ES2207757T3 - Deteccion de igg especifica para antigenos. - Google Patents
Deteccion de igg especifica para antigenos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE ANTIGENOS DE LA INMUNOGLOBULINA CLASE G, EN PRESENCIA DE INMUNOGLOBULINAS DE CLASE M Y/O DEL FACTOR REUMATOIDE, EN FLUIDOS CORPORALES, POR INCUBACION CON AL MENOS DOS RECEPTORES DIFERENTES, R 1 Y R 2 , Y RECEPTO RES OPTATIVAMENTE ADICIONALES, CARACTERIZADO PORQUE UN ELEMENTO COLABORADOR DE LA FIJACION, EN FORMA DE MONOMERO ES UN CONSTITUYENTE SUSTANCIAL DE R 2 . LA INVENCION SE REFIERE IGUALM ENTE A UN REACTIVO PARA DETERMINAR EL ANTICUERPO ESPECIFICO DE UN ANTIGENO DE LA INMUNOGLOBULINA CLASE G.
Description
Detección de una IgG específica para
antígenos.
El invento se refiere a un procedimiento para la
determinación de anticuerpos de la clase G de inmunoglobulinas, que
son específicos para antígenos, en líquidos corporales, por
incubación de la muestra con por lo menos dos diferentes receptores
R_{1} y R_{2}, siendo ambos receptores capaces de fijarse
específicamente con el anticuerpo, estando o pudiendo estar R_{1}
unido a una fase sólida y llevando R_{2} una marcación, por
separación de la fase sólida con respecto de la fase líquida y por
medición de la marcación, utilizándose como R_{2} un conjugado a
base de un partícipe en la fijación en una forma monómera, que es
reconocido específicamente por el anticuerpo que se ha de
determinar, y de una marcación.
En particular el invento se refiere a un método
para la detección específica de inmunoglobulinas de la clase IgG en
presencia de inmunoglobulinas de la clase IgM.
El sistema inmunitario de un organismo de animal
mamífero produce, como respuesta a la incorporación de sustancias
ajenas, anticuerpos, que son denominados también inmunoglobulinas.
Éstos sirven para la defensa frente a las sustancias ajenas, que
también son denominadas antígenos. Las inmunoglobulinas se pueden
clasificar en cinco diferentes clases. Se establece diferencia
entre las inmunoglobulinas de las clases M, G, A, E y D. Estas
cinco clases de inmunoglobulinas se diferencian en cada caso en la
composición de la cadena pesada, que se designa como cadena \mu,
\gamma, \alpha, \varepsilon o \delta respectivamente.
Cada clase de inmunoglobulinas tiene en el
organismo una misión diferente. Las inmunoglobulinas de la clase M
aparecen en el caso de un primer contacto con el antígeno, la
denominada primera inmunización. La concentración de estas
inmunoglobulinas disminuye sin embargo de nuevo rápidamente al
progresar la infección. Las inmunoglobulinas de la clase G se
forman tan sólo lentamente en una primera inmunización y aparecen en
grandes cantidades en el caso de una segunda infección con el mismo
antígeno. Las inmunoglobulinas de la clase A se pueden encontrar
sobre las superficies de mucosas del organismo y son competentes
para los procesos de defensa que allí se desarrollan.
Las inmunoglobulinas de la clase E son
responsables principalmente de reacciones alérgicas. La función
exacta de las inmunoglobulinas de la clase D no es conocida hasta
ahora.
Las clases individuales de inmunoglobulinas se
presentan en la sangre en concentraciones muy diversas. Así, las
inmunoglobulinas de la clase G (IgG) en un suero humano normal, con
una proporción de aproximadamente 75%, que corresponde a un
contenido en suero de 8 a 18 mg/ml, son la clase mayoritariamente
representada. La inmunoglobulina, que aparece en segundo lugar de
las frecuencias de presentación, es la IgA, cuya concentración
promedia en el suero es de 0,9 a 4,5 mg/ml. Las inmunoglobulinas de
la clase M están presentes en una concentración de 0,6 a 2,8 mg/ml,
las inmunoglobulinas de la clase D están presentes en una
concentración de 0,003 a 0,4 mg/ml. La más pequeña es la proporción
de los anticuerpos IgE, que aparecen en el suero solamente en una
concentración de 0,02 a 0,05 \mug/ml.
Para el diagnóstico diferenciado de muchas
enfermedades, es importante llevar a cabo la detección de
anticuerpos de una o varias clases de inmunoglobulinas perfectamente
determinadas, que son específicas para un determinado antígeno.
Solamente mediante esta detección de anticuerpos específicos para
una clase, o bien por medio de la exclusión de la presencia de
determinadas clases de inmunoglobulinas (p.ej. detección de
anticuerpos IgG e IgA, pero ninguna detección de anticuerpos IgM)
se puede asegurar un diagnóstico satisfactorio en el caso de
infecciones causadas por virus, bacterias y parásitos. Esto es
especialmente importante para la diferenciación entre infecciones
recientes o agudas y que se remontan a una época anterior, así como
para el control clínico de la evolución de una infección. La
detección de anticuerpos específicos para una clase es en
particular importante en el caso de infecciones causadas por los
virus HIV (de inmunodeficiencia humana), por hepatitis A, hepatitis
B, toxoplasmosis, rubéola y Chlamydia. Asimismo, la detección
específica para una clase de anticuerpos específicos para un
antígeno determinado, es necesaria en el caso de la determinación
del título de anticuerpos protectores y para la comprobación del
éxito de una vacunación. Existe por lo tanto, desde el punto de
vista del diagnóstico, un gran interés en detectar en particular
anticuerpos de los estadios no agudos de infecciones, tales como
los anticuerpos IgG e IgA.
En el estado de la técnica se describen
diferentes métodos para la detección de anticuerpos de una
determinada clase, que son específicos para un antígeno. Así, la
detección de anticuerpos de una determinada clase, específicos para
un antígeno, en una muestra, se lleva a cabo frecuentemente
mediante el recurso de que los anticuerpos específicos se unen a
una fase sólida revestida con el antígeno específico. La detección
de las inmunoglobulinas (Ig) unidas entonces a la fase sólida, que
son específicas para el antígeno, se efectúa mediante la fijación
de anticuerpos, que están dirigidos específicamente contra una Ig
humana de una determinada clase, a las moléculas de Ig que se han
de detectar. Los anticuerpos dirigidos contra una Ig humana están
provistos de una marcación, a través de la cual tiene lugar la
detección. Tal modo de realizar el ensayo es sin embargo posible
solamente cuando antes de la reacción con los anticuerpos
específicos para una clase, marcados y dirigidos contra una Ig
humana, se elimina por lavado la totalidad de las Ig no específicas
y no fijadas. Una realización del ensayo en una sola etapa, tal
como se necesita frecuentemente para sistemas automáticos, no es
posible por consiguiente.
De acuerdo con el método descrito en la patente
de los EE.UU. 4.292.403, los anticuerpos específicos para antígenos
de una determinada clase de inmunoglobulinas se detectan mediante
el recurso de que un anticuerpo específico para una clase se
inmoviliza junto a una fase sólida, el anticuerpo de la muestra que
se ha de determinar se fija, a continuación se añade el antígeno
específico, y el antígeno fijado se une mediante un anticuerpo
adicional marcado, que es específico para el antígeno. Sin embargo,
este procedimiento tiene la desventaja de que todos los anticuerpos
de la clase que se ha de determinar se fijan a los anticuerpos
inmovilizados que son específicos de una clase. La fijación de los
anticuerpos de la muestra no se efectúa de una manera específica
para ciertos antígenos. Esto puede desarrollarse a costa de la
sensibilidad del ensayo, puesto que posiblemente no están presentes
suficientes sitios de fijación libres para los anticuerpos
específicos para un antígeno. También en esta forma de realizar el
ensayo se necesitan varias etapas de lavado. Con este procedimiento
no es posible ninguna realización del ensayo en una sola etapa.
Una posibilidad de llevar a cabo una detección de
anticuerpos en un ensayo de una sola etapa, la abre el denominado
ensayo de puente. El concepto de ensayo de puente se describe en el
documento de solicitud de patente europea
EP-A-0.280.211. En este caso, un
primer receptor, que es capaz de fijarse específicamente con el
anticuerpo que se ha de determinar, tal como por ejemplo un
antígeno, está unido a una fase sólida. El anticuerpo que se ha de
determinar se fija al antígeno fijado a una fase sólida. En la
tanda de ensayo está presente además otro antígeno específico, que
está provisto de una marcación. La detección del anticuerpo se
efectúa a través de la marcación. En este ensayo se detectan todos
los anticuerpos específicos para un antígeno y no solamente los
anticuerpos de una determinada clase.
En el documento
EP-A-0.307.149 y la patente de los
EE.UU. 5.254.458 se divulgan procedimientos de acuerdo con el
principio de ensayo de puente para la detección de anticuerpos, que
están dirigidos específicamente contra un antígeno. En este caso,
péptidos preparados por vía recombinante, que se derivan de un
determinado epítopo del antígeno, se emplean para la fijación del
anticuerpo que se ha de determinar. Un péptido se inmoviliza junto
a una fase sólida. El anticuerpo de muestra se fija al péptido.
Para la detección, un péptido marcado adicional se fija al
anticuerpo de la muestra. Los péptidos recombinantes se expresan en
diferentes organismos, con el fin de aumentar la especificidad de
la detección. También en el caso de este método se fijan a los
péptidos anticuerpos de todas las clases. No es posible una
diferenciación entre anticuerpos, por ejemplo IgG e IgM.
El documento
EP-A-0.386.713 describe un
procedimiento para la detección de anticuerpos contra HIV mediando
utilización de dos soportes sólidos, siendo inmovilizados a ambos
soportes sólidos diferentes antígenos de HIV, que en cada caso se
ponen en contacto con una parte alícuota de una muestra y con un
antígeno de HIV marcado, siendo detectada la presencia de
anticuerpos mediante una reacción positiva en por lo menos uno de
los ensayos. Como antígenos de HIV se divulgan polipéptidos
preparados por vía recombinante. En el documento
EP-A-0.627.625 se divulga un método
sobre la base de una transferencia de borrón Western, en la que
mediante proteínas recombinantes o péptidos sintéticos se pueden
detectar también anticuerpos de HIV. Ambos métodos no hacen posible
sin embargo la detección específica para una clase de los
anticuerpos específicos para ciertos antígenos.
En el documento EP 0.366.092 A2 se divulga un
procedimiento para la determinación de anticuerpos específicos para
una clase A de antígeno, en el que la solución de la muestra se
incuba simultáneamente con un receptor R_{1}, que es capaz de
fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, y con un exceso
de anticuerpos humanos o sus fragmentos, que pertenecen a la misma
clase de inmunoglobulinas, que el anticuerpo que se ha de
determinar, y no es capaz de fijarse con el antígeno A, y a
continuación se añade un receptor R_{2}, que está marcado y es
capaz de fijarse, o bien con el anticuerpo que se ha de determinar
o con el antígeno A.
El documento de solicitud de patente alemana DE
38.20.556 A1 divulga un procedimiento para la determinación de
anticuerpos específicos para alergenos en líquidos corporales, por
incubación con por lo menos dos receptores R_{1} y R_{2}, que
son capaces de fijarse con los anticuerpos que se han de determinar,
llevando R_{2} una marcación. Como R_{1} se emplea el alergeno
capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo que se ha de
determinar, y como R_{2} se emplea un conjugado a base de un
anticuerpo, dirigido contra la parte Fc de IgE o IgG, y de una
marcación.
El documento EP 0.507.587 A2 divulga un método
para la detección de una inmunoglobulina específica, en particular
una IgM, en una muestra. En este caso, la muestra se incuba con un
receptor para la inmunoglobulina, que se puede unir a una fase
sólida. En el caso de este receptor se trata de un anticuerpo, que
está dirigido contra la parte Fc de la inmunoglobulina. Además, la
muestra se incuba con un antígeno, al que se fija específicamente
la inmunoglobulina procedente de la muestra. y con un anticuerpo
marcado, que es específico para el antígeno. La detección se efectúa
a través de la marcación del anticuerpo específico para el
antígeno.
Con los procedimientos hasta ahora conocidos, no
es posible detectar en un procedimiento de una sola etapa, un
anticuerpo de una determinada clase de inmunoglobulinas, que es
específico para un antígeno. Los procedimientos inmunológicos de
detección, conocidos a partir del estado de la técnica, de acuerdo
con el concepto de ensayo de puente, en los cuales se utiliza un
antígeno marcado y un antígeno capaz de fijarse a una fase sólida,
hacen posible ciertamente un ensayo en una sola etapa. Hasta ahora,
sin embargo, con este sencillo principio, los anticuerpos de las
clases IgG e IgM se pueden detectar solamente en común.
La misión fue por lo tanto poner a disposición un
método mejorado para la detección de anticuerpos dirigidos contra un
antígeno específico, de la clase de infección no aguda, es decir en
particular de la clase de IgG. En el procedimiento se debería
asegurar al mismo tiempo que no se detecten anticuerpos IgM con la
misma especificidad. Este método debería consistir de modo
preferido en un principio de ensayo de una sola etapa, con el fin
de poder utilizarlo ventajosamente en sistemas automáticos.
El problema planteado por esta misión se resuelve
con el procedimiento conforme al invento para la determinación de
un anticuerpo de la clase G de inmunoglobulinas, que sea específico
para un antígeno, por incubación de la muestra con por lo menos dos
diferentes receptores R_{1} y R_{2}, siendo ambos receptores
capaces de fijarse específicamente con el anticuerpo, estando o
pudiendo estar R_{1} unido a una fase sólida y llevando
R_{2}una marcación, que está caracterizado porque como R_{2} se
utiliza un conjugado a base de un partícipe en la fijación en una
forma monómera, que es reconocido específicamente por el anticuerpo
que se ha de determinar, y de una marcación.
El procedimiento conforme al invento hace posible
la determinación de anticuerpos de la clase G de inmunoglobulinas,
que son específicos para un antígeno, en muestras, en las cuales
están presentes anticuerpos de la clase IgM con la misma
especificidad para un antígeno.
Los anticuerpos IgA, IgD e IgE, presentes en la
muestra, que poseen la misma especificidad que los anticuerpos IgG
que se han de detectar, se presentan en unas concentraciones
esencialmente más bajas en comparación con las de los anticuerpos
IgG. En particular, las clases de los IgD e IgE están presentes en
unas concentraciones, que se sitúan en algunos órdenes de magnitud
por debajo de la concentración de los IgG, de manera tal que su
reactividad en el procedimiento de detección no modifica, o apenas
modifica, el resultado de la medición. Los anticuerpos IgA están
presentes en unas concentraciones, que corresponden aproximadamente
a un 10% del contenido total de IgG. Presumiblemente, por lo tanto,
en este procedimiento se determinan también anticuerpos IgA. Puesto
que la finalidad principal del procedimiento consiste en detectar
anticuerpos de la infección no aguda, no es crítica la detección en
común de anticuerpos IgG e IgA, puesto que ambos anticuerpos
representan a la infección no aguda. Puesto que los anticuerpos de
IgG representan a la clase de inmunoglobulinas, representada de
manera mayoritaria, de la infección no aguda, en lo sucesivo se
utiliza la denominación de detección de IgG. Es esencial que no
deben detectarse anticuerpos IgM con la misma especificidad para un
antígeno, que aparecen en cantidad aumentada solamente en el caso
de una infección aguda.
Se ha mostrado, de un modo sorprendente, que
mediante el empleo conforme al invento de partícipes en la fijación
en una forma monómera en un ensayo de puente de acuerdo con el
principio de ensayo de dobles antígenos, se detectan exclusivamente
anticuerpos de la clase IgG, que están dirigidos específicamente
contra un determinado antígeno. Los anticuerpos de la clase IgM con
igual especificidad, que están presentes en la misma muestra,
sorprendentemente no reaccionan o solamente reaccionan de una
manera despreciablemente débil con péptidos monoméricos y por
consiguiente no perturban a la detección de IgG. El concepto de
"despreciablemente débil" significa que los sitios de fijación
a antígenos de los anticuerpos IgM no son fijados de una manera
detectable por los partícipes en la fijación en una forma monómera.
Esto se debe presumiblemente a la afinidad esencialmente menor de
los anticuerpos IgM pentameros con respecto a los epítopos
presentes en una forma monómera, en comparación con los anticuerpos
IgG presentes en forma de moléculas individuales.
En el caso del procedimiento conforme al invento
no se necesita indispensablemente por lo tanto una realización
sucesiva de los ensayos para la separación de los anticuerpos IgM,
puesto que éstos no perturban. Una ventaja especial del
procedimiento es por lo tanto la sencillez del desarrollo de los
ensayos.
Junto a los denominados ensayos en húmedo, en los
cuales los reactivos de ensayo se presentan en una fase líquida, se
pueden utilizar también todos los formatos corrientes de ensayos en
seco, que son apropiados para la detección de proteínas o
anticuerpos. En estos ensayos en seco o en estas tiras de ensayo,
como se describen en el documento
EP-A-0.186.799, los componentes del
ensayo están aplicados sobre un soporte. Si el procedimiento
conforme al invento se lleva a cabo en un formato de tiras de
ensayo, no se necesita por lo tanto ninguna etapa de lavado.
Preferiblemente, el procedimiento conforme al invento se lleva a
cabo sin embargo como un ensayo en húmedo.
Es posible incubar conjuntamente todos los
receptores y la muestra, y llevar a cabo el procedimiento en una
sola etapa. Esto exige eventualmente solamente una única etapa de
lavado después de la incubación.
Para la realización del procedimiento conforme al
invento, se utilizan en el caso normal dos diferentes receptores
R_{1} y R_{2}. Si se utiliza un ensayo en húmedo, entonces el
receptor R_{2} se presenta en una fase líquida. R_{1} puede
presentarse en una fase líquida o ya unido a la fase sólida. Si
R_{1} y R_{2} están presentes en una fase líquida, entonces
ellos se presentan preferiblemente en la misma concentración. Se han
manifestado como bien apropiadas unas relaciones entre
concentraciones de R_{1} : R_{2} de 0,5:1,0 a 1,0:5,0. Las
relaciones óptimas de concentraciones pueden ser depuradas con
facilidad mediante ensayo por un experto en la especialidad.
Si como R_{1} se emplea un receptor capaz de
fijarse a una fase sólida, que todavía no está unido a la fase
sólida, entonces la muestra se incuba con los receptores R_{1} y
R_{2}. El anticuerpo de la muestra se fija en tal caso a R_{1} y
a R_{2}. Esta incubación puede tener lugar en presencia de la
fase sólida. Se forma en tal caso un complejo a base de una fase
sólida - R_{1}- un anticuerpo de la muestra - R_{2}. A
continuación, la fase sólida se separa con respecto de la fase
líquida, eventualmente se lava la fase sólida, y se mide la
marcación de R_{2}. La marcación se mide en la mayor parte de los
casos en la fase sólida, pero se puede determinar sin embargo
también en la fase líquida.
Si la incubación de la muestra se lleva a cabo
con R_{1} y R_{2} en ausencia de la fase sólida, entonces la
tanda de ensayo total se tiene que poner en contacto a continuación
con la fase sólida, eventualmente se tiene que llevar a cabo el
lavado y se tiene que medir la marcación.
Si el receptor R_{1} ya se presenta en una
forma fijada a una fase sólida, entonces la muestra y el receptor
R_{2} se añaden al receptor R_{1} fijado a la fase sólida, y se
incuban en común. El modo de proceder ulterior corresponde al del
procedimiento antes indicado.
No obstante, también es posible llevar a cabo el
procedimiento conforme al invento en varias etapas. En este caso,
convenientemente la muestra se incuba en primer lugar con los
receptores R_{1} y R_{2}. El resultante complejo a base de
R_{1}, R_{2} y los anticuerpos que se han de determinar, se
incuba a continuación con otros receptores adicionales, pudiendo
efectuarse esto en varias etapas. La evolución ulterior del ensayo
corresponde al del procedimiento precedentemente descrito.
El receptor R_{2} es un conjugado a base de un
partícipe en la fijación en una forma monómera y de una marcación.
Los partícipes en la fijación en una forma monómera, conformes al
invento, contienen exactamente una zona de epítopo o bien solamente
un sitio de fijación para los anticuerpos que se han de determinar,
es decir una estructura que reacciona inmunológicamente de una
manera específica con el anticuerpo IgG que se ha de determinar. La
estructura monómera del partícipe en la fijación es importante, con
el fin de garantizar que solamente se fijen en una forma monómera a
los partícipes en la fijación los anticuerpos IgG específicos para
un antígeno que se han de detectar, y no se fijen los perturbadores
anticuerpos IgM con la misma especificidad.
La zona de epítopo se puede derivar por ejemplo a
partir de un antígeno o de un anticuerpo
anti-idiotipo. Las zonas de epítopos pueden estar
derivadas, en el caso de los partícipes en la fijación en una forma
monómera, también de estructuras de azúcares y/o lípidos o de
estructuras combinadas con porciones peptídicas, lipídicas y/o de
azúcares. Se pueden utilizar todas las estructuras que se derivan de
una zona de epítopo, que tienen un sitio de fijación, al que se
fija específicamente el anticuerpo de la clase IgG, que se han de
detectar, en presencia de anticuerpos IgM con la misma
especificidad. La única condición para el sitio de fijación, es
decir para el partícipe en la fijación en una forma monómera, que
se emplea, consiste en que se ha de conservar la capacidad de
fijación específica para IgG. Esta condición es válida también para
el caso de que en el sitio de fijación estén contenidas estructuras
de azúcares o lípidos.
Conforme al invento, se pueden emplear también
partícipes en la fijación en una forma monómera, que flanquean o se
solapan al sitio de fijación, al que se fija específicamente el
anticuerpo IgG que se ha de detectar. Por consiguiente, es posible
detectar también anticuerpos IgG que reaccionan de modo cruzado,
cuyo sitio de fijación se solapa con el epítopo que se ha de
detectar. Preferiblemente, para la detección de los anticuerpos IgG
específicos para un antígeno se emplea por lo tanto una mezcla de
partícipes en la fijación en una forma monómera.
Preferiblemente, se emplean péptidos como
partícipes en la fijación en una forma monómera. Como un sitio de
fijación ha de entenderse, en el caso de una proteína como analito,
un péptido cuya secuencia es una parte de la secuencia proteínica un
antígeno proteínico y al que se fija específicamente un anticuerpo
dirigido contra esta proteína, que en el presente invento es un
anticuerpo IgG. Junto a estos péptidos, como un sitio de fijación
han de entenderse también todavía péptidos con unas secuencias de
aminoácidos, que muestran en lo esencial una especificidad y/o una
afinidad de la fijación a los anticuerpos IgG que se han de
detectar, equivalentes a las de los péptidos antes mencionados.
Estos péptidos se pueden derivar preferiblemente por sustitución,
deleción o inserción de radicales individuales de aminoácidos a
partir de los péptidos precedentemente mencionados.
Se pueden utilizar todos los péptidos, que
presenten un sitio de fijación, al que se fija específicamente el
anticuerpo de la clase IgG que se ha de determinar, también en
presencia de anticuerpos IgM con la misma especificidad. La única
condición para el sitio de fijación, es decir para el péptido
empleado, consiste en que ha de permanecer conservada la capacidad
específica de fijación a los IgG. Por un sitio de fijación ha de
entenderse un péptido, cuya secuencia es una parte de la secuencia
proteínica de un antígeno proteínico (analito), y al que se fija
específicamente un anticuerpo dirigido contra esta proteína, que en
el presente invento es un anticuerpo IgG. Junto a estos péptidos,
han de entenderse por un sitio de fijación también todavía péptidos
que tienen secuencias de aminoácidos, que muestran en lo esencial
una especificidad y/o una afinidad de la fijación a los anticuerpos
IgG que se han de determinar, equivalentes a las de los péptidos
antes mencionados. Estos péptidos pueden derivarse a partir de los
péptidos mencionados con anterioridad, preferiblemente, por
sustitución, deleción o inserción de radicales individuales de
aminoácidos.
Dentro de los péptidos conformes al invento, que
corresponden a un sitio de fijación específico, han de entenderse
también derivados peptídicos, en los que uno o varios aminoácidos
se han derivatizado mediante una reacción química. Ejemplos de
derivados peptídicos conformes al invento son en particular las
moléculas, en las cuales el entramado principal y/o los grupos
reactivos de cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo grupos
amino libres, grupos carboxilo libres y/o grupos hidroxilo libres,
han sido derivatizados. Ejemplos específicos para derivados de
grupos amino son amidas de ácidos sulfónicos o de ácidos
carboxílicos, derivados de tio-uretanos y sales de
amonio, por ejemplo los hidrocloruros. Derivados de grupos carboxilo
son sales, ésteres y amidas. Ejemplos de derivados de grupos
hidroxilo son derivados de O-acilo o de
O-alquilo. La preparación de los péptidos se efectúa
preferiblemente por síntesis química de acuerdo con métodos
conocidos por un experto en la especialidad y no precisan en el
presente contexto ninguna explicación especial. En principio, los
péptidos se pueden preparar también mediante métodos recombinantes.
No obstante, los polipéptidos de mayor longitud tienden con
frecuencia a la dimerización o polimerización, de manera tal que
los péptidos se producen preferiblemente por medio de una síntesis
química, a fin de asegurar las propiedades monómeras.
Además, el concepto de derivado peptídico abarca
también los péptidos en los que uno o varios aminoácidos se
reemplazan por homólogos de aminoácidos presentes en la naturaleza
o no presentes en la naturaleza, seleccionados entre los 20
aminoácidos "clásicos". Ejemplos de tales homólogos son
4-hidroxi-prolina,
5-hidroxi-lisina,
3-metil-histidina, homoserina,
ornitina, \beta-alanina y ácido
4-amino-butírico. Los derivados
peptídicos deben tener una especificidad y/o una afinidad de la
fijación a los anticuerpos IgG que se han de determinar, que en lo
esencial son equivalentes a las de los péptidos a partir de los que
ellos se derivan.
Como péptidos conformes al invento, que
corresponden a un sitio de fijación específico, se han de entender
también sustancias miméticas de péptidos, denominadas en lo
sucesivo compuestos miméticos de péptidos, que presentan una
especificidad y/o una afinidad de la fijación a los anticuerpos IgG
que se ha determinar, en lo esencial equivalentes a las de los
péptidos o derivados peptídicos precedentemente mencionados. Los
compuestos miméticos de péptidos son compuestos que pueden
reemplazar a los péptidos en su interacción con el anticuerpo que se
ha de determinar, y que pueden tener una estabilidad aumentada
frente a los péptidos nativos, en particular frente a proteínasas o
peptidasas. Métodos para la preparación de compuestos miméticos de
péptidos se describen en las citas de Giannis y Kolter, Angew. Chem.
195 (1993), 1303-1326 y de Lee y colaboradores,
Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010.
La longitud de un sitio de fijación, es decir la
longitud del péptido monómero conforme al invento, es usualmente de
por lo menos 4 aminoácidos. De modo preferido, la longitud está
situada entre 4 y 20, entre 6 y 15, o de modo especialmente
preferido entre 9 y 12 aminoácidos. En el caso de los compuestos
miméticos de péptidos o derivados de péptidos se necesita una
longitud análoga o un tamaño análogo de la molécula.
Los péptidos monoméricos conformes al invento en
calidad de partícipes en la fijación en una forma monómera,
contienen el epítopo, al que se fija específicamente el anticuerpo
IgG que se ha de determinar. Junto al extremo terminal de N y/o
junto al extremo terminal de C del péptido pueden estar presentes
sin embargo todavía otras secuencias de péptidos flanqueadoras, que
ya no correspondan al epítopo específico. Por lo demás, es posible
proveer al péptido de grupos espaciadores que son habituales para
un experto en la especialidad. Las únicas condiciones consisten en
que el péptido como partícipe en la fijación en una forma monómera
ha de presentarse realmente en una forma monómera, y en que se ha
de conservar la capacidad de fijación a los anticuerpos IgG que se
han de determinar.
Un constituyente adicional del receptor R_{2}
es la marcación. Preferiblemente se emplea como marcación una
sustancia directamente detectable, por ejemplo una sustancia
quimioluminiscente, fluorescente o radiactiva, o una partícula de
sol metálico, látex u oro. Además se prefieren como marcación las
enzimas u otras moléculas biológicas, tales como por ejemplo
haptenos. Entre los haptenos, la digoxigenina es una marcación
especialmente preferida. Los procedimientos para realizar la
marcación son habituales para un experto en la especialidad y no
necesitan aquí de ninguna explicación adicional. La detección de la
marcación se efectúa, de una manera en sí conocida, directamente
por medición de la sustancia quimioluminiscente, fluorescente o
radiactiva o de la partícula de sol metálico, látex u oro, o por
medición del substrato convertido por la enzima.
La detección de la marcación puede efectuarse
también de un modo indirecto. En este caso, un receptor adicional,
que por sí mismo está acoplado a su vez con un grupo generador de
señales, se fija específicamente a la marcación de R_{2}, por
ejemplo un hapteno, tal como digoxigenina. La detección del grupo
generador de señales, por ejemplo una sustancia quimioluminiscente,
fluorescente o radiactiva, o bien una enzima o una partícula de
oro, se efectúa de acuerdo con los métodos habituales para un
experto en la especialidad. Como receptor adicional, se puede
emplear por ejemplo un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que
se fija específicamente a la marcación de R_{2}. Si se utiliza
esta detección indirecta de la marcación, entonces la marcación de
R_{2} es de modo preferido digoxigenina u otro hapteno distinto, y
la detección se efectúa a través de un anticuerpo acoplado con una
peroxidasa, que se dirige contra digoxigenina o contra el
hapteno.
Un constituyente esencial del receptor R_{1} es
un partícipe en la fijación, que es capaz de fijarse
específicamente con el anticuerpo IgG que se ha de determinar. El
receptor R_{1} puede estar unido directamente a la fase sólida, o
puede ser capaz de fijarse a la fase sólida. Como partícipe en la
fijación, capaz de fijarse específicamente con el anticuerpo IgG
que se ha de determinar, se emplea un partícipe en la fijación en
una forma monómera, tal como en el receptor R_{2}. Es decisivo que
permanezca conservada la capacidad de fijación específica del
partícipe en la fijación con los anticuerpos IgG que se han de
determinar. Preferiblemente, se emplean sin embargo también péptidos
para el receptor R_{1}. Los péptidos contenidos en R_{1} se
preparan de acuerdo con los mismos métodos que los péptidos para
R_{2}.
Los partícipes en la fijación o péptidos
específicos para anticuerpos, contenidos en los receptores R_{1}
y R_{2}, pueden ser idénticos o diferentes, pero ambos deben ser
capaces de fijarse simultáneamente con el anticuerpo IgG que se ha
de determinar.
R_{1} puede, en una alternativa, estar unido
directamente a la fase sólida. La fijación directa de R_{1} a la
fase sólida se efectúa de acuerdo con métodos conocidos para un
experto en la especialidad. La fijación de R_{1} a la fase sólida
puede efectuarse también indirectamente a través de un sistema de
fijación específica. En este caso, R_{1} es un conjugado, que
consta de uno de los péptidos antes ilustrados y de un partícipe en
la reacción de un sistema de fijación específica. Por un sistema de
fijación específica se entienden en este caso dos partícipes, que
pueden reaccionar uno con otro de una manera específica. La
capacidad de fijación puede deberse en este caso a una reacción
inmunológica o a otra reacción específica distinta. De modo
preferido, como sistema de fijación específica se utiliza una
combinación de biotina y avidina, o de biotina y estreptavidina.
Otras combinaciones preferidas son las de biotina y
anti-biotina, de un hapteno y un
anti-hapteno, de un fragmento Fc de un anticuerpo y
anticuerpos contra este fragmento Fc, o de un hidrato de carbono y
una lectina. Uno de los partícipes en la reacción de este par capaz
de fijarse específicamente es entonces una parte del conjugado, que
forma el receptor R_{1}.
El otro partícipe en la reacción del sistema de
fijación específica se presenta en una fase sólida. La fijación del
otro partícipe en la reacción del sistema de fijación específica, a
un material de soporte insoluble, se puede llevar a cabo de acuerdo
con los métodos usuales, que son conocidos por un experto en la
especialidad. En este caso, es apropiada una fijación tanto
covalente como también por adsorción. Como fase sólida son
especialmente adecuados tubitos de reactivos o placas de
microtitulación a base de poliestireno u otros materiales
sintéticos similares, que están revestidos en su superficie interna
con partícipes en la reacción del sistema de fijación específica.
Además, son apropiadas y especialmente preferidas sustancias en
forma de partículas, tales como por ejemplo partículas de látex,
materiales de tamices moleculares, corpúsculos de vidrio, mangueras
de material sintético y similares. También se pueden utilizar como
soportes los soportes porosos en forma de capas, tales como
papel.
En una forma preferida de realización del
procedimiento conforme al invento, se emplea como R_{1} un
conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma
monómera y un partícipe en la reacción del sistema de fijación
específica. En esta forma de realización preferida, los receptores
R_{1} y R_{2}, así como la muestra, que contiene los
anticuerpos IgG que se han de determinar, se incuban en común. En
este caso, las partes peptídicas de los receptores R_{1} y R_{2}
reaccionan específicamente con los anticuerpos IgG que se han de
determinar. La fijación de este complejo a base de R_{1},
anticuerpos de la muestra y R_{2}, a la fase sólida, que está
revestida con el otro partícipe en la fijación del sistema de
fijación específica, se efectúa a través de un partícipe en la
reacción del sistema de fijación específica, que es un constituyente
de R_{1}. Por consiguiente, la totalidad del complejo a base de
R_{1}, de los anticuerpos de la muestra y de R_{2} se ha fijado
a la fase sólida. Después de la separación de la fase sólida con
respecto de la fase líquida y eventualmente tras de haber lavado la
fase sólida, se detecta la marcación de R_{2} de acuerdo con
métodos conocidos por un experto en la especialidad. Mediante esta
realización del ensayo, es posible detectar un anticuerpo IgG
específico en presencia de anticuerpos IgM con igual
especificidad.
En otra forma de realización preferida adicional
del procedimiento conforme al invento, junto a los receptores
R_{1} y R_{2} se emplea todavía un receptor adicional. En esta
modalidad de realización del ensayo, se emplea como R_{1} un
conjugado a base de un partícipe en la fijación en una forma
monómera y de un partícipe en la fijación de un sistema de fijación
específica, tal como por ejemplo biotina. Para ello, los receptores
R_{1} y R_{2}, así como la muestra, que contiene los anticuerpos
IgG que se han de determinar, se incuban en común. En este caso,
las partes peptídicas de los receptores R_{1} y R_{2}
reaccionan específicamente con los anticuerpos IgG que se han de
determinar. A través de un partícipe en la reacción de un sistema
de fijación específica, que es un constituyente de R_{1}, se
efectúa la fijación a la fase sólida, que está revestida con el
otro partícipe en la reacción del sistema de fijación específica
(por ejemplo con estreptavidina). Por consiguiente, la totalidad
del complejo a base de R_{1}, R_{2} y de los anticuerpos de la
muestra, se ha fijado a la fase sólida. Después de haber separado la
fase sólida con respecto de la fase líquida y eventualmente después
de haber lavado la fase sólida, el complejo fijado a la fase sólida
se incuba con un receptor adicional, que reconoce específicamente
la marcación de R_{2}. El receptor adicional está acoplado con un
grupo generador de señales, por ejemplo con una enzima. Después de
eventualmente una etapa de lavado adicional, se efectúa la detección
del anticuerpo de la muestra a través del grupo generador de
señales, en este caso mediante el substrato convertido por la
enzima. Si se emplea esta modalidad de realización del ensayo, como
marcación de R_{2} se utiliza de modo preferido digoxigenina. El
receptor adicional consta en este caso de un anticuerpo o fragmento
de anticuerpo dirigido contra digoxigenina y de la enzima
peroxidasa. En esta modalidad de realización del ensayo, la
incubación de la muestra con R_{1}, R_{2} y el receptor
adicional puede efectuarse también al mismo tiempo.
Esta modalidad de realización del ensayo es
apropiada asimismo muy bien para el empleo en sistemas automáticos,
pero exige dos o más etapas de lavado. La gran ventaja de esta
modalidad de realización del ensayo se pone de manifiesto cuando se
tienen que detectar varios anticuerpos IgG específicos para un
antígeno, tales como p.ej. anticuerpos de HIV contra gp41, p17,
etc.. En uno de tales casos, el receptor adicional se puede emplear
como marcación universal, puesto que este receptor adicional
reconoce específicamente a la marcación de R_{2}.
Como muestras se pueden utilizar todos los
líquidos biológicos que son conocidos por un experto en la
especialidad. Como muestras se emplean preferiblemente líquidos
corporales tales como sangre entera, suero sanguíneo, plasma
sanguíneo, orina, saliva, etc.
En las tandas de ensayo pueden estar presentes,
junto a la muestra, la fase sólida y los receptores señalados,
otros aditivos que se necesitan dependiendo de la aplicación, tales
como tampones, sales, detergentes, aditivos proteínicos tales como
por ejemplo RSA (de Rinder Serum Albumin = albúmina de suero
bovino). Los aditivos necesarios son conocidos para un experto en
la especialidad o pueden ser seleccionados por éste de una manera
sencilla.
Con el fin de garantizar que anticuerpos IgM o
factores reumáticos no perturben a la detección de IgG específica
de un antígeno, se pueden utilizar eventualmente medidas
adicionales de eliminación de perturbaciones. Entre ellas se cuentan
por ejemplo el empleo, divulgado en el documento de patente europea
EP-B-0.341.439, de sustancias
reductoras, tales como ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE) o
\beta-mercapto-etanol. Además, se
pueden emplear eventualmente anticuerpos anti-Fd
para la eliminación de perturbaciones causadas por factores
reumáticos. Un concepto de este tipo se divulga en el documento de
solicitud de patente internacional WO 96/14338. Las diferentes
medidas para la eliminación de perturbaciones se pueden emplear
individualmente o en una combinación arbitraria.
Un objeto adicional del invento es un reactivo
para la determinación de un anticuerpo específico para un antígeno,
de la clase de inmunoglobulinas G, que junto a los aditivos de
ensayo usuales para ensayos inmunológicos, tales como tampones,
sales, detergentes, etc., contiene un receptor R_{2} capaz de
fijarse con el anticuerpo que se ha de determinar, que consta de un
partícipe en la fijación en una forma monómera, y de una
marcación.
Es asimismo un objeto del invento un reactivo
para la determinación de un anticuerpo de la clase de
inmunoglobulina G, específico para un antígeno, que junto a los
usuales aditivos de ensayo para ensayos inmunológicos contiene dos
receptores R_{1} y R_{2} capaces de fijarse con el anticuerpo
que se ha de determinar, de los que R_{1} es capaz de fijarse con
una fase sólida y R_{2} lleva una marcación, realizándose que un
constituyente esencial del receptor R_{2} es un partícipe en la
fijación en una forma monómera.
Es además un objeto del invento un reactivo para
la determinación de un anticuerpo de la clase de inmunoglobulina G,
específico para un antígeno, que junto a los usuales aditivos de
ensayo para ensayos inmunológicos, contiene dos receptores R_{1}
y R_{2} capaces de fijarse con el anticuerpo que se ha de
determinar, de los que R_{1} es capaz de fijarse con una fase
sólida y R_{2} lleva una marcación, realizándose que un
constituyente esencial de ambos receptores es en cada caso un
partícipe en la fijación en una forma monómera.
Por otro lado, es un objeto del presente invento
la utilización de partícipes en la fijación en una forma monómera
para la determinación de un anticuerpo de la clase de
inmunoglobulina G, que es específico para un antígeno.
Los siguientes Ejemplos explican el invento con
mayor detalle.
Antígenos (de HIV 2) monómeros (ensayo A) o
multímeros (ensayo B), marcados con biotina y marcados con
digoxigenina, reaccionan con anticuerpos de la muestra y con una
fase sólida revestida con estreptavidina (incubación a 25ºC o 37ºC,
durante aproximadamente 60 a 180 min, en este Ejemplo: 120 min a
25ºC). Después de una etapa de lavado, el complejo inmunológico
fijado a las paredes, reacciona con un conjugado de
anti-digoxigenina y una peroxidasa (incubación a
25ºC o 37ºC, durante aproximadamente 30 a 120 min, en este Ejemplo:
60 min a 25ºC). Después de una etapa de lavado adicional, el
complejo inmunológico marcado con un conjugado de una peroxidasa se
detecta mediante una reacción con un substrato (incubación del
conjugado durante 60 min a 25ºC). En general, la incubación del
conjugado se puede llevar a cabo a 25ºC o 37ºC durante
aproximadamente 30 a 120 min.
Las etapas de reacción (aparte de la reacción con
el substrato) tienen lugar en un tampón de Tris/HCl (pH 7,5, de 50
a 150 mM, en este Ejemplo 100 mM) con aproximadamente 0,05 a 0,4%
de un detergente (aquí 0,2% de polidocanol), y con aproximadamente
0,5% de aditivos proteínicos o derivados proteínicos (aquí, entre
otros, peptona a partir de lactoalbúmina y RSA).
Los anticuerpos de la muestra son en este caso
anticuerpos monoclonales (MAKs) de ratón (IgM e IgG) contra un
epítopo de HIV 2, diluidos a aproximadamente 2 - 20 \mug/ml en un
suero humano negativo anti-HIV.
(Tabla pasa a página
siguiente)
La utilización de partícipes en la fijación,
específicos para HIV 2, en una forma monómera hace posible detectar
específicamente anticuerpos IgG contra los HIV 2. No son
reconocidos anticuerpos de la clase IgM con la misma especificidad
para un antígeno (Ensayo
A).
En el caso de la utilización de partícipes en la
fijación específicos para HIV 2, en una forma multímera, no es
posible la discriminación entre IgG e IgM (Ensayo B).
Realización experimental igual que en el Ejemplo
1.
La utilización de partícipes en la fijación en
una forma monómera hace posible la detección de la seroconversión
después de una infección causada por HIV 2. La ventaja del ensayo A
se muestra de modo especialmente manifiesto en la semana 3 después
de la infección. Existen solamente anticuerpos IgM, que no se
detectan con los partícipes en la fijación en una forma monómera.
Tan sólo después de la aparición de anticuerpos IgG, muestra el
ensayo A una señal positiva. El ensayo B, que utiliza epítopos
multímeros, no está en situación de diferenciar entre IgG e IgM con
igual
especificidad.
\newpage
Realización experimental igual que en el Ejemplo
1, pero con antígenos de HIV 1.
También en el caso de una infección con HIV1 es
posible con el ensayo A (de una manera análoga a los HIV2 de
acuerdo con el Ejemplo 2) una detección confiable de anticuerpos
IgG.
La detección de una IgG específica para rubéola
(R-IgG) mediante los partícipes en la fijación en
una forma monómera conformes al invento, se lleva a cabo en un
aparato Elecsys® 2010 de la entidad Boehringer Mannheim GmbH,
Alemania, de acuerdo con los datos del fabricante. Se emplean los
siguientes reactivos.
| Reactivo R1: | péptido cíclico del antígeno de rubéola E1, biotiniliado. Tampón Tris, |
| pH 7,5, 0,2% de Myrij, 0,2% de RSA, 0,1% de R-IgG. | |
| Reactivo R2: | péptido cíclico del antígeno de rubéola E1, rutenilado. Tampón Tris, |
| pH 7,5, 0,2% de Myrij, 0,2% de RSA, 0,1% de R-IgG. |
Como muestras se emplean muestras de sueros
humanos.
La realización del ensayo se efectúa en las
siguientes etapas:
- 1. 30 \mul de muestra + 65 \mul de R1 + 65 \mul de R2
- 2. Incubación a 37ºC, durante 39 min
- 3. Adición de 40 \mul de glóbulos magnéticos revestidos con SA
- 4. Incubación a 37ºC durante 9 min
- 5. Reacción de detección: medición de la señal de electroquimioluminiscencia.
Se reconocen como positivas solamente las
muestras que contienen IgG específicas para un antígeno. Conforme al
invento no se reconocen como positivas las muestras que solamente
contienen IgG específicas para un antígeno (N^{os} 1.3 y
1.4).
Claims (7)
1. Procedimiento para la determinación de un
anticuerpo de la clase G de inmunoglobulinas, que es específico
para un antígeno, en un ensayo de puente de acuerdo con el principio
de ensayo con dobles antígenos, mediante incubación de la muestra
con por lo menos dos diferentes receptores R_{1} y R_{2}, siendo
ambos receptores capaces de fijarse específicamente con los sitios
de fijación a antígenos del anticuerpo, estando o pudiendo estar
R_{1} fijado a una fase sólida y llevando R_{2} una marcación,
caracterizado porque como R_{2} se utiliza un conjugado a
base de un partícipe en la fijación en una forma monómera, que es
reconocido específicamente por el anticuerpo que se ha de
determinar, y de una marcación, y porque un constituyente esencial
de R_{1} es un partícipe en la fijación en una forma monómera.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque como sistema de
fijación específica para la fijación de R_{1} a la fase sólida se
utiliza un sistema de biotina y avidina, de biotina y
estreptavidina, de biotina y anti-biotina, de un
hapteno y un anti-hapteno, de un fragmento Fc de un
anticuerpo y anticuerpos contra este fragmento Fc, de un hidrato de
carbono y una lectina.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el receptor
R_{2} está marcado con una sustancia quimioluminiscente,
fluorescente o radiactiva, con una enzima o con otra molécula
biológica distinta.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra se
incuba simultáneamente con R_{1} y R_{2}.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la tanda de
ensayo se incuba con un receptor adicional, que se fija
específicamente a la marcación del receptor R_{2}, siendo el
receptor adicional un conjugado a base de un receptor específico
para la marcación de R_{2} y de una marcación, y a continuación
se determina la marcación.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las relaciones
entre concentraciones de R_{1} : R_{2} son de 0,5:1,0 a
1,0:5,0.
7. Reactivo para la determinación de un
anticuerpo de la clase G de inmunoglobulinas, específico para un
antígeno de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,
caracterizado porque contiene dos receptores R_{1} y
R_{2} capaces de fijarse con el anticuerpo que se ha de
determinar, de los que R_{1} es capaz de fijarse con una fase
sólida y R_{2} lleva una marcación, siendo un constituyente
esencial de ambos receptores en cada caso un partícipe en la
fijación en una forma monómera.
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