JPH0843392A - 抗体検出用試薬の非特異反応吸収剤 - Google Patents

抗体検出用試薬の非特異反応吸収剤

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JPH0843392A
JPH0843392A JP17813394A JP17813394A JPH0843392A JP H0843392 A JPH0843392 A JP H0843392A JP 17813394 A JP17813394 A JP 17813394A JP 17813394 A JP17813394 A JP 17813394A JP H0843392 A JPH0843392 A JP H0843392A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 遺伝子組換え技術における宿主となり得る細
胞による抗原産生に用いられたベクターと同種であっ
て、且つ上記抗原をコードする遺伝子を含まないベクタ
ーが組み込まれている上記宿主となり得る細胞と同種の
細胞の培養成分を含む、上記抗原に対する抗体検出用試
薬の非特異反応吸収剤。 【効果】 本発明の非特異反応吸収剤は、遺伝子組換え
により産生した抗原を用いる抗体測定試薬で生じる非特
異反応を抑制するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体検出用試薬の非特
異反応吸収剤に関する。さらに詳しくは、遺伝子組換え
技術における宿主となり得る細胞による抗原産生に用い
られたベクターと同種であって、且つ上記抗原をコード
する遺伝子を含まないベクターが組み込まれている上記
宿主となり得る細胞と同種の細胞の培養成分を含む、上
記抗原に対する抗体検出用試薬の非特異反応吸収剤に関
する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
抗体検出用試薬には、動物組織や動物血液等の生体成分
から精製した抗原が用いられてきた。このような生体成
分由来の精製抗原は、その元となる生体成分を円滑に供
給することが困難で抗原量を確保しにくく、また、感染
性のある抗原を直接扱うという危険が伴うものであっ
た。その後、近年の遺伝子組換え技術の発展により、こ
れら抗原は組換え遺伝子を組み込んだ宿主細胞から産生
させることができるようになった。遺伝子組換え技術
は、安全に大量の抗原を入手することを可能にし、ま
た、これまで生体成分からは充分量入手できなかったよ
うな抗原を産生させることも可能にしたため、抗体検出
用試薬の発展に大いに役立った。
【0003】しかしながら、遺伝子組換え技術により産
生された抗原は、遺伝子組換えの宿主となった細胞に対
して精製ロット毎に異なる非特異反応を生じ、そのため
偽陽性が出現した。該非特異反応を抑制するために、遺
伝子組換えに用いたと同種の、遺伝子組換え操作が行わ
れていない宿主細菌成分を用いることが考案され(特公
平3−59382号)相当な効果を示した。しかしなが
ら、これを用いる方法は、遺伝子組換え技術により産生
された抗原を用いる抗体測定試薬を、偽陽性が大きな問
題となる感染症の診断補助薬として実用化するために
は、非特異反応抑制効果は充分ではなかった。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、遺伝子組
換え技術により産生された抗原を用いる抗体検出用試薬
を実用化するために鋭意研究を重ねた結果、抗原をコー
ドする遺伝子を含まない、抗原産生に用いたと同種のベ
クターを組み込んだ培養細胞の成分が、該非特異反応を
吸収することを見出し、本発明を完成するに至ったもの
である。
【0005】本発明は、遺伝子組換え技術における宿主
となり得る細胞による抗原産生に用いられたベクターと
同種であって、且つ上記抗原をコードする遺伝子を含ま
ないベクターが組み込まれている上記宿主となり得る細
胞と同種の細胞の培養成分を含む、上記抗原に対する抗
体検出用試薬の非特異反応吸収剤である。
【0006】本発明において、宿主となり得る細胞と
は、通常遺伝子組換えに用いられる細胞であり、例え
ば、大腸菌又は枯草菌等の細菌、酵母等の菌類、アフリ
カツメガエル、カイコ、マウス、ウサギ、サル又はヒト
等の動物培養細胞、及びタバコ、ニンジン、コムギ、イ
ネ又はトマト等の植物培養細胞等の病原性を持たない細
胞等を挙げることができる。また、本発明において、抗
原をコードする遺伝子を含まないベクターとは、ウイル
スDNA又はプラスミドDNA等、細胞において複製増
殖し得るベクターで、抗原をコードする遺伝子によって
遺伝子組換えが行われていないベクターを挙げることが
できる。
【0007】かかるベクターを遺伝子組換えの宿主とな
り得る細胞に組み込む方法としては、例えば、ハナハン
の方法又はエレクトロポレーション法等の通常用いられ
ている遺伝子組換え方法を用いることができる。
【0008】抗原をコードする遺伝子を含まない、抗原
産生に用いたと同種のベクターを組み込んだ細胞は、培
養後、超音波処理又は酵素処理等の通常の細胞破砕手法
にて細胞成分を分散又は溶解させ、遠心分離又は濾過等
の操作により、抗体検出用試薬に適した非特異反応吸収
剤とすることができる。保存寿命をのばすためには、遠
心分離又は濾過等により清澄にした液に、例えばプロテ
アーゼインヒビターの添加、又はオートクレーブ処理等
の加熱処理を施して、細胞由来の各種酵素等を抑制又は
失活させることが好ましい。
【0009】本発明の非特異反応吸収剤の濃度は、抗体
検出用試薬の使用時に生じる非特異反応の強さに応じて
変えてもよく、該非特異反応を吸収するに充分な非特異
反応吸収剤の使用量を適宜設定することができる。ま
た、本発明の非特異反応吸収剤を使用するにあたって
は、測定検体に本発明の非特異反応吸収剤を添加し、抗
体検出前に非特異反応を吸収することもでき、また、抗
体検出用試薬に本発明の非特異反応吸収剤を添加し、抗
体検出中に非特異反応を同時吸収することもできる。
【0010】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に
説明する。
【0011】参考例1 リコンビナントHIV−1/2
抗原感作粒子の調製 発現のためT7RNAポリメラーゼがlacのプロモー
ターで制御されている大腸菌JM109(DE3)株
に、HIV−1(gp41, p24)抗原及びHIV−2(gp3
6)抗原をコードする遺伝子をトランスフォームし、T
7プロモーターの制御下で50μg/mlアンピシリンを含
むM9CA培地で37℃16時間培養後、イソプロピル
−1−チオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を1mM
加え、さらに7時間培養し、目的とする蛋白を発現誘導
した。発現誘導した培養液を遠心分離して大腸菌を回収
し、50mMトリス、pH8.0、100mMNaCl、1mM
EDTA溶液を加えて浮遊させた後、リゾチームを40
0mg/l、DNaseを0.005%になるように加え、
菌体を溶菌した。遠心分離により沈査を回収し、8M 尿
素で溶解した。ハイドロキシアパタイトカラム(BioRad
社製)で精製後、ゲル濾過法により脱塩し、精製リコン
ビナント抗原を得た。精製リコンビナント抗原は、特開
昭58−113754号公報の実施例1に従いゼラチン
を主成分にした粒子(以下ゼラチン粒子)に感作し、リ
コンビナントHIV−1/2抗原感作ゼラチン粒子の凍
結乾燥品を得た。
【0012】参考例2 大腸菌成分吸収剤の調製 大腸菌JM109(DE3)株をM9CA培地で37℃
15時間培養後、遠心分離により大腸菌を回収し、50
mMトリス、pH8.0、100mMNaCl、1mMEDTA
溶液に浮遊させた後、リゾチームを400mg/l、DNa
seを0.005%になるように加え、菌体を溶菌し
た。日立高速遠心機(himac CR20B3、PR14
A、155ローター)を用い、10,000rpm 30分
間遠心し、水溶性抽出物を得た。この水溶性抽出物にド
デシル硫酸ナトリウムを0.1%になるように添加し、
岩城社製オートクレーブ、ACV−3167にて110
℃10分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処
理により不溶化した成分を遠心除去し、大腸菌成分吸収
剤を得た。
【0013】実施例1 プラスミド成分吸収剤の調製 プラスミド成分吸収剤の調製には、HIV−1(gp41,
p24)抗原をコードする遺伝子及びHIV−2(gp36)抗
原をコードする遺伝子を組み込むのに使用したプラスミ
ドpWA50(市販のプラスミドpGEMEX−1をN
heIとSacIで消化した後、T4DNAポリメラー
ゼで処理し、gene10領域を除いて作成した)を用
いて大腸菌JM109(DE3)株をトランスフォーム
して得られた、大腸菌JM109(DE3)/pWA5
0株を用いた。参考例2と同様に、JM109(DE
3)/pWA50株を、50μg/mlアンピシリンを含む
M9CA培地で37℃15時間培養後、IPTGを1mM
加え、さらに7時間培養した。次いで、参考例2と同様
に、遠心分離により大腸菌を回収し、50mMトリス、pH
8.0、100mMNaCl、1mMEDTA溶液に浮遊さ
せた後、リゾチームを400mg/l、DNaseを0.0
05%になるように加え、菌体を溶菌した。日立高速遠
心機(himac CR20B3、PR14A、155ロータ
ー)を用い、10,000rpm 30分間遠心し、水溶性
抽出物を得た。この水溶性抽出物にドデシル硫酸ナトリ
ウムを0.1%になるように添加し、岩城社製オートク
レーブ、ACV−3167にて110℃10分間オート
クレーブ処理した。オートクレーブ処理により不溶化し
た成分を遠心除去し、プラスミド成分吸収剤を得た。
【0014】実施例2 吸収効果の確認 実施例1で調製したプラスミド成分吸収剤を用い、参考
例1で調製したリコンビナントHIV−1/2抗原感作
粒子と健常人血清の反応性をマイクロプレート法で調べ
た。健常人血清1000例は、予め富士レビオ社製セロ
ディア・HIV−1/2により抗HIV−1,2抗体が
陰性であることを確認した。リコンビナントHIV−1
/2抗原感作粒子を用いると、10例の偽陽性反応が認
められ、検体により反応の程度が異なったが、陽性を示
す最終希釈倍率で概ね16〜64倍の反応性を示した。
その中の2例の偽陽性血清を用いてプラスミド成分吸収
剤の吸収効果を調べた。プラスミド成分吸収剤は、1%
正常家兎血清を含む0.15M リン酸塩生理食塩緩衝液
(以下、血清希釈用液と略記する)に2〜10%になる
ように加えた。結果を表−1に示した。
【0015】
【表1】
【0016】リコンビナントHIV−1/2抗原感作粒
子の偽陽性反応は、プラスミド成分吸収剤を血清希釈用
液に5〜10%添加することで陰性化した。
【0017】実施例3 参考例1で調製したリコンビナントHIV−1/2抗原
感作粒子を用い、富士レビオ社製セロディア・HIV−
1/2により抗HIV−1,2抗体が陰性であることを
予め確認した健常人血清7898例から、希釈率32倍
で±以上の反応性を示す偽陽性血清38例を得た。この
リコンビナントHIV−1/2抗原感作粒子で偽陽性を
示す血清38例を用い、参考例2で調製した大腸菌成分
吸収剤、及び実施例1で調製したプラスミド成分吸収剤
の吸収効果を調べた。大腸菌成分吸収剤又はプラスミド
成分吸収剤を各々5%になるように含む血清希釈用液に
て試験したところ、大腸菌成分吸収剤添加では12例
が、プラスミド成分吸収剤添加では28例が陰性化し
た。結果を表−2に示した。
【0018】
【表2】
【0019】プラスミド成分吸収剤は、大腸菌成分吸収
剤添加で陰性化した12例をすべて陰性化した。プラス
ミド成分吸収剤で陰性化するが、大腸菌成分吸収剤で陰
性化しない検体16例については、大腸菌成分吸収剤の
濃度を10%まで上げたが、反応は陰性化しなかった。
すなわち、プラスミド成分吸収剤は、大腸菌成分吸収剤
で陰性化できない16例を含む28例の偽陽性検体を陰
性化した。
【0020】実施例4 参考例1で調製したリコンビナントHIV−1/2抗原
感作粒子を用い、富士レビオ社製セロディア・HIV−
1/2により抗HIV−1,2抗体が陽性であることを
予め確認した人血清10例と、参考例2で調製した大腸
菌成分吸収剤又は実施例1で調製したプラスミド成分吸
収剤を添加した血清希釈用液との反応性を調べた。大腸
菌成分吸収剤又はプラスミド成分吸収剤を添加した血清
希釈用液は、ともに、10例全例の抗体価が吸収剤を添
加していない対照群の抗体価と一致した。結果を表−3
に示した。
【0021】
【表3】
【0022】結論として、大腸菌成分吸収剤及びプラス
ミド成分吸収剤の添加は、抗HIV−1,2抗体が陽性
の検体の反応性には影響しなかった。
【0023】
【発明の効果】本願発明の抗体検出用試薬の非特異反応
吸収剤は、遺伝子組換え技術により産生された抗原を用
いる抗体検出用試薬において、従来抑制できなかった非
特異反応を抑制することができるという効果が得られ
る。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 遺伝子組換え技術における宿主となり得
    る細胞による抗原産生に用いられたベクターと同種であ
    って、且つ上記抗原をコードする遺伝子を含まないベク
    ターが組み込まれている上記宿主となり得る細胞と同種
    の細胞の培養成分を含む、上記抗原に対する抗体検出用
    試薬の非特異反応吸収剤。
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