CN113447658A - 一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测抗过氧化物还原酶‑1‑IgG抗体的试剂盒，由抗原蛋白peroxiredoxin‑1(过氧化物还原酶‑1)、固相载体、标记抗体、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色剂、洗涤液、标准品、阳性质控品、阴性质控品组成。本发明试剂盒利用间接法反应原理结合磁微粒化学发光免疫分析检测待检血清中的抗过氧化物还原酶‑1‑IgG抗体。本发明首次鉴定出自身免疫性肾病综合征患者血清中针对靶抗原过氧化物还原酶‑1的自身抗体，提供的试剂盒为国内外针对与过氧化物还原酶‑1和过氧化物还原酶‑1‑IgG自身抗体有关的自身免疫性肾病综合征的分子机制研究和临床诊疗提供依据。

Description

一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒。
背景技术
近年来儿童肾脏疾病种类越来越多，其中以自身免疫性肾病综合症发病率最高，严重危害了儿童身心健康。自身免疫性肾病综合征即一类因为肾小球滤过膜通透性增加，使得血浆蛋白滤出增多，引起大量蛋白尿，并由此引发病人主要表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高度水肿等特征的临床综合症。Ali等学者观察到，移植了来自难治性微小病变性肾病综合征病人的肾脏后，受者肾脏功能正常未出现任何蛋白尿，由此可见微小病变性肾病综合征病因并非都在肾脏自身，而可能主要是病人的内环境出现了问题。此外，除了部分由基因缺陷而引起的患儿，大部分自身免疫性肾病综合征患儿在经过激素和免疫抑制剂治疗后病情都能好转，这间接证明了该疾病与患者的自身免疫有着密切的联系。
近年来发现B细胞功能异常在自身免疫性肾病综合征中也具有重要的作用。近些年，全球多个多中心的临床研究成果表明，利妥昔单抗(Rituximab，RTX)能成功用于微小病变性肾病综合征的治疗，特别是在难治性肾病综合征的治疗方面取得了很好的治疗效果。然而研究也发现使用利妥昔单抗治疗激素依赖型肾病综合征的过程中发现，其清除B细胞的作用大约能维持5个月左右的时间，在6到7个月随着B细胞数量的回升患者的病情也会复发。由此提示自身免疫性肾病综合征患者体内存在病理性的B细胞克隆，对这些病理性的B细胞克隆进行鉴别和精准的清除，不仅有利于自身免疫性肾病综合征病情恢复，也减少因为采用利妥昔单抗等手段进行无差别的B细胞清除而给病人带来体液免疫缺陷的风险。然而，迄今为止，自身免疫性肾病综合征患儿体内病理性B细胞针对的靶抗原仍然不是很清楚。从病理特征上来说，微小病变型肾病或局灶节段性肾小球硬化被认为是由于足细胞功能丧失或改变，导致大量蛋白尿的足细胞病。足细胞为肾脏肾小球上皮细胞，附着在肾小球的基底膜的外侧，是阻止蛋白质丢失的最后屏障，足细胞损伤通常会引起大量的蛋白尿。
peroxiredoxin(过氧化物还原酶)参与的酶促反应构成机体的抗氧化系统，其在生物体的先天免疫应答中发挥着重要作用。peroxiredoxin-1是过氧化物还原酶家族的一个亚基，peroxiredoxin-1已被用于癌症研究，在口腔鳞状细胞癌(Yanagawa T，Iwasa S，Ishii T，et al.PeroxiredoxinⅠexpression in oral cancer：A potential new tumormarker.[J]Cancer Lett，2000，156(1)：27-35.)、甲状腺癌(Kim YJ，Ahn JY，Liang P，etal.Human prdx1 gene is a target of Nrf2 and is up-regulated by hypoxia/reoxygenation:Implication to tumor biology.Cancer Res,2007,67(2):546-554.)和肺癌(Kim JH,Bogner PN,Ramnath N,et al.Elevated peroxiredoxin 1，but not NF-E2-related factor 2，is an independent prognostic factor for disease recurrenceand reduced survival in stageⅠnonsmall cell lung cancer.Clin Cancer Res,2007,13(13):3875-3882.)中均可检测到peroxiredoxin-1过表达。Rho等首次研究发现peroxiredoxin-1在人结肠癌组织中表达上调，其表达与结直肠癌的增殖分化、侵袭转移密切相关，并在直肠癌中发挥双向调节作用(Rho J,Qin S,Wang J,et al.Proteomicexpression analysis of surgical human colorectal cancer tissues:Up-regulationof PSB7,peroxiredoxin-1,and SRP9 and hypoxic adaptation in cancer.J ProteomeRes,2008,7(7):2959-2972.)。
但目前关于peroxiredoxin-1的表达情况和peroxiredoxin-1的自身抗体的存在情况在肾病综合征中未见报道。另外现有技术中，没有涉及基于靶点peroxiredoxin-1或其自身抗体作为一种血清学标志物在自身免疫性肾病综合征中的应用。通过检测血清抗peroxiredoxin-1-IgG抗体鉴别出自身免疫性肾病综合征的研究是空白的。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒，是一种基于靶点peroxiredoxin-1及其相应自身抗体的检测试剂盒。所述试剂盒可通过与抗原蛋白peroxiredoxin-1(特别根据序列识别号SEQ ID NO.1所示)的免疫反应对来自组织(肾活检组织)或体液(特别是血液、血浆、血清)中的自身抗体进行检测。
所述试剂盒由抗原蛋白peroxiredoxin-1、固相载体、标记抗体如酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的二抗、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色剂、洗涤液、标准品、阳性质控品、阴性质控品组成。
所述抗原蛋白peroxiredoxin-1的序列如SEQ ID NO.1所示：
MSSGNAKIGHPAPNFKATAVMPDGQFKDISLSDYKGKYVVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFSDRAEEFKKLNCQVIGASVDSHFCHLAWVNTPKKQGGLGPMNIPLVSDPKRTIAQDYGVLKADEGISFRGLFIIDDKGILRQITVNDLPVGRSVDETLRLVQAFQFTDKHGEVCPAGWKPGSDTIKPDVQKSKEYFSKQK。
本发明的peroxiredoxin-1抗原蛋白可以是融合蛋白，使用具有某些生物学或物理功能的标签，特别是N-末端或C-末端。这些标签的存在有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀。在一个优选的实施方案中，所述标签是能够特异性结合配体的序列或结构域，所述的标签肽选自：His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。
根据本发明，所述抗原蛋白peroxiredoxin-1固定于固相载体上，优选的固相载体包括：硝酸纤维素膜、磁微粒、酶标微孔板。
本发明一个实施方案中，所述标准品和阳性质控品，标准品和阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗peroxiredoxin-1-IgG抗体作为阳性质控品和标准品，健康体检者血清为阴性质控品。
根据本发明，所述抗原蛋白peroxiredoxin-1可表达于细菌如大肠杆菌、真菌酵母、哺乳动物细胞中。
根据本发明，所述抗原蛋白peroxiredoxin-1经Ni柱亲和层析、分子筛层析、离子交换层析、疏水柱纯化。
根据本发明，所述生物样本为包含自身抗体的样品，选自全血、血清、血浆、尿液、淋巴液、胸腹水。优选为哺乳动物(人类)血清。
所述检测试剂盒还包括底物显色剂、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、洗涤液。所述底物显色剂为TMB、过氧化氢、4-MUP、AMPPD、BCIP；所述抗原稀释液为含有163mM NaCL、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4；所述样品稀释缓冲液为含有10％BSA的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液为含有1M D-glucose、2％甘油、0.35％Tween20的0.01MPBS pH7.4；所述洗涤液为：含有163mM NaCL、10％甘油、1％TritonX-100的1 x PBS pH7.4。
在一个优选实施方案中，如本文中所述“固定”是指与peroxiredoxin-1抗原蛋白不溶于水的固相载体结合，该固相载体或支持物不溶于水，更优选地通过共价键合，静电相互作用，疏水相互作用、或通过二硫键相互作用，最优选通过一个或多个共价键。固定可以是直接固定方式，例如通过过滤，离心或层析，将固定化的分子与不溶性载体一起从水溶液中分离出来。还包括可逆或不可逆的方式固定peroxiredoxin-1抗原蛋白。例如，抗原蛋白通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂解的二硫键)固定于载体，这种固定是可逆的。另外，如抗原蛋白通过在水性溶液中不会裂解的共价键(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式：如固定对所述抗原蛋白具有特异性亲和力的抗体，然后形成抗原蛋白-抗体复合物以达到固定的效目的。
本发明所述的抗原蛋白peroxiredoxin-1固定方法为直接包被法：(1)抗原蛋白peroxiredoxin-1通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)带有羧基功能团的磁微粒与抗原蛋白peroxiredoxin-1的氨基结合，抗原蛋白peroxiredoxin-1通过化学偶联方式结合在磁微粒上。
本发明所述的标记抗体可以是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记抗人IgG抗体、生物素标记抗人IgG抗体、吖啶酯标记抗人IgG抗体。
本发明采用基因重组原核表达方法成功表达并纯化出重组蛋白peroxiredoxin-1，以此作为试剂盒中抗原蛋白，研发出一套适合于检测自身免疫性肾病综合征患者血清抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的试剂盒。包括是一种定性或定量分析检测人血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的检测试剂盒。
一种检测血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体试剂盒的原理利用间接法反应原理，首先将peroxiredoxin-1抗原吸附于固相载体作为包被抗原，然后加入阳性质控品或标准品或待检血清样本进行孵育，再加入标记二抗反应后，若待检血清中含有抗peroxiredoxin-1-IgG抗体，则形成包被抗原peroxiredoxin-1-待检血清抗peroxiredoxin-1-IgG抗体-标记抗人IgG抗体三元复合物，最后利用光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，以达到定性或定量分析人血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的目的。
应用本发明试剂盒首次在部分自身免疫性肾病综合征患者的体内检测到了一种抗peroxiredoxin-1-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为足细胞上过氧化物还原酶-1(peroxiredoxin-1)。因此，本发明的试剂盒可用于抗peroxiredoxin-1-IgG自身抗体的检测，为研究自身免疫性肾病综合征提供依据。
与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：
(1)目前国内外关于肾脏疾病患者有关peroxiredoxin-1、抗peroxiredoxin-1-IgG抗体仅限于分子机制研究，并没有定量检测其在患者血清中水平。本发明首次鉴定了针对peroxiredoxin-1的自身抗体，并针对该peroxiredoxin-1-IgG自身抗体发明了检测试剂盒，填补了国内外空白。
(2)本发明试剂盒涉及到定性分析人血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体，其中固相膜免疫定性检测操作简单，试剂用量较少，比传统ELISA节约近10倍；另外NC膜吸附能力极强接近100％，微量抗原能够完全吸附固定在NC膜上；吸附抗原或抗体或已有结果的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性；另外本发明固相膜免疫定性检测人血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的试剂盒引入生物素-亲和素放大系统，大大提高了检测灵敏度。
(3)本发明涉及的磁微粒化学发光免疫分析定量检测人血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过起动发光试剂(H2O2、NaOH)0.4s后发射强度即可达到最大，半衰期为0.9s，2s内基本结束，便于快速检测。
附图说明
图1：足细胞上的peroxiredoxin-1蛋白是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原。图1A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点图；1B：一抗为自身免疫性肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；图1C：靶抗原peroxiredoxin-1蛋白的质谱鉴定。
图2：表达的重组蛋白peroxiredoxin-1的SDS-PAGE鉴定图。
图3：固相膜免疫试剂盒检测自身免疫性肾病综合征患者血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体。
图4：磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的原理示意图。
图5：抗原蛋白peroxiredoxin-1包被羧基磁微粒示意图。
图6：各类肾病病人中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的检测情况，其中NS：自身免疫性肾病综合征，HSP：过敏性紫癜，HSPN：紫癜性肾炎，IgAN：IgA肾病，NC：健康儿童。
图7：ROC曲线评估抗peroxiredoxin-1-IgG抗体作为PNS患者诊断的血清学标志物的应用价值。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于阐述本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1足细胞上的peroxiredoxin-1蛋白是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原
本发明通过前期大量临床和分子机制研究，首次发现肾病综合征患者血清IgG水平较高，并证实足细胞上的peroxiredoxin-1是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原。具体实施如下具体实施如下(1)肾小球足细胞总蛋白的提取：培养足细胞株(MPC5)，用PBS洗涤2-3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220,Gene)在含有30mm Tris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的肾小球足细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的肾小球足细胞总蛋白浓度。(2)二维电泳：提取肾小球足细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用健康人和自身免疫性肾病综合征病人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，见图1A，1B。(3)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上剪下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μl)进行消化，然后向反应混合物中加入10μl的25mM碳酸氢铵，37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为peroxiredoxin-1蛋白，见图1C。
实施例2重组抗原蛋白peroxiredoxin-1表达及纯化
利用基因工程的方法以编码peroxiredoxin-1蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明表达的抗原蛋白上含有His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析、离子亲和层析法、疏水柱、分子筛等进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白peroxiredoxin-1的分子量为27KDa，见图2。
实施例3本发明采用正交试验设计对试剂盒反应条件进行优化
根据抗原peroxiredoxin-1包被浓度(50μg、80μg、100μg、150μg四个包被浓度)、各反应时间(15min、30min、45min)和温度(25℃、37℃)、酶标二抗最佳稀释度(1:100、1:500、1:1000、1:1500四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清。选择阳性血清的最高光信号值(P)和阴性血清的最低光信号值(N)的比值(P/N)，选择阳性血清的最高光信号值(P)和阴性血清的最低光信号值(N)的比值(P/N)。通过正交设计我们得到了本试剂盒最佳抗原peroxiredoxin-1包被浓度为80μg/ml、固相膜免疫检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间30min及最佳生物素标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500；磁微粒化学发光免疫分析检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体试剂盒最佳抗原抗体反应温度为37℃、最佳抗原抗体反应时间15min及最佳吖啶酯标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500。
实施例4用于检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备
4.1用于检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的组成：
1.抗原：重组蛋白peroxiredoxin-1
2.固相载体：Satourius CN140硝酸纤维素膜
3.阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)
4.阴性质控品：健康体检者血清
5.标记抗体：生物素标记抗人IgG抗体
6.抗原稀释液
7.样品稀释缓冲液
8.抗体稀释液
9.洗涤液
10.酶工作液：碱性磷酸酶-链霉亲和素
11.底物显色液：BCIP显色液。
4.2用于检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的检测步骤如下：
4.2.1包被、封闭：将8μl浓度为80μg/ml的peroxiredoxin-1抗原直接点于硝酸纤维素膜上置37℃孵育箱中干燥30min，将硝酸纤维素膜置于检测板中，加入200μl 5％BSA于37℃温盒中封闭30min，弃去封闭液后用洗涤液洗2次；
4.2.2抗原孵育：向检测板内加入10μl用稀释液稀释的抗体标准品或待检血清，同时做阴性对照、阳性对照，室温孵育30min，每个样品设置3个平行孔；
4.2.3二抗孵育：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加入20μl 1:500生物素标记抗人IgG抗体，室温孵育30min；
4.2.4显色：弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，加500μl碱性磷酸酶-链霉亲和素，室温孵育20min，弃去检测板内液体，洗涤液洗5次×1min，然后加入BCIP显色液，室温反应20min，用流水冲洗检测板，终止酶反应。取出测试硝酸纤维素膜条用吹风机吹干膜条，用比色卡肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性见图3，或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体水平进行半定量分析。
实施例5用于检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的制备
5.1用于检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒组成：
1.抗原：重组蛋白peroxiredoxin-1
2.固相载体：羧基功能团的磁微粒
3.阳性质控品(标准品)：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)
4.阴性质控品：健康体检者血清
5.标记抗体：吖啶酯标记抗人IgG抗体
6.抗原稀释液
7.样品稀释缓冲液
8.抗体稀释液
9.洗涤液
10.预激发液：H2O2
11.激发液：NaOH。
5.2用于检测抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒的检测原理
本发明化学发光免疫分析试剂盒是将磁性分离技术、免疫分析技术、化学发光技术三者结合起来的一种分析方法。本发明试剂盒采用间接法定量分析检测人血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体：首先将磁微粒液与稀释样本混合，特异性抗peroxiredoxin-1-IgG抗体结合到peroxiredoxin-1抗原包被的磁微粒上，洗涤后，加入吖啶酯标记抗人IgG抗体，形成peroxiredoxin-1抗原包被磁微粒-抗peroxiredoxin-1-IgG抗体-吖啶酯标记抗人IgG抗体复合物，在外加磁场作用下，将未结合的物质与免疫反应形成的复合物进行分离，弃上清后清洗沉淀的复合物，加入预激发液(H2O2)和激发液(NaOH)进行发光反应，在碱性条件下，吖啶酯分子受到过氧化氢攻击生成二氧乙烷，二氧乙烷不稳定而分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出波长为430nm的光，通过化学发光仪收集发光强度。待检血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体浓度与发光值成正比，通过校准曲线计算待检血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体浓度，见图4。
5.3peroxiredoxin-1抗原包被磁微粒的制备
5.3.1peroxiredoxin-1抗原包被磁微粒的原理：基于磁微粒表面所含的羧基功能团与EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)溶液发生反应而生成不稳定的氨基活性O-酰基脲中间体，该中间体与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)发生反应生成半稳定的氨基反应活性NHS酯，半稳定的氨基反应活性NHS酯再与抗原蛋白peroxiredoxin-1上的氨基发生反应，形成抗原peroxiredoxin-1包被磁微粒，见图5。
5.3.2EDC/NHS活化羧基磁微粒，具体步骤如下：
a)称取10mg磁微粒，用20mM MES清洗磁微粒3次后，磁铁分离，弃去上清；
b)将清洗过的磁微粒重悬于100μl的20mM MES中，使磁微粒终浓度为100mg/ml；
c)向清洗后的磁微粒依次加入磷酸盐缓冲液配制的50μl 20mg/ml的EDC和50μl24mg/ml的Sμlfo-NHS，充分混匀，室温静置活化30min；
d)在外加磁场作用后，弃去上清，取400μl 0.05M磷酸盐缓冲液洗涤磁微粒，加入400μl保存液定容保存备用。
5.3.3活化磁微粒与抗原蛋白peroxiredoxin-1交联向上述活化好的磁微粒溶液中加入预冷的1ml 20mM MES继续清洗磁微粒2次；取200μl 2mg/ml的抗原蛋白peroxiredoxin-1加入到活化好的磁微粒中，充分混匀，室温静置反应16小时；反应结束后，加入含有0.2％Tween20的pH 7.4PBS缓冲液，重复清洗磁微粒2次；然后再加入含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液，至磁微粒终浓度为10mg/ml，充分混匀，室温静置反应30min；反应结束后，弃上清，并用含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液重悬磁微粒，这样活化的磁微粒与抗原蛋白peroxiredoxin-1交联完成。
5.4吖啶酯标记抗人IgG抗体的制备，具体步骤如下：
a)利用二甲基甲酰胺配制2mg/mL吖啶酯溶液；
b)利用0.2M(pH8.0)碳酸盐缓冲液配制1mg/mL抗人IgG抗体；
c)取摩尔比为4:1的吖啶酯与抗人IgG抗体充分混匀，反应40min；
d)加入20μl含有5％赖氨酸的碳酸盐缓冲液终止反应；
e)通过脱盐除杂，得到纯度较高的吖啶酯标记抗人IgG抗体溶液。
5.5磁微粒化学发光免疫分析试剂盒检测血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的的步骤
5.5.1待检血清加入取100μl稀释后的待检血清或抗His标签的IgG标准品，加入100μl peroxiredoxin-1抗原包被磁微粒溶液中，37℃反应15min，同时做阴阳性对照；
5.5.2标记抗体的加入400μl洗涤液洗涤3次x1 min，加入100μl 1:500稀释的吖啶酯标记抗人IgG抗体，37℃反应15min；
5.5.3信号检测400μl洗涤液洗涤3次x1 min，加入预激发液(H2O2)、激发液(NaOH)进行反应。通过化学发光仪检测发光信号，记录发光值。待检血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体浓度与发光值成正比，通过标准曲线计算待检血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体浓度。
实施例6检测血清抗peroxiredoxin-1-IgG抗体试剂盒的临床应用
6.1受试者纳入从2018年6月到2020年6月在诊断出各类肾病的患者，包括466例肾病综合征(NS)、168例过敏性紫癜(HSP)、137例紫癜性肾炎(HSPN)、133例IgA肾病(IgAN)及同时期195例健康儿童(NC)。血清样本取自各类肾病患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。
6.2各类肾病病人中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的检测情况利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者血清中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体水平，包括466例自身免疫性肾病综合征、168例过敏性紫癜、137例紫癜性肾炎、133例IgA肾病及同时期195例健康儿童，结果显示自身免疫性肾病综合征病人抗peroxiredoxin-1-IgG抗阳性，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病病人以及健康儿童中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体为阴性，见图6。
6.3 ROC曲线评估抗peroxiredoxin-1-IgG抗体作为一种血清学标志物用于自身免疫性肾病综合征患者诊断的价值对实施例6.2中的自身免疫性肾病综合征患者中抗peroxiredoxin-1-IgG抗体的检测结果采用ROC曲线进行分析，以评估抗peroxiredoxin-1-IgG抗体在诊断自身免疫性肾病综合征中的应用价值。结果显示抗peroxiredoxin-1-IgG抗体是用于自身免疫性肾病综合征患者的诊断的一种很好的血清学标志物，抗peroxiredoxin-1-IgG抗体(用界值大于172.5作为标准)作为一种血清学标志物用于自身免疫性肾病综合征患者诊断的敏感性为77.3％，特异性为65.3％，曲线下面积为0.777，见图7。
序列表
<110> 浙江大学医学院附属儿童医院
<120> 一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 199
<212> PRT
<213> peroxiredoxin-1蛋白(人工序列Unknow)
<400> 1
Met Ser Ser Gly Asn Ala Lys Ile Gly His Pro Ala Pro Asn Phe Lys
1 5 10 15
Ala Thr Ala Val Met Pro Asp Gly Gln Phe Lys Asp Ile Ser Leu Ser
20 25 30
Asp Tyr Lys Gly Lys Tyr Val Val Phe Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe
35 40 45
Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Ala Glu
50 55 60
Glu Phe Lys Lys Leu Asn Cys Gln Val Ile Gly Ala Ser Val Asp Ser
65 70 75 80
His Phe Cys His Leu Ala Trp Val Asn Thr Pro Lys Lys Gln Gly Gly
85 90 95
Leu Gly Pro Met Asn Ile Pro Leu Val Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile
100 105 110
Ala Gln Asp Tyr Gly Val Leu Lys Ala Asp Glu Gly Ile Ser Phe Arg
115 120 125
Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Ile Leu Arg Gln Ile Thr Val
130 135 140
Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val
145 150 155 160
Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly
165 170 175
Trp Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asp Val Gln Lys Ser Lys
180 185 190
Glu Tyr Phe Ser Lys Gln Lys
195

Claims (9)

1.一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由抗原蛋白peroxiredoxin-1、固相载体、标记抗体如酶标记或化学发光剂标记或生物素标记的二抗、抗原稀释液、样品稀释缓冲液、抗体稀释液、底物显色剂、洗涤液、标准品、阳性质控品、阴性质控品组成。
2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白peroxiredoxin-1的序列如SEQ ID:1所示。
3.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述标记抗体为酶标记、化学发光剂标记或生物素标记的二抗。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原蛋白peroxiredoxin-1上带有标签肽，所述的标签肽为：His标签、硫氧还蛋白、GST标签、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶的SA标签、c-Myc标签、Flag标签或生物素标签。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述peroxiredoxin-1抗原蛋白经镍柱亲和层析、分子筛层析、凝胶过滤层析、离子交换柱层析、疏水柱纯化。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品和阳性质控品为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段，或从血清中提取抗peroxiredoxin-1-IgG抗体作为阳性质控品和标准品，健康体检者血清为阴性质控品。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白peroxiredoxin-1固定于固相载体上，所述固相载体选用尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚苯乙烯微孔板、离子交换树脂、磁微粒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，利用物理吸附或共价键结合或化学结合将peroxiredoxin-1抗原蛋白通过直接的方式固定于固相载体上。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色剂为TMB、过氧化氢、4-MUP、AMPPD、BCIP；所述抗原稀释液为含有163mM NaCL、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4；所述样品稀释缓冲液为含有10％BSA的0.01M PBS pH7.4；所述抗体稀释液为含有1M D-glucose、2％甘油、0.35％Tween20的0.01M PBS pH7.4；所述洗涤液为：含有163mM NaCL、10％甘油、1％TritonX-100的1x PBS pH7.4。
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