CN105158465B - 一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型p24抗体检测elisa试剂盒 - Google Patents

一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型p24抗体检测elisa试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，有效解决现有ELISA检测HIV‑1抗体的方法检测窗口期长，易漏检及HIV‑1 P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题，该试剂盒内设有预包被HIV‑1 P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、封板膜，本发明利获取到新的HIV‑1 P24基因序列，并用此序列基因重组表达抗原蛋白包被ELISA，经间接法检测样本HIV‑1 P24抗体，有效用于HIV‑1感染的早期辅助诊断。

Description

一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是艾滋病的病原体能攻击人体免疫系统的病毒，它把人体免疫系统中最重要的T淋巴细胞作为主要攻击目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。因此，人体易于感染各种疾病，并可发生恶性肿瘤，病死率较高。由于其基因易突变，到目前为止还未有特效的防治疫苗，所以防治艾滋病仍是以早发现缩小隐形感染传播范围，早治疗防止病情进一步恶化。虽然自1983发现HIV病毒以来，HIV病毒相关检测指标的研究一直没有停息过，研究从HIV抗体检测到p24抗原检测、HIV核酸检测以及T淋巴细胞计数等检测项目。但目前在国内的初筛实验依然以HIV抗体检测为主，窗口期较长容易漏检。目前HIV分为1型和2型，但是国内主要流行HIV-1，而在HIV-1病毒中，gag基因所编码的结构蛋白是该病毒含量最丰富的蛋白，对于HIV-1颗粒的组装及释放至关重要且相对稳定不易突变。gag基因全长表达产物P55经蛋白酶水解后成为P24/P17/P15蛋白，而p24是HIV-1病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV-1各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-1 P24抗体出现较其他抗体早，所以可用于HIV-1感染的早期辅助诊断，但目前的HIV-1 P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低，至今未能得到广泛应用。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，可有效解决现有ELISA检测HIV-1抗体的方法检测窗口期长，易漏检及HIV-1 P24抗体检测的试剂盒假阳性率高，特异性低的问题。
本发明解决的技术方案是，该试剂盒内设有预包被HIV-1 P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体(即酶标二抗，购买于生工生物工程有限公司)、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含HIV-1 P24抗体的人血清；HIV-1 P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列构成：
所述的HIV-1 P24抗原的制备方法是：选择HIV-1阳性样本，提取RNA反转录为cDNA；分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：
gag_A_ 5’-TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3’
gag_S_ 5’-CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3’
第二轮引物为：
P24_S1：5’-AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3’
P24_A1：5’-TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3’
第三轮引物为：
P24_NCO Ⅰ-2：5’-TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT-3’，其5’端设计有NCO Ⅰ酶切位点；
P24_XHO Ⅰ-2：5’-AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT-3’，其5’端设计有XHO Ⅰ酶切位点；
利用上述引物，扩增模板cDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段(P24 DNA)，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCO Ⅰ和XHO Ⅰ分别双酶切，酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白；
所述的预包被HIV-1 P24抗原酶标板的制备方法是：
(1)将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔100ul稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4℃，16-18小时；
(2)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS(即磷酸盐缓冲液)洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
(3)封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置于37℃水浴箱，2h；
(4)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
(5)预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用；
其中，碳酸盐包被液的配制：碳酸钠(Na2CO3)0.8g，碳酸氢钠(NaHCO3)1.45g，加纯水溶解后定容至500ml，调PH至9.6，4℃保存；
PBS的配制：氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，KH2PO4(磷酸二氢钾)0.24g，Na2HPO4(磷酸氢二钠)1.44g，纯水定容至1000ml，调PH至7.2；
封闭液的配制：含5％体积浓度的胎牛血清的PBS；
所述的检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒的检测方法：
(1)实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-1 P24抗原酶标板的微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；
(2)试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；
(3)加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1：20稀释，每个待测样本的微孔中待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样；
(4)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；
(5)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
(6)加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul；
(7)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；
(8)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
(9)加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入显色剂TMB A液和显色剂TMB B液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37℃水浴箱，温育15min；
(10)加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入50ul终止液，震荡仪震荡混匀；
(11)检测：取波长450nm(参考波长630nm，建议使用双波长的酶标仪检测)设定酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；
(12)结果判断：阴性对照(A值)*2.5＝临界值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳性，反之，则为阳性；
其中，抗体稀释液：100ml PBS中加入5ml胎牛血清和50ul Tween-20，调pH值至7.2；洗涤液：含0.15％Tween-20的PBS，pH值为7.2；显色剂TMB A、B液：购买于北京泰天河生物技术有限公司；终止液：2mol/L H2SO4溶液；
本发明利获取到新的HIV-1 P24基因序列，并用此序列基因重组表达抗原蛋白包被ELISA，经间接法检测样本HIV-1 P24抗体，因为衣壳蛋白p24特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，并且HIV-1 P24抗体出现较其他抗体早，所以具有较高的特异性和敏感性，有效用于HIV-1感染的早期辅助诊断。
具体实施方式
以下结合实际情况对本发明具体实施方式作进一步详细说明；
1、获取HIV-1 P24基因
(1)获取经WB(免疫印记法)确证过的HIV-1阳性样本；利用Trizol法提取HIV-1P24 RNA模板，方法是，复苏液氮冻存的HIV-1阳性样本PBMC(单个核细胞)，取HIV-1阳性样本PBMC 500ul加1ml Trizol(RNA抽提试剂)，混匀，18-30℃放置5min，按200ul氯仿/mlTrizol(即1ml Trizol中加入200ul氯仿)加入氯仿，振荡混匀15s，18-30℃放置2-3min，4℃，12000g离心15min，吸取上层水相，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇，混匀，18-30℃放置5-10min，4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底，按1ml质量浓度75％的乙醇/ml Trizol加入质量浓度75％的乙醇，振荡离心管，悬浮沉淀，4℃8000g离心5min，弃上清，18-30℃晾5-10min，得RNA样品，用50ul 0.1％DEPC处理水(DEPC为焦碳酸二乙酯)溶解(0.1％DEPC处理水的配制方法：在1000ml的纯水中加入1ml DEPC，混匀，室温避光静置过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min)RNA样品，55-60℃，溶解5-10min，-70℃保存，即得HIV-1 P24RNA模板；
(2)选用随机引物反转录RNA为cDNA(Takara反转录试剂盒)：反应体系：HIV-1 P24RNA模板1ul，Oligo primer(引物)1ul，5×reaction buffer 4ul，Ribolock RNaseInhibitor(20U/ul)1ul，10mM dNTP Mix 2ul，RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/ul)1ul，Water 10ul，总体系20ul，混匀；反应条件：混匀体系，放于PCR仪，42℃孵育60min，70℃孵育5min，4℃保存1小时，取出后-70℃保存，得模板cDNA；
(3)利用巢式PCR获得P24基因(Takara PCR试剂盒)：根据NCBI Blast数据库已公布的gag蛋白基因序列设计特异性引物，第一轮引物：P24_gag-A：5’-TCTGGCTGTGTGCCCTTCTTTGCCACAATTGAAACACTT-3’和P24_gag-S：5’-CGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAG-3’，PCR反应体系：Takara Taq(5U/ul)0.25ul，10×PCR buffer 5ul，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，模板cDNA1ul，上述引物P24_gag-A 2ul，引物P24_gag-S 2ul，蒸馏水加至50ul；PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，59.8℃2min，72℃1min30s，35循环，72℃10min，4℃保存，作为第二轮模板DNA；第二轮引物：P24_S15’-AGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG-3’和P24_A15’-TTTGTTACTTGGCTCATTGCTTCAG-3’，PCR反应体系：Takara Taq(5U/ul)0.25ul，10×PCR buffer 5ul，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，第二轮模板DNA 1ul，P24_A1 2ul，P24_S1 2ul，蒸馏水加至50ul；PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，54.7℃1min，72℃1min20s，35循环，72℃10min，4℃保存，作为第三轮模板DNA；第三轮引物：P24_NCO Ⅰ ‐2 5’‐TTAACATGCCATGGGCCCTATAGTGCAAAACCT‐3’其5’端设计有NCOⅠ酶切位点和P24_XHO Ⅰ ‐2 5’‐AACCGCTCGAGTGGCAAGATTCTTGCTTTGT‐3’其5’端设计有XHOⅠ酶切位点，PCR反应体系：Takara Taq(5U/ul)0.25ul，10×PCR buffer 5ul，dNTP Mixture(各2.5mM)4ul，第三轮模板DNA 1ul，P24_NCO Ⅰ‐2 2ul，P24_XHO Ⅰ‐2 2ul，蒸馏水加至50ul；PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，54.7℃1min，72℃1min，35次循环，72℃10min，4℃保存，扩增后片段大小为693bp，PCR产物经在1％琼脂糖凝胶中电泳，条带与目的片段大小相符；
(4)切胶回收(利用omega胶回收试剂盒)：在紫外灯箱中用小刀切取凝胶上的目的基因条带；称量空EP管重量，把切取带有目的基因的胶装入称好的EP管中，称量出胶的重量；根据1g/1ml Buding Buffer(即每1g胶加入1ml的Buding Buffer)加入Buding Buffer；置于55-60℃预热的水浴锅中7min溶解，震荡混匀，得胶液；处理过滤柱(处理过滤柱的步骤为：a、在过滤中加入200ul GPS溶液，静置2-3min，10000g离心1min弃滤液；b、在过滤中加入700ul蒸馏水，10000g离心1min弃滤液)：向过滤柱中加入200ul GPS(omega胶回收试剂盒内试剂)，18-30℃放置2-3min，10000g离心1min，弃滤液；再加入700ul蒸馏水，10000g离心1min，弃去滤液；加入700ul溶解后的胶液，10000g离心1min，弃去滤液；加入300ul BudingBuffer，10000g离心1min，弃去滤液；加入700ul SPW wash buffer(omega胶回收试剂盒内试剂)，10000g离心1min，弃去滤液，再加入700ul SPW wash buffer，10000g离心1min，弃去滤液；将过滤柱放入空收集管中，13000g离心2min，弃去滤液；将过滤柱放入另取的EP管中，在过滤柱中加入30-50ul Elution Buffer，18-30℃放置1min；13000g离心1min，吸取EP管内滤液再次加入过滤柱中，13000g离心1min，即得切胶纯化的P24基因片段(P24 DNA)；
2、构建PMD-18-T-P24质粒载体
(1)构建T-P24质粒：将上述切胶纯化的P24基因片段连接于PMD-18-T载体(宝生物工程有限公司)：反应体系：PMD18-T载体4ul，P24 DNA 16ul，Solution 20ul，混匀；反应条件：放置于PCR仪，16℃，16-18小时。
(2)将(1)步骤连接好的T-P24质粒转入菌株DH5a感受态细胞中，即得DH5a-T-P24菌；其方法是，取菌株DH5a接种于LB琼脂培养基平板，37℃培养16-18小时；挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，200r/min,37℃培养16-18小时，得菌液；接种菌液到LB液体培养基中，菌液和LB液体培养基的体积比为1:100，250r/min，37℃培养至OD值为0.4-0.5；转入50ml离心管中，冰浴10min；4℃，4000r/min离心10min，弃上清，倒扣于滤纸1min，加入30ml预冷至4℃的0.1mol/L CaCl2(氯化钙)溶液(0.1mol/L CaCl2溶液配方：:称取1.11g CaCl2,溶于100ml纯水中，0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存)重悬沉淀，冰浴10min；4℃，4000r/min离心10min，弃上清，倒扣于滤纸1min，加入300ml预冷至4℃的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，放入冰盒中，得感受态细胞悬液；细菌质粒转化方法：用无菌枪头吸取感受态细胞悬液100ul转移到1.5ml无菌离心管中，加T-P24质粒30ul，混匀，将离心管插入浮漂中并放于冰盒中45min；再放入预热至42℃的水浴中，放置90s，转移至另取的冰盒中，使细胞冷却15min；得到已转化的感受态细胞，加入800ul LB液体培养基，混匀，150r/min，37℃培养1h，得菌液A，取200ul菌液A转移至氨苄抗性的LB琼脂培养基平板，用灭菌过的玻璃棒涂匀；将氨苄抗性的LB琼脂培养基平板置于18-30℃直至液体被吸收；倒置氨苄抗性的LB琼脂培养基平板，37℃培养16-18小时，得DH5a-PMD-18-T-P24菌；所述的LB液体培养基的配制方法：在100ml水中加入2g LB肉汤，混匀，121℃高压蒸汽灭菌，20min，待冷却到18-30℃，4℃保存，以下同；所述氨苄抗性的LB琼脂培养基平板的配制方法：在100ml水中加入2g LB肉汤和1.5g琼脂粉，混匀，121℃高压蒸汽灭菌，20min，待冷却到50-60℃，加入100ul氨苄青霉素(浓度为100mg/ml)，混匀，每个培养板中倒入20-30ml，4℃保存，以下同；
(3)DH5a-PMD-18-T-P24菌中PMD-18-T-P24质粒基因测序：方法是，将上述步骤(2)培养出的产物由测序公司进行测序，得出其中P24基因序列为:
上述P24基因与NCBI Blast数据库比较未检索出相同序列，在P24基因序列中602位点处突变位点未检索出，经验证此突变不影响P24蛋白的抗原性；
3、表达载体重组
(1)扩增DH5a-PET32a菌株；使用Axygen质粒提取试剂盒提取DH5a-PET32a菌株中的PET32a质粒，提取方法是：
所述扩增DH5a-PET32a菌株方法为：取DH5a-PET32a菌株乳化于5ml氨苄抗性的LB液体培养基，放置于摇床200r/min,16-18h,得扩增DH5a-PET32a菌株菌液；取扩增DH5a-PET32a菌株菌液5ml，4℃12000g离心1min，弃上清；加250ml Buffer S1悬浮细菌沉淀；加250ml Buffer S2上下翻转4-6次，混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，翻转时间不超过5min；加350ul Buffer S3上下翻转6-8次，4℃,12000g离心，10min；吸取离心上清液转移至制备管,12000g,离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加500ul BufferW1,4℃,12000g，离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加700ul BufferW2,4℃,12000g，离心1min，弃滤液,再加700ul BufferW2,4℃,12000g，离心1min，弃滤液；将制备管置回2ml离心管中，4℃,12000g，离心1min；将制备管移入1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40ulELuent，18-30℃静置1min，4℃,12000g，离心1min；即得PET32a质粒，-70℃保存；所述的氨苄抗性的LB液体培养基的配制方法：在100ml水中加入2g LB肉汤，混匀，121℃高压蒸汽灭菌，20min，待冷却至18-30℃，加入100ul氨苄青霉素(浓度为100mg/ml)，4℃保存，以下同；
(2)将获得的PET32a质粒和另取上述1步骤中(4)所得的切胶纯化的P24基因片段利用NCO Ⅰ和XHO Ⅰ分别双酶切，PET32a质粒酶切的反应体系：PET32a质粒32ul，NCO Ⅰ 2ul，XHO Ⅰ 2ul 10×K 4ul，总体积共40ul，混匀；PET32a质粒反应条件：放于PCR仪37℃，16-18小时；切胶纯化的P24基因片段酶切的反应体系：切胶纯化的P24基因片段32ul，NCO Ⅰ 2ul，XHO Ⅰ 2ul 10×K 4ul，总体积共40ul，混匀；切胶纯化的P24基因片段酶切的反应条件：放于PCR仪37℃，16-18小时；酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；
(3)用T4连接酶连接(2)步骤所得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段构建PET32a-P24重组质粒，方法是，把酶切P24基因片段插入酶切PET32a质粒：反应体系：酶切P24基因片段21.5ul，酶切PET32a质粒21.5ul，10×T4 DNA ligase buffer 5ul，T4 DNAligase 2ul，共50ul；反应条件：放置于PCR仪中，16℃，16-18小时，即得PET32a-P24重组质粒；
4、构建表达菌株：将10ul PET32a-P24重组质粒转入100ul BL21(DE3)感受态细胞，得BL21(DE3)-PET32a-P24菌液，取100ul BL21(DE3)-PET32a-P24菌液接种于氨苄抗性的LB琼脂培养基平板中，37℃，培养16-18小时，取200ul培养好的BL21(DE3)-PET32a-P24菌液接种至5ml氨苄抗性的LB液体培养基中，提取PET32a-P24质粒，经测序鉴定为目的质粒，转入BL21菌株中，成功构建P24抗原表达菌株即BL21-PET32a-P24菌株；
5、蛋白表达
用IPTG(诱导剂)诱导BL21-PET32a-P24菌株表达P24抗原：吸取氨苄抗性的LB液体培养基5ml加入20ml摇菌管中，沾取单个BL21-PET32a-P24菌落，加入20ml摇菌管中，混匀，置于37℃,250r/min摇床16-18小时，得菌液B，取5ml菌液B加入200ml氨苄抗性的LB液体培养基，37℃,250r/min摇床2h；再加入2ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)溶液(IPTG溶液为IPTG加水制成，每毫升水中含有0.2g IPTG)，混匀，放置于37℃,250r/min摇床3h，得诱导表达后的菌液；
6、蛋白纯化
(1)利用镍柱填料初次纯化P24抗原；a、将诱导表达后的菌液4000r/min，10min 4℃离心，弃去上清；b、加入10ml缓冲液(缓冲液为500ml水中加入NaH2PO43g和Nacl 8.77g，调PH为7.4)重悬，超声破菌：300V，1s超声，4s冷却，60个循环为一次，至菌液澄清为止；c、再将澄清的菌液在4000r/min，10min 4℃离心，上清经0.22um滤膜过滤，与4ml镍柱填料(购买于life science公司)结合，混匀30min，3000r/min 2min离心，弃上清；d、加入30ml 20mM咪唑洗涤液(20mM咪唑洗涤液为：500ml水中加入NaH2PO43g、Nacl 8.77g和咪唑0.544g，调PH为7.4)，混匀，3000r/min 2min离心，弃上清；重复上述d步骤两次；再加入3ml 250mM咪唑脱洗液(250mM咪唑脱洗液为:500ml水中加入NaH2PO43g、Nacl 8.77g和咪唑6.8g，调PH为7.4)，混匀，3000r/min 2min离心，吸取上清，即P24抗原溶液，-70℃保存；
(2)SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原：将P24抗原溶液用蛋白上样Buffer(缓冲液)100℃10min预处理，将制胶板装好，加入12％分离胶；再加入2ml蒸馏水，静置30分钟，弃去蒸馏水，再加入5％浓缩胶，插入梳子，静置1h，拔出梳子，放入电泳仪，加入预处理的P24抗原溶液，调电压60v，跑胶；切胶回收：将电泳好的胶片取下置于预冷至4℃的0.1mol/L KCL溶液(0.745g KCL加100ml水配成浓度为0.1mol/L KCL溶液)中，再置于-20℃，放置1min；切割呈灰白色的目的蛋白条带并分成0.5cm长的小段；电渗：将上述小段装入透析袋内置于电渗槽中电渗，60v，电渗出蛋白，至凝胶变透明为止；所述的12％分离胶：在10ml烧杯中依次加入灭菌水1.6ml、30％Acrytamide2ml、1.5M Tris HCL(PH8.8)1.3ml、10％SDS 0.05ml、10％过硫酸铵0.05ml、TEMED 2ul，混匀，即得；所述的5％浓缩胶：在5ml烧杯中依次加入灭菌水1.4ml、30％Acrytamide 0.33ml、1.5M Tris HCL(PH8.8)0.25ml、10％SDS 0.02ml、10％过硫酸铵0.02ml、TEMED 2ul，混匀，即得；
(3)蛋白复性及浓缩：置于PBS中，4℃透析24h；用聚乙二醇8000覆盖1h，得浓缩蛋白，-70℃保存，即为纯化的重组P24蛋白；
检测人HIV-1 P24抗体检测ELISA试剂盒的制备
1、检测人HIV-1 P24抗体检测ELISA试剂盒预包被HIV-1 P24抗原酶标板的制备；
(1)购买96孔聚苯乙烯微孔板，将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2ug/ml，得稀释液，每孔100ul稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板,封膜，4℃，16-18小时；
(2)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
(3)封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200ul封闭液，封膜，置于37℃水浴箱，2h；
(4)微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
(5)预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用；
2、检测人HIV-1 P24抗体检测ELISA试剂盒试剂组分：
(1)酶标二抗：HRP兔抗人IgG二抗(购买于生工生物工程有限公司)
(2)抗体稀释液(PH7.2)：含5％胎牛血清和0.05％Tween-20的PBS；
(3)洗涤液(PH7.2)：含0.15％Tween-20的PBS；
(4)显色剂TMB A、B液：购买于北京泰天河生物技术有限公司；
(5)终止液：2mol/L H2SO4溶液；
(6)阴性对照血清：正常人血清；
(7)阳性对照血清：含P24抗体的人血清；
检测人HIV-1 P24抗体检测ELISA试剂盒使用说明：
(1)实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-1 P24抗原酶标板的微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；
(2)试剂配制：使用抗体稀释液稀释酶标二抗，抗体稀释液和酶标二抗的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；
(3)加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1：20稀释，每个待测样本的微孔中待测样本加入量为50ul、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50ul、阳性对照的微孔中阳性对照液血清加入量为50ul，空白对照的微孔中不加样；
(4)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；
(5)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
(6)加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50ul；
(7)温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；
(8)洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
(9)加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入显色剂TMB A液和显色剂TMB B液各50ul，震荡仪震荡混匀，置于37℃水浴箱，温育15min；
(10)加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入50ul终止液，震荡仪震荡混匀；
(11)检测：取波长450nm(参考波长630nm，建议使用双波长的酶标仪检测)设定酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；
(12)结果判断：阴性对照(A值)*2.5＝临界值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳性，反之，则为阳性；
该试剂盒采用间接法检测人血清/血浆中的HIV-1 P24抗体，若待测样本中含有HIV-1 P24抗体，则会与预包被HIV-1 P24抗原酶标板上的P24抗原结合形成固相抗原-P24抗体复合物，再用辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体于固相抗原-P24抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-P24抗体-HRP酶标二抗复合物，如待测样本中含有HIV-1 P24抗体，则加入显色剂TMB A液和显色剂TMB B液后颜色变蓝，并且随着待测样本中抗体量的增加，颜色越来越深；
需要指出的是，上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，但不能以此来限定本发明保护的范围，对于本领域的技术人员来说，在本发明的基础上做出的等同或等效的变化及替换，均属于本发明所要求保护的范围；
本发明的试剂盒的性能试验如下：
1、特异性和敏感性
按照本发明的方法研制人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒，分别对275份经WB确证实验确定的HIV-Ⅰ P24抗体阳性样本、310份非HIV-Ⅰ阳性样本进行检测(其中非HIV-Ⅰ阳性样本包括：正常人血清、丙肝抗体阳性血清、乙肝阳性血清、梅毒抗体阳性血清、类风湿抗体阳性血清)；
用本发明检测试剂盒检测结果如下：275份HIV-Ⅰ P24抗体阳性样本均为阳性；310份非HIV-Ⅰ阳性样本中有307份为阴性，3份为阳性，由此可得：特异性为99.03％，敏感性为100％；假阳性率为0.971％，假阴性率为0％；
2、重复性试验
使用人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒检测60份HIV-Ⅰ P24抗体阳性样本、10份正常人样本、20份类风湿抗体阳性样本；
1)批间可重复性试验：
分别使用三批人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒检测60份HIV-Ⅰ P24抗体阳性样本、10份正常人样本、20份类风湿抗体阳性样本。其检测结果见表1：
表1批间可重复性试验
2)批内可重复试验：
使用同一批次人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒重复检测3次上述60份HIV-Ⅰ P24抗体阳性样本，其检测结果见表2
表2批内可重复试验
批次 第一次 第二次 第三次 变异系数
阳性数 60 60 60 0
由表1和表2可知本人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒有较好的重复性。

Claims (4)

1.一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，试剂盒内设有预包被HIV-1 P24抗原酶标板，阴性对照液血清、阳性对照液血清、辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体、抗体稀释液、显色剂TMB A液和显色剂TMB B液、终止液、洗涤液、封板膜；其中，阴性对照液血清为正常人血清；阳性对照液血清为含P24抗体的人血清；HIV-1 P24抗原为纯化的重组P24蛋白，P24蛋白由以下P24基因序列SEQ ID NO:1构成。
2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的HIV-1 P24抗原的制备方法是：选择HIV-1阳性样本，提取RNA反转录为cDNA；分别设计三轮引物，其中第一轮引物为：
gag_A_ SEQ ID NO:2，gag_S_ SEQ ID NO:3；第二轮引物为：P24_S1：SEQ ID NO:4，P24_A1 ：SEQ ID NO:5；第三轮引物为：P24_NCOⅠ-2：SEQ ID NO:6，其5’端设计有NCOⅠ酶切位点；P24_XHOⅠ-2：SEQ ID NO:7，其5’端设计有XHOⅠ 酶切位点；
利用上述引物，扩增模板cDNA，扩增后片段大小为693bp，利用omega胶回收试剂盒切胶回收，得切胶纯化的P24基因片段，扩增DH5a-PET32a菌株，得PET32a质粒，将获得的PET32a质粒和切胶纯化的P24基因片段利用NCOⅠ和XHOⅠ分别双酶切，酶切后的产物分别用omega胶回收试剂盒进行纯化回收，得酶切PET32a质粒和酶切P24基因片段；酶切P24基因片段和酶切PET32a质粒连接，构建PET32a-P24重组质粒，提取PET32a-P24质粒转入BL21菌株中，构成BL21-PET32a-P24菌株，通过IPTG诱导表达P24抗原，利用镍柱填料初次纯化P24抗原后，再经SDS-PAGE电泳切胶回收再次纯化P24抗原，置于磷酸盐缓冲液中，透析，经聚乙二醇8000浓缩得浓缩蛋白，即为纯化的重组P24蛋白。
3.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述的预包被HIV-1 P24抗原酶标板的制备方法是：
（1）将纯化的重组P24蛋白用碳酸盐包被液稀释至2μg/ml，得稀释液，每孔100μl稀释液包被96孔聚苯乙烯微孔板，封膜，4℃，16-18小时；
（2）微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
（3）封闭微孔板：在96孔聚苯乙烯微孔板的各个孔中加入200μl封闭液，封膜，置于37℃水浴箱，2h；
（4）微孔板洗涤：弃去96孔聚苯乙烯微孔板中液体，用PBS洗涤3次，拍干96孔聚苯乙烯微孔板；
（5）预包板的保存：装封闭袋中，置于4℃保存备用。
4.根据权利要求1或2或3所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，其检测方法是：
所述的检测人类免疫缺陷病毒Ⅰ型P24抗体检测试剂盒的检测方法：
（1）实验设计：根据待测样本的数量选择相应的预包被HIV-1 P24抗原酶标板的微孔数量，另设空白对照、阴性对照、阳性对照各一孔；
（2） 试剂配制：使用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体，抗体稀释液和辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG抗体的体积比为1:6000，即得酶标二抗工作液；
（3）加样：将待测样本用抗体稀释液按体积比1：20稀释，每个待测样本的微孔中待测样本加入量为50μl、阴性对照的微孔中阴性对照液血清加入量为50μl、阳性对照的微孔中阳性对照液血清加入量为50μl，空白对照的微孔中不加样；
（4）温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，温育1h；
（5）洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
（6）加酶：空白对照的微孔除外，其余每孔加入酶标二抗工作液50μl；
（7）温育：用封板膜封盖反应板，置于37℃水浴箱，30min；
（8）洗板：撕去封板膜，弃去微孔中液体，注满洗涤液，浸泡至少5s，反复洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
（9）加底物液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入显色剂TMB A液和显色剂TMB B液各50μl，震荡仪震荡混匀，置于 37℃水浴箱，温育15min；
（10）加终止液：待测样本的微孔、阴性对照的微孔、阳性对照的微孔和空白对照的微孔内均加入50μl终止液，震荡仪震荡混匀；
（11）检测：取波长450nm设定酶标仪检测，以空白对照的微孔校零，再读取各孔OD值；
（12）结果判断：阴性对照A值*2.5＝临界值，阴性对照的OD值高于0.05时，阴性对照A值按实际OD值计算，阴性对照的OD值小于0.05时，阴性对照A值按0.05计算，凡待测样本的A值大于临界值即为阳性，反之，则为阴性。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113121678B (zh) * 2019-12-31 2022-11-08 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗hiv-1 p24的重组抗体
WO2023241416A1 (zh) * 2022-06-17 2023-12-21 菲鹏生物股份有限公司 抗p24抗体、检测p24的试剂和试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033857A1 (en) * 1994-06-02 1995-12-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for determining hiv-1 antigen and antibody
EP1072888A2 (en) * 1999-07-28 2001-01-31 Fujirebio Kabushiki Kaisha Immunoassay method and reagent for HIV-1p24 antigen
CN102680690A (zh) * 2011-03-17 2012-09-19 北京易斯威特生物医学科技有限公司 第四代hiv抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用
CN102768274A (zh) * 2011-05-04 2012-11-07 武汉康苑生物医药科技有限公司 一种人类免疫缺陷病毒p24抗原酶联免疫检测试剂盒
CN104237510A (zh) * 2014-09-12 2014-12-24 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2762394B1 (fr) * 1997-04-16 1999-05-28 Bio Merieux Compose ligand de coordination et utilisation pour fixer un materiel biologique

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995033857A1 (en) * 1994-06-02 1995-12-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for determining hiv-1 antigen and antibody
EP1072888A2 (en) * 1999-07-28 2001-01-31 Fujirebio Kabushiki Kaisha Immunoassay method and reagent for HIV-1p24 antigen
CN102680690A (zh) * 2011-03-17 2012-09-19 北京易斯威特生物医学科技有限公司 第四代hiv抗体抗原检测试纸及其制备方法和应用
CN102768274A (zh) * 2011-05-04 2012-11-07 武汉康苑生物医药科技有限公司 一种人类免疫缺陷病毒p24抗原酶联免疫检测试剂盒
CN104237510A (zh) * 2014-09-12 2014-12-24 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An ELISA-inhibition assay for antibody to human immunodeficiency virus core antigen (p24);J Povolotsky et al.;《Journal of Virological Methods》;19901231;第30卷(第1期);第109-114页 *
Assessment of an ELISA for the detection of antibodies against HIV-1 protein p24;MA Ribas Antúnez et al.;《Revista Cubana De Medicina Tropical》;19991230;第51卷(第2期);第130-132页 *
Differences in Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Anti-p24 Reactivities in Serum of HIV-1-Infected and Uninfected Subjects: Analysis of Indeterminate Western Blot Reactions;Jacob Povolotsky et al.;《The Journal of Infectious Diseases》;19910228;第163卷(第2期);第247-251页 *

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