ES2339834T3 - Uso de superficies de control para detectar muestras que interfieren en un proceso de identificacion. - Google Patents
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Abstract
Método de detección de un analito mediante su fijación específica a un receptor de fase sólida, revelando además las interferencias ocasionadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito mediante el uso de una fase sólida con, al menos, una superficie de ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio de unión al receptor específico del analito, de modo que la fase sólida incluye asimismo, al menos, una superficie de control delimitada, para detectar interferencias causadas por fijaciones inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, y el receptor de fase sólida con el sitio de unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el empleo de una solución de carga y la superficie de control forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del analito.
Description
Uso de superficies de control para detectar
muestras que interfieren en un proceso de identificación.
La presente invención se refiere a una fase
sólida que lleva al menos una superficie de ensayo para detectar un
analito y también comprende, al menos, una superficie de control
para detectar interferencias. Además la presente invención se
refiere a un proceso para detectar uno o más analitos, usando una
fase sólida conforme a la presente invención, que permite
distinguir reacciones perturbadoras y, dado el caso,
corregirlas.
Al detectar un analito mediante ensayos de
fijación, en la reacción de identificación de algunas muestras
aparecen interferencias que falsean los valores de la medición. Este
fenómeno se designa casi siempre efecto matriz de la muestra.
Generalmente en los formatos de ensayo usuales hasta la fecha no se
puede poner de manifiesto una interferencia. Mediante una compleja
optimización de la fase acuosa, de los tampones y del reactivo de
identificación se intenta suprimir totalmente el efecto matriz de
las diversas muestras o mantenerlo lo más bajo posible, pero
eliminar las perturbaciones de los procesos de detección es difícil
y costoso. Tampoco hay que descartar que en determinadas muestras,
a pesar de la optimización del ensayo, no se pueda lograr una
eliminación suficiente de las perturbaciones, por ser
desgraciadamente imposible la supresión total del efecto matriz.
Además durante el desarrollo del proceso de ensayo pueden surgir
nuevas interferencias desconocidas, que también dan lugar a
resultados falsos. Por lo tanto existe el problema de que en los
métodos de detección se pueden obtener resultados de ensayo falsos,
sin que el usuario lo reconozca. Esta circunstancia es especialmente
trágica en el caso de los ensayos cualitativos de detección de
enfermedades infecciosas. Así, por ejemplo, una muestra falsamente
positiva debida a problemas de matriz en una prueba de VIH tiene
consecuencias considerables.
La patente
US-A-4,558,013 describe una tira de
ensayo que junto a zonas de ensayo recubiertas con reactivos
específicos tiene una zona de control negativa no delimitada, sin
recubrir. El valor medido en la zona de ensayo se corrige por
substracción de la fijación inespecífica en la zona de control. De
todos modos este procedimiento solo permite corregir en parte las
interferencias, pues la fijación inespecífica de componentes
perturbadores a la zona de ensayo casi siempre se diferencia
considerablemente de la fijación inespecífica de componentes
perturbadores a la zona de control.
La patente
US-A-5,35 6,7 85 describe una fase
sólida con varias superficies de ensayo que llevan respectivamente
distintas cantidades de un receptor en fase sólida para detectar un
analito. La fase sólida contiene además una superficie de
referencia que da una señal detectable de intensidad conocida con el
reactivo de ensayo. No se revela ninguna superficie de control para
determinar interacciones inespecíficas entre la muestra y la fase
sólida.
La patente
US-A-4,916,05 6 (Brown III y otros)
describe una fase sólida para la determinación cualitativa o
cuantitativa de un analito - sobre todo de un antígeno, anticuerpo o
segmento de ADN - en una muestra. Además de una superficie de
ensayo, la fase sólida comprende una superficie de referencia que da
una señal positiva en el ensayo, así como una zona de control
negativa, no delimitada, que contiene la superficie de referencia
positiva y la superficie de ensayo. Una desventaja de este
dispositivo es que la superficie de la zona de control no
recubierta difiere demasiado de la superficie de ensayo para lograr
una corrección efectiva de las perturbaciones.
Por tanto un objetivo de la presente invención
consistía en aportar dispositivos y métodos para la determinación
de un analito, que permitieran una indicación directa de la
presencia y, dado el caso, del tipo de interferencias, para poder
incluirlas en la valoración de los resultados de ensayo.
Según la presente invención dicho objetivo se
resuelve con un método de detección de un analito mediante su
fijación específica a un receptor de fase sólida, revelando además
las interferencias ocasionadas por fijaciones inespecíficas a la
superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito
mediante el uso de una fase sólida con, al menos, una superficie de
ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio
de unión al receptor específico del analito, de modo que la fase
sólida incluye asimismo, al menos, una superficie de control
delimitada, para detectar interferencias causadas por fijaciones
inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes
perturbadores ajenos al analito, la cual forma parte de la
superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga,
pero no el sitio de unión al receptor específico del analito. La
presente invención se refiere igualmente a una fase sólida con, al
menos, una superficie de ensayo definida que lleva un receptor de
fase sólida para la detección de un analito en una muestra mediante
su fijación específica a un sitio de unión al receptor, específico
del analito, del receptor de fase sólida, la cual se caracteriza
por comprender además, como mínimo, una superficie de control
delimitada para detectar interferencias producidas por fijaciones
inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores
ajenos al analito, de modo que la superficie de control forma parte
de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de
carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del
analito.
Por "superficies de ensayo delimitadas"
sobre una fase sólida hay que entender que las superficies de ensayo
abarcan zonas definidas de la fase sólida, distanciadas
preferiblemente de otras superficies de ensayo mediante zonas
inertes. Las superficies de ensayo delimitadas tienen
preferiblemente un diámetro de 10 \mum hasta 1 cm y con especial
preferencia de 10 \mum hasta 5 mm. Sobre todo se prefieren
superficies de ensayo miniaturizadas, con un diámetro de 10 \mum
hasta 2 mm. Se prefieren las fases sólidas con varias superficies de
ensayo, también conocidas como sistemas matriciales. Estos sistemas
están descritos p.ej. por Ekins y Chu (Clin. Chem. 37 (1995),
1955-1967), y en las patentes US nº 5,432,099,
5,516,635 y 5,126,276. Los sistemas matriciales tienen la ventaja
de que permiten efectuar varias determinaciones simultáneas de
analitos y controles en una muestra. El empleo de superficies de
control para detectar fijaciones inespecíficas y/o muestras
perturbadoras puede mejorar mucho la seguridad de los resultados,
precisamente en sistemas matriciales de ensayo miniaturizados.
Aquí es de especial interés la captación de
interferencias y fijaciones inespecíficas en los ensayos
cualitativos, sobre todo en aquellos con gran exigencia de
especificidad, como en el caso de las pruebas de infección (p.ej.
por VIH). La indicación de una interferencia y la corrección del
valor medido pueden disminuir claramente los resultados falsamente
positivos, mejorando enormemente la especificidad.
La fase sólida según la presente invención es
cualquier soporte habitual en procesos de detección, preferiblemente
un soporte no poroso, p.ej. un soporte con superficie de plástico,
de vidrio, de metal o de óxido metálico. También son adecuados
soportes porosos como por ejemplo las tiras de ensayo. Sobre este
soporte se han dispuesto zonas discretas (superficies de ensayo).
Sobre estas superficies de ensayo hay receptores de fase sólida
inmovilizados. La inmovilización de los receptores de fase sólida
se realiza según métodos conocidos, p.ej. por fijación directa
adsortiva, por unión covalente o por acoplamiento mediante pares de
fijación de gran afinidad, p.ej. estreptavidina/biotina,
antígeno/anticuerpo o azúcar/lectina. La presencia y/o cantidad de
analito en una muestra puede determinarse por fijación específica
de componentes del medio detector, p.ej. del analito o de un análogo
del analito objeto de detección, al receptor de fase sólida.
En el proceso de la presente invención, la
detección del analito y de la presencia de reacciones perturbadoras
tiene lugar de manera conocida, usando grupos marcadores adecuados,
p.ej. grupos marcadores fluorescentes. Como alternativa - en fases
sólidas apropiadas - la interacción de los componentes del medio
detector con las superficies de ensayo y de control también se
puede detectar determinando el espesor de capa de la respectiva
superficie, p.ej. mediante espectroscopia de resonancia de
plasmones.
En los sistemas matriciales - en los cuales se
detectan simultáneamente varios analitos de una muestra - se
prefiere el uso de un grupo marcador "universal", que permite
detectar simultáneamente varios analitos diferentes en superficies
de ensayo distintas. Un ejemplo de tales grupos marcadores
universales son los que llevan un receptor capaz de interactuar
específicamente (p.ej. a través de un par de fijación de gran
afinidad, como por ejemplo antígeno/anticuerpo o
estreptavidina/biotina, etc.) con un receptor complementario sobre
un reactivo de ensayo, p.ej. un receptor soluble para un analito o
un análogo del analito a determinar.
El uso de un marcador universal de este tipo se
ilustra como ejemplo en la figura 1. Ahí se usa una perla de látex
fluorescente acoplada a un anticuerpo de digoxigenina (marcador
(<Dig>) para tres formatos de ensayo distintos sobre una sola
fase sólida, en concreto para determinar anticuerpos de VIH,
antígenos HBs y anticuerpos anti-HBc. En la
determinación de anticuerpos anti-VIH se utiliza un
antígeno de VIH inmovilizado y un antígeno de VIH soluble marcado
con digoxigenina, que forman un inmucomplejo inmovilizado con los
anticuerpos anti-VIH a detectar. El grupo marcador
puede unirse a los grupos de digoxigenina existentes en este
inmucomplejo. En la determinación de antígenos HBs se usa
respectivamente un anticuerpo inmovilizado y un anticuerpo soluble
marcado con digoxigenina capaz de interactuar con el grupo marcador.
En la determinación de anticuerpos anti-HBc se usa
un formato de ensayo competitivo, en el cual los anticuerpos
anti-HBc presentes en la muestra compiten con un
anticuerpo anti-HBc marcado con digoxigenina por un
antígeno HBc inmovilizado. La cantidad de grupo marcador unido a la
superficie de ensayo es indirectamente proporcional a la
concentración de anticuerpos anti-HBc en la
muestra.
Para distinguirlas de zonas inertes de la fase
sólida, las superficies delimitadas de ensayo y de control pueden
llevar además un grupo marcador inespecífico del analito que pueda
detectarse junto con el grupo marcador específico del analito, sin
interferir con él. Como ejemplo cabe mencionar un grupo marcador
fluorescente que emita fluorescencia a una longitud de onda
distinta de la longitud de onda de fluorescencia de un grupo
marcador específico del analito. El grupo marcador inespecífico del
analito se inmoviliza preferiblemente - al igual que el receptor de
fase sólida - mediante un par fijador de gran afinidad, p.ej.
estreptavidina/biotina.
La fase sólida de la presente invención puede
usarse en cualquier procedimiento de detección, p.ej. en
inmunoensayos, en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, en
ensayos de azúcar-lectina y en procesos
análogos.
La propia fase sólida de la presente invención
permite detectar luego reacciones de interferencia, a fin de
obtener resultados de ensayo fiables cuando para ciertas muestras no
bastan las medidas de eliminación de perturbaciones conocidas del
estado técnico. Las superficies de control no solo permiten una
detección cualitativa de reacciones de interferencia, sino también,
en muchos casos, una corrección cuantitativa de la perturbación.
Para detectar diferentes perturbaciones, la fase
sólida puede comprender varias superficies de control, especialmente
distintas, con el fin de detectar diversos tipos de interferencias.
De este modo pueden abarcarse específicamente varios tipos de
perturbaciones. Se recomienda, sobre todo, aplicar una serie de
superficies de control que sean apropiadas para detectar
componentes perturbadores frecuentes o/y especialmente relevantes
para el ensayo correspondiente.
En general las perturbaciones de los procesos de
ensayo pueden surgir debido a interacciones no deseadas,
inespecíficas del analito, de sustancias en la superficie de ensayo
con componentes del medio detector. En este caso, como sustancias
de la superficie de ensayo hay que considerar especialmente los
componentes de la fase sólida, las partes del receptor de fase
sólida y otros reactivos presentes en la superficie de la fase
sólida. Los componentes perturbadores del medio detector proceden
sobre todo de la muestra (efecto matriz) y en algunos casos
producen la fijación inespecífica de reactivos de ensayo, p.ej. del
reactivo detector, a la fase sólida, y falsean la señal de
medición. Por lo tanto hay que tener en cuenta las interacciones
perturbadoras entre la superficie de ensayo y los componentes de la
muestra, reactivos de ensayo, productos de reacción o bien
complejos de componentes de la muestra con reactivos de ensayo.
La fase sólida de la presente invención
comprende preferiblemente superficies de control para detectar las
interferencias provocadas por una fijación no deseada de componentes
del medio detector al receptor de fase sólida específico del
analito. En las muestras hay a menudo componentes perturbadores
ajenos al analito, como por ejemplo anticuerpos o antígenos, que
tienden a una mayor unión inespecífica con el receptor de fase
sólida y por tanto a resultados de ensayo falsos. Por ello resulta
especialmente útil una superficie de control que incluya un
receptor de fase sólida no específico del analito y que sea
totalmente idéntico al receptor de fase sólida de las superficies
de ensayo, exceptuando la zona de fijación específica para el
analito.
Si el receptor de fase sólida es, por ejemplo,
un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, se emplea una superficie
de control que contenga un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo
inespecíficos de la misma especie, preferiblemente de la misma
clase y con mayor preferencia de la misma subclase, que el receptor
de fase sólida de la superficie de ensayo. Si el receptor de fase
sólida es por ejemplo un antígeno, p.ej. un péptido o un
polipéptido, se usa una superficie de control que lleve un antígeno
"mutado", diferenciado de un antígeno inmunológicamente
reactivo mediante variaciones, p.ej. modificación de un número lo
más pequeño posible de aminoácidos en la zona del epitopo
inmunogénico. Estas modificaciones de aminoácidos pueden ser
inserciones, deleciones y preferiblemente sustituciones de
aminoácidos naturales por otros amino-ácidos naturales o por
derivados de aminoácido no naturales, p.ej.
D-aminoácidos. Cuando el receptor de fase sólida es
por ejemplo un ácido nucleico, se usa una superficie de control que
lleve un ácido nucleico "mutado", diferenciado del ácido
nucleico inmovilizado en la superficie de ensayo por variaciones en
la secuencia de nucleótidos, por ejemplo mediante un intercambio de
bases en la secuencia responsable del reconocimiento de una ácido
nucleico diana, preferiblemente en su parte central. Con mayor
preferencia se usa una muteína del receptor de fase sólida que es
totalmente idéntica al anticuerpo de la fase sólida en las
superficies de ensayo, exceptuando el sitio de unión al antígeno
específico del analito.
También se prefiere que el receptor de fase
sólida aplicado sobre la superficie de control recorra las mismas
etapas de tratamiento, p.ej. modificaciones químicas, que el
receptor de fase sólida aplicado sobre la superficie de ensayo.
Así, por ejemplo, en un receptor de fase sólida biotinilado el
número de moléculas de biotina acopladas a dicho receptor debería
ser igual en la superficie de ensayo y en la superficie de control.
Además los receptores de fase sólida en las superficies de ensayo y
de control deberían haber seguido una química de acoplamiento
idéntica. También deberían emplearse los mismos conectores. Un
receptor de fase sólida apto para una superficie de control no debe
tener ninguna capacidad de fijación específica para el analito, pero
comprende preferiblemente todas las demás zonas y, por lo tanto,
los sitios de unión del receptor de fase sólida de la superficie de
ensayo. De este modo la unión inespecífica de componentes
perturbadores al respectivo receptor de fase sólida en las
superficies de ensayo y de control es básicamente idéntica, lo cual
permite efectuar una corrección cuantitativa del valor medido en la
superficie de ensayo mediante el valor medido en la superficie de
control.
Además la fase sólida incluye preferiblemente,
al menos, una superficie de control para la detección de
perturbaciones provocadas por la reacción de componentes de la
muestra, distintos del analito, con otros reactivos inmovilizados
en las superficies de ensayo. Así se captan, sobre todo, componentes
perturbadores que reaccionan específica o/y inespecíficamente con
componentes de la solución de carga empleada para aplicar el
receptor de fase sólida. Dicha superficie de control puede contener
por ejemplo reactivos de la solución de carga usados en un sistema
de ensayo, como tampones, reactivos de inmovilización como la
estreptavidina, sustancias biotiniladas como p.ej. marcadores
fluorescentes biotinilados, anticuerpos no específicos del analito,
etc., reactivos de bloqueo o conectores.
Los ensayos se alteran a menudo por factores
reumáticos. Por tanto es preferible aplicar sobre la fase sólida al
menos una superficie de control para detectar factores reumáticos.
La mayor parte de factores reumáticos son moléculas de IgM, con
menor frecuencia moléculas de IgG, IgA y IgE, que reaccionan con el
fragmento Fc de los anticuerpos y - si p.ej. presentan una reacción
cruzada con el anticuerpo inmovilizado sobre la superficie de
ensayo o/y con un anticuerpo detector soluble - perturban el ensayo,
p.ej. al reticular el anticuerpo unido a la fase sólida con un
anticuerpo detector marcado, obteniéndose una señal inespecífica
aumentada. Para una superficie de control correspondiente se aplica
sobre la fase sólida una molécula de IgG inespecífica,
preferiblemente el fragmento Fcy de una molécula de IgG humana.
Luego durante el ensayo el factor reumático se fija a la superficie
de ensayo, pero también a la superficie de control, indicando por
tanto la perturbación.
Otra perturbación que aparece con bastante
frecuencia es provocada por anticuerpos específicos de especies
ajenas presentes en la muestra, es decir, anticuerpos dirigidos
contra anticuerpos de especies extrañas, p.ej. anticuerpos humanos
anti-ratón (HAMA). Por consiguiente la fase sólida
de la presente invención también comprende preferiblemente, al
menos, una superficie de control para detectar la presencia de
anticuerpos específicos de especies ajenas. En un ensayo sandwich
de doble anticuerpo los componentes perturbadores específicos de
especies ajenas, p.ej. HAMA, causan por ejemplo una reticulación del
anticuerpo de la fase sólida con el anticuerpo detector y, por
tanto, una mayor señal inespecífica. Para una superficie de control
correspondiente se usa preferiblemente un anticuerpo inespecífico
de la misma especie que el anticuerpo de ensayo. Un componente
perturbador tipo HAMA ocasionalmente presente en la muestra se une
al anticuerpo aplicado sobre la superficie de control y señala la
reacción de interferencia.
Sobre una superficie de control, en lugar de un
receptor de fase sólida idéntico al reactivo detector de la
superficie de ensayo menos en la región de unión específica del
analito, también se puede aplicar el complejo formado durante la
reacción de detección, p.ej. anticuerpo de fase
sólida-analito-anticuerpo detector
(sin marcador), de manera que no se pueda producir ninguna reacción
específica, mientras los sitios de fijación inespecífica sean
prácticamente idénticos a los de la superficie de ensayo.
Además se conocen componentes perturbadores en
el suero, que se dirigen contra neo-epitopos de un
fragmento de anticuerpo. Estos neo-epitopos se
forman p.ej. durante la separación de un fragmento
F(ab')_{2} de una molécula de IgG. En este caso es
preferible prever una superficie de control que lleve un fragmento
de un anticuerpo inespecífico, preparado por el mismo método
(condiciones de separación y proteína separada) que el fragmento de
anticuerpo de la superficie de ensayo. Los componentes perturbadores
se fijan a dicho fragmento de anticuerpo inespecífico, con lo cual
pueden detectarse.
Asimismo cabe la posibilidad de captar los
componentes perturbadores ocasionalmente presentes en una muestra -
p.ej. anticuerpos perturbadores dirigidos contra reactivos de
inmovilización sobre superficies de ensayo como estreptavidina -
usando superficies de control idóneas. Entonces se aplica
estreptavidina (SA) sobre una superficie de control y se añade SA
marcada al reactivo detector. Si la muestra lleva anticuerpos
anti-SA se forma un complejo sandwich y el
anticuerpo se detecta específicamente.
Además la fase sólida según la presente
invención puede contener una superficie de control para detectar el
contenido total de IgE. Ese tipo de superficie de control se
recomienda especialmente para pruebas de alergia. Durante la
determinación específica de IgE, para el diagnóstico de las
alergias, la reacción de detección específica de una determinada
IgE es perturbada a menudo por muestras que tienen un gran contenido
total de IgE. Con la ayuda de una superficie de control sobre la
que se hayan aplicado anticuerpos anti-IgE puede
determinarse el contenido total de IgE paralelamente al proceso de
detección.
Por último también se pueden prever superficies
de control para detectar interferencias producidas por reacciones
de los componentes del medio detector con el receptor de fase
sólida. Para ello se aplican todos los componentes de la fase
sólida, como materiales soporte (p.ej. poliestireno),
plastificantes, grupos funcionales, etc., sobre una superficie de
control.
Asimismo en ciertos procesos de ensayo, p.ej. en
pruebas cualitativas o semicuantitativas de enfermedades
infecciosas, alergias, etc. se usan superficies de control para
calcular un valor límite. El valor "límite" se establece en
los procesos de ensayo para poder distinguir entre valores positivos
y negativos. Dicho valor "límite" es de especial importancia
en procesos de ensayo relacionados con enfermedades infecciosas. Por
un lado se puede emplear una superficie de control "negativo"
que contenga una solución de carga sin el reactivo de ensayo o una
muteína del mismo. La gran ventaja reside en que para cada muestra
se registra un valor de la fijación inespecífica, que es específico
de la muestra y por lo tanto se obtiene una mejor especificidad del
ensayo. De esta manera no hace falta realizar un control negativo
por separado.
La figura 2 representa el efecto de una
superficie de control empleada en un ensayo en el cual se utiliza
un valor límite. Cuando hay una gran cantidad de muestras, en la
realización convencional de un ensayo se obtiene cierto número de
resultados falsamente negativos y falsamente positivos (lado
izquierdo). Con el uso de superficies de control según la presente
invención (lado derecho) se puede conseguir una disminución
selectiva de las señales procedentes de muestras negativas, lo cual
reduce el valor límite. De esta forma se puede alcanzar una
diferenciación positivo/negativo con una probabilidad de error
considerablemente menor.
También se puede simular un control positivo
mediante una superficie de referencia que lleve el analito o un
reactivo análogo del analito. La gran ventaja reside en que la
combinación de una superficie de control negativo y una superficie
de referencia positiva permite determinar un valor límite específico
de la muestra para cada medición individual, con lo cual no hace
falta ninguna calibración indirecta y se consigue una mayor
especificidad del ensayo.
Naturalmente además de las superficies de
control preferidas, anteriormente citadas, se pueden prever otras
o/y más superficies de control según el modo de ejecución del
ensayo, a fin de detectar en una muestra componentes perturbadores
presentes o supuestos.
Las superficies de control previstas según la
presente invención no solo permiten un reconocimiento cualitativo
de las reacciones perturbadoras, sino también frecuentemente una
corrección cuantitativa de la perturbación. Seleccionando
adecuadamente las condiciones de ensayo se reproduce precisamente en
ciertas superficies de control la fijación inespecífica de
componentes distintos del analito, que tiene lugar en las
superficies de ensayo. Así se puede corregir fácilmente el valor
medido en una superficie de ensayo, obteniéndose un resultado
correcto y no falseado. Incluso en el caso de que la fijación
inespecífica no sea idéntica en la superficie de ensayo y en la
superficie de control, en los ensayos cualitativos se puede corregir
la señal de medición, pues aquí solo cabe distinguir entre
"positivo" o "negativo".
Otra ventaja es que con la fase sólida de la
presente invención se puede reconocer separadamente sin mucho
esfuerzo la presencia de varios componentes perturbadores y
determinar el tipo de interferencia. El usuario percibe
inmediatamente que el resultado puede ser falso debido a la
presencia de uno o más componentes perturbadores y entonces puede
corregir los resultados del ensayo con la ayuda de los datos
averiguados, repetir la medición con otro formato de ensayo o
someter la muestra a un tratamiento previo adecuado, p.ej. separando
los componentes perturbadores.
La fase sólida de la presente invención se puede
emplear para detectar un analito en una muestra, p.ej. en un
líquido corporal como sangre, suero, plasma, saliva, etc.
Preferentemente se usan fases sólidas con varias superficies de
ensayo, es decir sistemas matriciales, para detectar simultáneamente
varios analitos. En dichos sistemas matriciales se usa
preferentemente, como mínimo, una superficie de control para cada
superficie de ensayo. Las fases sólidas de la presente invención se
pueden emplear en todos los procesos heterogéneos de ensayo
conocidos, sobre todo en inmunoensayos y en ensayos de hibridación
de ácidos nucleicos.
Otro objetivo de la presente invención es por
tanto un proceso para detectar un analito mediante la fijación
específica del analito a un receptor de la fase sólida, detectando
además interferencias causadas por fijaciones inespecíficas a la
superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito
mediante el uso de una fase sólida con al menos una superficie de
ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio
de unión al receptor específico del analito, y además la fase sólida
incluye al menos una superficie de control delimitada para detectar
interferencias causadas por fijaciones inespecíficas a la superficie
de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito, de manera
que la superficie de control es parte de la superficie de ensayo y
lleva reactivos de la solución de carga, pero no posee el sitio de
unión al receptor específico del analito. El método de la presente
invención comprende preferiblemente el uso de superficies de
control para la corrección cuantitativa de las perturbaciones.
Por último la presente invención también se
refiere al uso de superficies de control en un proceso para detectar
un analito y reconocer al mismo tiempo interferencias, es decir el
uso de superficies de control delimitadas para reconocer
perturbaciones causadas por componentes ajenos al analito en un
proceso para detectar un analito por fijación específica del
analito a un sitio de unión al receptor, específico del analito, de
un receptor de fase sólida en una superficie de ensayo delimitada,
de modo que la superficie de control forma parte de la superficie
de ensayo y lleva reactivos de la solución de carga, pero no posee
el sitio de unión al receptor específico del analito.
La presente invención se explica más
detalladamente con las siguientes figuras y ejemplos, que
representan:
figura 1: un ejemplo de un sistema matricial
miniaturizado ("Microspot") que permite determinar
simultáneamente 3 parámetros sobre una fase sólida mediante el uso
de un grupo marcador universal;
figura 2: mejora de la especificidad en formatos
de ensayo para los cuales se determina un valor límite, con el uso
de superficies de control según la presente invención, y
figura 3: un esquema de una fase sólida según la
presente invención para la determinación de antígeno HBs, que
además de la superficie de ensayo (<HBsAg>) contiene varias
superficies de control (<CK-MB>, <TNT> y
<TSH>).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Sobre una superficie de ensayo de aprox. 100
\mum - dispuesta sobre un soporte de poliestireno - se aplica un
anticuerpo monoclonal anti-HBsAg. Aplicando varias
veces la misma solución de reactivo se puede efectuar una
determinación múltiple por cada pipeteo de muestra, sin esfuerzo
adicional durante la ejecución del ensayo. Sobre la superficie de
ensayo se pipetean 30 \mul de muestra prediluida con tampón de
muestra y se incuba 20 minutos, agitando a temperatura ambiente.
Tras aspirar la muestra y lavar el área de ensayo con tampón de
lavado se agregan con pipeta 30 \mul de solución de reactivo 1 con
anticuerpo anti-HBsAg marcado con digoxigenina
(Dig) y se incuba de nuevo 20 minutos, agitando a temperatura
ambiente. Después de aspirar la solución de reactivo 1 y lavar el
área de ensayo con tampón de lavado se pipetean 30 \mul de
solución de reactivo 2 con reactivo detector sobre el área de
ensayo. Como reactivo detector se usan partículas de látex de 100
nm de tamaño, teñidas con colorante fluorescente y recubiertas
covalentemente con un anticuerpo anti-Dig. Este
reactivo de detección se incuba otra vez 20 minutos, agitando a
temperatura ambiente, y después se aspira, se lava y se aspira
hasta sequedad. El área de ensayo se irradia con un láser de
He-Ne de 633 nm de longitud de onda, y se mide la
fluorescencia a una longitud de onda de 670 nm con una cámara CCD.
En el centro de la figura 1 se muestra esquemáticamente este
formato de ensayo.
En el ensayo se usaron los siguientes reactivos
específicos:
- Anticuerpo en fase sólida:
- conjugado anticuerpo monoclonal de ratón anti-HBsAg-1 (fragmento Fab'2)-biotina 1:1 subtipo IgG1
- Anticuerpo de detección:
- conjugado anticuerpo monoclonal de ratón anti-HBsAg-2 IgG-Dig 1:10
\newpage
Se midieron los siguientes valores
(recuento):
Cuando el valor límite es > 1 el ensayo es
positivo; cuando es < 1 el ensayo es negativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para detectar interferencias de HAMA, además de
anticuerpos específicos de HBsAg se aplicaron otros anticuerpos
monoclonales inespecíficos (ACMs) (véase figura 3). Aquí se
utilizaron anticuerpos contra la creatincinasa-MB
(<CK-MB>), la troponina T (<TNT>) y la
hormona estimulante del tiroides (<TSH>) en forma de
conjugados Fab'2- o Fab'-biotina. Debido al hecho de
que los anticuerpos humanos anti- ratón provocan en la muestra una
reticulación del ACM inespecífico unido a la fase sólida y del
anticuerpo detector específico, se puede detectar la llamada
interferencia HAMA. La finalidad del ensayo era encontrar el ACM
óptimo para la detección de HAMA. Las mediciones del panel de
HBsAg/control se efectuaron con 6 muestras diferentes de HAMA. Para
ello no se agregó ningún reactivo eliminador de interferencia HAMA
al tampón de muestra o bien se le añadieron 100 \mug/ml de dicho
reactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este resultado demuestra que el ensayo de HBsAg
se ve fuertemente perturbado por 5 de las 6 muestras de HAMA y da
un resultado positivo falso. La presencia de manchas de control
permite indicar claramente la interferencia. Para ello el ACM de
TSH es el más apropiado, porque presenta el mismo fragmento de
disociación (Fab'2), la misma estequiometría de biotina e idéntica
química de acoplamiento. En cambio ambos ACMs con fragmentos Fab'
reaccionan peor que el ACM de HBsAg con las muestras perturbadoras
de HAMA y por tanto son menos adecuados para identificar todas las
interferencias HAMA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con la adición de una cantidad tan elevada de
reactivo eliminador de interferencia, de 100 \mug/ml, que
encarecería el ensayo para su uso rutinario, se pueden eliminar
interferencias en 5 de las 6 muestras de HAMA. Sin embargo persiste
el problema con la muestra de HAMA 6, en la cual, a pesar de la
elevada concentración de reactivo, no se pueden eliminar las
interferencias. Con la ayuda de ambas manchas de control se puede
indicar claramente la interferencia de HAMA aún existente. Como la
fijación inespecífica en la mancha de control de TSH corresponde a
la fijación inespecífica en la mancha específica de control de
HBsAg, la señal específica se puede corregir mediante la señal de
la mancha de control. Con esta corrección también esta muestra
resulta claramente negativa y mejora notablemente la especificidad.
Por tanto, con la ayuda de las manchas de control y la mejora de la
especificidad se pueden rebajar las concentraciones de proteína
eliminadora de interferencias en el tampón de la muestra, lo cual
permite reducir claramente los costes del proceso.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Es generalmente sabido que los diversos efectos
matriz pueden provocar fijaciones inespecíficas del reactivo
detector en los ensayos de fijación. La aplicación de manchas de
control, que contra los efectos matriz tienen un comportamiento
comparable al de la mancha específica del ensayo, permite indicar
dichos efectos matriz y, dado el caso, corregirlos, lo cual, por
tanto, mejora mucho la especificidad.
\newpage
En la prueba siguiente se midió de nuevo un
ensayo de HBsAg con distintas muestras negativas de HBsAg, escogidas
por sus aparentes efectos matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Al medir las 9 muestras aparentemente negativas
2 dieron resultados positivos falsos. Corrigiendo los valores de
medición con la ayuda de la mancha de control, todas las muestras se
ponen a cero y por tanto son claramente negativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para detectar una interferencia por factores
reumáticos, además de los anticuerpos específicos de HBsAg se
aplicaron otros ACMs del subtipo IgG1. Como los factores reumáticos
reaccionan con el fragmento Fc de anticuerpos se puede producir una
reticulación de los ACMs específicos del ensayo unidos a la fase
sólida y del anticuerpo detector específico, dando así una reacción
falsamente positiva. El objeto del ensayo era encontrar el ACM
óptimo para la detección de los factores reumáticos. Por este motivo
se aplicaron diferentes ACMs de la subclase IgG1. Este panel de
HBsAg/control se midió con un control negativo, 3 controles
positivos distintos, 4 muestras negativas normales y 5 muestras
negativas con factores reumáticos crecientes (FR
1-5). El respectivo contenido de controles
positivos en HBsAg y el contenido de factores reumáticos se expresa
en U/ml. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Este ejemplo demuestra claramente que las
muestras negativas cuya concentración de factores reumáticos >
1000 U/ml interfieren claramente en el ensayo de HBsAg y dan un
resultado positivo falso. De las 3 superficies de control con ACM 2
simulan la interferencia del ensayo de HBsAg y también dan
claramente reacciones positivas con los 3 sueros reumáticos de
mayor título. Así se reconoce en seguida la interferencia del
ensayo, evitando un resultado falsamente positivo. El ACM más
adecuado para señalar la interferencia por factor reumático es el
"2".
Claims (20)
1. Método de detección de un analito mediante su
fijación específica a un receptor de fase sólida, revelando además
las interferencias ocasionadas por fijaciones inespecíficas a la
superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al analito
mediante el uso de una fase sólida con, al menos, una superficie de
ensayo delimitada que lleva un receptor de fase sólida con un sitio
de unión al receptor específico del analito, de modo que la fase
sólida incluye asimismo, al menos, una superficie de control
delimitada, para detectar interferencias causadas por fijaciones
inespecíficas a la superficie de ensayo de componentes perturbadores
ajenos al analito, y el receptor de fase sólida con el sitio de
unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el
empleo de una solución de carga y la superficie de control forma
parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución
de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del
analito.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque las superficies de control se usan para
la corrección cuantitativa de interferencias.
3. Uso de superficies de control delimitadas
para detectar interferencias causadas por componentes perturbadores
ajenos al analito en un proceso de detección de un analito mediante
su fijación específica a un sitio de unión al receptor, específico
del analito, de un receptor de fase sólida en una superficie de
ensayo delimitada, de modo que el receptor de fase sólida con el
sitio de unión al receptor específico del analito ha sido aplicado
con el empleo de una solución de carga y la superficie de control
forma parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la
solución de carga, pero no el sitio de unión al receptor específico
del analito.
4. Fase sólida con al menos una superficie de
ensayo delimitada, que contiene un receptor de fase sólida para
detectar un analito en una muestra por fijación específica del mismo
a un sitio de unión al receptor, específico del analito, del
receptor de fase sólida, caracterizado porque además incluye,
al menos, una superficie de control delimitada para detectar
interferencias producidas por fijaciones inespecíficas a la
superficie de ensayo de componentes perturbadores ajenos al
analito, de modo que el receptor de fase sólida con el sitio de
unión al receptor específico del analito ha sido aplicado con el
empleo de una solución de carga y la superficie de control forma
parte de la superficie de ensayo y lleva reactivos de la solución de
carga, pero no el sitio de unión al receptor específico del
analito.
5. Fase sólida según la reivindicación 4,
caracterizada porque lleva varias superficies de ensayo para
la detección simultánea de varios analitos en una muestra.
6. Fase sólida según una de las reivindicaciones
4 o 5, caracterizada porque lleva al menos una superficie de
control para detectar interferencias producidas por una fijación, no
específica del analito, de componentes del medio detector a la
superficie de ensayo.
7. Fase sólida según una de las reivindicaciones
anteriores 4 a 6, caracterizada porque comprende al menos
una superficie de control para detectar interferencias producidas
por una fijación, no específica del analito, de componentes del
medio detector al receptor de fase sólida sobre una superficie de
ensayo.
8. Fase sólida según la reivindicación 6 o 7,
caracterizada porque comprende al menos una superficie de
control para detectar interferencias producidas por una fijación,
no específica del analito, de componentes del medio detector a
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, antígenos o/y ácidos
nucleicos inmovilizados sobre una superficie de
ensayo.
ensayo.
9. Fase sólida según la reivindicación 7 u 8,
caracterizada porque la superficie de control lleva un
receptor de fase sólida modificado que difiere de un receptor de
fase sólida sobre una superficie de ensayo por la falta de un sitio
de unión específico del analito.
10. Fase sólida según la reivindicación 7, 8 o
9, caracterizada porque lleva al menos una superficie de
control para detectar interferencias causadas por factores
reumáticos.
11. Fase sólida según la reivindicación 7, 8 o
9, caracterizada porque lleva al menos una superficie de
control para detectar interferencias causadas por anticuerpos
específicos de especies extrañas.
12. Fase sólida según una de las
reivindicaciones anteriores 4 a 11, caracterizada porque
lleva al menos una superficie de control para detectar
interferencias causadas por la fijación inespecífica de componentes
del medio detector a sustancias no específicas del analito sobre el
soporte de fase sólida.
13. Fase sólida según la reivindicación 12,
caracterizada porque incluye al menos una superficie de
ensayo con estreptavidina y al menos una superficie de control para
detectar interferencias causadas por componentes fijadores de
estreptavidina no específicos del analito.
14. Fase sólida según la reivindicación 6,
caracterizada porque lleva al menos una superficie de control
para detectar el contenido total de IgE.
15. Fase sólida según una de las
reivindicaciones 4 a 14, caracterizada porque además lleva,
al menos, una superficie de referencia positiva con el analito a
determinar.
16. Fase sólida según una de las
reivindicaciones 4 a 15, caracterizada porque las superficies
de ensayo y las superficies de control tienen un diámetro de 10
\mum hasta 1 cm.
17. Uso de una fase sólida según una de las
reivindicaciones 1 a 16 para detectar un analito en una muestra.
18. Uso según la reivindicación 17,
caracterizado porque la fase sólida comprende varias
superficies de ensayo para la detección simultánea de varios
analitos.
19. Uso según la reivindicación 17 o 18 en un
inmunoensayo.
20. Uso según la reivindicación 17 o 18 en un
ensayo de hibridación de ácidos nucleicos.
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