MXPA96006583A

MXPA96006583A - Metodo inmunologico de determinacion

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Publication number: MXPA96006583A
Application number: MXPA/A/1996/006583A
Authority: MX
Inventors: Pauly Hanserwin; Peiselermuller Hanna
Original assignee: Dade Behring Marburg Gmbh
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-18
Publication date: 1998-01-01

Abstract

El presente invento concierne a un método inmunoquímico de determinación según el principio competitivo, en el cual se determina la concentración del analito en un procedimiento de 1 etapa, y el analito compite en tal caso con unos partícipes en la fijación específicos, primero y segundo, en cuanto a la fijación a un tercer partícipe específico en la fijación, estando unido al primer partícipe específico en la fijación a un soporte insoluble en agua y estando provisto el segundo partícipe específico en la fijación de una marcación generadora de una señal.

Description

Método imnunológlco de determinación 1 El presente invento concierne a un método inmunoquímico de determinación según el principio competitivo, en el cual se determina la concentración del analito en un procedimiento de 1 etapa, y el analito compite en este caso con un primer y un segundo partícipes específicos en la fijación en cuanto a la fijación a un tercer partícipe específico en la fijación, siendo unido el primer partícipe específico en la fijación a un soporte insoluble en agua, y siendo provisto el segundo partícipe específico en la fijación de una marcación generadora de señal . Los métodos inmunológicos de determinación han adquirido una importancia sobresaliente, desde que se efectuó la primera descripción de un procedimiento radioin-munológico (1959) y del primer procedimiento inmunoenzimáti-co, en muchos sectores del diagnóstico clínico. En un procedimiento inmunoenzimático para la determinación de un analito pasan a utilizarse partícipes inmunológicos en la fijación y en la reacción, tales como p.ej. haptenos, antígenos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Los partícipes utilizados en la fijación y en la reacción pueden por una parte presentarse en tal caso unidos a una fase sólida o pueden estar conjugados con una marca generadora de señal, p.ej. una enzima de marcación a través, p.ej., de un enlace covalente. Como fase sólida se utilizan cuerpos moldeados cóncavos, tales como p.ej. tubitos o cavidades en forma de placas de microtitulación, pero también cuerpos moldeados convexos, tales como p.ej. esferas. También encuentran utilización fases sólidas planas, tales como p.ej. tiras de ensayo. Como enzimas de marcación se emplean con frecuencia fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa y peroxidasa de rábano picante, utilizándose como substratos compuestos cromógenos, fluorógenos o luminiscentes. Las composiciones de los tampones de muestra, de incubación y de lavadc, así como de los diferentes reactivos de substratos y cromógenos, son conocidos para un experto en la materia. A diferencia de los procedimientos inmunoenzimáticos homogéneos, en el caso de procedimientos inmunoenzimáticos heterogéneos, los partícipes en la reacción, no fijados, son separados de los partícipes en la reacción, fijados, mediante una separación de fases y subsiguientes etapas de lavado. En tal caso, se establece diferencia entre el procedimiento de 1 etapa y el de 2 etapas. Mientras que en el procedimiento de 1 etapa se lleva a cabo en total solamente 1 etapa de separación (separación entre "fijado y libre" (bound/free) ) , ésta, en el caso del procedimiento en 2 etapas, se lleva a cabo después de cada etapa individual de incubación o reacción. En términos generales, los procedimientos inmunoenzimáticos se clasifican, según los principios inmunológicos de reacción, en técnicas no competitivas y competitivas. Las técnicas no competitivas (ensayos en "emparedado") se distinguen porque los partícipes en la reacción, fijados a una fase sólida y generadores de una señal, se presentan en un gran exceso molar en comparación con el analito que se ha de determinar. Para la estructuración del complejo en "emparedado" se necesitan por lo menos dos sitios de fijación del analito, que son reconocidos en cada caso por uno de los partícipes en la reacción fijados a una fase sólida o generadores de una señal. La actividad de señalización medida del complejo en "emparedado" que se ha formado, es en tal caso directamente proporcional a la concentración del analito. Por el contrario, en el caso de las técnicas competitivas, uno de los partícipes en la reacción, por causa de pequeña concentración, se presenta limitando la formación del complejo inmunológico, de manera tal que tiene lugar una competencia entre partícipes en la reacción y el analito en cuanto a por lo menos un sitio de fijación del partícipe común en la fijación. Dentro de las técnicas competitivas, éstas pueden ser gubdivididas a su vez en dos grupos. En el primero de los grupos, el número de los partícipes insolubi-lizados en la fijación es menor que el número de los partícipes en la reacción, generadores de una señal, y de la molécula que se ha de determinar, mientras que, en el caso del segundo grupo, la concentración del partícipe en la reacción, generador de una señal, es menor que el número de los partícipes insolubilizados en la fijación y de las moléculas de analito libres. En ambos casos, la actividad de señalización del complejo formado es inversamente proporcional a la concentración medida del analito. Al realizar una comparación entre ambos principios inmunológicos de reacción, ' se puede comprobar que las conocidas técnicas competitivas son inferiores a las técnicas no competitivas en lo que se refiere a la sensibilidad, el margen de medición, la especificidad, la robustez y el período de tiempo de incubación (EKINS R. (1985) CURRENT CONCEPTS AND FUTURE DEVELOPMENTS: IN ALTERNATIVE IMMUNOASSAYS ) . La diversa afinidad de los anticuerpos de suero, que se han de detectar, determina por lo tanto muy esencialmente si se ha de emplear el procedimiento de 1 etapa o el de 2 etapas. Al detectar anticuerpos de baja afinidad, se ha manifestado como ventajoso el procedimiento de 2 etapas frente al procedimiento de 1 etapa, especialmente si el período de tiempo de incubación del suero se lleva a cabo como primera etapa durante una noche. Sin embargo, hay que prestar atención a que en la segunda etapa de incubación no se establezca ningún equilibrio entre los partícipes en la reacción generadores de una señal, fijados, y los no fijados, lo cual conduciría a una expulsión de anticuerpos analitos de baja afinidad. La detección de anticuerpos de baja afinidad se puede hacer en principio mejor con el procedimiento de 2 etapas que con el procedimiento de 1 etapa, que es más fácil de realizar por el usuario y más corto. La pureza del antígeno fijado a una fase sólida, por cuya fijación compiten, en un procedimiento inmunoenzimático competitivo, tanto los anticuerpos que se han de detectar como también los partícipes en la reacción, generadores de una señal, desempeña un importante papel. Es decisiva para la sensibilidad de la detección, en tal caso, la densidad de epítopos del antígeno insolubilizado (KENNY G. et al. (1983) J. CLIN. MICROBIOL. 17, 655-665). Si se emplea una mezcla de proteínas, tal como sucede, p.ej., en el caso de un antígeno de virus HAV purificado, se puede perjudicar considerable-mente la sensibilidad de la detección cuando las porciones proteínicas específicas del virus constituyan sólo una pequeña proporción en la proteína global empleada. Con el fin de evitar esto, se debe de utilizar por lo tanto, en los procedimientos conocidos, un antígeno correspondientemente purificado en alto grado, estando vinculada la producción del necesario grado de pureza con un considerable gasto, y ejecutándose ésta correspondientemente de un modo difícil, caro y largo (PURCELL R. et al. (1976) JOURNAL OF IMMUNOLOGY 118, 349-356). Especialmente en el caso de la detección de anticuerpos anti-HAV de baja afinidad, que son formados inmediatamente después de haberse efectuado una vacunación, los diferentes dispositivos de ensayo para diagnóstico obtenibles comercialmente presentan una mala sensibilidad. Tan sólo mediante el empleo de un antígeno de HAV purificado o del antígeno de una vacuna, se pudo mejorar la sensibilidad al efectuar la detección de anticuerpos de baja afinidad (DELEM A. (1992) BIOLOGICALS 20, 289-291). La misión que constituye el fundamento del presente invento consistió, por lo tanto, en desarrollar un procedi-miento que permitiese la detección de anticuerpos de baja afinidad con ayuda del procedimiento de 1 etapa, y en tal caso se puede utilizar un antígeno que se ha purificado sólo de modo mínimo. El problema planteado por esta misión se resolvió en lo esencial mediante las formas de realización puestas a punto en las reivindicaciones. El procedimiento inmunoquímico conforme al invento, para la determinación de un analito mediante un procedimiento competitivo heterogéneo de determinación, incluye las siguientes etapas: a ) incubación del analito con unos partícipes en la fijación específicos, primero, segundo y tercero, estando fijado él primer partícipe específico en la fijación a una fase sólida insoluble en agua (partícipe en la reacción fijado a la fase sólida) y estando provisto el segundo partícipe específico en la fijación de una marcación generadora de una señal (partícipe en la reacción generador de una señal ) , y compitiendo el analito y los partícipes específicos en la fijación, primero y segundo, en cuanto a la fijación al tercer partícipe específico en la fijación (partícipe común en la fijación); b) separación de la marcación generadora de una señal, fijada a la fase sólida a través del tercer partícipe específico en la fijación, con respecto de la porción no fijada; c) medición de la señal generable por la porción fijada de la marcación; y d) determinación de la concentración de analito mediante comparación de los valores hallados en la etapa c) con una curva patrón, trazada en las mismas condiciones o calculada teóricamente. Los analitos, que pueden ser determinados mediante el procedimiento conforme al invento, son en sí conocidos para un experto en la materia. Ventajosamente, el analito es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo de origen humano o animal, que es relevante en el diagnóstico microbiológico, especialmente en el sector del diagnóstico de infecciones, tal como se lleva a cabo en bancos de sangre, tales como p.ej. anticuerpos anti-HAV, anticuerpos anti-HIV, anticuer-pos anti-HCV o anticuerpos utilizados en el diagnóstico de la hepatitis B. Los partícipes específicos en la fijación, primero y segundo, deben estar en situación de poder reaccionar específicamente con el tercer partícipe específico en la fijación. Ventajosamente, los partícipes específicos en la fijación, primero y segundo, son anticuerpos, monoclonales o policlonales, o fragmentos de anticuerpos. Para la realización del procedimiento conforme al invento se pueden emplear, sin embargo, también lectinas o anticuerpos sintéticos/recombinantes. Fundamentalmente, el procedimiento conforme al invento es utilizable también para la detección de antígenos, que no son anticuerpos de ningún tipo, pudiendo entonces los partícipes específicos en la fijación primero y segundo ser respectivamente un antígeno y el partícipe específico en la fijación tercero ser un anticuerpo. Las fases sólidas, como tales, son en sí conocidas para un experto en la materia. Ventajosamente, se emplean fases sólidas insolubles en agua, tales como p.ej. partículas de látex, partículas atraíbles magnéticamente o placas de microtitulación. Las marcaciones generadoras de una señal, como tales, son en sí conocidas para un experto en la materia. Una de tales marcaciones puede ser conjugada o bien directamente a los pertinentes partícipes específicos en la fijación o a través de un acoplamiento reversible, en sí conocido para un experto en la materia, tal como p.ej. fijaciones entre biotina y estreptavidina, fos y jun o anticuerpos y antígenos. Como marcación generadora de una señal se emplean preferiblemente componentes que están capacitados para la quimioluminiscencia o fluorescencia, o enzimas que pueden convertir substratos luminógenos, fluorógenos o cromógenos. En el caso de las enzimas, se prefiere especialmente la peroxidasa de rábano picante. En el caso de las marcaciones quimioluminiscentes, se prefieren especialmente los compuestos descritos en los documentos de solicitudes de patente europeas EP-A-0.257.541 y EP-A-0.330.050.

Usualmente, en el caso de los procedimientos inmuno-químicos descritos, después de la separación de la fase sólida y de la fase líquida, se mide la señal o bien en la fase sólida o bien en el material sobrenadante separado. A partir de la señal medida, se determina, de un modo en sí conocido para un experto en la materia, la concentración del analito mediante una denominada curva patrón. Para el trazado de la curva patrón, se miden, mediando utilización del correspondiente procedimiento de determinación, las señales para concentraciones conocidas del analito, y éstas se convierten bien sea gráficamente o matemáticamente, a la forma de una curva. Tal curva patrón también se puede calcular teóricamente con una cierta exactitud, basándose en las propiedades físicas y químicas conocidas de los partíci-pes específicos en la fijación. El procedimiento conforme al invento es aplicable en el caso de métodos inmunoquímicos, en los cuales tiene lugar una competencia entre el analito que se ha de determinar y los partícipes en la reacción, generadores de una señal, y/o los partícipes en la reacción insolubilizados, en cuanto a la fijación a un partícipe común en la fijación. El procedimiento conforme al invento se distingue además porque el partícipe común en la fijación ha de ser purificado sólo en un grado mínimo. Se ha establecido como esencial que el partícipe común en la fijación tenga por lo menos dos diferentes sitios de fijación, siendo reconocido uno de los sitios de fijación por los partícipes en la reacción insolubilizados, mientras que los partícipes en la reacción, generadores de una señal, se fijan al segundo sitio de fijación. En el caso de la presencia del analito a detectar, se efectúa entonces una competencia específica de la molécula de analito con los partícipes en la reacción, generadores de una señal, y/o los insolubilizados, en cuanto a la fijación al partícipe común en la fijación. Se ha establecido como esencial en tal caso para el procedimiento conforme al invento que, en el caso de la ausencia de un analito, la formación de un complejo en "emparedado" que forma una señal no sea impedida por la competencia entre los partícipes en la reacción, insolubilizados, y los generadores de una señal . Sorprendentemente, en el caso del procedimiento conforme al invento para la detección de anticuerpos contra el virus de hepatitis A (HAV), se comprobó que en el caso de la ausencia de un analito (= testigo negativo) no aparecía ninguna competencia entre los partícipes en la reacción, generadores de una señal (= conjugado de anticuerpos monoclonales específicos anti-HAV) y los insolubilizados en la reacción (anticuerpos policlonales específicos anti-HAV), en cuanto a la fijación al partícipe común en la fijación ( = antígeno de HAV) y con ello se hace posible la formación de un complejo en "emparedado", generador de una señal. Esto resultaba sorprendente, por cuanto que los conocidos anticuerpos monoclonales contra HAV pueden bloquear casi totalmente la fijación al virus de anticuerpos policlonales en diferentes procedimientos inmunológicos competitivos (LEMON S. et al. (1993) VIROLOGY 4, 285-295; HUGHES J. et al. (1984) J. VIROL. 52, 465-473; STAPLETON J. et al. (1987) J. VIROL. 61, 491-498). Por el contrario, en el caso de la presencia de moléculas de analito (= anticuerpos específicos anti-HAV = testigo positivo) también se pudo comprobar con sorpresa que puede tener lugar una competencia específica en cuanto a los partícipes comunes en la fijación, entre el analito y los partícipes en la reacción insolubilizados y/o los partícipes en la reacción, generadores de una señal. También era sorprendente la comprobación de que el partícipe común en la fijación debía ser purificado sólo de modo mínimo o nada en absoluto, para detectar ya con el procedimiento de 1 etapa anticuerpos de baja afinidad, que pueden aparecer en la fase temprana de una infección o después de haberse efectuado una vacunación. En el procedimiento conforme al invento, se proporcionan posiblemente, mediante la presencia de partícipes en la reacción, fijados a una fase sólida, las premisas que permiten una competencia especialmente eficaz y específica entre el analito y los partícipes en la reacción, generadores de una señal y/o fijados a una fase sólida, en cuanto a los sitios de fijación del partícipe común en la fijación. "Purificado de modo mínimo" en el sentido del presente invento quiere decir que la proporción de proteina específica es menor que 80%, preferiblemente menor que 50%, muy preferiblemente menor que 20%. Preferiblemente, en el marco del invento se utilizan, como partícipes en la reacción, anticuerpos o fragmentos definidos de anticuerpos. La preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales (KOHLER G. y MILSTEIN C. (1975) NATURE 256, 497-497) se efectúa de acuerdo con un método en sí conocido para un experto en la materia. Junto con anticuerpos policlonales, se pueden emplear también anti-cuerpos monoclonales o sus fragmentos (F(ab')2 o Fab'). Correspondientemente al procedimiento conforme al invento, en este caso un partícipe en la reacción es fijado a la fase sólida insoluble en agua, mientras que el segundo partícipe en la reacción es empleado como componente generador de una señal. Preferiblemente, en el procedimiento conforme al invento, un anticuerpo policlonal es fijado a la fase sólida y un anticuerpo monoclonal,' que está conjugado con una enzima de marcación, es utilizado como partícipe en la reacción, generador de una señal. La preparación del conjugado monoclonal, utilizado en el invento, es asimismo conocida para un experto en la materia (artículo recopilati-vo: ISHIKAWA E. et al. (1983) J. IMMUNOASSAY 4, 209-327).

La idoneidad de los anticuerpos utilizados se puede determinar p.ej. mediante experimentos en sí conocidos para un experto en la materia. Como partícipe en la fijación se puede emplear, dentro del marco del invento, cualquier macromolécula que tenga por lo menos dos sitios de fijación separados para los partícipes en la reacción insolubilizados y para los generadores de una señal. Son macromoléculas apropiadas, en tal caso, proteínas - eventualmente modificadas mediante hidratos de carbono y/o lípidos -, hidratos de carbono, lípidos, polímeros sintéticos y ácidos nucleicos. Preferiblemente, el peso molecular del partícipe en la fijación se halla entre 50.000 y 2 millones. El procedimiento conforme al invento se puede aplicar a todos los métodos inmunológicos de detección, en los cuales pueda tener lugar en inmunoanálisis heterólogos una competencia específica entre el analito y un partícipe en la reacción fijado a una fase sólida y/o un partícipe en la reacción generador de una señal, en cuanto a por lo menos dos sitios de fijación de un partícipe común en la fijación.

Los siguientes Ejemplos deben de explicar el invento: Abreviaturas : HAV: Virus de hepatitis A POD: Peroxidasa SH: Grupos sulfhidrilo i ATCC: American Tissue Cell Culture Ejemplos Ejemplo 1 a): Conjugación de anticuerpos Se hacen reaccionar anticuerpos monoclonales contra HAV con un reactivo heterobifuncional (TARRIMORE et al. (1983) J. IMM. METH. 62, 123-131), después de ello, se incuban con peroxidasa activada por SH (KING et al. (1978) BIOCHEMISTRY 17, 1499-1506) y a continuación se purifican por cromatografía en gel. b) : Preparación del antígeno de HAV Para la preparación del antígeno de HAV se infectan células obtenibles comercialmente, tales como p.ej. fibroblastos pulmonares embrionales diploides humanos, con una cepa de virus de hepatitis A caracterizada, tal como p.ej. la ATCC HM-175. Después de varios días, el material sobrenadante celular retirado se centrifuga, el sedimento celular obtenido se recoge en un usual tampón de almacenamiento y se inactiva según un procedimiento conocido para un experto en la materia. El antígeno inactivado se puede utilizar ulteriormente sin ninguna purificación adicional. El procedimiento conforme al invento no se limita en tal caso al método antes señalado para la preparación del antígeno de HAV, sino que también se pueden utilizar otros procedimientos de preparación conocidos para un experto en la materia a fin de aislar antígenos. Además de ello, se pueden emplear también en el procedimiento conforme al invento preparaciones de antígenos de HAV obtenibles comercialmente. c) : Revestimiento de las cavidades de placas de microtitu- lación A una solución de revestimiento (carbonato de sodio 0,01 mol/1 pH 9,6) se le añade, bajo ligera agitación, una determinada cantidad de anticuerpos anti-HAV policlonales humanos (16 µg/ml), y se homogeneiza durante aproximadamente 30 minutos. El revestimiento de las cavidades individuales de una placa de microtitulación se efectúa a continuación con un volumen de revestimiento de 150 µl. Después de una incubación durante una noche a la temperatura ambiente, la solución de revestimiento se filtra con succión y las cavidades individuales de la placa de microtitulación se lavan dos veces con una solución de lavado (ácido cítrico 0,25 mol/1/Tris 0,05 mol/1, pH 7,4). A continuación de la última etapa de lavado, se succionan hasta quedar vacías las cavidades individuales de la placa de microtitulación y se encierran conjuntamente con un agente desecante empaquetado (p.ej. gel de sílice) por sellado en hojas de aluminio. Las placas revestidas de microtitulación se almacenan a 4°C hasta su utilización. i d) : Procedimiento inmunoenzimático para la determinación de anticuerpos anti-HAV El procedimiento conforme al invento es un ensayo inmunoenzimático competitivo según el procedimiento de 1 etapa. A las cavidades de una placa de microtitulación, que están revestidas con anticuerpos policlonales humanos específicos anti-HAV, se les añaden consecutivamente una muestra a investigar (25 µl ) , un conjugado (= anticuerpo monoclonal específico anti-HAV conjugado con POD, 50 µl ) y el antígeno de HAV (50 µl ) . La placa revestida de microtitulación, el conjugado y el antígeno de HAV se tomaron del estuche de ensayo anti-HAV Enzygnost® (número de encargo OQEC Behring erke AG, Marburg). Si, en tal caso, la muestra a investigar contiene los anticuerpos anti-HAV que se han de determinar, éstos compiten con las moléculas del conjugado y/o con los anticuerpos policlonales insolubilizados específicos anti-HAV, en cuanto a la fijación al antígeno de HAV. Después de un período de tiempo de incubación de 2 horas a 37 °C, se eliminan el conjugado en exceso y los reaccionantes no fijados, mediante filtración con succión y lavado repetido 4 veces, p.ej'. con el procesador II ELISA de Behring o el procesador III ELISA de Behring (Behringwerke AG, Marburg) y se determina la cantidad del conjugado fijado mediante la adición de 100 µl de una solución de substrato y cromógeno (Behringwerke AG, número de encargo OUVP) (temperatura ambiente, durante 30 min, protegida de la luz). La reacción enzimática del cromógeno dihidrocloruro de tetrametilbencidina se interrumpe mediante la adición de 100 µl de ácido sulfúrico 0,5 N, y se determina fotométricamente la extinción a 450 nm. La extinción medida es en tal caso indirectamente proporcional a la concentración de anticuerpo anti-HAV, contenido en la muestra. e) : Comparación del procedimiento conforme al invento con un procedimiento alternativo, enteramente monoclonal El procedimiento conforme al invento es un ensayo inmunoenzimático según el procedimiento de 1 etapa, que contiene un anticuerpo policlonal de origen humano, especí-fico anti-HAV, fijado a la fase sólida, y como anticuerpo de conjugado, un anticuerpo monoclonal de ratón específico anti-HAV. El procedimiento de comparación se diferencia del procedimiento conforme al invento en que el anticuerpo policlonal en fase sólida ha sido reemplazado por un anticuerpo monoclonal .

En la Tabla 1 se representa el procedimiento conforme al invento con el procedimiento enteramente monoclonal alternativo, en relación con la intensidad de señal del testigo negativo y el límite determinado de detección.

Tabla 1: Comparación del procedimiento conforme al invento con un procedimiento enteramente monoclonal Valor de extinción Límite de del testigo negativo detección Procedimiento conforme al invento 1.427 mE 13 UI/1 Procedimiento enteramente monoclonal 543 mE 28 UI/1 La mayor intensidad de señal del testigo negativo y el mejorado límite de detección del procedimiento conforme al invento, constituido por un anticuerpo anti-HAV policlonal y otro monoclonal, pone de manifiesto claramente la superioridad del procedimiento conforme al invento frente a un procedimiento enteramente monoclonal, alternativo.

Descripción de ias Figuras El límite de detección del procedimiento conforme al invento fue determinado con ayuda de diluciones definidas de un patrón anti-HAV (patrón de WHO). En la Figura 1 se reproducen en una representación semilogarítmica los valores medidos de extinción de diferentes concentraciones de anticuerpos. Condicionado por la constitución competitiva del ensayo, los valores de extinción disminuyen al aumentar la concentración de los anticuerpos. La sensibilidad analítica calculada asciende a 13,4 UI/1, habiendo sido dividido a la mitad como valor de corte el valor de la extinción del testigo negativo. Con ayuda de seroconversiones de vacunas, se pudo mostrar qué anticuerpos contra HAV de baja afinidad se pueden detectar en una fase muy temprana con el procedimiento conforme al invento. En la Figura 2 se representa la evolución cronológica de una típica seroconversión anti-HAV (0193). Se tomaron muestras de sueros en diferentes momentos a partir de voluntarios de vacunación, y éstas se investigaron con el procedimiento conforme al invento. Los valores representados de la relación corresponden en tal caso a valores de cocientes entre las extinciones medidas y al valor de corte. Unos valores de la relación < 1 indican que con la aparición detectable de anticuerpos anti-HAV ha tenido lugar una seroconversión. Tal como se representa en la Figura 2, ya a partir de la segunda semana después de haberse efectuado la vacunación, se pudieron detectar seroconversiones con el procedimiento conforme al invento. En la Figura 3 se cuantificaron los valores medidos de la extinción de la seroconversión 0193 investigada con ayuda de la curva de calibración de la Figura 1. Ya a partir de la 2a semana, se determinó una concentración de anticuerpos que sobrepasa con claridad el valor de protección en vacunación de 20 UI/1.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Procedimiento inmunoquímico para la determinación de un analito mediante un procedimiento competitivo heterogéneo de determinación, que incluye las siguientes etapas: a) incubación del analito con unos partícipes en la fijación específicos, primero, segundo y tercero, estando fijado el primer partícipe específi- co en la fijación a una fase sólida insoluble en agua y estando provisto el segundo partícipe específico en la fijación de una marcación generadora de una señal, y compitiendo el analito y los partícipes específicos en la fijación, primero y segundo, en cuanto a la fijación al tercer partícipe específico en la fijación; b) separación de la marcación generadora de una señal, fijada a la fase sólida a través del tercer partícipe específico en la fijación, con respecto de la porción no fijada; c ) medición de la señal generable por la porción fijada de la marcación; y d) determinación de la concentración de analito mediante comparación de los valores hallados en la etapa c) con una curva patrón, trazada en las mismas condiciones o calculada teóricamente. < 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como método inmunoquímico de determinación se utiliza el procedimiento de 1 etapa. 3.- Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque como partícipes en la fijación específicos, primero y segundo, se utilizan anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. 4.- Procedimiento según la reivindicación 3, caracte-rizado porque como primer partícipe específico en la fijación se utilizan anticuerpos policlonales o correspondientes fragmentos de anticuerpos. 5.- Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque como primer partícipe específico en la fijación se utilizan anticuerpos específicos anti-HAV, o correspondientes fragmentos de anticuerpos. 6.- Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque como segundo partícipe específico en la fijación se utiliza el mismo anticuerpo específico anti-HAV, o correspondientes portadores de anticuerpos. 7. - Procedimiento según la reivindicación 6 , caracte-rizado porque como segundo partícipe específico en la fijación se utiliza otro anticuerpo específico anti-HAV, o correspondientes portadores de anticuerpos. 8.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como componente generador de una señal se utiliza una enzima. 9.- Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque como enzima se utiliza peroxidasa de rábano picante. 10. - Procedimiento según la reivindicación 7 , caracte-rizado porque el primer partícipe específico en la fijación y el segundo partícipe específico en la fijación reconocen diferentes sitios de fijación en el partícipe común en la fijación. 11.- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el analito es un anticuerpo. 12.- Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque el analito es un anticuerpo específico anti-HAV. 13.- Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el analito que se ha de determinar es un anticuerpo específico anti-HAV, de las subclases IgM y/o IgG. 14.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el tercer partícipe específico en la fijación debe tener por lo menos dos sitios de fijación diferentes relevantes inmunológicamente. 15.- Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el tercer partícipe específico en la fijación se emplea en una forma sólo mínimamente purificada. 16.- Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el tercer partícipe específico en la fijación es una macromolécula. 17.- Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el tercer partícipe específico en la fijación es un antígeno vírico. 18.- Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el tercer partícipe específico en la fijación es un antígeno vírico cultivado en un cultivo celular. 19.- Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el tercer partícipe específico en la fijación es un antígeno de virus HAV.