WO2010114031A1 - 生物学的試料中の物質を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し;
2) ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b-i) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b-ii) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
4) ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。
態様1の工程3(b-i)において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、態様1に記載の方法。
ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、態様1又は2のいずれか1項に記載の方法。
生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳からなる群から選択される、態様1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
生物学的試料を希釈するための剤であって、
1) 細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
2) 遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む剤。
生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
A) 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体;並びに、
B-i) A)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
B-ii) A)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤;
を含むキット。
本発明の検出方法は、
1) ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し;
2) ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b-i) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b-ii) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
4) ビオチン化タンパク質と特異的に結合した被検物質を検出する
ことを含む。
本発明は、生物学的試料中の物質を検出する方法に関する。
(1)SITH-1タンパク質、核酸
SITH-1タンパク質、核酸の構造及び機能は、PCT/JP2008/67300に開示されており、その全内容が本明細書中に援用される。
SITH-1に対する抗体は、SITH-1タンパク質又はその変異体、あるいはそれらの部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる。公知の方法としては、例えば、文献(Harlowらの「Antibodies : A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1988))」、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA、講談社(1991)」)に記載の方法が挙げられる。このようにして得られる抗体は、SITH-1タンパク質の検出・測定などに利用できる。
本発明は、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させた、ビオチン化タンパク質が、ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体を利用する。
1) ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し;
2) ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成する、
ことによって作成することができる。
ビオチン結合性タンパク質としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、AVRタンパク質(Biochem. J.,(2002), 363: 609-617)、ブラダビジン(Bradavidin)(J. Biol. Chem.,(2005), 280: 13250-13255)、リザビジン(Rhizavidin)(Biochem. J., (2007),405:397-405)、タマビジン(WO02/072817)やこれらの変異体等、ビオチンと強く結合するタンパク質であれば、いずれも好適に使用することができる。好ましくは、ビオチンとの解離定数(KD)が10-8M以下、さらに好ましくは10-10M以下、さらに好ましくは10-12M以下である。但し、被検試料に添加するビオチン結合性タンパク質については、後述のとおりである。
1)配列番号7の104番目のアルギニン残基;
2)配列番号7の141番目のリジン残基;
3)配列番号7の26番目のリジン残基;及び
4)配列番号7の73番目のリジン残基
から選択される1又は複数の残基が、酸性アミノ酸残基又は中性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、改変型ビオチン結合タンパク質である。
配列番号7において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質(D40N-R104E);
配列番号7において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、そして、141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質(D40N-K141E);並びに、
配列番号7において、40番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されており、104番目のアルギニン残基がグルタミン酸残基に置換されており、そして、141番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されている、改変型ビオチン結合タンパク質(D40N-R104E-K141E)、
からなるグループから選択される、改変型ビオチン結合タンパク質である。
固体担体を構成する材料は、セルロース、テフロン(登録商標)、ニトロセルロース、アガロース、高架橋球形アガロース、デキストラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、ポリジビニリデンジフルオライド、ラテックス、ポリスチレンラテックス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェライト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、タンパク(アルブミン等)、炭素又はそれらの組合せ、などを含むがこれらに限定されない。また、一定の強度を有し、組成が安定し、かつ非特異結合が少ないものが好ましい。
本発明においては、被検物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させ、ビオチン化タンパク質を作製して、これをビオチン-ビオチン結合性タンパク質間結合を利用して担体に結合させてよい。
本発明においては、ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体と、ビオチン化タンパク質を準備し、両者を接触させることにより、アビジン-ビオチン結合を介して担体にタンパク質を結合させることができる。
なお、このように細胞破砕粗抽出液を接触させることにより、ビオチン化タンパク質を結合させる場合、事実上、精製と固定化を同時に行ったことになる。従って、この場合、別途の精製作業は不要である。
本発明の方法は、工程3)において、工程2)で作成した、ビオチン化タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する
ことを含む。
一般に、担体を利用した検出方法において、バックグラウンドシグナルの原因となる非特異結合を低減させるため、細菌破砕抽出液を検出用試薬に含有させる方法(特開昭59-99257)、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質産生に使用したベクターと同種でありかつ当該タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターが導入された宿主細胞の培養成分を試料に添加する方法(特開平8-43392)、被検物質に特異的に結合する組換えタンパク質を産生した細胞と同種であり、かつ当該タンパク質を含まない細胞からの水抽出液を加熱処理した後、その水溶性画分を試料に添加する方法(特開2004-301646)などが知られている。
本発明の方法において、生物学的試料にビオチン結合性タンパク質を添加することにより、最終的にバックグラウンドシグナルを抑制することができる。
担体への生物学的試料、及び、細胞破砕抽出液の添加は任意の方法で行うことができる。ただし、生物学的試料が担体と接触するよりも同時、あるいはそれよりも前に、生物学的試料が細胞破砕抽出液と接触しなければならない。すなわち、生物学的試料と細胞破砕抽出液が十分に接触すればよく、細胞破砕抽出液由来の成分は必ずしも最終的に生物学的試料とともに担体に添加される必要はない。例えば、細胞破砕抽出液成分を結合した担体を作成し、そこへ生物学的試料を処理したものを使用してもよい。具体的には、生物学的試料を、細胞破砕抽出液成分カラムに通す、などの態様が挙げられる。
本発明の検出方法は、工程4)において、ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する。
また、好ましくは、試料が由来する生物(例えば、SITH-1の場合はヒト)が抗体を有しない任意のタンパク質(制限されるものではないが、上記生物が哺乳類の場合は、例えばGFP(緑色蛍光タンパク質)などを挙げることができる)を固相化した区の測定値を差し引くことで、より正確に求めることが出来る。固定化の方法としては、特に限定はされないが、当該タンパク質をビオチン化し、ビオチン結合性タンパク質が固定化された担体に、ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間の結合により固定化することが好ましい。
以上のような算出方法は、生物学的試料の性質や使用する抗体の特徴などを踏まえ、当業者が適切に設計、選択することができる。
本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出する系に用いる、生物学的試料を希釈するための剤を提供する。
1) 細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
2) 遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む。
本発明はまた、生物学的試料中の物質を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、
A) 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体;並びに、
B-i) A)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
B-ii) A)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤;
を含む。
SITH-1タンパク質のN末側に、BioEaseタグが配置された融合タンパク質をコードする遺伝子を設計した。このBioEaseタグは生体内(この場合大腸菌)において生体中のビオチン化酵素によってビオチン化される配列を含むペプチドタグである。BioEase-SITH-1融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に、コードする塩基配列を配列番号9に示す。
BioEase-SITH-1融合遺伝子構築のために、まず、SITH-1遺伝子を増幅させるためのプライマーを設計した。即ち、SITH-1タンパク質のN末端部位をコードするDNA配列からなるプライマー(SITH1NtermGW-F)と、SITH-1タンパク質のC末端部位を逆向きにコードするDNA配列からなるプライマー(SITH1CtermGW-R)を設計した。
1-2.PCR
SITH-1遺伝子(ORF)(配列番号2)にFLAGタグをつけた発現ベクター(PCT/JP2008/67300)のDNAを鋳型にして、プライマーSITH1NtermGW-FとSITH1CtermGW-Rを用いてSITH-1部位の増幅を行った。PCR反応条件は、20μlの反応液中に鋳型DNAを500ng、10(ExTaq buffer(TaKaRa社)を2μl、2.5mM dNTPを1.6μl、プライマーを各20pmoles、5U/μl ExTaqを0.1μl添加し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用いて96℃3分を1回、95℃で1分,60℃で1分,72℃で2分を20回、72℃6分を1回行った。その結果、477bpのPCR産物が得られた。
PCRによって得られたSITH-1遺伝子を、ベクターpCR8/GW/TOPO(Invitrogen社製)にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書に従った。大腸菌TB1にエレクトロポレーション法を用いてDNAを導入し、常法(Sambrook et al.1989, Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition)に従ってプラスミドDNAを抽出した。インサートの存在が確認されたプラスミドに関してM13プライマー(TaKaRa社)と、ABI PRISM蛍光シークエンサー(Model 310 Genetic Analyzer,Perkin Elmer社)を用いて塩基配列を決定し、設計した遺伝子の配列と比較して、変異がないことを確認した。
BioEase-SITH1/pET104.1を導入した大腸菌BL21(DE3)、又は対照としてpTrc99Aのみを導入した大腸菌BL21を、抗生物質アンピシリン(最終濃度100μg/ml)を含むLB培地50mlに接種し、OD600における吸光度が0.5に達するまで30℃で振とう培養した。その後、1mM IPTGを添加し、さらに30℃で5時間振とう培養した。培養液50mlから遠心にて菌体を回収した。菌体は0.1M HEPES/KOH(pH7.4)3ml中に懸濁後、超音波により破砕した。破砕液を遠心(15,000rpm)し、その上清を大腸菌粗抽出液とした。
精製TM2をNew ELISA plateキット(住友ベークライト)を用いてマイクロプレートに固定化した。固定化方法はキット添付の説明書に従った。
ウサギ抗SITH-1抗体(抗血清)の血清中抗体価は、典型的なうつ病(気分障害)患者の血清中抗SITH-1抗体価に比べ、およそ50倍程度高いと推定される。従って市販(健常者)ヒト血清に体積比で1/50量のウサギ抗SITH-1抗体(抗血清)を混ぜると、典型的なうつ病患者血清の擬似検体となると考えられる。よって、上記の抗体希釈率は、うつ病患者血清をおよそ10倍から80倍希釈して用いる場合と同程度とみなすことができる。
さらに、血清の希釈に用いた大腸菌粗抽出液中におけるTM2の効果を確認するために、PBS若しくは上記pTrc99A導入大腸菌粗抽出液に、最終濃度50μg/mlとなるように、精製TM2を加えた溶液を調製し、これを用いてヒト血清を100倍希釈した溶液に、上記と同様、ウサギ抗SITH-1抗体を体積比で1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000となるように段階希釈して加え、BioEaseタグ融合SITH-1を固定化したプレートに100μlずつ添加し、1時間室温で反応させた。また対照として、何も結合させていないTM2固定化プレートに上記ブロッキング操作を行った後、上記と同様にPBS溶液や、pTrc99A導入あるいはTM2/pTrc99A導入大腸菌粗抽出液(1mg総可溶性タンパク質/ml)、さらに精製TM2を加えたPBSや、精製TM2を加えたpTrc99A導入大腸菌粗抽出液で、100倍希釈したヒト血清に、段階的に希釈したウサギ抗SITH-1抗体を加えたものを100μlずつ添加し、室温で1時間反応させた。
S/N比=抗SITH-1抗体を各濃度で加えた区の抗SITH-1抗体検出量/抗SITH-1抗体を加えない区の抗SITH-1抗体検出量
Claims (6)
- 生物学的試料中の物質を検出する方法であって、
1) ビオチン結合性タンパク質を結合させた担体、及び、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質を準備し;
2) ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間の結合を介して、工程1)で準備した担体にビオチン化タンパク質を結合させて、ビオチン化タンパク質が結合した担体を作成し;
3) 工程2)で作成したビオチン化タンパク質が結合した担体に、
(a) 生物学的試料、及び
(b-i) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
(b-ii) 工程1)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を混合して添加する;そして、
4) ビオチン化タンパク質と特異的に結合した披検物質を検出する
ことを含む、前記方法。 - 請求項1の工程3(b-i)において、細胞破砕抽出液として、任意のベクターを含む細胞から抽出した細胞破砕抽出液を添加する、請求項1に記載の方法。
- ビオチン結合性タンパク質がタマビジン又はその変異体である、請求項1又は2のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料が、血液、血清、脳脊髄液、唾液、咽頭拭い液、汗、尿、涙、リンパ液、精液、腹水、及び母乳からなる群から選択される、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料を希釈するための剤であって、
1) 細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、又は
2) 遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液
を含む剤。 - 生物学的試料中の物質を検出するためのキットであって、
A) 検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質にビオチンを結合させたビオチン化タンパク質が、ビオチン-ビオチン結合性タンパク質間結合によって結合している、担体;並びに、
B-i) A)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞より調製した細胞破砕抽出液と、ビオチン結合性タンパク質、あるいは
B-ii) A)のビオチン結合性タンパク質、検出すべき物質と特異的に結合するタンパク質、及び/又はビオチン化タンパク質を発現させるのに利用した宿主細胞と同種の細胞に遺伝子工学技術によりビオチン結合性タンパク質を発現させた細胞から調製した細胞破砕抽出液を含む、生物学的試料を希釈するための剤;
を含むキット。
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