JP2002048794A - ビオチンを含む洗浄液、反応試薬および特異的結合アッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】特異的結合アッセイに用いられるアビジン固相
への非特異的結合を低減させるのに有用な手段を提供す
る。 【解決手段】・ビオチンを含有する特異的結合アッセイ
用洗浄液、 ・ビオチンと、標識した特異的結合物質または標識した
被検成分類似体とを含む特異的結合アッセイ用反応試
薬、及び ・それらの洗浄液及び／又は反応試薬を用いた、溶液中
の被検成分の特異的結合アッセイ方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特異的結合アッセ
イのための洗浄液、反応試薬およびアッセイ方法に関
し、とくにアビジン−ビオチン結合を利用した特異的結
合アッセイに関する。特異的結合アッセイとは、分子間
の特有の空間配置と分子間水素結合の集合とに起因する
特異的な分子間相互作用をもった結合対、たとえば抗原
と抗体、ホルモンと受容体、ビタミン類と結合蛋白質、
核酸の相補的結合鎖などにおいて、その一方を、他方と
の特異的な複合体形成能力を利用して、各種混合物、た
とえば血清、血漿、尿、唾液、核酸抽出物、環境水など
から選択的に分析しようとする技術である。

【０００２】

【従来の技術】アビジンまたはストレプトアビジンとビ
オチンとの高い親和性に基づく反応系（以下アビジン−
ビオチン系という）は、免疫測定法、核酸プローブ法、
アフィニティークロマトグラフィーなどの分野におい
て、生体関連物質の固相化や標識化に広く利用されてい
る。

【０００３】アビジン−ビオチン系を固相化に利用する
おもな利点は、（１）被検成分に対する特異的結合物質
を効率よく固定化できること、（２）異なる被検成分に
対しても同じ固相（いわゆるユニバーサル固相）を適用
できること、および（３）時間のかかる免疫反応を液相
中で実施し、固相への捕捉をアビジン−ビオチンの高親
和結合によって実質的に短時間で済ますことが可能であ
ることなどである。たとえば、特開昭６２−３０９６３
号公報には、ビオチン結合タンパク質（アビジン、スト
レプトアビジンなど）を固定化した固相と、ビオチン化
した第１の免疫学的結合相手と、被検成分と、標識化し
た第２の免疫学的結合相手と、を同時または別々にイン
キュベートしたのちＢ／Ｆ分離する固相免疫検定法が開
示されている。とくに液相成分による抗原抗体反応を優
先的に行った後、固相への捕捉を行なう遅延型固相免疫
検定法は、検定時間を短縮するために効果的である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般に固相を用いた特
異的結合アッセイにおいて、固相表面への望ましくない
非特異的結合を低減させることは検出感度を改良するた
めに重要である。たとえば、検出用に標識化した試薬が
被検成分の量と関係なく非特異的に固相表面に吸着する
ことは、バックグラウンドシグナルの増加につながる。
このことは「アビジンまたはストレプトアビジンを固定
化した固相」（以後、アビジン固相とよぶことがある）
においても当てはまり、とくに固相表面のアビジンまた
はストレプトアビジンへの非特異的結合を低減させるこ
とが望ましい。

【０００５】特開平１１−２１１７２７号公報は、たと
えばアビジン固相に、ビオチン化特異的結合物質（被検
成分に対する特異的結合物質とビオチンとの結合物）を
結合させたのち、ポリエチレングリコールとビオチンと
の抱合体でアビジン固相をブロッキングするという、固
相への非特異的結合の防止技術を開示している。このポ
リエチレングリコールとビオチンとの抱合体は、従来か
らよく使用されてきたウシ血清アルブミン、動物Ｉｇ
Ｇ、ゼラチン、ポリエチレングリコール、界面活性剤な
どのような非特異的ブロッキング物質とは異なり、前記
抱合体中のビオチンが、アビジン固相上のフリーのビオ
チン結合部位に特異的に結合するいわば特異的ブロッキ
ング物質（特開平１１−３１６２２５号公報）である。
この公報には、上記の抱合体でブロッキングした固相を
乾燥したのち、更にビオチン溶液を塗布して依然として
フリーのままの結合部位を飽和させるといった記載もあ
る。

【０００６】上記の特開平１１−２１１７２７号公報お
よび特開平１１−３１６２２５号公報で開示された技術
は、すでにビオチン化特異的結合物質が結合した固相形
態をなす試薬の製造方法である。しかしながら、「従来
の技術」に記載したような遅延型固相免疫検定法におい
ては、ビオチン化特異的結合物質（ビオチン化した第１
の免疫学的結合相手）、被検成分、及び標識化特異的結
合物質（標識化した第２の免疫学的結合相手）からなる
生成物が先に生成するため、上記の特異的ブロッキング
をそのまま適用することはできないと考えられる。なぜ
なら固相を特異的にブロッキングする前に、検体中に存
在する種々の干渉因子または遊離の標識化特異的結合物
質が先に固相に非特異的結合してしまうからである。

【０００７】本発明の課題は遅延型固相免疫検定法にも
適用可能であって、特異的結合アッセイに用いられるア
ビジン固相への非特異的結合を低減させるのに有用な手
段を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題は
アビジン固相にビオチン化特異的結合物質を結合させる
工程のあとにビオチンを含有する溶液を接触させるとい
う手段により解決できることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００９】即ち本願第一の発明は、ビオチンを含有す
ることを特徴とする、特異的結合アッセイ用洗浄液であ
る。

【００１０】また本願第二の発明は、溶液中の被検成分
の特異的結合アッセイ方法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
結合物質（２）、被検成分（３）、および被検成分に対
する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検
成分類似体（４）を接触させて固相と液相からなる反応
混合物を得る工程、 ・前記反応混合物中の固相を液相から分離し、前述の洗
浄液を用いてその固相を洗浄する工程、及び ・洗浄した前記固相上の標識を検出する工程、を含むこ
とを特徴とする方法である。

【００１１】さらに本願第三の発明は、溶液中の被検成
分の特異的結合アッセイ方法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて固
相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、 ・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、前
述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、 ・洗浄した前記固相に、被検成分に対する標識した第２
の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）
を接触させて、固相と液相からなる第２の反応混合物を
得る工程、及び ・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固
相上の標識を検出する工程、を含むことを特徴とする方
法である。

【００１２】また本願第四の発明は、ビオチンと、被検
成分に対する標識した特異的結合物質または標識した被
検成分類似体とを含むことを特徴とする、特異的結合ア
ッセイ用反応試薬である。

【００１３】また本願第五の発明は、溶液中の被検成分
の特異的結合アッセイ方法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて、
固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、 ・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離する工
程、 ・分離した前記固相に、前述の反応試薬を接触させて固
相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び ・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固
相上の標識を検出する工程、を含むことを特徴とする方
法である。

【００１４】また本願第六の発明は、溶液中の被検成分
の特異的結合アッセイ方法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
（１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
結合物質（２）および被検成分（３）を接触させて固相
と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、 ・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、前
述の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工程、 ・洗浄した前記固相に、前述の反応試薬を接触させて固
相と液相からなる第２の反応混合物を得る工程、及び ・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固
相上の標識を検出する工程、を含むことを特徴とする方
法である。

【００１５】以下、本発明を更に詳細に説明する。はじ
めに本願で使用される用語について説明する。

【００１６】本願において、「ビオチン」とは、ビオチ
ンそのものばかりでなく、アビジンまたはストレプトア
ビジンと高親和性の結合対を形成する点でビオチンと実
質的に同様の挙動を示すビオチン誘導体およびビオチン
類縁体たとえばビオシチン、ビスノルビオチン、テトラ
ノルビオチン、デスチオビオチンなどをも含むものであ
る。ただしビオチンは被検成分とは実質的に直接結合し
ない。

【００１７】また本願において、「アビジンまたはスト
レプトアビジン」とは、天然物または組換え体の、アビ
ジン、ストレプトアビジンまたはそれらの誘導体（重合
体を含む）であって、１分子上にビオチン結合能を複数
もってもよい蛋白質を意味する。

【００１８】アビジンまたはストレプトアビジンを固定
化するのに使用される固相は水不溶性担体であって、
形、大きさ、材質には制限がなく、従来のイムノアッセ
イや核酸プローブ法、アフィニティークロマトグラフィ
ーで使用されている水不溶性担体であってよい。たとえ
ば、イムノアッセイでよく使われるポリスチレンなどの
熱可塑性樹脂で製造された微粒子、ビーズ、板状の担
体、反応容器の内壁、セルロースエステルなどの繊維を
固相とすることができる。微粒子やビーズを使用すると
きは、磁力による撹拌やＢ／Ｆ分離をしやすくするため
に、担体の表面または内部に鉄やフェライトなどの磁性
物質を担持させてもよい。

【００１９】アビジンまたはストレプトアビジンを固相
に固定化するには、直接吸着させてもよく、また適切な
リンカーを介して化学的に架橋してもよく、ビオチンを
固定化した固相にビオチン−アビジン結合により結合さ
せてもよい。

【００２０】第１の特異的結合物質は、被検成分が抗原
のときはその抗原に特異的な抗体でよく、被検成分が抗
体のときはその抗体が特異的に結合する抗原でもよい
し、その抗体に対する抗体であってもよい。また、被検
成分がホルモンのときはその受容体であってもよく、被
検成分が受容体のときは対応するホルモンであってもよ
い。また、被検成分がビタミン類のときはその結合蛋白
質であってもよい。また、被検成分が核酸のときは相補
的な核酸プローブであってもよい。

【００２１】被検成分に対するビオチン化した第１の特
異的結合物質は、アビジンまたはストレプトアビジンと
の結合能、および対応する被検成分との特異的結合能を
兼ね備えた結合物を意味する。蛋白質や核酸をビオチン
化する方法には公知の方法が多数あり、本発明はそれら
の方法によって製造されるビオチン化物質のすべてを利
用できる。

【００２２】被検成分に対する標識した第２の特異的結
合物質とは、第１の特異的結合物質とは異なった位置で
被検成分に特異的に結合する物質を標識した結合物であ
って、いわゆるサンドイッチ法の反応試薬を構成する。
標識した被検成分類似体とは、第１の特異的結合物質の
結合部位をめぐって被検物質と競合する物質を標識した
結合物であって、いわゆる競合法の反応試薬を構成す
る。本願において被検成分類似体という用語は被検成分
そのもの及びその類似体を含む。標識は検出用に用いら
れるもので、この分野において公知であるすべてのも
の、たとえば酵素、化学発光物質、蛍光物質、放射性物
質などが利用できる。なお本願において、標識という用
語は特別に断わらない限り検出用の標識を意味するもの
とする。標識の検出には特に限定はなく、各標識に応じ
た方法で行うことができる。反応混合物中の固相を液相
から分離する方法には特に限定はなく、いわゆる通常の
Ｂ／Ｆ分離を行うことができる。

【００２３】上記の反応成分（１）から（３）及び／又
は（４）を接触させるとは、アビジン−ビオチン結合の
形成、被検成分に対する第一及び／又は第二の特異的結
合物質の反応が、特異的結合アッセイの達成に必要な程
度進行するのに十分な物理化学的条件下で、十分な時
間、インキュベーションすることを意味する。

【００２４】次に本願発明を順に説明する。まず本願第
一の発明による洗浄液は、ビオチンを含むことを特徴と
し、必要に応じて酸、塩基、塩、それらの組み合わせか
らなる緩衝物質、界面活性剤、防腐剤などを含んでもよ
い。また通常、特異的結合アッセイに使われている公知
の洗浄液や緩衝液にビオチンを添加することで製造する
ことができる。

【００２５】本発明の洗浄液は、使用時はビオチンを含
む溶液の形態で用いられ、特に水溶液の形態が好ましい
が、輸送、保存の容易さのために、凍結乾燥品や濃縮液
で供給されてもよい。洗浄液に含有されるビオチンの濃
度に制限はないが、０．１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００
ｎｍｏｌ／ｍＬが好ましく、１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１
０ｎｍｏｌ／ｍＬがとくに好ましい。

【００２６】本願第二の発明は、溶液中の被検成分の特
異的結合アッセイ方法に関するものであり、固相から標
識化物質までを含んだ免疫複合体の形成後にはじめてＢ
／Ｆ分離及び洗浄を行ういわゆる１ステップアッセイに
おいて、洗浄液に本願第一の発明による洗浄液を用いる
ことにより、固相への被検成分および標識化物質の導入
後でも、固相への非特異的結合を低減させることができ
る。

【００２７】上記の成分（１）から（４）までの接触の
仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触させ
たのち（３）そして（４）の順に接触させてもよく、そ
の逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接触させて
もよい。好ましくは（２）、（３）および（４）を互い
に接触させたのち（１）を接触させるのがよい。すなわ
ち液相成分による特異的結合反応を優先的に行った後、
固相への捕捉を行なうのが、アッセイ全体に要する時間
を短縮するために効果的である。固相化反応を含めた特
異的結合反応の進行は、液相だけの反応に比べて一般に
遅いからである。固相への捕捉はアビジン−ビオチンの
高親和結合によって実質的に短時間で済ますことができ
る。

【００２８】本願第三の発明では、上記の２ステップア
ッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相を
洗浄する際に、本願第一の発明による洗浄液を用いるこ
とにより、非特異的結合を効果的に低減させることがで
きる。この方法は標識物質（４）を反応させる前に固相
を洗浄する工程を含み、検体中の妨害成分と標識物質
（４）との接触を避けたいときに好適に使用される。上
記の成分（１）から（３）までの接触の仕方に制限はな
く、たとえば（１）に（２）を接触させたのち（３）を
接触させてもよく、その逆順に接触させてもよく、すべ
てを同時に接触させてもよい。好ましくは（２）および
（３）を互いに接触させたのち（１）を接触させるのが
よい。

【００２９】本願第四の発明による反応試薬は酸、塩
基、塩、それらの組み合わせからなる緩衝物質、界面活
性剤、防腐剤などを含んでもよい。本発明による反応試
薬は、使用時は水溶液の形態で用いられるが、輸送、保
存の容易さのために、凍結乾燥品や濃縮液で供給されて
もよい。含有するビオチンの濃度に制限はないが、０．
１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬが好まし
く、１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００ｎｍｏｌ／ｍＬがと
くに好ましい。

【００３０】本願第五の発明では、上記の２ステップア
ッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相
に、本願第４の発明に記載の反応試薬を接触して第２の
反応混合物を得ることにより、非特異的結合を低減させ
ることができる。上記の成分（１）から（３）までの接
触の仕方に制限はなく、たとえば（１）に（２）を接触
させたのち（３）を接触させてもよく、その逆順に接触
させてもよく、すべてを同時に接触させてもよい。好ま
しくは（２）および（３）を互いに接触させたのち
（１）を接触させるのがよい。

【００３１】本願第六の発明では、上記の２ステップア
ッセイにおいて、第１の反応混合物から分離した固相を
洗浄する際に、本願第一の発明の洗浄液を用い、かつ洗
浄後の固相に本願第四の発明の反応試薬を接触し、第２
の反応混合物を得ることにより、非特異的結合をとくに
効果的に低減させることができる。上記の成分（１）か
ら（３）までの接触の仕方に制限はなく、たとえば
（１）に（２）を接触させたのち（３）を接触させても
よく、その逆順に接触させてもよく、すべてを同時に接
触させてもよい。好ましくは（２）および（３）を互い
に接触させたのち（１）を接触させるのがよい。

【００３２】意外にも、本願第一の発明の洗浄液および
本願第四の発明の反応試薬に含まれるビオチンは、遅延
型固相免疫検定法においてすでに固相に非特異結合した
標識化物質を追い出す効果を示した。この作用機序は明
らかではないが、アビジン上の疎水性領域に標識化物質
が非特異的に結合しているところへビオチンを共存せし
めた結果、ビオチンがアビジン上のビオチン結合部位に
結合し、疎水部分が親水化するか、もしくは立体的に標
識化物質が外れやすい構造をとるものと考えられる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するため実施
例を示す。しかし本発明はこれら実施例のみに限定され
るものではない。

【００３４】実施例１ ビオチンを含有する洗浄液 つぎに示す組成をもった種々の濃度のビオチンを含有す
る洗浄液を製造した。

【００３５】トリス緩衝液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍ
Ｍ（ｐＨ８） 塩化ナトリウム ０．１５Ｍ 塩化マグネシウム １ｍＭ Ｔｗｅｅｎ−２０ ０．０５％ アジ化ナトリウム ０．０５％ ビオチン ０、０．１、１、１０、または１００ｎｍｏ
ｌ／ｍＬ。

【００３６】実施例２ １ステップＴＳＨ測定における
洗浄液へのビオチンの添加効果 実験した１ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りで
ある。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液３３．３μＬと、検
体（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶
液）３３．３μＬと、アルカリ性ホスファターゼ標識抗
ＴＳＨ抗体（ビオチン化抗ＴＳＨ抗体とは異なる部位で
ＴＳＨに結合するもの）溶液３３．３μＬとを９６穴黒
色マイクロタイタープレート中で混合し、３７℃で５分
間反応させた。その後ストレプトアビジン固定化磁性微
粒子（ダイナル社製）１０μＬと混合し、３７℃で３分
間攪拌したのち固相を分離し、実施例１に示した種々の
濃度のビオチンを含有する洗浄液で洗浄した。そして発
光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分注し、
酵素反応／発光測定をおこなった。発光測定にはベルト
ールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用し、測光
条件は５分後の１秒間測光とした。

【００３７】結果を表１に示す。洗浄液中のビオチン濃
度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの相対発光量ＲＬＵ
（以後、たんに発光量とよぶ）が下がっていくことがわ
かった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃度を増やすに
従って非特異的結合に起因するバックグラウンドシグナ
ルが下がっていくことがわかった。ビオチン濃度が１０
ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチン濃度ゼロの
ときに比べてバックグラウンドシグナルが約３分の１
（３３．９％）に減少し、ビオチン濃度をさらに１００
ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかった。他
方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほとんど
影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの
発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ比に相
当する）は、ビオチン濃度ゼロのときに比べて１０ｎｍ
ｏｌ／ｍＬでは約３倍に上昇している。洗浄液中のビオ
チンの濃度を増やしてもＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの
発光量にはほとんど影響がなかったことは、いったんス
トレプトアビジン上のビオチン結合部位に結合したビオ
チン化免疫複合体が、洗浄液中のビオチンによって追い
出されなかったことを意味し、このアッセイ方法の有用
性を支持する。

【００３８】

【表１】

【００３９】実施例３ ２ステップＴＳＨ測定における
洗浄液へのビオチンの添加効果 実験した２ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りで
ある。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液６６．７μＬと検体
（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）
３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート
中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレ
プトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μ
Ｌと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離
し、実施例１に示した種々の濃度のビオチンを含有する
洗浄液で洗浄した。その後アルカリ性ホスファターゼ標
識抗ＴＳＨ抗体（ビオチン化抗ＴＳＨ抗体とは異なる部
位でＴＳＨに結合するもの）溶液５０μＬを分注し、５
分間反応後、固相を分離し同じ洗浄液で再び洗浄した。
そして発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを
分注し、酵素反応／発光検出をおこなった。発光測定に
はベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用
し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。

【００４０】結果を表２に示す。洗浄液中のビオチン濃
度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの発光量が下がって
いくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃
度を増やすに従って非特異的結合に起因すると思われる
バックグラウンドシグナルが下がっていくことがわかっ
た。ビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじ
めのビオチン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンド
シグナルが約３分の１（３３．０％）に減少し、ビオチ
ン濃度をさらに１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下
にはならなかった。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬ
の発光量にはほとんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃
度１０μＩＵ／ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量
との比（Ｓ／Ｎ比に相当する）は、はじめのビオチン濃
度ゼロのときに比べて約３倍に上昇している。洗浄液中
のビオチンの濃度を増やしてもＴＳＨ濃度１０μＩＵ／
ｍＬの発光量にはほとんど影響がなかったことは、いっ
たんストレプトアビジン上のビオチン結合部位に結合し
たビオチン化免疫複合体が、洗浄液中のビオチンによっ
て追い出されなかったことを意味し、このアッセイ方法
の有用性を支持する。

【００４１】洗浄液中のビオチン濃度が１０ｎｍｏｌ／
ｍＬのときは、この実施例３に示した２ステップ測定
（表２）においても、先の実施例２に示した１ステップ
測定（表１）においてもバックグラウンドシグナルが共
に約３分の１に減少するという驚くべき一致を示した。
ただし細かく見ると、ビオチン濃度が１ｎｍｏｌ／ｍＬ
のとき、表２のバックグラウンドシグナルは、はじめの
ビオチン濃度ゼロのときに比べて３３．６％となり、１
０ｎｍｏｌ／ｍＬのときの３３．０％とほぼ同じレベル
にまで低下している。これに対して、表１のバックグラ
ウンドシグナルは、はじめのビオチン濃度ゼロのときに
比べて１ｎｍｏｌ／ｍＬでは３９．０％となり、１０ｎ
ｍｏｌ／ｍＬのときの３３．９％のレベルにまでは低下
しきれていないことがわかる。２ステップアッセイのは
じめの洗浄が、標識化物質の導入前であるのに対して、
１ステップアッセイの洗浄は、標識化物質の導入後であ
ることから、固相に非特異的結合している標識化物質を
一定時間内に追い出すためにより多くのビオチンが必要
になるためであると考えられる。

【００４２】

【表２】

【００４３】実施例４ ビオチンと、被検成分に対する
標識した特異的結合物質を含む特異的結合アッセイ用反
応試薬 つぎに示す組成をもった種々の濃度のビオチンを含有す
る前記反応試薬を製造した。

【００４４】トリス緩衝液 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１
Ｍ ウシ血清アルブミン ０．１％ アジ化ナトリウム ０．１％ アルカリ性ホスファターゼ標識抗ＴＳＨ抗体 ０．７３
μｇ／ｍＬ ビオチン ０、０．１、１、１０、又は１００ｎｍｏｌ
／ｍＬ。

【００４５】実施例５ ２ステップＴＳＨ測定における
反応試薬へのビオチンの添加効果 実験した２ステップＴＳＨ測定系の概略はつぎの通りで
ある。ビオチン化抗ＴＳＨ抗体溶液６６．７μＬと検体
（ＴＳＨ濃度ゼロおよび１０μＩＵ／ｍＬの標準溶液）
３３．３μＬとを９６穴黒色マイクロタイタープレート
中で混合し、３７℃で５分間反応させた。その後ストレ
プトアビジン固定化磁性微粒子（ダイナル社製）１０μ
Ｌと混合し、３７℃で３分間攪拌したのち固相を分離
し、実施例１に示したビオチン濃度ゼロの洗浄液で洗浄
した。その後実施例４に示した反応試薬を分注し、５分
間反応後、固相を分離し同じ洗浄液で再び洗浄した。そ
して発光基質（Ｔｒｏｐｉｘ社ＣＳＰＤ）５０μＬを分
注し、酵素反応／発光検出をおこなった。発光測定には
ベルトールド社製ルミノメーター ＬＢ９６Ｖを使用
し、測光条件は５分後の１秒間測光とした。

【００４６】結果を表３に示す。洗浄液中のビオチン濃
度を増やすに従ってＴＳＨ濃度ゼロの発光量が下がって
いくことがわかった。すなわち、洗浄液中のビオチン濃
度を増やすに従って非特異的結合に起因するバックグラ
ウンドシグナルが下がっていくことがわかった。ビオチ
ン濃度が１０ｎｍｏｌ／ｍＬになると、はじめのビオチ
ン濃度ゼロのときに比べてバックグラウンドシグナルが
約３分の２（６６％）に減少し、ビオチン濃度をさらに
１００ｎｍｏｌ／ｍＬとしてもそれ以下にはならなかっ
た。他方、ＴＳＨ濃度１０μＩＵ／ｍＬの発光量にはほ
とんど影響がなく、結果としてＴＳＨ濃度１０μＩＵ／
ｍＬの発光量とＴＳＨ濃度ゼロの発光量との比（Ｓ／Ｎ
比に相当する）は、はじめのビオチン濃度ゼロのときに
比べて約１．５倍に上昇している。

【００４７】

【表３】

【００４８】実施例６ ２ステップＴＳＨ測定における
洗浄液・反応試薬へのビオチンの添加効果 実施例３と５の結果から、洗浄液、反応試薬への有効な
ビオチン添加濃度はそれぞれ１ｎｍｏｌ／ｍＬ、１０ｎ
ｍｏｌ／ｍＬであることがわかったので、これらの濃度
に固定して、以下の洗浄液（実施例１に記載）と反応試
薬（実施例４に記載）を用いて実施例３、５に準じて実
験を行い、ビオチンを添加した場合の効果を試験した。
実験はつぎの４つの場合に分けておこなった。

【００４９】１）洗浄液及び反応試薬：いずれもビオチ
ン濃度ゼロ ２）洗浄液：ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍＬ含有、反応試
薬：ビオチン濃度ゼロ ３）洗浄液：ビオチン濃度ゼロ、反応試薬：ビオチン１
０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有 ４）洗浄液：ビオチン１ｎｍｏｌ／ｍＬ含有、反応試
薬：ビオチン１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有。

【００５０】結果を表４に示す。１）を基準として、Ｔ
ＳＨ濃度ゼロの発光量を見ていくと、まず２）の洗浄液
の効果として発光量が３６％に下がっていることがわか
る。これは実施例３の結果と同様である。つぎに１）を
基準として、３）の反応試薬の効果としては発光量が６
４％に下がっている。さらに４）の効果を１）を基準と
して見ると、２４％に下がっていることがわかる。２）
の効果が３６％、３）の効果が６４％であるから、それ
らが線形的にバックグラウンドシグナル低下に寄与する
と仮定すると、６４％×３６％＝２３％となり、４）の
結果である２４％と実質的に一致することがわかった。
このことから２ステップ測定系においては、洗浄液と標
識化物質を含む反応試薬との両方にビオチンを好適に添
加すれば、それぞれの効果が独立に働くため、非特異的
結合の総合的な低減に効果があることが判明した。

【００５１】

【表４】

【００５２】

【発明の効果】本発明の特異的結合アッセイ用洗浄液を
Ｂ／Ｆ分離後の固相の洗浄工程に使用することにより、
アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相へ
の非特異的結合を低減させる効果を奏する。

【００５３】また本発明の洗浄液を、本願第二の発明の
ように１ステップアッセイに使用することにより、標識
した物質がアッセイの過程でアビジンまたはストレプト
アビジンを固定化した固相に捕捉されたあとであって
も、それらの固相への非特異的結合を低減させる効果を
奏する。すなわち遅延型固相免疫検定法にも適用可能
な、固相への非特異的結合を低減させた特異的結合アッ
セイ方法を提供する。

【００５４】更に本願第三の発明のように、標識した物
質が、アッセイの過程でアビジンまたはストレプトアビ
ジンを固定化した固相に捕捉される前に、本発明の洗浄
液で固相を洗浄することにより、ビオチン濃度が低くて
も効果的にバックグラウンドシグナルを低減させること
ができる。すなわち２ステップアッセイにおいて、固相
への非特異的結合を低減させた特異的結合アッセイ方法
を提供する。

【００５５】一方、本発明の特異的結合アッセイ用反応
試薬は、２ステップアッセイに使用するとき、アビジン
またはストレプトアビジンを固定化した固相への非特異
的結合を低減させる効果を奏する。被検成分の種類に応
じて反応試薬中の好適なビオチン含有量を適宜選択する
ことができ、被検成分の項目ごとにアッセイ用試薬キッ
トとして供給するのに便利である。

【００５６】本願第五の発明のように、第１の反応混合
物を得る工程のあとに固相を洗浄する工程を設ける２ス
テップアッセイにおいて、本発明の反応試薬を第２の反
応混合物を得る工程で用いることにより、非特異的結合
を低減させた特異的結合アッセイ方法を提供する。

【００５７】更に本願第六の発明のように、第１の反応
混合物を得る工程のあとに固相を洗浄する工程を設ける
２ステップアッセイにおいて、本発明の洗浄液、および
本発明の反応試薬を用いることにより、洗浄液中のビオ
チンおよび反応試薬中のビオチンの両者の非特異的結合
低減効果をあわせもった総合的な低減効果を奏する。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ビオチンを含有することを特徴とする、特
   異的結合アッセイ用洗浄液。
2. 【請求項２】ビオチンを１ｎｍｏｌ／ｍＬないし１００
   ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度で含有する、請求項１記載の洗浄
   液。
3. 【請求項３】溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方
   法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
   （１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
   結合物質（２）、被検成分（３）、および被検成分に対
   する標識した第２の特異的結合物質または標識した被検
   成分類似体（４）を接触させて固相と液相からなる反応
   混合物を得る工程、 ・前記反応混合物中の固相を液相から分離し、請求項１
   または２に記載の洗浄液を用いてその固相を洗浄する工
   程、及び ・洗浄した前記固相上の標識を検出する工程、を含むこ
   とを特徴とする方法。
4. 【請求項４】前記反応混合物を得る工程が、（２）、
   （３）および（４）を互いに接触させた後、（１）を接
   触させる工程である請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方
   法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
   （１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
   結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて固
   相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、 ・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、請
   求項１または２に記載の洗浄液を用いてその固相を洗浄
   する工程、 ・洗浄した前記固相に、被検成分に対する標識した第２
   の特異的結合物質または標識した被検成分類似体（４）
   を接触させて、固相と液相からなる第２の反応混合物を
   得る工程、及び ・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固
   相上の標識を検出する工程、 を含むことを特徴とする方法。
6. 【請求項６】ビオチンと、被検成分に対する標識した特
   異的結合物質または標識した被検成分類似体とを含むこ
   とを特徴とする、特異的結合アッセイ用反応試薬。
7. 【請求項７】ビオチンの濃度が１ｎｍｏｌ／ｍＬないし
   １００ｎｍｏｌ／ｍＬである請求項６記載の反応試薬。
8. 【請求項８】溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方
   法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
   （１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
   結合物質（２）、および被検成分（３）を接触させて、
   固相と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、 ・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離する工
   程、 ・分離した前記固相に、請求項６または７に記載の反応
   試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物
   を得る工程、及び ・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固
   相上の標識を検出する工程、を含むことを特徴とする方
   法。
9. 【請求項９】溶液中の被検成分の特異的結合アッセイ方
   法において、 ・アビジンまたはストレプトアビジンを固定化した固相
   （１）、被検成分に対するビオチン化した第１の特異的
   結合物質（２）および被検成分（３）を接触させて固相
   と液相からなる第１の反応混合物を得る工程、 ・前記第１の反応混合物中の固相を液相から分離し、請
   求項１または２に記載の洗浄液を用いてその固相を洗浄
   する工程、 ・洗浄した前記固相に、請求項６または７に記載の反応
   試薬を接触させて固相と液相からなる第２の反応混合物
   を得る工程、及び ・前記第２の反応混合物中の固相を液相から分離し、固
   相上の標識を検出する工程、を含むことを特徴とする方
   法。