JPH08114590A - 測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法 - Google Patents
測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法Info
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- JPH08114590A JPH08114590A JP7246505A JP24650595A JPH08114590A JP H08114590 A JPH08114590 A JP H08114590A JP 7246505 A JP7246505 A JP 7246505A JP 24650595 A JP24650595 A JP 24650595A JP H08114590 A JPH08114590 A JP H08114590A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼー
ションアッセイにおける妨害を除去する一般的かつ普遍
的方法を提供する。 【解決手段】 以下の成分： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）活性固相、および ｄ）活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
きない不活性固相、を使用し、被験試料をまず不活性固
相とのみ接触させてその後活性固相と接触させるか、あ
るいは活性固相と不活性固相とに同時に接触させる。
ションアッセイにおける妨害を除去する一般的かつ普遍
的方法を提供する。 【解決手段】 以下の成分： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）活性固相、および ｄ）活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
きない不活性固相、を使用し、被験試料をまず不活性固
相とのみ接触させてその後活性固相と接触させるか、あ
るいは活性固相と不活性固相とに同時に接触させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イムノアッセイま
たは核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって被験
試料中の測定すべき物質を定性的または／および定量的
に検出する方法、このようなアッセイに用いる不活化固
相、ならびに分析すべき被験試料中の非特異的結合成分
を捕捉することによりイムノアッセイまたは核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおける妨害を除去するため
のかかる不活化固相の使用に関する。最後に本発明は、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイの通常成分と、本発明の不活化固相とを含む試験キ
ットにも関する。
たは核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって被験
試料中の測定すべき物質を定性的または／および定量的
に検出する方法、このようなアッセイに用いる不活化固
相、ならびに分析すべき被験試料中の非特異的結合成分
を捕捉することによりイムノアッセイまたは核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおける妨害を除去するため
のかかる不活化固相の使用に関する。最後に本発明は、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイの通常成分と、本発明の不活化固相とを含む試験キ
ットにも関する。
【０００２】
【従来技術】今日では、イムノアッセイおよび核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイは診断などの分野において
物質の迅速かつ簡単な試験として用いられている。これ
らは生物学的試料中の内因性または外因性物質の存在を
迅速かつ信頼性高く検出するために用いられている。イ
ムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イは、検出すべきある物質が別の物質と特異的に結合
し、そしてもしもアッセイが適正に設計されているなら
ば、検出すべき物質の存在はこの別の物質の助けによっ
て測定できる、という原理に基づいている。したがっ
て、測定すべき物質が１またはいくつかの別の物質と特
異的に結合できることが検出に利用される。しかしなが
ら、この過程においては、望ましくない相互作用や非特
異的結合反応などの副反応も生じ得る。特に、特異的に
結合する物質を固定するか、あるいは固定しうる固相を
用いる場合には、この固相に結合する別の物質が試料中
にしばしば存在し、このために誤った正のシグナルを生
じる。これによりバックグランドシグナルが増大し、シ
グナルのバラツキが大きくなることにより各試験の感受
性および特異性が減少する。
ブリダイゼーションアッセイは診断などの分野において
物質の迅速かつ簡単な試験として用いられている。これ
らは生物学的試料中の内因性または外因性物質の存在を
迅速かつ信頼性高く検出するために用いられている。イ
ムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イは、検出すべきある物質が別の物質と特異的に結合
し、そしてもしもアッセイが適正に設計されているなら
ば、検出すべき物質の存在はこの別の物質の助けによっ
て測定できる、という原理に基づいている。したがっ
て、測定すべき物質が１またはいくつかの別の物質と特
異的に結合できることが検出に利用される。しかしなが
ら、この過程においては、望ましくない相互作用や非特
異的結合反応などの副反応も生じ得る。特に、特異的に
結合する物質を固定するか、あるいは固定しうる固相を
用いる場合には、この固相に結合する別の物質が試料中
にしばしば存在し、このために誤った正のシグナルを生
じる。これによりバックグランドシグナルが増大し、シ
グナルのバラツキが大きくなることにより各試験の感受
性および特異性が減少する。
【０００３】非特異的因子との相互作用を避けるため
に、例えば欧州特許出願ＥＰ０１６３３１２は、最大平
均サイズが０．２μｍで、非特異的反応を引き起こす物
質と結合してこれを捕捉することのできる超微粒子をイ
ムノアッセイ試薬に加えることを提案する。しかしなが
ら、このために超微粒子を特別に調製しなければなら
ず、またどのような非特異的因子が試料中に実際に存在
するのかということもわかっていなければならない。
に、例えば欧州特許出願ＥＰ０１６３３１２は、最大平
均サイズが０．２μｍで、非特異的反応を引き起こす物
質と結合してこれを捕捉することのできる超微粒子をイ
ムノアッセイ試薬に加えることを提案する。しかしなが
ら、このために超微粒子を特別に調製しなければなら
ず、またどのような非特異的因子が試料中に実際に存在
するのかということもわかっていなければならない。
【０００４】
【発明が解決すべき課題】しかしながら、実際に存在す
る妨害物質を知らなくともイムノアッセイや核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおける妨害を除去する一般
的かつ普遍的方法が提供されれば有利であろう。したが
って、本発明の目的は適当な方法を提供することにあ
る。
る妨害物質を知らなくともイムノアッセイや核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイにおける妨害を除去する一般
的かつ普遍的方法が提供されれば有利であろう。したが
って、本発明の目的は適当な方法を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的は本発明により
達成される。すなわち、本発明は、イムノアッセイまた
は核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって被験試
料中の測定すべき物質を定性的または／および定量的に
検出する方法であって、該方法は以下の成分： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）活性固相、および ｃ）活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
きない不活性固相、を使用し、被験試料をまず不活性固
相とのみ接触させてその後活性固相と接触させるか、あ
るいは活性固相と不活性固相とに同時に接触させ、この
間捕捉試薬および所望するならば追加の試験成分は最初
から存在するか、あるいは後に添加し、そして測定すべ
き物質を検出する、ことからなる。
達成される。すなわち、本発明は、イムノアッセイまた
は核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって被験試
料中の測定すべき物質を定性的または／および定量的に
検出する方法であって、該方法は以下の成分： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）活性固相、および ｃ）活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
きない不活性固相、を使用し、被験試料をまず不活性固
相とのみ接触させてその後活性固相と接触させるか、あ
るいは活性固相と不活性固相とに同時に接触させ、この
間捕捉試薬および所望するならば追加の試験成分は最初
から存在するか、あるいは後に添加し、そして測定すべ
き物質を検出する、ことからなる。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明の捕捉試薬は２つの型の結
合部位をもつように設計される。捕捉試薬は１つの型の
結合部位によって特異的結合ペアの１つのパートナーと
カップリングしうる。結合ペアのいくつかのパートナー
とのカップリングも可能である。さらに本発明の捕捉試
薬は測定すべき物質の特異的検出を可能にする別の型の
結合部位をもつ。これらの結合部位は好ましくは測定す
べき物質または測定すべき物質の複合体と、および追加
の試験成分と特異的に結合できる。捕捉試薬はまたこの
種の結合部位をいくつかもつことができ、例えば抗体は
特異的結合部位をもつ２つのエピトープをもつ。
合部位をもつように設計される。捕捉試薬は１つの型の
結合部位によって特異的結合ペアの１つのパートナーと
カップリングしうる。結合ペアのいくつかのパートナー
とのカップリングも可能である。さらに本発明の捕捉試
薬は測定すべき物質の特異的検出を可能にする別の型の
結合部位をもつ。これらの結合部位は好ましくは測定す
べき物質または測定すべき物質の複合体と、および追加
の試験成分と特異的に結合できる。捕捉試薬はまたこの
種の結合部位をいくつかもつことができ、例えば抗体は
特異的結合部位をもつ２つのエピトープをもつ。
【０００７】本発明の方法においては、物質は測定すべ
き物質と特異的に結合できる捕捉試薬として使用される
のが好ましい。測定すべき物質が抗体である場合には、
対応する抗原、ハプテンまたは測定すべき抗体に対する
第２抗体またはその断片であっても捕捉試薬として使用
できる。これとは対照的に測定すべき物質が抗原である
場合には、抗体または抗体断片を捕捉試薬として使用す
る。測定すべき物質が核酸である場合には、核酸オリゴ
マーまたは核酸ポリマーまたは核酸類似体を捕捉試薬と
して使用する。この場合には、ペプチド性核酸を核酸類
似体として使用することが好ましい。
き物質と特異的に結合できる捕捉試薬として使用される
のが好ましい。測定すべき物質が抗体である場合には、
対応する抗原、ハプテンまたは測定すべき抗体に対する
第２抗体またはその断片であっても捕捉試薬として使用
できる。これとは対照的に測定すべき物質が抗原である
場合には、抗体または抗体断片を捕捉試薬として使用す
る。測定すべき物質が核酸である場合には、核酸オリゴ
マーまたは核酸ポリマーまたは核酸類似体を捕捉試薬と
して使用する。この場合には、ペプチド性核酸を核酸類
似体として使用することが好ましい。
【０００８】この関連において、本発明の捕捉試薬は、
測定すべき物質の結合を妨害しない分子の部位を用いて
捕捉試薬を特異的結合ペアを介して固相と結合できるよ
うに設計するか、あるいは捕捉試薬を固相とすでに結合
したものとして存在するように設計される。この結合は
結合ペアを介して直接行うことができる。しかしなが
ら、互いに結合できる２以上の成分からなる結合系を用
いて、捕捉試薬を固相にカップリングすることもでき
る。特異的結合ペアの１つのパートナーは常に捕捉試薬
と連結しており、特異的結合ペアの第２のパートナーは
固相とカップリングする。このカップリングは当業者に
公知のあらゆる方法を用いて実施することができ、特異
的結合ペアを介する捕捉試薬の固相へのカップリングは
イムノアッセイを実施する前に行うことができ、あるい
はイムノアッセイの途中まで行わないこともでき、この
場合には単に捕捉試薬をイムノアッセイの他の成分に後
で加える。
測定すべき物質の結合を妨害しない分子の部位を用いて
捕捉試薬を特異的結合ペアを介して固相と結合できるよ
うに設計するか、あるいは捕捉試薬を固相とすでに結合
したものとして存在するように設計される。この結合は
結合ペアを介して直接行うことができる。しかしなが
ら、互いに結合できる２以上の成分からなる結合系を用
いて、捕捉試薬を固相にカップリングすることもでき
る。特異的結合ペアの１つのパートナーは常に捕捉試薬
と連結しており、特異的結合ペアの第２のパートナーは
固相とカップリングする。このカップリングは当業者に
公知のあらゆる方法を用いて実施することができ、特異
的結合ペアを介する捕捉試薬の固相へのカップリングは
イムノアッセイを実施する前に行うことができ、あるい
はイムノアッセイの途中まで行わないこともでき、この
場合には単に捕捉試薬をイムノアッセイの他の成分に後
で加える。
【０００９】本発明の好ましい態様では、互いに特異的
に結合しうるビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプ
トアビジン、抗原／抗体、ハプテン／抗体ペアまたはそ
の断片を特異的結合ペアとして使用する。本発明の特に
好ましい態様では、ビオチン／アビジンまたはビオチン
／ストレプトアビジンを特異的結合ペアとして使用す
る。
に結合しうるビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプ
トアビジン、抗原／抗体、ハプテン／抗体ペアまたはそ
の断片を特異的結合ペアとして使用する。本発明の特に
好ましい態様では、ビオチン／アビジンまたはビオチン
／ストレプトアビジンを特異的結合ペアとして使用す
る。
【００１０】本発明によると、捕捉試薬と一緒になって
測定すべき物質の特異的検出を可能にし、かつ間接また
は直接の標識をもつ検出試薬によって、測定すべき物質
は検出される。直接標識された検出試薬を用いると、検
出試薬が測定すべき物質と結合し、標識をもつ検出可能
なサンドイッチ複合体を形成するか、または検出試薬が
測定すべき物質と競合して捕捉試薬と結合し、標識をも
つ検出試薬−捕捉試薬複合体を形成する、これらのいず
れかにより検出が行われる。間接標識をもつ検出試薬は
いくつかの成分からなっており、これらの成分のうち測
定すべき物質または捕捉試薬と結合する成分は未標識で
あり、標識をもつ追加の成分と結合することができる。
測定すべき物質の特異的検出を可能にし、かつ間接また
は直接の標識をもつ検出試薬によって、測定すべき物質
は検出される。直接標識された検出試薬を用いると、検
出試薬が測定すべき物質と結合し、標識をもつ検出可能
なサンドイッチ複合体を形成するか、または検出試薬が
測定すべき物質と競合して捕捉試薬と結合し、標識をも
つ検出試薬−捕捉試薬複合体を形成する、これらのいず
れかにより検出が行われる。間接標識をもつ検出試薬は
いくつかの成分からなっており、これらの成分のうち測
定すべき物質または捕捉試薬と結合する成分は未標識で
あり、標識をもつ追加の成分と結合することができる。
【００１１】適当な標識は当業者に公知である。放射性
標識、化学発光標識、蛍光標識または電子化学発光標
識、金属ゾル粒子などの染色粒子、あるいは染色または
非染色ラテックスを使用するのが好ましい。例えば、パ
ーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ
ホスファターゼなどの酵素を用いる酵素標識の場合にも
標識により間接シグナルが生じる。本発明では標識は活
性固相上で、または／および試料上清中で測定すること
が好ましい。
標識、化学発光標識、蛍光標識または電子化学発光標
識、金属ゾル粒子などの染色粒子、あるいは染色または
非染色ラテックスを使用するのが好ましい。例えば、パ
ーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ
ホスファターゼなどの酵素を用いる酵素標識の場合にも
標識により間接シグナルが生じる。本発明では標識は活
性固相上で、または／および試料上清中で測定すること
が好ましい。
【００１２】本発明ではすべての公知の検出法を測定す
べき物質の検出に用いることができる。試験は例えばい
わゆる置換法（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏ
ｄ）またはサンドイッチ法として実施することができ
る。本発明で好ましい置換法においては、測定すべき物
質と同じまたは類似の結合部位をもち、それ故測定すべ
き物質と競合する標識された検出試薬を使用する。例え
ば測定すべき物質が抗体ならば、捕捉試薬としての適当
な抗原と標識抗体とを加えて置換法でこの抗体を検出
し、この場合標識抗体は測定すべき抗体と同じまたは類
似の結合特異性を有する。抗原は固相と直接連結する
か、あるいは特異的結合ペアを介して固相と結合するこ
とができ、この特異的結合ペアの第１パートナーは抗原
に連結し、第２パートナーは活性固相にカップリングす
る。抗原を固相に結合するか、あるいは固相と結合でき
るかまたは固相と結合された第２抗体を介して抗原を固
相上に間接的に固定化できる。標識抗体と同様に、この
第２抗体も測定すべき抗体と同じまたは類似の特異性を
もつ。試料抗体は抗原との結合において標識抗体と競合
し、そして所望するならば第２抗体と競合する。
べき物質の検出に用いることができる。試験は例えばい
わゆる置換法（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏ
ｄ）またはサンドイッチ法として実施することができ
る。本発明で好ましい置換法においては、測定すべき物
質と同じまたは類似の結合部位をもち、それ故測定すべ
き物質と競合する標識された検出試薬を使用する。例え
ば測定すべき物質が抗体ならば、捕捉試薬としての適当
な抗原と標識抗体とを加えて置換法でこの抗体を検出
し、この場合標識抗体は測定すべき抗体と同じまたは類
似の結合特異性を有する。抗原は固相と直接連結する
か、あるいは特異的結合ペアを介して固相と結合するこ
とができ、この特異的結合ペアの第１パートナーは抗原
に連結し、第２パートナーは活性固相にカップリングす
る。抗原を固相に結合するか、あるいは固相と結合でき
るかまたは固相と結合された第２抗体を介して抗原を固
相上に間接的に固定化できる。標識抗体と同様に、この
第２抗体も測定すべき抗体と同じまたは類似の特異性を
もつ。試料抗体は抗原との結合において標識抗体と競合
し、そして所望するならば第２抗体と競合する。
【００１３】測定すべき物質が抗原である場合には、測
定すべき抗原の免疫学的競合類似体を置換法の検出に使
用するのが好ましい。これは例えば同じ抗原または／お
よび類似の結合特異性をもつ抗原である。測定すべき物
質が核酸である場合には、核酸オリゴマーまたは核酸ポ
リマーまたは核酸類似体、そして特にペプチド性核酸を
検出試薬として使用するのが好ましい。
定すべき抗原の免疫学的競合類似体を置換法の検出に使
用するのが好ましい。これは例えば同じ抗原または／お
よび類似の結合特異性をもつ抗原である。測定すべき物
質が核酸である場合には、核酸オリゴマーまたは核酸ポ
リマーまたは核酸類似体、そして特にペプチド性核酸を
検出試薬として使用するのが好ましい。
【００１４】本発明によると、測定すべき物質はサンド
イッチ法によって検出するのが特に好ましい。この場
合、検出試薬は測定すべき物質と特異性に結合しうる。
測定すべき物質が抗体である場合には、抗原、ハプテン
または第１抗体に対する第２抗体または抗体断片が検出
試薬として使用しうる。他方、測定すべき物質が抗原で
ある場合には、抗体または抗体断片を、捕捉試薬のエピ
トープとは異なる抗原エピトープと特異的に結合する検
出試薬として使用する。測定すべき物質が例えばオリゴ
ヌクレオチドまたはＤＮＡやＲＮＡの一部のような核酸
である場合には、測定すべき物質と相補的な配列領域を
もつ捕捉試薬として、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマ
ーまたは類似の構造体を使用するのが便利である。
イッチ法によって検出するのが特に好ましい。この場
合、検出試薬は測定すべき物質と特異性に結合しうる。
測定すべき物質が抗体である場合には、抗原、ハプテン
または第１抗体に対する第２抗体または抗体断片が検出
試薬として使用しうる。他方、測定すべき物質が抗原で
ある場合には、抗体または抗体断片を、捕捉試薬のエピ
トープとは異なる抗原エピトープと特異的に結合する検
出試薬として使用する。測定すべき物質が例えばオリゴ
ヌクレオチドまたはＤＮＡやＲＮＡの一部のような核酸
である場合には、測定すべき物質と相補的な配列領域を
もつ捕捉試薬として、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマ
ーまたは類似の構造体を使用するのが便利である。
【００１５】修飾核酸塩基、糖または／およびヌクレオ
チド間結合を核酸類似体として使用することができる。
ペプチド性核酸／ＰＮＡがヌクレオチド類似体として特
に適している。このようなイムノアッセイおよび核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイ、特に「サンドイッチア
ッセイ」に適した捕捉試薬および検出試薬は一般に当業
者に公知であり、特に本明細書で明らかにする必要はな
い。
チド間結合を核酸類似体として使用することができる。
ペプチド性核酸／ＰＮＡがヌクレオチド類似体として特
に適している。このようなイムノアッセイおよび核酸ハ
イブリダイゼーションアッセイ、特に「サンドイッチア
ッセイ」に適した捕捉試薬および検出試薬は一般に当業
者に公知であり、特に本明細書で明らかにする必要はな
い。
【００１６】本発明で好ましいサンドイッチ検出法にお
いては、測定すべき物質、固相への結合を仲介する捕捉
試薬、および標識をもち測定すべき物質の存在の検出を
可能にする検出試薬によって複合体が形成される。個々
の試験成分を添加する順序は本試験法で重要ではない。
本発明の方法では、捕捉試薬に加えて、活性固相と、必
要ならば検出試薬とを使用する。この活性固相は捕捉試
薬を既に結合した形で含んでいるか、あるいは固相に捕
捉試薬を結合できるように設計されている。「活性」固
相という用語は、この固相が測定すべき物質の検出を捕
捉試薬によって実施できることを明らかにするものであ
る。非結合成分が分離されて測定すべき物質が検出でき
るような方法によって、捕捉試薬が検出試薬を活性固相
に結合しうることが好ましい。しかしながら、従来公知
のイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イとは異なり、本発明の方法では、実質的には活性固相
に対応するが、捕捉試薬がこれに結合できないように修
飾された不活性固相をさらに使用する。しかしながら、
この不活性固相上では捕捉試薬または固相へのその特異
的結合によって仲介されない非特異的結合が生じ得る。
被験試料のみとプレインキュベーションできるが、ある
いは１または複数のまたは究極的にはイムノアッセイの
すべての他の成分と組み合わせて用い得るこの不活性固
相を用いると、非特異的結合を防止でき、その結果、活
性固相上で生じるあらゆる種類の非特異的結合による架
橋を防止し、検出試薬が活性固相と結合して誤った正の
シグナルを生じることを防止できる。
いては、測定すべき物質、固相への結合を仲介する捕捉
試薬、および標識をもち測定すべき物質の存在の検出を
可能にする検出試薬によって複合体が形成される。個々
の試験成分を添加する順序は本試験法で重要ではない。
本発明の方法では、捕捉試薬に加えて、活性固相と、必
要ならば検出試薬とを使用する。この活性固相は捕捉試
薬を既に結合した形で含んでいるか、あるいは固相に捕
捉試薬を結合できるように設計されている。「活性」固
相という用語は、この固相が測定すべき物質の検出を捕
捉試薬によって実施できることを明らかにするものであ
る。非結合成分が分離されて測定すべき物質が検出でき
るような方法によって、捕捉試薬が検出試薬を活性固相
に結合しうることが好ましい。しかしながら、従来公知
のイムノアッセイや核酸ハイブリダイゼーションアッセ
イとは異なり、本発明の方法では、実質的には活性固相
に対応するが、捕捉試薬がこれに結合できないように修
飾された不活性固相をさらに使用する。しかしながら、
この不活性固相上では捕捉試薬または固相へのその特異
的結合によって仲介されない非特異的結合が生じ得る。
被験試料のみとプレインキュベーションできるが、ある
いは１または複数のまたは究極的にはイムノアッセイの
すべての他の成分と組み合わせて用い得るこの不活性固
相を用いると、非特異的結合を防止でき、その結果、活
性固相上で生じるあらゆる種類の非特異的結合による架
橋を防止し、検出試薬が活性固相と結合して誤った正の
シグナルを生じることを防止できる。
【００１７】被験試料はまず不活性固相のみとインキュ
ベートするのが好ましい。この工程で固相と結合できる
すべての非特異的物質が反応し、その後試料を不活性固
相から分離し、次いで活性固相や捕捉試薬などのその他
の成分および所望するならば検出試薬および追加の試験
成分と任意の順序または組み合わせでインキュベート
し、測定すべき物質を標識シグナルを介して検出でき
る。
ベートするのが好ましい。この工程で固相と結合できる
すべての非特異的物質が反応し、その後試料を不活性固
相から分離し、次いで活性固相や捕捉試薬などのその他
の成分および所望するならば検出試薬および追加の試験
成分と任意の順序または組み合わせでインキュベート
し、測定すべき物質を標識シグナルを介して検出でき
る。
【００１８】別の好ましい態様では、不活性固相と活性
固相を同時に試料と、そして所望するならばイムノアッ
セイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイのその
他の成分と接触させ、非特異的物質も不活性固相と結合
することにより少なくともある程度バックグランドと妨
害シグナルを減少する。本発明においては、イムノアッ
セイに使用できるすべての固相を固相として使用でき
る。プラスチック管、ミクロタイタープレート、ガラス
またはプラスチックビーズまたはラテックス粒子を固相
として用いるのが好ましい。しかし、紙またはプラスチ
ック製の試験ストリップも使用できる。
固相を同時に試料と、そして所望するならばイムノアッ
セイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイのその
他の成分と接触させ、非特異的物質も不活性固相と結合
することにより少なくともある程度バックグランドと妨
害シグナルを減少する。本発明においては、イムノアッ
セイに使用できるすべての固相を固相として使用でき
る。プラスチック管、ミクロタイタープレート、ガラス
またはプラスチックビーズまたはラテックス粒子を固相
として用いるのが好ましい。しかし、紙またはプラスチ
ック製の試験ストリップも使用できる。
【００１９】固相は各種方法で不活性化できる。しかし
ながら、この工程で捕捉試薬の固相への特異的結合が起
こらないよう確認しなければならない。ビオチン／スト
レプトアビジンまたはビオチン／アビジンを特異的結合
ペアとして用い、またそのうちのアビジンまたはストレ
プトアビジンが固相と結合して存在する本発明の特に好
ましい態様では、不活性固相の製造においてアビジンま
たはストレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導
体で飽和することにより不活性化する。さらに、固相と
結合しているか、あるいは固相と結合すべきアビジンま
たはストレプトアビジンは活性中心の共有結合修飾によ
り不活性化することが好ましい。このような共有結合修
飾は活性中心の少なくとも１個のアミノ酸を誘導体とす
るか、あるいは活性中心にビオチンを共有結合的にカッ
プリングすることにより行うことが好ましい。この場
合、共有結合的カップリングは、例えばビオチン−ＤＡ
ＤＯＯ−ＡＢなどの光活性化されうるビオチンをアビジ
ンまたはストレプトアビジンにカップリングすることに
より行うのが好ましい。
ながら、この工程で捕捉試薬の固相への特異的結合が起
こらないよう確認しなければならない。ビオチン／スト
レプトアビジンまたはビオチン／アビジンを特異的結合
ペアとして用い、またそのうちのアビジンまたはストレ
プトアビジンが固相と結合して存在する本発明の特に好
ましい態様では、不活性固相の製造においてアビジンま
たはストレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導
体で飽和することにより不活性化する。さらに、固相と
結合しているか、あるいは固相と結合すべきアビジンま
たはストレプトアビジンは活性中心の共有結合修飾によ
り不活性化することが好ましい。このような共有結合修
飾は活性中心の少なくとも１個のアミノ酸を誘導体とす
るか、あるいは活性中心にビオチンを共有結合的にカッ
プリングすることにより行うことが好ましい。この場
合、共有結合的カップリングは、例えばビオチン−ＤＡ
ＤＯＯ−ＡＢなどの光活性化されうるビオチンをアビジ
ンまたはストレプトアビジンにカップリングすることに
より行うのが好ましい。
【００２０】しかしながら、不活性化固相を得るために
遺伝子操作により製造したアビジンまたはストレプトア
ビジンを用いることも可能であり、また本発明において
は特に好ましいことである。該方法では１または複数の
アミノ酸を置換、欠失または挿入することによって遺伝
子操作により活性中心を修飾してビオチンの結合を妨害
する。
遺伝子操作により製造したアビジンまたはストレプトア
ビジンを用いることも可能であり、また本発明において
は特に好ましいことである。該方法では１または複数の
アミノ酸を置換、欠失または挿入することによって遺伝
子操作により活性中心を修飾してビオチンの結合を妨害
する。
【００２１】アビジンまたはストレプトアビジンの断片
は、これとカップリングした固相がなお十分な非特異的
結合を捕捉できることを条件に、使用できる。簡単な予
備試験でこれを確認できる。水性試料を被験試料として
一般に使用し、体液および特に血液、血漿、血清、唾
液、皮膚パッチなどを用いて皮膚から得た組織液などの
組織液、ある種の体液（ｌｉｑｕｏｒ）または尿を診断
に用いる。したがって好ましい試料は体液である。
は、これとカップリングした固相がなお十分な非特異的
結合を捕捉できることを条件に、使用できる。簡単な予
備試験でこれを確認できる。水性試料を被験試料として
一般に使用し、体液および特に血液、血漿、血清、唾
液、皮膚パッチなどを用いて皮膚から得た組織液などの
組織液、ある種の体液（ｌｉｑｕｏｒ）または尿を診断
に用いる。したがって好ましい試料は体液である。
【００２２】本発明の方法では、測定すべき物質が抗原
である場合、抗体または抗体断片を捕捉試薬および所望
するときは検出試薬として用いるのが好ましい。逆に、
測定すべき物質が抗体である場合には、抗原または／お
よびハプテンを捕捉または／および検出試薬として用
い、これらの試薬のうちの１つまたは両方が抗原または
／およびハプテンで、他方の試薬が測定すべき抗体に対
する第２抗体であることができる。測定すべき物質がオ
リゴヌクレオチドまたはＤＮＡやＲＮＡのセクションで
ある場合には、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマーまた
は核酸類似体、そして特に好ましくはペプチド性核酸を
用いることが便利である。
である場合、抗体または抗体断片を捕捉試薬および所望
するときは検出試薬として用いるのが好ましい。逆に、
測定すべき物質が抗体である場合には、抗原または／お
よびハプテンを捕捉または／および検出試薬として用
い、これらの試薬のうちの１つまたは両方が抗原または
／およびハプテンで、他方の試薬が測定すべき抗体に対
する第２抗体であることができる。測定すべき物質がオ
リゴヌクレオチドまたはＤＮＡやＲＮＡのセクションで
ある場合には、核酸オリゴマーまたは核酸ポリマーまた
は核酸類似体、そして特に好ましくはペプチド性核酸を
用いることが便利である。
【００２３】本発明の方法は、固相を含むすべての成分
を最初に反応容器に導入して行うことができる。この場
合、固相として修飾ガラスまたはプラスチックビーズを
用いることが好ましい。しかしながら、反応容器を２つ
の固相のうちの一方とし、そしてガラスまたはプラスチ
ックビーズを２つの固相のうちの他方として用いるイム
ノアッセイも実施できる。試験ストリップの形での固相
も使用でき、この場合両方の固相を試験ストリップとし
て設計することもできるし、あるいは反応容器を２つの
固相のうちの一方とすることもできる。
を最初に反応容器に導入して行うことができる。この場
合、固相として修飾ガラスまたはプラスチックビーズを
用いることが好ましい。しかしながら、反応容器を２つ
の固相のうちの一方とし、そしてガラスまたはプラスチ
ックビーズを２つの固相のうちの他方として用いるイム
ノアッセイも実施できる。試験ストリップの形での固相
も使用でき、この場合両方の固相を試験ストリップとし
て設計することもできるし、あるいは反応容器を２つの
固相のうちの一方とすることもできる。
【００２４】本発明の特に好ましい態様においては、特
異的結合系の一方のパートナーとしてのストレプトアビ
ジンまたはアビジンを熱ウシ血清アルブミン（ＴＢＳ
Ａ）によって固相にカップリングさせる。本発明のさら
に好ましい態様においては、ミクロタイタープレートを
固相として各場合に使用する。この場合のプレートは例
えば８および１６ウエルストリップのような他の形態で
あってもよい。この場合には、幾つかの異なるイムノア
ッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイを同
時に行うことができる。このためには、まず被験試料を
不活性化固相として設計されたミクロタイタープレート
と、所望するならば検出または／および捕捉試薬の存在
下に、接触させ、試料をウエルに導入する。不活性化固
相との非特異的結合が起きるプレインキュベーションの
後に、各種の平行して実施する試料を遅滞無くピペッ
ト、好ましくはマルチチャンネルピペットによって、活
性固相として設計された別のミクロタイタープレートに
移す。
異的結合系の一方のパートナーとしてのストレプトアビ
ジンまたはアビジンを熱ウシ血清アルブミン（ＴＢＳ
Ａ）によって固相にカップリングさせる。本発明のさら
に好ましい態様においては、ミクロタイタープレートを
固相として各場合に使用する。この場合のプレートは例
えば８および１６ウエルストリップのような他の形態で
あってもよい。この場合には、幾つかの異なるイムノア
ッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイを同
時に行うことができる。このためには、まず被験試料を
不活性化固相として設計されたミクロタイタープレート
と、所望するならば検出または／および捕捉試薬の存在
下に、接触させ、試料をウエルに導入する。不活性化固
相との非特異的結合が起きるプレインキュベーションの
後に、各種の平行して実施する試料を遅滞無くピペッ
ト、好ましくはマルチチャンネルピペットによって、活
性固相として設計された別のミクロタイタープレートに
移す。
【００２５】マルチチャンネルピペットでピペッティン
グすると、活性固相を含むウエルへのピペッティングが
同時にできるので、よりよい試験精度が得られ、同時に
全体としての試験時間を短縮できる。本発明はさらに、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイで用いられる固相に対応するが、捕捉試薬への結合
が起こらないように修飾されたことを特徴とする、イム
ノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
に使用するための不活性固相に関する。捕捉試薬はイム
ノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
で検出すべき物質と特異的結合することのできる試薬と
して理解され、これは固相への結合能のために壁−結合
（ｗａｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ）を仲介することができ
る。
グすると、活性固相を含むウエルへのピペッティングが
同時にできるので、よりよい試験精度が得られ、同時に
全体としての試験時間を短縮できる。本発明はさらに、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイで用いられる固相に対応するが、捕捉試薬への結合
が起こらないように修飾されたことを特徴とする、イム
ノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
に使用するための不活性固相に関する。捕捉試薬はイム
ノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
で検出すべき物質と特異的結合することのできる試薬と
して理解され、これは固相への結合能のために壁−結合
（ｗａｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ）を仲介することができ
る。
【００２６】不活性固相は好ましくはプラスチック管、
ミクロタイタープレート、ガラスまたはプラスチックビ
ーズまたはラテックス粒子である。この不活性固相は、
パートナーとして互いにそれぞれ結合しうる結合ペアで
あるビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジ
ン、抗原／抗体、ハプテン／抗ハプテン抗体または断片
をもつのが好ましい。これらの結合ペアのパートナーは
例えば吸着コーティングなどの公知の方法によって不活
性固相に連結される。この場合、アビジンまたはストレ
プトアビジンが結合ペアのパートナーとして固相に結合
することが特に好ましく、ここでカップリングを熱−Ｂ
ＳＡ（ＴＢＳＡ）によるコーティングによって行うのが
特に好ましい。本発明の不活性固相はアビジンまたはス
トレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導体で飽
和することによって、アビジンまたはストレプトアビジ
ンの活性中心を共有結合的に修飾することによって（こ
こで活性中心の少なくとも１個のアミノ酸を誘導体とす
ることにより共有結合的に修飾することが特に好まし
い）、または活性中心にビオチンを共有結合的にカップ
リングすることにより不活性化することが好ましい。本
発明による不活性固相を不活性化するさらなる可能性と
しては、例えばビオチン−ＤＡＤＯＯ−ＡＢなどの光活
性化されうるビオチンを用いて活性中心にビオチンを共
有結合的にカップリングさせて次いで光活性化すること
である。ビオチンが固相上でもはや特異的に結合できな
いアビジンまたはストレプトアビジンの断片を用いて不
活性化固相を製造することは本発明の範囲内にある。最
後に、１または複数のアミノ酸を置換、欠失または挿入
などの遺伝子操作によりアビジンまたはストレプトアビ
ジンの活性中心を不活性化することは本発明の範囲内で
特に好ましい。
ミクロタイタープレート、ガラスまたはプラスチックビ
ーズまたはラテックス粒子である。この不活性固相は、
パートナーとして互いにそれぞれ結合しうる結合ペアで
あるビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジ
ン、抗原／抗体、ハプテン／抗ハプテン抗体または断片
をもつのが好ましい。これらの結合ペアのパートナーは
例えば吸着コーティングなどの公知の方法によって不活
性固相に連結される。この場合、アビジンまたはストレ
プトアビジンが結合ペアのパートナーとして固相に結合
することが特に好ましく、ここでカップリングを熱−Ｂ
ＳＡ（ＴＢＳＡ）によるコーティングによって行うのが
特に好ましい。本発明の不活性固相はアビジンまたはス
トレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導体で飽
和することによって、アビジンまたはストレプトアビジ
ンの活性中心を共有結合的に修飾することによって（こ
こで活性中心の少なくとも１個のアミノ酸を誘導体とす
ることにより共有結合的に修飾することが特に好まし
い）、または活性中心にビオチンを共有結合的にカップ
リングすることにより不活性化することが好ましい。本
発明による不活性固相を不活性化するさらなる可能性と
しては、例えばビオチン−ＤＡＤＯＯ−ＡＢなどの光活
性化されうるビオチンを用いて活性中心にビオチンを共
有結合的にカップリングさせて次いで光活性化すること
である。ビオチンが固相上でもはや特異的に結合できな
いアビジンまたはストレプトアビジンの断片を用いて不
活性化固相を製造することは本発明の範囲内にある。最
後に、１または複数のアミノ酸を置換、欠失または挿入
などの遺伝子操作によりアビジンまたはストレプトアビ
ジンの活性中心を不活性化することは本発明の範囲内で
特に好ましい。
【００２７】さらに本発明は、分析すべき試料中の非特
異的結合成分を捕捉することによってイムノアッセイま
たは核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける妨害
除去に本発明の不活性固相を用いることに関する。本発
明の方法、またはイムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイにおける本発明の不活性固相の使
用は、非特異的に結合する成分による妨害を簡単かつ費
用効率的に制御下におき、実施すべきイムノアッセイか
ら妨害を除去する。この方法では、それぞれの試験の感
受性と特異性を損なう試験結果の広範すぎるバラツキと
同様に誤った正の結果を回避できる。
異的結合成分を捕捉することによってイムノアッセイま
たは核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける妨害
除去に本発明の不活性固相を用いることに関する。本発
明の方法、またはイムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイにおける本発明の不活性固相の使
用は、非特異的に結合する成分による妨害を簡単かつ費
用効率的に制御下におき、実施すべきイムノアッセイか
ら妨害を除去する。この方法では、それぞれの試験の感
受性と特異性を損なう試験結果の広範すぎるバラツキと
同様に誤った正の結果を回避できる。
【００２８】さらに本発明は、被検試料中の物質を定性
的または／および定量的に検出するためのイムノアッセ
イまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ用試験キ
ットに関し、ここで該試験キットはイムノアッセイまた
は核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための通常の
成分、およびイムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイで用いられる活性固相と実質的に対応
するが捕捉試薬がこれとは結合しない不活性固相を含
む。試験キットは好ましくは以下の成分を含む： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）検出試薬 ｃ）活性固相、および ｄ）本発明の不活性固相。
的または／および定量的に検出するためのイムノアッセ
イまたは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ用試験キ
ットに関し、ここで該試験キットはイムノアッセイまた
は核酸ハイブリダイゼーションアッセイのための通常の
成分、およびイムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼ
ーションアッセイで用いられる活性固相と実質的に対応
するが捕捉試薬がこれとは結合しない不活性固相を含
む。試験キットは好ましくは以下の成分を含む： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）検出試薬 ｃ）活性固相、および ｄ）本発明の不活性固相。
【００２９】さらに本発明は、以下の成分を用いるイム
ノアッセイにおいて固相への非特異的結合による妨害を
防止する方法に関する： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）少なくとも２つの活性固相であって、ここで捕捉試
薬および所望するならば追加の試験成分を加える前に被
験試料を第１活性固相の存在下にインキュベートし、そ
の後被験試料をこの第１固相から分離し、捕捉試薬およ
び所望するならば追加の試験成分ならびに実質的に同じ
第２固相の存在下にインキュベーションを行い、測定す
べき物質を適当な方法で検出することを特徴とする。こ
の方法は被験試料中に存在する物質の固相への結合によ
って引き起こされる非特異的妨害とそれによる非特異的
シグナルの発生を回避できる。非特異的に結合する物質
はイムノアッセイで用いられる固相に対応する活性固相
とプレインキュベーションすることによってあらかじめ
捕捉され、この方法では固相が分離されて捕捉試薬、所
望するならば検出試薬および新しいコーティングされて
いない試験相などの成分とインキュベートするまでは実
際のイムノアッセイは行われない。捕捉試薬は第２イン
キュベーションの後に添加するので、プレインキュベー
ションの間に測定すべき物質は活性固相にまだ結合しな
い。この態様では、固相を不活性化することは必ずしも
必要ではない。以下の実施例で本発明をさらに詳しく説
明する。
ノアッセイにおいて固相への非特異的結合による妨害を
防止する方法に関する： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）少なくとも２つの活性固相であって、ここで捕捉試
薬および所望するならば追加の試験成分を加える前に被
験試料を第１活性固相の存在下にインキュベートし、そ
の後被験試料をこの第１固相から分離し、捕捉試薬およ
び所望するならば追加の試験成分ならびに実質的に同じ
第２固相の存在下にインキュベーションを行い、測定す
べき物質を適当な方法で検出することを特徴とする。こ
の方法は被験試料中に存在する物質の固相への結合によ
って引き起こされる非特異的妨害とそれによる非特異的
シグナルの発生を回避できる。非特異的に結合する物質
はイムノアッセイで用いられる固相に対応する活性固相
とプレインキュベーションすることによってあらかじめ
捕捉され、この方法では固相が分離されて捕捉試薬、所
望するならば検出試薬および新しいコーティングされて
いない試験相などの成分とインキュベートするまでは実
際のイムノアッセイは行われない。捕捉試薬は第２イン
キュベーションの後に添加するので、プレインキュベー
ションの間に測定すべき物質は活性固相にまだ結合しな
い。この態様では、固相を不活性化することは必ずしも
必要ではない。以下の実施例で本発明をさらに詳しく説
明する。
【００３０】
実施例１：ヒト血清中の抗−ＧＡＤ抗体測定のためのイ
ムノアッセイにおける比較試験法 Ａ）従来法による試験法 濃度約１μｇ／ｍｌのビオチン化グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＧＡＤ）を含む
溶液１００μｌを活性ストレプトアビジン−コーティン
グミクロタイタープレートの各ウエルに分注し、室温で
１時間インキュベートする。その後プレートを適当なバ
ッファーで３回洗浄する。ヒト血清をＥｎｚｙｍｕｎ−
Ｔｅｓｔ（登録商標）抗−ＨＩＶ１＋２からのインキュ
ベーションバッファー中に１＋２５で希釈し、その１０
０μｌをミクロタイタープレートの各ウエルに加え、室
温で１時間インキュベートする。この工程の後試料を吸
引し、ウエルを３回洗浄する。ヒトＩｇＧへの結合特異
性をもつヒツジ由来のＰＯＤ−結合検出抗体（ヒツジ−
（抗−）ヒトＰＯＤ）を約７５ｍＵ／ｍｌの濃度でＥｎ
ｚｙｍｕｎ−Ｔｅｓｔ（登録商標）抗−ＨＩＶ１＋２か
らのコンジュゲートバッファー中に希釈し、この希釈溶
液１００μｌをミクロタイタープレートの各ウエルに加
え、室温で１時間インキュベートする。液体を再度吸引
し、プレートを上述のように３回洗浄する。染料ＡＢＴ
Ｓ（登録商標）をＥｎｚｙｍｕｎ−Ｔｅｓｔ（登録商
標）基質バッファー中に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう
に溶解し、１００μｌをミクロタイタープレートの各ウ
エルに加えてインキュベートする。約３０分後にミクロ
タイタープレート光度計で吸光度を読み取る。測定波長
は４０５ｎｍであり、参照波長は４９２ｎｍである。基
質／染料溶液のみを含む未処理キュベットからブランク
を決定する。異なる８つの血清を用いたＧＡＤ測定の結
果を「プレインキュベーションなし」の欄に示す。
ムノアッセイにおける比較試験法 Ａ）従来法による試験法 濃度約１μｇ／ｍｌのビオチン化グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｇｌｕｔａｍ
ａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ＧＡＤ）を含む
溶液１００μｌを活性ストレプトアビジン−コーティン
グミクロタイタープレートの各ウエルに分注し、室温で
１時間インキュベートする。その後プレートを適当なバ
ッファーで３回洗浄する。ヒト血清をＥｎｚｙｍｕｎ−
Ｔｅｓｔ（登録商標）抗−ＨＩＶ１＋２からのインキュ
ベーションバッファー中に１＋２５で希釈し、その１０
０μｌをミクロタイタープレートの各ウエルに加え、室
温で１時間インキュベートする。この工程の後試料を吸
引し、ウエルを３回洗浄する。ヒトＩｇＧへの結合特異
性をもつヒツジ由来のＰＯＤ−結合検出抗体（ヒツジ−
（抗−）ヒトＰＯＤ）を約７５ｍＵ／ｍｌの濃度でＥｎ
ｚｙｍｕｎ−Ｔｅｓｔ（登録商標）抗−ＨＩＶ１＋２か
らのコンジュゲートバッファー中に希釈し、この希釈溶
液１００μｌをミクロタイタープレートの各ウエルに加
え、室温で１時間インキュベートする。液体を再度吸引
し、プレートを上述のように３回洗浄する。染料ＡＢＴ
Ｓ（登録商標）をＥｎｚｙｍｕｎ−Ｔｅｓｔ（登録商
標）基質バッファー中に１ｍｇ／ｍｌの濃度となるよう
に溶解し、１００μｌをミクロタイタープレートの各ウ
エルに加えてインキュベートする。約３０分後にミクロ
タイタープレート光度計で吸光度を読み取る。測定波長
は４０５ｎｍであり、参照波長は４９２ｎｍである。基
質／染料溶液のみを含む未処理キュベットからブランク
を決定する。異なる８つの血清を用いたＧＡＤ測定の結
果を「プレインキュベーションなし」の欄に示す。
【００３１】Ｂ）本発明の方法による試験法 １Ａ）に記載したようにしてビオチン化ＧＡＤ（約１μ
ｇ／ｍｌ）および血清の溶液（１：２６）を調製し、不
活性ストレプトアビジンでコーティングしたミクロタイ
タープレート中、１ウエル当たりこの溶液２５０μｌの
量で１時間インキュベートする。各ウエルから１００μ
ｌのアリコートを２つピペットで取り出し活性ストレプ
トアビジンでコーティングしたプレートの各ウエルに入
れて再び１時間インキュベートする。その後溶液をピペ
ットで除去し、バッファーで３回洗浄し、ヒツジ−（抗
−）ヒトＰＯＤとインキュベートし、１Ａ）と同様の発
色反応を行う。本発明の方法により得られた値を表１の
「インキュベーションあり」の欄に示す。
ｇ／ｍｌ）および血清の溶液（１：２６）を調製し、不
活性ストレプトアビジンでコーティングしたミクロタイ
タープレート中、１ウエル当たりこの溶液２５０μｌの
量で１時間インキュベートする。各ウエルから１００μ
ｌのアリコートを２つピペットで取り出し活性ストレプ
トアビジンでコーティングしたプレートの各ウエルに入
れて再び１時間インキュベートする。その後溶液をピペ
ットで除去し、バッファーで３回洗浄し、ヒツジ−（抗
−）ヒトＰＯＤとインキュベートし、１Ａ）と同様の発
色反応を行う。本発明の方法により得られた値を表１の
「インキュベーションあり」の欄に示す。
【００３２】これらのデータは本発明の方法において非
特異的結合が劇的に減少したことを明瞭に示す。 表１ 妨害血清 インキュベーションあり プレインキュベーションなし ７３７８−２６２ １５ ２６０ −２６９ ４５ ４６８ −２７２ ３０ １６６９ −２８９ ６９ ２２０８ ７４８０−２０３ ９７ １３４３ −２１０ ７２ １３６ ７４６３−５３１ ０ １６１３ ７４７８−２９８ １８２ １５１７
特異的結合が劇的に減少したことを明瞭に示す。 表１ 妨害血清 インキュベーションあり プレインキュベーションなし ７３７８−２６２ １５ ２６０ −２６９ ４５ ４６８ −２７２ ３０ １６６９ −２８９ ６９ ２２０８ ７４８０−２０３ ９７ １３４３ −２１０ ７２ １３６ ７４６３−５３１ ０ １６１３ ７４７８−２９８ １８２ １５１７
Claims (21)
- 【請求項１】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイによって被験試料中の測定すべき物
質を定性的または／および定量的に検出する方法であっ
て、該方法は以下の成分： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）活性固相、および ｃ）活性固相と実質的に対応するが、捕捉試薬が結合で
きない不活性固相、を使用し、被験試料をまず不活性固
相とのみ接触させてその後活性固相と接触させるか、あ
るいは活性固相と不活性固相とに同時に接触させ、この
間捕捉試薬および所望するならば追加の試験成分は最初
から存在するか、あるいは後に添加し、そして測定すべ
き物質を検出する、ことからなる上記方法。 - 【請求項２】 捕捉試薬と一緒になって測定すべき物質
の特異的検出を可能にし、かつ間接または直接の標識を
もつ検出試薬を使用し、そして測定すべき物質を、活性
固相上で、または／および試料上清中で標識を測定する
ことにより検出する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 プラスチック管、ミクロタイタープレー
ト、ガラスまたはプラスチックビーズまたはラテックス
粒子を固相として用いる、請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項４】 被験試料をまず捕捉試薬および不活性固
相とインキュベートし、次いで不活性固相を除去し、そ
の後活性固相および検出試薬をインキュベートする、請
求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 互いに特異的に結合できるビオチン／ア
ビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体、
ハプテン／抗−ハプテン抗体ペアまたはその断片を特異
的結合ペアとして用いる、請求項１〜４のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項６】 不活性固相を製造する間、アビジンまた
はストレプトアビジンをビオチンまたはビオチン誘導体
で飽和することにより不活性化する、請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 アビジンまたはストレプトアビジンを活
性中心の共有結合修飾により不活性化する、請求項５記
載の方法。 - 【請求項８】 活性中心の少なくとも１個のアミノ酸を
誘導体とするか、または共有結合修飾するために活性中
心にビオチンを共有結合的にカップリングする、請求項
７記載の方法。 - 【請求項９】 活性中心へのビオチンの共有結合的カッ
プリングを例えばビオチン−ＤＡＤＯＯ−ＡＢによって
光活性化されうるビオチンによって行う、請求項７また
は８記載の方法。 - 【請求項１０】 不活性固相を製造する間、１または複
数のアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入による遺伝
子操作によって活性中心を修飾することによってアビジ
ンまたはストレプトアビジンを不活性化する、請求項５
記載の方法。 - 【請求項１１】 測定すべき物質と特異的に結合する検
出試薬を用いる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１２】 測定すべき物質と結合部位を競合する
検出試薬を用いる、請求項１〜１０のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１３】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイに使用する不活性固相であって、
イムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイで使用する固相に対応するが、捕捉試薬への結合が
起こらないように修飾されている、上記不活性固相。 - 【請求項１４】 結合ペアのパートナーがアビジンまた
はストレプトアビジンである、請求項１３記載の不活性
固相。 - 【請求項１５】 アビジンまたはストレプトアビジンを
ビオチンまたはビオチン誘導体で飽和することにより不
活性化する、請求項１４記載の不活性固相。 - 【請求項１６】 アビジンまたはストレプトアビジンを
活性中心の共有結合修飾により不活性化する、請求項１
４記載の不活性固相。 - 【請求項１７】 活性中心の少なくとも１個のアミノ酸
を誘導体とするか、または共有結合修飾するために活性
中心にビオチンを共有結合的にカップリングする、請求
項１６記載の不活性固相。 - 【請求項１８】 活性中心へのビオチンの共有結合的カ
ップリングを例えばビオチン−ＤＡＤＯＯ−ＡＢによっ
て光活性化されうるビオチンによって行う、請求項１７
記載の不活性固相。 - 【請求項１９】 １または複数のアミノ酸残基の置換、
欠失、または挿入による遺伝子操作によってアビジンま
たはストレプトアビジンの活性中心を修飾することによ
って不活性化を行う、請求項１４記載の不活性固相。 - 【請求項２０】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイの成分ならびに請求項１３〜１９
のいずれかに記載の不活性固相を含む、被検試料中の測
定すべき物質を定性的または／および定量的に検出する
ためのイムノアッセイまたは核酸ハイブリダイゼーショ
ンアッセイのための試験キット。 - 【請求項２１】 イムノアッセイまたは核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイにおいて固相への非特異的結合に
よる妨害を回避する方法であって、該方法は以下の成
分： ａ）２つの異なる結合部位という手段によって試料中の
測定すべき物質を、１）所望するならば追加の試験成分
とともに特異的に検出することを可能とする捕捉試薬で
あって、該試薬は２）活性固相に特異的結合ペアを介し
て結合されているかまたは結合することができ、該結合
ペアの第１パートナーは捕捉試薬に連結し、第２パート
ナーは活性固相にカップリングする該試薬、 ｂ）少なくとも２つの活性固相、を使用し、ここで捕捉
試薬および所望するならば追加の試験成分を加える前に
被験試料を第１活性固相の存在下にインキュベートし、
その後被験試料をこの第１固相から分離し、次いで捕捉
試薬および所望するならば追加の試験成分ならびに第２
の実質的に同じ固相の存在下にインキュベーションを行
い、測定すべき物質を適当な方法で検出する、ことから
なる上記方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4434093:1 | 1994-09-23 | ||
| DE4434093A DE4434093A1 (de) | 1994-09-23 | 1994-09-23 | Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08114590A true JPH08114590A (ja) | 1996-05-07 |
| JP2902581B2 JP2902581B2 (ja) | 1999-06-07 |
Family
ID=6529055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7246505A Expired - Lifetime JP2902581B2 (ja) | 1994-09-23 | 1995-09-25 | 測定すべき物質の定性的または／および定量的検出法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5935780A (ja) |
| EP (1) | EP0703452B1 (ja) |
| JP (1) | JP2902581B2 (ja) |
| DE (2) | DE4434093A1 (ja) |
| ES (1) | ES2199233T3 (ja) |
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| WO2003075013A1 (fr) * | 2002-03-04 | 2003-09-12 | The New Industry Research Organization | Methode destinee a mesurer l'activite d'une proteine de liaison a l'adn |
| WO2010101157A1 (ja) | 2009-03-02 | 2010-09-10 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する方法 |
| WO2010114031A1 (ja) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する方法 |
| WO2013018836A1 (ja) * | 2011-08-01 | 2013-02-07 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する工程において、非特異的結合を抑制する方法、当該方法に使用するための剤 |
| JP2018004371A (ja) * | 2016-06-30 | 2018-01-11 | シスメックス株式会社 | 免疫複合体転移法により被検物質を検出するための抗体試薬及びその製造方法、並びにその抗体試薬の利用 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19637718A1 (de) | 1996-04-01 | 1997-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten |
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| CN114910634A (zh) * | 2017-10-26 | 2022-08-16 | 科美诊断技术股份有限公司 | 一种无基质效应的均相免疫检测试剂盒及其分析方法和应用 |
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