ES2252881T3

ES2252881T3 - Produccion de fases solidas de contorno nitido para pruebas de fijacion.

Info

Publication number: ES2252881T3
Application number: ES99103135T
Authority: ES
Inventors: Hans Dr. Hornauer
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: EP1380839A1; EP0939319B8; EP0939319A3; EP0939319A2; EP1380839B1; ES2340369T3; ATE462971T1; DE19806989A1; DE59915146D1; ATE311597T1; DE59912844D1; EP0939319B1; JPH11316225A; JP4173240B2

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA COLOCAR UN REVESTIMIENTO MULTIESTRATIFICADO SOBRE UN SOPORTE SOLIDO NO POROSO, UN PROCEDIMIENTO PARA EVITAR LA FUSION DE FASES SOLIDAS ESPACIALMENTE DEFINIDAS, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA DISMINUIR LA UNION INESPECIFICA EN UNA FASE SOLIDA RECUBIERTA.

Description

Producción de fases sólidas de contorno nítido para pruebas de fijación.

La presente invención se refiere a un método para aplicar un recubrimiento de varias capas sobre un soporte sólido no poroso, así como a fases sólidas preparadas con el método de la presente invención.

Las pruebas de fijación para determinar analitos, como por ejemplo inmunoanálisis, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, etc., se efectúan a gran escala. La detección de un analito mediante pruebas de fijación puede realizarse con un ensayo de tipo heterogéneo, poniendo en contacto una fase líquida con una fase sólida. La fase sólida comprende superficies de ensayo con moléculas de receptor, a las cuales es capaz de unirse el analito. A continuación se comprueba la fijación del analito, p.ej. mediante un marcaje.

Para que la determinación cualitativa o cuantitativa de un analito resulte fiable es necesario que las superficies de ensayo de las pruebas de fijación puedan prepararse de modo reproducible y con cantidades de moléculas receptoras exactamente definidas. Los diferentes tamaños de las superficies de ensayo, la falta de nitidez de sus bordes, el ensuciamiento de las moléculas receptoras, la distinta densidad de receptor en las superficies de ensayo y los sitios de fijación inespecíficos dan lugar a diferencias en la intensidad de la señal detectada y por tanto a imprecisiones en la evaluación de los resultados de ensayo.

Estos problemas tienen mayor repercusión cuanto menor sea la fase sólida y las superficies de ensayo que se hallan sobre ellas. Cuando hay superficies de ensayo individuales cercanas entre sí, con diferentes moléculas de receptor para la detección de distintos analitos, la falta de nitidez de los bordes de dichas superficies o/y el ensuciamiento de las moléculas receptoras puede causar la contaminación de superficies específicas de ensayo con moléculas de receptor dirigidas contra otro analito y por tanto dar falsos resultados. Este problema es especialmente grave en el caso de análisis cualitativos para la detección de enfermedades infecciosas. Así p.ej., una prueba falsamente positiva por ensuciamiento de las moléculas receptoras en un ensayo de HIV tiene serias consecuencias.

Muchos formatos de ensayo se basan en el uso de soportes porosos, como por ejemplo discos de papel u otros materiales porosos. Para dichos formatos de ensayo - como los que se describen en las patentes EP-A-0 427 984 y EP-A-0 063 810 por ejemplo - se forma una capa de receptor sobre un material poroso, aplicando sobre él moléculas receptoras en solución, que son absorbidas por el soporte. La absorción de esta solución produce sobre todo una ampliación de la superficie recubierta, que depende de la microestructura local del material soporte. Por tanto, con este método resulta difícil preparar superficies de ensayo uniformes y reproducibles, sobre todo para formatos de ensayo miniaturizados. Además en estos formatos de ensayo miniaturizados, a base de materiales soporte porosos, la evaluación es difícil. Dado que las superficies de los materiales soporte porosos no son planas ni uniformes, en la mayoría de los casos solo puede lograrse una resolución óptica limitada de las superficies de ensayo.

Por consiguiente, se intentó el empleo de un material soporte con una superficie no porosa, en lugar de material poroso. La patente US-PS-4,591,570 describe un dispositivo de inmunoensayos para determinar simultáneamente diversos antígenos mediante una colección de anticuerpos, usando vidrio o plástico como soporte. Con el empleo de este material soporte se puede reducir claramente el tamaño global del formato de ensayo y, por lo tanto, la cantidad necesaria de muestras. De todos modos, en las superficies no porosas, sobre todo en los procesos de ensayo miniaturizados, también hay el problema de ensuciamiento de las moléculas receptoras. El ensuciamiento puede ser debido a una atomización incontrolada de la solución de recubrimiento, es decir, un incremento de superficie cuyo contorno queda uniforme. Además también puede producirse una delicuescencia incontrolada de la disolución de recubrimiento aplicada, lo cual da lugar a un contorno irregular. Por último, el ensuciamiento puede causar un desplazamiento de moléculas receptoras fuera de la superficie humectada con la disolución de recubrimiento.

Además, muchas de las moléculas receptoras normalmente utilizadas, por ejemplo de receptores de bajo peso molecular, se adsorben mal o de manera poco reproducible sobre soportes sólidos con superficies no porosas. Asimismo, muchas soluciones acuosas de moléculas receptoras - como las que se aplican habitualmente sobre fases sólidas - contienen un detergente para su estabilización, lo cual impide, al menos en parte, la adsorción de las moléculas receptoras sobre soportes sólidos con superficies no porosas.

Para mejorar la capacidad de fijación de las moléculas receptoras a superficies no porosas se pueden aplicar recubrimientos de varias capas. Pero estos recubrimientos también presentan diferencias de tamaño y falta de nitidez de bordes entre cada una de las superficies de ensayo, lo cual ocasiona grandes problemas durante la valoración, sobre todo en caso de formatos de ensayo miniaturizados.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención era proporcionar un método que permitiera obtener superficies de ensayo de contornos nítidos para pruebas de fijación.

Este objetivo se alcanza, según la presente invención, mediante un método para aplicar un recubrimiento de varias capas sobre un soporte sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:

(a): aplicación de un recubrimiento previo sobre una zona reactiva del soporte sólido,

(b): lavado del soporte provisto del recubrimiento previo con un líquido acuoso que tiene una concentración de sustancias tampón \leq 250 mmoles, y

(c): aplicación de un segundo recubrimiento - en forma de microgotitas que llevan moléculas receptoras capaces de unirse al recubrimiento previo - sobre el soporte con el recubrimiento previo, en forma de superficies delimitadas sobre la zona reactiva.

Conforme a la presente invención, el soporte sólido no poroso se trata primero con un recubrimiento previo, que se puede aplicar totalmente o también por puntos sobre una parte o sobre toda la superficie de una zona reactiva del soporte sólido. El recubrimiento previo se aplica preferentemente a toda la superficie. El recubrimiento previo suele aplicarse sobre el soporte en forma de solución acuosa y puede constar de cualquier tipo de moléculas que permitan la fijación de un segundo recubrimiento. El recubrimiento previo comprende preferentemente un primer componente de un par de ligandos muy afines, p.ej. estreptavidina, avidina o biotina, así como análogos, derivados y conjugados de dichas sustancias, o bien anticuerpos, como p.ej. un anticuerpo anti-ratón. Pero como recubrimiento previo también se pueden aplicar moléculas previstas para un enlace covalente con el segundo recubrimiento, por ejemplo moléculas que contienen un grupo amino, sulfuro o sililo.

Cuando se aplican moléculas de receptor en disolución acuosa formando gotitas sobre el recubrimiento previo, éstas se difunden desde la solución hacia el recubrimiento previo y se fijan al mismo. Sin embargo, se comprobó que las gotitas aplicadas se desvían, variando el contorno y el tamaño de las superficies de los puntos. De ahí resultan diferencias en la densidad de receptor en cada una de las superficies de ensayo y por lo tanto diferencias en la intensidad de la señal, que pueden falsear los resultados.

Sorprendentemente se comprobó que la introducción de la etapa (b) del método, es decir el lavado del soporte provisto del recubrimiento previo con un líquido acuoso, permite conseguir puntos de ensayo uniformes y reproducibles. El lavado del soporte previamente recubierto se puede efectuar con agua pura; preferentemente se usa un tampón de poca fuerza iónica. El líquido acuoso o la solución de lavado del soporte previamente recubierto puede llevar sustancias tampón, detergentes o/y otros aditivos. Como sustancias tampón se pueden emplear básicamente todas aquellas que son usuales o conocidas del especialista. La concentración de las sustancias tampón en la solución de lavado es \leq 250 mM, con preferencia \leq 100 mM y con mayor preferencia \leq 40 mM. Los mejores resultados para el funcionamiento de la solución de lavado según la presente invención se obtienen cuando la concentración de la sustancia tampón es \leq 10 mM, con preferencia \leq 5 mM y con mayor preferencia \leq 2 mM. En la tabla 1 se indican algunas sustancias tampón, así como sus intervalos de concentración preferidos (c_{1}), especialmente preferidos (c_{2}) y más preferidos (c_{3}).

TABLA 1

Sustancia tampón	c_{1} [mM]	c_{2} [mM]	c_{3} [mM]
Fosfato	\leq 40	\leq 5	\leq 2
Carbonato	\leq 40	\leq 5	\leq 2
Mes/Tris	\leq 100	\leq 10	\leq 5
Hepes/Tris	\leq 100	\leq 10	\leq 5

Para seguir optimizando el método de la presente invención, según el tipo de interacción con que las moléculas del receptor se fijan sobre el recubrimiento previo cabe la posibilidad de elegir un tampón que garantice unas condiciones de reacción óptimas. Por ejemplo, para un recubrimiento previo con estreptavidina es óptimo un intervalo de pH de 5 hasta 9.

Según la presente invención también se pueden usar combinaciones tampón que lleven un componente volátil, como por ejemplo ácido acético o ácido fórmico. No obstante, al secarse los restos de tampón, dichas combinaciones pueden provocar grandes oscilaciones de pH en el recubrimiento previo, ya que un componente del tampón se evapora mientras que el otro permanece en la superficie. Por lo tanto se prefieren combinaciones tampón, formadas exclusivamente por componentes volátiles o exclusivamente por componentes no volátiles.

Además o en lugar de sustancias tampón, la solución de lavado empleada de acuerdo con la presente invención también puede contener un detergente. La adición de detergente a la solución de lavado favorece su eliminación del recubrimiento previo, sin dejar apenas residuos. La concentración de detergente en la solución de lavado es preferentemente \leq 0,05% en volumen (respecto al volumen total), especialmente \leq 0,02% (vol-vol), con mayor preferencia \leq 0,01% (vol-vol) y sobre todo \leq 0,005% (vol-vol). Los mejores resultados se consiguen cuando la concentración del detergente en la solución de lavado es \leq 0,003% (vol-vol), con mayor preferencia \leq 0,002% (vol-vol) y sobre todo \leq 0,001% (vol-vol). En la tabla 2 se indican las concentraciones preferidas (c_{1}), particularmente preferidas (c_{2}) y más preferidas (c_{3}) de algunos detergentes preferidos.

TABLA 2

Detergente	c_{1} [% (vol-vol)]	c_{2} [% (vol-vol)]	c_{3} [% (vol-vol)]
Tween 20	\leq 0,01	\leq 0,005	\leq 0,003
n-octilglucósido	\leq 0,02	\leq 0,01	\leq 0,003
Chaps	\leq 0,01	\leq 0,005	\leq 0,003
Brj 35	\leq 0,005	\leq 0,002	\leq 0,001

Básicamente, todos los detergentes son adecuados para conseguir una eliminación de la solución de lavado sin dejar restos. Con unas pocas pruebas previas el especialista puede averiguar la idoneidad de un determinado detergente para un formato de ensayo determinado en función del tipo de recubrimiento y de condiciones técnicas marginales, como por ejemplo el formato del soporte del reactivo, el dispositivo de absorción empleado, etc. Sobre todo hay que procurar que el detergente no provoque, o solo en menor medida, el corrimiento de un líquido aplicado posteriormente. Por tal motivo, al usar por ejemplo el detergente SDS hay que tener especial cuidado, sobre todo en cuanto a la concentración empleada.

La solución de lavado empleada según la presente invención también puede contener otros aditivos que influyan ventajosamente en la ejecución del método. Sobre todo se pueden utilizar aditivos que tengan un efecto estabilizante sobre el recubrimiento previo, lo cual permite una separación temporal en el proceso de preparación, entre el recubrimiento previo del soporte reactivo y la aplicación del recubrimiento específico para cada ensayo de fijación. Como ejemplos de tales aditivos cabe citar los azúcares, las sales y los reactivos bloqueantes. En la tabla 3 se representan las concentraciones preferidas (c_{1}), especialmente preferidas (c_{2}) y mayormente preferidas (c_{3}) de estas sustancias.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

Sustancia	c_{1} [% (peso-vol)]	c_{2} [% (peso-vol)]	c_{3} [% (peso-vol)]
Azúcares	\leq 0,5	\leq 0,1	\leq 0,05
Sales	\leq 0,5	\leq 0,1	\leq 0,05
Reactivosbloqueantes	\leq 0,2	\leq 0,02	\leq 0,005

Los azúcares preferidos son los de bajo peso molecular, \leq 1000, con especial preferencia \leq 500, como, por ejemplo, la sacarosa. Se prefieren, sobre todo, los azúcares oligoméricos con una, dos o tres unidades de azúcar.

Como sales se utilizan preferentemente aquellas que no tienden a cristalizar durante el secado, como por ejemplo el tartrato disódico dihidratado.

Como reactivos bloqueantes se utilizan preferentemente proteínas de bajo peso molecular, por ejemplo peptona.

La concentración de cada una de estas sustancias en la solución de lavado puede ajustarse según los requisitos específicos del ensayo, como, por ejemplo, tipo de recubrimiento, tamaño del formato de ensayo, etc. Así, por ejemplo, en caso de soportes de reactivo con una superficie de reacción relativamente grande (de diámetro > 1 cm) se usa preferentemente agua pura o una solución de lavado con concentraciones relativamente pequeñas de las sustancias arriba citadas (tampón, detergente, aditivos especiales), para lograr una aspiración lo más libre posible de residuos.

De modo preferente, el líquido acuoso se encauza sobre el recubrimiento previo y luego se elimina totalmente, p.ej. aspirando, de manera que el recubrimiento previo quede seco. Preferentemente se emplea un recubrimiento previo que tenga propiedades hidrófobas.

Sobre el recubrimiento previo lavado se aplica después un segundo recubrimiento, que comprende moléculas de receptor capaces de unirse al recubrimiento previo, en forma de superficies delimitadas sobre la zona reactiva. Las moléculas de receptor contienen preferentemente el segundo componente del par de ligandos, el cual puede desencadenar una interacción de gran afinidad, p.ej. una reacción inmunológica, una interacción estreptavidina/avidina o similar, o incluso un enlace covalente con el primer componente del par de ligandos aplicado como recubrimiento previo. Así, por ejemplo, se puede aplicar estreptavidina o avidina como recubrimiento previo y luego la molécula receptora puede contener cierta proporción de biotina. De manera preferente, la fijación de la molécula receptora al recubrimiento previo tiene lugar mediante interacciones de elevada afinidad, con una constante de equilibrio K_{M} \geq 10^{8} l/mol. Aplicando el segundo recubrimiento sobre el recubrimiento previo lavado se obtienen superficies de ensayo cuyo contorno y tamaño es uniforme y reproducible.

Este efecto se ilustra además con las figuras adjuntas, en las que

Figura 1 muestra unas superficies de ensayo miniaturizadas, preparadas de manera convencional sin la etapa de lavado,

Figura 2 muestra unas superficies de ensayo miniaturizadas, preparadas según el método de la presente invención, y

Figura 3 ilustra el efecto de la etapa de lavado, de manera que en la figura 3a se muestra un tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática no recubierto, lleno de agua (un tubito de poliestireno sin recubrir); en la figura 3b se muestra un tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática recubierto con estreptavidina, lleno de agua (un tubito de poliestireno recubierto con estreptavidina, de Boehringer Mannheim, nº de pedido 1144553, "Enzymun-Test Streptavidin Tube"); y en la figura 3c se muestra un tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática recubierto con estreptavidina y luego lavado y secado, el cual se llenó de agua.

Una comparación entre las superficies de ensayo mostradas en las figuras 1 y 2 demuestra claramente la ventaja conseguida con la etapa de lavado, es decir, que sobre una zona reactiva se pueden obtener unas superficies de ensayo con un contorno uniforme y reproducible.

Si se llena de agua un tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática no recubierto, tal como muestra la figura 3a, se forma una interfase agua-aire completamente horizontal, lo cual demuestra poca humectación de la pared con agua. Si en cambio se llena con agua un tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática previamente recubierto con estreptavidina, resulta una interfase agua-aire muy curvada, tal como muestra la figura 3b. El recubrimiento previo produce una humectación elevada de la pared. Si se llena un tubito de ensayo que primero se recubrió con estreptavidina, luego se lavó intensamente con un líquido acuoso y a continuación se secó, resulta otra vez una interfase agua-aire horizontal, tal como muestra la figura 3c. Tras la etapa de lavado el recubrimiento previo presenta propiedades hidrófobas y por tanto una baja humectación de la pared con agua.

Como soporte sólido no poroso se puede emplear según la presente invención cualquier material sólido no poroso. Preferentemente el soporte es de metal, de vidrio o de plástico, sobre todo de poliestireno.

El segundo recubrimiento se aplica, preferentemente, en forma de superficies delimitadas, con un diámetro de 10 \mum a 10 mm. Como que el método de la presente invención es especialmente adecuado para preparar formatos de ensayo miniaturizados, el segundo recubrimiento se aplica, preferentemente, en forma de superficies delimitadas, con un diámetro de 10 \mum hasta 500 \mum, con especial preferencia de 20 \mum a 200 \mum. El segundo recubrimiento se puede aplicar según procedimientos conocidos. Por conveniencia se aplica en disolución acuosa, formando gotitas microscópicas de volumen comprendido entre 0,00001 y 1 \mul, p.ej. mediante pulverización. Según la presente invención también cabe la posibilidad de recubrir recipientes de reacción más grandes, como p.ej. placas de microvaloración o cubetas.

El recubrimiento previo se aplica preferentemente sobre toda la zona reactiva del soporte sólido y luego, sobre dicho recubrimiento, se aplica el segundo en forma de superficies de ensayo delimitadas. También cabe la posibilidad de aplicar el recubrimiento previo en forma de puntos, pero esto resulta más costoso, porque luego el segundo recubrimiento tiene que posicionarse exactamente sobre las áreas prerrecubiertas.

La reproducibilidad del método de la presente invención permite preparar sistemas que contienen varias superficies de ensayo iguales o distintas, especialmente en forma miniaturizada, con lo cual tanto la cantidad de analito requerido como los tiempos de análisis pueden reducirse mucho. Por lo tanto es preferible aplicar varias áreas delimitadas del segundo recubrimiento sobre un soporte. Todas las áreas pueden tener las mismas moléculas receptoras. En tal caso puede analizarse simultáneamente un gran número de muestras diferentes sobre un mismo soporte de ensayo. Cuando al menos dos de las áreas llevan moléculas receptoras distintas, en una muestra pueden determinarse paralelamente varios analitos. En estos sistemas es muy importante conseguir unas áreas de ensayo de contornos muy nítidos y evitar cualquier ensuciamiento de las moléculas receptoras. Solo así puede asegurarse que el analito deseado sea capaz de unirse realmente a un área de ensayo específica y que la contaminación de superficies contiguas con moléculas receptoras de otras áreas de ensayo no falsee los resultados.

Otro objeto de la presente invención es una fase sólida que se pueda preparar según el método anteriormente descrito, incluyendo un recubrimiento previo sobre un soporte sólido y un segundo recubrimiento unido al primero, formando múltiples áreas circulares bien delimitadas, y que se caracteriza porque el segundo recubrimiento comprende moléculas receptoras fijadas sobre el recubrimiento previo y porque el diámetro de las áreas del segundo recubrimiento es de 10 \mum hasta 10 mm y de superficie a superficie varía menos de un 10%, preferentemente menos de un 5% y, sobre todo, menos de un 2,5%. Esta fase sólida se emplea con especial preferencia en un sistema de ensayo miniaturizado, donde el diámetro de las superficies de ensayo es de 10 a 500 \mum, preferentemente de 20 a 200 \mum.

\newpage

Asimismo, la presente invención incluye el uso de dicha fase sólida para detectar uno o varios analitos, sobre todo en pruebas de fijación, como por ejemplo un inmunoensayo, un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, etc.

Otro objeto de la presente invención es un método para mejorar la uniformidad de las áreas delimitadas del recubrimiento sobre un soporte sólido y concretamente no poroso, que comprende las siguientes etapas:

(b): lavado del soporte, provisto del recubrimiento previo, con un líquido acuoso que lleva sustancias tampón a una concentración de \leq 250 mmol, y

(c): aplicación de un segundo recubrimiento en forma de gotitas microscópicas, capaces de unirse al recubrimiento previo, sobre el soporte provisto del recubrimiento previo, formando áreas bien delimitadas sobre la zona reactiva.

La presente invención se ilustra asimismo mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de puntos sobre una superficie recubierta con estreptavidina

Las superficies de ensayo se trataron con una solución de recubrimiento que contenía un compuesto macromolecular de RSA-estreptavidina con un tamaño de partícula de aproximadamente 100 nm. Transcurrido un tiempo de reacción de 15 minutos, la solución de recubrimiento se aspiró y las superficies de ensayo se bloquearon con una solución formada por 0,05% de NaCl, 0,2% de sacarosa y 0,05% de RSA. Para las superficies de ensayo mostradas en la fig. 1 solamente se aspiró hasta sequedad tras un tiempo de incubación de 5 minutos, mientras que para las superficies de ensayo mostradas en la fig. 2 se llevó a cabo una etapa de lavado según la presente invención, empleando un medio acuoso, y luego se aspiró hasta sequedad.

Ejemplo 2

En 5 l de agua se disuelven 3,7 g de Tris (tris(hidroximetil)-aminometano) y 4,75 g de MES (ácido 2-morfolino-etanosulfónico). A través de un recipiente de reacción con un volumen nominal de 50 \mul, dotado de un recubrimiento previo, se pasan 5 ml de dicho tampón de lavado. A continuación, el recipiente de reacción se aspira hasta sequedad mediante una o varias agujas de succión. Con la aplicación de un segundo recubrimiento sobre el recubrimiento previo lavado y secado se obtienen superficies de ensayo bien delimitadas, como, por ejemplo, las representadas en la
figura 2.

Ejemplo 3

Sobre un soporte sólido se aplica un recubrimiento previo de estreptavidina y sobre el mismo se aplica una solución de recubrimiento con anticuerpos monobiotinilados, formando pequeñas gotitas. Una vez secadas, se vierte por encima una solución que lleva 3 mg/ml de biotina en K_{2}HPO_{4} 50 mM. A los pocos segundos se elimina la solución de biotina y se aplica una solución con 1% de RSA (albúmina de suero de bovino) y 2% de sacarosa, que también se elimina después de unos segundos. A continuación se seca el sistema. De esta manera se obtienen fases sólidas de contornos muy nítidos, sin desplazamiento de las moléculas receptoras fuera de la superficie de reacción deseada.

Ejemplo 4 Recubrimiento previo de estreptavidina

En primer lugar se aplica una macromolécula biotinilada (p.ej. RSA térmicamente aglomerada), a una concentración de 100 \mug/ml en PBS, sobre un soporte de poliestireno de 50 \mul de volumen nominal y se incuba durante 5 minutos. Después se aspira y se añade una solución de estreptavidina de 100 \mug/ml de concentración en PBS. Tras los 5 minutos de incubación se lleva a cabo una etapa de lavado, seguida de un secado por aspiración.

En un tampón de Mes 5 mM, Tris 5 mM, 1% de sacarosa y 0,5 mg/ml de RSA se disuelven varias sondas de captura de ADN biotinilado (de 18 bases) a una concentración de 1 \muM. Luego se aplican gotitas de unos 150 pl de volumen, alineadas sobre un soporte de poliestireno. Tras un tiempo de aproximadamente 5 segundos de incubación y de aproximadamente 60 segundos de secado se añade una solución formada por 3 mg/ml de biotina en fosfato dipotásico 50 mM y se incuba durante 2 segundos. A continuación, se aspira y se agrega una solución bloqueante formada por 1% de RSA y 2% de sacarosa; después se aspira y se seca.

Ejemplo 5 Recubrimiento previo con anticuerpos anti-ratón

Se disuelven PAK < F_{c\gamma} de ratón > S IgG - a una concentración de 30 \mug/ml - en un tampón que lleva fosfato potásico 40 mM a pH 7,4 en cloruro sódico al 0,9%. Esta disolución se aplica sobre un recipiente de reacción de 50 \mul de volumen nominal. Tras 15 minutos de incubación y subsiguiente aspiración se añade una solución bloqueante formada por 1% de RSA y 2% de sacarosa. Tras 5 minutos de incubación tiene lugar una etapa de lavado según la presente invención y luego se aspira hasta sequedad.

En un tampón que lleva Mes 5 mM, Tris 5 mM, 1% de sacarosa y 0,5 mg/ml de RSA se disuelve una proteína de fusión (F_{c\gamma} de ratón + CD28) a una concentración de 100 \mug/ml. Sobre el soporte de poliestireno recubierto del modo antes descrito se aplican gotitas de 150 pl de volumen y se incuba durante unos 5 segundos. Tras unos 60 segundos de secado se añade una solución bloqueante formada por un tampón de fosfato potásico 50 mM a pH 7,4, 100 \mug/ml de IgG de ratón y 1 mg/ml de RSA. Después de 10 segundos de incubación se aspira y se añade una solución bloqueante de 1% de RSA y 2% de sacarosa. Después se aspira y se seca.

Ejemplo 6 Superficies de ensayo para anticuerpos anti-rubéola

Sobre un soporte de poliestireno de 50 \mul de volumen nominal se aplica una macromolécula biotinilada (p.ej. RSA térmicamente aglomerada), a una concentración de 100 \mug/ml en PBS, se incuba durante 5 minutos y se aspira. Luego se añade una solución de estreptavidina de 100 \mug/ml de concentración en PBS. Tras los 5 minutos de incubación se lleva a cabo una etapa de lavado, según la presente invención, seguida de un secado por aspiración.

En un tampón de Mes 5 mM, Tris 5 mM, 1% de sacarosa y 0,5 mg/ml de RSA se disuelve un anticuerpo anti-rubéola biotinilado a una concentración de 50 \mug/ml. Sobre el soporte recubierto del modo anteriormente descrito se aplican gotitas de unos 150 pl de volumen. Después se incuba durante unos 5 s y se seca durante unos 60 s. A continuación se añade una disolución formada por 3 mg/ml de biotina en fosfato dipotásico 50 mM, se incuba durante 2 segundos y se aspira. Después se agrega una solución formada por 0,1% de Tween 20, 1% de RSA, 3 U/ml de lisado vírico (virus de la rubéola) en PBS, se incuba durante 20 minutos y luego se aspira. A continuación se añade una solución bloqueante formada por 1% de RSA y 2% de sacarosa, se aspira y se seca.

Claims

1. Método para aplicar un recubrimiento de varias capas sobre un soporte sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo recubrimiento se aplica en forma de superficies de contorno bien delimitado, con un diámetro de 10 \mum a 10 mm.

3. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el soporte sólido se recubre previamente con un primer componente de un par específico de ligandos y porque la molécula receptora incluye el segundo componente.

4. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se aplican varias superficies delimitadas sobre un soporte, de tal modo, que al menos dos de ellas presentan moléculas receptoras distintas.

5. Fase sólida que puede obtenerse mediante un método según una de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo un recubrimiento previo sobre un soporte sólido no poroso y un segundo recubrimiento, unido con el recubrimiento previo, en forma de varias superficies circulares bien delimitadas,

caracterizada porque el segundo recubrimiento lleva moléculas receptoras unidas al recubrimiento previo, porque el diámetro de las superficies del segundo recubrimiento es de 10 \mum hasta 10 mm y varía menos del 10% de superficie a superficie.

6. Empleo de una fase sólida según la reivindicación 5 para detectar uno o varios analitos.

7. Método para mejorar la uniformidad de las áreas delimitadas del recubrimiento sobre un soporte sólido y no poroso, que comprende las siguientes etapas:

(c): aplicación de un segundo recubrimiento en forma de gotitas microscópicas - capaz de unirse al recubrimiento previo - sobre un soporte previamente recubierto, en forma de áreas bien delimitadas sobre la zona reactiva.