CN102439446A

CN102439446A - 检测生物学样品中的物质的方法

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Publication number: CN102439446A
Application number: CN2010800156081A
Authority: CN
Inventors: 高仓由光; 冈直美; 近藤一博
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2012-05-02
Also published as: JPWO2010114031A1; CA2756109A1; US9034590B2; KR20120003903A; IL215321A0; EP2416158A1; AU2010232305A1; SG174558A1; US20120088313A1; JP5628793B2; BRPI1015445A2; EP2416158A4; WO2010114031A1; AU2010232305B2; RU2011143787A

Abstract

本发明涉及检测生物学样品中的物质的方法、该方法中使用的承载体、以及试剂盒。该方法包括下述步骤：1)准备结合有生物素结合性蛋白质的承载体、以及将生物素结合在特异性结合需检测物质的蛋白质上而成的生物素化蛋白质；2)藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合将生物素化蛋白质结合在步骤1)中准备的承载体上，制作结合有生物素化蛋白质的承载体；3)将(a)生物学样品，以及(b-i)从与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液、和生物素结合性蛋白质，或者(b-ii)从通过基因工程技术使与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞表达生物素结合性蛋白质而得到的细胞制备的细胞破碎提取液混合并添加至步骤2)中制作的结合有生物素化蛋白质的承载体；然后4)检测特异性结合于生物素化蛋白质的被检物质。

Description

检测生物学样品中的物质的方法

技术领域

本发明涉及定性地和/或定量地检测生物学样品中的物质的方法。通过本发明的方法尤其还能够对生物学样品中微量存在的、通常检测困难的物质进行检测。

背景技术

为了检测生物学样品中的物质，传统上广泛采用利用特异性结合该物质(被检物质)的物质的方法。例如有利用抗原抗体反应的所谓免疫测定、利用核酸链之间的氢键的核酸杂交等。例如，在免疫测定的情况下，如果被检物质是抗体就将抗原、相反地如果被检物质是抗原就将抗体固定化在微板、微珠或传感器芯片等承载体上，使之与被检物质反应后，检测、测定抗原抗体反应的有无或程度。

作为固定化的通用方法，已知有疏水键、共价键等。“疏水键”利用承载体的疏水性表面与和需检测物质特异性结合的蛋白质(以下有时也称作“特异性蛋白质”)的疏水性部分之间的相互作用使承载体与特异性蛋白质结合，从无需特殊试剂这一点来说是简便的。然而，一般而言结合力弱，在用于ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)等的情况下，在结合后的洗涤操作等中蛋白质从承载体上脱离的情况时有发生。此外，在通过疏水键使特异性蛋白质与承载体结合的情况下，许多该蛋白质完全或部分丧失其功能的情况时有发生。“共价键”利用特异性蛋白质中的官能团(例如氨基)与配置于承载体表面的官能团(例如羧基)之间的相互作用，结合力强。但是，在通过共价键使特异性蛋白质与承载体结合的情况下，与疏水键的情况相似，结合的蛋白质常常会完全或部分丧失其功能。

除了疏水键和共价键以外，还已知将多个组氨酸融合在蛋白质的末端、使该具有组氨酸标签的融合蛋白质结合于表面配置有镍的例如蛋白芯片等基板等上的方法。然而，组氨酸标签与镍离子的相互作用不是很强，而还已知镍离子存在与各种生物分子的非特异性结合。

此外，还考察了利用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白的生物素(维生素H)结合性来使蛋白质结合于承载体的方法。抗生物素蛋白是卵清来源的糖蛋白质，可与生物素极强力地结合。抗生物素蛋白与生物素的相互作用是最强的非共价键之一(Green(1975)Adv Protein Chem 29：85-133)。此外，链霉抗生物素蛋白是放线菌来源的抗生物素蛋白样蛋白质，亦与生物素强结合。生物素是分子量244的小分子，使用市售的试剂盒等能够容易地使其与各种生物分子例如蛋白质、核酸、脂质或者糖链等结合，且很少会改变生物素化的分子的性质。至今为止，(链霉)抗生物素蛋白-生物素的相互作用因其作用力之强而在例如抗原、抗体的检测等分子生物学、生物化学领域有着广泛应用(Green(1990)Methods Enzymol 184：51-67)。当利用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白使蛋白质与承载体结合时，有首先通过共价键、疏水键使(链霉菌)抗生物素蛋白结合于诸如微板等基板，再通过使其与生物素化的蛋白质结合而进行固定化的方法。此外，还报道了下述技术：首先藉由抗生物素蛋白-生物素结合使抗生物素蛋白结合在结合有生物素的基板上，然后通过使生物素化的希望的蛋白质结合于抗生物素蛋白的其他生物素口袋，而在其上按基板-生物素-抗生物素蛋白-生物素-希望的蛋白质的顺序进行固定(日本特开平4-236353)。使用采用这样的方法固定化的平板，可以检测被检物质。

一般而言，在使用通过疏水键或共价键结合有抗原、抗体这样的与特异性结合被检物质的蛋白质的固相的特异性结合测定系统中，减少作为背景信号的原因的非特异性结合是重要课题。作为解决该课题的方法，提出了例如下述方法：使细菌成分提取液中含有检测用试剂的方法(日本特开昭59-99257)；将导入了与用于产生特异性结合被检物质的重组蛋白质的载体同种类、且不包含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法(日本特开平8-43392)；对与产生特异性结合被检物质的重组蛋白质的细胞同种类、且不包含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(特开2004-301646)等。通过这些方法，可见对非特异结合的抑制具有一定效果。

此外，在利用抗生物素蛋白-生物素结合的测定中，与使用通过疏水键、共价键等结合有特异于被检物质的蛋白质的固相的测定相似，背景信号的应对也是一个大问题。对此，除了上述的非特异抑制方法以外，还提出了下述方法：使样品接触结合有灭活的(链霉)抗生物素蛋白的固相后，再与结合有活性(链霉菌)抗生物素蛋白的固相接触的方法(特开平8-114590)；使生物素化物质与抗生物素蛋白结合固相结合后，再与聚乙二醇和生物素的偶联物接触的方法(日本特开平11-211727)；使之与含有生物素的溶液接触的方法(特开2002-48794)等。然而，实用上的效果不可谓充分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开昭59-99257

专利文献2：特开平8-43392

专利文献3：特开2004-301646

专利文献4：特开平4-236353

专利文献5：特开平8-114590

专利文献6：特开平11-211727

专利文献7：特开2002-48794

非专利文献

非专利文献1：Green(1975)Adv Protein Chem 29：85-133

非专利文献2：Green(1990)Methods Enzymol 184：51-67

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供定性地和/或定量地检测生物学样品中的物质的方法。

本发明的目的特别在于提供在抑制背景信号的同时对生物学样品中微量存在的物质定性地和/或定量地进行检测、测定的方法。

解决问题的方法

本发明人等进行了深入研究，对在利用生物素-生物素结合性蛋白质间的结合将在特异性结合被检物质的蛋白质上结合生物素而成的生物素化蛋白质固定化在承载体上而得到的系统中、特别是在对生物学样品中微量存在的物质进行检测时降低背景信号进行了钻研，从而想到了本发明。具体地，在向生物学样品中添加细胞破碎提取液以及生物素结合性蛋白质的情况下，降低非特异结合的效果显著。或者，添加从通过基因工程技术表达生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液来替代添加生物素结合性蛋白质，也能够取得同样效果。

基于以上认识，本发明提供在利用抗生物素蛋白-生物素结合、将特异性地检测被检物质的物质固定化在承载体上而成的系统中，非特异结合减少、灵敏度更高的检测方法。

本发明包括以下实施方式，但不限于此。

[实施方式1]

一种检测生物学样品中的物质的方法，所述方法包括：

1)准备结合有生物素结合性蛋白质的承载体、以及将生物素结合在特异性结合需检测物质的蛋白质上而成的生物素化蛋白质；

2)藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合，将生物素化蛋白质结合在步骤1)中准备的承载体上，制作结合有生物素化蛋白质的承载体；

3)将(a)生物学样品，以及

(b-i)步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或从与用于表达生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液、和生物素结合性蛋白质、或者

(b-ii)步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或从使与用于表达生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞通过基因工程技术表达生物素结合性蛋白质而得到的细胞制备的细胞破碎提取液

混合并添加至步骤2)中制作的结合有生物素化蛋白质的承载体；然后

4)检测特异性结合于生物素化蛋白质的被检物质。

[实施方式2]

实施方式1所述的方法，其中，在实施方式1的步骤3(b-i)中，添加从包含任意载体的细胞提取得到的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。

[实施方式3]

实施方式1或2中任一项所述的方法，其中，生物素结合性蛋白质是tamavidin或其突变体。

[实施方式4]

实施方式1～3中任一项所述的方法，其中，生物学样品选自血液、血清、脑脊液、唾液、咽拭子、汗、尿、泪液、淋巴液、精液、腹水以及母乳。

[实施方式5]

一种用于稀释生物学样品的试剂，该试剂包含：

1)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质；或

2)从通过基因工程技术表达生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液。

[实施方式6]

一种用于检测生物学样品中的物质的试剂盒，该试剂盒包含：

A)通过生物素-生物素结合性蛋白质间结合而结合有将生物素结合在特异性结合需检测物质的蛋白质上而成的生物素化蛋白质的承载体；以及

用于稀释生物学样品的试剂，该试剂包含：

B-i)从与用于表达A)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液，和生物素结合性蛋白质、或者

B-ii)从通过基因工程技术使与用于表达A)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞表达生物素结合性蛋白质而得到的细胞制备的细胞破碎提取液。

发明效果

根据本发明的方法，在生物学样品中的被检物质的检测中，能够抑制背景信号，稳定地进行更高灵敏度的检测。本发明的方法，特别是还可以用于生物学样品中微量存在的、通常难以检测或准确定量的物质的检测、测定。

附图说明

[图1]图1显示了BioEase标签(生物素化标签)融合SITH-1蛋白质的表达。具体地，图1A是用于SITH-1蛋白质检测的western印迹的结果，图1B是用于生物素化蛋白质检测的活性染色的结果。

对表达BioEase标签融合SITH-1蛋白质的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声波破碎，将所得大肠杆菌粗提取液级分用SDS-PAGE(15％丙烯酰胺凝胶)展开，使得为20μg总蛋白质/泳道，然后转印至PVDF膜。

具体地，图1A是与抗SITH-1抗体(1/1000稀释)反应后，再与碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔IgG抗体(1/1000稀释)反应，然后利用AP进行染色。图1B是链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)(1/1000稀释)反应后的染色图像。图1A、图1B中，对照均采用仅具有表达载体的大肠杆菌来源的提取样品。BioEase标签融合SITH-1蛋白质的位置用箭头示出。

图1B的Streptavidin-HRP染色中，检测到2条粗条带。下方的条带用图1A的抗SITH-1抗体未检出，因而可以认为其是SITH-1位点的一部分发生分解后的带BioEase标签的蛋白质。

[图2]图2是显示各种血清稀释液对非特异结合的效果的图表。将血清用PBS稀释的区以白四边形(虚线)标示、用在PBS中加入纯化tamavidin2(TM2)而得到的液体稀释的区以白四边形(实线)标示、用仅具有表达载体的大肠杆菌破碎提取液稀释的区以星号(虚线)标示、用在仅具有表达载体的大肠杆菌破碎提取液中加入纯化TM2而得到的液体稀释的区以星号(实线)标示、用表达TM2的大肠杆菌破碎提取液稀释的区以黑圈(实线)标示。各图表的纵轴(发光)表示抗SITH-1抗体的检出量，横轴表示梯度稀释的抗SITH-1抗体的稀释比例。

[图3]图3是根据图2所示的结果，针对各抗SITH-1抗体的稀释比例求出S/N比的图表。

将血清用PBS稀释的区以白四边形(虚线)标示、用在PBS中加入纯化tamavidin2(TM2)而得到的液体进行稀释的区以白四边形(实线)标示、用仅具有表达载体的大肠杆菌破碎提取液稀释的区以星号(虚线)标示、用在仅具有表达载体的大肠杆菌破碎提取液中加入纯化TM2而得到的液体进行稀释的区以星号(实线)标示、用表达TM2的大肠杆菌破碎提取液稀释的区以黑圈(实线)标示。

发明的具体实施方式

I.检测生物学样品中的物质的方法

本发明的检测方法包括：

2)藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合将生物素化蛋白质结合在步骤1)中准备的承载体上，制作结合有生物素化蛋白质的承载体；

3)将(a)生物学样品、以及

(b-i)从与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液、和生物素结合性蛋白质、或者

(b-ii)从通过基因工程技术使与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞表达生物素结合性蛋白质而得到的细胞制备的细胞破碎提取液，混合并添加至步骤2)中制作的结合有生物素化蛋白质的承载体；然后

4)检测特异性结合于生物素化蛋白质的被检物质。

1.生物学样品中的检测物质

本发明涉及检测生物学样品中的物质的方法。

作为本发明中的生物学样品，没有特殊限制，只要是可能包含作为检测对象的物质即可。可以是包含采集自生物的细胞、组织或其碎片等的样品，例如体液，更优选是血液、血清、脑脊液、唾液、咽拭子、汗、尿、泪液、淋巴液、精液、腹水以及母乳等。

这些体液可以视需要稀释使用。稀释率是通常2倍～10000倍左右、优选100倍～1000倍左右，但不限于此。用于稀释的溶液可以使用任意缓冲液，也可以包含适当的封闭剂。作为封闭剂，以抑制非特异性结合的效果高者为佳，可以使用BSA、酪蛋白等本领域技术人员公知的封闭剂。

作为本发明的被检物质，没有特殊限制，是生物学样品中的希望检测或测定的物质即可，优选可以列举出抗体、抗原等蛋白质或其片段、肽、核酸、激素、糖类、糖脂、或者生物学样品中包含的细菌、病毒等。

本发明也能够测定生物学样品中浓度低，采用传统方法难以检测、准确定量的物质。例如，在被检物质是血清中的抗体、且其抗体效价低的情况下(例如下述这样的低抗体效价的情况：在将血清1000倍稀释的情况下难以检测，而100倍稀释的情况下勉强能够检测)，需要抑制血清的稀释率，结果血清中成分来源的非特异性结合也会增加，因而采用现有方法难以进行该抗体的检测、定量，但采用本发明的方法则能够容易地检测，或者更准确地定量。

并非进行限定，在本发明中的被检物质是抗体的情况下，包括例如针对Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6(由HHV-6的潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质)(SITH-1)的抗体。此外，可以列举出针对疱疹病毒的上述以外的抗原的抗体、针对巨细胞病毒、肝炎病毒、HIV病毒、HTLV病毒、麻疹病毒、流感病毒等来源的病毒相关抗原的抗体、或者针对幽门螺旋杆菌等来源的细菌相关抗原的抗体、或者针对真菌相关抗原的抗体等。

此外，并非进行限定，在本发明中的被检物质是抗原的情况下，可以列举出上述病原体来源的抗原、癌抗原、前列腺特异抗原等。

基于PCT/JP2008/67300的记载内容的SITH-1

(1)SITH-1蛋白质、核酸

SITH-1蛋白质、核酸的结构以及功能在PCT/JP2008/67300中公开，将其全部内容引用在本说明书中。

SITH-1是参与疱疹病毒的潜伏感染的因子、更具体地是疱疹病毒的潜伏感染时特异性地表达的蛋白质。这里，“疱疹病毒的潜伏感染时特异性地表达”是指：在感染疱疹病毒的宿主中，疱疹病毒潜伏感染(未进行增殖感染)时，疱疹病毒来源的基因或基因产物特异性地表达。

作为SITH-1的蛋白质以及核酸，可以列举出例如由(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质、以及编码该蛋白质的核酸。

由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的SITH-1蛋白质如后述的参考例所示，是作为在人疱疹病毒-6(HHV-6)的潜伏感染时特异性地表达的蛋白质被分离、鉴定的。SITH-1蛋白质具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，该蛋白质由159个氨基酸组成，分子量约17.5kDa。

SITH-1蛋白质由SITH-1基因的核酸编码。该SITH-1基因的cDNA如SEQ ID NO：3所示，具有1795个碱基对(约1.79kbp)的大小，954位～956位的碱基序列是起始密码子(Kozak ATG)，1431位～1433位的碱基序列是终止密码子(TAA)。因此，所述SITH-1核酸具有SEQ ID NO：3所示的碱基序列中的第954位至第1430位的碱基序列作为开放阅读框(ORF)，此ORF具有477个碱基对(约0.48kbp)的大小。将SITH-1的cDNA之中表示ORF区域的碱基序列示于SEQ ID NO：2。此外，所记载的SEQ ID NO：2所示的碱基序列包含了终止密码子的3个碱基。

SITH-1核酸经常在潜伏感染有HHV-6的细胞的细胞质中表达，但在增殖感染细胞中未观察到表达。编码SITH-1蛋白质的核酸由与目前为止报告的HHV-6潜伏感染特异性基因(H6LT)构成互补链关系的DNA编码，其表达在HHV-6的潜伏感染的中间阶段增强。由这些事实可以认为SITH-1蛋白质是在HHV-6的潜伏感染时特异性地表达的蛋白质。

SITH-1蛋白质与作为宿主蛋白质的CAML(钙调节性亲环蛋白配体，Accesion#；U18242)结合，提高神经胶质细胞内钙浓度。CAML在宿主生物内大量存在于脑和淋巴细胞，是已知能够提高细胞内的钙浓度的蛋白质。此外据信，基于SITH-1蛋白质的表达的细胞内钙浓度的提高带来潜伏感染细胞内的普遍性的信号传导的活化，对HHV-6的高效率的再活化做出贡献。

已知HHV-6在脑内的神经胶质细胞中潜伏感染，据信如果处于潜伏感染时或作为活性高的潜伏感染状态的中间阶段的HHV-6表达SITH-1，则神经胶质细胞内的钙浓度提高。据信脑的细胞中的细胞内钙浓度的提高与心境障碍等精神障碍有很大关系(理研年报2003)。

SITH-1蛋白质保持与宿主蛋白质CAML结合的活性，具有提高细胞内钙浓度的功能。此外，通过将SITH-1蛋白质在被认为是表达该蛋白质最强的脑内的神经胶质细胞中表达，能够诱导精神障碍。因此，据信SITH-1蛋白质具有在疱疹病毒的潜伏感染时或再活化初期表达，使宿主产生精神障碍的功能。

(2)针对SITH-1的抗体

针对SITH-1的抗体可以以SITH-1蛋白质或其突变体、或者它们的部分肽作为抗原，采用公知方法以多克隆抗体或单克隆抗体的形式得到。作为公知方法，可以列举出例如文献(Harlow等的“Antibodies：A laboratorymanual(Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988))”、岩崎等的“モノクロ一ン抗体ハイブリド一マとELISA、讲谈社(1991)”)所述的方法。这样得到的抗体可以用于SITH-1蛋白质的检测、测定等。

术语“抗体”是指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM以及它们的Fab片段、F(ab′)₂片段、Fc片段)，作为例子可以列举多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体以及人源化抗体，但并不限定于这些抗体。

术语“识别SITH-1蛋白质的抗体”意思是包含可以与SITH-1蛋白质特异性结合的完整的分子以及抗体片段(例如Fab以及F(ab′)₂片段)。Fab、F(ab’)₂以及SITH-1抗体的其他片段可以按照本说明书中公开的方法、或公知方法来使用。典型地，这样的片段通过基于使用如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)₂片段)等酶进行的蛋白质分解的切割而产生。

据信心境障碍患者或具有心境障碍的可能性的个体中，SITH-1蛋白质的表达量增加，其结果是SITH-1抗体效价也提高。本发明在一个实施方式中，通过检测生物学样品中的SITH-1抗体，能够鉴定出心境障碍患者或具有心境障碍可能性的个体。

2.结合有生物素结合在特异性结合需检测物质的蛋白质上而成的生物素化蛋白质的承载体

本发明中利用了通过生物素-生物素结合性蛋白质间结合结合有将生物素结合在特异性结合需检测物质的蛋白质上而成的生物素化蛋白质的承载体。

本发明的承载体可以如下地制作：

2)藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合，将生物素化蛋白质结合在步骤1)中准备的承载体上，制作结合有生物素化蛋白质的承载体。

“生物素”是D-[(+)-顺-六氢-2-氧代-1H-噻吩并-(3，4)-咪唑-4-戊酸]的通用名。生物素是属于B族维生素的一种水溶性维生素，也称作维生素B₇、维生素H或辅酶R。生物素非常强烈地结合卵清中所含的一种糖蛋白质-抗生物素蛋白，使其吸收遭到阻碍。因此，大量摄入生卵清有时会产生生物素缺乏症。

在本说明书中，“生物素”除了上述的生物素以外，还包括亚氨基生物素(iminobiotin)(Hofmann，et al.，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4666-4668)、脱硫生物素(desthiobiotin)(Hirsch，et al.，(2002)Anal.Biochem.，308：343-357)、生物胞素(biocytin)或生物素亚砜(biotin sulfoxide)等生物素类似物。

使用生物素-抗生物素蛋白(生物素结合性蛋白质)复合体的系统广泛应用于生物化学、分子生物学、组织免疫学、DNA分析或者临床检查等领域。

本发明包括利用生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合将特异性结合需检测物质的蛋白质固定在承载体上。在本发明中，有时也将“生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合”称作“抗生物素蛋白-生物素结合”。

生物素结合性蛋白质

作为生物素结合性蛋白质，只要是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、AVR蛋白质(Biochem.J.，(2002)，363：609-617)、Bradavidin(J.Biol.Chem.，(2005)，280：13250-13255)、Rhizavidin(Biochem.J.，(2007)，405：397-405)、tamavidin或它们的突变体等与生物素强结合的蛋白质，均可以适宜使用。优选地，与生物素的解离常数(KD)是10^-8M以下、更优选10^-10M以下、更优选10^-12M以下。但是，关于被检样品中添加的生物素结合性蛋白质如后述。

作为生物素结合性蛋白质，特别优选可以使用在大肠杆菌中高表达的tamavidin及其突变体。tamavidin是在食用蘑菇担子菌白黄侧耳(pleurotuscomucopiae)中发现的生物素结合性蛋白质(WO 02/072817；Takakura et al.，(2009)FEBS J.，276：1383-1397)。作为tamavidin的突变体，可以列举出例如高结合能力/低非特异性结合tamavidin(PCT/JP2009/64302)等。

本发明中的“tamavidin”是指：tamavidin 1(TM1)、tamavidin 2(TM2)或它们的突变体。具体地，本发明的tamavidin典型地可以是包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质，或者可以是由包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者，本发明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的氨基酸序列的蛋白质或由包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、且具有与tamavidin 1或2相同的生物素结合活性的蛋白质或具有高结合能力/低非特异性结合的活性的蛋白质。在本说明书中，有些情况下也简单地将tamavidin 1、tamavidin 2以及它们的突变体统称为tamavidin。

tamavidin 1或2的突变体可以是包含在SEQ ID NO：5或7的氨基酸序列中包含1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列、并且具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性的蛋白质。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似的物理化学特征的残基。保守取代的非限制性例子包括含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。

通过氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而产生的突变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA进行例如作为公知技术的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982，通过引用将其全文引入到本说明书中)来制作。在本说明书中，“一个或多个氨基酸”是指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本说明书中，“一个或多个氨基酸”根据情况也可以指1个或数个氨基酸。并非进行限定，“1个或多个氨基酸”是指50个以内、优选40个以内、30个以内、20个以内、10个以内、8个以内、5个以内、3个以内的氨基酸。

tamavidin 1或2的突变体还可以是包含与SEQ ID NO：5或7的氨基酸序列具有至少60％以上、优选65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上、更优选99.3％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列，并且具有与tamavidin 1或2等同的生物素结合活性或者具有高结合能力/低非特异性结合的活性的蛋白质。

两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者，两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.，48：443-453，1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括：(1)Henikoff，S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)所记载的得分/矩阵、blosum62；(2)空位权重12；(3)空位长权重4；以及(4)末端空位不扣分。

也可使用该领域技术人员使用的其它进行序列比较的程序。关于同一性百分比，例如，可以使用Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中记载的BLAST程序与序列信息进行比较来加以确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA DataBank of Japan(DDBJ)网站使用。在相同站点上对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。

两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，或者，此类比较更优选使用计算机程序比较序列信息来进行。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG；威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等，1984，Nucl.Acids Res.，12：387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。

而且，结合于承载体的“生物素结合性蛋白质”用于制作藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合而结合有生物素化蛋白质的承载体。因而，并非进行限定，优选上述tamavidin1或2的突变体与利用它们的野生型形成生物素化蛋白质的情况相比较，生物素结合活性没有大幅减少。

因而，非限定性地，关于tamavidin1的突变体，优选在SEQ ID NO：5的氨基酸序列中N14、S18、Y34、S36、S78、W82、W98、W110、D118不进行修饰。而且，该表示方式中，例如Y34是指SEQ ID NO：5的氨基酸序列的第34位的酪氨酸残基。或者，在对它们进行修饰的情况下，优选修饰为性质或者结构类似的氨基酸，例如，优选地，对于天冬酰胺(N14)，修饰成谷氨酰胺(Q)或天冬氨酸(D)，优选天冬氨酸；对于丝氨酸(S18、S36、S78)，修饰成苏氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，优选苏氨酸；对于酪氨酸(Y34)，修饰成丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，优选苯丙氨酸；对于色氨酸(W82、W98、W110)，修饰成苯丙氨酸(F)；对于天冬氨酸(D118)，修饰成谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)，优选天冬酰胺。

此外，对于tamavidin2的突变体，优选在SEQ ID NO：7的氨基酸序列中4个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)不进行修饰。或者，在对它们进行修饰的情况下，优选修饰成性质或者结构类似的氨基酸，例如苯丙氨酸(F)。此外，对于被认为与生物素直接相互作用的氨基酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)也希望不进行修饰。或者，在对它们进行修饰的情况下，优选修饰成性质或者结构类似的氨基酸，以便能够保持与生物素的结合，例如，优选地，对于天冬酰胺(N14)，修饰成谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，优选天冬氨酸；对于天冬氨酸(D40)，修饰成天冬酰胺(N)；对于丝氨酸(S18、S36、S76)，修饰成苏氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，优选苏氨酸；对于酪氨酸(Y34)，修饰成丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，优选苯丙氨酸；对于苏氨酸(T78)，修饰成丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)，优选丝氨酸；对于天冬氨酸(D116)，修饰成谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，优选天冬酰胺。

在本发明中，优选的tamavidin修饰体包括以下修饰体。(PCT/JP2009/64302)。

在包含SEQ ID NO：7所述的氨基酸序列、或者在该序列中具有1～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80％以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的1或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质：

1)SEQ ID NO：7的104位的精氨酸残基；

2)SEQ ID NO：7的141位的赖氨酸残基；

3)SEQ ID NO：7的26位的赖氨酸残基；以及

4)SEQ ID NO：7的73位的赖氨酸残基。

更优选地，选自下组中的修饰型生物素结合蛋白质：

在SEQ ID NO：7中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(R104E-K141E)；

在SEQ ID NO：7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E)；

在SEQ ID NO：7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-K141E)；以及

在SEQ ID NO：7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E-K141E)。

结合有生物素结合性蛋白质的承载体

构成固体承载体的材料包括纤维素、特氟隆(注册商标)、硝基纤维素、琼脂糖、高交联球形琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、聚苯乙烯胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳以及它们的组合，但不限于此。此外，优选具有一定强度、组成稳定、且非特异结合少者。

固体承载体的形状包括但不限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体承载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。

本发明的一类实施方式中，珠子可以具有约25nm～约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，珠子具有约50nm～约10μm范围的直径。珠子的大小可以根据特定用途进行选择。

并非进行限定，例如，在希望高检测灵敏度的情况下，从需检测物质与与之特异性结合的物质之间的接触频率、洗涤操作的容易性这样的观点出发，优选使用诸如上述的珠子作为固体承载体。

作为制作结合有生物素结合性蛋白质的承载体的方法，可以将生物素结合性蛋白质直接结合于承载体，或者可以购买预先固定化有生物素结合性蛋白质的承载体。或者，也可以藉由生物素-生物素结合性蛋白质间结合来结合于生物素化的承载体。

作为使生物素结合性蛋白质直接结合的方法，有利用疏水键、共价键的方法等。或者，可以在诸如NEW ELISA Plate Kit(SUMITOMO BAKELITE公司)等微板上，按照试剂盒附带的说明书直接结合、固定化生物素结合性蛋白质。而且，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白在例如SIGMA公司等有售。

在利用疏水键的情况下，利用承载体的疏水性表面与生物素结合性蛋白质的疏水性部分之间的相互作用进行结合。具体地，通过使生物素结合性蛋白质溶液直接接触例如微板等(例如但不限于，Nunc-Immunoyy Plate(Nunc公司)、SpectraPlate-96HB(Perkin Elmer公司)、或者Reacti-Bind(商标)96-Well Plates Corner Notch(PIERCE公司)等)承载体表面，放置一定时间，借助生物素结合性蛋白质的疏水性部分与承载体的疏水性部分之间的相互作用使之结合、固定化。

另一方面，在利用共价键的情况下，在承载体的表面配置官能团，使之与生物素结合性蛋白质中的官能团结合。为了进行这样的结合，表面配置有各种官能团的各种承载体已经市售，可以优选使用。例如但并非限定，作为表面配置有官能团的微板，马来酸酐平板有例如Reacti-Bind(商标)MaleicAnhydride Activated Polystyrene 96-Well Plates(PIERCE公司)，活性型氨基平板有例如Immobilizeryy-Amino Modules/Plates(Nunc公司)，羧基平板有例如ELISA用平板MS-8796F(96孔·C型·平底·羧基)(SUMITOMO BAKELITE公司)。此外，在表面配置有官能团的微珠方面，作为高交联琼脂糖珠有例如Sepharose(商标)(GE Healthcare Bio-Science公司)，作为磁珠有例如Dynabeads(商标)(Dynal公司)等，但不限于此。生物素结合性蛋白质与固体载体的连接可以按照承载体附带的说明书来进行。

具体地，并非进行限定，可以采用本领域技术人员公知的蛋白质与固体载体的偶联方法来进行。例如，可以对固体承载体表面进行修饰，使得羧基露出来，然后使该羧基与生物素结合性的氨基在交联试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在下进行偶联反应，从而将生物素结合性蛋白质与固体承载体连接起来。或者，例如，通过将表面的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯化后的固体承载体与生物素结合性蛋白质在不含伯氨基的pH6.5～9的缓冲液中混合，可以将固体承载体表面的羧基与生物素结合性蛋白质的氨基连接起来。或者，可以使用交联试剂BS3(双[硫代琥珀酰亚胺基]辛二酸酯)或DSS(二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)将固体承载体表面的氨基与生物素结合性蛋白质的氨基连接起来，或者使用交联试剂SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS(N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺)将固体承载体表面的氨基与生物素结合性蛋白质的巯基连接起来。

作为固定化有生物素结合性蛋白质的承载体，可以列举出例如Reacti-Bindyy Streptavidin Coated Plates(PIERCE公司)、Nunc StreptavidinCoated 96Micro Wellyy Plates(Nalge Nunc公司)等微板类、或者DynabeadsM-280Streptavidin(Dynal公司)、MagnaBindyy Streptavidin Beads(PIERCE公司)等磁珠类等市售品，但不限于此。

此外，生物素结合性蛋白质也可以如上述将承载体生物素化，藉由抗生物素蛋白-生物素结合来结合。即，利用生物素结合性蛋白质多为四聚体的事实，在结合有生物素的承载体上结合生物素结合性蛋白质，然后再结合生物素化的蛋白质的方法。

作为使生物素结合于承载体的方法，可以列举出例如使用生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如PIERCE公司制造的EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-生物素(13.5埃、伯胺)(括号内依次为接头长度、反应基团)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LC-生物素(22.4埃、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5埃、伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-生物素(9.6埃、胺)、EZ-Link(注册商标)马来酰亚胺-PEO₂-生物素(29.1埃、硫醇基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PEO₂胺(20.4埃、羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PEO₃-LC胺(22.9埃、羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-酰肼(15.7埃、醛基)、EZ-Link(注册商标)生物素-LC-酰肼(24.7埃、醛基)、EZ-Link(注册商标)NHS-亚胺基生物素(13.5埃、伯胺)等，但不限于此。

使用上述生物素化试剂，可以采用公知方法在微板、微珠或者传感器芯片等期望的承载体上结合生物素。例如有使用具有氨基、羧基、巯基、甲苯磺酰基、环氧基、马来酰亚胺基、活化酯等各种官能团的承载体(例如磁珠、Sepharose珠子、琼脂糖珠子、胶乳珠子、微滴定板等)的方法。这些情况例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，通过用DMSO(二甲基亚砜)这样的有机溶剂或pH7-9的磷酸缓冲液进行溶解、并添加至具有氨基的固定化承载体，可以结合生物素。此外，例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，通过使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)这样的碳化二亚胺，在将固定化承载体的羧基转换为活化酯后，添加用pH5附近的缓冲液溶解的生物素化试剂，可以结合生物素。而且，生物素化的固定化承载体优选在将未反应官能团灭活后，用BSA等进行封闭。

此外，可以利用生物素化的市售承载体。作为生物素化的微板，可以利用例如Reacti-Bind(商标)Biotin Coated Polystyrene Plates(PIERCE公司制)，但不限于此。在生物素化的微珠方面，例如，作为磁珠，可以利用BioMagBiotin(Polysciences公司制)；作为纳米磁珠，可以利用Corefront公司制的nanomag(注册商标)-D Biotin、nanomag(注册商标)-Silica Biotin；作为聚苯乙烯制微珠，可以利用Beadlyte(注册商标)Biotin Beads(Upstate公司制)；作为琼脂糖，可以利用Sigma公司制的Biotin Agarose、2-Iminobiotin-Agarose；作为高交联琼脂糖，可以利用Biotin-Sepharose(Bioresearch Technology公司制)，但不限于此。

承载体与生物素相连接的接头的长度优选至少长于5埃，更优选13.5埃以上。

通过使生物素结合性蛋白质接触这样的生物素化承载体，可以制作结合有生物素结合性蛋白质的承载体。

生物素化蛋白质

在本发明中，可以在特异性结合被检物质的蛋白质上结合生物素而制作生物素化蛋白质，并利用生物素-生物素结合性蛋白质间结合将其结合于承载体。

作为生物素化蛋白质的制作方法，没有特殊限制，可以使用生物素标记试剂盒(例如但不限于，EZ-Linkyy NHS-Lc-Biotin PIERCE公司)、BiotinLabeling Kit-NH2(DOJINDO MOLECULAR TECHNOLOGIES INC.公司)等)在特异性结合被检物质的蛋白质上结合生物素。或者，可以通过将特异性结合被检物质的蛋白质的基因与编码包含生物素化序列的肽的DNA融合，构建表达该融合基因的载体，并在任意宿主中以与生物素化序列所成的融合蛋白质的形式进行表达，来制作生物素化蛋白质(Schwarz et al.，(1988).J.Biol.Chem.263：9640-9645.)。作为这样的载体，并非进行限定，可以列举出例如包含有Invitrogen公司的BioEase(商标)标签的载体(本说明书的实施例1)。这其中，供哺乳类细胞表达用的有pcDNA(商标)6载体，供大肠杆菌表达用的有pET 104载体，或者供果蝇(Drosophila)表达用的有pMT/BioEase载体。

而且，对于期望的蛋白质的生物素化，也可优选利用与上述的将承载体生物素化时采用的方法相同的方法。即，可以列举出使用生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如PIERCE公司制造的EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-生物素(13.5埃、伯胺)(括号内依次为接头长度、反应基团)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LC-生物素(22.4埃、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5埃、伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-生物素(9.6埃、胺)、EZ-Link(注册商标)马来酰亚胺-PEO2-生物素(29.1埃、硫醇基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PEO2胺(20.4埃、羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-PEO3-LC胺(22.9埃、羧基)、EZ-Link(注册商标)生物素-酰肼(15.7埃、醛基)、EZ-Link(注册商标)生物素-LC-酰肼(24.7埃、醛基)、EZ-Link(注册商标)NHS-亚胺基生物素(13.5埃、伯胺)等，但不限于此。

使用这样的生物素化试剂，可以采用公知方法在期望的蛋白质上结合生物素。

例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，通过用DMSO(二甲基亚砜)这样的有机溶剂或pH7-9的磷酸缓冲液进行溶解、并添加至期望的蛋白质，可以结合生物素。此外，例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，通过使用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)这样的碳化二亚胺，在将期望的蛋白质的羧基转换为活化酯后，添加用pH5附近的缓冲液溶解的生物素化试剂，可以结合生物素。

而且，在如上述地使用生物素化试剂来制作生物素化蛋白质的情况下，优选预先对特异性结合被检物质的蛋白质进行纯化。纯化可以从该蛋白质原始来源的生物进行纯化，或者可以将编码该蛋白质的基因组入表达载体，并用期望的宿主细胞进行基因工程表达，然后再进行纯化。作为宿主细胞，可以列举出哺乳类细胞(非限制性地例如人、猴等灵长类、小鼠、大鼠、中国仓鼠等啮齿类、或者犬等来源的细胞)、昆虫细胞(利用杆状病毒的表达系统或果蝇的系统等)、酵母、大肠杆菌、植物、枯草杆菌等。优选可以列举出大肠杆菌。此外，例如，在人方面优选利用HEK293、HeLa、HepG2、293T，在啮齿类方面优选利用CHO、NIH3T3、PCI2，在其他哺乳类方面优选利用COS-1、COS-7、MDCK、Vero，在昆虫细胞方面优选利用Sf9、S2等已经确立的培养细胞系。此外，还可以使用利用小麦胚芽提取液、昆虫细胞提取液等的无细胞表达系统进行蛋白质的表达。

在表达载体方面，本领域技术人员能够适宜选择适于所用的宿主细胞的表达载体。

对表达出的蛋白质的纯化可以采用本领域技术人员公知的方法。可以组合使用常规的离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱等色谱，也可以使用纯化用的标签序列。在该情况下，例如，可以将特异性结合被检物质的蛋白质以与谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、纤维素结合蛋白、壳多糖结合蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白等所成的融合蛋白质形式在大肠杆菌、哺乳类等任意宿主中表达，分别利用与谷胱甘肽、麦芽糖、纤维素、壳多糖、硫氧还蛋白的亲和性(例如使用谷胱甘肽固定化柱)来进行纯化。此外，如果预先在和特异性结合被检物质的蛋白质的融合位点导入蛋白酶的识别位点，在纯化后通过用该蛋白酶处理标签序列，也能够将其除去。作为蛋白酶，可以是例如肠激酶、因子Xa等本领域技术人员公知的蛋白酶。此外，使用HisTag、Strep(II)-Tag，能够分别使用固定化有离子化的镍、StrepTactin的柱来进行纯化。而且，为了提高纯度，可以将多个标签和特异性结合被检物质的蛋白质融合，并将纯化方法组合。例如，可以在特异性结合被检物质的蛋白质的末端融合HisTag和BioEASE(商标)(Invitrogen公司)等的生物素化序列，在宿主中以重组蛋白质的形式进行表达后，用镍柱进行纯化，再用低亲和性抗生物素蛋白、低亲和性链霉抗生物素蛋白(例如SA mutein、Roche公司)柱进行纯化。

生物素化蛋白质与承载体的结合

在本发明中，通过准备结合有生物素结合性蛋白质的承载体和生物素化蛋白质，并使两者接触，能够通过抗生物素蛋白-生物素结合在承载体上结合蛋白质。

并非进行限定，以0.1mg/ml～5mg/ml、优选0.2mg/ml～2mg/ml的总蛋白质浓度准备含生物素化蛋白质的细胞破碎粗提取液。将其在10℃～40℃、优选20℃～30℃与结合有生物素结合性蛋白质的承载体接触5分钟～2小时、优选30分钟～1小时。通过该操作，生物素化蛋白质被固定化于结合有生物素结合性蛋白质的承载体。优选然后再于含0.05％～1％、优选0.1％～0.3％的Tween20等表面活性剂的PBS或者TBS等缓冲液中，洗去多余的细胞破碎粗提取物。

而且，在通过这样与细胞破碎粗提取液接触，结合生物素化蛋白质的情况下，事实上纯化与固定化同时进行。因此，该情况下，无需另外进行纯化作业。

此外，可以使0.1μg/ml～5μg/ml浓度的纯化的生物素化蛋白质与结合有生物素结合性蛋白质的承载体接触。

3.结合有生物素化蛋白质的承载体上生物学样品的添加

本发明的方法在步骤3)中，将(a)生物学样品、以及

(b)从与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液

混合并添加于步骤2)中制作的结合有生物素化蛋白质的承载体。

细菌破碎提取液的添加

一般地，在利用承载体的检测方法中，为了减少作为背景信号的原因的非特异结合，已知有下述方法：使细菌成分提取液中含有检测用试剂的方法(日本特开昭59-99257)；将导入了与用于产生特异性结合被检物质的重组蛋白质的载体同类、且不包含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法(日本特开平8-43392)；对与产生特异性结合被检物质的重组蛋白质的细胞同种类、且不包含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(特开2004-301646)等。

本发明人等进行了深入研究，想到了在利用生物素-生物素结合性蛋白质间的结合将检测用蛋白质结合于承载体的系统中，取得更显著效果的方法。具体地发现了：在使被检样品与承载体接触时，让细胞破碎提取液以及生物素结合性蛋白质这两者同时存在是理想的。

对细胞破碎提取液所来源的细胞没有特殊限制，可以是大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳类细胞、昆虫细胞、植物细胞等。但是，优选的是与用于表达生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞。例如，在用大肠杆菌制备生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的情况下，理想的是细胞破碎提取液也从大肠杆菌制备。此外，在利用无细胞系统表达生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的情况下，可以将使用的细胞破碎提取液直接、或者悬浮于期望的缓冲液来使用。根据用于表达生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞的组合，可以使用2种或2种以上的细胞破碎提取液。

此外，生物素结合性蛋白质和/或特异性结合需检测物质的蛋白质也可以不是通过基因工程技术表达的，而是从本来就具有这些蛋白质的细胞提取、纯化的。例如，在使用tamavidin作为生物素结合性蛋白质的情况下，也可以利用担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)细胞的细胞破碎提取液。这样，本来包含生物素结合性蛋白质和/或特异性结合需检测物质的蛋白质的细胞的破碎提取液也包含在本发明的细胞提取液中。

此外，用于制备细胞破碎提取液的细胞可以包含任意的载体、优选空载体。空载体是指与表达生物素结合性蛋白质、特异性结合被检物质的蛋白质、和/或其生物素化蛋白质时使用的载体同种类、且不包含编码这些蛋白质的基因的载体。此外，例如可以是这些空载体进一步包含任意核酸而成的任意载体。此外，也可以是与表达生物素结合性蛋白质、特异性结合被检物质的蛋白质和/或生物素化蛋白质时使用的载体无关的任意载体。

此外，作为细胞的破碎提取液，没有特殊限制，是细胞来源的成分即可，可以使用例如其蛋白质成分、糖类成分、脂质成分或其混合成分。优选地，可以使用细胞的可溶性提取物。

作为细胞的破碎提取液的制备方法，没有特殊限制，可以采用各种方法。通常，将用适宜的培养基培养过的细胞通过超声波等物理手段或者使用表面活性剂等的化学手段或者酶处理等进行破碎或者可溶化，通过离心分离或过滤等操作，以可溶性成分的形式进行制备。此外，为了延长保存寿命，优选可以对通过离心分离或过滤等而澄清的液体例如添加蛋白酶抑制剂、或进行高压灭菌处理等加热处理，使细胞来源的各种酶等被抑制或失活。加入细胞破碎提取液的浓度可以根据产生的非特异反应的强度而变化，可以适宜设定对吸收该非特异反应而言充分的浓度。

作为制备细胞破碎提取液的具体方法的例子，并非进行限定，例如，对于大肠杆菌细胞的情况，将大肠杆菌(可以包含载体、此外载体可以包含编码生物素结合性蛋白质的基因)接种于含抗生素的LB培养基，15℃～37℃、优选25℃～37℃振荡培养直至OD600处的吸光度为0.1～2、优选0.25～1、更优选0.4～0.6，然后添加0.01mM～5mM、优选0.1mM～1mM的IPTG，再进行15℃～37℃、优选25℃～37℃、2小时～24小时、优选4小时～16小时的振荡培养。从培养液通过离心回收菌体，将菌体悬浮于期望的缓冲液中后，进行破碎，对破碎液进行离心，将其上清作为大肠杆菌粗提取液回收。

在生物学样品中混合细胞破碎粗提取液时，并非进行限定，在样品中混合用期望的缓冲液(可以包含BSA、酪蛋白、市售的封闭剂等)制备成总蛋白质浓度0.05mg/ml～5mg/ml、优选0.5mg/ml～5mg/ml的细胞破碎粗提取液，在10℃～30℃、优选20℃～30℃反应1分钟～4小时、优选10分钟～1小时。而且，在生物学样品为血清等的情况下，通常将血清用细胞破碎提取液稀释10倍～10000倍、优选100倍～1000倍、更优选100倍～500倍来使用。

生物素结合性蛋白质的添加

在本发明的方法中，通过在生物学样品中添加生物素结合性蛋白质，能够最终抑制背景信号。

这样的生物素结合性蛋白质可以与上述的结合于承载体的生物素结合性蛋白质相同，也可以不同。此外，可以是野生型，也可以是突变体，生物素结合能力与野生型相比较可以等同，也可以更高或更低。此外，作为添加的方式，可以直接添加生物素结合性蛋白质(可以是天然来源的，也可以是基因工程表达的)的粉末，也可以用适当液体溶解后再添加。此外，例如也可以是下述方式：不是将生物素结合性蛋白质直接添加在样品中，而是将样品与细胞破碎提取液的混合物用固定有生物素结合性蛋白质的承载体进行处理(例如通过柱子)(步骤b-i)。

在将生物素结合性蛋白质添加于细胞破碎粗提取液时，并非进行限定，生物素结合性蛋白质的浓度以最终浓度计添加1μg/ml～500μg/ml、优选10μg/ml～100μg/ml。对于在该细胞中基因工程表达生物素结合性蛋白质时的生物素结合性蛋白质的浓度而言，并非进行限定，也可以是同样的浓度。

或者，可以将编码生物素结合性蛋白质的基因导入宿主细胞并进行表达，以将破碎该宿主细胞而得到的含生物素结合性蛋白质的细胞提取液的形式使用(步骤b-ii)。该情况下，生物素结合性蛋白质可以在期望的宿主中以本领域技术人员公知的方法表达，但在基因工程表达特异性结合被检物质的期望的蛋白质和/或期望的生物素化蛋白质的情况下，优选是与该宿主同种类的。

在宿主为大肠杆菌的情况下，将编码生物素结合性蛋白质的基因组入表达载体，并将其导入大肠杆菌，在诱导蛋白质表达的同时，进行大肠杆菌的培养。表达载体、宿主大肠杆菌株、培养基成分、IPTG浓度、培养温度等诱导条件可以适宜选择适于生物素结合性蛋白质的表达的条件。

承载体中生物学样品等的添加

承载体中生物学样品以及细胞破碎提取液的添加可以采用任意方法进行。但必须在生物学样品与承载体接触的同时、或者在此之前，使生物学样品与细胞破碎提取液接触。即，使生物学样品与细胞破碎提取液充分地接触即可，细胞破碎提取液来源的成分并不一定需要最终与生物学样品一起添加至承载体。例如，可以采用制作结合有细胞破碎提取液成分的承载体，然后向其添加生物学样品，使用经处理的生物学样品。具体地，可以列举出将生物学样品通过细胞破碎提取液成分柱等方式。

而且，添加后，并非进行特别限定，使生物学样品以及细胞破碎提取液与承载体于10℃～30℃、优选20℃～30℃反应10分钟～4小时、优选30分钟～2小时。

4.被检物质的检测方法

本发明的检测方法在步骤4)中对特异性结合于生物素化蛋白质的被检物质进行检测。

检测被检物质的方法可以基于期望的蛋白质的性质，由本领域技术人员适宜选择。作为优选的方法，可以列举出诸如酶联免疫吸附测定法(含ELISA、夹心ELISA法)、放射性免疫测定法(RIA)等免疫测定法、核酸杂交测定法、表面等离子体共振法等的测定法。使被检样品与使用抗生物素蛋白-生物素结合固相化的、与被检物质特异性结合-相互作用的物质进行反应后，检测该被检物质。

在免疫测定中，例如，在需测定的物质是抗体的情况下，将抗原固定化，使存在于被检样品中的抗体与抗原反应，采用本领域技术人员公知的方法进行检测。例如，在被检样品来源于人的情况下，使用抗人抗体检测与抗原结合的人抗体。此时，将该抗人抗体预先用荧光、酶、或者放射性同位素标记，最终测定荧光量、酶活性、或者放射性量，来间接地测定、定量抗体的量。此外，在需测定的物质是抗原的情况下，固定化针对该抗原的某部分(表位)的抗体，使之与存在于被检样品中的抗原反应后，再与针对该抗原的其他表位的抗体反应。如果预先将针对该其他表位的第二抗体如上述地进行标记，能够间接地测定抗原的量。此外，在核酸杂交测定中，预先将具有与需测定的核酸互补的序列区域的数十～数百、或者数千碱基的核酸利用生物素-生物素结合性蛋白质间结合进行固相化。使之与包含预先用荧光、放射性同位素标记的核酸的被检样品反应，测定荧光量或放射性量。

上述标记可以采用本领域技术人员公知的方法进行，也可以使用市售的经荧光或酶标记的抗人抗体等。作为荧光标记，可以考虑例如利用荧光素以及罗丹明等的标记、利用GFP等荧光蛋白质的标记。作为酶标记，可以利用过氧化物酶、碱性磷酸酶、或者萤光素酶、葡萄糖氧化酶等，但不限于此。用于利用这些酶进行测定的底物有市售，例如，对过氧化物酶的情况，可以使用TBA或化学发光用底物。此外，作为放射性同位素，可以列举出例如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、以及氚(³H)，在核酸的情况下，可以列举出磷(³²P)等。

生物学样品(样品)中存在的抗原或抗体的量可以采用例如线性回归计算机算法，通过与标准制备物(例如在临床检测体的情况下，是健康正常者的标准样品或者典型患者的标准样品)中存在的量进行比较，通过简单容易地计算得出。用检测抗原、抗体的这样的测定方法，例如关于ELISA，记载于Iacobelli等Breast Cancer Research and Treatment 11：19-30(1988)。

或者例如，在生物学样品中的需检测物质例如抗体少的情况下(抗体效价低的情况下)、或者在血清等生物学样品本身的非特异性结合多的情况下，非特异结合所致的背景信号的影响变大。因此，通过从测定值中适当地扣除背景信号，能够更准确地测定希望检测的物质。扣除的背景可以根据实验体系由本领域技术人员适宜判断。

例如，这样的实施方式的例子有检测血清中存在的针对胶原的抗体的“人/猴抗I型以及II型胶原IgG抗体测定试剂盒”(Chondrex公司制)。使用该试剂盒时，从样品测定值中扣除背景的值(不加血清、仅由第二抗体引起的测定值)来进行计算。

此外，对于诸如血清这样的生物学样品本身的非特异性结合多的情况，为了扣除由非特异反应引起的背景，如实施例2中记载的那样，采用下述实施方式是也有效的：从通过tamavidin固定化有生物素化的SITH-1抗原(特异性结合需检测物质的蛋白质)的承载体的测定值中扣除未固定化生物素化SITH-1抗原的区(但是在区中，承载体上固定化有tamavidin，而且像固定化有SITH-1抗原的区那样，用BSA等进行封闭操作，并添加了包含抗SITH-1抗体(生物学样品中的希望检测的物质)的血清(生物学样品)的区)的测定值。

此外，优选地，通过扣除固相化有样品所来源的生物(例如，对于SITH-1而言是人)不具有抗体的任意蛋白质(并非限定，当上述生物是哺乳类时可例举如GFP(绿色荧光蛋白)等)的区的测定值，能够更准确地求出。作为固定化的方法，没有特殊限制，优选将该蛋白质生物素化，藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合固定化于固定化有生物素结合性蛋白质的承载体上。

诸如以上的计算方法可以根据生物学样品的性质、使用的抗体的特点等由本领域技术人员适当地设计、选择。

本发明的检测方法优选能够特异性地检测血清中的抗体效价低的抗体。

II.生物学样品的稀释剂

此外，本发明提供用于对生物学样品中的物质进行检测的系统的、供稀释生物学样品用的试剂。

本发明的稀释剂包含：

1)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质、或

该稀释剂是用于在对生物学样品中的物质进行检测的系统中，在将生物学样品添加至通过生物素-生物素结合性蛋白质间结合而结合有将生物素结合在特异性结合需检测物质的蛋白质上而成的生物素化蛋白质的承载体上之前，对生物学样品进行稀释的试剂。本发明的稀释剂优选根据结合于承载体的蛋白质，即生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的生产过程来选择其组成。

具体地，在对生物学样品中的物质进行检测的系统中，优选利用与用于表达生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞。

本发明的稀释剂可以包含1)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质。本发明的检测生物学样品中的物质的方法中，这能够在步骤3)(b-i)的方式中使用。或者，可以包含2)从通过基因工程技术表达生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液。这能够在步骤3)(b-ii)的实施方式中使用。

“用于稀释生物学样品的试剂”可以是细胞破碎提取液(以及生物素结合性蛋白质)本身，或者可以是将细胞破碎提取液与生物学样品一起进一步稀释的试剂，其中可以包含适当的缓冲液、市售的细胞稀释液或者血清稀释液等溶剂。

III.试剂盒

此外，本发明提供用于检测生物学样品中的物质的试剂盒。本发明的试剂盒包含：

用于稀释生物学样品的试剂，该试剂包含

B-i)A)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或从与用于表达生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质；或者

“用于稀释生物学样品的试剂”可以是细胞破碎提取液(以及生物素结合性蛋白质)本身，或者可以是将细胞破碎提取液与生物学样品一起进一步稀释的试剂，其中包含适当的缓冲液、市售的细胞稀释液或者血清稀释液等溶剂。

实施例

以下通过实施例对本发明进行具体说明，但这些并非是对本发明技术范围的限定。本领域技术人员基于本说明书的记载能够容易地对本发明加以修饰和变更，这些也包含在本发明的技术范围内。

在本说明书中的实施例中，用大肠杆菌表达人疱疹病毒6(HHV-6)来源的SITH-1蛋白与生物素化序列(Invitrogen公司的BioEase标签)的融合蛋白，然后使由此获得的大肠杆菌粗抽提液直接与tamavidin2(以下记作“TM2”)固定化微板反应，通过tamavidin-生物素结合使融合蛋白结合于微板。

使这样得到的SITH-1蛋白质结合平板与用大肠杆菌粗抽提液稀释的人血清(含兔抗SITH-1抗体。市售的人血清中不含抗SITH-1抗体，因此在本试验中，将兔的抗SITH-1抗体(抗血清)梯度稀释后加入到市售的人血清中，用来作为被检测物)进行反应，测定了人血清中所含的抗SITH-1抗体效价。

实施例1 SITH-1与生物素化序列(BioEase标签)的融合蛋白质表达用载体的构建

设计了编码在SITH-1蛋白质的N末侧配置BioEase标签而得到的融合蛋白质的基因。该BioEase标签是包含能够在生物内(此时为大肠杆菌)被生物中的生物素化酶生物素化的序列的肽标签。BioEase-SITH-1融合蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，编码碱基序列如SEQ ID NO：9所示。

1-1.引物的设计

为了构建BioEase-SITH-1融合基因，首先设计了用于扩增SITH-1基因的引物。即，设计了由编码SITH-1蛋白质的N末端位点的DNA序列构成的引物(SITH1NtermGW-F)和由反向编码SITH-1蛋白质的C末端位点的DNA序列构成的引物(SITH1CtermGW-R)。

SITH-1与BioEase标签的融合基因构建用引物总结于表1。

[表1]

SITH-1基因扩增用引物

名称	序列	长度
			SITH1NtermGW-F	GGATATGAAGAAAAAGTGTC	20mer
SITH1CtermGW-R	TTACACATTCATTTCAGTTT	20mer

(SEQ ID NO：10-11)

1-2.PCR

以在SITH-1基因(ORF)(SEQ ID NO：2)上附加了FLAG标签的表达载体(PCT/JP2008/67300)的DNA作为模板，使用引物SITH1NtermGW-F和SITH1CtermGW-R进行了SITH-1位点的扩增。PCR反应条件如下：在20μl的反应液中添加模板DNA 500ng、10(ExTaq缓冲液(TaKaRa公司)2μl、2.5mM dNTP 1.6μl、引物各20皮摩尔、5U/μl ExTaq 0.1μl，使用GeneAmp PCRSystem 9600(PERKIN ELMER)进行96℃3分钟1次；95℃1分钟、60℃1分钟、72℃2分钟20次；72℃6分钟1次。结果得到了477bp的PCR产物。

1-3.克隆

将通过PCR得到的SITH-1基因克隆在载体pCR8/GW/TOPO(Invitrogen公司制)上。连接反应按照载体试剂盒附带的说明书进行。采用电穿孔法将DNA导入大肠杆菌TB 1，按常规方法(Sambrook et al.1989，Molecular Cloning，A laboratory manual，2nd edition)抽提质粒DNA。对于确认了存在插入物的质粒，使用M13引物(TaKaRa公司)和ABI PRISM荧光测序仪(Model 310Genetic Analyzer，Perkin Elmer公司)测定了碱基序列，与设计的基因的序列进行了比较，确认没有突变。

将装入了SITH-1基因的质粒作为入门克隆(entry clone)，使用GatewaySystem与作为BioEase标签融合蛋白质表达载体的pET104.1目的载体(Invitrogen公司制)进行了重组反应。用重组产物转化大肠杆菌TB1，抽提质粒DNA，再用该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。以所得大肠杆菌菌落作为模板，使用SITH 1NtermGW-F和SITH1CtermGW-R利用PCR进行插入基因位点的扩增，确认插入基因的有无。

通过以上方法，制作完成了BioEase标签融合SITH-1蛋白质表达用载体BioEase-SITH1/pET104.1。

1-4.大肠杆菌表达

将导入了BioEase-SITH1/pET104.1的大肠杆菌BL21(DE3)、或作为对照的仅导入了pTrc99A的大肠杆菌BL21接种于含抗生素氨苄西林(最终浓度100μg/ml)的LB培养基50ml中，30℃振荡培养直至OD600处的吸光度达到0.5。然后，添加1mM IPTG，再于30℃振荡培养5小时。从培养液50ml中通过离心回收菌体。将菌体悬浮于0.1M HEPES/KOH(pH7.4)3ml中后，利用超声波进行破碎。将破碎液离心(15,000rpm)，以其上清作为大肠杆菌粗抽提液。

为了确认BioEase标签融合SITH-1蛋白质的表达，将粗抽提液中所含的蛋白质用SDS-PAGE进行分级，并进行了western印迹。利用western印迹进行的BioEase标签融合SITH-1的检测中使用了兔抗SITH-1抗体(未发表)和碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体(BIO RAD公司制)。

结果如图1A所示。对表达融合有BioEase标签的SITH-1的大肠杆菌，检测到了在对照中不存在的约30kDa的条带。该大小与BioEase标签融合SITH-1的分子量28.6kDa基本上一致。

进一步，使用辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白代替抗SITH-1抗体进行了信号的检测。结果如图1B所示。对照基本上未检出信号，而在表达融合有BioEase标签的SITH-1的大肠杆菌粗抽提液中，检测到了2条来源于与链霉抗生物素蛋白反应(因而可认为被生物素化)的蛋白质的粗条带。而且，其中在上的条带与先前在western印迹时检测到的条带基本上大小相同。以上结果表明，成功地表达了生物素化SITH-1。

而且，除了上述之外，为了用于后述的ELISA实验，对于导入了pTrc99A、TM2/pTrc99A(WO 02/072817)的大肠杆菌BL21也像上述那样，在IPTG存在下进行培养后，制备了大肠杆菌粗抽提液。

实施例2利用ELISA进行人血清中抗SITH-1抗体的检测

使用New ELISA plate试剂盒(SUMITOMO BAKELITE)将纯化TM2固定化在微板上。固定化方法按试剂盒附带的说明书。

将实施例1中所得的表达融合有BioEase标签的SITH-1蛋白质的大肠杆菌粗抽提液用0.1M HEPES/KOH(pH7.4)制备成总蛋白质浓度2mg/ml后，添加100μl到TM2固定化平板(SUMITOMO BAKELITE、New ELISA)上。室温静置1小时，利用tamavidin-生物素结合将融合有BioEase标签的SITH-1蛋白质结合于TM2固定化平板。然后，将平板的各孔用含0.1％Tween20的TBS缓冲液(TBST)洗涤3次，在各孔中添加5μg/ml BSA/TBST溶液250μl，室温静置1小时，进行封闭。然后，将各孔用TBST洗涤3次。

然后，将人血清(Human Serum pool，Cosmo-Bio公司制)用PBS、或用实施例1的(1-4)中制备的1mg总可溶性蛋白质/ml的pTrc99A导入大肠杆菌粗抽提液、或用1mg总可溶性蛋白质/ml的TM2/pTrc99A导入大肠杆菌粗抽提液稀释100倍，在所得溶液中加入兔抗SITH-1抗体，使得以体积比1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000梯度稀释。将该(含抗SITH-1抗体的)稀释后的人血清各100μl地添加于利用生物素-tamavidin2结合固定化有融合有BioEase标签的SITH-1蛋白质的平板上，室温反应1小时。

推定兔抗SITH-1抗体(抗血清)的血清中抗体效价比典型的抑郁症(心境障碍)患者的血清中抗SITH-1抗体效价高大约50倍左右。因此可以认为，如果在市售(健康正常者)人血清中以体积比1/50量的混入兔抗SITH-1抗体(抗血清)，则成为典型抑郁症患者血清的模拟被检测物。因此，上述的抗体稀释率可以视为与将抑郁症患者血清稀释约10倍～80倍使用的程度相同。

进一步，为了确认用于血清的稀释的大肠杆菌粗抽提液中TM2的效果，在PBS或者上述pTrc99A导入大肠杆菌粗抽提液中加入最终浓度50μg/ml的纯化TM2而制备溶液，在用该溶液将人血清100倍稀释而得到的溶液中，像上述那样，加入兔抗SITH-1抗体，使得以体积比1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000梯度稀释，按100μl分别添加至固定化有BioEase标签融合SITH-1的平板，室温反应1小时。此外，作为对照，对于什么都没有结合的TM2固定化平板进行上述封闭操作后，将人血清像上述那样用PBS溶液、导入了pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液、或者导入了TM2/pTrc99A大肠杆菌粗抽提液(1mg总可溶性蛋白质/ml)、或者加入了纯化TM2的PBS、或者加入了纯化TM2的导入了pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液稀释100倍，然后加入梯度稀释的兔抗SITH-1抗体，将所得溶液加入100μl到上述平板上，室温反应1小时。

使像上述那样用各种稀释液稀释后的人血清中梯度稀释地加入兔抗SITH-1抗体而得到的物质与固定化于承载体上的融合有BioEase标签的SITH-1蛋白质反应后，用TBST洗涤3次。然后，为了分别检测与SITH-1结合了的兔抗SITH-1抗体、以及认为在各孔中发生了非特异性结合的血清中的人IgG，添加100μl将辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体以及过氧化物酶标记山羊抗人IgG抗体分别用TBST稀释5000倍而得到的混合溶液，室温静置1小时。然后，用TBST洗涤3次，检测了过氧化物酶活性。活性如下测定：在各孔中分别加入SuperSignal ELISA Pico ChemiluminescentSubstrate(PIERCE)100μl，室温静置5分钟后，用读板器Infinite M200(TECAN公司制)测定发光量。而且，作为数据值，对于兔抗SITH-1抗体的各浓度区，分别同时进行了对照区(在TM2平板上未固定BioEase标签融合SITH-1，但用BSA进行了封闭操作，且用含各浓度的抗SITH-1抗体的人血清进行了处理的区)的各发光量的测定，将该对照区的值从固定化有BioEase标签融合SITH-1的区的发光量的值中扣除。以此作为血清中所含的抗SITH-1抗体的检测量。进而，为了进行各血清稀释液的效果的比较，按以下所示的式子计算出S/N比。

S/N比＝加入了各浓度的抗SITH-1抗体的区的抗SITH-1抗体检出量/未加入抗SITH-1抗体的区的抗SITH-1抗体检出量

因此，表明S/N比越大，则检测灵敏度越高。

结果如图2、图3所示。对于血清中所含的抗SITH-1抗体，在将血清用PBS稀释的区中，非特异结合多，即使在未添加抗SITH-1抗体的区中也检测到了高发光量。此外，该非特异结合即使在50μg/ml TM2的存在下也未得到改善。另一方面，在将血清用导入了pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液、导入了TM2/pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液、或者导入了pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液中添加50μg/ml TM2而得到的物质进行稀释的区中，未加入SITH-1抗体的区的发光值相当低，非特异结合急剧减少(图2)。

此外，如图3所示，在S/N比方面，特别是在导入了pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液中添加50μg/ml TM2的区与添加导入了TM2/pTrc99A的大肠杆菌粗抽提液的区中S/N高。

以上结果表明，在使用在TM2平板上固定化BioEase标签融合SITH-1而成的平板的测定系统中，通过用含有TM2的大肠杆菌粗抽提液稀释人血清，可以减少源于人血清的非特异结合，对于极低浓度的抗SITH-1抗体也能够以良好的灵敏度定量检出。

SEQ ID NO：1：SITH-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2：SITH-1ORF的碱基序列。

SEQ ID NO：3：SITH-1cDNA的碱基序列。

SEQ ID NO：4：tamavidin1的碱基序列。

SEQ ID NO：5：tamavidin1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6：tamavidin2的碱基序列。

SEQ ID NO：7：tamavidin2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8：BioEase-SITH-1融合蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO：9：编码BioEase-SITH-1融合蛋白质的碱基序列

SEQ ID NO：10：PCR用引物SITH1NtermGW-F

SEQ ID NO：11：PCR用引物SITH1NtermGW-R

Claims

1.一种检测生物学样品中的物质的方法，该方法包括下述步骤：

2)藉由生物素-生物素结合性蛋白质间的结合使生物素化蛋白质结合在步骤1)中准备的承载体上，制作结合有生物素化蛋白质的承载体；

3)将(a)生物学样品，以及

(b-i)从与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液，和生物素结合性蛋白质，或者

(b-ii)从通过基因工程技术使与用于表达步骤1)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞表达生物素结合性蛋白质而得到的细胞制备的细胞破碎提取液

4)检测特异性结合于生物素化蛋白质的被检物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3(b-i)中，添加从包含任意载体的细胞提取得到的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中，所述生物素结合性蛋白质是tamavidin或其突变体。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述生物学样品选自血液、血清、脑脊液、唾液、咽拭子、汗、尿、泪液、淋巴液、精液、腹水和母乳。

5.一种用于稀释生物学样品的试剂，该试剂包括：

1)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质；或

6.一种用于检测生物学样品中的物质的试剂盒，该试剂盒包含：

用于稀释生物学样品的试剂，所述用于稀释生物学样品的试剂包含：

B-i)从与用于表达A)的生物素结合性蛋白质、特异性结合需检测物质的蛋白质、和/或生物素化蛋白质的宿主细胞同种类的细胞制备的细胞破碎提取液，和生物素结合性蛋白质，或者