ES2340369T3 - Produccion de fases solidas de contorno nitido para pruebas de fijacion. - Google Patents
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Abstract
Método para aplicar superficies espacialmente delimitadas, que contienen moléculas receptoras, sobre un soporte sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas: (a) aplicación de una solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, sobre áreas limitadas del soporte sólido prefijadas, (b) fijación de las moléculas receptoras en las áreas espacialmente delimitadas, (c) secado de la disolución de recubrimiento y (d) aplicación de una solución de recarga -añadiendo a la solución de recubrimiento un retardante de la elución elegido entre sacáridos, polivinilpirrolidona, dextrano, gelatina o derivados de celulosa - que contiene una sustancia bloqueante.
Description
Producción de fases sólidas de contorno nítido
para pruebas de fijación.
La presente invención se refiere a un método
para aplicar un recubrimiento de varias capas sobre un soporte
sólido no poroso, a un método para evitar el ensuciamiento de fases
sólidas espacialmente definidas, a un método para reducir la unión
inespecífica a una fase sólida recubierta con estreptavidina o
avidina, así como a fases sólidas preparadas con el método de la
presente invención.
Las pruebas de fijación para determinar
analitos, como por ejemplo inmunoanálisis, ensayos de hibridación
de ácidos nucleicos, etc., se efectúan a gran escala. La detección
de un analito mediante pruebas de fijación puede realizarse con un
ensayo de tipo heterogéneo, poniendo en contacto una fase líquida
con una fase sólida. La fase sólida comprende superficies de ensayo
con moléculas de receptor, a las cuales es capaz de unirse el
analito. A continuación se comprueba la fijación del analito, p.ej.
mediante un marcaje.
Para que la determinación cualitativa o
cuantitativa de un analito resulte fiable es necesario que las
superficies de ensayo de las pruebas de fijación puedan prepararse
de modo reproducible y con cantidades de moléculas receptoras
exactamente definidas. Los diferentes tamaños de las superficies de
ensayo, la falta de nitidez de sus bordes, el ensuciamiento de las
moléculas receptoras, la distinta densidad de receptor en las
superficies de ensayo y los sitios de fijación inespecíficos dan
lugar a diferencias de intensidad de la señal detectada y por tanto
a imprecisiones en la evaluación de los resultados de ensayo.
Estos problemas tienen mayor repercusión cuanto
menor sea la fase sólida y las superficies de ensayo que se hallan
sobre ellas. Cuando hay superficies de ensayo individuales cercanas
entre sí, con diferentes moléculas de receptor para la detección de
distintos analitos, la falta de nitidez de los bordes de dichas
superficies o/y el ensuciamiento de las moléculas receptoras puede
causar la contaminación de superficies específicas de ensayo con
moléculas de receptor dirigidas contra otro analito y por tanto dar
falsos resultados. Este problema es especialmente grave en el caso
de análisis cualitativos para la detección de enfermedades
infecciosas. Así p.ej., una prueba falsamente positiva por
ensuciamiento de las moléculas receptoras en un ensayo de HIV tiene
serias consecuencias.
Muchos formatos de ensayo se basan en el uso de
soportes porosos, como por ejemplo discos de papel u otros
materiales porosos. Para dichos formatos de ensayo - como los que se
describen en las patentes EP-A-0 427
984 y EP-A-0 063 810 por ejemplo -
se forma una capa de receptor sobre un material poroso, aplicando
sobre él moléculas receptoras en solución, que son absorbidas por
el soporte. La absorción de esta solución produce sobre todo una
ampliación de la superficie recubierta, que depende de la
microestructura local del material soporte. Por tanto, con este
método resulta difícil preparar superficies de ensayo uniformes y
reproducibles, sobre todo para formatos de ensayo miniaturizados.
Además en estos formatos de ensayo miniaturizados, a base de
materiales soporte porosos, la evaluación es difícil. Dado que las
superficies de los materiales soporte porosos no son planas ni
uniformes, en la mayoría de los casos solo puede lograrse una
resolución óptica limitada de las superficies de ensayo.
Por consiguiente, se intentó el empleo de un
material soporte con una superficie no porosa, en lugar de material
poroso. La patente US-PS-4,5 91,570
describe un dispositivo de inmunoensayos para determinar
simultáneamente diversos antígenos mediante una colección de
anticuerpos, usando vidrio o plástico como soporte. Con el empleo
de este material soporte se puede reducir claramente el tamaño
global del formato de ensayo y, por lo tanto, la cantidad necesaria
de muestras. De todos modos, en las superficies no porosas, sobre
todo en los procesos de ensayo miniaturizados, también hay el
problema de ensuciamiento de las moléculas receptoras. El
ensuciamiento puede ser debido a una atomización incontrolada de la
solución de recubrimiento, es decir, un incremento de superficie
cuyo contorno queda uniforme. Además también puede producirse un
corrimiento incontrolado de la disolución de recubrimiento
aplicada, lo cual genera un contorno irregular. Por último, el
ensuciamiento puede causar un desplazamiento de moléculas
receptoras fuera de la superficie humectada con la disolución de
recubrimiento.
Además Pirrung y otros, Bioconjugate Chemistry,
7(3), 1996, 317-321, describen un método por
el cual se fija BSA con un grupo nitrobencilo eliminable mediante
luz. Después de fijar BSA a un soporte de vidrio, se puede eliminar
por irradiación en determinadas zonas, que luego quedan libres para
una fijación de avidina. La subsiguiente adición de una molécula
biotinilada permite una unión ortoespecífica de la molécula.
Delamarche y otros, J. Am. Soc., 120, 1998,
500-508, describen la organización, función y
fijación de un dispositivo de reactantes químicos espacialmente
delimitado sobre un substrato mediante una red microfluida. En
general las redes microfluidas trabajan con cantidades de líquidos
del orden de \mul, que por tanto son adecuadas para aquellas
aplicaciones en que se dispone de pequeñas cantidades de
reactantes.
Sundarababu y otros, Photochemistry and
Photobiology 61(6), 1995, 540-544, describen
el revestimiento de chips de silicio con anticuerpos, mediante un
acoplamiento inducido por luz.
Ansari y otros, Journal of Immunological
Methods, 84, 1985, 117-124, describen el
recubrimiento de placas microtítulo de poliestireno con anticuerpos
y estudian el efecto de diversas condiciones de almacenamiento de
las placas sobre la estabilidad y la fijación de los
anticuerpos.
Además, muchas de las moléculas receptoras
normalmente empleadas, por ejemplo los receptores de bajo peso
molecular, se adsorben mal o de manera poco reproducible sobre
soportes sólidos con superficies no porosas. Asimismo, muchas
soluciones acuosas de moléculas receptoras - como las que se emplean
habitualmente para aplicar moléculas receptoras sobre fases sólidas
- contienen un detergente para su estabilización, lo cual impide,
al menos en parte, la adsorción de las moléculas receptoras sobre
soportes sólidos con superficies no porosas.
Para mejorar la capacidad de fijación de las
moléculas receptoras a superficies no porosas se pueden aplicar
recubrimientos de varias capas. Pero estos recubrimientos también
presentan diferencias de tamaño y falta de nitidez de bordes entre
cada una de las superficies de ensayo, lo cual ocasiona grandes
problemas durante la valoración, sobre todo en caso de formatos de
ensayo miniaturizados.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención era proporcionar un método que permitiera obtener
superficies de ensayo de contornos nítidos para pruebas de
fijación.
Este objetivo se logra según la presente
invención con un método para aplicar superficies espacialmente
delimitadas, que contienen moléculas receptoras, sobre un soporte
sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- aplicación de una solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, sobre áreas limitadas del soporte sólido prefijadas,
- (b)
- fijación de las moléculas receptoras en las áreas espacialmente delimitadas,
- (c)
- secado de la disolución de recubrimiento y
- (d)
- aplicación de una solución de recarga -añadiendo a la solución de recubrimiento un retardante de la elución elegido entre sacáridos, polivinilpirrolidona, dextrano, gelatina o derivados de celulosa - que contiene una sustancia bloqueante. Además el método según la presente invención puede incluir un recubrimiento previo que consta de las siguientes etapas:
- (a')
- aplicación de un recubrimiento previo sobre un área de reactivo del soporte sólido,
- (b')
- lavado del soporte prerrecubierto con un líquido acuoso y
- (c')
- aplicación de un segundo recubrimiento que contiene moléculas receptoras capaces de unirse al soporte prerrecubierto en forma de superficies espacialmente delimitadas sobre el área reactiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a la presente invención, el soporte
sólido no poroso se trata primero con un recubrimiento previo, que
se puede aplicar totalmente o también por puntos sobre una parte o
sobre toda la superficie de una zona reactiva del soporte sólido.
El recubrimiento previo se aplica preferentemente a toda la
superficie. El recubrimiento previo suele aplicarse sobre el
soporte en forma de solución acuosa y puede constar de cualquier
tipo de moléculas que permitan la fijación de un segundo
recubrimiento. El recubrimiento previo comprende preferentemente un
primer componente de un par de ligandos muy afines, p.ej.
estreptavidina, avidina o biotina, así como análogos, derivados y
conjugados de dichas sustancias, o bien anticuerpos, como p.ej. un
anticuerpo anti-ratón. Pero como recubrimiento
previo también se pueden aplicar moléculas previstas para un enlace
covalente con el segundo recubrimiento, por ejemplo moléculas que
contienen un grupo amino, sulfuro o sililo.
Cuando se aplican moléculas de receptor en
disolución acuosa formando gotitas sobre el recubrimiento previo,
éstas se difunden desde la solución hacia el recubrimiento previo y
se fijan al mismo. Sin embargo, se comprobó que las gotitas
aplicadas se desvían, variando el contorno y el tamaño de las
superficies de los puntos. De ahí resultan diferencias en la
densidad de receptor en cada una de las superficies de ensayo y por
lo tanto diferencias en la intensidad de la señal, que pueden
falsear los resultados.
Sorprendentemente se comprobó que la
introducción de la etapa (b') del método, es decir lavado del
soporte provisto del recubrimiento previo con un líquido acuoso,
permite conseguir puntos de ensayo uniformes y reproducibles. El
lavado del soporte previamente recubierto se puede efectuar con agua
pura; preferentemente se usa un tampón de poca fuerza iónica. El
líquido acuoso o la solución de lavado del soporte previamente
recubierto puede llevar sustancias tampón, detergentes o/y otros
aditivos. Como sustancias tampón se pueden emplear básicamente
todas aquellas que son usuales o conocidas del especialista. La
concentración de las sustancias tampón en la solución de lavado es
\leq 250 mM, con preferencia \leq 100 mM y con mayor preferencia
\leq 40 mM. Los mejores resultados para el funcionamiento de la
solución de lavado según la presente invención se obtienen cuando
la concentración de la sustancia tampón es \leq 10 mM, con
preferencia \leq 5 mM y con mayor preferencia \leq 2 mM. En la
tabla 1 se indican algunas sustancias tampón, así como sus
intervalos de concentración preferidos (c_{1}), especialmente
preferidos (c_{2}) y más preferidos (c_{3}).
Para seguir optimizando el método de la presente
invención, según el tipo de interacción con que las moléculas del
receptor se fijan sobre el recubrimiento previo cabe la posibilidad
de elegir un tampón que garantice unas condiciones de reacción
óptimas. Por ejemplo, para un recubrimiento previo con
estreptavidina es óptimo un intervalo de pH de 5 hasta 9.
Según la presente invención también se pueden
usar combinaciones tampón que lleven un componente volátil, como
por ejemplo ácido acético o ácido fórmico. No obstante, al secarse
los restos de tampón, dichas combinaciones pueden provocar grandes
oscilaciones de pH en el recubrimiento previo, ya que un componente
del tampón se evapora mientras que el otro permanece en la
superficie. Por lo tanto se prefieren combinaciones tampón, formadas
exclusivamente por componentes volátiles o exclusivamente por
componentes no volátiles.
Además o en lugar de sustancias tampón, la
solución de lavado empleada de acuerdo con la presente invención
también puede contener un detergente. La adición de detergente a la
solución de lavado favorece su eliminación del recubrimiento
previo, sin dejar apenas residuos. La concentración de detergente en
la solución de lavado es preferentemente \leq 0,05% en volumen
(respecto al volumen total), especialmente \leq 0,02%
(vol-vol), con mayor preferencia \leq 0,01%
(vol-vol) y sobre todo \leq 0,005%
(vol-vol). Los mejores resultados se consiguen
cuando la concentración del detergente en la solución de lavado es
\leq 0,003% (vol-vol), con mayor preferencia
\leq 0,002% (vol-vol) y sobre todo \leq 0,001%
(vol-vol). En la tabla 2 se indican las
concentraciones preferidas (c_{1}), particularmente preferidas
(c_{2}) y más preferidas (c_{3}) de algunos detergentes
preferidos.
Básicamente, todos los detergentes son adecuados
para conseguir una eliminación de la solución de lavado sin dejar
restos. Con unas pocas pruebas previas el especialista puede
averiguar la idoneidad de un determinado detergente para un formato
de ensayo determinado en función del tipo de recubrimiento y de
condiciones técnicas marginales, como por ejemplo el formato del
soporte del reactivo, el dispositivo de absorción empleado, etc.
Sobre todo hay que procurar que el detergente no provoque, o solo en
menor medida, el corrimiento de un líquido aplicado posteriormente.
Por tal motivo, al usar por ejemplo el detergente SDS hay que tener
especial cuidado, sobre todo en cuanto a la concentración
empleada.
La solución de lavado empleada según la presente
invención también puede contener otros aditivos que influyan
ventajosamente en la ejecución del método. Sobre todo se pueden
utilizar aditivos que tengan un efecto estabilizante sobre el
recubrimiento previo, lo cual permite una separación temporal en el
proceso de preparación, entre el recubrimiento previo del soporte
reactivo y la aplicación del recubrimiento específico para cada
ensayo de fijación. Como ejemplos de tales aditivos cabe citar los
azúcares, las sales y los reactivos bloqueantes. En la tabla 3 se
representan las concentraciones preferidas (c_{1}), especialmente
preferidas (c_{2}) y mayormente preferidas (c_{3}) de estas
sustancias.
Los azúcares preferidos son los de bajo peso
molecular, \leq 1000, con especial preferencia \leq 500, como,
por ejemplo, la sacarosa. Se prefieren, sobre todo, los azúcares
oligoméricos con una, dos o tres unidades de azúcar.
Como sales se utilizan preferentemente aquellas
que no tienden a cristalizar durante el secado, como por ejemplo el
tartrato disódico dihidratado.
Como reactivos bloqueantes se utilizan
preferentemente proteínas de bajo peso molecular, por ejemplo
peptona.
La concentración de cada una de estas sustancias
en la solución de lavado puede ajustarse según los requisitos
específicos del ensayo, como, por ejemplo, tipo de recubrimiento,
tamaño del formato de ensayo, etc. Así, por ejemplo, en caso de
soportes de reactivo con una superficie de reacción relativamente
grande (de diámetro > 1 cm) se usa preferentemente agua pura o
una solución de lavado con concentraciones relativamente pequeñas
de las sustancias arriba citadas (tampón, detergente, aditivos
especiales), para lograr una aspiración lo más libre posible de
residuos.
De modo preferente, el líquido acuoso se encauza
sobre el recubrimiento previo y luego se elimina totalmente, p.ej.
aspirando, de manera que el recubrimiento previo quede seco.
Preferentemente se emplea un recubrimiento previo que tenga
propiedades hidrófobas.
Sobre el recubrimiento previo lavado se aplica
después un segundo recubrimiento que comprende moléculas de
receptor capaces de unirse al recubrimiento previo, en forma de
superficies delimitadas sobre la zona reactiva. Las moléculas de
receptor contienen preferentemente el segundo componente del par de
ligandos, el cual puede desencadenar una interacción de gran
afinidad, p.ej. una reacción inmunológica, una interacción
estreptavidina/avidina o similar, o incluso un enlace covalente con
el primer componente del par de ligandos aplicado como recubrimiento
previo. Así, por ejemplo, se puede aplicar estreptavidina o avidina
como recubrimiento previo y luego la molécula receptora puede
contener cierta proporción de biotina. De manera preferente, la
fijación de la molécula receptora al recubrimiento previo tiene
lugar mediante interacciones de elevada afinidad, con una constante
de equilibrio K_{M} \geq 10^{8} l/mol. Aplicando el segundo
recubrimiento sobre el recubrimiento previo lavado se obtienen
superficies de ensayo cuyo contorno y tamaño es uniforme y
reproducible.
Este efecto se ilustra además con las figuras
adjuntas, en las que
Figura 1 muestra unas superficies de ensayo
miniaturizadas, preparadas de manera convencional sin la etapa de
lavado,
Figura 2 muestra unas superficies de ensayo
miniaturizadas, preparadas según el método de la presente invención,
y
Figura 3 ilustra el efecto de la etapa de
lavado, de manera que en la figura 3a se muestra un tubito de ensayo
de inmunoabsorción enzimática no recubierto, lleno de agua (un
tubito de poliestireno sin recubrir); en la figura 3b se muestra un
tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática recubierto con
estreptavidina, lleno de agua (un tubito de poliestireno recubierto
con estreptavidina, de Boehringer Mannheim, nº de pedido 1144553,
"Enzymun-Test Streptavidin Tube"); y en la
figura 3c un tubito de ensayo de inmunoabsorción enzimática
recubierto con estreptavidina y luego lavado y secado, el cual se
llenó de agua.
Una comparación entre las superficies de ensayo
mostradas en las figuras 1 y 2 demuestra claramente la ventaja
conseguida con la etapa de lavado, es decir, que sobre una zona
reactiva se pueden obtener unas superficies de ensayo con un
contorno uniforme y reproducible.
Si se llena de agua un tubito de ensayo de
inmunoabsorción enzimática no recubierto, tal como muestra la figura
3a, se forma una interfase agua-aire completamente
horizontal, lo cual demuestra poca humectación de la pared con
agua. Si en cambio se llena con agua un tubito de ensayo de
inmunoabsorción enzimática previamente recubierto con
estreptavidina, resulta una interfase agua-aire muy
curvada, tal como muestra la figura 3b. El recubrimiento previo
produce una humectación elevada de la pared. Si se llena un tubito
de ensayo que primero se recubrió con estreptavidina, luego se lavó
intensamente con un líquido acuoso y a continuación se secó, resulta
otra vez una interfase agua-aire horizontal, tal
como muestra la figura 3c. Tras la etapa de lavado el recubrimiento
previo presenta propiedades hidrófobas y por tanto una baja
humectación de la pared con agua.
Como soporte sólido no poroso se puede emplear
según la presente invención cualquier material sólido no poroso.
Preferentemente el soporte es de metal, de vidrio o de plástico,
sobre todo de poliestireno.
El segundo recubrimiento se aplica,
preferentemente, en forma de superficies delimitadas, con un
diámetro de 10 \mum a 10 mm. Como el método de la presente
invención es especialmente adecuado para preparar formatos de
ensayo miniaturizados, el segundo recubrimiento se aplica,
preferentemente, en forma de superficies delimitadas, con un
diámetro de 10 \mum hasta 500 \mum, con especial preferencia de
20 \mum a 200 \mum. El segundo recubrimiento se puede aplicar
según procedimientos conocidos. Por conveniencia se aplica en
disolución acuosa, formando gotitas microscópicas de volumen
comprendido entre 0,00001 y 1 \mul, p.ej. mediante pulverización.
Según la presente invención también cabe la posibilidad de recubrir
recipientes de reacción más grandes, como p.ej. placas de
microvaloración o cubetas.
El recubrimiento previo se aplica
preferentemente sobre toda la zona reactiva del soporte sólido y
luego, sobre dicho recubrimiento, se aplica el segundo en forma de
superficies de ensayo delimitadas. También cabe la posibilidad de
aplicar el recubrimiento previo en forma de puntos, pero esto
resulta más costoso, porque luego el segundo recubrimiento tiene
que posicionarse exactamente sobre las áreas prerrecubiertas.
También cabe la posibilidad de aplicar la
solución de recubrimiento que contiene las moléculas receptoras
directamente sobre el soporte sólido no poroso.
La reproducibilidad del método de la presente
invención permite preparar sistemas que contienen varias superficies
de ensayo iguales o distintas, especialmente en forma
miniaturizada, con lo cual tanto la cantidad de analito requerido
como los tiempos de análisis pueden reducirse mucho. Por lo tanto es
preferible aplicar varias áreas delimitadas del segundo
recubrimiento sobre un soporte. Todas las áreas pueden tener las
mismas moléculas receptoras. En tal caso puede analizarse
simultáneamente un gran número de muestras diferentes sobre un mismo
soporte de ensayo. Cuando al menos dos de las áreas llevan
moléculas receptoras distintas, en una muestra pueden determinarse
paralelamente varios analitos. En estos sistemas es muy importante
conseguir unas áreas de ensayo de contornos muy nítidos y evitar
cualquier ensuciamiento de las moléculas receptoras. Solo así puede
asegurarse que el analito deseado sea capaz de unirse realmente a un
área de ensayo específica y que la contaminación de superficies
contiguas con moléculas receptoras de otras áreas de ensayo no
falsee los resultados.
Otro objeto de la presente invención es una fase
sólida que se puede preparar según el método anteriormente
descrito, incluyendo opcionalmente un recubrimiento previo sobre un
soporte sólido y un segundo recubrimiento unido al primero, en
forma de múltiples áreas circulares bien delimitadas, la cual se
caracteriza porque el segundo recubrimiento contiene moléculas
receptoras fijadas sobre el recubrimiento previo y porque el
diámetro de las áreas del segundo recubrimiento es de 10 \mum
hasta 10 mm y de superficie a superficie varía menos de un 10%,
preferentemente menos de un 5% y, sobre todo, menos de un 2,5%. Esta
fase sólida se emplea con especial preferencia en un sistema de
ensayo miniaturizado, donde el diámetro de las superficies de ensayo
es de 10 a 500 \mum, preferentemente de 20 a 200 \mum.
Asimismo, la presente invención incluye el uso
de dicha fase sólida para detectar uno o varios analitos, sobre
todo en pruebas de fijación, como por ejemplo un inmunoensayo, un
ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, etc.
También se revela un método para mejorar la
uniformidad de las áreas delimitadas del recubrimiento sobre un
soporte sólido y concretamente no poroso, que incluye las siguientes
etapas:
- (a)
- aplicación de un recubrimiento previo sobre una zona reactiva del soporte sólido,
- (b)
- lavado del soporte, provisto del recubrimiento previo, con un líquido acuoso y
- (c)
- aplicación de un segundo recubrimiento capaz de unirse al recubrimiento previo, sobre el soporte provisto del recubrimiento previo formado por áreas definidas sobre la zona reactiva.
Un problema que se presenta con frecuencia al
preparar o/y usar fases sólidas para ensayos de fijación es el
ensuciamiento con moléculas receptoras fuera de las superficies
espacialmente delimitadas, previstas para ellas, cuando se aplica
una solución de recarga.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere por tanto a un método para evitar el ensuciamiento de fases
sólidas espacialmente delimitadas, impidiendo que moléculas
receptoras eluidas de las fases sólidas espacialmente delimitadas
se fijen de nuevo al aplicar una solución de recarga, que comprende
las siguientes etapas:
- (a)
- aplicación de una solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, sobre determinadas áreas prefijadas del soporte sólido,
- (b)
- fijación de las moléculas receptoras en las áreas espacialmente delimitadas,
- (c)
- secado de la solución de recubrimiento y
- (d)
- aplicación de una solución de recarga - añadiendo a la solución de recubrimiento un retardante de elución elegido entre sacáridos, polivinilpirrolidona, dextrano, gelatina o derivados de celulosa - que contiene una sustancia bloqueante.
También se revela un método para evitar el
ensuciamiento de fases sólidas espacialmente delimitadas - creadas
mediante la aplicación de una solución de recubrimiento que contiene
moléculas receptoras sobre determinadas áreas prefijadas de un
soporte sólido y seguidamente de una solución de recarga - que
incluye al menos una de las siguientes medidas:
- (a)
- aplicación de la solución de recubrimiento de modo que tenga lugar una fijación básicamente cuantitativa de las moléculas receptoras dentro de las superficies delimitadas y prefijadas o/y
- (b)
- Bloqueo de una nueva fijación de moléculas receptoras eluidas de las superficies fijas delimitadas mediante la aplicación de una solución de postratamiento.
Sorprendentemente se encontró que empleando al
menos una de estas medidas se puede evitar el ensuciamiento de
fases sólidas espacialmente delimitadas, con lo cual se obtienen
unas superficies de ensayo nítidas, de contornos y tamaños
reproducibles. Este método puede usarse tanto para recubrimientos
monocapa como para recubrimientos multicapa.
En general las moléculas receptoras se aplican
mediante solución acuosa, en forma de gotitas, sobre un soporte
sólido que dado el caso puede estar prerrecubierto. Partiendo de la
solución, las moléculas receptoras se difunden luego sobre el
soporte sólido o el recubrimiento previo y se fijan al mismo. Esta
fijación puede ser una interacción de gran afinidad, por ejemplo
una reacción inmunológica o una interacción
estreptavidina/avidina-biotina o una unión
covalente. En los sistemas de fase sólida convencionales del estado
técnico los procesos posteriores a la aplicación del recubrimiento,
p.ej. durante la realización de un ensayo de determinación de un
analito o durante la aplicación de una solución de recarga,
producen una elución de la fase sólida de moléculas no fijadas o
insuficientemente unidas.
Una fase sólida específicamente recubierta se
trata normalmente con una solución de recarga, cuya misión consiste
en bloquear sitios de unión inespecíficos y en estabilizar las
moléculas receptoras frente a factores externos. Esto es
conveniente porque las superficies de ensayo del área reactiva de
una fase sólida no siempre están cubiertas al 100%. Las zonas
libres del soporte o del recubrimiento previo constituyen, sin
embargo, sitios de unión inespecíficos a los cuales pueden fijarse
otros componentes de la muestra, en lugar del analito deseado.
En la mayoría de los casos un recubrimiento con
moléculas receptoras también lleva una pequeña proporción de
moléculas dañadas, a las que pueden fijarse inespecíficamente los
demás componentes de la muestra, aparte del analito deseado. Con la
aplicación de una solución de recarga - que lleva, por ejemplo,
proteínas inertes - se bloquean estos sitios, impidiendo luego la
adición de componentes de la muestra durante el análisis. Además,
una solución de recarga también sirve a menudo para estabilizar las
moléculas receptoras o el recubrimiento frente a factores externos
como la temperatura o la humedad. En muchas formas de ejecución de
sistemas analíticos - como p.ej. placas de microvaloración o tubos
ES - hay procesos en que la solución de recarga tiene funciones
tanto de bloqueo como de estabilización.
Aunque el uso de una solución de recarga es
necesaria para muchos formatos de ensayo, a menudo es causa de
ensuciamiento de las moléculas receptoras aplicadas anteriormente.
La aplicación de la solución de recarga provoca la elución de
moléculas receptoras no fijadas o insuficientemente unidas. Luego
estas moléculas receptoras eluidas se pueden fijar de manera no
deseada a cualquier sitio aún accesible del soporte sólido o del
recubrimiento previo, ensuciando fases sólidas espacialmente
delimitadas con anterioridad, ya que las moléculas receptoras
también pueden adicionarse fuera de la aplicación primaria. Este
ensuciamiento es un gran inconveniente, sobre todo cuando en un
soporte hay aplicadas varias superficies espacialmente delimitadas
que llevan cada una moléculas receptoras distintas. La elución de
moléculas receptoras y su fijación a otros sitios de la fase sólida
puede ocasionar una mezcla de receptores en las áreas de ensayo, de
modo que sea imposible tener un resultado de análisis claro. Este
problema aparece sobre todo en formatos de ensayo miniaturizados. En
ensayos donde no se usa ninguna solución de recarga también surgen
los mismos problemas, como muy tarde en el momento de aplicar una
solución de muestra.
Ahora se ha visto sorprendentemente que el
ensuciamiento de las fases sólidas espacialmente delimitadas puede
evitarse aplicando una solución de recubrimiento, de manera que
tenga lugar una fijación sustancialmente cuantitativa de las
moléculas receptoras dentro de zonas predeterminadas. Gracias a una
fijación de casi el 100% de las moléculas receptoras se puede
evitar su elución. Preferiblemente se fija más del 90%, con especial
preferencia más del 95% y sobre todo más del 99% de moléculas
receptoras. La fijación sustancialmente cuantitativa de las
moléculas receptoras se realiza con preferencia usando una solución
de recubrimiento que tiene una concentración de moléculas
receptoras menor que la concentración límite necesaria para cubrir
la zona prefijada. Si la solución de recubrimiento lleva menos
moléculas receptoras que las que se pueden fijar a la superficie de
ensayo, todas las moléculas receptoras aplicadas se unen a dicha
superficie y no queda ninguna sin fijar o insuficientemente fijada,
que luego pueda ser eluida, por ejemplo, por una solución de
recarga. En la tabla 4 figuran las concentraciones límite de varias
moléculas receptoras.
Preferiblemente se utiliza una solución de
recubrimiento cuya concentración de moléculas receptoras es inferior
a la concentración límite, con preferencia inferior al 50% y sobre
todo inferior al 25% de la concentración límite.
Asimismo se prefiere usar moléculas receptoras
de fuerte fijación, por ejemplo anticuerpos reticulados, en lugar
de anticuerpos monoméricos. Concretamente, con la reticulación de
anticuerpos para dar polímeros con un peso molecular > 1,2
millones de Dalton se puede evitar el ensuciamiento, pues se
encontró que las proteínas muy reticuladas se unen muy bien a los
soportes sólidos, sobre todo a superficies de plástico. Como
molécula receptora se usa con especial preferencia antígeno HBc
recombinante y entonces por autoagregación se forman macromoléculas
del orden de varios millones de Dalton, y también conjugados de
tRSA, como por ejemplo tRSA-biotina,
tRSA-estreptavidina o
tRSA-anticuerpos anti-TSH. En todos
los casos se halló una fijación de casi el 100% y por tanto ningún
ensuciamiento de moléculas receptoras fuera de la superficie
diana.
Las moléculas receptoras pueden aplicarse
directamente sobre el soporte sólido o sobre un recubrimiento previo
aplicado sobre el soporte sólido. En el caso de un recubrimiento
previo es preferible utilizar moléculas receptoras con una gran
afinidad, como mínimo de 10^{8} l/mol, por el recubrimiento
previo.
Además se halló que añadiendo un retardante de
elución a la solución de recubrimiento se podía evitar el
ensuciamiento de las fases sólidas espacialmente delimitadas. Como
retardantes de elución se entienden aquellas sustancias que tras el
secado completo de la solución de recubrimiento forman una capa
sobre la superficie de ensayo, evitando o retrasando así la elución
inmediata de moléculas receptoras no fijadas o mal unidas durante la
adición de una solución de recarga o de una solución de muestra.
Como retardantes de elución sirven, por ejemplo, sacáridos como
sacarosa, PVP (polivinilpirrolidona) o dextrano, que presenta
preferiblemente un peso molecular de 10.000 hasta 100.000 Da. Otros
retardantes de elución adecuados son por ejemplo la gelatina y los
derivados de celulosa, sobre todo la metilcelulosa, que se emplean
preferentemente cuando las moléculas receptoras reaccionan con un
recubrimiento previo aplicado con anterioridad. Con la adición de un
retardante la elución de moléculas receptoras no fijadas se
retrasa, como mínimo, hasta que todos los sitios libres en el
soporte sólido quedan bloqueados mediante medidas apropiadas, con
lo cual las moléculas receptoras eluidas ya no se pueden fijar y
son eliminadas por lavado.
En un segundo aspecto se evita que las moléculas
receptoras eluidas de zonas predeterminadas se fijen de nuevo al
aplicar una solución de recarga, lo cual se logra mediante la
adición de una sustancia bloqueante a la solución de recarga. En
este caso hay que procurar que las sustancias bloqueantes se fijen
lo más rápidamente posible, lo cual puede lograrse mezclando la
solución de recarga con altas concentraciones, preferiblemente
\geq 0,5% en peso, de una sustancia bloqueante, por ejemplo con 1%
en peso de BSA (albúmina de suero bovino), proteína C, caseína,
etc. Otras sustancias bloqueantes idóneas son p.ej. peptona, IgG
bovina, IgG de conejo, colágeno, gelatina, polietilenglicol y
detergentes, como por ejemplo el Tween 20.
La cinética de la fijación de la sustancia
bloqueante, sobre todo de las proteínas de bloqueo, también puede
mejorarse añadiendo un tampón apropiado, por ejemplo MgCl_{2} al
3%. Cuando la solución de recubrimiento no se aplica directamente
al soporte sólido sino sobre un recubrimiento previo, se eligen
sustancias bloqueantes que reaccionen específicamente con el
recubrimiento previo. En lugar o además de las sustancias
bloqueantes inespecíficas, como por ejemplo las proteínas de
bloqueo, estas sustancias bloqueantes específicas capaces de
reaccionar específicamente con el recubrimiento previo mejoran el
efecto del bloqueo. Para ello, por ejemplo, sobre un recubrimiento
previo de estreptavidina se aplica una solución que contiene
moléculas receptoras biotiniladas. Una vez seca, se aplica por
encima una solución de biotina, que satura los sitios de fijación de
estreptavidina todavía libres.
Por último según la presente invención, el
ensuciamiento de fases sólidas espacialmente delimitadas también se
puede evitar aplicando la solución de recarga en un intervalo de
tiempo muy breve, con el fin de que las moléculas receptoras
eluidas queden inmediatamente muy diluidas. El tiempo máximo es en
general de 500 mseg, preferiblemente de 250 mseg y con especial
preferencia de 50 mseg. En este caso es conveniente que la mezcla
sea rápida, para evitar una concentración local alta de moléculas
receptoras eluidas en zonas de la solución de recarga. Por ejemplo,
se puede conseguir una mezcla eficaz aplicando la solución de
recarga con una velocidad de flujo lo más alta posible, lo cual
garantiza que el tiempo de contacto entre solución de recarga y
superficie de ensayo sea lo más breve posible.
Preferiblemente se usan varias de dichas medidas
combinadas, a fin de evitar que las moléculas receptoras eluidas se
fijen fuera de las áreas de ensayo previstas. Ha resultado
particularmente ventajoso agregar un retardante de elución a la
solución de recubrimiento y una sustancia bloqueante a la solución
de recarga, procurando que al mismo tiempo la solución de recarga
se mezcla rápidamente.
Como este método es eficaz, sobre todo para
formatos de ensayo miniaturizados, las fases sólidas espacialmente
delimitadas tienen preferiblemente un diámetro de 10 hasta 500
\mum y con especial preferencia de 20 hasta 200 \mum.
La presente invención también comprende una fase
sólida que se puede obtener mediante el método arriba descrito para
evitar el ensuciamiento de fases sólidas espacialmente delimitadas,
aplicando una solución de recubrimiento que contenga moléculas
receptoras sobre determinadas zonas de un soporte sólido y a
continuación una solución de recarga, de modo que las moléculas
receptoras se sitúen en superficies espacialmente delimitadas, la
cual se caracteriza porque \geq 80%, especialmente \geq 90% y
sobre todo \geq 95% de moléculas receptoras se hallan dentro de
las superficies espacialmente delimitadas. Con una fase sólida de
este tipo se pueden lograr resultados de análisis fiables y
reproducibles. Una fase sólida de este tipo se puede usar para
detectar uno o más analitos.
Otra causa frecuente de falsos resultados en los
ensayos de fijación son las uniones inespecíficas, es decir,
uniones de componentes de las muestras, aparte del analito deseado,
a fases sólidas recubiertas con estreptavidina o avidina.
Por lo tanto la presente invención también se
refiere a un método para disminuir la fijación inespecífica a una
fase sólida recubierta con estreptavidina o avidina, que comprende
las siguientes etapas
- (a)
- aplicar un conjugado formado por una macromolécula y biotina y
- (b)
- aplicar estreptavidina o avidita monomérica sobre la fase sólida.
Sorprendentemente, se comprobó que mediante este
método puede conseguirse una clara reducción de las fijaciones
inespecíficas a una fase sólida recubierta con estreptavidina o
avidina. El uso de estreptavidina monomérica disminuye
especialmente la fijación inespecífica de conjugados y otros
componentes de la muestra a la fase sólida.
Preferiblemente, el conjugado constituido por
una macromolécula, por ejemplo tRSA, y biotina, se aplica en
solución acuosa, en forma de microgotitas, sobre un soporte sólido.
En este caso se usa un conjugado formado por una macromolécula y
biotina en relación 1:1 hasta 1:3, sobre todo 1:1 hasta 1:2. Esta
baja estequiometría de biotinilización de la proteína permite
reducir aún más sustancialmente la fijación inespecífica, sobre todo
de conjugados.
El método de reducción de la fijación
inespecífica a una fase sólida recubierta con estreptavidina o
avidina, según la presente invención, también es particularmente
apropiado para formatos de ensayo miniaturizados, en que el
diámetro de la fase sólida es preferentemente \leq 10 mm, sobre
todo \leq 5 mm.
Otro objeto de la presente invención es una fase
sólida que puede obtenerse por el método arriba descrito,
caracterizada porque lleva un recubrimiento previo de un conjugado
que consta de una macromolécula y biotina, y por encima una capa de
estreptavidina o avidina monomérica. Dicho tipo de fase sólida se
usa para detectar un analito.
La presente invención se explica más
detalladamente por medio de los siguientes ejemplos:
\vskip1.000000\baselineskip
Las superficies de ensayo se trataron con una
solución de recubrimiento que contenía un compuesto macromolecular
de RSA-estreptavidina con un tamaño de partícula de
aproximadamente 100 nm. Transcurrido un tiempo de reacción de 15
minutos se aspiró la solución de recubrimiento y las superficies de
ensayo se bloquearon con una solución formada por 0,05% de NaCl,
0,2% de sacarosa y 0,05% de RSA. Para las superficies de ensayo
mostradas en la fig. 1 solamente se aspiró hasta sequedad tras un
tiempo de incubación de 5 minutos, mientras que para las
superficies de ensayo mostradas en la fig. 2 se llevó a cabo una
etapa de lavado según la presente invención, empleando un medio
acuoso, y luego se aspiró hasta sequedad.
En 5 l de agua se disuelven 3,7 g de Tris
(tris(hidroximetil)-aminometano) y 4,75 g de
MES (ácido
2-morfolino-etanosulfónico). A
través de un recipiente de reacción con un volumen nominal de 50
\mul, dotado de un recubrimiento previo, se pasan 5 ml de dicho
tampón de lavado. A continuación, el recipiente de reacción se
aspira hasta sequedad mediante una o varias agujas de succión. Con
la aplicación de un segundo recubrimiento sobre el recubrimiento
previo lavado y secado se obtienen superficies de ensayo bien
delimitadas, como, por ejemplo, las representadas en la
figura 2.
figura 2.
Sobre un soporte sólido se aplica un
recubrimiento previo de estreptavidina y sobre el mismo se aplica
una solución de recubrimiento con anticuerpos monobiotinilados,
formando pequeñas gotitas. Una vez secadas, se vierte por encima
una solución que lleva 3 mg/ml de biotina en K_{2}HPO_{4} 50 mM.
A los pocos segundos se elimina la solución de biotina y se aplica
una solución con 1% de RSA (albúmina de suero de bovino) y 2% de
sacarosa, que también se elimina después de unos segundos. A
continuación se seca el sistema. De esta manera se obtienen fases
sólidas de contornos muy nítidos, sin desplazamiento de las
moléculas receptoras fuera de la superficie de reacción
deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron fijaciones inespecíficas sobre
distintas fases sólidas de estreptavidina. Los resultados se
resumen en la tabla 5.
Como puede verse claramente, la combinación de
conjugado y estreptavidina monomérica, según la presente invención,
permite reducir evidentemente la fijación inespecífica.
\vskip1.000000\baselineskip
Primero se prepara un polihapteno por
acoplamiento de varios péptidos idénticos a RSA. El polihapteno se
disuelve a 50 \mug/ml en un tampón que incluye Mes 5 mM, Tris 5
mM y 1% de sacarosa. A continuación se aplican un volumen de 150 pl
en gotitas sobre un soporte de poliestireno, se incuba durante unos
5 s y se seca durante unos 60 s. Seguidamente se aplica una
solución bloqueante que consta de 1% de RSA y 2% de sacarosa y se
incuba durante 10 s. A continuación se aspira y se añade una
solución bloqueante que consta de 1% de RSA y 2% de sacarosa.
Seguidamente se aspira y se seca.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar se aplica una macromolécula
biotinilada (p.ej. RSA térmicamente aglomerada), a una concentración
de 100 \mug/ml en PBS, sobre un soporte de poliestireno de 50
\mul de volumen nominal y se incuba durante 5 minutos. Después se
aspira y se añade una solución de estreptavidina de 100 \mug/ml de
concentración en PBS. Tras los 5 minutos de incubación se lleva a
cabo una etapa de lavado, seguida de un secado por aspiración.
En un tampón de Mes 5 mM, Tris 5 mM, 1% de
sacarosa y 0,5 mg/ml de RSA se disuelven varias sondas de captura
de ADN biotinilado (de 18 bases) a una concentración de 1 \muM.
Luego se aplican gotitas de unos 150 pl de volumen, alineadas sobre
un soporte de poliestireno. Tras un tiempo de aproximadamente 5
segundos de incubación y de aproximadamente 60 segundos de secado
se añade una solución formada por 3 mg/ml de biotina en fosfato
dipotásico 50 mM y se incuba durante 2 segundos. A continuación, se
aspira y se agrega una solución bloqueante formada por 1% de RSA y
2% de sacarosa; después se aspira y se seca.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelven PAK < F_{c\gamma} de ratón
> S IgG - a una concentración de 30 \mug/ml - en un tampón que
lleva fosfato potásico 40 mM a pH 7,4 en cloruro sódico al 0,9%.
Esta disolución se aplica sobre un recipiente de reacción de 50
\mul de volumen nominal. Tras 15 minutos de incubación y
subsiguiente aspiración se añade una solución bloqueante formada
por 1% de RSA y 2% de sacarosa. Tras 5 minutos de incubación tiene
lugar una etapa de lavado según la presente invención y luego se
aspira hasta sequedad.
En un tampón que lleva Mes 5 mM, Tris 5 mM, 1%
de sacarosa y 0,5 mg/ml de RSA se disuelve una proteína de fusión
(F_{c\gamma} de ratón + CD28) a una concentración de 100
\mug/ml. Sobre el soporte de poliestireno recubierto del modo
antes descrito se aplican gotitas de 150 pl de volumen y se incuba
durante unos 5 segundos. Tras unos 60 segundos de secado se añade
una solución bloqueante formada por un tampón de fosfato potásico
50 mM a pH 7,4, 100 \mug/ml de IgG de ratón y 1 mg/ml de RSA.
Después de 10 segundos de incubación se aspira y se añade una
solución bloqueante de 1% de RSA y 2% de sacarosa. Después se aspira
y se seca.
\vskip1.000000\baselineskip
Una macromolécula de unos 100 nm de tamaño de
partícula, formada por RSA y estreptavidina, se disuelve en tampón
de fosfato 20 mM pH 7,4 y 1% de sacarosa a una concentración de 500
\mug/ml. Sobre un soporte de poliestireno se aplica un volumen de
unos 150 \mul en forma de gotitas, se incuba durante unos 5 s y se
seca durante unos 60 s. A continuación se añade una solución
formada por 1% de RSA y 2% de sacarosa, se incuba durante unos 10 s
y se aspira. Luego se agrega una solución formada por 1% de RSA, 2%
de sacarosa, 1 \mug/ml de anticuerpo anti-TSH
biotinilado, se incuba durante 20 minutos y se aspira. Por último se
añade una solución bloqueante formada por 1% de RSA y 2% de
sacarosa, se aspira y se seca. El resultado es una fase sólida
miniaturizada, específica de TSH y de gran precisión.
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre un soporte de poliestireno de 50 \mul de
volumen nominal se aplica una macromolécula biotinilada (p.ej. RSA
térmicamente aglomerada), a una concentración de 100 \mug/ml en
PBS, se incuba durante 5 minutos y se aspira. Luego se añade una
solución de estreptavidina de 100 \mug/ml de concentración en PBS.
Tras los 5 minutos de incubación se lleva a cabo una etapa de
lavado, según la presente invención, seguida de un secado por
aspiración.
En un tampón de Mes 5 mM, Tris 5 mM, 1% de
sacarosa y 0,5 mg/ml de RSA se disuelve un anticuerpo
anti-rubéola biotinilado a una concentración de 50
\mug/ml. Sobre el soporte recubierto del modo anteriormente
descrito se aplican gotitas de unos 150 pl de volumen. Después se
incuba durante unos 5 s y se seca durante unos 60 s. A continuación
se añade una disolución formada por 3 mg/ml de biotina en fosfato
dipotásico 50 mM, se incuba durante 2 segundos y se aspira. Después
se agrega una solución formada por 0,1% de Tween 20, 1% de RSA, 3
U/ml de lisado vírico (virus de la rubéola) en PBS, se incuba
durante 20 minutos y luego se aspira. A continuación se añade una
solución bloqueante formada por 1% de RSA y 2% de sacarosa, se
aspira y se seca.
Claims (12)
1. Método para aplicar superficies espacialmente
delimitadas, que contienen moléculas receptoras, sobre un soporte
sólido no poroso, que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- aplicación de una solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, sobre áreas limitadas del soporte sólido prefijadas,
- (b)
- fijación de las moléculas receptoras en las áreas espacialmente delimitadas,
- (c)
- secado de la disolución de recubrimiento y
- (d)
- aplicación de una solución de recarga -añadiendo a la solución de recubrimiento un retardante de la elución elegido entre sacáridos, polivinilpirrolidona, dextrano, gelatina o derivados de celulosa - que contiene una sustancia bloqueante.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la solución de recubrimiento se aplica
formando superficies espacialmente delimitadas, con un diámetro de
10 \mum a 10 mm.
3. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque se aplican varias
superficies espacialmente delimitadas, de tal manera, que al menos
dos de ellas presentan moléculas receptoras distintas.
4. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la solución de recarga contiene \geq
0,5% en peso de una sustancia bloqueante.
5. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la solución de recarga se
aplica dentro de un periodo mínimo de tiempo, como máximo de 500
mseg.
6. Método según una de las reivindicaciones
precedentes que además comprende un recubrimiento previo con las
siguientes etapas
- (a')
- aplicación de un recubrimiento previo sobre un área de reactivo del soporte sólido,
- (b')
- lavado del soporte prerrecubierto con un líquido acuoso y
- (c')
- aplicación, sobre superficies prefijadas y espacialmente delimitadas del soporte prerrecubierto, de la solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, capaces de unirse al recubrimiento previo.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método según una de las reivindicaciones 1 a
6, caracterizado porque la solución de recubrimiento que
lleva moléculas receptoras se aplica directamente sobre el soporte
sólido no poroso.
8. Método según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizado porque la solución de
recubrimiento que lleva moléculas receptoras se aplica en forma de
microgotitas.
9. Método para evitar el ensuciamiento de fases
sólidas espacialmente delimitadas - impidiendo que moléculas
receptoras eluidas de dichas fases se fijen de nuevo al aplicar una
solución de recarga - que comprende las siguientes etapas:
- (a)
- aplicación de una solución de recubrimiento que contiene moléculas receptoras, sobre áreas limitadas del soporte sólido prefijadas,
- (b)
- fijación de las moléculas receptoras en las áreas espacialmente delimitadas,
- (c)
- secado de la disolución de recubrimiento y
- (d)
- aplicación de una solución de recarga -añadiendo a la solución de recubrimiento un retardante de la elución elegido entre sacáridos, polivinilpirrolidona, dextrano, gelatina o derivados de celulosa - que contiene una sustancia bloqueante.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Método según la reivindicación 9,
caracterizado porque se aplica una solución de recubrimiento
que tiene una concentración de moléculas receptoras inferior al 90%
de la concentración límite necesaria para cubrir completamente la
zona prefijada.
\newpage
11. Fase sólida que puede obtenerse por un
método según una de las reivindicaciones precedentes, la cual se
genera aplicando una solución de recubrimiento - que contiene
moléculas receptoras - sobre determinadas zonas de un soporte
sólido no poroso y a continuación una solución de recarga, de modo
que las moléculas receptoras se sitúan en superficies espacialmente
delimitadas, caracterizada porque \geq 80% de las moléculas
receptoras se hallan dentro de las superficies espacialmente
delimitadas.
12. Fase sólida según la reivindicación 11,
caracterizada porque las zonas prefijadas y espacialmente
delimitadas que llevan las moléculas receptoras tienen un diámetro
de 10 \mum a 10 mm y varían de superficie a superficie menos de un
10%.
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Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE102004029909A1 (de) * | 2004-06-21 | 2006-01-19 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von bindungsfähigen Reagenzträgern |
DE102004052729A1 (de) | 2004-10-30 | 2006-05-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Immunkomplex-spezifsicher Antikörper zur Reduktion des Nullwerts beim Nachweis von Antigen-spezifisch gebundenen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in Array-Testformaten |
JP5647599B2 (ja) * | 2009-03-02 | 2015-01-07 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する方法 |
KR20130091746A (ko) | 2010-07-19 | 2013-08-19 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 췌장암의 치료를 위한 베바시주맙 병용 치료법을 위한 혈장 생체마커 |
KR20130091750A (ko) | 2010-07-19 | 2013-08-19 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 유방암의 치료를 위한 베바시주맙 병용 치료법을 위한 혈장 생체마커 |
WO2012010551A1 (en) | 2010-07-19 | 2012-01-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy |
KR20130126576A (ko) | 2010-07-19 | 2013-11-20 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법 |
CN103109190B (zh) | 2010-08-19 | 2015-07-22 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于测量结合治疗性单克隆抗体的抗体的测定法 |
BR112014012623A2 (pt) | 2011-12-05 | 2017-06-13 | Hoffmann La Roche | métodos para determinar adequação de terapia anticâncer, composição, kit e método para melhorar o efeito do tratamento de um regime quimioterápico |
MX2014014821A (es) | 2012-06-26 | 2015-02-12 | Hoffmann La Roche | Biomarcadores de plasma sanguineo para terapias de combinacion con bevacizumab para el tratamiento de cancer de mama. |
JP2019523404A (ja) | 2016-07-15 | 2019-08-22 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 全vegf−aのレベルを検出するための方法及び手段 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4591570A (en) * | 1983-02-02 | 1986-05-27 | Centocor, Inc. | Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens |
US4496654A (en) * | 1983-04-08 | 1985-01-29 | Quidel | Detection of HCG with solid phase support having avidin coating |
JPH05226637A (ja) * | 1991-06-28 | 1993-09-03 | Oki Electric Ind Co Ltd | 微細物の配列方法並びにこれを用いたバイオ素子の製造方法、超微粒子の配列方法、微細配線法及び偏光子の製造方法 |
-
1998
- 1998-02-19 DE DE19806989A patent/DE19806989A1/de not_active Withdrawn
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