JP2009075125A - 検出方法において干渉性のサンプルを検出するためのコントロール領域の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】サンプル中の少なくとも1つのアナライトを検出するための試薬を含有する少なくとも1つの試験領域をもつ固相であって、さらに、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合による干渉反応を検出するための少なくとも1つのコントロール領域も含んでいる。アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が該充填溶液の試薬を含むがアナライト特異的結合部位を含まないことを特徴とする。
【選択図】なし
Description
HBsAgに対するモノクローナル抗体を、ポリスチレン支持体上の約100μmの試験領域に付着させる。同じ試薬溶液を数回付着させることによって、一回のサンプルピペッティングで1つの試験を行うときに余分な作業をすることなく複数の測定を行うことができる。サンプルバッファであらかじめ希釈したサンプル30μlをピペットで試験領域上に載せ、室温で振盪しながら20分間インキュベートする。サンプルを吸引し、試験領域を洗浄バッファで洗浄した後、ジゴキシゲニン(Dig)−標識抗−HBsAg抗体を含有する30μlの試薬溶液1をピペットで添加し、再び室温で振盪しながら20分間インキュベートする。試薬溶液1を吸引し、試験領域を洗浄バッファで洗浄した後、検出試薬を含有する30μlの試薬溶液2をピペットで試験領域上に載せる。検出試薬として、抗−Dig抗体で共有結合によりコートされた100nmで蛍光染色したラテックス粒子を用いる。つぎに、この検出試薬を室温で振盪しながら20分間インキュベートし、次いで吸引し、洗浄し、吸引乾燥する。試験領域に633nmの波長のHe−Neレーザーを照射し、670nmの波長の蛍光をCCDカメラで測定する。このテストフォーマットの代表例を図1の中央に示す。
固相抗体:モノクローナルマウス抗−HBsAg抗体1(Fab’2フラグメント)ビオチンコンジュゲート 1:1 サブタイプIgG1
検出抗体:モノクローナルマウス抗−HBsAg抗体2 IgG−Digコンジュゲート 1:10
**カットオフ指数:[シグナル(試験領域)−シグナル(陰性コントロール領域)]/3×シグナル(陰性コントロール)
HAMA干渉を検出するために、HBsAg−特異的抗体に加えて追加の非特異的モノクローナル抗体(MABs)を付着させた(図3)。クレアチニンキナーゼMB(<CK−MB>)、トロポニン(<TNT>)および甲状腺刺激ホルモン(<TSH>)に対する抗体をFab’2またはFab’ビオチンコンジュゲートの形態で使用した。サンプル中のヒト抗−マウス抗体が固相に結合した非特異的MABsと特異的検出抗体とを架橋するという事実に起因して、いわゆるHAMA干渉を検出することが可能である。この実験の目的は、HAMA検出に最適なMABを見出すことであった。6種の異なるHAMAサンプルを用いてHBsAg/コントロールパネルを測定した。このために、HAMA干渉低減用試薬をサンプルバッファに添加しないかまたは100μg/ml添加した。
**カットオフ指数:[シグナル(試験領域)−シグナル(陰性コントロール領域)]/3×シグナル(陰性コントロール)
シグナル(陰性コントロール)=28カウント
**カットオフ指数=[シグナル(試験領域)−シグナル(陰性コントロール領域)]/3×シグナル(陰性コントロール)
シグナル(陰性コントロール)=34カウント
***カットオフ指数HBsAgcorr.=[シグナル(試験領域)−シグナル(MABコントロール領域)]/3×シグナル(陰性コントロール);定義:陰性値=0
検出試薬の非特異的結合はさまざまなマトリックス効果により生じうることが一般に知られている。マトリックス効果に対して試験特異的スポットに匹敵する作用を有するコントロールスポットを適用すると、そのようなマトリックス効果を示し、場合によっては修正することさえ可能になる。その結果として特異性が大きく改善される。
**カットオフ指数=[シグナル(試験領域)−シグナル(陰性コントロール領域)]/3×シグナル(陰性コントロール)
シグナル(陰性コントロール)=28カウント
***カットオフ指数HBsAgcorr.=[シグナル(試験領域)−シグナル(MABコントロール領域)]/3×シグナル(陰性コントロール);定義:陰性値=0
リウマチ因子による干渉を検出するために、HBsAg−特異的抗体に加えて、IgG1サブタイプの追加のMABを付着させた。リウマチ因子は抗体のFc部分と反応することができるので、固相に結合した試験特異的MABと特異的検出抗体との架橋が生起し、したがって偽陽性反応が生じうる。この実験の目的は、リウマチ因子を検出するのに最適なMABを見出すことであった。このため、IgG1サブクラスの異なるMABを付着させた。このHBsAg/コントロールパネルを、陰性コントロール、3つの異なる陽性コントロール、4つの通常の陰性サンプル、およびリウマチ因子の量を次第に増大させた5つの陰性サンプル(RF1〜5)で測定した。陽性コントロール中のHBsAgのそれぞれの含量およびリウマチ因子サンプル中のリウマチ因子の含量はU/mlで示す。結果は次の通りである。
Claims (18)
- アナライトと固相レセプターのアナライト特異的結合部位との特異的結合によってサンプル中のアナライトを検出するための固相レセプターを含む少なくとも1つの画定された試験領域を有する固相であって、さらに、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも1つの画定されたコントロール領域を含み、アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が該充填溶液の試薬を含むがアナライト特異的結合部位を含まないことを特徴とする、固相。
- サンプル中の複数のアナライトを同時に検出するための複数の試験領域を含んでいる、請求項1記載の固相。
- 検出媒体の成分と試験領域上の固相レセプターとの非アナライト特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも1つのコントロール領域を含んでいる、請求項1または2に記載の固相。
- 検出媒体の成分と試験領域上に固定化された抗体、抗体フラグメント、抗原および/または核酸との、非アナライト特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも1つのコントロール領域を含んでいる、請求項1〜3のいずれか1項記載の固相。
- コントロール領域が、アナライトに特異的な結合部位が存在しない点で試験領域上の固相レセプターとは異なる改変された固相レセプターを含有している、請求項1〜4のいずれか1項記載の固相。
- リウマチ因子による干渉を検出するための少なくとも1つのコントロール領域を含んでいる、請求項1〜5のいずれか1項記載の固相。
- 異種特異的抗体による干渉を検出するための少なくとも1つのコントロール領域を含んでいる、請求項1〜6のいずれか1項記載の固相。
- 検出媒体の成分と、固相支持体上の非アナライト特異的物質との非特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも1つのコントロール領域を含んでいる、請求項4〜7いずれか1項に記載の固相。
- ストレプトアビジンを含有する少なくとも1つの試験領域と、検出媒体の非アナライト特異的ストレプトアビジン結合性成分による干渉を検出するための少なくとも1つのコントロール領域とを含んでいる、請求項8記載の固相。
- 総IgE含量を検出するための少なくとも1つのコントロール領域を含んでいる、請求項1〜9のいずれか1項記載の固相。
- 試験領域とコントロール領域が各々10μm〜1cmの直径を有している、請求項1〜10のいずれか1項に記載の固相。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の固相の、サンプル中のアナライトを検出するための使用。
- 固相が複数のアナライトを同時に検出するための複数の試験領域を含んでいる、請求項12記載の使用。
- イムノアッセイにおける、請求項12または13記載の使用。
- 核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおける、請求項12または13記載の使用。
- アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターを含む少なくとも1つの画定された試験領域を有する固相を用いてアナライトと固相レセプターとの特異的結合によってアナライトを検出する方法であって、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合によって生起する干渉をさらに検出することを含み、固相が、非アナライト干渉成分の試験領域への非特異的結合によって生起する干渉を検出するための少なくとも1つの画定されたコントロール領域をさらに含み、アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が該充填溶液の試薬を含むがアナライト特異的結合部位を含まない、前記方法。
- 干渉を定量的に修正するためにコントロール領域を使用する、請求項16記載の方法。
- 画定された試験領域の固相レセプターのアナライト特異的結合部位へのアナライトの特異的結合によってアナライトを検出する方法における、非アナライト成分によって生起する干渉を検出するための画定されたコントロール領域の使用であって、アナライト特異的結合部位を有する固相レセプターが充填溶液を使用して適用されており、コントロール領域が該充填溶液の試薬を含むがアナライト特異的結合部位を含まない、前記使用。
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