＩＢＡ社製）で測定した値は、それぞれ、０．１４、０．２６、３．３３、０．８５であった。
　６Ｍ　酢酸又はリン酸を用いた酸処理工程では、凝集物の形成は目視で確認されなかった。凝集物の形成が目視で確認された、６Ｍ　硝酸又は硫酸を用いた酸処理工程後の血清試料を、冷却遠心機（ＭＸ－３０７、トミー精工社製、ローター型式：ＡＲ０１５－２４）にて遠心分離し｛４℃、１５，０００ｒｐｍ（２０，４００×ｇ）、５分間｝、沈降させた（凝集タンパク質除去工程）。回収した上清２２５μＬに８Ｍ　水酸化ナトリウムと、ｐＨ調整用リン酸溶液｛１５０ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、３０ｇ／Ｌ　リン酸２水素カリウム、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液（ｐＨ６．０）｝とを添加し、ｐＨを中性付近に調整した（中和工程）。これらを、測定試料とした。
　測定試料に対し、ネガティブコントロールヤギＩｇＧ（日本バイオテスト研究所社製）を添加した（最終濃度１３４μｇ／ｍＬ）後、測定試料を１００μＬ／ウェルにて、実施例２と同じ方法で作製したＥＬＩＳＡプレートに添加し、冷蔵（温度範囲：４±３℃）にて一晩（１５～２６時間）静置した。また、血清に実施例１で作製したＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βを、最終濃度４００、８００、１６００、３２００、４８００、６４００ｐｇ／ｍＬとなるように加え、６Ｍ　硝酸又は硫酸を用いた酸処理工程を備える前処理を行った血清試料を、検量線作成用の標準試料として同時に測定した。洗浄緩衝液｛１１．７ｇ／Ｌ　塩化ナトリウム、７．４４ｇ／Ｌ　リン酸水素２ナトリウム・１２水和物、１２．４ｇ／Ｌ　リン酸２水素ナトリウム・２水和物、及び、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む水溶液｝によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体（ヤマサ醤油社製）をＨＲＰで標識化したＨＲＰ標識化抗ヒトＩＦＮ－βモノクローナル抗体を５ｎｇ／１００μＬ／ウェルにてＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で約１時間静置した。洗浄緩衝液によるウェル内の洗浄を３回繰り返した後、ウェル内の水分を取り除いた。
　ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの検出及び定量は、実施例５に従った。
　各試料に含まれるＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度（測定値）及び理論値に対する真度（正確性）の指標であるＲ．Ｅ．（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｅｒｒｏｒ）の算出は、実施例５に従った。
２．結果
　結果を表４に示す。理論値は、血清試料に加えたＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの濃度を示し、測定値は、酸処理工程を備える前処理を行った測定試料のＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度をＥＬＩＳＡによって求めた濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　６Ｍ　酢酸又はリン酸を全容量の２０％になるよう添加し酸処理工程を行った場合、酸処理工程後の血清試料のｐＨは、実施例３及び４にて明らかとなった、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できるｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲外であった。一方、６Ｍ　硝酸又は硫酸を全容量の２０％になるよう添加し酸処理工程を行った場合、酸処理工程後の血清試料のｐＨは、ｐＨ－０．１０からｐＨ０．３２の範囲内であり、さらに、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－β濃度の測定値のＲ．Ｅ．が２０％未満であったことから、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できることが示された。
　この結果から、ｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲内で酸処理工程を備える前処理を行った場合、酸種によらず、ＰＥＧ修飾ヒトＩＦＮ－βの含有量を高い正確性で測定できることが明らかとなった。
　本発明の前処理方法は、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βとＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βとが共存する試料液中から、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出に影響を及ぼすＰＥＧ非修飾のＩＦＮ－βを取り除くことができる。また、本発明のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの検出方法及び定量方法並びにＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β検出キットは、ＰＥＧ修飾ＩＦＮ－β投与後に生体から採取された試料液中のＰＥＧ修飾ＩＦＮ－βの含有量の測定に使用できる。
　配列番号１：ヒト・ＩＦＮ－βのアミノ酸配列

Claims (8)

  1. 　ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出及び定量に使用する試料液の前処理方法であり、
    　前記試料液に酸を加えて該試料液のｐＨをｐＨ－０．１０～ｐＨ０．５０の範囲に調整する酸処理工程と、
    　前記酸処理工程で凝集したタンパク質を前記試料液から除去する凝集タンパク質除去工程と、
    を備える、前処理方法。
  2. 　前記試料液を糖鎖結合性タンパク質固定化担体と接触させ、該糖鎖結合性タンパク質固定化担体に結合する物質を除去する糖鎖修飾物質除去工程を備える、請求項１記載の前処理方法。
  3. 　前記糖鎖結合性タンパク質は、レクチンである、請求項２項記載の前処理方法。
  4. 　前記ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βは、糖鎖を有しないポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βである、請求項２又は３記載の前処理方法。
  5. 　前記試料液は、血液、血漿、血清又は腹水である、請求項１～４のいずれか一項記載の前処理方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項記載の前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、
    　前記前処理工程で前処理した前記試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βを免疫学的又は生物学的に検出する検出工程と、
    を備える、試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの検出方法。
  7. 　請求項１～５のいずれか一項記載の前処理方法で試料液を前処理する前処理工程と、
    　前記前処理工程で前処理した前記試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βを免疫学的又は生物学的に検出し、該ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの含有量を測定する測定工程と、
    を備える、試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βの定量方法。
  8. 　請求項１～５のいずれか一項記載の酸処理工程で試料液を酸処理するために使用する酸と、
    　請求項６又は７記載の検出工程での試料液中のポリエチレングリコール修飾インターフェロン－βを検出するために使用する、抗インターフェロン－β抗体、インターフェロン感受性細胞に感染能を持つウイルス、インターフェロン刺激応答領域の制御下にレポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクター及びインターフェロン刺激応答領域の制御下のレポーター遺伝子が染色体に組み込まれた形質転換細胞からなる群から選択される１以上のキット構成品と、
    を備える、ポリエチレングリコール修飾インターフェロン－β検出キット。
     
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