ES2199233T3 - Procedimiento para la deteccion cualitativa y cuantitativa de una sustancia que se ha de determinar. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion cualitativa y cuantitativa de una sustancia que se ha de determinar.Info
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Abstract
PARA LA COMPARACION CUALITATIVA Y/O CUANTITATIVA DE UNA SUSTANCIA A SER DETERMINADA EN UNA MUESTRA DE PRUEBA CON LA AYUDA DE UNA DISPOSICION DE HIBRIDIZACION EN APLICACION INMUNE O DE ACIDO NUCLEICO SE UTILIZAN LOS SIGUIENTES COMPONENTES: A) UN REACTIVO COLECTOR QUE POR MEDIO DE DOS LUGARES 1) DE UNION DIFERENTES PERMITEN QUE LA SUSTANCIA A SER DETERMINADA SE SOMETA A UNA COMPROBACION ESPECIFICA EVENTUALMENTE DE FORMA CONJUNTA CON OTROS COMPONENTES DE PRUEBA Y A TRAVES DE UN PAR DE ENLACES ESPECIFICOS, QUE ESTAN UNIDOS CON UN PARTNER EN EL REACTIVO COLECTOR Y CUYO SEGUNDO PARTNER SE ACOPLA A UNA FASE ACTIVA, TIENEN CAPACIDAD DE ENLACE O ESTAN LIGADOS A UNA FASE SOLIDA ACTIVA, B) UNA FASE SOLIDA ACTIVA Y C) UNA FASE SOLIDA INACTIVA QUE CORRESPONDE AMPLIAMENTE A LA FASE SOLIDA ACTIVA, EN EL QUE NO PUEDEN SER LIGADOS LOS REACTIVOS COLECTORES. CON ELLO LA MUESTRA DE PRUEBA SE APLICA O BIEN PRIMERO EN LA FASE SOLIDA INACTIVADA DE MANERA AISLADA O MAS TARDE CON LA FASE SOLIDA ACTIVADA O AL MISMOTIEMPO CON FASE SOLIDA ACTIVADA E INACTIVADA EN CONTACTO, DONDE EL REACTIVO COLECTOR Y EVENTUALMENTE OTRO COMPONENTE DE PRUEBA SE AÑADEN O BIEN EN EL PRINCIPIO O ESTAN PRESENTES MAS TARDE, CONSIGUIENDOSE UNA COMPROBACION DE LA SUSTANCIA A SER DETERMINADA.
Description
Procedimiento para la detección cualitativa y
cuantitativa de una sustancia que se ha de determinar.
El presente invento se refiere a un procedimiento
para la detección cualitativa o/y cuantitativa de una sustancia que
se ha de determinar en una muestra de ensayo con ayuda de un ensayo
inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos, a una fase
sólida desactivada para su utilización en tal ensayo, así como a la
utilización de esta fase sólida desactivada para la eliminación de
interferencias en ensayos inmunológicos o de hibridación de ácidos
nucleicos mediante captura de componentes que se fijan de manera
inespecífica en una muestra de ensayo que se ha de analizar.
Finalmente el invento se refiere también todavía a un estuche de
ensayo, que contiene los componentes usuales de un ensayo
inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos, así como una
fase sólida desactivada de acuerdo con el invento.
Los ensayos inmunológicos y de hibridación de
ácidos nucleicos sirven hoy en día para la detección rápida y
sencilla de sustancias, p. ej. en el sector del diagnóstico. Con
ellos se puede detectar la presencia de sustancias propias del
cuerpo o ajenas al cuerpo en muestras biológicas de una manera
rápida y fiable. Los ensayos inmunológicos y de hibridación de
ácidos nucleicos están basados en el principio de que una sustancia
que se ha de detectar es fijada de una manera específica con otra
sustancia, realizándose que, en el caso de una realización
apropiada del ensayo se puede detectar la presencia de la sustancia
que se ha de determinar por medio de esta otra sustancia. La
capacidad de fijación específica de la sustancia que se ha de
detectar con una o varias otras sustancias se aprovecha, por lo
tanto, para hacer posible la detección. En este caso, pueden
aparecer no obstante también reacciones secundarias, tales como
interacciones indeseadas y reacciones de fijación inespecíficas. En
particular en el caso de utilizarse una fase sólida, junto a la que
están inmovilizadas o se pueden inmovilizar las sustancias que se
fijan específicamente, se presenta el problema de que
frecuentemente están contenidas en la muestra de ensayo sustancias
adicionales, que se fijan asimismo a esta fase sólida y que provocan
en tal caso señales falsamente positivas. En este caso puede
aumentarse la señal de fondo, al igual que puede efectuarse una
dispersión más fuerte de las señales, y la consecuencia de ello
pueden ser por consiguiente una sensibilidad y una especificidad
disminuidas del correspondiente ensayo.
El documento de patente francesa
FR-A-2.410.278 divulga, por ejemplo,
un ensayo inmunológico heterogéneo, que implica la utilización de
dos fases sólidas para disminuir la influencia de componentes que
se fijan de manera inespecífica. A la primera fase sólida se acopla
un antígeno específico para el anticuerpo que se ha de determinar.
La segunda fase sirve para la fijación de otras proteínas, no
conteniendo esta fase sólida ningún antígeno específico para el
anticuerpo que se ha de determinar.
El documento de solicitud de patente europea
EP-A-0.331.127 describe la fijación
de un reactivo de captura a una fase sólida a través de un par de
fijación específica, que se compone p. ej. de polímeros que se
fijan uno a otro de una manera específica.
En el documento
EP-A-0.265.244 se describe una
incubación secuencial de fases sólidas en un ensayo. Se divulga la
adición consecutiva de dos tipos de partículas, que han sido
marcadas con ácidos nucleicos, que son específicos para diferentes
reactivos de captura.
Para impedir interacciones con factores no
específicos se propone en la solicitud de patente europea EP
0.163.312 añadir a los reactivos del sistema de ensayo inmunológico
partículas ultrafinas que tienen un tamaño medio máximo de 0,2
\mum, las cuales están estructuradas de tal manera que son capaces
de fijar a la sustancia que provoca la fijación inespecífica y de
capturar a ésta. Para ello, se requiere no obstante una preparación
previa especial de estas partículas ultrafinas, y también tienen
que conocerse los factores inespecíficos que están realmente
presentes en la muestra.
Sin embargo, sería ventajoso tener a disposición
un método para eliminar de manera totalmente general perturbaciones
en ensayos inmunológicos o de hibridación de ácidos nucleicos,
incluso sin tener conocimiento de las sustancias perturbadoras que
están realmente presentes. Por lo tanto la misión del presente
invento fue la de poner a disposición un procedimiento
correspondiente. El problema planteado por esta misión se resuelve
de acuerdo con el invento mediante un procedimiento para la
detección cualitativa o/y cuantitativa de una sustancia que se ha
de determinar en una muestra de ensayo con ayuda de un ensayo
inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos, en el que se
emplean los siguientes componentes:
- a)
- un reactivo de captura, que por medio de dos sitios de fijación diferentes, 1) eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar y 2) está fijado o es capaz de fijarse a una fase sólida activa a través de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura, y cuyo segundo partícipe está acoplado a una fase sólida activa,
- b)
- una fase sólida activa, a la que está acoplado el segundo partícipe del par de fijación específica,
- c)
- una fase sólida inactiva, que se corresponde con la fase sólida activa, pero que está modificada no obstante de tal manera que el reactivo de captura no se pueda fijar a ella,
\newpage
siendo la muestra de ensayo puesta en contacto o
bien primeramente con la fase sólida desactivada a solas, y
solamente más tarde con la fase sólida activa, o simultáneamente
con la fase sólida activa y con la inactiva, pudiendo estar
presentes desde el principio, o pudiendo añadirse más tarde, el
reactivo de captura y eventualmente otros componentes del sistema
de ensayo, y efectuándose una detección de la sustancia que se ha
de
determinar.
El reactivo de captura de acuerdo con el invento
está estructurado de tal manera que tiene dos sitios de fijación.
Por medio de un tipo de sitio de fijación, éste se puede acoplar a
un partícipe de un par de fijación específica. También es posible
el acoplamiento a varios partícipes de pares de fijación. Además, el
reactivo de captura de acuerdo con el invento tiene otro tipo de
sitio de fijación, que hace posible una detección específica de la
sustancia que se ha de determinar. De manera preferida, estos
sitios de fijación son capaces de fijarse específicamente con la
sustancia que se ha de determinar o con un complejo a base de la
sustancia que se ha de determinar y de otros componentes del
sistema de ensayo. Un reactivo de captura puede tener también varios
sitios de fijación de este tipo, por ejemplo, los anticuerpos
tienen dos epítopos con sitios de fijación específica.
En el procedimiento de acuerdo con el invento se
emplean como reactivo de captura preferiblemente las sustancias que
son capaces de fijarse específicamente con la sustancia que se ha
de determinar. Si en el caso de la sustancia que se ha de
determinar se trata de un anticuerpo, se utilizará como reactivo de
captura o bien un correspondiente antígeno, un hapteno, o sino un
segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo que se ha de
determinar, o un fragmento de éste. Por el contrario, si en el caso
de la sustancia que se ha de determinar se trata de un antígeno, se
utilizará como reactivo de captura un anticuerpo o un fragmento de
anticuerpo. Si en el caso de la sustancia que se ha de determinar
se trata de un ácido nucleico, se utilizará como reactivo de
captura un oligómero o polímero de ácido nucleico o un compuesto
análogo a ácido nucleico. Preferiblemente, en este caso se
utilizará como compuesto análogo a ácido nucleico un ácido nucleico
peptídico.
El reactivo de captura está estructurado en este
caso de tal manera que pueda ser fijado a una fase sólida a través
de un par de fijación específica con un sitio de la molécula que no
interfiere con la fijación de la sustancia que se ha de determinar,
o que se presente ya fijado a la fase sólida. Esta fijación puede
efectuarse por una parte directamente a través del par de fijación
específica. El acoplamiento del reactivo de captura a la fase
sólida puede llevarse a cabo, no obstante, también a través de un
sistema de fijación, que se compone de más de dos componentes que
son capaces de fijarse uno con otro. Fundamentalmente, un partícipe
del par de fijación específica está unido con el reactivo de
captura y un segundo partícipe del par de fijación específica está
acoplado a la fase sólida. Este acoplamiento puede efectuarse de
nuevo según todos los métodos habituales para un experto en la
materia, y el acoplamiento del reactivo de captura con la fase
sólida a través del par de fijación específica se puede efectuar
antes de la realización del ensayo inmunológico o sino también
durante el ensayo inmunológico, añadiéndose el reactivo de captura
a los otros componentes del ensayo inmunológico tan sólo en un
momento posterior.
En una forma de realización preferida del
invento, se utilizan como par de fijación específica pares de
biotina y avidina, biotina y estreptavidina, un antígeno y un
anticuerpo, un hapteno y un anticuerpo o fragmentos de éstos que
son capaces de fijarse específicamente entre sí. En una forma de
realización del invento especialmente preferida se utiliza como par
de fijación específica el de biotina y avidina o el de biotina y
estreptavidina.
La detección de la sustancia que se ha de
determinar se efectúa de acuerdo con el invento preferiblemente a
través de un reactivo de detección, que en común con reactivo de
captura hace posible una detección específica de la sustancia que
se ha de determinar y que lleva una marcación indirecta o directa.
Con reactivos de detección marcados directamente la detección se
efectúa mediante el recurso de que el reactivo de detección o bien
se fija directamente a la sustancia que se ha de determinar y se
forma un complejo en emparedado que lleva la marcación, o bien se
fija al reactivo de captura de una manera competitiva con respecto
a la sustancia que se ha de determinar y se forma un complejo del
reactivo de detección con el reactivo de captura, que lleva la
marcación. Los reactivos de detección con marcación indirecta
abarcan varios componentes, estando sin marcar el componente que se
fija a la sustancia que se ha de determinar o al reactivo de
captura, y siendo este componente capaz de fijarse con otro
componente, que lleva la marcación.
Marcaciones apropiadas son conocidas para un
experto en la materia. Para esto se prefieren marcaciones
radiactivas, marcadores quimioluminiscentes, fluorescentes o
electro-quimioluminiscentes, partículas coloreadas.
tales como p. ej. partículas de un sol metálico, o un látex
coloreado o no coloreado. La marcación puede proporcionar también
una señal indirecta, tal como, por ejemplo, en el caso de
marcaciones enzimáticas con enzimas tales como una peroxidasa,
\beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina. La
determinación de la marcación puede efectuarse de acuerdo con el
invento de manera preferida en la fase sólida activa o/y en el
material sobrenadante de la muestra.
Para la detección de la sustancia que se ha de
determinar se pueden utilizar de acuerdo con el invento todos los
procedimientos de detección conocidos. La detección puede llevarse
a cabo, por ejemplo, como un denominado procedimiento de
desalojamiento o como un procedimiento en emparedado. En el caso del
procedimiento de desalojamiento, preferido de acuerdo con el
invento, se emplea un reactivo de detección marcado, que tiene un
sitio de fijación igual o similar al que tiene la sustancia que se
ha de determinar y, por consiguiente, compite con la sustancia que
se ha de determinar. Si en el caso de la sustancia que se ha de
determinar se trata, por ejemplo, de un anticuerpo, para la
detección de este anticuerpo en el procedimiento de desalojamiento
se añadirán, como reactivo de captura, un antígeno correspondiente
y un anticuerpo marcado, teniendo el anticuerpo marcado una
especificidad de fijación igual o semejante a la que tiene el
anticuerpo que se ha de determinar. El antígeno puede estar fijado a
la fase sólida activa directamente a través de un par de fijación
específica, uno de cuyos partícipes está unido con el antígeno y
cuyo segundo partícipe está acoplado a la fase sólida activa, o es
capaz de fijarse con ésta. El antígeno puede ser inmovilizado junto
a la fase sólida o puede estar inmovilizado junto a ésta también
indirectamente a través de un segundo anticuerpo que es capaz de
fijarse con la fase sólida o que está fijado a ésta. Este segundo
anticuerpo puede tener, al igual que el anticuerpo marcado, una
especificidad igual o semejante a la del anticuerpo que se ha de
determinar. El anticuerpo de la muestra compite con el anticuerpo
marcado y eventualmente con el segundo anticuerpo en cuanto a la
fijación al antígeno.
Si en el caso de la sustancia que se ha de
determinar se trate un antígeno, se utilizará para la detección
mediante el procedimiento de desalojamiento preferiblemente un
análogo antígeno que se ha de determinar que compite
inmunológicamente con él. Por ejemplo, en este caso se trata del
mismo antígeno o/y de un antígeno con una similar especificidad
para fijación. En el caso de que se trate de un ácido nucleico,
como reactivo de detección se utilizará preferiblemente un oligómero
o polímero de ácido nucleico o un compuesto análogo a ácido
nucleico y, de manera especialmente preferida, un ácido nucleico
peptídico (APN).
De manera especialmente preferida de acuerdo con
el invento, la detección de la sustancia que se ha de determinar se
llevará a cabo mediante el procedimiento en emparedado. El reactivo
de detección es en este caso capaz de fijarse específicamente con
la sustancia que se ha de determinar. Si en el caso de la sustancia
que se ha de determinar se trata de nuevo de un anticuerpo, como
reactivo de detección se puede utilizar o bien un antígeno, un
hapteno o bien un segundo anticuerpo o un fragmento de anticuerpo
dirigido contra el primer anticuerpo. Si en el caso de la sustancia
que se ha de determinar se trate, por el contrario, de un antígeno,
se utilizará un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo como
reactivo de detección, que se fija a un epítopo del antígeno que es
diferente al del reactivo de captura. Si en el caso de la sustancia
que se ha de determinar se trata de un ácido nucleico tal como, por
ejemplo, un oligonucleótido o de un segmento de ADN o ARN, como
reactivo de captura se utilizará de manera más apropiada un
oligómero o polímero de ácido nucleico o una estructura análoga que
tiene una zona de la secuencia que es complementaria con respecto a
la sustancia que se ha de determinar.
Como compuestos análogos a ácidos nucleicos se
pueden utilizar estructuras que tienen nucleobases modificadas,
azúcares o/y enlaces internucleotídicos. Compuestos análogos a
nucleótidos especialmente bien apropiados son los ácidos nucleicos
peptídicos también denominados APN. Generalmente, los reactivos de
captura y detección que son apropiados para tales ensayos
inmunológicos y de hibridación de ácidos nucleicos y en particular
para "ensayos en emparedado" son conocidos para un experto en
la materia y no tienen que ser ilustrados aquí.
En el procedimiento de detección en emparedado,
preferido de acuerdo con el invento, se forma, por lo tanto, un
complejo a base de una sustancia que se ha de determinar, de un
reactivo de captura, que media en la fijación a una fase sólida, y
de un reactivo de detección que lleva una marcación y por
consiguiente hace posible la detección de la presencia de la
sustancia que se ha de determinar. El orden de sucesión de las
adiciones de los componentes individuales del sistema de ensayo no
es crítico para la realización de este ensayo.
Junto al reactivo de captura y eventualmente al
reactivo de detección se utiliza una fase sólida activa para el
procedimiento de acuerdo con el invento. Esta fase sólida activa o
bien contiene el reactivo de captura ya en una forma fijada, o está
estructurada de tal manera que el reactivo de captura se pueda
fijar a la fase sólida. La expresión de fase sólida "activa" ha
de poner de manifiesto que esta fase sólida hace posible, a través
del reactivo de captura, la detección de la sustancia que se ha de
determinar. De manera preferida, a través del reactivo de captura
se hace posible la fijación del reactivo de detección a la fase
sólida activa, con lo que puede efectuarse una separación de
componentes no fijados y se puede llevar a cabo la detección de la
sustancia que se ha de determinar. En el procedimiento de acuerdo
con el invento se utiliza, no obstante, al contrario que en los
ensayos inmunológicos y de hibridación de ácidos nucleicos
conocidos hasta ahora, todavía otra fase sólida inactiva, que
ciertamente se correspondiente ampliamente con la fase sólida
activa, pero está modificada de tal manera que el reactivo de
captura no se pueda fijar a ella. En esta fase sólida inactiva
pueden tener lugar, sin embargo, fijaciones inespecíficas, que no
son mediadas por el reactivo de captura o por su fijación
específica a la fase sólida. La utilización de esta fase sólida
inactiva, que puede ser incubada previamente o bien con la muestra
de ensayo a solas, pero que sin embargo se puede emplear también en
combinación con uno o varios de los otros componentes del sistema
de ensayo inmunológico, o finalmente con todos ellos, hace posible
capturar fijaciones inespecíficas y evitar, por consiguiente, que
en la fase sólida activa tenga lugar a través de fijaciones
inespecíficas una formación de puente de índole arbitraria, de tal
manera que se fije a la fase sólida un reactivo de detección y se
genera así una señal falsamente positiva.
Preferiblemente, la muestra de ensayo se incuba
primeramente con la fase sólida inactiva a solas. En este caso
pueden reaccionar todas las sustancias inespecíficas que son
capaces de fijarse con la fase sólida, después de lo cual la
muestra de ensayo se separa con respecto de la fase sólida inactiva,
y luego se incuba con la fase sólida activa y con los otros
componentes, tales como el reactivo de captura y eventualmente el
reactivo de detección y demás componentes del sistema de ensayo, en
un orden de sucesión arbitrario o en combinación, y finalmente la
detección de la sustancia que se ha de determinar se puede llevar a
cabo a través de la señal de marcación.
En otra forma preferida de realización la fase
sólida inactiva y la activa se ponen en contacto simultáneamente
con la muestra de ensayo y, eventualmente, también con los otros
componentes del ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos
nucleicos, lo cual reduce sin embargo por lo menos considerablemente
las señales de fondo y perturbadoras asimismo por fijación de
sustancias inespecíficas también a la fase sólida inactiva.
Como fases sólidas se pueden emplear en el marco
del invento todas las fases sólidas que son utilizables para
ensayos inmunológicos. Preferiblemente, como fase sólida se
utilizan tubitos de material plástico, placas de microtitulación,
perlas de vidrio o de material plástico o partículas de látex. No
obstante, también es posible la utilización de tiras de ensayo a
base de papel o un material plástico.
La desactivación de la fase sólida se puede
efectuar de diferentes maneras. En este caso tiene que estar
asegurado que no pueda tener lugar la fijación específica del
reactivo de captura a la fase sólida. En una forma de realización
especialmente preferida del invento, en la que se utiliza como par
de fijación específica el de biotina y estreptavidina o el de
biotina y avidina, y de éstas la avidina y la estreptavidina
respectivamente se presentan fijadas a la fase sólida, en la
producción de la fase sólida inactiva se establece una
desactivación de la avidina o estreptavidina mediante saturación con
biotina o con un derivado de biotina. Por lo demás, la
desactivación de la avidina o de la estreptavidina, que están
fijadas a la fase sólida o que deben de fijarse a ésta, se puede
efectuar preferiblemente mediante modificación covalente del centro
activo. Tal modificación covalente se establece preferiblemente
mediante una derivatización de por lo menos un aminoácido del
centro activo o mediante un acoplamiento covalente de biotina con
el centro activo. El acoplamiento covalente se puede efectuar en
este caso acoplando una biotina fotoactivable, tal como, por
ejemplo, el complejo de
biotina-DADOO-AB, a la avidina o
estreptavidina.
Sin embargo - y esto se prefiere igualmente de
manera especial en el marco del invento - también una avidina o
estreptavidina preparada mediante tecnología genética se puede
utilizar para la preparación de la fase sólida inactiva, en la que
se impide la fijación de biotina mediante una modificación por
tecnología genética del centro activo, tal como una sustitución,
deleción o inserción de aminoácidos individuales o de varios
aminoácidos.
También aparece como posible la utilización de
fragmentos de avidina o estreptavidina, siempre y cuando que la
fase sólida acoplada a éstos pueda capturar todavía una cantidad
suficiente de fijación inespecífica. Esto se puede comprobar
mediante sencillos ensayos previos.
Como muestra de ensayo se pueden emplear
generalmente muestras acuosas, encontrando utilización en el
diagnóstico líquidos corporales y en particular sangre, plasma
sanguíneo, suero, saliva, líquidos de tejidos, tales como, por
ejemplo, el líquido de un tejido obtenido a través de la piel por
medio de parches cutáneos, el líquido cefalorraquídeo u orina. De
manera preferida, la muestra de ensayo es uno de estos líquidos
corporales.
En el procedimiento de acuerdo con el invento, en
el caso de la sustancia que se ha de determinar se trate de un
antígeno, se prefiere utilizar como reactivo de captura y
eventualmente de detección, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Para el caso inverso, de que en el caso de la sustancia que se ha
de determinar se trate de un anticuerpo, como reactivo de captura
o/y detección se utilizan antígenos o/y haptenos, pudiendo uno de
los dos reactivos ser un antígeno o/y un hapteno y siendo el otro
reactivo un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo que se
ha de determinar. Si en el caso de que la sustancia que se ha de
determinar se trata de un ácido nucleico tal como, por ejemplo, un
oligonucleótido o un segmento de ADN o ARN, se utilizará como
reactivo de captura de manera apropiada un oligómero o polímero de
ácido nucleico o un compuesto análogo a ácido nucleico, y de manera
especialmente preferida un ácido nucleico peptídico.
El procedimiento de acuerdo con el invento se
puede llevar a cabo de tal manera que todos los componentes,
también la fase sólida, sean introducidos primeramente en el
recipiente de reacción. En este caso, se prefiere utilizar como
fases sólidas perlas de vidrio o de material plástico modificadas
correspondientemente. No obstante, el ensayo inmunológico se puede
llevar a cabo también de tal manera que se utilice el recipiente de
reacción como una de las dos fases sólidas y que como la otra de
las dos fases sólidas se utilicen perlas de vidrio o de material
plástico. También se pueden utilizar fases sólidas en forma de una
tira de ensayo, estando estructuradas las dos fases sólidas en
forma de tiras de ensayo o constituyendo el recipiente de reacción
de nuevo una de las dos fases sólidas.
El acoplamiento de estreptavidina o avidina como
un partícipe de un sistema de fijación específica a la fase sólida,
se efectúa en una forma de realización del invento especialmente
preferida por medio de albúmina de suero bovino de tipo térmico
(TRSA).
En otra forma de realización preferida del
invento se utilizan como fases sólidas en cada caso placas de
microtitulación. El concepto de "placa" se presenta aquí
también representando a otras conformaciones, p. ej. tiras de a 8 o
de a 16. En este caso, se pueden llevar a cabo paralelamente varios
diferentes ensayos inmunológicos o de hibridación de ácidos
nucleicos. Primeramente, en este caso la muestra de ensayo se pone
en contacto, eventualmente en presencia del reactivo de detección
o/y del reactivo de captura, con una placa de microtitulación
estructurada como fase sólida desactivada, introduciéndose las
muestras en los pocillos. Después de un período de tiempo de
incubación previa, en el que pueden efectuarse fijaciones
inespecíficas con la fase sólida desactivada, se transfieren
entonces por medio de una pipeta, preferiblemente de una pipeta de
múltiples canales, las diferentes muestras paralelas sin retraso
cronológico a la placa de microtitulación, la cual está estructurada
como fase sólida activa.
El pipeteo con la pipeta de múltiples canales
tiene la ventaja de que la introducción por pipeteo en los pocillos
que contienen la fase sólida activa por medio de la pipeta se
efectúa simultáneamente y con ello se puede conseguir una precisión
aumentada del sistema de ensayo, que va acompañada de manera
eventual al mismo tiempo por una duración en total más corta del
ensayo.
Otro objeto más del presente invento es una fase
sólida inactiva destinada a su utilización en ensayos inmunológicos
o de hibridación de ácidos nucleicos, que está caracterizada porque
ella se corresponde con una fase sólida que se ha de utilizar en un
ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos, estando
modificada ella, no obstante, de tal manera que no pueda tener lugar
ninguna fijación con el reactivo de captura. Por el concepto de
"reactivo de captura" se entiende en este caso, de nuevo, un
reactivo capaz de fijarse específicamente con una sustancia que se
ha de detectar en un ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos
nucleicos, que puede mediar en una fijación a una pared debido a su
capacidad de fijarse con una fase sólida.
Preferiblemente, la fase sólida desactivada es un
tubito de material plástico, una placa de microtitulación, perlas
de vidrio o de plástico o partículas de látex.
La fase sólida desactivada tiene en este caso
preferiblemente como partícipe uno de los pares de fijación de
biotina y estreptavidina, de biotina y avidina, de un antígeno y un
anticuerpo, de un hapteno y un anticuerpo
anti-hapteno o fragmentos que son capaces de
fijarse en cada caso unos a otros. Estos partícipes de un par de
fijación están unidos en este caso con la fase sólida desactivada
según métodos en sí conocidos, tal como, por ejemplo, mediante
revestimiento por adsorción. En este caso, se prefiere especialmente
que esté fijada a la fase sólida avidina o estreptavidina como
partícipe del par de fijación, teniendo lugar el acoplamiento de
manera especialmente preferida por revestimiento mediante
termo-RSA (TRSA). La desactivación de la fase sólida
inactiva de acuerdo con el invento se efectúa preferiblemente
mediante saturación de avidina o estreptavidina con biotina o un
derivado de biotina, mediante modificación covalente del centro
activo de avidina o estreptavidina, efectuándose la modificación
covalente de manera especialmente preferida a través de una
derivatización de por lo menos un aminoácido del centro activo o de
un acoplamiento covalente de biotina con el centro activo. Como otra
posibilidad para la desactivación de la fase sólida inactiva de
acuerdo con el invento está a disposición el acoplamiento covalente
de biotina con el centro activo por medio de una biotina
fotoactivable, por ejemplo el complejo de
biotina-DADOO-AB y una subsiguiente
fotoactivación. También es posible en el marco del invento la
utilización de los fragmentos de avidina o estreptavidina, a los
que ya no puede tener lugar ninguna fijación específica de biotina,
junto a la fase sólida, y la preparación de esta manera de una fase
sólida desactivada. Finalmente, se prefiere especialmente en el
marco del invento llevar a cabo la desactivación del centro activo
de la avidina o de la estreptavidina mediante una modificación por
tecnología genética, tal como una sustitución, deleción o inserción
de radicales individuales de aminoácidos o de varios radicales de
aminoácidos.
Otro objeto del presente invento es la
utilización de una fase sólida inactiva de acuerdo con el invento
para la eliminación de perturbaciones de ensayos inmunológicos o de
hibridación de ácidos nucleicos mediante captura de componentes que
se fijan inespecíficamente en una muestra que se ha de analizar. El
procedimiento de acuerdo con el invento, y respectivamente la
utilización de acuerdo con el invento de la fase sólida desactivada
en un ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos
permite, de una manera sencilla y barata capturar perturbaciones
debidas a componentes que se fijan inespecíficamente y llevar a
cabo después de ello un ensayo inmunológico sin perturbaciones. De
esta manera se impiden en este caso tanto los resultados falsamente
positivos, como una dispersión demasiado amplia de los resultados
del ensayo, que perjudica igualmente a la sensibilidad y la
especificidad del correspondiente ensayo.
Es objeto del presente invento además un estuche
de ensayo para ensayos inmunológicos o de hibridación de ácidos
nucleicos para la detección cualitativa o/y cuantitativa de una
sustancia en una muestra de ensayo, conteniendo el estuche de
ensayo los componentes usuales para un ensayo inmunológico o de
hibridación de ácidos nucleicos y una fase sólida desactivada, que
se corresponde ampliamente con una fase sólida utilizada en un
ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos, pero a la
que no se puede fijar el reactivo de captura. De manera preferida,
el estuche de ensayo contiene los siguientes componentes:
a) un reactivo de captura que, por medio de dos
sitios de fijación diferentes,
- 1)
- eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo, hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar, y
- 2)
- por medio de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura y cuyo segundo partícipe está acoplado a una fase sólida activa, está fijado a una fase sólida activa o es capaz de fijarse con ésta,
b) un reactivo de detección,
c) una fase sólida activa y
d) una fase sólida desactivada de acuerdo con el
invento.
Un objeto más del presente invento es un
procedimiento para impedir la perturbación debida a fijaciones
inespecíficas a la fase sólida en un ensayo inmunológico mediando
empleo de los siguientes componentes
\newpage
a) un reactivo de captura que, por medio de dos
sitios de fijación diferentes,
- 1)
- eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo, hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar, y
- 2)
- por medio de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura y cuyo segundo partícipe está acoplado a una fase sólida activa, está fijado a una fase sólida activa o es capaz de fijarse con ésta,
b) por lo menos dos fases sólidas activas, que
están caracterizadas porque antes de la adición del reactivo de
captura y eventualmente de otros componentes del sistema de ensayo,
se efectúa una incubación de la muestra de ensayo en presencia de
una primera fase sólida activa, y después de ello se separa la
muestra de ensayo con respecto de esta primera fase sólida activa, y
luego se efectúa una incubación en presencia del reactivo de
captura y eventualmente de otros componentes del sistema de ensayo
y de una segunda fase sólida que es ampliamente idéntica, y se
detecta de una manera apropiada la sustancia que se ha de
determinar. También este procedimiento hace posible evitar
perturbaciones inespecíficas mediante fijación a la fase sólida de
sustancias contenidas en la muestra de ensayo y, por consiguiente,
la generación de una señal inespecífica. Mediante la incubación
previa con una fase sólida activa, que se corresponde con la fase
sólida utilizada en el ensayo inmunológico, se eliminan previamente
mediante captura las sustancias que se fijan inespecíficamente,
después de lo cual tan sólo después de una separación de la fase
sólida y de una subsiguiente incubación con los componentes,
reactivo de captura, eventualmente reactivo de detección y una
nueva fase sólida no cargada ni cubierta se lleva a cabo el ensayo
inmunológico propiamente dicho. Una fijación de la sustancia que se
ha de determinar a la fase sólida activa no puede efectuarse
todavía durante la incubación previa, puesto que el reactivo de
captura es añadido tan sólo en la subsiguiente segunda incubación.
Una desactivación de la fase sólida no es indispensablemente
necesaria en esta forma de realización.
El siguiente Ejemplo ha de ilustrar más aún el
invento:
100 \mul de una solución que se compone de
glutamato descarboxilasa (GAD) biotinilada en una concentración de
aproximadamente 1 \mug/ml se pipetean en cada caso en un
respectivo pocillo de una placa de microtitulación revestida con
estreptavidina y se incuba durante una hora a la temperatura
ambiente. Después de esto, la placa se lava tres veces con un
tampón apropiado. Un suero humano se diluye a 1+25 en un tampón de
incubación procedente del sistema de ensayo Enzymun®
anti-HIV 1+2, del que se pipetean, a su vez 100
\mul en los respectivos pocillos de la placa de microtitulación y
se incuba durante una hora a la temperatura ambiente. También
después de esta etapa se filtran con succión las muestras y se
lavan tres veces los pocillos. El anticuerpo de detección de oveja,
que está acoplado a POD, con especificidad de fijación para IgG de
ser humano (POD (anti)-humano de oveja) se diluye
en un tampón de conjugado procedente del sistema de ensayo Enzymun®
anti-HIV 1+2, hasta una concentración de
aproximadamente 75 mU/ml, y a cada pocillo de la placa de
microtitulación se le añaden 100 \mul de esta solución diluida y
se incuba durante una hora a temperatura ambiente. De nuevo, el
líquido se filtra con succión y la placa se lava tres veces tal
como se ha descrito anteriormente. El colorante ABTS® se disuelve
hasta una concentración de 1 mg/ml en el tampón de substrato del
sistema de ensayo Enzymun® y se introducen por pipeteo 100 \mul
por cada pocillo de la placa de microtitulación, y se incuba.
Después de aproximadamente 30 min., se determina la extinción en un
fotómetro para placas de microtitulación. La longitud de onda de
medición es de 405 nm y la longitud de onda de referencia es de 492
nm. El valor en vacío se determina en dos cubetas no tratadas, que
sólo contienen una solución del substrato y del colorante. Los
resultados para la determinación de GAD con ocho sueros diferentes
son mostrados en la Tabla 1 en la columna "sin incubación
previa".
Se prepara una solución a base de GAD biotinilada
(aproximadamente 1 \mug/ml) y de suero (1:26) en un tampón
apropiado, tal como se ha descrito en el párrafo 1A), y se incuba
durante una hora en una placa de microtitulación revestida con
estreptavidina desactivada en una cantidad de 250 \mul de esta
solución por pocillo. A partir de un pocillo se extraen con una
pipeta dos veces, cada vez 100 \mul y se pipetean dentro de un
pocillo de una placa revestida con estreptavidina activa y de nuevo
se incuba durante una hora. Después de esto, se extrae la solución
con una pipeta, se lava tres veces con un tampón y se lleva a cabo
la incubación con POD (anti)-humano de oveja así
como la reacción de formación de color de acuerdo con el párrafo
1A). Los valores obtenidos según el modo de proceder de acuerdo con
el invento se pueden tomar de la Tabla 1, en la columna que está
designada como "con incubación".
De estos datos se puede deducir claramente la
espectacular reducción de la fijación inespecífica en el caso del
modo de proceder de acuerdo con el invento.
| Sueros con perturbación | con incubación | sin incubación previa |
| 7.478-262 | 15 | 260 |
| \hskip0,7cm -269 | 45 | 468 |
| \hskip0,7cm -272 | 30 | 1.669 |
| \hskip0,7cm -289 | 69 | 2.208 |
| 7.480-203 | 97 | 1.343 |
| \hskip0,7cm -210 | 72 | 136 |
| 7.463-531 | 0 | 1.613 |
| 7.478-298 | 182 | 1.517 |
Claims (45)
1. Procedimiento para la detección cualitativa
o/y cuantitativa de una sustancia que se ha de determinar en una
muestra de ensayo con ayuda de un ensayo inmunológico o de
hibridación de ácidos nucleicos, en el que se emplean los
siguientes componentes:
- a)
- un reactivo de captura, que por medio de dos sitios de fijación diferentes, 1) eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar y 2) está fijado o es capaz de fijarse a una fase sólida activa a través de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura, y cuyo segundo partícipe está acoplado a una fase sólida activa,
- b)
- una fase sólida activa, a la que está acoplado el segundo partícipe del par de fijación específica,
- c)
- una fase sólida inactiva, que se corresponde con la fase sólida activa, pero que está modificada no obstante de tal manera que el reactivo de captura no se pueda fijar a ella,
siendo la muestra de ensayo puesta en contacto o
bien primeramente con la fase sólida desactivada a solas, y
solamente más tarde con la fase sólida activa, o simultáneamente
con la fase sólida activa y con la inactiva, pudiendo estar
presentes desde el principio, o pudiendo añadirse más tarde, el
reactivo de captura y eventualmente otros componentes del sistema
de ensayo, y efectuándose una detección de la sustancia que se ha
de
determinar.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se emplea un reactivo de detección
que hace posible, en común con el reactivo de captura, una
detección específica de la sustancia que se ha de determinar, y que
lleva una marcación indirecta o directa, y la detección de la
sustancia que se ha de determinar se lleva a cabo mediante
determinación de la marcación junto a la fase sólida activa o/y en
el material sobrenadante de la muestra de ensayo.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque como fase sólida se utilizan
tubitos de material plástico, placas de microtitulación, perlas de
vidrio o de material plástico o partículas de látex.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
3, caracterizado porque por lo menos como fase sólida
inactiva se utilizan perlas de vidrio o de material plástico, que
están modificadas eventualmente de una manera correspondiente.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la muestra de
ensayo se incuba primeramente con el reactivo de captura y con la
fase sólida inactiva, luego se retira la fase sólida inactiva y tan
sólo después de esto se efectúa la incubación con la fase sólida
activa y con el reactivo de detección.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque como par de
fijación específica se utilizan pares de biotina y avidina, de
biotina y estreptavidina, de un hapteno y un anticuerpo
anti-hapteno o fragmentos de éstos que son capaces
de fijarse específicamente entre sí.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como par
de fijación específica se utiliza el de biotina y estreptavidina o
el de biotina y avidina, pudiendo presentarse la avidina o la
estreptavidina fijadas a la fase sólida.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque en la preparación de la fase sólida
inactiva se produce una desactivación de la avidina o
estreptavidina mediante saturación con biotina o con un derivado de
biotina.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizado porque la desactivación de avidina o
estreptavidina se efectúa mediante una modificación covalente del
centro activo.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque para la modificación
covalente se lleva a cabo una derivatización de por lo menos un
aminoácido del centro activo o un acoplamiento covalente de biotina
con el centro activo.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el acoplamiento
covalente de biotina al centro activo se efectúa por medio de una
biotina fotoactivable, por ejemplo, el complejo de
biotina-DADOO-AB.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, caracterizado porque en la preparación de
la fase sólida inactiva se efectúa una desactivación de avidina o
estreptavidina mediante modificación por tecnología genética del
centro activo, tal como una sustitución, deleción o inserción de
radicales individuales de aminoácidos o de varios de ellos.
\newpage
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como
muestra de ensayo se utiliza un líquido corporal y en particular
sangre, plasma sanguíneo, suero, saliva, líquido de tejido, líquido
cefalorraquídeo u orina.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para la
detección de la sustancia que se ha de determinar se utiliza una
marcación seleccionada entre marcaciones radiactivas, marcaciones
enzimáticas, marcaciones fluorescentes, marcaciones
quimioluminiscentes, marcaciones electro- quimioluminiscentes y
partículas coloreadas.
15. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque para el
caso de que en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se
trate de un antígeno, se utilizan como reactivo de captura
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
16. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque para el caso
de que en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de
un anticuerpo, se utilizan como reactivo de captura antígenos o/y
haptenos.
17. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque para el caso
de que en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de
un ácido nucleico, se utiliza como reactivo de captura un oligómero
o polímero de ácido nucleico o un compuesto análogo a ácido
nucleico.
18. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, caracterizado porque como compuesto
análogo a ácido nucleico se utiliza un ácido nucleico peptídico.
19. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se
utiliza un reactivo de detección, que se fija específicamente a la
sustancia que se ha de determinar.
20. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, caracterizado porque para el caso de que
en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de un
antígeno, se utilizan como reactivo de detección anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos.
21. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, caracterizado porque para el caso de que
en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de un
anticuerpo, se utilizan como reactivo de detección antígenos o/y
haptenos.
22. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, caracterizado porque para el caso de que
en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de un
ácido nucleico, se utiliza como reactivo de detección un oligómero o
polímero de ácido nucleico o un compuesto análogo a ácido
nucleico.
23. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 22, caracterizado porque como compuesto
análogo a ácido nucleico se utiliza un ácido nucleico peptídico.
24. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque se utiliza un
reactivo de detección, que compite con la sustancia que se ha de
determinar en cuanto a un sitio de fijación.
25. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado porque para el caso de que
en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de un
anticuerpo, se utilizan como reactivo de detección anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos.
26. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado porque para el caso de que
en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de un
antígeno, se utilizan como reactivo de detección antígenos o/y
haptenos.
27. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, caracterizado porque para el caso de que
en cuanto a la sustancia que se ha de determinar se trate de un
ácido nucleico, se utiliza como reactivo de detección un oligómero o
un polímero de ácido nucleico o un compuesto análogo a ácido
nucleico.
28. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27, caracterizado porque como compuesto
análogo a ácido nucleico se utiliza un ácido nucleico peptídico.
29. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el
acoplamiento de estreptavidina o avidina a la fase sólida se efectúa
por medio de albúmina de suero bovino de tipo térmico (TRSA).
30. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como
fase inactiva se utiliza una placa de microtitulación, cuyos
pocillos son llenados con diferentes muestras de ensayo, y estas
muestras de ensayo diferentes se transfieren preferiblemente por
medio de una pipeta de múltiples canales, sin pérdida de tiempo, a
otro placa de microtitulación como fase sólida activa.
31. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 30, caracterizado porque durante la
incubación previa con una fase sólida inactiva están presentes ya
también el reactivo de captura y eventualmente ya también el
reactivo de detección.
32. Fase sólida inactiva para su utilización en
un ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos para la
detección cualitativa o/y cuantitativa de una sustancia que se ha
de determinar en una muestra de ensayo, en la que se emplean los
siguientes componentes:
- a)
- un reactivo de captura, que por medio de dos sitios de fijación diferentes, 1) eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar y 2) está fijado o es capaz de fijarse a una fase sólida activa a través de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura, y cuyo segundo partícipe está acoplado a una fase sólida activa,
- b)
- una fase sólida activa, a la que está acoplado el segundo partícipe del par de fijación específica,
caracterizada porque la fase sólida
inactiva se corresponde con la fase sólida activa, pero está
modificada no obstante de tal manera que no pueda tener lugar
ninguna fijación con el reactivo de
captura.
33. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 32, caracterizada porque contiene como fase
sólida un tubito de material plástico, una placa de
microtitulación, perlas de vidrio o de material plástico o
partículas de látex.
34. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 32 ó 33, caracterizada porque comprende un
partícipe de uno de los pares de fijación de biotina y
estreptavidina, de biotina y avidina, de un antígeno y un
anticuerpo, de un hapteno y un anticuerpo
anti-hapteno o fragmentos de éstos que son en cada
caso capaces de fijarse unos con otros.
35. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 34, caracterizada porque el partícipe del
par de fijación es avidina o estreptavidina.
36. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 35, caracterizada porque el acoplamiento de
avidina o estreptavidina a la fase sólida se produce por
revestimiento mediante termo-RSA.
37. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 35 ó 36, caracterizada porque la
desactivación se efectúa mediante saturación de la avidina o
estreptavidina con biotina o con un derivado de biotina.
38. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 35 ó 36, caracterizada porque la
desactivación se efectúa por modificación covalente del centro
activo de la avidina o estreptavidina.
39. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 38, caracterizada porque para la
modificación covalente se efectúa una derivatización de por lo menos
un aminoácido del centro activo o un acoplamiento covalente de
biotina con el centro activo.
40. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 39, caracterizada porque el acoplamiento
covalente de biotina con el centro activo se efectúa con una
biotina fotoactivable, por ejemplo, el complejo de
biotina-DADOO-AB.
41. Fase sólida inactiva de acuerdo con la
reivindicación 35 ó 36, caracterizada porque la
desactivación se efectúa mediante modificación por tecnología
genética del centro activo de la avidina o estreptavidina, tal como
una sustitución, deleción o inserción de radicales individuales de
aminoácidos o de varios de ellos.
42. Utilización de una fase sólida inactiva de
acuerdo con una de las reivindicaciones 32 hasta 41 para eliminar
perturbaciones de ensayos inmunológicos o de hibridación de ácidos
nucleicos mediante captura de componentes que se fijan
inespecíficamente en una muestra de ensayo que se ha de
analizar.
43. Estuche de ensayo para un ensayo inmunológico
o de hibridación de ácidos nucleicos para la detección cualitativa
o cuantitativa de una sustancia que se ha de determinar en una
muestra de ensayo, que contiene los componentes del respectivo
ensayo inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos así como
una fase sólida desactivada de acuerdo con una de las
reivindicaciones 32 a 41.
44. Estuche de ensayo de acuerdo con la
reivindicación 43, caracterizado porque abarca los
siguientes componentes:
- a)
- un reactivo de captura, que, por medio de dos sitios de fijación diferentes, 1) hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo y 2) está fijado a una fase sólida activa o es capaz de fijarse a una fase sólida activa a través de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura y cuyo segundo partícipe está acoplado con una fase sólida activa,
- b)
- un reactivo de detección,
- c)
- una fase sólida activa, a la que está acoplado el segundo partícipe del par de fijación específica,
- d)
- una fase sólida inactivada, que se corresponde con la fase sólida activa, pero que está modificada no obstante de tal manera que el reactivo de captura no se puede fijar a ella.
45. Procedimiento para impedir perturbaciones
debidas a fijaciones inespecíficas en la fase sólida en un ensayo
inmunológico o de hibridación de ácidos nucleicos mediando
utilización de los siguientes componentes
- a)
- un reactivo de captura, que, por medio de dos sitios de fijación diferentes, 1) hace posible una detección específica de la sustancia que se ha de determinar eventualmente en común con otros componentes del sistema de ensayo y 2) está fijado a una fase sólida activa o es capaz de fijarse a una fase sólida activa a través de un par de fijación específica, uno de cuyos partícipes está unido con el reactivo de captura y cuyo segundo partícipe está acoplado con una fase sólida activa,
- b)
- por lo menos dos fases sólidas activas,
caracterizado porque antes de la adición
del reactivo de captura y eventualmente de otros componentes del
sistema de ensayo se lleva a cabo una incubación de la muestra de
ensayo en presencia de una primera fase sólida activa, y después de
esto se separa la muestra de ensayo con respecto de esta primera
fase sólida y luego se efectúa una incubación en presencia del
reactivo de captura y eventualmente de otros componentes del
sistema de ensayo, y de una segunda fase sólida ampliamente
idéntica, y se detecta la sustancia que se ha de determinar de una
manera
apropiada.
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