JPH02201265A - 酵素定量ウィッキングアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特異的結合ベアアッセイに関し、そしてβ−ガ
ラクトシダーゼ断片の補完および複合体の分離を使う。

〔従来技術およびその課題〕

非常に様々なイムノアッセイは、試料中の分析物（ａｎ
ａｌｙｔｅ）が固定量の抗−分析物抗体を目当てに既知
量のラベル化された分析物と競争する競合阻害に基づい
ている。競合阻害アッセイにおいては酵素ラベルがしば
しば使われており、ここで抗−分析物抗体と酵素−分析
物接合体との結合が、複合体形成した接合体と複合体形
成しなかった接合体の分離のために用意される。

β−ガラクトシダーゼ断片の補完＄よび活性酵素形成の
能力に基づくアッセイが報告されている。

特に、β−ガラクトシダーゼ酵素供与体（ＥＤ）はβ−
ガラクトシダーゼ酵素受容体（ＥＡ）と結合して活性な
β−ガラクトシダーゼ酵素を形成する。ＥＤの成る部位
へ小さい分析物または分析物類似体を接合させても、β
−ガラクトシダーゼで触媒される活性の量には影響を及
ぼさない。しかしながら、ＥＤ−分析物接合体が抗−分
析物抗体と結合すると、反応の初期段階の間の酵素触媒
反応速度が減少する。酵素触媒反応速度にあけるこの減
少が複数の分析物の定量に利用されており、この場合ア
ッセイ媒質中に存在するＥＤ−分析物接合体と試料中に
存在する分析物とがＥＡの添加の前に抗−分析物抗体を
目当てに競争する。β−ガラクトシダーゼ−触媒反応速
度は、試料中に存在する分析物の量が増加するにつれて
増加する。

該アッセイは病院または他の据え付けの臨床実験室にお
いて実施可能であるが、比較的熟練されていない人々に
より実施でき、そして精巧な装置を使用することなく分
析できる簡便化されたアッセイプロトコールが必要とさ
九ている。

〔関連文献〕

改変されたβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体および酵素
受容体は、化学合成および組換え操作により調製されて
いる。改変された該断片は、補完の際のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を保持しており、そして該断片の生産および
該断片への分析物の結合を容易にする。例えば米国特許
束４．７０８．９２９号およびその中に引用された文献
を参照のこと。

〔課題を解決するための手段〕

ラベルとしてβ−ガラクトシダーゼの相補的断片を使う
ウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ）アッセイが提供される
。β−ガラクトシダーゼ相補的断片のうちの一方は吸水
性表面に結合しており、もう一方は、リガンド分析物と
免疫的に交差反応性であるかまたはレセプター分析物と
相補的であるエピトープに接合されている。レセプター
と複合体形成した相補的メンバーを複合体形成していな
い相補的メンバーから遠位に運ぶために吸水性メンバー
への移行が用意される。複合体形成していない相補的メ
ンバーが他方の酵素断片と結合すると、そのような結合
部位のところで基質により発色することができる。複合
体形成していない酵素断片接合体の存在の測定は、複合
体形成していない酵素接合体からの複合体形成した酵素
接合体の前分離または吸水性メンバー上での複合体形成
した酵素接合体と複合体形成していない酵素接合体との
識別の結果としてであることができる。

〔特定の実施態様〕

相補的なβ−ガラクトシダーゼ断片を使用するウィッキ
ングアッセイが提供され、ここで一方の断片は、分析物
のエピトープと交差反応性であるかまたはレセプター分
析物と特異的に結合するエピトープに接合されている。

他方の断片は、水性媒質の輸送のために用意された吸水
性メンバーに非拡散的に結合されている。これら２つの
断片はそれぞれ、通常小さい方の断片でありそしてβ−
ガラクトシダーゼ酵素のＮ−０末端部分の少なくとも一
部分を含んで成る酵素供与体、および通常大きい方の断
片でありそしてβ−ガラクトシダーゼ酵素のＣ−末端部
分である酵素受容体と呼称される。酵素供与体および酵
素受容体はそれぞれ”ＥＤ”および“ＥＡ”と省略され
る。酵素系の完全な記載については、米国特許束４．７
０８．９２９号を参照のこと。

当該アッセイの成分は、酵素断片接合体、支持体に結合
した酵素断片、酵素基質、およびアッセイ媒質である。

多数の異なるプロトコールを使用することができ、それ
の選択は分析物の性質に応じるであろう。

該アッセイを実施する際に、試料、接合体およびレセプ
ター（分析物であってもよい）を適当なアッセイ媒質中
で混合する。分析物がリガンドである場合、レセプター
と結合して複合体を形成する接合体の物理的分離に備え
るために、レセプターは固体支持体に結合されているか
、または該複合体が吸水性メンバーに適用される場合は
溶液中に遊離していてもよい。ある場合には、該複合体
が溶液中に遊離している場合、試料との混合前に分離が
行われ得る。

試料とレセプターとの間に起こる反応にとって十分な時
間の後、アッセイ媒質を吸水性メンバーと接触させる。

接触は、アッセイ媒質がストリップの長さの実質的部分
を移動するであろう場合には、細長いストリップの一端
に近い部位であることができ、または適用部位から実質
的に均一に放射状に広がるように、アッセイ媒質ゆく適
用部位かすることができる。吸水性メンバーに更なるア
ッセイ媒質を添加せずそして移動が止まった時点で、吸
水性メンバーを基質溶液と接触せしめる。通常、適用部
位から溶媒先端までを含む領域が基質と接触されるだろ
う。次いで更なる反応が起こらないように、基質溶液と
の接触を止めるが、溶媒が実質上蒸発するまでは反応が
続くだろう。

指摘した様に、アッセイの形式は分析物の性質に依存し
て異なることができる。親水性分析物の場合は、吸水性
メンバーが複１合体形成した酵素複合体と遭遇しないよ
うに、複合体形成した酵素断片接合体を複合体形成して
いない酵素断片接合体から前分離することが好ましいだ
ろう。分離は、容器の壁、例えばミクロタイタープレー
ト、粒子、例えばセファデックス粒子、セル等のような
固体支持体に結合されたレセプターを用意することによ
り達成され得、または吸水性メンバーとの接触部位から
移動することができないであろう非常に高分子量の複合
体凝集物を形成することができそして不活性ならば活性
酵素を形成する際に実質的に減少してしまうであろう、
多価の抗−レセプターを有することによっても達成され
得る。

あるいは、細長いストリップを使用する場合には、レセ
プターを捕捉するために、抗−レセプターと接合された
アッセイ媒質と最初に接触する部位を有することができ
る。試料により置換される相補的酵素断片の存在は、抗
−レセプターの領域から置換されるだろう。

分析物が疎水性であるか、または酵素断片への疎水性基
の結合により、即ち分析物以外の疎水性分子により、接
合体が疎水性にされる場合は、結合された酵素断片との
接触前の複合体形成した接合体と複合体形成していない
接合体との分離は必要ない。アッセイ媒質を吸水性支持
体と接触させると、疎水性の複合体形成していない接合
体は接触部位近くの比較的小さい領域中に保持され、−
方複合体形成したメンバーは接触部位から遠くに移動す
る。吸水性メンバーと基質を接触させる時、相補的酵素
断片が結合して活性酵素を形成する部位で発色がずっと
強くなる。レセプターが結合された接合体の存在は、溶
媒と一緒の移動ふよび適用部位から離れたＥＡとの結合
をもたらし、より広い検出可能領域０ために用意される
。この形式は、主な関心が限界濃度より上または下の分
析物の存在である限界アッセイについて特定の適用を有
する。

ＥＤおよびＥＡ断片並びにそれらの接合体は米国特許第
４．７０８．９２９号中に詳細に記載されており、これ
は本明細書中に引例として組み込まれる。従って、ＥＤ
およびＥＡの簡単、な説明だけで充分であろう。ＥＤは
通常約６０〜１００アミノ酸であり、通常着目のエピト
ープを提供するアミノ酸配列との融合により、または接
合のためのメルカプトまたはアミノ官能基に備えて、シ
スティンまたはリジンを提供する突然変異により改変さ
れるだろう。

ＥＡの調製方法は、天然に存在する変異体源からの単離
であることができ、または組換え技術によりＥＡを合成
することもでき、そこでは接合のために利用可能な官能
基を使用してもよく、または接合に有用な部位に備えて
該配列中にシスティンを導入してもよい。米国特許第４
．７０８．９２９号に記載されている多数のＥＤおよび
ＥＡのいずれかを使用してもよい。

吸水性支持体の選択は、多数の考慮に依存するだろう。

吸水性支持体は、共有結合または非共有結合のどちらか
により該支持体への酵素断片の非拡散性結合を可能にす
るべきである。該支持体はアッセイ成分の所望の移動を
妨害すべきではな（、または必要な性質に備えて改変さ
れてもよい。即ち、該支持体は有意な非特異的結合を生
じてはならず、または該支持体を処理してそのような非
特異的結合を回避すべきである。

イムノアッセイウィッキング法において使われる多数の
吸水性固体支持体が文献中に報告されており、その中に
は、改質されたセルロース系支持体、例えば紙、ニトロ
セルロースおよび好ましくは非−セルロース系支持体、
例えばナイロン膜、ポリエステルベースの膜およびポリ
アミドベースの膜が含まれる。便利には、固体支持体は
化学的に反応性の膜、例えば処理されたナイロン膜であ
り、膜と共にインキユベートされたタンパク質を共有結
合的、または非共有結合的に結合する。明らかにタンパ
ク質のアミノ基との結合の形成を通してタンパク質を共
有結合的に結合するナイロン膜は、ミリポア・コーポレ
ーション（“Ｉｍｒｎｏｂｉｌｏｎ”）およびポール・
コーポレーション（“Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ”）を含む
業者から商業的に入手可能である。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ
膜よりもＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅ膜の方が膜に固定された
ＥＡが保存の際に長期間安定であることがわかっている
ので、Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ膜がより好ましい。

酵素断片は、支持体材料へタンパク質を共有結合または
非共有結合的に結合させるための便利な手段により固体
支持体に結合されるだろう。ＥＡをＩｍｍｏｂｉ　ｆａ
ｎ膜に付着せしめるための好ましい手段は、実験の部に
右いて記載される。便利には、酵素断片は固体支持体の
全表面を被覆することができるが、少なくとも色の形成
を測定する領域を被覆するであろう。望ましくは、酵素
断片は実質的に一定の濃度で紙の表面上に存在するだろ
う。

これは、浸漬、噴霧、ナイフの刃での適用等により達成
され得る。酵素断片の付着の後、支持体へのタンパク様
物質の非特異的結合を最小にするために、支持体はブロ
ック剤、通常はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　または
カゼインのようなタンパク質でコートされるだろう。通
常、タンパク質含有溶液は約０．０５〜５重量％、より
普通には０．１〜１重量％の範囲内の濃度であろう。支
持体は、望ましくは界面活性剤を含有する水性緩衝液で
注意深く洗浄され、支持体にしっかりと結合していない
酵素断片が除去されるだろう。

調製の後、支持体は好ましくは真空デシケータ−中でプ
ロット乾燥されそして保存される。乾燥条件下で支持体
を保存するとＥＡの安定性を高めることが知られている
。支持体は室温で延長された期間保存でき、またはより
長い安定性のために冷蔵することもできる。糖などの安
定剤を適用してもよい。

支持体は大きなシートとして用意することもできる。こ
れは更に加工してストリップ、円状ノくラド、円筒状パ
ッド等にすることができる。ストリップは支持体の正確
なメンバーを含むことができそして操作の容易さを有す
るであろう。多数のストリップおよびパッドが診断的ア
ッセイに関する文献中に記載されており、これらの品を
本発明に使用することができる。パッドは普通、ストリ
ップに比べると実質的に左右対称であり、約３ｍｍより
大きく約２ｃｍより小さい最小表面寸法を有するだろう
。

ストリップの場合は、分離領域に備えて更なる処理にか
けられ得る。既に示、したように、アッセイ媒質との接
触部位に近い領域が、レセプターと複合体形成した接合
体の分離のために用意され得る。従って、その領域中に
抗−レセプターを有することにより、どんな複合体形成
された酵素断片接合体でもその領域内に保持され、そし
て次の領域への移動を妨げられ、そこで相補昨酵素接合
体が結合するであろう。

支持体上の酵素断片の量は色々異なることができるが、
通常はアッセイ媒質中の相補的酵素断片接合体の量に対
して全量で実質的に過剰である。

支持体表面上の特定の濃度は、特定のアッセイ、酵素断
片接合体の結合親和力、およびアッセイの方式に依存す
るだろう。支持体を酵素断片で含浸するのに使う溶液の
濃度は、通常約１〜１００−の範囲、より普通には約５
〜７５団の範囲内であろう。

便利には、酵素接合体は、通常約６．５〜８の範囲内の
ｐＨに緩衝化された約５０〜２５０禮の範囲内の緩衝液
濃度を有する水性緩衝化溶媒中で支持体に適用されるだ
ろう。トリス、リン酸塩、酢酸塩、ＭＯＰＳＳＨ８ＰＢ
Ｓ等、どんな便利な緩衝液でも使うことができる。

アッセイ媒質は、酵素断片接合体、試料、および分析物
がレセプター以外の時には分析物のためのレセプターを
含んで成るだろう。既に示したように、レセプターは支
持体に結合されてもよく、または溶液中に分散されても
よい。酵素断片接合体の量は、着目の分析物の濃度範囲
と共に変化するだろう。普通は、酵素断片接合体は、着
目の範囲内の分析物の最も高い濃度あたりの範囲内であ
ろう。特定の濃度は、着目の濃度範囲内の所望のシグナ
ルレベルを考慮して、そしてその範囲が定量される場合
、バックグラウンドレベルおよび他の妨害レベルを最小
にしながら、濃度における有意な差を識別できるような
十分な感度を考慮して選択されるだろう。

この濃度は、好ましくは、反応の速度論を研究すること
により溶液中で決定される。例えば、１９８８年２月２
日に出願した同時係属出願第１５１．４１２号を参照の
こと。この中に、予想される濃度範囲の分析物量に応答
するように、接合体および抗体の濃度を最適化すること
が詳細に記載されている。

普通、相補的な特異的結合ペアメンバーおよび接合体の
濃度は、最適条件に必要な濃度の少なくとも８５％、よ
り普通には少なくとも９５％以内であろう。

所望の分析物濃度範囲内での相補的な特異的結合ペアメ
ンバーおよび接合体の最適濃度を溶液アッセイにおいて
決定した後、これらの濃度を当該ウィッキングアッセイ
に使用することができる。

緩衝液組成は重要ではない。一般に、リン酸塩緩衝化塩
溶液、トリス緩衝液などの生理的緩衝液が有用である。

好ましい緩衝液は、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭのＮａ
Ｐ口４、約５ｍＭ〜約１０ｒｎＭのＥＧＴ＾および約ｌ
　ＱｍＭ　〜２０ｍＭのＮａＮ３を含んで成り、６〜８
のｐＨを有するものである。アッセイの温度は普通少な
くとも約２０℃で、好ましくは高められるが、６０℃以
下であろう。大抵のアッセイは約り０℃〜約３０℃にて
、または約３７℃の高められた温度にて行われる。アッ
セイは大気圧にて行われる。

試料は、生理的流体、例えば血液、血清、血しょう、を
髄液、硝子体液等、化学的操作流出液または反応混合物
、水源、エアー源等を含むいずれかの着目の源から得る
ことができる。試料の特定の源は本発明にとって重要で
はない。試料は前処理にかけてもよいし全く前処理しな
くてもよい。

試料は希釈してもよいしまたそのまま使用することもで
きる。大抵は、試料は普通アッセイ媒質の容量の約５０
％よりも少ないであろう。普通、試料はアッセイ媒質の
約０．１〜２０容量％の範囲であろう。希釈の場合、試
料は通常、試料と混合した後に約６〜８の範囲のｐＨを
提供するように緩衝化されている、緩衝化された媒質と
混合される。普通、該酵素断片接合体は、乾燥粉末とし
てよりもむしろ溶液として試料と混合されるだろう。レ
セプターは、酵素接合体と共に予め形成された複合体と
して存在してもよく、この場合には存在するレセプター
は通常、酵素接合体の実質上全部を結合するのに十分な
量で存在するであろう。レセプター対酵素接合体の比は
、試料中の分析物との競合を考慮したものであり、その
た、め存在する複合体形成していない酵素断片接合体の
量がアッセイ媒質中の分析物の量に関連するであろう。

アッセイ媒質中で使われるレセプターの量は、アッセイ
の感度に従って少なくとも実質的に最適化されるだろう
。

アッセイ媒質の様々な成分を混合した後、アッセイ媒質
は通常少なくとも０．５分間および多くても１２０分間
、普通約３〜６０分間インキュベートされるだろう。イ
ンキ二ベーション温度は、支持体の反応に使用される温
度範囲内であろう。

インキュベーション時間の後、支持体とアッセイ媒質と
の接触が行われるであろう。いずれかの長いストリップ
またはデイツプスティックを使用する場合、アッセイ媒
質はストリップの一方の縁もしくは先端でまたはその近
くでストリップと接触されるだろう。ス）　＋Ｊツブの
一方の端を媒質中に浸すかまたは媒質の表面上に維持し
、ウィッキングを行うことができる。これは、アッセイ
反応容器として働くチューブまたはミクロタイタープレ
ートウェル中にストリップを置くことにより行うことも
できる。

あるいは、アッセイ媒質のアリコートをスライドガラス
または他の表面上に置き、そしてアッセイ媒質の小滴の
上に該デイツプスティックをつる下げてもよい。アッセ
イ媒質は、乾燥支持体との接触により該デイツプスティ
ックの上方に垂直に吸引されるかまたはウィックされる
だろう。便利には、多くても約１００ｐ１、普通は約２
０〜約２５ｄか使われるだろう。便利にはアッセイ媒質
の容量は、支持体まで予め決められた長さを移動するの
に必要とされるものよりも幾らか多い容量であり、前記
長さは望ましくは該ストリップの少なくとも５０％で且
つ１００％未満であり、望ましくは約５〜約３０％であ
ろう。必要なアッセイ媒質の量が少なければ非常に小さ
い試料容量の使用が可能になり、そしてアッセイ試薬の
浪費が避けられる。しかしながら、測定の簡便さ等にと
って望ましい時は実質的により大きいアッセイ媒質容量
を使用することができる。

アッセイ溶媒の先端が該ストリップ上を予め決められた
高さまで移動した後、該ストリップは温度に依存して、
約５〜約３０分間、より普通には約１０〜３０分間イン
キ二ベートされるだろう。普通インキュベーションは、
ＥＡがＥＤと反応し、固体支持体に固定されたβ−ガラ
クトシダーゼを形成するのに十分な時間の間であろう。

アッセイ媒質が中央の位置に置かれ、その位置から外側
に放射状に広がる場合、アッセイ媒質はキャピラリー、
ドロッパーまたは他の便利な手段によりその位置に適用
され得る。次いで液体は、その位置から中心の位置に適
用された容量に依存した距離まで放射状に広がるであろ
う。この添加は連続であっても間隔をあけてもよい。

その後、支持体は酵素基質溶液とインキュベートされる
。酵素基質は、酵素により開裂された時に支持体の吸光
（光学濃度）または発光の量において視覚的に検出可能
な変化をもたらすものが使用される。即ち、基質の開裂
が着色または蛍光生成物の出現または消失をもたらし、
通常はその生成部位に生成物が保持される。酵素基質は
沈澱生成物を生じるものであってもよい。好ましい酵素
基質はクロロフェノールレッドガラクトシド（ＣＰＲＧ
）である。ＣＰＲＧおよび他の匹敵する酵素基質、例え
ばオルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｏ
ＮＰＧ）は商業的に入手可能である。酵素基質とのイン
キュベーションは、便利には支持体を酵素基質溶液中に
浸漬することにより行われる。ＣＰＲＧを使用する時、
支持体は、便利には約０．５〜２ｄのＣＰＲＧの溶液中
で室温にて１〜１０分間インキュベートされるだろう。

所望であれば、発色を増強するためにＥＡが基質溶液に
添加されてもよい。

ストリップを使用する場合、通常溶媒先端の距離に比例
する、発色が起こる距離、または色の強度の変化は、ア
ッセイ媒質中の分析物の量に関係するであろう。しかし
ながら、支持体が単一部位での適用および外側への放射
のために用意される場合、疎水性分析物では、通常アッ
セイ媒質の適用部位に近い部位のところで、そのような
部位から離れたもしくは遠位の領域に比べて、より濃い
色が観察されるだろう。遠位領域では、色の生成は媒質
中の分析物の量に関連がある。この場面で、近位領域に
おける発色が予め決められた濃度を超える分析物の存在
を指摘するように、限界値が取り扱われるであろう。酵
素断片接合体が親水性である時は、着色領域の直径また
は色の強度が媒質中の分析物の濃度に比例するように、
複合体形成した酵素接合体は予めアッセイ媒質から除去
されているかまたは不活性化されるであろう。

様々なプロトコールを使用することができ、この中の幾
つかは既に指摘されている。例えば、ミクロタイタープ
レートウェルの壁に共有結合的に結合された抗体に結合
されているＥＤ−接合体に、緩衝化された試料を添加す
る。インキュベーションのための十分な時間の後、アッ
セイ媒質のアリコートを、指定された部位にＥＡが接合
されている支持体に移し、そしてもはや移動が起こらな
くなるまで該媒質を移動させ、そして支持体を乾燥させ
る。次に実質的に乾燥された支持体を、着色生成物をも
たらす酵素基質溶液中に浸し、そして酵素基質溶液から
取り出し、そして乾燥させる。

媒質中の分析物の量の尺度として高さまたは色の強度を
測定する。

次の態様では、分析物が疎水性分析物、例えばチロキシ
ンである。ＥＤ−チロキシン接合体と抗−チロキシンま
たはチロキシン結合グロブリンとの可溶性複合体を試料
と混合し、そしてチロキシンが該複合体から該接合体を
置換するのに十分な時間の間インキュベートする。次に
アッセイ媒質のアリコートを、ＥＡが接合された支持体
上の部位にスポットし、そして溶媒を移動させ、支持体
を乾燥させる。次いで支持体を酵素基質溶液中に浸漬し
、そこから取り出し、乾燥させる。周辺の領域に比べて
アッセイ媒質の適用部位の暗いスポットの存在は、アッ
セイ媒質中の限界濃度を上回るチロキシンの濃度を示し
ている。接合体−抗体複合体は、適用部位から遠位に移
動することができ、そして活性酵素に備えるが、一方線
水性接合体は実質的に適用部位にとどまる。

更なる態様においては、抗体複合体として親水性のＥＡ
−分析物接合体を試料と混合し、そして該混合物が平衡
に達するのに十分な時間の間インキュベートする。一方
の末端に抗−抗体がアッセイ媒質中の抗体の全部を結合
するのに十分な量で存在している領域を有するス）　Ｉ
Ｊツブが使われる。

該ストリップの残部はＥＤと接合されている。該ストリ
ップの、抗−抗体が結合している方の末端をアッセイ媒
質に浸し、そして溶媒の先端が予め決められた距離に達
するようにアッセイ媒質を移動させる。次いでストリッ
プをアッセイ媒質から取り出し、乾燥させ、そして酵素
基質溶液中に浸す。酵素基質溶液からストリップを取り
出し、発色させ、そして色の先端の距離を測定する。こ
の距離または色の強度はアッセイ媒質中の分析物の量に
比例する。

当該アッセイを実施するのを容易にするために、キット
が用意され得る。このキットの成分は、酵素断片が非分
散的に結合されている吸収性支持体、分析物と交差反応
性であるエピトープまたは分析物がレセプターである場
合には相補的なエピトープを含んで成る酵素断片接合体
、および所望によりリガンド分析物に対するレセプター
を包含するであろう。該接合体およびレセプターは別々
に用意されてもよくまたは単一試薬として用意されても
よい。ある場合には、レセプターが容器（ｒｅｃｅｐ−
ｔａｃｌｅ）の壁に結合されているような容器を考慮に
入れることが望ましいかもしれない。加えて、予想され
る試料濃度範囲内で既知濃度の分析物を有する１つまた
は複数の分析物対照が用意され得る。

支持体を除き、その他の試薬は液体または乾燥形で用意
され得る。

次の実施例は例示のために提出され限定のためではない
。

〔実施例〕

例１：ＥＡペーパーの調製 ＥＡを膜に結合させるために、膜を５０ｍＭのＰｏ、３
−緩衝液（ｐＨ７，４）中５−１０声のＥＡ溶液中で室
温（ＲＴ）にて３′０分間振とうしてカバーした。次い
でその膜をＰＢＳ中の１％カゼイン溶液でブロックしく
ＲＴで６０分間振とう）１、続いて０．０５％のＴｗｅ
ｅｎ　２０を含むＰＢＳ中で２回洗浄した（ＲＴで１５
分間振とう）。次にその膜を吸取乾燥し、そして真空デ
シケータ−中に保存した。

タンパク質の完全な結合が起こるためには、膜上のタン
パク質結合部位を目当てに競争するチオールが存在しな
いのが好ましい。従って、以下の例で使用するＥＡは、
セファデックスカラムへの通過により貯蔵チオールが除
去された“交換済”ＢＡ２２であった。

交換済ＥＡは、チオールの保護のためＢＧＴＡの添加を
伴ってまたは伴わないで７日間まで冷蔵保存されるか、
または１０％グリセロールと共に７日もしくはそれ以上
冷凍保存され、免疫処置後匹敵する酵素活性に備えた。

垂直のウィッキング形式で同じ実験を実施した。

８０４濃度が１．０禮以上に増加しなければ、ＥＤの濃
度が増加するにつれてＣＰＲ反応性先端の高さがわずか
に増加した。放射状形式と異なり、非常に高濃度の８０
４を使用するまでは反応性先端が溶媒先端と同じ高さに
は達しなかった。また、ＥＤ４濃度または固定されたＥ
Ａの濃度のどちらかが増加した時、色の濃度が増加した
。

５−または２０Ｊｆｌ　Ｅ　Ａを使って調製されたＰａ
１ｌ膜上に８０４　　（０，０６〜１．０禮）をスポッ
トし、そして放射状にウィックせしめた。ＥＤまたは免
疫処置されたＥＡの濃度が増加するにつれて、ＥＤ４Ｔ
４を使った実験（例８参照）に見られるように、クロロ
フェノールレッド（ＣＰＲ）スポットの色素濃度が増加
した。しかしながら、全ての試料において、ＣＰＲのス
ポットの形成は溶媒の先端と同じ直径であった。このこ
とは、ＢＤ４Ｔ４と異なり、Ｆａｌｌ−ＥＡ膜は８０４
を優先的に引き止めなかったことを示す。

ＣＰＲＧは非特異的にＰａ１ｌ−ＥＡ膜に結合するため
、８０４がブロックされたＰａ１ｌ−Ｂ＾膜のＥＡに特
異的に結合しているかどうか、または鉄膜のブロックが
乏しいために非特異的に結１合しているかどうかを決定
する実験を行った。１０禮のＥＡを使って調製されたＰ
ａ１ｌ−ＥＡ膜を１％ＢＳＡまたは０．１％もしくは１
％カゼインでブロックした。５−の８口４溶液をそれら
の膜に垂直にウィックせしめ、そしていつも通りに反応
をモニターした。ＢＳＡでブロックされた膜を使った時
は、ＣＰＲ反応性先端は溶媒先端の高さのわずか１／２
であった；一方、カゼインでブロックされた膜のいずれ
かを用いると、反応性先端は溶媒先端と等しかった。こ
れらの結果は、ＢＳＡでブロックされた膜がカゼインで
ブロックされた膜はど効果的に過剰の８０４をウィック
できなかったことを示す。

ＥＡを固定することなく、単にブロックしそして洗浄し
たＰａ１ｌ膜についてもＥＤ４の動向を研究した。１０
ｎＭのＥＤ４溶液を、ブロックされた膜を用いて垂直に
ウィッキングせしめた。次いでＥＡを含有するＣＰＲＧ
と共に鉄膜をインキユベートシ、ウィックしている８０
４の高さを検出した。カゼインでブロックされた膜は、
溶媒先端と一緒にＥＤ４をウィックせしめ；一方、ＢＳ
Ａでブロックされた膜を使った時には８０４は溶媒先端
の高さの１７２よりも小さい高さまでしかウィックしな
かった。この点で、ブロック剤としてカゼインの使用を
更に研究した。

例４：カゼイン濃度の最適化 ブロック用カゼインの最適濃度を決定するために次の実
験を行った。１０ｊ＃ＩＥＤ４の溶液は、０．１％カゼ
インでブロックされたＦａｌｌ−ＥＡ膜に対して１％カ
ゼインを用いるとより高くウィックすることがわかった
。ＥＡ無しのＰａ１ｌ膜上で８０４をウィックさせ、そ
してアッセイ前に洗浄すると、どちらのカゼイン−ブロ
ックの濃度でもＣＰＲ形成は認められなかった。このこ
とは、どちらのカゼイン濃度でもＥＡ無しの膜への８０
４の非特異的結合をしっかり防ぐことを示した。

ブロックにとって最適のカゼイン濃度を決定する次の試
みは、固定化された１−または１０−のＥＡを用いそし
てブロッキング段階において０．１％または１％のカゼ
インを用いてＰａ１ｌ膜を調製することを含む。８０４
が膜上に固定されたＥＡにより特異的に引き止められて
いる場合、１３０４により到達される高さはＥＡ濃度が
減少するにつれて高くなるであろう。即ち、固定化され
たＥＡが少なければ、溶媒先端に接近して８０４をウィ
ックさせるであろう。１％カゼインでブロックされたＥ
Ａ膜を用いた場合、ＩＪＩＭ対１０岸のＥＡ膜を比較し
ても、到達したＥＤ４の高さに差はなかった；一方、わ
ずか０．１％のカゼインでブロックされた１０渕ＥＡ膜
に対して１ｄＥＡ膜についてはウィックしているＥＤ４
の高さがわずかに高かった。最適な膜は、８０４の濃度
が増加するにつれて８０４をより高くウィックせしめる
；しかしながら、調製された全ての膜はまだ、ＢＤ４濃
度に対するＥＤ４の高さの関係が乏しかった。加えて、
ＥＤ４が昇った高さは、輪郭のはっきりした線ではなか
った。これは、ＥＤ４の高さについてアッセイ条件を変
えることにより決定された。色々な濃度のＥＡを種々の
ＥＡ−膜上で垂直にウィックせしめた後、その膜を例の
ごと＜　ＣＰＲＧ中に浸すかまたは追加のＥＡを含むＣ
ＰＲＧ中に浸した。ＣＰＲ反応性先端は後者の場合によ
り高くなり、このことはＥＡがＣＰＲＧと共に存在しな
い時に見られるよりも高い高さにＥＤ４が実際に達して
いたことを示す。即ち、明らかに８０４は主バンドの前
方に少量を有する勾配として進行した。ＣＰＲＧ中の追
加のＥＡの存在は、主たるεＤ４先端の前方にウィック
するこの少量の８０４を検出するための感度を提供した
。

１％のカゼインでブロックされたＰａ　Ｉ　１−ＨＡ　
（１０ｄＨＡ）を選択し、移動性アッセイが６０４に関
して達成され得るかどうか、即ち、試料中の８０４濃度
の増加をＥＤ４がウィックする高さの増加と互いに関係
づけることができるかどうかを調べた。このプロトコー
ルは、Ｐａ１ｌ−ＢＡ膜を使って３〜３０ｎＭのＥＤ４
をウィックさせ、３７℃にて１０分間インキュベートし
、ＣＰＲＧ中に浸し、次いで鉄膜を湿密の容器中にシー
ルするかまたはシールせずに室温（ＲＴ）にて発色させ
ることを含んで成る。シールされた膜はシールされない
容器中の、膜よりも遅く乾燥し、より速く反応を完了さ
せ、そしてＢＤ４濃度に対してより濃色の高さの識別を
生じた。

３ｎＭのＥＤが溶媒先端の高さの半分以上まで上昇した
ので、より低い８０４濃度範囲（０，６〜２．４ｎＭ）
において実験を繰り返した。様々なＥＤ濃度間の高さの
識別は不十分であったが、色の強度とは良い相関性があ
った。

例５　：　Ｐａ１ｌ−ＢＡ膜の結合能力膜に結合してい
るＥＡの濃度を増加させると膜がＥＤ４をより効果的に
結合しそして垂直のウィッキング距離と８０４との良い
相関関係を提供するかどうかを調べるために実験を企画
した。膜に結合させるために６．２３または４２戸のＥ
Ａ溶液を使って１シリーズのＰａ１ｌ−ＢＡ膜を調製し
た。これらの膜を、垂直と放射状の両方のウィッキング
形式において８０４の濃度を変えながらアッセイした。

ＢＤ４濃度を一定に保った時、２３Ｍ　Ｅ　Ａ膜を使っ
て達せられた高さは６ｔ＋ＥＡ膜のものと同じかまたは
より低かった。この両者は４２州のＥＡ試料を使った時
よりもより高い高さに到達した。しかしながら、高濃度
のＥ！Ａ−Ｐａｉｌ膜の感度により余分なＥＤ４高さが
検出された。膜に固定された追加のＥＡはＥＤをより効
果的に結合するので、４２ＪＩＭのＥＡ試料を使って得
られた高さが実際に最も低かった。

例７：ＥＡと結合しているＥＤの安定性次の実験は、８
０４と固定されたＥＡとの間の結合の強さをテストする
ために計画した。Ｐａ１ｌ−ＢＡの幅広のストリップを
使ってＥＤ４　（２ｎＭ）を垂直にウィックせしめた。

このストリップをすぐに縦に半分に切った。半分はいつ
も通りに３７℃で１０分間インキニベートシ、次いでＣ
ＰＲＧの中に浸した。

もう半分は、洗浄を使って８０４結合に挑戦するのに用
いた。最初の溶媒先端を幾らか追加の距離移動させるＴ
ｗｅｅｎ−ＰＢＳの溶液（５０ｍＭ　ＮａＰＯ＊　ｌ　
ｐＨ７，０〜７．５　、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　）中に
膜を入ｆＬる（Ｒ初のＥＤ４ウィッキング後）ことがで
きるように、最初の溶媒先端は膜の最上部までウィック
させなかった。このストリップをインキュベートシ、そ
して発色せしめた時、８口４の高さはもう半分のストリ
ップと同じ高さに達した。従って、固定されたＥＡに結
合しているもとのＥＤ４は、その後の洗浄により除去さ
れなかった。

例８：接合体の親水性 ＥＡと共にインキュベートされていないが１％カゼイン
でブロックされているＰａ１ｌ膜を使って、種々の濃度
のεＤ４Ｔ３（１〜１０１００ｎをスポットしそして放
射状にウィックせしめた。この膜をＥＡとＣＰＲＧで発
色させた。どの場合でも、色は中央のドツトに限定され
、溶媒先端に達していなかった。

従って、前の実験ではＨＤ４は溶媒先端までウィックし
たが、ブロックされたＰａ１ｌ膜はεＤ４Ｔ３を溶媒先
端までウィックせしめなかった。この接合体の非特異的
結合は、ＨＤ−Ｔ３接合体の疎水性によるものであり、
そして他の接合体のシリーズを実験して、ＥＡにより結
合されなければ接合体がアッセイ媒質と共にウィックす
るのに必要とする親水性の程度を調べた。

５岸のＥＡとＰａ１ｌ膜とを反応させることにより調製
したＥＡ紙に、種々の接合体の１０ｎＭ溶液を３〜５ｉ
ＩＩスポツトした。初期実験においては、ＢＤ４スポッ
トは溶媒先端と共に拡張し、一方ＢＤ４Ｔ３は小スポッ
トとして残った。ＨＤ４−ジゴキシンは中心に残ったけ
れども半径はＴ３およびＴ４接合体のスポットよりも大
きかった。ＨＤ４−８１２は溶媒先端まで広がった。Ｂ
０４−ＫＬＩ（およびＨＤ４−ＢＳＡの溶液は、反応性
は乏しいけれども、溶媒先端まで広がった。

これらの結果は、抗体の非存在下での接合体の移動の量
が接合体の親水性と直接相関関係があることを証明して
いる。即ち、Ｔ３およびＴ４接合体が最も疎水性で、次
にジゴキシン接合体であり、そして溶媒先端と共にウィ
ックしなかった接合体はこれらだけである。

例９　：　　８０４−８１２のアッセイ例８に記載のＥ
Ｄ４Ｔ３を使った実験を、８Ｄ４Ｔ３よりも親水性であ
る接合体を使って繰り返した。

ＨＤ４−８１２をある範囲の濃度の抗−８１２抗体（１
：５０００〜１：１００希釈）と共に、インキユベート
して免疫複合体を形成せしめた。これら複合体を溶液中
でアッセイして補完の阻害を測定し、そしてＰａ１ｌ−
ｔ！Ａ紙上にスポットした。最も低い抗−８１２抗体濃
度では、溶液アッセイはわずか２２％を阻害されそして
膜スポットの発色が全く減少しなかった。高い抗−８１
２抗体濃度を使って形成された免疫複合体を用いると膜
上の発色に減少が見られ、これは溶液アッセイにおける
補完の阻害率の増加（１：１０００〜１：１００抗−Ｂ
１２では５５〜６４％の阻害）と相関関係があった。こ
のアッセイを“開発する”ために、免疫複合体（１：２
０００抗−８１２）をアッセイおよびスポット前に５〜
１１００ｎの８１２と共にインキユベートした。この複
合体は分析物量なしでは４４％阻害されそして最も高い
Ｂ１２濃度では３４％阻害された。このことは８０−８
１２と抗−Ｂ１２の托が最適化を必要とすることを示す
。しかしながら、発色の面積は分析物量の存否によりご
くわずかしか影響を受けなかった。溶媒先端の外側の色
の濃度は分析物無しの試料と同じである一方、その中央
の濃度においてわずかに増加が認められた。このデータ
から、−炭種々の成分の濃度が最適化されれば、Ｂ１２
のための高感度のアッセイを開発できることが明らかで
ある。

上記の実施例および説明により証明されるように、本発
明は、広範囲の様々なリガンドを測定するための便利で
正確な且つ迅速な方法を提供する。

このプロトコールは単純であり、そして種々の段階を行
うのに技術的能力を必要としない。加えて、高価な装置
を必要とすることなく、または結果を得るための装置を
使う必要性もなく、結果の可視的測定を可能にするフォ
ーマットが提供される。

今まで本発明を理解の明確化のために説明および実施例
により幾分詳しく記載してきたが、本発明の教示を考慮
すれば、特許請求の範囲および精神を逸脱することなく
幾つかの変更および改良を行い得ることは当業者にとっ
て容易に明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の分析物の存在を検出する方法であって、酵
   素受容体（ＥＡ）および酵素供与体（ＥＤ）として定義
   されそして結合すると活性酵素の複合体を形成するβ−
   ガラクトシダーゼの相補的断片、前記断片のうちの第一
   の断片が検出領域中に実質的に均一に結合されている吸
   水性支持体、並びにリガンド分析物と交差反応性である
   かまたはレセプター分析物と相補的である部分に結合さ
   れた前記断片のうちの第二の断片を含んで成る接合体を
   使用し、 アッセイ媒質中で、前記試料、前記接合体および、前記
   分析物がリガンドである時にはレセプター試薬を混合し
   、そして前記リガンド分析物が前記レセプター試薬と結
   合するのに十分な時間の間インキュベートし、ただし前
   記接合体が親水性である場合は、前記レセプター試薬ま
   たはレセプターと前記リガンド接合体との複合体が前記
   検出領域中の前記断片のうちの前記第一の断片と結合し
   ないようにし； 前記アッセイ媒質を前記吸水性支持体の受容部位に添加
   し、それにより前記アッセイ媒質が前記受容部位から前
   記検出領域中にウイックし；前記検出領域をβ−ガラク
   トシダーゼの基質と接触せしめ、検出可能なシグナルに
   変化を与えるような生成物を生成せしめ；そして 前記変化を前記試料中の分析物の存在に関連づける； ことを含んで成る方法。 ２、前記ＥＡが前記吸水性支持体に結合されている、請
   求項１に記載の方法。 ３、前記吸水性支持体を接触後実質的に乾燥させる、請
   求項１に記載の方法。 ４、試料中の分析物の存在を検出する方法であって、酵
   素受容体（ＥＡ）および酵素供与体（ＥＤ）として定義
   されそして結合すると活性酵素の複合体を形成するβ−
   ガラクトシダーゼの相補的断片、ＥＡが検出領域中に実
   質的に均一に結合されている細長い吸水性支持体、並び
   にリガンド分析物と交差反応性であるかまたはレセプタ
   ー分析物と相補的である部分に結合されたＥＤを含んで
   成る接合体を使用し、 アッセイ媒質中で前記試料、前記接合体および、前記分
   析物がリガンドである時にはレセプター試薬を混合し、
   そして前記リガンド分析物が前記レセプター試薬と結合
   するのに十分な時間の間インキュベートし、ただし前記
   接合体が親水性である場合は、前記リガンド接合体と前
   記レセプター試薬またはレセプターとの複合体が前記検
   出領域中の前記ＥＡと結合しないようにし； 前記アッセイ媒質を前記吸水性支持体の受容部位に添加
   し、それにより前記アッセイ媒質が前記受容部位から前
   記検出領域中にウイックし；前記検出領域をβ−ガラク
   トシダーゼの基質と接触せしめ、検出可能なシグナルに
   変化を与えるような生成物を生成せしめ；そして 前記検出可能なシグナルが観察される所において色の強
   度または前記受容部位からの距離を測定する； ことを含んで成る方法。 ５、前記レセプター試薬またはレセプターを支持体に結
   合することにより、前記レセプター試薬またはレセプタ
   ーが前記検出領域中のＥＡに結合しないようにする、請
   求項４に記載の方法。 ６、前記レセプター試薬またはレセプターを前記レセプ
   ター試薬またはレセプターに特異的な第二抗体に結合す
   ることにより、前記レセプター試薬またはレセプターが
   前記検出領域中のＥＡに結合しないようにする、請求項
   ４に記載の方法。 ７、試料中の分析物の存在を検出する方法であって、酵
   素受容体（ＥＡ）および酵素供与体（ＥＤ）として定義
   されそして結合すると活性酵素の複合体を形成するβ−
   ガラクトシダーゼの相補的断片、ＥＡが検出領域中に実
   質的に均一に結合されている実質的に左右対称形の吸水
   性支持体、並びにリガンド分析物と交差反応性である部
   分に結合されたＥＤを含んで成る疎水性接合体を使用し
   、 アッセイ媒質中で前記試料、前記接合体およびレセプタ
   ー試薬を混合し、そして前記リガンド分析物が前記レセ
   プター試薬と結合するのに十分な時間の間インキュベー
   トし； 前記アッセイ媒質を前記吸水性支持体の受容部位に添加
   し、それにより前記アッセイ媒質が前記受容部位から前
   記検出領域中にウイックし；前記検出領域をβ−ガラク
   トシダーゼの基質と接触せしめ、検出可能なシグナルに
   変化を与えるような生成物を生成せしめ、ここで前記受
   容部位から遠位の前記検出可能なシグナルの存在が前記
   分析物の存在を示す； ことを含んで成る方法。 ８、前記接合体がポリヨードチロニンを含んで成る、請
   求項７に記載の方法。 ９、ナイロン膜、前記膜に結合されており、酵素受容体
   （ＥＡ）および酵素供与体（ＥＤ）として定義されそし
   て結合すると活性酵素の複合体を形成するβ−ガラクト
   シダーゼの相補的断片のうちの一断片、並びに前記膜に
   結合されているタンパク質安定化剤を含んで成る装置。 １０、請求項１に記載の方法において使用するためのキ
   ットであって、 （１）ナイロン膜、前記膜に結合されており、酵素受容
   体（ＥＡ）および酵素供与体（ＥＤ）として定義されそ
   して結合すると活性酵素の複合体を形成するβ−ガラク
   トシダーゼの相補的断片のうちの一断片、並びに前記膜
   に結合されているタンパク質安定化剤を含んで成る装置
   ； （２）着目のリガンド分析物と交差反応性であるかまた
   は着目のレセプター分析物と相補的であるエピトープに
   結合された、前記一断片に相補的な断片の接合体；およ
   び （３）分析物がリガンドである時、前記エピトープのた
   めのレセプター； を含んで成るキット。